CN108603222A - 对目标核酸进行检测的方法及该方法中使用的核酸探针 - Google Patents

Abstract

本发明的一个实施方式为对目标核酸进行检测的核酸探针。目标核酸的探针结合区域的至少一个末端为鸟嘌呤碱基、且在距离该鸟嘌呤碱基为1～7个碱基以内的所述探针结合区域存在1个以上的胞嘧啶碱基。核酸探针与目标核酸的探针结合区域杂交。核酸探针具备末端具有与该鸟嘌呤碱基相对的胞嘧啶碱基的寡核苷酸和结合于该胞嘧啶碱基的荧光色素。该荧光色素是在与鸟嘌呤碱基的相互作用下发生消光的荧光色素。所述寡核苷酸除了存在于距离所述末端鸟嘌呤碱基为1～7个碱基以内的胞嘧啶碱基之外、与所述探针结合区域的核酸完全互补，与该胞嘧啶碱基中最靠近所述末端鸟嘌呤碱基的胞嘧啶碱基相对的所述寡核苷酸上的碱基是不具有荧光的消光作用的碱基。

Description

对目标核酸进行检测的方法及该方法中使用的核酸探针

技术领域

本发明涉及对目标核酸进行检测的方法及该方法中使用的核酸探针。

背景技术

作为核酸的检测方法之一，可举出荧光标记探针法(参照下述专利文献1)。该方法中使用的探针例如有具备荧光色素及具有使荧光色素产生的荧光消光的作用(也称作“消光作用”)的消光分子按照相邻的方式结合的单链寡核苷酸的核酸探针。该核酸探针是按照与作为目标的核酸(以下称作“目标核酸”)杂交的方式设计的。在聚合酶链反应(以下也称作“PCR”)中，当上述核酸探针与目标核酸杂交、进而核酸探针被具有核酸酶活性的聚合酶分解时，消光分子会自荧光色素离去，因此荧光色素的荧光强度增加。在使用上述具有单链寡核苷酸的核酸探针的方法中，通过核酸探针分解前后的荧光强度或荧光波长的变化，对目标核酸进行检测。

在荧光标记探针法使用的探针中有具有长度不同的2条寡核苷酸的核酸探针(参照下述专利文献2-3)。该核酸探针中，2条寡核苷酸具有相互间互补的碱基序列，将荧光色素结合在一条寡核苷酸上、将具有使荧光色素产生的荧光消光的作用的消光分子结合在另一条寡核苷酸上。PCR中，在加热至高温时，上述2条寡核苷酸分离。与其相伴，消光分子自荧光色素离去，因此荧光强度增加。接着，当降低温度时，较长的寡核苷酸与目标核酸杂交，持续观测到荧光色素产生的荧光。另一方面，在不存在目标核酸的情况下，当降低温度时，上述2条寡核苷酸相互间杂交，消光分子靠近荧光色素，因此荧光色素产生的荧光发生消光。在使用具有上述2条寡核苷酸的核酸探针的方法中，通过测定PCR退火阶段的荧光强度，对目标核酸进行检测。

荧光标记探针法中使用的探针中，还有被靠近鸟嘌呤碱基时、荧光强度减少的(也称作“消光”)荧光色素标记的Quenching Probe(以下称作“QProbe”)(参照下述专利文献4)。该QProbe按照在末端具有结合有上述荧光色素的胞嘧啶碱基、当QProbe与目标核酸杂交时、胞嘧啶碱基与目标核酸中的鸟嘌呤碱基形成碱基对、将鸟嘌呤碱基配置于荧光色素附近的方式设计。因此，当QProbe与目标核酸杂交时，荧光色素由于配置在鸟嘌呤碱基的附近，因此发生消光。使用QProbe的核酸的检测方法中，利用杂交前后的荧光强度的减少量，对目标核酸进行定量。

现有技术文献

专利文献

专利文献1：日本特表平6-500021号公报

专利文献2：日本特开平10-262700号公报

专利文献3：日本特表2004-511227号公报

专利文献4：日本特开2001-286300号公报

发明内容

发明欲解决的技术问题

但是，使用专利文献1～3中记载的核酸探针对目标核酸进行检测时，检测等需要昂贵的精密机器，费用高。此外，使用了专利文献1-3中记载的核酸探针的目标核酸的检测的工序数多、复杂，检测需要熟练。

另外，通过本发明者们的研究，发现即便是QProbe，仍会发生难以以高灵敏度对目标核酸进行检测的情况等，从灵敏度的观点出发仍有进一步改善的余地。

即，QProbe在距离结合有荧光色素的胞嘧啶碱基为1～7个碱基以内存在鸟嘌呤碱基时，通过与该鸟嘌呤碱基的相互作用，荧光色素的荧光强度降低。即，QProbe即便是未与目标核酸杂交，荧光色素的荧光强度也会下降。由此，杂交前后的荧光色素的荧光强度减少率减小、导致灵敏度降低。

因此，在设计QProbe时，在核酸探针与目标核酸杂交的区域(以下称作“探针结合区域”)中，必须选择适于使QProbe杂交的区域，即为了保持高灵敏度、必须选择在距离与结合有荧光色素的胞嘧啶碱基相对的鸟嘌呤碱基为1～7个碱基以内不存在胞嘧啶碱基的区域。

本发明是鉴于该情况而完成的，其目的在于提供自由地选择探针结合区域、且能够实现高灵敏度的检测的手段。更具体而言，本发明的目的在于提供即便是在目标核酸的探针结合区域中，在探针上的距离与结合有荧光色素的胞嘧啶碱基相对的鸟嘌呤碱基为1～7个碱基以内存在胞嘧啶碱基时，灵敏度也优异的核酸探针。本发明的目的还在于提供对使用了上述核酸探针的目标核酸进行检测的方法。

用于解决技术问题的手段

为了解决上述技术问题，本发明提供一种对目标核酸进行检测的第一核酸探针，其中，所述目标核酸具备所述第一核酸探针进行杂交的探针结合区域，所述探针结合区域的至少一个末端为鸟嘌呤碱基、且在距离所述鸟嘌呤碱基为1～7个碱基以内的所述探针结合区域存在1个以上的胞嘧啶碱基，所述第一核酸探针具备末端具有与所述鸟嘌呤碱基相对的胞嘧啶碱基的寡核苷酸和结合在该胞嘧啶碱基上的荧光色素，所述荧光色素是在与鸟嘌呤碱基的相互作用下发生消光的荧光色素，所述寡核苷酸除了存在于距离所述末端鸟嘌呤碱基为1～7个碱基以内的胞嘧啶碱基之外、与所述探针结合区域的核酸互补，与该胞嘧啶碱基相对的所述寡核苷酸上的碱基是鸟嘌呤碱基或不具有荧光的消光作用的碱基，其中，与该胞嘧啶碱基中最靠近所述末端鸟嘌呤碱基的胞嘧啶碱基相对的所述寡核苷酸上的碱基是不具有荧光的消光作用的碱基。

第一核酸探针中，不具有荧光的消光作用的碱基优选是选自次黄嘌呤、腺嘌呤、胸腺嘧啶、胞嘧啶及水粉蕈素中的任一种碱基，更优选是次黄嘌呤碱基。

本发明还提供一种对目标核酸进行检测的方法，其具备以下工序：将第一核酸探针与试样混合，制备混合液的工序；对所述混合液的荧光强度进行测定的工序；和基于所述荧光强度、对所述目标核酸进行检测的工序。

对上述目标核酸进行检测的方法中，检测可以通过熔解曲线分析进行。

本发明还提供一种对目标核酸进行检测的方法，其具备以下工序：将上述第二核酸探针与含有受检核酸的试样混合，制备混合液的工序；和以所述混合液中含有的受检核酸为模板，进行核酸扩增反应，获得扩增产物的工序。所述扩增反应是包含反复进行变性阶段、退火阶段及延伸阶段的循环的聚合酶链反应。所述方法还具备在所述退火阶段中对所述混合液的荧光强度进行测定的工序；和基于所述荧光强度对所述目标核酸进行检测的工序。

本发明还提供一种对目标核酸进行检测的第二核酸探针，所述目标核酸具备所述第二核酸探针进行杂交的探针结合区域，所述探针结合区域的至少一个末端为鸟嘌呤碱基、且在距离所述鸟嘌呤碱基为1～7个碱基以内的所述探针结合区域中存在1个以上的单核苷酸多态性，所述第二核酸探针具备末端具有与所述鸟嘌呤碱基相对的胞嘧啶碱基的寡核苷酸和结合在该胞嘧啶碱基上的荧光色素，所述荧光色素是在与鸟嘌呤碱基的相互作用下发生消光的荧光色素，所述寡核苷酸除了存在于距离所述末端鸟嘌呤碱基为1～7个碱基以内的单核苷酸多态性之外、与所述探针结合区域的核酸互补，与该单核苷酸多态性相对的所述寡核苷酸上的碱基是鸟嘌呤碱基或不具有荧光的消光作用的碱基，其中，该单核苷酸多态性中，与最靠近所述末端鸟嘌呤碱基的单核苷酸多态性相对的所述寡核苷酸上的碱基是不具有荧光的消光作用的碱基。

第二核酸探针中，不具有荧光的消光作用的碱基优选是选自次黄嘌呤、腺嘌呤、胸腺嘧啶、胞嘧啶及水粉蕈素中的任一个碱基，更优选是次黄嘌呤碱基。

本发明还提供一种对目标核酸进行检测的方法，其具备以下工序：将第二核酸探针与试样混合，制备混合液的工序；对所述混合液的荧光强度进行测定的工序；和基于所述荧光强度，对所述目标核酸进行检测的工序。该检测可以通过熔解曲线分析进行，还可以通过熔解曲线分析对单核苷酸多态性进行检测。

上述试样还可以含有通过以受检核酸为模板的核酸扩增反应获得的扩增产物。

发明效果

根据本发明，只要是目标核酸的探针结合区域的至少一个末端为鸟嘌呤碱基，则可以没有特别限定地选择探针结合区域，且能够设计可实现高灵敏度的检测的QProbe。具体而言，本发明可以提供即便是在目标核酸的探针结合区域中距离与探针上结合有荧光色素的胞嘧啶碱基相对的鸟嘌呤碱基为1～7个碱基以内存在胞嘧啶碱基的情况下，灵敏度也优异的核酸探针(第一核酸探针)。

根据本发明，还可以提供使用了上述核酸探针(第一核酸探针)的目标核酸的检测方法。

根据本发明，还可以提供能够检测单核苷酸多态性(Single NucleotidePolymorphism：SNP)的核酸探针(第二核酸探针)。

根据本发明，还可以提供使用了上述核酸探针(第二核酸探针)的目标核酸的检测方法。

附图说明

图1为表示利用本发明第一核酸探针进行核酸检测的机制的示意图。

图2表示使用具有下述碱基序列的核酸探针所进行的熔解曲线分析的结果，所述碱基序列中与存在于寡核苷酸末端的胞嘧啶碱基相邻的鸟嘌呤碱基取代成了次黄嘌呤碱基。

图3表示使用具有下述碱基序列的核酸探针所进行的熔解曲线分析的结果，所述碱基序列中与存在于寡核苷酸末端的胞嘧啶碱基相邻的鸟嘌呤碱基取代成了胸腺嘧啶碱基等其他碱基。

图4表示使用下述探针所进行的熔解曲线分析的结果，所述探针中取代成次黄嘌呤碱基的鸟嘌呤碱基与结合有荧光色素的胞嘧啶碱基的距离阶段性地改变。

图5表示使用下述探针所进行的熔解曲线分析的结果，所述探针中存在于距离结合有荧光色素的胞嘧啶碱基为1～7个碱基以内的多个鸟嘌呤碱基取代成了次黄嘌呤碱基。

图6表示利用LAMP法进行肺炎支原体(Mycoplasma pneumoniae)检测的结果。

图7表示利用PCR法及熔解曲线分析进行人型结核杆菌的检测的结果。

图8表示单核苷酸多态性(SNP)的检测的结果。

图9表示阶段性地改变SNP位置的目标核酸的检测的结果。

具体实施方式

以下根据情况一边参照附图，一边说明本发明的优选实施方式。

本发明中所说的“目标核酸”是指成为使用本实施方式所记载的探针进行检测的对象的核酸。

本发明中所说的“互补性”是指腺嘌呤碱基与胸腺嘧啶碱基、鸟嘌呤碱基与胞嘧啶碱基分别成对，能够形成氢键。

本发明中所说的“单核苷酸多态性(Single Nucleotide Polymorphism：SNP)”是指由于碱基序列上的一个碱基的取代所引起的多态性。

本发明中所说的“完全匹配”是指探针所具有的寡核苷酸的碱基序列与目标核酸所具有的探针结合区域的碱基序列完全互补，目标核酸所具有的探针结合区域与探针所具有的寡核苷酸发生杂交。

另一方面，本发明中所说的“错配”是指探针所具有的寡核苷酸的碱基序列与目标核酸所具有的探针结合区域的碱基序列由于1个碱基也不互补，因而目标核酸所具有的探针结合区域与探针所具有的寡核苷酸无法杂交；或者与“完全匹配”相比，具有较低的熔解温度。

这里所说的“熔解温度”是指双链核酸的50％发生变性而变成单链的温度。

目标核酸的来源并无特别限定，例如可以以动物、植物、菌类、微生物或病毒来源的核酸为对象。

本实施方式中的核酸可以是DNA及RNA等天然存在的核酸，还可以是锁核酸(Locked Nucleic Acid，LNA)及肽核酸(Peptide Nucleic Acid，PNA)等人工核酸。

本实施方式中的目标核酸具备第一核酸探针进行杂交的探针结合区域。

上述目标核酸的探针结合区域的至少一个末端(可以是5’末端、也可以是3’末端)是鸟嘌呤碱基。

在距离位于上述目标核酸的探针结合区域末端的鸟嘌呤碱基为1～7个碱基以内的上述探针结合区域中存在1个以上的胞嘧啶碱基。当将与该胞嘧啶碱基相对的鸟嘌呤碱基取代成不具有荧光的消光作用的碱基时，从本实施方式的第一核酸探针的灵敏度更为优异的观点出发，胞嘧啶碱基可以存在于距离位于探针结合区域末端的鸟嘌呤碱基为5个碱基以内、还可以存在于3个碱基以内，与上述末端鸟嘌呤碱基相邻的碱基还可以是胞嘧啶碱基。

本实施方式的第一核酸探针具备在末端具有与位于上述探针结合区域末端的鸟嘌呤碱基相对的胞嘧啶碱基的寡核苷酸；和结合于该胞嘧啶碱基、被鸟嘌呤碱基消光的荧光色素。

上述第一核酸探针所具有的寡核苷酸除了在距离位于上述探针结合区域末端的鸟嘌呤碱基为1～7个碱基以内存在的胞嘧啶碱基之外，与上述探针结合区域的核酸完全互补。与该胞嘧啶碱基相对的所述寡核苷酸上的碱基是鸟嘌呤碱基或不具有荧光的消光作用的碱基。其中，与该胞嘧啶碱基中处于最接近位于上述探针结合区域末端的鸟嘌呤碱基的位置的胞嘧啶碱基相对的、上述寡核苷酸上的碱基是不具有荧光的消光作用的碱基。

距离末端的胞嘧啶碱基为1～7个碱基以内存在2个以上鸟嘌呤碱基时，除了处于最接近末端胞嘧啶碱基的位置的鸟嘌呤碱基以外，可以取代成、也可以不取代成不具有荧光的消光作用的碱基。从进一步提高第一核酸探针的灵敏度的观点出发，优选在距离末端胞嘧啶碱基为1～7个碱基以内存在的鸟嘌呤碱基中、将2个碱基以上取代成不具有荧光的消光作用的碱基。

本发明中所说的“不具有荧光的消光作用的碱基”是指位于在与鸟嘌呤碱基的相互作用下发生消光的荧光色素的附近位置时，该荧光色素的荧光不会消光的碱基，或者与鸟嘌呤碱基相比、荧光色素的荧光强度的减少量小的碱基。

上述不具有荧光的消光作用的碱基从灵敏度优异的观点出发，优选是选自次黄嘌呤、腺嘌呤、胸腺嘧啶、胞嘧啶及水粉蕈素中的任一个碱基。此外，上述不具有荧光的消光作用的碱基更优选是次黄嘌呤碱基。次黄嘌呤碱基由于能够与胞嘧啶碱基形成氢键，因此当上述不具有荧光的消光作用的碱基为次黄嘌呤碱基时，第一核酸探针能够牢固地结合于目标核酸的探针结合区域。

上述第一核酸探针所具有的荧光色素在与鸟嘌呤碱基的相互作用下发生消光。即，在荧光色素的附近存在鸟嘌呤碱基时，会引起荧光能量共振转移、荧光强度减少。作为这种荧光色素，例如可举出荧光素或其衍生物(异硫氰酸荧光素(FITC)等)、四甲基罗丹明(TMR)、6-JOE、Alexa Fluor(注册商标)488(Molecular Probes公司)、Cy(注册商标)3(GEHealthcare公司)、Cy(注册商标)5(GE Healthcare公司)、BODIPY(注册商标)-FL(Molecular Probes公司)、羧基四甲基罗丹明(TAMRA)等。

作为本实施方式的第一核酸探针的寡核苷酸，可以使用通过通常的寡核苷酸的制造方法获得者。例如，可举出通过化学合成法获得的寡核苷酸。化学合成法中，可以将腺嘌呤、胞嘧啶、鸟嘌呤、胸腺嘧啶、次黄嘌呤、水粉蕈素等任意的碱基导入至任意的位置。

荧光色素可以根据以往公知的方法使其结合在寡核苷酸上(例如参照上述专利文献4)。

使荧光色素结合于寡核苷酸的5’末端时，例如可举出在寡核苷酸的5’末端的磷酸基上导入硫醇基、使荧光色素共价结合在该硫醇基上的方法。

另外，使荧光色素结合在寡核苷酸的3’末端时，例如可举出在结合于核糖或脱氧核糖的3’位碳原子的羟基上导入氨基，使荧光色素共价结合在该氨基上的方法。

本实施方式的第一核酸探针在目标核酸的探针结合区域中，即便是在距离与荧光色素结合的胞嘧啶碱基相对的鸟嘌呤碱基为1～7个碱基以内存在胞嘧啶碱基的情况下，也可基于荧光强度的变化、对目标核酸进行检测。

作为对目标核酸进行检测的方法的实施方式之一，可举出具备以下工序的方法：将本实施方式的第一核酸探针与试样混合，制备混合液的工序；对所述混合液的荧光强度进行测定的工序；根据所述荧光强度、对所述目标核酸进行检测的工序。

图1示意地表示本实施方式的第一核酸探针及作为检测对象的核酸。核酸具有探针结合区域时，第一核酸探针与核酸的探针结合区域杂交。此时，与存在于第一核酸探针末端的胞嘧啶碱基结合的荧光色素由于靠近存在于核酸的探针结合区域的鸟嘌呤碱基，荧光色素的荧光发生消光(图1(a))。

另一方面，当核酸不具有探针结合区域时，第一核酸探针无法与核酸杂交，由于鸟嘌呤碱基不会靠近荧光色素，因此荧光色素的荧光不会消光。即，此时观测到荧光色素的荧光(图1(b))。

因此，例如在将本实施方式的第一核酸探针与试样混合时，与混合前相比，当荧光强度减少时，可以判断试样中存在目标核酸。

作为对目标核酸进行检测的方法的另一实施方式，可举出进行熔解曲线分析的方法。熔解曲线分析可以通过以往公知的方法进行(例如参照上述专利文献1)。

作为熔解曲线分析之一，例如可举出以下的方法。该方法中，首先将本实施方式中的第一核酸探针与试样混合，通过热处理将试样中的双链核酸解离(变性)为单链核酸。进而，该方法中，在将该混合液的温度降低至第一核酸探针与目标核酸发生杂交的温度(以下根据情况称作“杂交温度”)的情况下，测定混合液的荧光强度。

试样中的核酸具有探针结合区域时，当混合液的温度降低至规定温度时，第一核酸探针与试样中的核酸发生杂交，由于鸟嘌呤碱基靠近荧光色素，因此混合液的荧光强度减少。以下将此时的温度称作“消光开始温度”。

另一方面，当试样中的核酸不具有探针结合区域时，即便是降低至消光开始温度，第一核酸探针也无法与试样中的核酸杂交，由于鸟嘌呤碱基没有靠近荧光色素，因此混合液的荧光强度不会减少。

因而，与消光开始温度时观测到的荧光强度相比，在降低混合液的温度至杂交温度时所观测到的混合液的荧光强度减少的情况下，可以判断试样中存在目标核酸。

上述试样还可以含有通过以受检核酸为模板的核酸扩增反应获得的扩增产物。

作为对目标核酸进行检测的方法的另一实施方式，还可举出具备以下工序的方法：将本实施方式的第一核酸探针与含有受检核酸的试样混合，制备混合液的工序；和以所述混合液所含的受检核酸为模板进行核酸扩增反应，获得扩增产物的工序。所述扩增反应是包含反复进行变性阶段、退火阶段及延伸阶段的循环的聚合酶链反应。在所述退火阶段中，具备对所述混合液的荧光强度进行测定的工序；和根据所述荧光强度对所述目标核酸进行检测的工序。

在上述核酸扩增反应中，当目标核酸具有探针结合区域时，在退火阶段中，第一核酸探针与核酸的探针结合区域杂交。此时，由于第一核酸探针的荧光色素靠近探针结合区域的末端鸟嘌呤碱基，荧光色素的荧光会发生消光。

当核酸扩增反应的反复循环数增加时，由于试样中的目标核酸(扩增产物)增加，因此在退火阶段中，与目标核酸杂交的第一核酸探针增加。因而，在核酸扩增反应的退火阶段中，当测定混合液的荧光强度时，随着核酸扩增反应的反复循环数增加、荧光强度的减少量增大。

上述核酸扩增反应还可以是环介导等温扩增(Loop-mediated IsothermalAmplification，LAMP)法。具体而言，作为对目标核酸进行检测的方法的另一实施方式，可举出具备以下工序的方法：将本实施方式的第一核酸探针与含有受检核酸的试样混合，制备混合液的工序；和以所述混合液中含有的受检核酸为模板进行核酸扩增反应(LAMP法)，获得扩增产物的工序。

对第二核酸探针进行说明。第二核酸探针中，除了下述各点之外具有与第一核酸探针相同的构成：在距离探针结合区域的末端鸟嘌呤碱基为1～7个碱基以内存在1个以上单核苷酸多态性；第二核酸探针具有的寡核苷酸除了在距离所述末端鸟嘌呤碱基为1～7个碱基以内存在的单核苷酸多态性之外、与所述探针结合区域的核酸互补；与该单核苷酸多态性相对的所述寡核苷酸上的碱基是鸟嘌呤碱基或不具有荧光的消光作用的碱基；在该单核苷酸多态性中、与最靠近所述末端鸟嘌呤碱基的单核苷酸多态性相对的所述寡核苷酸上的碱基是不具有荧光的消光作用的碱基。即，第二核酸探针是在第一核酸探针中，将与在距离末端鸟嘌呤碱基为1～7个碱基以内的探针结合区域中存在的“单核苷酸多态性”相对的所述寡核苷酸上的碱基取代成不具有荧光的消光作用的碱基者。

使用第二核酸探针，利用上述熔解曲线分析，可以进行SNP的检测。

探针与目标核酸杂交时，根据与不具有探针所具有的荧光的消光作用的碱基相对的、探针结合区域的碱基的种类不同，消光开始温度有所不同。

因此，例如如下可以判断有无SNP及构成SNP的碱基的种类。首先，预先测定将与不具有探针所具有的荧光的消光作用的碱基相对的、探针结合区域的碱基种类变更成其他碱基时的消光开始温度。接着，对预先测定的消光开始温度与另外测定的试样中的目标核酸的消光开始温度进行比对，可以判断有无SNP及构成SNP的碱基的种类。

实施例

以下通过实施例进一步具体地说明本发明，但本发明并不限定于以下的实施例。

[实施例1]使用了取代成了次黄嘌呤碱基的QProbe的熔解曲线分析

使用在核酸探针具有的寡核苷酸中、将距离结合有荧光色素的胞嘧啶碱基为1个碱基地存在的鸟嘌呤碱基取代成了次黄嘌呤碱基的QProbe(以下称作“IQP1”)，进行熔解曲线分析。另外，作为比较例，使用未进行取代的QProbe(以下称作“QP1”)进行熔解曲线分析。

(材料)

目标核酸：具有序列号1的碱基序列的合成DNA(以下也称作“模型1”)10μM。

QProbe：具备具有序列号2、3的碱基序列的寡核苷酸，且在寡核苷酸的末端胞嘧啶碱基上结合有TAMRA的探针(QP1及IQP1)2μM。

杂交用缓冲液：含有KCl、Tris-HCl(pH为8.0)及Tween-20的缓冲液。

其中，目标核酸及QProbe是委托株式会社日本Bio Services而合成的。

将模型1、QP1及IQP1的特征示于表1。其中，碱基序列中，将次黄嘌呤碱基用I表示。

表1

(方法)

将3.2μL模型1、0.5μL QP1或IQP1及21.3μL杂交用缓冲液混合，制备终浓度分别是模型1为1.28μM、QP1或IQP1为0.04μM、KCl为50mM、Tris-HCl(pH为8.0)为10mM及Tween-20为0.1％的混合液。另外，不混合模型1，将0.5μL QP1或IQP1及24.5μL杂交用缓冲液混合，制备混合液。混合液的制备在8联管中进行。在将混合液的温度从95℃降低至20℃的情况下，测定荧光强度，进行熔解曲线分析。降温速度以-0.06℃/秒进行，测定为每1℃进行5次。其中，测定使用LightCycler(注册商标)480InstrumentII(Roche公司)，在533nm的波长下进行激发，测定580nm处的荧光强度。

需要说明的是，进行2次同样的测定。

(结果)

IQP1与QP1同样，当混合液中存在模型1时，当达到一定温度以下时，开始消光，而当混合液中不存在模型1时，未观测到消光(图2)。

另外，IQP1与QP1相比，消光开始时(以下也称作“峰时”)的荧光强度较大。即，使用了IQP1时，与使用了QP1的情况相比，无法观察到峰时的荧光强度和伴随混合液的温度降低的荧光强度的减少，荧光强度达到一定时的荧光强度之差(减少量)增大。

由实施例1的结果可知，混合液中存在目标核酸时，IQP1发生消光、能够检测到目标核酸。另外，IQP1与QP1相比，灵敏度更为优异。

[实施例2]使用了取代成各种碱基的QProbe的熔解曲线分析

使用将与结合有荧光色素的胞嘧啶碱基相邻的鸟嘌呤碱基取代成选自次黄嘌呤、胸腺嘧啶、胞嘧啶、腺嘌呤、水粉蕈素、2-二甲基氨基亚甲基氨基-6-甲氧基氨基嘌呤及3-硝基吡咯中的任一个碱基的QProbe(以下分别称作“IQP1”、“TQP”、“CQP”、“AQP”、“NQP”、“dKQP”及“NitQP”)，进行熔解曲线分析。

(材料)

目标核酸：模型1 10μM。

QProbe：具备具有序列号2～9的碱基序列的寡核苷酸，且在寡核苷酸的末端胞嘧啶碱基上结合有TAMRA的探针(QP1、IQP1、TQP、CQP、AQP、NQP、dKQP及NitQP)2μM。

杂交用缓冲液：含有KCl、Tris-HCl(pH为8.0)及Tween-20的缓冲液。

其中，目标核酸及QProbe是委托株式会社日本Bio Services而合成的。

将模型1、QP1、IQP1、TQP、CQP、AQP、NQP、dKQP及NitQP的特征示于表2。以下，根据情况将与结合有荧光色素的胞嘧啶碱基相邻的鸟嘌呤碱基取代成了胸腺嘧啶、胞嘧啶、腺嘌呤、水粉蕈素、2-二甲基氨基亚甲基氨基-6-甲氧基氨基嘌呤及3-硝基吡咯的碱基分别用T、C、A、N、dK及Nit表示。

表2

(方法)

除了使用TQP、CQP、AQP、NQP、dKQP及NitQP以及不进行由各QProbe和杂交用缓冲液构成的混合液的制备之外，通过与实施例1相同的方法，进行熔解曲线分析。

(结果)

使用选自IQP1、TQP、CQP、AQP及NQP中的任一种QProbe时，峰时的荧光强度与使用了QP1的情况相比，有所上升(图3(a)～(d))。即，使用选自IQP1、TQP、CQP、AQP及NQP中的任一种QProbe时，与使用了QP1的情况相比，无法观察到峰时的荧光强度和伴随混合液的温度降低的荧光强度的减少，荧光强度达到一定时的荧光强度之差(减少量)增大。

由实施例2的结果可知，IQP1、TQP、CQP、AQP及NQP相对于QP1，灵敏度更为优异。

[实施例3]取代位置的选定

使用取代成次黄嘌呤碱基的鸟嘌呤碱基与结合有荧光色素的胞嘧啶碱基的距离阶段性地改变的QProbe，进行熔解曲线分析。具体而言，以具有序列号1、10～12的碱基序列的合成DNA(以下分别称作“模型1”、“模型2”、“模型3”及“模型4”)为目标核酸，使用距离结合有荧光色素的胞嘧啶碱基为1、3、5或7个碱基地存在的鸟嘌呤碱基取代成了次黄嘌呤碱基的QProbe(以下分别称作“IQP1”、“IQP3”、“IQP5”及“IQP7”)，进行熔解曲线分析。另外，作为比较例，使用未进行取代的QProbe(以下分别称作“QP1”、“QP3”、“QP5”、“QP7”)进行熔解曲线分析。

(材料)

目标核酸：具有序列号1、10～12的碱基序列的DNA(模型1～4)10μM。

QProbe：具备具有序列号2、3、13～18的碱基序列的寡核苷酸，且在寡核苷酸的末端胞嘧啶碱基上结合有TAMRA的探针(QP1、QP3、QP5、QP7、IQP1、IQP3、IQP5及IQP7)2μM。

杂交用缓冲液：含有KCl、Tris-HCl(pH为8.0)及Tween-20的缓冲液。

其中，目标核酸及QProbe是委托株式会社日本Bio Services而合成的。

将模型1～4、QP1、QP3、QP5、QP7、IQP1、IQP3、IQP5及IQP7的特征示于表3中。

表3

(方法)

除了使用模型2～4、QP3、QP5、QP7、IQP3、IQP5及IQP7之外，通过与实施例2同样的方法进行熔解曲线分析。

(结果)

使用进行了选自IQP1、IQP3、IQP5及IQP7中的任一个取代的QProbe时，与使用未进行取代的QProbe的情况相比，消光开始时的荧光强度提高(图4)。即，使用进行了选自IQP1、IQP3、IQP5及IQP7中的任一个取代的QProbe时，与使用未进行取代的QProbe的情况相比，无法观察到峰时的荧光强度和伴随混合液的温度降低的荧光强度的减少，荧光强度达到一定时的荧光强度之差(减少量)增大。

由实施例3的结果可知，IQP1、IQP3、IQP5及IQP7相对于未进行取代的QProbe，灵敏度改善。

[实施例4]使用了取代了多个碱基的QProbe的熔解曲线分析

使用将存在于距离结合有荧光色素的胞嘧啶碱基为1～7个碱基以内的多个鸟嘌呤碱基取代成次黄嘌呤碱基的QProbe，进行熔解曲线分析。具体而言，以具有序列号19的碱基序列的合成DNA(以下称作“模型5”)为目标核酸，使用取代成次黄嘌呤碱基的鸟嘌呤碱基的个数为1或2个碱基的QProbe(以下分别称作“I1QP”及“I2QP”)，进行熔解曲线分析。需要说明的是，以下将具有序列号20的碱基序列的QProbe称作“2QP”。

(材料)

目标核酸：具有序列号19的碱基序列的合成DNA(模型5)10μM。

QProbe：具备具有序列号20～22的寡核苷酸，且在寡核苷酸的末端胞嘧啶碱基结合有TAMRA的探针(2QP、I1QP及I2QP)2μM。

杂交用缓冲液：含有KCl、Tris-HCl(pH为8.0)及Tween-20的缓冲液。

其中，目标核酸及QProbe是委托株式会社日本Bio Services而合成的。

将模型5以及2QP、I1QP及I2QP的特征示于表4中。

表4

(方法)

除了使用2QP、I1QP及I2QP之外，通过与实施例2同样的方法进行熔解曲线分析。

(结果)

使用I2QP时，与使用I1QP的情况相比，峰时的荧光强度提高(图5)。即，使用I2QP时，与使用I1QP的情况相比，无法观察到峰时的荧光强度和伴随混合液的温度降低的荧光强度的减少，荧光强度达到一定时的荧光强度之差(减少量)增大。

由实施例4的结果可知，通过将存在于距离结合有荧光色素的胞嘧啶碱基为1～7个碱基以内的多个鸟嘌呤碱基取代成次黄嘌呤碱基，探针的灵敏度得以改善。

[实施例5]利用LAMP法进行肺炎支原体的检测

使用将存在于距离结合有荧光色素的胞嘧啶碱基为1～7个碱基以内的鸟嘌呤碱基取代成了次黄嘌呤碱基的QProbe，利用LAMP法检测肺炎支原体。具体而言，以具有序列号23的碱基序列的肺炎支原体FH株的纯化基因组DNA(以下称作“MycP基因组”)为目标核酸，使用远离结合有荧光色素的胞嘧啶碱基为2个碱基地存在的鸟嘌呤碱基取代成次黄嘌呤碱基的QProbe(以下称作“MycP-IQP”)，利用LAMP法实时地检测MycP基因组。其中，作为比较例，使用未进行取代的QProbe(以下称作“MycP-QP”)，对MycP基因组进行检测。

(材料)

目标核酸：具有序列号23的碱基序列的肺炎支原体FH株的纯化基因组DNA(MycP基因组)。

QProbe：具备具有序列号24～25的寡核苷酸、且在寡核苷酸的末端胞嘧啶碱基上结合有TAMRA的探针(MycP-QP及MycP-IQP)2μM。

Loopamp(注册商标)支原体P检测试剂盒(Reaction Mix MycP(RM MycP)、链取代型DNA合成酶(Bst Pol))

其中，作为MycP基因组，将在95℃下进行5分钟热处理、骤冷后的产物用于测定。QProbe是委托株式会社日本Bio Services而合成的。

将MycP基因组以及MycP-QP及MycP-IQP的特征示于表5。

表5

(方法)

将20.00μL RM MycP和1.00μL Bst Pol混合，获得混合溶液。将20.00μL该混合溶液、0.50μL MycP-QP或MycP-IQP及4.50μL MycP基因组混合，获得MycP-QP或MycP-IQP的终浓度为0.04μM的混合液25.00μL。将所述混合液在65℃下孵育60分钟，实时地测定混合液中的荧光强度。另外，对于代替MycP基因组混合精制水所获得的混合液，也与使用了MycP基因组时同样地实时测定混合液中的荧光强度。其中，测定使用Mx3005P(AgilentTechnologies株式会社制)，在556nm的波长下进行激发，测定580nm处的荧光强度。解析使用MxPro软件。进行2次同样的测定。

(结果)

对使用了MycP-IQP的情况与使用了MycP-QP的情况进行对比时，混合液中存在MycP基因组时的荧光强度与混合液中不存在Myc基因组时的荧光强度之差为，前者比后者大(图6)。

由实施例5的结果可知，使用了在距离结合有荧光色素的胞嘧啶碱基为1～7个碱基以内存在的多个鸟嘌呤碱基取代成次黄嘌呤碱基的QProbe时，与使用未进行该取代的QProbe的情况相比，以更高的灵敏度进行利用LAMP法的肺炎支原体的检测。

[实施例6]利用PCR法及熔解曲线分析进行的人型结核杆菌的检测

使用将存在于距离结合有荧光色素的胞嘧啶碱基为1～7个碱基以内的鸟嘌呤碱基取代成了次黄嘌呤碱基的QProbe，通过PCR法及熔解曲线分析检测人型结核杆菌(Mycobacterium tuberculosis)。具体而言，以具有序列号26的碱基序列的结核杆菌H37Rv株的纯化基因组DNA(以下称作“TB基因组”)为目标核酸，使用将远离结合有荧光色素的胞嘧啶碱基为1个碱基或2个碱基地存在的鸟嘌呤碱基取代成了次黄嘌呤碱基的QProbe(以下分别称作“TB-IQP1”及“TB-IQP2”)，通过PCR法利用熔解曲线分析对经扩增的TB基因组进行检测。此外，作为比较例，使用未进行取代的QProbe(以下称作“TB-QP”)对TB基因组进行检测。

(材料)

目标核酸：具有序列号26的碱基序列的的结核杆菌H37Rv株的纯化基因组DNA(TB基因组)。

PCR用引物：具有序列号27～28的碱基序列的引物(TB-dnaJ1-PCR26及TB-dnaJ1-PCR11)10μM。

10×PCR用缓冲液

dNTPs 2mM

MgSO₄ 25mM

KOD plus DNA polymerase 1U

QProbe：具备具有序列号27～29的寡核苷酸，且在寡核苷酸的末端胞嘧啶碱基上结合有BODIPY(注册商标)-FL的探针(TB-QP、TB-IQP1及TB-IQP2)2μM。

将TB-dnaJ1-PCR26及TB-dnaJ1-PCR11以及TB-QP、TB-IQP1及TB-IQP2的特征示于以下的表6中。

表6

(方法)

制备含有以下试剂的PCR反应液。

[PCR反应液(10.00μL)]

蒸馏水 2.20μL

TB-dnaJ1-PCR26V2 0.250μM 0.25μL

TB-dnaJ1-PCR11 1.500μM 1.50μL

QProbe(TB-QP、TB-IQP1或TB-IQP2)0.250μM 1.25μL

缓冲液 1×1.00μL

dNTPs 0.2mM 1.00μL

MgSO₄ 4.0mM 1.60μL

KOD plus DNA polymerase 0.2U 0.20μL

TB基因组 20.0ng 1.00μL

在以下条件下进行PCR反应及熔解曲线分析。熔解曲线分析(以下的6))中，在将反应液的温度从40℃上升至75℃的情况下，测定荧光强度。上温速度为0.5℃/秒，测定为每1℃进行5次。根据所测定的荧光强度，求得荧光强度的变化量(-(d/dt)荧光强度)。此外，测定使用LightCycler(注册商标)480 Instrument II(Roche公司)，在465nm的波长下进行激发，测定510nm处的荧光强度。进行2次同样的测定。

[PCR反应及熔解曲线分析的条件]

1)94℃2分钟

2)98℃1秒

3)65℃5秒

4)94℃1分钟

5)40℃1分钟

6)40℃～75℃

PCR反应中，反复2)～4)的工序50个循环。

(结果)

使用将存在于距离结合有荧光色素的胞嘧啶碱基为1～7个碱基以内的鸟嘌呤碱基取代成了次黄嘌呤碱基的探针(TB-IQP1或TB-IQP2)时，与使用未将存在于距离结合有荧光色素的胞嘧啶碱基为1～7个碱基以内的鸟嘌呤碱基取代成次黄嘌呤碱基的探针(TB-QP)时相比，荧光强度的变化量增加(图7)。即，使用TB-IQP1或TB-IQP2时，相对于使用TB-QP的情况，因与目标核酸的杂交所导致的荧光强度的变化量增大。另外，使用将存在于距离结合有荧光色素的胞嘧啶碱基为1～7个碱基以内的鸟嘌呤碱基取代成次黄嘌呤碱基的探针(TB-IQP2)时，与未将存在于距离结合有荧光色素的胞嘧啶碱基为1～7个碱基以内的1个鸟嘌呤碱基取代成次黄嘌呤碱基的探针(TB-IQP1)的情况相比，荧光强度的变化量增加(图7)。即，使用了TB-IQP2时，相对于使用了TB-IQP1的情况，对目标核酸的杂交所导致的荧光强度的变化量进一步增大。

由实施例6的结果可知，通过将存在于距离结合有荧光色素的胞嘧啶碱基为1～7个碱基以内的鸟嘌呤碱基取代成次黄嘌呤碱基，能够更高灵敏度地通过PCR反应及熔解曲线分析进行结核杆菌的检测。另外可知，通过将存在于距离结合有荧光色素的胞嘧啶碱基为1～7个碱基以内的多个鸟嘌呤碱基取代成次黄嘌呤碱基，能够以更高灵敏度进行上述检测。

[实施例7]SNP的检测

使用将距离结合有荧光色素的胞嘧啶碱基为1个碱基地存在的、相对“单核苷酸多态性”的寡核苷酸上的碱基取代成选自次黄嘌呤、胸腺嘧啶、胞嘧啶及腺嘌呤中的任一个碱基的QProbe，利用熔解曲线分析对具有SNP的目标核酸进行检测。

(材料)

目标核酸：具有序列号32～35的碱基序列的合成DNA(以下也分别称作“模型A”、“模型G”、“模型T”及“模型C”)。

QProbe：具备具有序列号36～40的寡核苷酸，且在寡核苷酸的末端胞嘧啶碱基上结合有TAMRA的探针(以下也分别称作“SNP-GQP”、“SNP-IQP”、“SNP-AQP”、“SNP-TQP”及“ANP-CQP”)2μM。

杂交用缓冲液：含有KCl、Tris-HCl(pH为8.0)及Tween-20的缓冲液。

其中，目标核酸及QProbe是委托株式会社日本Bio Services而合成的。

将目标核酸及QProbe的特征示于表7。

表7

(方法)

将目标核酸(模型A、模型G、模型T或模型C)3.2μL、SNP-GQP 0.5μL及杂交用缓冲液21.3μL混合，制备终浓度分别达到目标核酸(模型A、模型G、模型T或模型C)为1.28μM、SNP-GQP为0.04μM、KCl为50mM、Tris-HCl(pH为8.0)为10mM及Tween-20为0.1％的混合液。在将混合液的温度从95℃降低至20℃的情况下，测定荧光强度，进行熔解曲线分析。降温速度为-0.06℃/秒，测定为每1℃进行5次。根据所测定的荧光强度，求得荧光强度的变化量(-(d/dt)荧光强度)。其中，测定使用LightCycler(注册商标)480Instrument II(Roche公司)，在533nm的波长下进行激发，测定580nm处的荧光强度。进行2次同样的测定。代替SNP-GQP使用SNP-IQP、SNP-AQP、SNP-TQP及SNP-CQP中的任一个，除此之外与使用SNP-GQP时同样地进行熔解曲线分析。

(结果)

使用将存在于距离结合有荧光色素的胞嘧啶碱基为1～7个碱基以内的、与“单核苷酸多态性”相对的寡核苷酸上的碱基取代成了次黄嘌呤碱基的探针(SNP-IQP)时，以模型C、模型A、模型G及模型T的顺序，消光开始温度降低(图8(a))。因此，由于模型C、模型A、模型G及模型T的消光开始温度分别不同，因此可知通过使用SNP-IQP，可以对每个突变碱基的种类检测SNP。使用将存在于距离结合有荧光色素的胞嘧啶碱基为1～7个碱基以内的与“单核苷酸多态性”相对的寡核苷酸上的碱基取代成胸腺嘧啶碱基的探针(SNP-TQP)时，模型C、模型A、模型G及模型T的消光开始温度也分别不同，因此通过使用SNP-TQP，可以对每个突变碱基的种类检测SNP(图8(b))。

[实施例8]阶段性地改变SNP位置的目标核酸的检测

使用将存在于距离结合有荧光色素的胞嘧啶碱基为1～7个碱基以内的与“单核苷酸多态性”相对的寡核苷酸上的碱基取代成了次黄嘌呤碱基的QProbe，通过熔解曲线分析对阶段性地改变了SNP位置的目标核酸进行检测。

(材料)

目标核酸：具有序列号32～35、41～44及46～49的碱基序列的合成DNA(以下将具有41～44、46～49的碱基序列的合成DNA分别称作“模型A3”、“模型G3”、“模型T3”及“模型C3”以及“模型A5”、“模型G5”、“模型T5”及“模型C5”)。

QProbe：具备具有序列号37、45及50的寡核苷酸，且在寡核苷酸的末端胞嘧啶碱基上结合有TAMRA的探针(以下分别将具备具有序列号45及50的寡核苷酸、且在寡核苷酸的末端胞嘧啶碱基上结合有TAMRA的探针也称作“SNP-IQP3”及“SNP-IQP5”)2μM。

杂交用缓冲液：含有KCl、Tris-HCl(pH为8.0)及Tween-20的缓冲液。

其中，目标核酸及QProbe是委托株式会社日本Bio Services而合成的。

将目标核酸及QProbe的特征示于表8。

表8

(方法)

实施例7中与使用SNP-IQP的情况同样，以模型A、模型G、模型T及模型C为目标核酸，进行熔解曲线分析。另外，作为目标核酸，代替模型A、模型G、模型T及模型C使用模型A3、模型G3、模型T3及模型C3，以及作为Qprobe，代替SNP-GQP、SNP-IQP、SNP-AQP、SNP-TQP及ANP-CQP使用SNP-IQP3，除此之外，与实施例7同样地进行熔解曲线分析。另外，作为目标核酸，代替模型A、模型G、模型T及模型C而使用模型A5、模型G5、模型T5及模型C5，以及作为Qprobe，代替SNP-GQP、SNP-IQP、SNP-AQP、SNP-TQP及ANP-CQP而使用SNP-IQP5，除此之外与实施例7同样地进行熔解曲线分析。

(结果)

对于阶段性地改变了SNP位置的目标核酸而言，使用SNP-IQP3进行检测时，由于模型A3、模型C3及模型T3(或模型G3)的消光开始温度分别不同，因此能够辨别突变碱基的种类(A、C及T(或G))(图9(b))。具体而言，使用SNP-IQP3检测模型A3、模型G3、模型T3及模型C3时，以模型C3、模型A3及模型T3(或模型G3)的顺序，消光开始温度降低(图9(b))。另外，使用SNP-IQP5检测模型A5、模型G5、模型T5及模型C5时，由于模型A5、模型C5及模型T5(或模型G5)的消光开始温度分别不同，因此能够辨别突变碱基的种类(A、C及T(或G))(图9(c))。具体而言，以模型C5、模型A5及模型G5(或模型T5)的顺序，消光开始温度降低(图9(c))。

由实施例8的结果可知，对于阶段性地改变了SNP位置的目标核酸而言，可以使用将存在于距离结合有荧光色素的胞嘧啶碱基为1～7个碱基以内的、与“单核苷酸多态”相对的寡核苷酸上的碱基取代成了次黄嘌呤碱基的探针，能够检测SNP。

序 列 表

<110> 荣研化学株式会社

<120> 对目标核酸进行检测的方法及该方法中使用的核酸探针

<130> WP-078

<160> 50

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 21

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Synthetic oligonucleotide

<400> 1

gctttttttt tttttttttt c 21

<210> 2

<211> 20

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Synthetic oligonucleotide

<400> 2

aaaaaaaaaa aaaaaaaagc 20

<210> 3

<211> 21

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Synthetic oligonucleotide

<220>

<221> modified_base

<222> (20)..(20)

<223> I

<400> 3

gaaaaaaaaa aaaaaaaaan c 21

<210> 4

<211> 21

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Synthetic oligonucleotide

<400> 4

gaaaaaaaaa aaaaaaaaat c 21

<210> 5

<211> 21

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Synthetic oligonucleotide

<400> 5

gaaaaaaaaa aaaaaaaaac c 21

<210> 6

<211> 21

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Synthetic oligonucleotide

<400> 6

gaaaaaaaaa aaaaaaaaaa c 21

<210> 7

<211> 21

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Synthetic oligonucleotide

<220>

<221> modified_base

<222> (20)..(20)

<223> Nebularine

<400> 7

gaaaaaaaaa aaaaaaaaan c 21

<210> 8

<211> 21

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Synthetic oligonucleotide

<220>

<221> modified_base

<222> (20)..(20)

<223> 2-dimethylaminomethyleneamino-6-methoxyaminopurine

<400> 8

gaaaaaaaaa aaaaaaaaan c 21

<210> 9

<211> 21

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Synthetic oligonucleotide

<220>

<221> modified_base

<222> (20)..(20)

<223> 3-Nitropyrrole

<400> 9

gaaaaaaaaa aaaaaaaaan c 21

<210> 10

<211> 21

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Synthetic oligonucleotide

<400> 10

gttctttttt tttttttttt c 21

<210> 11

<211> 21

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Synthetic oligonucleotide

<400> 11

gttttctttt tttttttttt c 21

<210> 12

<211> 21

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Synthetic oligonucleotide

<400> 12

gttttttctt tttttttttt c 21

<210> 13

<211> 20

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Synthetic oligonucleotide

<400> 13

aaaaaaaaaa aaaaaagaac 20

<210> 14

<211> 20

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Synthetic oligonucleotide

<400> 14

aaaaaaaaaa aaaagaaaac 20

<210> 15

<211> 20

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Synthetic oligonucleotide

<400> 15

aaaaaaaaaa aagaaaaaac 20

<210> 16

<211> 21

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Synthetic oligonucleotide

<220>

<221> modified_base

<222> (18)..(18)

<223> I

<400> 16

gaaaaaaaaa aaaaaaanaa c 21

<210> 17

<211> 21

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Synthetic oligonucleotide

<220>

<221> modified_base

<222> (16)..(16)

<223> I

<400> 17

gaaaaaaaaa aaaaanaaaa c 21

<210> 18

<211> 21

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Synthetic oligonucleotide

<220>

<221> modified_base

<222> (14)..(14)

<223> I

<400> 18

gaaaaaaaaa aaanaaaaaa c 21

<210> 19

<211> 22

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Synthetic oligonucleotide

<400> 19

gccttttttt tttttttttt cc 22

<210> 20

<211> 20

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Synthetic oligonucleotide

<400> 20

aaaaaaaaaa aaaaaaaggc 20

<210> 21

<211> 21

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Synthetic oligonucleotide

<220>

<221> modified_base

<222> (20)..(20)

<223> I

<400> 21

gaaaaaaaaa aaaaaaaagn c 21

<210> 22

<211> 22

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Synthetic oligonucleotide

<220>

<221> modified_base

<222> (20)..(21)

<223> I

<400> 22

ggaaaaaaaa aaaaaaaaan nc 22

<210> 23

<211> 425

<212> DNA

<213> Mycoplasma pneumoniae

<400> 23

aattcgaatt tgaaggccca aggcctcacc caacccgcct acctcatcgc cggtcttgac 60

gttgtggccg accacctcgt ctttgcggcc tttaaagcgg gcgcggtggg gtatgatatg 120

acgactgatt cgagcgcttc gacctacaac caagcactcg cctggtcgac cacggccggg 180

ttggacagtg atggggggta caaggccttg gtggaaaaca cggccgggct caacggcccg 240

attaatggct tgtttaccct gctcgacacc tttgcgtatg tgacccccgt gagtgggatg 300

aaagggggga gtcagaataa tgaagaagtg caaacgactt acccggtcaa gtccgaccaa 360

aaggccaccg ccaaaattgc ctccttaatt aatgccagcc cactcaacag ttatggggat 420

gatgg 425

<210> 24

<211> 21

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Synthetic oligonucleotide

<400> 24

tccgaccaaa aggccaccgc c 21

<210> 25

<211> 22

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Synthetic oligonucleotide

<220>

<221> modified_base

<222> (20)..(20)

<223> I

<400> 25

gtccgaccaa aaggccaccn cc 22

<210> 26

<211> 664

<212> DNA

<213> Mycobacterium tuberculosis

<400> 26

agttggcgcg cgacctgcat ccggacgcga acccgggcaa cccggccgcc ggcgaacggt 60

tcaaggcggt ttcggaggcg cataacgtgc tgtcggatcc ggccaagcgc aaggagtacg 120

acgaaacccg ccgcctgttc gccggcggcg ggttcggcgg ccgtcggttc gacagcggct 180

ttgggggcgg gttcggcggt ttcggggtcg gtggagacgg cgccgagttc aacctcaacg 240

acttgttcga cgccgccagc cgaaccggcg gtaccaccat cggtgacttg ttcggtggct 300

tgttcggacg cggtggcagc gcccgtccca gccgcccgcg acgcggcaac gacctggaga 360

ccgagaccga gttggatttc gtggaggccg ccaagggcgt ggcgatgccg ctgcgattaa 420

ccagcccggc gccgtgcacc aactgccatg gcagcggggc ccggccaggc accagcccaa 480

aggtgtgtcc cacttgcaac gggtcgggcg tgatcaaccg caatcagggc gcgttcggct 540

tctccgagcc gtgcaccgac tgccgaggta gcggctcgat catcgagcac ccctgcgagg 600

agtgcaaagg caccggcgtg accacccgca cccgaaccat caacgtgcgg atcccgcccg 660

gtgt 664

<210> 27

<211> 23

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Synthetic oligonucleotide

<400> 27

ccaagcgcaa ggagtacgac gaa 23

<210> 28

<211> 27

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Synthetic oligonucleotide

<400> 28

gaacaagcca ccgaacaagt caccgat 27

<210> 29

<211> 15

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Synthetic oligonucleotide

<400> 29

cggtggagac ggcgc 15

<210> 30

<211> 17

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Synthetic oligonucleotide

<220>

<221> modified_base

<222> (16)..(16)

<223> I

<400> 30

gtcggtggag acggcnc 17

<210> 31

<211> 18

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Synthetic oligonucleotide

<220>

<221> modified_base

<222> (15)..(15)

<223> I

<220>

<221> modified_base

<222> (17)..(17)

<223> I

<400> 31

ggtcggtgga gacgncnc 18

<210> 32

<211> 21

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Synthetic oligonucleotide

<400> 32

gatttttttt tttttttttt c 21

<210> 33

<211> 21

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Synthetic oligonucleotide

<400> 33

ggtttttttt tttttttttt c 21

<210> 34

<211> 21

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Synthetic oligonucleotide

<400> 34

gttttttttt tttttttttt c 21

<210> 35

<211> 21

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Synthetic oligonucleotide

<400> 35

gctttttttt tttttttttt c 21

<210> 36

<211> 21

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Synthetic oligonucleotide

<400> 36

gaaaaaaaaa aaaaaaaaag c 21

<210> 37

<211> 21

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Synthetic oligonucleotide

<220>

<221> modified_base

<222> (20)..(20)

<223> I

<400> 37

gaaaaaaaaa aaaaaaaaan c 21

<210> 38

<211> 21

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Synthetic oligonucleotide

<400> 38

gaaaaaaaaa aaaaaaaaaa c 21

<210> 39

<211> 21

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Synthetic oligonucleotide

<400> 39

gaaaaaaaaa aaaaaaaaat c 21

<210> 40

<211> 21

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Synthetic oligonucleotide

<400> 40

gaaaaaaaaa aaaaaaaaac c 21

<210> 41

<211> 21

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Synthetic oligonucleotide

<400> 41

gttatttttt tttttttttt c 21

<210> 42

<211> 21

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Synthetic oligonucleotide

<400> 42

gttgtttttt tttttttttt c 21

<210> 43

<211> 21

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Synthetic oligonucleotide

<400> 43

gttttttttt tttttttttt c 21

<210> 44

<211> 21

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Synthetic oligonucleotide

<400> 44

gttctttttt tttttttttt c 21

<210> 45

<211> 21

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Synthetic oligonucleotide

<220>

<221> modified_base

<222> (18)..(18)

<223> I

<400> 45

gaaaaaaaaa aaaaaaanaa c 21

<210> 46

<211> 21

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Synthetic oligonucleotide

<400> 46

gttttatttt tttttttttt c 21

<210> 47

<211> 21

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Synthetic oligonucleotide

<400> 47

gttttgtttt tttttttttt c 21

<210> 48

<211> 21

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Synthetic oligonucleotide

<400> 48

gttttttttt tttttttttt c 21

<210> 49

<211> 21

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Synthetic oligonucleotide

<400> 49

gttttctttt tttttttttt c 21

<210> 50

<211> 21

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Synthetic oligonucleotide

<220>

<221> modified_base

<222> (16)..(16)

<223> I

<400> 50

gaaaaaaaaa aaaaanaaaa c 21

Claims (14)

1.一种对目标核酸进行检测的第一核酸探针，其中，

所述目标核酸具备所述第一核酸探针进行杂交的探针结合区域，

所述探针结合区域的至少一个末端为鸟嘌呤碱基、且在距离所述鸟嘌呤碱基为1～7个碱基以内的所述探针结合区域中存在1个以上的胞嘧啶碱基，

所述第一核酸探针具备末端具有与所述鸟嘌呤碱基相对的胞嘧啶碱基的寡核苷酸和结合在该胞嘧啶碱基上的荧光色素，

所述荧光色素是在与鸟嘌呤碱基的相互作用下发生消光的荧光色素，

所述寡核苷酸除了存在于距离所述末端鸟嘌呤碱基为1～7个碱基以内的胞嘧啶碱基之外、与所述探针结合区域的核酸互补，与该胞嘧啶碱基相对的所述寡核苷酸上的碱基是鸟嘌呤碱基或不具有荧光的消光作用的碱基，其中，与该胞嘧啶碱基中最靠近所述末端鸟嘌呤碱基的胞嘧啶碱基相对的所述寡核苷酸上的碱基是不具有荧光的消光作用的碱基。

2.根据权利要求1所述的第一核酸探针，其中，所述不具有荧光的消光作用的碱基是选自次黄嘌呤、腺嘌呤、胸腺嘧啶、胞嘧啶及水粉蕈素中的任一种碱基。

3.根据权利要求1所述的第一核酸探针，其中，所述不具有荧光的消光作用的碱基是次黄嘌呤碱基。

4.一种对目标核酸进行检测的方法，其具备以下工序：

将权利要求1～3中任一项所述的第一核酸探针与试样混合，制备混合液的工序；

对所述混合液的荧光强度进行测定的工序；和

基于所述荧光强度、对所述目标核酸进行检测的工序。

5.根据权利要求4所述的方法，其中，所述检测通过熔解曲线分析进行。

6.根据权利要求4～5中任一项所述的方法，其中，所述试样含有通过以受检核酸为模板的核酸扩增反应获得的扩增产物。

7.一种对目标核酸进行检测的方法，其具备以下工序：

将权利要求1～3中任一项所述的第一核酸探针与含有受检核酸的试样混合，制备混合液的工序，

以所述混合液中含有的受检核酸为模板进行核酸扩增反应，获得扩增产物的工序，所述扩增反应是包含反复进行变性阶段、退火阶段及延伸阶段的循环的聚合酶链反应，

在所述退火阶段中对所述混合液的荧光强度进行测定的工序；和

基于所述荧光强度对所述目标核酸进行检测的工序。

8.一种为对目标核酸进行检测的第二核酸探针，其中，

所述目标核酸具备所述第二核酸探针进行杂交的探针结合区域，

所述探针结合区域的至少一个末端为鸟嘌呤碱基、且在距离所述鸟嘌呤碱基为1～7个碱基以内的所述探针结合区域存在1个以上的单核苷酸多态性，

所述第二核酸探针具备末端具有与所述鸟嘌呤碱基相对的胞嘧啶碱基的寡核苷酸和结合在该胞嘧啶碱基上的荧光色素，

所述荧光色素是在与鸟嘌呤碱基的相互作用下发生消光的荧光色素，

所述寡核苷酸除了存在于距离所述末端鸟嘌呤碱基为1～7个碱基以内的单核苷酸多态性之外、与所述探针结合区域的核酸互补，与该单核苷酸多态性相对的所述寡核苷酸上的碱基是鸟嘌呤碱基或不具有荧光的消光作用的碱基，其中，该单核苷酸多态性中，与最靠近所述末端鸟嘌呤碱基的单核苷酸多态性相对的所述寡核苷酸上的碱基是不具有荧光的消光作用的碱基。

9.根据权利要求8所述的第二核酸探针，其中，所述不具有荧光的消光作用的碱基是选自次黄嘌呤、腺嘌呤、胸腺嘧啶、胞嘧啶及水粉蕈素中的任一个碱基。

10.根据权利要求8所述的第二核酸探针，其中，所述不具有荧光的消光作用的碱基是次黄嘌呤碱基。

11.一种对目标核酸进行检测的方法，其具备以下工序：

将权利要求8～10中任一项所述的第二核酸探针与试样混合，制备混合液的工序；

对所述混合液的荧光强度进行测定的工序；和

基于所述荧光强度，对所述目标核酸进行检测的工序。

12.根据权利要求11所述的方法，其中，所述检测通过熔解曲线分析进行。

13.根据权利要求12所述的方法，其中，通过所述熔解曲线分析对单核苷酸多态性进行检测。

14.根据权利要求11～13中任一项所述的方法，其中，所述试样含有通过以受检核酸为模板的核酸扩增反应获得的扩增产物。