CN104640984A - 使用含有光响应性核酸类的探针的光偶联方法 - Google Patents

使用含有光响应性核酸类的探针的光偶联方法 Download PDF

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Abstract

本发明提供可以克服使用含有光响应性核酸类的探针而与靶核酸的光偶联发生停滞的问题，使光偶联效率提高的光偶联方法；以及光偶联试剂盒。所述光偶联方法是将存在于核酸样品中的靶位点、和与该靶位点具有互补的序列且含有光响应性核酸类的探针1在反应溶液中杂交，通过光照射进行光偶联，其特征在于：抑制该探针1内的起因于该光响应性核酸类的自身缔合。所述光偶联试剂盒的特征在于：其含有与核酸样品中的靶位点具有互补的序列且含有光响应性核酸类的探针1、和与该探针1具有高互补性的探针2。

Description

使用含有光响应性核酸类的探针的光偶联方法
技术领域
本发明涉及使用含有光响应性核酸类的探针进行光偶联的方法。
背景技术
近年来，为了对每一个患者建立作为定制治疗方案的个性化医疗，人们提出了阐明该患者的特定基因多态性与药物感受性或药物响应性的关联性的研究。
特别是由于基因组科学的进步，药代动力学的阐明和参与药物反应性的酶、蛋白质等的基因多态性的阐明迅速进行。在人类基因组分析中，单核苷酸多态性(SNP)作为频率最高的基因多态性标志物一直受到关注。已知该SNP在明确各种疾病与药物响应的关联性方面有用。还已知使用多个SNP的单倍型分析在分析疾病感受性方面有用。
特别是在医疗现场，可考虑使用SNP检测结果用于疾病罹患率诊断、有效的给予药物的选择、对副作用的预测等，不仅增加治疗效果，还有望贡献于患者QOL的提高。
对于判别这样的SNP位点的碱基、即所谓的分型，已报道有很多方法。作为对DNA的单核苷酸多态性分型的技术，TaqMan PCR法或Invader法等作为具有甚至可识别单碱基置换这样的高序列选择性的技术广泛已知。
但是，在如恶性肿瘤这样的后天性突变的检测中，占检样材料大部分的来自正常细胞的野生型核酸分子成为背景噪声，因此，以上所述的分析方法常常无法高灵敏度地检测单碱基置换等的突变。
因此，作为取代上述方法的特别有效的分析方法，有人公开了光响应性核酸类的应用。杂交的光响应性核酸类和靶核酸通过进行特定波长的光照射，可以形成光偶联。该光偶联是通过人工碱基部分的光反应，在光响应性核酸类分子和靶核酸分子之间形成分子间的共价键而产生。这样进行了光偶联的分子与分子并不是只以单纯的热稳定性进行缔合，因此即使置于互补双链可以解离的条件下也不会发生解离，依然结合(专利文献1)。
还基于光响应性核酸类的性质即光偶联反应以1秒左右极迅速地进行、以及未完全杂交则不发生光偶联的认识，公开了使用光响应性核酸类的检测突变型基因的分析方法(专利文献2)。
专利文献1和2中，对于使用光响应性核酸类的SNP的确定进行了公开，但只是根据含有光响应性核酸类的探针在与具有互补序列的靶位点杂交时进行光偶联的认识，公开了光响应性核酸类的使用对于突变型基因的选择性扩增有用的例子。
因此，根据这样的以往的技术常识，光偶联时需要含有光响应性核酸类的探针和具有其互补序列的靶位点杂交，并且光偶联是通过光响应性核酸类与靶位点或靶位点附近的靶核酸结合而形成，因此可以认为光响应性核酸类只与具有互补序列的靶位点或靶位点附近的靶核酸序列结合。
现有技术文献
专利文献
专利文献1：日本特开2009-254279号公报
专利文献2：WO2012/033190号公报。
发明内容
发明所要解决的课题
本发明人发现，在含有光响应性核酸类的探针(即光偶联探针)与靶核酸进行光偶联的反应中，与靶核酸的量无关，只以一定的比例进行光偶联，即，光偶联发生停滞。根据这个事实进行深入研究，结果发现：发生光偶联停滞的主要原因是由于：由于为了与靶核酸光偶联而进行的光照射，含有光响应性核酸类的探针该探针本身在自身序列内发生光偶联。即，可推测探针内的光响应性核酸类和可与该光响应性核酸类光偶联的碱基缔合，发生光偶联，因此，不能与靶位点杂交和/或不与靶核酸光偶联的探针与光照射的时间(能量)相关性地累积，结果，与靶核酸的光偶联发生停滞。
并且根据以往的技术常识考虑，在选择性地抑制野生型基因的扩增、而选择性地扩增突变型基因时，如专利文献2所示的使用光响应性核酸类的光偶联方法的最大优势在于：通过光进行光偶联的靶核酸在PCR反应工序中的热变性工序中不会发生开裂，即，可以将通过光进行光偶联的靶核酸带入到非平衡系统中。
但是，本发明人发现：在照射可能发生光偶联的波长(365nm)的光时，也不只进行与靶核酸的光偶联，与该靶核酸发生了光偶联的探针由于原本不发生的光开裂反应而一部分脱离。即，可以认为光偶联的反应和使光偶联开裂的反应并行发生的光平衡状态是与靶核酸的光偶联发生停滞的主要原因。
本发明的目的在于提供：克服使用含有光响应性核酸类的探针的与靶核酸的光偶联发生停滞的问题，使光偶联效率提高的方法、试剂盒。
解决课题的方案
本发明人深入研究了解决所述课题的方案，结果发现：为了避免光偶联效率的停滞，在反应溶液中，通过抑制含有光响应性核酸类的探针在自身序列内的光偶联来确保该探针的有效浓度，还通过局部提高靶位点附近的含有光响应性核酸类的探针的实质性浓度来促进杂交，使光偶联效率提高。
即，本发明涉及以下内容。
[1] 光偶联方法，该方法是使存在于核酸样品中的靶位点、和具有与该靶位点互补的序列且含有光响应性核酸类的探针1在反应溶液中杂交，通过光照射进行光偶联，其特征在于：抑制该探针1内的起因于该光响应性核酸类的自身缔合，
[2] [1]的光偶联方法，其特征在于：通过使与所述探针1具有高互补性的探针2共存，来抑制该探针1内起因于该光响应性核酸类的自身缔合。
[3] [1]或[2]的光偶联方法，其中，所述高互补性是所述探针1与所述探针2存在互相互补的关系，在规定的光偶联条件下，该探针1中的该光响应性核酸类在自身内发生光偶联的碱基与探针2杂交。
[4] [1]-[3]中任一项所述的光偶联方法，其中，所述光偶联的方法是存在于所述核酸样品中的靶位点所具有的靶核酸、与所述探针1的光响应性核酸类之间进行光偶联。
[5] [1]-[4]中任一项所述的光偶联方法，其中，所述探针2含有光响应性核酸类。
[6] [1]-[5]中任一项所述的光偶联方法，其中，所述探针1和所述探针2含有光响应性核酸类，在该探针1和该探针2的非互补性区使用具有与该探针1和/或该探针2互补的序列的探针3，以使存在于该探针1和/或该探针2内的光响应性核酸类无法在自身内发生光偶联。
[7] [1]的光偶联方法，该方法是将存在于核酸样品中的靶位点、与该靶位点具有互补的序列且含有光响应性核酸类的探针1、和与该靶位点具有互补的序列且含有靶核酸的探针4在反应溶液中相邻接地配置，使它们杂交，通过光照射，存在于该探针4中的靶核酸和该探针1中的该光响应性核酸类之间发生光偶联，其特征在于：通过使与该探针1具有高互补性的探针2共存，抑制该探针1在自身内的光偶联。
[8] [1]-[7]中任一项所述的光偶联方法，其特征在于：在所述探针1内，将与光响应性核酸类发生自身缔合的核酸置换为不与该光响应性核酸类发生光偶联的核酸，使用该探针1来抑制该探针1在自身内的光偶联。
[9] [8]所述的光偶联方法，其中，不与所述光响应性核酸类发生光偶联的核酸是嘌呤碱基。
[10] [8]所述的光偶联方法，其中，不与所述光响应性核酸类发生光偶联的核酸是将嘧啶环人工变换而成的合成碱基。
[11] [1]-[10]中任一项所述的光偶联方法，其中，反应溶液中存在阴离子性物质。
[12] [1]-[11]中任一项所述的光偶联方法，其特征在于：至少一种光偶联探针在反应溶液中以0.1μmol/L以上的浓度存在。
[13] 基因分析方法，该基因分析方法采用[1]-[12]中任一项所述的光偶联方法。
[14] [13]所述的基因分析方法，其中，所述基因分析方法是基因检测方法或核酸扩增方法。
[15] 突变型核酸检测方法，其特征至于：[14]所述的核酸扩增方法是通过选择性地扩增含有突变型核酸的靶位点的扩增用核苷酸序列，来检测该突变型核酸的有无。
[16] 光偶联试剂盒，其特征在于：该试剂盒含有与核酸样品中的靶位点具有互补的序列且含有光响应性核酸类的探针1、和与该探针1具有高互补性的探针2。
[17] [16]所述的光偶联试剂盒，其中，所述探针1与核酸样品中的靶位点的靶核酸发生光偶联。
[18] [16]所述的光偶联试剂盒，该试剂盒进一步含有探针4，该探针4含有能与该探针1的该光响应性核酸类发生光偶联的靶核酸。
[19] [16]-[18]中任一项所述的光偶联试剂盒，其中，所述探针2含有光响应性核酸类。
[20] [16]-[19]中任一项所述的光偶联试剂盒，其中，所述探针1是将在该探针内与光响应性核酸类发生自身缔合的核酸置换为不与该光响应性核酸类发生光偶联的核酸。
发明效果
根据本发明，在使用光响应性核酸类的基因分析方法中，可以使靶位点和含有光响应性核酸类的探针之间的光偶联效率提高。即，可以特异性且高效率地与靶核酸光偶联，因此在需要高灵敏度和特异性的对象基因分析方法中有效。
附图说明
图1是光响应性核酸的一个例子3-氰基乙烯基咔唑(CNVK)的结构式。
图2是对于以EGFR基因上的外显子21(ex.21)区的一部分作为光偶联形成对象、将光响应性核酸CNVK的插入位置设计为插入到接近5’末端的位置的光偶联探针，进行光偶联形成波长的光照射和光偶联开裂波长的光照射，将样品通过电泳确认的结果。
图3是对于以EGFR基因上的外显子21(ex.21)区的一部分作为光偶联形成对象、将光响应性核酸CNVK的插入位置设计为插入到与5’末端相比更接近中心的位置的光偶联探针，进行光偶联形成波长的光照射和光偶联开裂波长的光照射，将样品通过电泳确认的结果。
图4是对于以EGFR基因上的外显子21(ex.21)区的一部分作为光偶联形成对象、将光响应性核酸CNVK的插入位置设计为插入到与3’末端相比更接近中心的位置的光偶联探针，进行光偶联形成波长的光照射和光偶联开裂波长的光照射，将样品通过电泳确认的结果。
图5是对于以EGFR基因上的外显子21(ex.21)区的一部分作为光偶联形成对象、将光响应性核酸CNVK的插入位置设计为插入到接近3’末端的位置的光偶联探针，进行光偶联形成波长的光照射和光偶联开裂波长的光照射，将样品通过电泳确认的结果。
图6是对于只由不作为CNVK的靶核酸的腺嘌呤(A)构成的光偶联探针，进行光偶联形成波长的光照射，将样品通过电泳确认的结果。
图7是对于只由不作为CNVK的靶核酸的鸟嘌呤(G)构成的光偶联探针，进行光偶联形成波长的光照射，将样品通过电泳确认的结果。
图8是对于只由不作为CNVK的靶核酸的腺嘌呤(A)、鸟嘌呤(G)构成的光偶联探针，进行光偶联形成波长的光照射，将样品通过电泳确认的结果。
图9是以EGFR基因的3处突变为目标位点设计的光偶联探针。具体来说，是以(1)编码第861号亮氨酸(L861)的核酸序列为目标位点、(2)以相当于第790号苏氨酸(T790)的核酸序列为目标位点，(3)以相当于第858号亮氨酸(L858)的核酸序列为目标位点，表示分别对有义链和反义链设计的光偶联探针及其互补性的图。
图10是以EGFR基因的编码第861号亮氨酸(L861)的核酸序列为目标位点、分别对有义链和反义链设计光偶联探针时，进行光偶联形成波长的光照射和光偶联开裂波长的光照射，将样品通过电泳确认的结果。
图11是以EGFR基因的编码第790号苏氨酸(T790)的核酸序列为目标位点、分别对有义链和反义链设计光偶联探针时，进行光偶联形成波长的光照射和光偶联开裂波长的光照射，将样品通过电泳确认的结果。
图12是以EGFR基因的编码第858号亮氨酸(L858)的核酸序列为目标位点、分别对有义链和反义链设计光偶联探针时，进行光偶联形成波长的光照射和光偶联开裂波长的光照射，将样品通过电泳确认的结果。
图13是表示以EGFR基因的编码第790号苏氨酸(T790)的核酸序列为目标位点、分别对有义链和反义链设计光偶联探针时，使杂交温度变化并形成光偶联时的光偶联形成效率的图。
图14是表示以EGFR基因的编码第790号苏氨酸(T790)的核酸序列为目标位点、分别对有义链和反义链设计光偶联探针时，添加聚丙烯酸作为杂交促进剂在4℃下进行杂交以形成光偶联时的光偶联形成效率的图。
图15是表示以EGFR基因的编码第790号苏氨酸(T790)的核酸序列为目标位点、分别对有义链和反义链设计光偶联探针时，添加聚丙烯酸作为杂交促进剂在50℃下进行杂交以形成光偶联时的光偶联形成效率的图。
图16是表示以EGFR基因的编码第790号苏氨酸(T790)的核酸序列为目标位点进行基因突变检测时的定量PCR测定结果的图。
图17是对于以EGFR基因上的外显子21(ex.21)区的一部分作为光偶联形成对象，将光响应性核酸CNVK的插入位置插入到接近于5’末端的位置，进一步将CNVK可形成光偶联的嘧啶碱基置换为肌苷的光偶联探针，进行光偶联形成波长的光照射和光偶联开裂波长的光照射，将样品通过电泳确认的结果。
图18是表示将EGFR基因与在实施例8-1.中设计的光偶联探针进行光偶联形成时的光偶联形成效率的图。
图19是表示以EGFR基因的外显子21(ex.21)区的编码第861号的亮氨酸(L861)的核酸序列作为目标位点、分别对有义链和反义链设计的光偶联探针及其互补性的图。
图20是表示将EGFR基因与在实施例10-1.中设计的光偶联探针进行光偶联形成时的光偶联形成效率的图。
具体实施方式
以下，适当参照附图详细说明本发明的实施方案，但是，利用方法或试剂盒的方案并不限于此。
本发明中，关于DNA、RNA、基因表达、编码、模板、启动子、引物、PCR、序列等的术语的定义，与目前分子生物学、遗传学、基因工程学等中广泛地一般使用的术语为相同含义。
本发明中，核酸只要是DNA、RNA或后述的核苷酸类似物即可，没有特别限定，可以是天然产物，也可以是合成产物。天然的核酸例如为从生物收集的基因组DNA、mRNA、tRNA、rRNA、hnRNA等。合成的核酸为通过β-氰基乙基亚磷酰胺法、DNA固相合成法等公知的化学合成法合成的DNA，或通过PCR等公知的核酸扩增法合成的核酸、通过反转录反应合成的cDNA等。
本发明中，核酸样品是含有核酸的样品，只要是可能含有靶位点的样品即可，没有特别限定。例如为可能含有含靶位点的野生型核酸或其突变型核酸中至少一方的样品，优选可能含有其两者的样品。例如以血液或组织等为试样，从试样中的全细胞得到的基因组DNA或RNA符合所述含义。该核酸的提取可通过酚/氯仿法等公知的方法进行。此时无关核酸样品中的突变型的存在率。例如可以100%为野生型，也可以是50%为野生型、其余50%为突变型。该核酸样品还可以是从细胞得到的基因组DNA，也可以是由细胞制备的mRNA，还可以是以mRNA为模板进行反转录反应得到的cDNA。进一步可以是将克隆的多个基因人工混合而成，还可以是通过核酸扩增反应来人工扩增的核酸或它们的混合物。
本发明中，野生型核酸是指发生突变之前的核酸，其典型的例子是未发生突变、含有原本具有正常功能的遗传信息的核酸。这里所述的遗传信息不仅是编码mRNA、tRNA、rRNA、snRNA等的信息的转录区，还包含启动子等的基因表达所必需的调节区。
本发明中，突变型核酸是发生了突变的核酸。突变是指DNA或RNA等核酸序列的变化，遗传学等中使用的碱基置换、插入、缺失、倒位、重复、转座等符合该定义。该突变型核酸中，存在突变的区不仅是转录区，也包含启动子等的基因表达所必需的调节区。无须通过突变使突变型核酸功能上具有变化。另外突变包含先天的和后天的突变。
本发明中，靶位点是探针在存在于核酸样品中的核酸序列中发生杂交的位点。杂交的探针无需含有光响应性核酸类，该核酸序列与探针之间的杂交是指与其序列的全部或一部分的杂交。靶核酸是指具有与光响应性核酸类结合并发生光偶联的核酸序列的位点。这里，光偶联是指含有光响应性核酸类的探针与靶核酸共价结合。已知所形成的共价键的类型根据光响应性核酸类的种类而存在多种，包含其中任意种类，特别包含形成交联型共价键的情形和形成连接型共价键的情形。
光响应性核酸类只要具有受光反应、与其它核酸类形成共价键进行偶联的性质即可，例如可以使用后述式I-VII所示的核酸类。后述式I-VII的光响应性核酸类均具有与嘧啶碱基共价结合的性质，只要是与该光响应性核酸类共价结合的即可，没有特别限定。如上所述，形成碳-碳双键的碱基天然存在时，优选含有胞嘧啶、胸腺嘧啶、尿嘧啶等的序列成为靶核酸。靶核酸可以设计为存在于靶位点中，也可以设计为存在于本发明中使用的光偶联探针以外的探针中。
本发明中，目标位点是在突变型核酸中可见到突变的碱基所存在的位点，包括野生型核酸在内，是成为本发明的基因分析方法的对象的位点。例如有碱基置换时，在野生型核酸、突变型核酸中，该进行了碱基置换的碱基均符合定义。有插入时，在突变型核酸中，被插入的碱基符合该定义，在野生型基因中，突变型核酸中被插入了碱基的位点符合该定义。有缺失时，在突变型核酸中，由于缺失而失去了碱基的位点符合该定义，野生型核酸中，突变型核酸中失去的碱基符合该定义。该目标位点在本发明中可作为最终的分析对象。例如可以表示具有编码遗传信息的序列的链(以下为有义链)，也可以表示与有义链具有互补序列的链(以下作为反义链)。还包含未直接参与遗传信息的序列中的核酸序列的变化。
关于该光偶联探针的碱基序列和光响应性核酸类的位置或数量，只要可以与靶位点的一部分或全部特异性杂交即可，没有特别限定。
根据突变位置或碱基的种类、光偶联探针的长度等情况，可以将光偶联探针设计为靶位点与目标位点一致，也可以在与目标位点不同的部位设定靶位点来设计探针。靶位点和目标位点一致时，可以只使一部分位点重复，也可以设计为全部重复。
可在本发明中使用的光响应性核酸类只要是可以通过光照射与靶核酸偶联即可。
例如可使用补骨脂素衍生物(Chang, E等人. Biochemistry 1991, 30, 8283)或氨基嘌呤衍生物(日本特开2001-206896)或4-硫尿嘧啶等。上述补骨脂素衍生物具有与5’-AT-3’碱基序列中的胸腺嘧啶特异性反应的性质，氨基嘌呤衍生物与序列无关，但具有胞苷特异性，因此其应用范围有一定的制约，因此更优选没有上述限制的下述光响应性核酸类。
作为优选使用的光响应性核酸类1，可举出具有下式I所示的基团作为碱基部分的核酸类(Org. Lett., Vol. 10, No. 15, 2008；日本特开2009-254279号公报)：
[化1]
式中，Ra为氰基、酰胺基、羧基、C2-C7的烷氧基羰基或氢，R1和R2各自独立地为氰基、酰胺基、羧基、C2-C7的烷氧基羰基或氢。所结合的核酸为DNA时，该式I所示的取代咔唑基如下式1(a)所示，在β位与2-脱氧核糖的1位碳原子(C)结合：
[化2]
具体例子可举出3-氰基乙烯基咔唑-1’-β-脱氧核苷(CNVK)。
优选使用的光响应性核酸类2可举出具有下式II所示的基团的核酸类(Organic & Biomolecular Chemistry 2007, 5, 2583；Bioorganic & Medicinal Chemistry Letters 15 (2005), 1299-1301；日本特开2005-348645)：
[化3]
式中，R为-CN、-CONR1R2或-COOR3，所述R1-R3各自独立地为氢原子或烷基CnH2n+1 (n≥1)。这里，n的上限没有特别限定，例如n可以为1-7，优选1-5。所结合的核酸为DNA时，该式II所示的取代苯氧基如下式II(a)所示，在α位与2-脱氧核糖的1位碳原子(C)结合：
[化4]
R优选为-CN、-COOH、-COOMe，特别优选为-COOH、-COOMe。
通过具有这些式I或式II所示的基团，形成具备光偶联性的核酸类。该光偶联性的赋予可以是DNA，也可以是RNA，还可进一步是核苷酸类似物。这些光响应性核酸类可按照常规的核酸制造方法制造。
本发明的优选的实施方案中，光响应性核酸类具有下式III所示的基团作为碱基部分：
[化5]
式III中，Z表示O或NH，X和Y的至少一方表示选自羧基、低级烷氧基羰基、取代酰胺基和氰基的吸电子性基团，X和Y的其余基团表示氢原子。烷氧基羰基中的烷基可举出碳原子数1-10、优选1-5的低级烷基。取代基X、Y可以两方同时为相同或为不同的吸电子基团，还可以是取代基X、Y的仅其中一方为吸电子基团，另一方为氢原子。式III中，优选Z为O，X为氢原子，Y为羧基、低级烷氧基羰基、取代酰胺基或氰基。特别优选的碱基部分可举出5-乙烯基-2’-脱氧尿苷和5-羧基乙烯基-2’-脱氧尿苷。特别优选5-羧基乙烯基-2’-脱氧尿苷。
优选的另一实施方案中，光响应性核酸类具有下式IV所示的基团作为碱基部分：
[化6]
式IV中，R1为氢原子，R2和R3的至少其中一方表示选自羧基、低级烷氧基羰基、低级烯基、低级炔基、取代酰胺基、酰胺基、氰基和氢原子的基团，R2和R3的其余的基团表示氢原子或氰基。
R2和R3的至少一方优选为羧基，羧基与氢原子的组合作为R2和R3的优选组合。
R2和R3的至少一方优选为低级烷氧基羰基，低级烷氧基羰基的烷基部分可举出碳原子数1-10、优选1-5、进一步优选1-3、还进一步优选1-2、特别优选碳原子1的低级烷基。即，优选的低级烷氧基羰基的例子可举出：甲氧基羰基、乙氧基羰基、丙氧基羰基和丁氧基羰基等，进一步优选甲氧基羰基、乙氧基羰基和丙氧基羰基，还进一步优选甲氧基羰基和乙氧基羰基，特别优选甲氧基羰基。低级烷氧基羰基与氢原子的组合、特别是甲氧基羰基与氢原子的组合作为R2和R3的优选组合。
R2和R3的至少一方优选为低级烯基，低级烯基可举出碳原子数2-10、优选碳原子数2-5、进一步优选碳原子数2-3、特别优选碳原子数2的低级烯基。低级烯基与氢原子的组合、特别是乙烯基与氢原子的组合作为R2和R3的优选组合。
R2和R3的至少一方优选为低级炔基，低级炔基可举出碳原子2-10、优选碳原子数2-5、进一步优选碳原子数2-3、特别优选碳原子数2的低级烯基。低级炔基与氢原子的组合、特别是乙炔基与氢原子的组合作为R2和R3的优选组合。
R2和R3的至少一方优选为取代酰胺基，取代酰胺基可举出1取代的N-取代酰胺基，优选的例子可举出：N-烷基酰胺基、N-氨基烷基酰胺基。这样的N-烷基酰胺基、N-氨基烷基酰胺基的碳原子数为1-10，优选碳原子数1-5，进一步优选碳原子数1-3，特别优选碳原子数3，更特别优选N-氨基烷基酰胺基。取代酰胺基与氢原子的组合、特别是N-氨基(C1-C3烷基)酰胺基与氢原子的组合作为R2和R3的优选组合。
R2和R3的至少一方优选为酰胺基，酰胺基与氢原子的组合作为R2和R3的优选组合。R2和R3的至少一方优选为氰基，氰基与氰基的组合、以及氰基与氢原子的组合作为R2和R3的优选组合。
R2和R3的至少一方优选为氢原子，至少含有1个氢原子的组合、以及氢原子与氢原子的组合作为R2和R3的优选组合。
优选的另一实施方案中，光响应性核酸类具有下式V所示的基团作为碱基部分：
[化7]
式V中，R4为氢原子或低级烷基，R5和R6的至少一方表示选自羧基、低级烷氧基羰基、低级烯基、低级炔基、取代酰胺基、酰胺基、氰基和氢原子的基团，R5和R6的其余的基团表示氢原子或氰基。
R4特别优选为氢原子。
R4优选为低级烷基，低级烷基为碳原子数1-5、优选碳原子数1-3、进一步优选碳原子数1-2、特别优选碳原子数1。这样的低级烷基可举出：甲基、乙基和丙基等，优选甲基和乙基，特别优选甲基。
R5和R6的至少一方优选为羧基，羧基与氢原子的组合作为R5和R6的优选组合。
R5和R6的至少一方优选为低级烷氧基羰基，低级烷氧基羰基的烷基部分可举出碳原子1-10、优选1-5、进一步优选1-3、还进一步优选1-2、特别优选碳原子数1的低级烷基。即，优选的低级烷氧基羰基的例子可举出：甲氧基羰基、乙氧基羰基、丙氧基羰基和丁氧基羰基等，进一步优选甲氧基羰基、乙氧基羰基和丙氧基羰基，还进一步优选甲氧基羰基和乙氧基羰基，特别优选甲氧基羰基。低级烷氧基羰基与氢原子的组合、特别是甲氧基羰基与氢原子的组合作为R5和R6的优选组合。
R5和R6的至少一方优选为低级烯基，低级烯基可举出碳原子数2-10、优选碳原子数2-5、进一步碳原子数2-3、特别优选碳原子数2的低级烯基。低级烯基与氢原子的组合、特别是乙烯基与氢原子的组合作为R5和R6的优选组合。
R5和R6的至少一方优选为低级炔基，低级炔基可举出碳原子数2-10、优选碳原子数2-5、进一步优选碳原子数2-3、特别优选碳原子数2的低级烯基。低级炔基与氢原子的组合、特别是乙炔基与氢原子的组合作为R5和R6的优选组合。
R5和R6的至少一方优选为取代酰胺基，取代酰胺基可举出1取代的N-取代酰胺基，优选的例子可举出：N-烷基酰胺基、N-氨基烷基酰胺基。这样的N-烷基酰胺基、N-氨基烷基酰胺基为碳原子数1-10、优选碳原子数1-5、进一步优选碳原子数1-3、特别优选碳原子数3，特别优选N-氨基烷基酰胺基。取代酰胺基与氢原子的组合、特别是N-氨基(C1-C3烷基)酰胺基与氢原子的组合作为R5和R6的优选组合。
R5和R6的至少一方优选为酰胺基，酰胺基与氢原子的组合作为R5和R6的优选组合。
R5和R6的至少一方优选为氰基，氰基与氰基的组合、以及氰基与氢原子的组合作为R5和R6的优选组合。
R5和R6的至少一方优选为氢原子，至少含有1个氢原子的组合、以及氢原子与氢原子的组合作为R5和R6的优选组合。
在优选的另一实施方案中，光响应性核酸类具有下式VI所示的基团作为碱基部分：
[化8]
式VI中，R7为氢原子或低级烷基，R8和R9的至少一方表示选自羧基、低级烷氧基羰基、低级烯基、低级炔基、取代酰胺基、酰胺基、氰基和氢原子的基团，R8和R9的其余的基团表示氢原子或氰基。
R7特别优选为氢原子。
R7优选为低级烷基，低级烷基为碳原子数1-5、优选碳原子数1-3、进一步优选碳原子数1-2、特别优选碳原子1。这样的低级烷基可举出：甲基、乙基和丙基等，优选甲基和乙基，特别优选甲基。
R8和R9的至少一方优选为羧基，羧基与氢原子的组合作为R8和R9的优选组合。
R8和R9的至少一方优选为低级烷氧基羰基，低级烷氧基羰基的烷基部分可举出碳原子1-10、优选1-5、进一步优选1-3、还进一步优选1-2、特别优选碳原子数1的低级烷基。即，优选的低级烷氧基羰基的例子可举出：甲氧基羰基、乙氧基羰基、丙氧基羰基和丁氧基羰基等，进一步优选甲氧基羰基、乙氧基羰基和丙氧基羰基，还进一步优选甲氧基羰基和乙氧基羰基，特别优选甲氧基羰基。低级烷氧基羰基与氢原子的组合、特别是甲氧基羰基与氢原子的组合作为R8和R9的优选组合。
R8和R9的至少一方优选为低级烯基，低级烯基可举出碳原子数2-10、优选碳原子数2-5、进一步碳原子数2-3、特别优选碳原子数2的低级烯基。低级烯基与氢原子的组合、特别是乙烯基与氢原子的组合作为R8和R9的优选组合。
R8和R9的至少一方优选为低级炔基，低级炔基可举出碳原子数2-10、优选碳原子数2-5、进一步优选碳原子数2-3、特别优选碳原子数2的低级烯基。低级炔基与氢原子的组合、特别是乙炔基与氢原子的组合作为R8和R9的优选组合。
R8和R9的至少一方优选为取代酰胺基，取代酰胺基可举出1取代的N-取代酰胺基，优选的例子可举出：N-烷基酰胺基、N-氨基烷基酰胺基。这样的N-烷基酰胺基、N-氨基烷基酰胺基为碳原子数1-10、优选碳原子数1-5、进一步优选碳原子数1-3、特别优选碳原子数3，特别优选N-氨基烷基酰胺基。取代酰胺基与氢原子的组合、特别是N-氨基(C1-C3烷基)酰胺基与氢原子的组合作为R8和R9的优选组合。
R8和R9的至少一方优选为酰胺基，酰胺基与氢原子的组合作为R8和R9的优选组合。
R8和R9的至少一方优选为氰基，氰基与氰基的组合、以及氰基与氢原子的组合作为R8和R9的优选组合。
R8和R9的至少一方优选为氢原子，至少含有1个氢原子的组合、以及氢原子与氢原子的组合作为R8和R9的优选组合。
在优选的另一实施方案中，光响应性核酸类具有下式VII所示的基团作为碱基部分：
[化9]
式VII中，R10为氢原子或低级烷基，R11和R12的至少一方表示选自羧基、低级烷氧基羰基、低级烯基、低级炔基、取代酰胺基、酰胺基、氰基和氢原子的基团，R11和R12的其余的基团表示氢原子或氰基。
R10特别优选为氢原子。
R10优选为低级烷基，低级烷基为碳原子数1-5、优选碳原子数1-3、进一步优选碳原子数1-2、特别优选碳原子1。这样的低级烷基可举出：甲基、乙基和丙基等，优选甲基和乙基，特别优选甲基。
R11和R12的至少一方优选为羧基，羧基与氢原子的组合作为R11和R12的优选组合。
R11和R12的至少一方优选为低级烷氧基羰基，低级烷氧基羰基的烷基部分可举出碳原子1-10、优选1-5、进一步优选1-3、还进一步优选1-2、特别优选碳原子数1的低级烷基。即，优选的低级烷氧基羰基的例子可举出：甲氧基羰基、乙氧基羰基、丙氧基羰基和丁氧基羰基等，进一步优选甲氧基羰基、乙氧基羰基和丙氧基羰基，还进一步优选甲氧基羰基和乙氧基羰基，特别优选甲氧基羰基。低级烷氧基羰基与氢原子的组合、特别是甲氧基羰基与氢原子的组合作为R11和R12的优选组合。
R11和R12的至少一方优选为低级烯基，低级烯基可举出碳原子数2-10、优选碳原子数2-5、进一步碳原子数2-3、特别优选碳原子数2的低级烯基。低级烯基与氢原子的组合、特别是乙烯基与氢原子的组合作为R11和R12的优选组合。
R11和R12的至少一方优选为低级炔基，低级炔基可举出碳原子数2-10、优选碳原子数2-5、进一步优选碳原子数2-3、特别优选碳原子数2的低级烯基。低级炔基与氢原子的组合、特别是乙炔基与氢原子的组合作为R11和R12的优选组合。
R11和R12的至少一方优选为取代酰胺基，取代酰胺基可举出1取代的N-取代酰胺基，优选的例子可举出：N-烷基酰胺基、N-氨基烷基酰胺基。这样的N-烷基酰胺基、N-氨基烷基酰胺基为碳原子数1-10、优选碳原子数1-5、进一步优选碳原子数1-3、特别优选碳原子数3，特别优选N-氨基烷基酰胺基。取代酰胺基与氢原子的组合、特别是N-氨基(C1-C3烷基)酰胺基与氢原子的组合作为R11和R12的优选组合。
R11和R12的至少一方优选为酰胺基，酰胺基与氢原子的组合作为R11和R12的优选组合。
R11和R12的至少一方优选为氰基，氰基与氰基的组合、以及氰基与氢原子的组合作为R11和R12的优选组合。
R11和R12的至少一方优选为氢原子，至少含有1个氢原子的组合、以及氢原子与氢原子的组合作为R11和R12的优选组合。
以下列举这样的碱基的适合的结构式。可在本发明中使用的碱基并不限于以下例示：
[化10]
。
本发明中，探针是指具有公知的结合在一起的两个以上的核苷亚单位或核酸碱基亚单位的聚合物，包含DNA和/或RNA或其类似物。
类似物是非天然的核苷酸，与天然的核苷酸—脱氧核糖核苷酸(DNA)或核糖核苷酸(RNA)具有同样功能。即，核苷酸类似物与核苷酸同样，可通过磷酸二酯键形成链，且使用核苷酸类似物形成的引物或探针与只使用核苷酸形成的引物或探针同样，可用于PCR或杂交。
这样的核苷酸类似物例如有：PNA(聚酰胺核苷酸衍生物)、LNA (BNA)、ENA (2’-O,4’-C-亚乙基-桥接核酸)以及它们的复合物等。这里，PNA是将DNA或RNA的由磷酸和五碳糖形成的主链置换为聚酰胺链所得。LNA (BNA)是具有核糖核苷的2’部位的氧原子与4’部位的碳原子经由亚甲基结合的2个环状结构的化合物。
并不限于上述类似物，该探针只要是在杂交测定条件下与靶位点互补、可稳定杂交即可。这里，互补序列是指具有可在杂交条件下形成稳定的氢键的碱基序列，无需各探针的核酸间完全一致。
本发明的含有光响应性核酸类的探针(即光偶联探针)是在上述探针中至少含有一个光响应性核酸类的探针，该含有光响应性核酸类的探针具有与靶位点互补的序列。
本发明中，探针1(以下有些场合称为光偶联探针)是指具有与靶位点互补的序列、且含有上述光响应性核酸类的核酸类探针。该光偶联探针只要含有具上式I-VII所示的基团的光响应性核酸类即可。
本发明的光偶联方法是使存在于核酸样品中的靶位点、和与该靶位点具有互补的序列且含有光响应性核酸类的探针1在反应溶液中杂交，通过光照射进行光偶联的方法，其特征在于：该探针1抑制起因于该光响应性核酸类的自身缔合(即，自身内的光偶联)。
本发明的光偶联方法的方案1是交联型光偶联方法，是使核酸样品中的靶位点、和与该靶位点具有互补的序列且含有光响应性核酸类的探针1在反应溶液中杂交，通过光照射，在存在于该靶位点中的靶核酸、和该探针1中的该光响应性核酸类之间进行光偶联，可举出：使与该探针1具有高互补性的探针2共存，由此抑制该探针1在自身内的光偶联。
由此，可以使存在于该靶位点中的靶核酸、和该探针1之间的光偶联效率提高。例如在规定的光偶联条件下，通过使该探针2同未与靶位点杂交的未反应的该探针1杂交，防止该探针1自身缔合形成二次结构，从而抑制光照射导致的该探针1在自身内的光偶联。其结果，未与存在于靶位点中的靶核酸光偶联的未反应的该探针1仍可保持光偶联能力，因此通过持续长时间光照射、或者在改性或退火的温度调节循环中重复多次光照射，可以使光偶联效率提高。
上述高互补性是含有该光响应性核酸类的该探针1与该探针2为互补的关系，是指在规定的光偶联条件下，该探针1中的该光响应性核酸类在自身内发生光偶联的碱基与互补的该探针2杂交的状态。该探针2可以是完全互补的关系，虽优选与该探针1互补，但只要在规定的光偶联条件下与该探针1杂交即可，未必是完全互补的关系。例如，在构成该探针1的核酸类碱基中，由该探针1序列的种类或长度等信息来确定参与自身内的光偶联的位置时，该位置的碱基以外的碱基无需互补。
这里，该探针1中的光响应性核酸类与靶位点中的靶核酸发生光偶联，因此该光响应性核酸类必须设计成不与该探针2发生光偶联。从而，优选设计该探针2，使其不妨碍该光响应性核酸类与靶核酸的光偶联。例如可举出如下设计：该探针2通过杂交，抑制该含有光响应性核酸类的探针1的自身缔合，同时又不失去光响应性核酸类的结合能力。
光响应性核酸类可进行光偶联的碱基是公知的，或者本领域技术人员无需试错即可鉴定。例如式I或II所示的光响应性核酸类与胞嘧啶、胸腺嘧啶或尿嘧啶等嘧啶碱基发生光偶联，这是公知的，因此该探针2可以设计为与该探针1内的嘧啶碱基互补的序列来使用。探针2无需与该探针1中的该光响应性核酸类可发生自身内光偶联的所有的碱基互补，只要至少与在规定的光偶联条件下、该探针1中的该光响应性核酸类在自身内发生光偶联的碱基互补即可。
该探针2与该探针1杂交，因此必须是连续的碱基，这是公知的，因此，根据需要，该探针2必须与该探针1内的光响应性核酸类在自身内光偶联的核酸类的碱基以外的碱基也互补，这是不言自明的。
探针2可以以连续的一个序列抑制所述探针1自身内的光偶联，同时可以以与存在于探针1内的光响应性核酸类可发生光偶联的核酸具有互补性的、非连续的多个序列使用。本领域技术人员根据公知的方法，根据分析方法或光偶联条件，考虑可杂交的碱基序列或链长等，可以适当设计连续的一个序列或非连续的多个序列来使用。
光响应性核酸类可以配置于含有所述光响应性核酸类的探针的中央附近，也可以配置于该探针1的末端一侧。在所利用的分析系统中，可使用的该探针1的链长受到限制时(例如可杂交的最小链长等)，可以将光响应性核酸类配置于该探针1的末端一侧，由此将所述探针2设计为与该探针1稳定杂交。
将光响应性核酸类配置于末端，由于该光响应性核酸类的空间位阻，导致与通过杂交与该末端碱基进行光偶联的核酸的距离接近程度不充分，可能无法与靶位点光偶联时，更优选将该光响应性核酸类导入到比末端更内侧，更进一步优选导入到距离末端第2-5个碱基处。
在以往的技术常识中，探针与靶位点以外不具有互补序列，以及为了防止探针在自身序列内形成二次结构而在探针内不具有互补序列，这自不待言；在使用2个以上的探针时，这些探针之间互补序列少，这在探针设计时是非常重要的。
但是本发明的光偶联方法中，相对于与靶位点具有互补序列且含有光响应性核酸类的探针1，通过利用与靶位点存在竞争关系、与该探针1互补性高的探针2，可以使光偶联效率提高，这是令人意外的效果。
对于所述含有光响应性核酸类的探针1可否在自身内进行光偶联，本领域技术人员可以适当选择使用公知的方法。例如可以使用软件进行碱基的相邻计算或所产生的结构的自由能的计算，由此可预测所述光偶联探针的二次结构，筛选参与自身内光偶联的核酸。并且如后述实施例所述，可以研究在规定的光偶联条件下是否发生了自身内的光偶联。
探针2中也可以含有光响应性核酸类，可以设计为作为探针2具有抑制自身缔合的功能和作为含有光响应性核酸类的探针1(光偶联探针)具有光偶联的功能来使用。
含有光响应性核酸类的探针，当在显示光偶联的作用时可称为探针1，在显示抑制自身缔合的作用时可称为探针2。例如靶位点的有义链探针、该靶位点的反义链探针均含有光响应性核酸类时，在将该有义链探针作为探针1时，则该反义链探针成为探针2，在该反义链探针为探针1时，则该有义链探针发挥探针2的功能。
这种情况下，该探针2可以与该靶位点的反义链靶核酸进行交联型光偶联。
只要是抑制自身缔合的方法即可，并不限于上述方法，在多种分析方法中，可将本发明的光偶联方法适当变更使用。
例如序列为单链时(例如mRNA等)，光响应性核酸类只要含在探针1中即可，但靶位点为双链时(例如dsDNA等)，优选光响应性核酸类不仅含在探针1中，也含在探针2中。例如在将野生型序列进行光偶联、高灵敏度检测突变型序列时，以及进一步进行伴随核酸扩增反应的基因分析时，通过在野生型序列的有义链和反义链的两个链中进行光偶联，可以更高灵敏度地检测并鉴定突变型序列。
探针1和探针2均具有光响应性核酸类时(即，起光偶联探针功能)，探针1和探针2的非互补性区域中可以使用探针3，该探针3具有与探针1和/或探针2互补的序列，使存在于探针1和/或探针2内的光响应性核酸类无法在自身内光偶联。探针3可以与所述探针2的方案同样地设计使用。
本发明的光偶联方法的方案2是连接型的光偶联方法：将核酸样品中的靶位点、与该靶位点具有互补的序列且含有光响应性核酸类的探针1、以及与该靶位点具有互补的序列且含有靶核酸的探针4在反应溶液中相邻地配置，使它们杂交，通过光照射，在存在于该探针4中的靶核酸、和该探针1中的该光响应性核酸类之间进行光偶联，其中可举出：使与该探针1具有高互补性的探针2共存，由此抑制该探针1在自身内的光偶联。
通过使用与该探针1具有互补序列的探针2，其与存在于插入了光响应性核酸类的末端的相对一侧的末端的碱基结合，可以抑制自身序列内的缔合。
作为该连接型的光偶联方法，可以将WO2007/058326公报所述的方法结合到本申请中使用。除了光偶联方法为该连接型之外，本领域技术人员将本发明的光偶联方法的方案1适当改变，可容易地实施该方案2。使用如上所述的连接型的光响应性核酸类的方法中，该探针1在其3’末端或5’末端具有光响应性核酸类，上述该探针1和该探针4与靶位点杂交，除了这种情况以外，也可以作为防止该探针1内的光响应性核酸类与嘧啶碱基由于空间配置接近时发生缔合而发生光偶联的使用方法。
以下对连接型的光偶联方法进行详述。
含有光响应性核酸类的探针1和含有靶核酸的探针4在规定的靶位点相邻接配置以杂交，且该光响应性核酸类与该靶核酸相邻接地配置，以可通过光照射进行光偶联。
此时，该光响应性核酸类优选设计为位于探针1的末端。探针4优选设计为：与探针1相邻接一侧的末端为可光偶联的靶核酸。
优选该探针1和探针4以间隙小于一个碱基的方式互相接近，可在对两探针进行光照射时构成通过光偶联结合的、连续的一条核酸序列。
含有光响应性核酸类的该探针1、和含有靶核酸的该探针4通过光照射偶联，由此生成更稳定的、与靶位点的碱基序列互补的碱基序列。
例如，使用具有5-羧基乙烯基-2’-脱氧尿苷(标记为CVU)作为光响应性核酸类的探针1时，该CVU与作为靶核酸的嘧啶碱基显示光偶联性，与胸腺嘧啶的碱基部分形成碳-碳双键。
将作为靶位点且作为检测对象的核酸序列、含有该CVU的该探针1、含有靶核酸的该探针4混合，使它们杂交。于是，由于碱基序列的互补性，该探针1和该探针4相对于靶位点可光偶联地邻接排列。在该状态下进行光照射，则由于光反应而发生光偶联，形成CVU与作为靶核酸的嘧啶碱基通过共价键偶联成单链的状态。
这样的连接型的光偶联方法中，如上所述，可以使用可在探针1和探针4的各自末端一侧发生光偶联的光响应性核酸类，例如可使用式III-VII所示的化合物作为该光响应性核酸类。
所述方案1和所述方案2可分别单独实施，该方案2也可以与该方案1组合实施。例如可举出：含有光响应性核酸类的探针1进行交联型的光偶联、含有光响应性核酸类的探针2进行连接型的光偶联的方法，或者含有光响应性核酸类的探针1进行连接型的光偶联、含有光响应性核酸类的探针2进行交联型的光偶联的方法等。
本发明的光偶联方法的方案3中，在所述光偶联探针可以与靶位点杂交的前提下设计该光偶联探针，将在规定的光偶联条件下的光偶联探针内的光响应性核酸类发生自身缔合的核酸置换为不与该光响应性核酸类光偶联的核酸，这样也可以抑制自身内的光偶联。为了防止有义链探针和反义链探针在探针之间发生光偶联，还可以置换为不与该光响应性核酸类发生光偶联的核酸来设计探针，抑制探针间的光偶联。例如该光响应性核酸类为CNVK时，可以由嘧啶碱基置换为腺嘌呤、鸟嘌呤或肌苷等的嘌呤碱基来实施。被置换的碱基数目可根据存在于靶位点或探针内的嘧啶碱基数目来适当设定。
另外，光响应性核酸类为CNVK时，也可以使用将可光偶联的碱基—胞嘧啶或胸腺嘧啶的嘧啶环人工转换得到的合成碱基。此时，不使其发生光照射导致的[2+2]加成环化反应，由此可以抑制光偶联探针在自身序列内的光偶联。这种情况下，可使用的合成碱基例如可举出：将嘧啶环的5位或6位的碳置换为氮的5-偶氮-胸腺嘧啶、6-偶氮-胸腺嘧啶、5-偶氮-胞嘧啶、6-偶氮-胞嘧啶等的合成碱基等。
该方案3可单独实施，也可以与所述方案1和/或所述方案2组合实施。
本领域技术人员根据公知的信息考虑所使用的光响应性核酸类以哪种碱基作为靶标或者通过怎样的化学反应机理进行光偶联等的性质，可以对作为靶标的碱基实施置换或修饰，适当使用合成碱基。
本发明的光偶联方法可以在含有具缓冲作用的盐的反应溶液中进行。具缓冲作用的盐可举出：二甲胂酸盐、磷酸盐、Tris盐。具缓冲作用的盐的浓度优选在5-250mmol/L的范围。还优选含有碱金属和/或碱土类金属的盐。碱金属和/或碱土类金属的盐可举出：氯化钠和氯化镁。进一步通过在反应溶液中加入DMSO或甲酰胺等有机溶剂，可以促进含有光响应性核酸类的探针与靶位点的特异性光结合反应。其中，优选避免会阻碍之后或同时进行的基因分析方法的物质的混入。在与核酸扩增反应同时进行时，特别优选为适合核酸扩增反应的反应组成。
本发明的光偶联方法中的光照射通常是350-380nm的范围，优选含有365nm波长的光，特别优选为365nm的单波长激光。在适合的实施方案中，优选通过光照射进行的光反应为1秒-数秒以内。但是考虑容器和溶液的透光性，可以进一步增加时间。
所述光照射可进行1次以上，可多次重复以提高光偶联效率。本领域技术人员可根据所利用的基因分析方法来适当选择并实施。例如在PCR法中，通过对每个扩增循环重复进行光照射，可以更确实地抑制野生型核酸的扩增。可以在整个扩增循环中照射光，也可以自任意的扩增循环开始或结束照射。
光照射时波长的选择和输出的选择也是重要的，以确保与靶核酸进行了光偶联的光偶联探针不会由于光照射导致的光平衡反应而发生开裂。关于光照射时波长的选择和输出的选择，本领域技术人员无需实施过多的研究即可选择。
根据其它优选的实施方案，通过局部提高所述探针浓度，可以高效率且迅速地进行所述探针与所述靶位点的缔合，结果可以使光偶联效率提高。
例如核酸在反应溶液中带负电，因此通过与阴离子性物质共存，可以局部提高实质密度，使光偶联效率提高。如阴离子性物质这样，带负电的物质与聚乙二醇或葡聚糖这样不带电的非离子性聚合物相比，可以促进杂交，提高光偶联效果。
这样的杂交促进剂可以使用公知的阴离子性物质，例如可以使用聚丙烯酸、聚甲基丙烯酸或其盐。阴离子性物质只要存在于进行光偶联的反应溶液中即可，在对核酸样品中的对象基因进行分析的基因分析方法中，为了不对光偶联以外的反应有影响，本领域技术人员可以适当研究确定适当的浓度范围并使用。例如，聚丙烯酸盐优选约0.2-10%(以相对于容量的重量百分率(w/v)表示，以下相同)的范围，更优选0.5-5%左右。聚甲基丙烯酸盐中，优选约1.0-50%的范围，更优选5-25%左右。
这些聚合物的分子量涉及较广范围，优选为约5,000-100,000道尔顿，更优选分子量约5,000-10,000道尔顿。为了促进本发明中的杂交，可以使用等价的各种丙烯酸盐聚合物，可以是丙烯酸盐的各种均聚物和共聚物，可使用预期具有杂交促进性的化合物。
本领域技术人员应了解，所述杂交效率的提高方法不仅对光偶联条件下的靶位点与含有光响应性核酸类的探针的杂交有效，对所有的杂交均有效。
本发明的光偶联中，通过高效率且迅速地进行所述光偶联探针与所述靶位点的缔合，可以使光偶联效率提高。
例如，与核酸样品中的含有靶位点的核酸序列的存在量无关，通过提高含有光响应性核酸类的光偶联探针的浓度，可以使光偶联效率提高。这种情况下，光偶联时的探针浓度优选为约0.1μmol/L以上，更优选为约1μmol/L以上，最优选为约10μmol/L以上。
如上所述，含有光响应性核酸类的光偶联探针抑制自身序列内的光偶联，或局部提高光偶联探针的浓度以与靶位点有效杂交，由此可使光偶联效率提高。
本发明中的光偶联方法可以用于公知的对核酸样品中的对象基因进行分析的基因分析方法。这不仅是鉴定对象基因的有无或其序列，也包含该基因的纯化或选择性回收，本领域技术人员应了解其在设计变更的范围内。
所述纯化或选择性回收的例子可举出：该基因的纯化、或选择性收集核酸样品中含有靶核酸类的核酸的前处理工序。在这些前处理工序中的应用对于以下所述的基因分析方法极为有效。因此，可以在该前处理后继续实施的基因分析方法、基因检测方法中实现高灵敏度、准确的分析，优选。
可在本发明中使用的基因分析方法可采用公知的基因检测方法或核酸扩增方法等。基因检测方法或核酸扩增方法已知有各种方法，可列举Invader法、Sniper法、TaqMan PCR法、杂交探针(Hybridization Probe)法、SNPIT法、焦磷酸微测序(Pyrominisequencing)法、变性高效液相色谱(Denaturing High Performance Liquid Chromatography, DHPLC)法、MALDI-TOF/MS法、NanoChip法等作为可迅速且以高通量进行分析的方法。作为可在本发明中使用的其它基因分析方法，例如当认为在靶位点具有未知的突变型核酸时，可以确定检测区域的扩增产物的碱基序列，由此判定突变型核酸的有无。
本发明的基因检测方法的利用可举出：对与靶位点互补且含有光响应性核酸类的光偶联探针进行荧光标记，使其杂交，通过光照射，在该靶核酸与该光偶联探针之间进行光偶联，检测荧光，由此检测该基因的方法。本领域技术人员可根据基因分析的目的，将本发明的光偶联方法适当变更实施，还可以容易地用于公知的基因检测方法。
本发明中，核酸扩增方法是指利用公知的聚合酶反应的模板核酸的扩增反应，例如在WO2012/033190号公报中公开的公知的核酸的扩增抑制方法中，可以利用本发明的光偶联方法。
作为本发明的光偶联方法在核酸的扩增方法中的利用，可列举在以下方法中的利用：在使用可扩增含有靶位点的检测对象核酸序列(扩增用核苷酸序列)的引物实施公知的核酸扩增方法时，根据检测对象基因的核酸的突变，来抑制某核酸序列(例如野生型核酸)的扩增，而只选择性地扩增除此以外的核酸序列(例如突变型核酸)的方法。
以野生型核酸或突变型核酸的哪一种作为扩增抑制对象，这可根据其目的适当选择，没有特别限定，例如核酸样品中的存在比例有较大倾向时，通过抑制大量存在的核酸(例如野生型核酸)的扩增，只选择性地扩增微量存在的核酸(例如突变型核酸)，由此可以检测微量存在的核酸的有无。
例如，根据本发明的光偶联方法，对于作为扩增抑制对象的野生型核酸(具有靶位点)，使与该靶位点具有互补的序列且含有光响应性核酸类的探针1与其杂交，通过光照射，使该靶核酸与该探针1光偶联，由此抑制该野生型核酸的扩增，只选择性地扩增作为检测对象的突变型核酸。
还如TaqMan法中使用的TaqMan探针，可根据需要用荧光物或消光物质标记序列中的碱基。利用针对突变型核酸的TaqMan探针等公知的检测用探针，不仅可以检测对象核酸，还可以进行定量。
采用本发明的光偶联方法的特定核酸扩增抑制方法可以与其它核酸扩增方法同时进行，也可以作为核酸扩增方法的前处理阶段实施。本领域技术人员可根据基因分析的目的，适当改变本发明的光偶联方法来实施，还可以容易地应用于公知的基因扩增方法。
所述选择性核酸扩增中使用的引物是可以对突变型核酸扩增用核苷酸序列进行扩增的引物，同时在具有光响应性核酸类的探针发生光偶联之前的野生型核酸中，它也是可对野生型核酸扩增用核苷酸序列进行扩增的引物。
具有野生型序列的分子通过光照射与具有光响应性核酸类的光偶联探针进行光偶联，因此，不会从交联的碱基向3’末端一侧进行延伸反应，不会被扩增。而具有突变型序列的分子的大部分不与具有光响应性核酸类的光偶联探针进行光偶联，因此发生延伸反应，结果进行选择性的核酸扩增。
可在核酸扩增法中使用的扩增引物是可通过PCR对含有1或2个以上靶位点的扩增用核苷酸序列进行扩增的引物，是夹着扩增用核苷酸序列的2种引物。例如可以是由与扩增用核苷酸序列的上游端区具有同源的核苷酸序列的正向引物、和与扩增用核苷酸序列的下游端区具有互补的核苷酸序列的反向引物构成的2种引物。PCR中使用的该2种引物各自的浓度只要是可获得双链核酸作为PCR产物的浓度比即可，没有特别限定，优选以等浓度使用。
PCR中使用的这些引物可以通过常规方法，根据含有扩增用核苷酸序列的核苷酸序列的序列信息设计并合成。PCR中使用的这些引物是选自核苷酸和核苷酸类似物的1种以上通过磷酸二酯键连接而成的引物。引物的长度可考虑引物的Tm值、扩增核苷酸序列的种类等适当确定，优选10-100个分子连接而成。
PCR反应中使用的试剂的种类、量、制备方法和反应条件等的方案可按常规方法进行。PCR中使用的DNA聚合酶只要是在常规PCR中使用的DNA聚合酶即可，没有特别限定，优选为耐热性聚合酶。
具有光响应性核酸类的探针是通过光照射与靶位点进行光偶联来抑制聚合酶的延伸反应，因此具有光响应性核酸类的探针本身无需对核酸酶活性具有抵抗性。因此也可以使用具有核酸酶活性的聚合酶。不过，具有光响应性核酸类的探针发挥引物功能、可发生聚合酶的延伸反应时，优选考虑Tm值，使得探针可在发生聚合酶延伸反应的温度下从靶分子上解离，或者通过在具有光响应性核酸类的探针的3’末端修饰抑制延伸反应的物质来使其不发挥扩增引物的功能。为了本发明的光偶联方法使用探针1、探针2、探针3、探针4时，对于这些探针也同样优选考虑Tm值以及在3’末端修饰抑制延伸反应的物质，以使其不发挥扩增引物的功能。
PCR反应中，可以以适合常规PCR扩增反应的反应组成实施。为了促进选择性扩增反应，还可进一步在反应液中加入DMSO或甲酰胺等对杂交条件产生影响的物质。
本发明的光偶联试剂盒以能够实施本发明的光偶联方法的方式构成。具体来说，实施所述本发明光偶联方法的方案1、所述方案2、所述方案3等。构成该光偶联试剂盒的探针1、探针2、探针3、探针4是指与本发明的光偶联方法中的探针1、探针2、探针3、探针4相同。
本发明的光偶联试剂盒1至少含有：与核酸样品中的靶位点具有互补的序列、与该靶位点中的靶核酸进行光偶联的含有光响应性核酸类的探针1(光偶联探针1)，和与该探针1具有高互补性的探针2。
还可以含有含光响应性核酸类的探针2。这种情况下，该探针2发挥光偶联探针的功能。
可进一步含有发挥光偶联探针功能、与所述探针1和/或所述探针2具有互补序列的探针3。
本发明的光偶联试剂盒2至少含有：与核酸样品中的靶位点具有互补的序列、含有光响应性核酸类的探针1(光偶联探针)，与该探针1的该光响应性核酸类进行光偶联、含有靶核酸的探针4，和与该探针1具有高互补性的探针2。
还可以含有含光响应性核酸类的探针2。这种情况下，所述探针2也发挥光偶联探针的功能。
还可进一步含有发挥光偶联探针功能、与所述探针1和/或所述探针2具有互补的序列的探针3。
本发明的光偶联试剂盒3至少含有与核酸样品中的靶位点具有互补的序列、含有光响应性核酸类的探针1(光偶联探针)，该光偶联探针是将该光偶联探针内的光响应性核酸类可发生自身缔合的核酸置换为不与该光响应性核酸类光偶联的核酸，从而抑制该光偶联探针自身内的光偶联。
本发明的光偶联试剂盒中可根据所利用的基因分析方法含有反应溶液、标记酶、核酸扩增用的聚合酶、核酸扩增用的引物等。本领域技术人员可根据公知的试剂盒的构成进行适当选择、设计。
实施例
以下，使用CNVK作为光偶联探针的光响应性核酸类，以表皮生长因子受体(EGFR)基因序列的一部分作为靶位点，以此情形为例进行详细说明，但本发明的范围并不限于此。不脱离本发明的精神的情况下可以加入任何变更、改良或改变，这是本领域技术人员所了解的。
本实施例中，以氨基酸单字母标记和以该氨基酸的位置编号进行标记时，野生型是用原有氨基酸位置文字标记和该氨基酸位置编号，除此之外进一步组合被取代的氨基酸单字母标记时，是表示突变型。
[实施例1：光偶联探针在自身序列内的光偶联确认]
实施例1-1. 光偶联探针的制备
合成由与EGFR基因上的外显子21(ex.21)区的一部分为相同序列的100聚体构成的寡核苷酸(SEQ ID NO: 1)，作为光偶联对象的模板。
[SEQ ID NO: 1]100聚体寡核苷酸：
由可与该合成寡核苷酸杂交的16聚体构成的光偶联探针如下制备。作为光偶联探针，对光响应性探针的光响应性核酸类3-氰基乙烯基咔唑-1’-β-脱氧核苷(CNVK)的导入位置进行改变，设计了4种(SEQ ID NO: 2-5)。这些PREP的序列如表1所示。CNVK导入到PREP中的位置以n表示。
CNVK按照日本特开2009-254279号公报所述的方法制备，探针的合成委托FASMAC Co., Ltd.公司进行。另外CNVK的结构式如图1所示。
[表1]
。
实施例1-2. 对光偶联探针的光照射处理
将实施例1-1.中合成的PREP用TE溶解为100μmol/L，分取各200pmol，分别装入0.2mL管中。对于各样品，按以下条件实施光照射。光偶联波长365nm的光照射是使用UV-LED照射器(ZUV-C30H：Omron Corporation)，开裂波长312nm的光照射是使用(紫外透照仪) (Funakoshi Co., Ltd.)。
条件1：未进行光照射
对各PREP未进行光照射。
条件2：光偶联光照射
在室温下，对各PREP照射1分钟365nm的光。
条件3：光偶联光照射+光偶联开裂光照射
对于实施了条件2的光照射的各PREP，在室温下照射5分钟312nm的光。
实施例1-3. 电泳评价
为了观察光照射处理的影响，将在实施例1-2.的条件下处理的各PREP用无菌水稀释为10μmol/L，然后使用MultiNA(岛津制作所)进行微芯片电泳。其凝胶图像如图2-图5所示。
在全部4种PREP中，通过照射光偶联波长的光，电泳的条带向低分子一侧位移，这表示PREP的构象发生了明显变化。
照射光偶联波长的光后再照射光偶联开裂波长的光，则可确认移向低分子一侧的条带又恢复至照射光偶联波长的光之前(即未进行光照射)的条带位置。这可以认为是由于在自身序列内形成的光偶联发生开裂，恢复原有状态。
该现象在全部4种PREP中均同样得到确认，因此可以认为是与作为光偶联部位的CNVK导入位置无关地发生的。
[实施例2：进行了光照射处理的光偶联探针的光偶联效率评价]
实施例2-1. 光偶联探针的制备
评价对象的光偶联探针使用实施例1-2.中制备的PREPa.-PREPd.。
实施例2-2. 光偶联探针的光偶联反应
分取2μL 100pmol/L的合成寡核苷酸作为靶位点，加入到0.2mL试管中，加入2μL 10μmol/L的PREP(在实施例1-2.所述各条件下进行了处理)，以1×PCR缓冲液(10mmol/L Tris-HCl(pH8.3)、50mmol/L KCl、1.5mmol/L MgCl2、0.001%(W/V)明胶)的终浓度，使总量为20μL。
将其在95℃下加热处理5分钟，在50℃下静置5秒，然后在50℃下用UV-LED照射30秒365nm的光。同时准备了未照射光的样品作为对照。
实施例2-3. 定量PCR反应溶液的制备和反应条件
在20μL实施例2-2.中制备的样品(包含对照样品)的各制备液中分别加入80μL无菌水，充分混合后以其中的各5μL作为模板，通过引物EGFR Ex.21F和Ex.21R、使用Light Cycler (Roche)实施定量PCR反应。
PCR反应试剂使用Light Cycler Fast Start DNA Master SYBER Green I (Roche)。引物的序列如下所述：
EGFR ex.21F: 5’-GAACGTACTGGTGAAAACACC-3’(SEQ ID NO: 6)
EGFR ex.21R: 5’-GCATGGTATTCTTTCTCTTCC-3’(SEQ ID NO: 7)。
实施例2-4. 光偶联效率的评价
以实施例2-2.中实施了光偶联处理的样品、和未实施光偶联处理的对照样品为模板，分别按照实施例2-3.的条件实施定量PCR反应。PREP发生光偶联的靶位点是通过共价键交联的位置，聚合酶的延伸反应终止，因此不能发挥扩增反应的模板功能。因此在定量PCR反应中，通常是以比未实施光偶联处理的对照样品更慢的循环产生荧光信号。因此可按照下式计算通过PREP光偶联的靶位点的量，标记为光偶联效率：
ΔCt=光偶联处理后靶位点的Ct值-未进行光偶联处理的靶位点的Ct值
光偶联效率(%)=(1-2ΔCt)×100。
这样，各PREP与靶位点的光偶联效率的评价结果表示在表2中。
[表2]
。
由该结果可以确认，在任一种PREP中，照射1分钟光偶联波长后，光偶联效率显著降低。经确认，照射5分钟开裂波长，则一度失去的光偶联效率重新恢复，成为可光偶联的状态。
由该结果可以认为，对PREP照射光偶联波长，则PREP在自身序列内发生光偶联，其结果，PREP的光偶联能力消失，由此使其与靶位点的光偶联效率大大降低。
进一步对在自身序列内发生了光偶联的PREP照射光偶联开裂波长312nm的光，则在自身序列内形成了的光偶联发生开裂，恢复为原有的状态，因此降低的光偶联效率得以恢复。
在任一种PREP中均可见光偶联能力的消失和恢复，由此显示，无关CNVK导入到PREP中的位置，PREP在自身内发生了光偶联和开裂。
这些结果与实施例1中在光偶联反应后电泳条带移动、照射光偶联开裂波长的光后电泳条带恢复至原有位置的事实一致。
[实施例3：只由嘌呤碱基构成的光偶联探针中的自身序列内的光偶联确认]
合成不与光响应性核酸类CNVK光偶联、只由嘌呤碱基构成的PREP，可确认，合成的PREP即使照射光偶联波长的光，在自身序列内也不发生光偶联。
实施例3-1. 光偶联探针的制备
作为光偶联探针，制备只由嘌呤碱基腺嘌呤(A)或鸟嘌呤(G)构成的以下3种PREP。合成的PREP的序列表示在表3中。此时，光响应性核酸类CNVK的导入位置(X)和链长(16聚体)是统一的。
[表3]
。
实施例3-2. 对光偶联探针的光照射处理
将实施例3-1.中合成的各PREP用TE溶解为100μmol/L，分取各200pmol分别加入到0.2mL管中。对于各样品，按以下条件实施光照射。
光偶联波长365nm下的光照射是使用UV-LED照射器。
条件1：未进行光照射
对各PREP未进行光照射。
条件2：光偶联光照射
在4 ℃下，对各PREP照射3分钟365nm的光。
实施例3-3. 电泳评价
为了观察光照射处理的影响，将在实施例3-2.的条件下处理的各PREP用无菌水稀释为10μmol/L，然后使用MultiNA进行微芯片电泳。其凝胶图像如图6-图8所示。
在3种PREP中，在照射光偶联波长的光前后未见电泳条带移动度的不同。由此可以推测：只由嘌呤碱基构成的PREP，探针的序列内不存在可与光响应性核酸类CNVK结合的碱基，因此未发生自身序列内的光偶联。
[实施例4：利用互补序列的光偶联探针抑制自身序列内的光偶联]
实施例4-1. 光偶联探针的制备
以野生型序列EGFR基因上的相当于第790号苏氨酸(T790)、第858号亮氨酸(L858)和第861号亮氨酸(L831)的核酸序列作为靶位点，设计与EGFR基因的编码链即有义链杂交的反义链(AS链)的光偶联探针PREP，同时也设计与EGFR基因的反义链杂交的有义链(S链)的光偶联探针PREP。此时，使有义链的PREP和反义链的PREP的互补性按以下组合进行变化，在互相的光偶联探针之间不发生光偶联的位置配置实施例1所述的CNVK。图9表示实际作为光偶联探针使用的PREP序列及其互补性的示意图。图中的AS链是指与野生型EGFR基因序列的有义链互补，S链是指与野生型EGFR基因序列的反义链互补。
(1)L861：互补性低的组合的例子
L861 AS链：5’-CTCTTCCGCACCCAnCAG-3’(SEQ ID NO: 11)
L861 S链：5’-TTGGGCTGGCCAAnCTGC-3’(SEQ ID NO: 12)
(2)T790：互补性高的组合的例子
T790 AS链：5’-TGAnCTGCGTGATGAG-3’(SEQ ID NO: 13)
T790 S链：5’-CAnCTCATCACGCAGC-3’(SEQ ID NO: 14)
(3)L858：互补性为(1)和(3)中间的组合的例子
L858 AS链：5’-CAnTTTGGCCAGCCC-3’(SEQ ID NO: 15)
L858 S链：5’-CAnTTTGGGCTGGCCA-3’(SEQ ID NO: 16)。
实施例4-2. 对光偶联探针的光照射处理
对光偶联探针的光照射处理按以下条件实施。
条件1：AS链，未进行光照射
将与实施例4-1.中合成的EGFR基因的有义链杂交的AS链PREP分别用TE制备为10μmol/L，以此作为条件1。
条件2：AS链，光照射
将与条件1同样制备的各AS链PREP用热循环仪(Applied制造)置于4℃，然后用UV-LED照射器照射3分钟365nm的光，以此作为条件2。
条件3：S链，未进行光照射
将与实施例1-1.中合成的EGFR基因的反义链杂交的S链PREP分别用TE制备为10μmol/L，以此作为条件3。
条件4：S链，光照射
将与条件3同样制备的各S链PREP用热循环仪置于4℃，然后用UV-LED照射器照射3分钟365nm的光，以此作为条件4。
条件5：S链+AS链，未进行光照射
将与实施例4-1.中合成的EGFR基因的有义链杂交的AS链PREP、和与EGFR基因的反义链杂交的S链PREP混合，终浓度分别为10μmol/L，以此作为条件5。
条件6：S链+AS链，光照射
将与条件5同样混合的各PREP溶液用热循环仪置于4℃，然后用UV-LED照射器照射3分钟的光，以此作为条件6。
实施例4-3. 电泳评价
使用MultiNA，对实施例4-2.条件下制备的PREP试样进行微芯片电泳。其凝胶图像如图10-图12所示。图10是(1)以L861为靶位点的PREP的组合的结果，图11是(2)以T790为靶位点的结果，图12是(3)以L858为靶位点的结果。
(1)L861：互补性低的组合
由电泳结果可见，在互补性低的组合中，单独针对有义链的PREP以及单独针对反义链的PREP在光照射处理后均可见条带位移，显示自身序列内发生光偶联(图10的泳道1-4)。
在将针对有义链的PREP和针对反义链的PREP混合的条件5下，在与条件1和条件3中所见的、单独针对有义链的PREP和单独针对反义链的PREP的相同位置上可见条带，因此可以认为针对有义链的PREP和针对反义链的PREP未杂交。
在将针对有义链的PREP和针对反义链的PREP混合并光照射的条件6下，在与对针对有义链的PREP进行光照射处理的条件2和对针对反义链的PREP进行光照射处理的条件4的条带相同位置上可见条带。
(2)T790：互补性高的组合
通过电泳的结果，在互补性高的组合中，单独针对有义链的PREP以及单独针对反义链的PREP在光照射处理后均可见条带位移，显示自身序列内发生光偶联(图11的泳道1-4)。
在将针对有义链的PREP和针对反义链的PREP混合的条件5下，相对于未进行光照射的条件1的单独针对有义链的PREP、和未进行光照射的条件3的单独针对反义链的PREP，在不同位置上可见一条条带，由此可以推测针对有义链的PREP和针对反义链的PREP发生了杂交。
在对针对有义链的PREP和针对反义链的PREP混合物进行光照射的条件6下，在与光照射之前相同的位置可见条带，在针对有义链的PREP和针对反义链的PREP通过光照射在自身序列内发生光偶联时所检测出的位置上未见条带。
由此显示，光照射时，如果针对有义链的PREP和针对反义链的PREP发生杂交，则自身序列内不发生光偶联。
(3)L858：互补性为(1)和(2)中间的组合
由电泳的结果显示，在互补性为中间的组合中，单独针对有义链的PREP和单独针对反义链的PREP均在光照射后可见条带位移，显示自身序列内发生光偶联(图12的泳道1-4)。
在将针对有义链的PREP和针对反义链的PREP混合的条件5中，相对于未进行光照射的条件1的单独针对有义链的PREP、和未进行光照射的条件3的单独针对反义链的PREP，在不同的位置可见条带，由此可以推测针对有义链的PREP和针对反义链的PREP发生了杂交。
在对针对有义链的PREP和针对反义链的PREP混合物进行光照射的条件6中，在与光照射前不同的位置可确认2条条带。
低分子一侧的条带(下面的条带)与在对单独针对有义链的PREP或单独针对反义链的PREP进行光照射使自身序列内发生光偶联时的条带位置相同，因此可以认为是来源于针对有义链的PREP或针对反义链的PREP的自身缔合的条带。
高分子一侧的条带(上面的条带)在与来自单独针对有义链的PREP或单独针对反义链的PREP的自身缔合的条带不同的位置上可见。这可以认为，针对有义链的PREP和针对反义链的PREP之间的杂交得以保持，但是在未能杂交的碱基部分进行光偶联，条带发生了位移。
由以上可以确认，将互补性低的PREP混合使用时，不管是分别单独使用针对有义链的PREP或针对反义链的PREP，或者将各PREP混合使用，PREP均在自身序列内发生光偶联。
还显示，针对有义链的PREP和针对反义链的PREP有中等程度的互补性时，若未杂交的碱基中存在可与CNVK光偶联的胞嘧啶或胸腺嘧啶等的嘧啶碱基，则在自身序列内发生光偶联。
由此认为，为了抑制光偶联探针在自身序列内光偶联，提高光偶联探针间的互补性是有效的。还认为，可与CNVK光偶联的嘧啶碱基被互补链覆盖而不以可与CNVK结合的状态存在，这也是有效的。
[实施例5：使用互补性高的光偶联探针进行的光偶联的确认]
实施例5-1. 光偶联探针的制备
使用以T790为靶位点的实施例4-1.(2)中制备的互补性高的组合PREP。
实施例5-2. EGFR外显子20(ex.20)区内的野生型基因片段的制备
按照常规方法，由健康人末梢血制备人基因组DNA，以此为模板，使用引物对EGFR ex.20F和EGFR ex.20R，按照常规PCR反应条件扩增含有相当于该T790的核酸序列的EGFR外显子20(ex.20)区。PCR反应中使用的引物序列如下所示：
EGFR ex.20F：5’-CAGAAGCCTACGTGATGG-3’(SEQ ID NO: 17)
EGFR ex.20R：5’-ACCTTTGCGATCTGCACAC-3’(SEQ ID NO: 18)。
按照所附方案，将所得PCR扩增产物插入pGEMT easy Vector (Promega KK)内，进行克隆。
以该质粒为模板，使用上述引物对EGFR ex.20F和EGFR ex.20R，按照常规PCR反应条件进行扩增，使用PCR纯化试剂盒(PCR Purification Kit, Qiagen)纯化，由此得到直链状的EGFR ex.20的野生型基因片段(SEQ ID NO: 19)。
使用NanoDrop分光光度计(Thermo Scientific)测定使用PCR纯化试剂盒(Qiagen)纯化的EGFR ex.20的野生型基因片段的重量浓度，考虑扩增片段长度，计算各基因片段的拷贝数，将其作为野生型核酸，用作以下反应的研究模板。
[SEQ ID NO: 19] EGFR ex.20野生型片段
。
实施例5-3. 光偶联反应时的试剂组成
在0.2mL管中分别加入2μL实施例5-2.中制备的靶核酸(1×107拷贝/μL)，各2μL制备为10μmol/L、实施例4-1.(2)所示的以相当于T790的核酸碱基为靶标的T790 AS链(SEQ ID NO: 3)和T790 S链(SEQ ID NO: 4)的PREP，以1×PCR缓冲液(10mmol/L Tris-HCl(pH8.3)、50mmol/L KCl、1.5mmol/L MgCl2、0.001%(W/V)明胶)终浓度，使总量为20μL。
实施例5-4. 光偶联反应时的条件
对实施例5-3.中制备的核酸样品溶液，在2种温度条件下实施光偶联波长365nm的光照射。同时准备了未进行光照射的样品作为对照，。
条件1：50℃下的光照射
在95℃下加热处理3分钟，然后在50℃下静置30秒，然后在50℃下照射30秒的光。
条件2：4℃下的光照射
在95℃下加热处理3分钟，然后在4℃下静置1分钟，然后在4℃下光照射30秒。
实施例5-5. 通过定量PCR确认光偶联量
分别向20μL实施例5-4中的实施了光偶联反应的各反应液中加入80μL无菌水，充分混合，然后以其中的各5μL为模板，使用Light Cycler(LC 480 Ver2：Roche)实施定量PCR反应。
作为定量PCR用反应液，将以下试剂混合来制备，加入无菌水制备成每1个样品的最终液量为25μL。在12.5μL的2×Premix Ex Taq(注册商标)(Takara-Bio)中分别加入5pmol EGFR ex.20F和EGFR ex.20R作为扩增引物。
进一步添加2.5pmol末端荧光标记的检测探针。该检测探针的序列如下所示：
Total LNA探针：5’-Cy5/CTT+CGGC+TGC+CTC/BHQ2-3’ (SEQ ID NO: 20)。
序列中的+表示其后的碱基为LNA，Cy5表示为猝灭剂的荧光染料，BHQ2表示荧光抑制物质。该检测探针的合成委托IDT公司。
定量PCR反应是在95℃、10秒+(95℃，3秒/58℃，30秒)×45个循环的条件下实施。
对于各试样，光偶联效率是与实施例2同样，由通过定量PCR计算的ΔCt值评价。其结果如图13所示。
在50℃下进行光偶联波长365nm的光照射时，即使以4次左右多次照射光，ΔCt值也是大致恒定(图13中黑色圆圈)，但在4℃下实施时，每次照射光则可确认ΔCt升高(图13中的黑色三角形)。这意味着：在50℃下即使多次照射光，光偶联量也不增加，而在4℃下每次照射光，则光偶联量均增加。
因此认为，4℃下可保持PREP互补链之间的杂交形成、抑制PREP自身序列内的光偶联，因此多次照射光时，光偶联量均增加，而在50℃下，PREP互补链之间的杂交无法充分保持，PREP在自身序列内发生光偶联，由此PREP无法与模板光偶联，因此即使多次照射光，光偶联量也不增加。
即，为了抑制光偶联探针在自身序列内的光偶联，必须提高光偶联探针的互补链的互补性、以及在互补的光偶联探针之间(或者和与光偶联探针互补的探针2之间)可充分形成杂交的温度条件下照射光。
[实施例6：促进杂交的添加剂的研究]
实施例5的结果显示，在50℃下照射光时，无法保持互补的光偶联探针之间的杂交。因此，对于可促进光偶联探针之间杂交的添加剂进行了研究。进行了各种研究，这里给出其中效果较高的带阴性电荷的高分子(聚丙烯酸：pAAc)的结果。
实施例6-1. 光偶联探针的制备
使用以相当于T790的核酸序列为靶标的、实施例4-1.(2)中制备的互补性高的组合的PREP。
实施例6-2. EGFR外显子20(ex.20)区中野生型基因片段的制备
以健康人末梢血为材料，按照与实施例5-2.相同的方法制备EGFR ex.20区的野生型基因片段。
实施例6-3. 光偶联反应时的试剂组成
在0.2mL管中分别加入2μL实施例6-2.中制备的ex.20的野生型基因片段(1×107拷贝)，各2μL制备为10μmol/L的、实施例4-1.(2)所示的、以相当于T790的核酸序列为靶标的T790 AS链(SEQ ID NO: 3)和T790 S链(SEQ ID NO: 4)的光偶联探针PREP，2μL10%(w/w)聚丙烯酸(pAAc)，以1×PCR缓冲液(10mmol/L Tris-HCl(pH8.3)、50mmol/L KCl、1.5mmol/L MgCl2、0.001%(W/V)明胶)终浓度，使总量为20μL。
实施例6-4. 光偶联反应时的条件
在以下条件下对实施例5-3.中制备的核酸样品溶液实施光照射。同时准备了未照射365nm光的样品作为对照。
条件1：对于添加了聚丙烯酸(pAAc)的核酸样品溶液在4℃下光照射。
条件2：对于未添加聚丙烯酸(pAAc)的核酸样品溶液在4℃下光照射。
条件3：对于添加了聚丙烯酸(pAAc)的核酸样品溶液在50℃下光照射。
条件4：对于未添加聚丙烯酸(pAAc)的核酸样品溶液在50℃下光照射。
实施例6-5. 通过定量PCR确认光偶联量
对在实施例5-4.中通过光照射进行了光偶联的试样进行定量PCR。在定量PCR的条件与实施例5相同的条件下实施。
对于各试样，光偶联效率与实施例2同样，由通过定量PCR计算的ΔCt值评价。4 ℃下光照射的结果如图14所示，50℃下光照射的结果如图15所示。
在4℃下进行光偶联波长365nm的光照射处理时，通过添加pAAc，1个循环的光照射下的ΔCt值增加(图15中的黑色三角形)。这是由于通过添加pAAc，PREP可以与模板更有效地杂交，可以使每光照射1次的光偶联量增加。即，pAAc促进PREP与模板的杂交。
在50℃下进行光偶联波长365nm的光照射处理时，通过添加pAAc，ΔCt较大增加(图15中的黑色三角形)。这与在4℃下进行光偶联波长365nm的光照射处理的结果同样，可以认为通过pAAc，PREP与模板可更有效地杂交，除此之外，PREP互补链之间的杂交得到促进，因此在PREP互补链之间可形成充分的杂交，其结果，PREP在自身序列内的光偶联受到抑制。
由此可以确认，在光偶联波长365nm的光照射时保持光偶联探针互补链之间的杂交、抑制光偶联探针自身序列内的光偶联、将光偶联探针保持在可光偶联的状态，这对于提高光偶联效率有效。
[实施例7：基因突变检测灵敏度的确认]
如之前的实施例所示，通过抑制光偶联探针自身序列内的光偶联，可以提高与靶位点的光偶联效率。基于该事实，为了验证对基因突变检测灵敏度的效果，以EGFR基因的T790M为靶标进行了基因突变检测。
实施例7-1. 突变型EGFR基因片段的制备
按照公知的方法，使用PrimeSTAR(注册商标)Mutagenesis Basal Kit (Takara-Bio)，向实施例5-2.中制备的野生型质粒中导入T790M的突变。即，通过该方法，将EGFR基因的第2639号碱基由胞嘧啶(C)突变为胸腺嘧啶(T)。将其作为突变型质粒。
接着，以该质粒为模板，使用实施例4所述的引物对EGFR ex.20F和EGFR ex.20R，按照常规的PCR反应条件进行扩增，得到了直链状EGFR突变型基因片段。使用PCR纯化试剂盒将所得突变型基因片段纯化，然后使用NanoDrop分光光度计测定重量浓度，考虑扩增片段长度，计算各基因片段的拷贝数，以此作为突变型核酸，用作以下研究的模板(SEQ ID NO: 21)。
EGFR ex.20突变型片段
。
实施例7-2. 混入了突变型的样品的制备
改变实施例5-2.中制备的野生型核酸和实施例7-1.中制备的突变型核酸的混合比例，制备3种(突变1%、突变0.1%、突变0.01%)，用作突变型核酸检测用的试样。所使用的野生型核酸和突变型核酸的混合比如表4所示。将未混合突变型核酸的试样作为突变0%试样。混合型示出每1μL的拷贝数。
[表4]
。
实施例7-3. 光偶联探针的制备
使用以相当于T790的核酸序列为靶标、实施例1-1.(2)中制备的互补性高的组合的光偶联探针。
实施例7-4. 光偶联反应时的试剂组成
在0.2mL管中分别加入2μL实施例7-2.中制备的、以实施例4-1.(2)所示的、相当于T790的核酸序列为靶标的T790 AS链(SEQ ID NO: 13)和T790 S链(SEQ ID NO: 14)的PREP，2μL 10%(w/w)聚丙烯酸(pAAc)，以1×PCR缓冲液(10mmol/L Tris-HCl(pH8.3)、50mmol/L KCl、1.5mmol/L MgCl2、0.001%(W/V)明胶)的终浓度，使总量为20μL。
实施例7-5. 光偶联反应时的条件
对于实施例7-4.中制备的样品，通过UV-LED实施光偶联波长365nm的光照射。在95℃下加热处理3分钟，然后在95℃下保持30秒，在50℃下静置5秒，然后在50℃下光照射30秒，将该工序作为1个循环，合计重复10次。
实施例7-6. 通过定量PCR确认光偶联量
分别向20μL实施例7-5.的各制备液中加入80μL的无菌水，充分混合，然后取其中的5μL，加入45μL无菌水。以其中各5μL作为模板，使用Light Cycler实施定量PCR反应。定量PCR在与实施例5和实施例6相同的条件下实施。
其结果如图16所示。图16中，a表示突变1%的结果，b表示突变0.1%的结果，c表示突变0.01%的结果，d表示突变0%的结果。图表的纵轴为荧光强度的对数表示值，横轴为PCR循环数。与突变型0%(仅为野生型)相比，在混入突变型时，荧光信号升高。其结果可以确认检测出突变1%至突变0.01%的浓度相关性的突变。这可以认为是由于抑制了PREP自身序列内的光偶联，因此与野生型序列的光偶联效率提高。
通过抑制光偶联探针自身序列内的光偶联，即使是目前非常难以检测的突变0.01%的存在比下，也可以选择性且有效地扩增突变型核酸。
以上显示，本发明可高灵敏度且高精度地检测突变基因。
[实施例8：导入了肌苷的PREP的评价]
实施例8-1. 光偶联探针(PREP)的制备
使用实施例1-1.中制备的由与EGFR基因上的外显子21(ex.21)区的一部分为同序列的100聚体构成的寡核苷酸作为光偶联对象的模板。
对于由可与该合成寡核苷酸杂交的16聚体构成的PREP，改变肌苷的导入位置，设计3种(SEQ ID NO: 23-25)。1种设计为以未导入肌苷的PREP作为比较对象用的对照(SEQ ID NO: 22)。这些PREP的序列如表5所示。光偶联性核酸类CNVK导入到PREP的位置表示为n，肌苷的导入位置表示为I。
[表5]
。
实施例8-2. 对PREP的光照射处理
将实施例8-1.中合成的各PREP用TE溶解为100μmol/L，将各200pmol分取到0.2mL管中。对于各样品按以下条件实施光照射。锁(clamp)形成波长365nm的光照射使用UV-LED照射器(ZUV-C30H：Omron Corporation)。
条件1：未进行光照射
对各PREP未进行光照射
条件2：锁形成光照射
对各PREP在4℃下照射3分钟365nm的光。
实施例8-3. 电泳评价
为了观察光照射处理的影响，将在实施例8-2.条件下处理的各PREP用无菌水稀释为10μmol/L，然后使用MultiNA(岛津制作所制造)进行微芯片电泳。其凝胶图像如图17所示。
未导入肌苷的PREP(PREP e.)、导入1处肌苷的PREP(PREP f.)在UV照射后的条带向低分子一侧位移，与此相对，导入2个、3个肌苷的PREP(PREP g.、PREP h.)则未见UV照射后的条带位移。这显示：未导入肌苷的PREP、只导入1个肌苷的PREP通过UV照射产生了明显的PREP构象变化，而导入2个、3个肌苷则抑制了PREP的构象变化。
这显示：通过将PREP内作为交联型靶标的嘧啶碱基置换为肌苷这样的不会形成交联型靶标的碱基，可以抑制PREP在自身序列内锁的形成。
[实施9：进行了光照射处理的PREP的锁环形成效率的评价]
实施例9-1. 光偶联探针(PREP)的制备
评价对象PREP使用实施例8-1.中制备的PREP e.和PREP h.。
实施例9-2. PREP的光偶联反应(锁形成反应)
在0.2mL管内分装2μL 100pmol/L合成寡核苷酸作为具有靶位点的核酸序列，加入2μL 100μmol/L PREP(在实施例8-2.所述的各条件下处理的)，以1×PCR缓冲液(10mmol/L Tris-HCl(pH8.3)、50mmol/L KCl、1.5mmol/L MgCl2、0.001%(W/V)明胶)的终浓度，使总量为20μL。
将其在95℃下加热处理5分钟，在45℃下静置5秒钟，在45℃下通过UV-LED照射30秒365nm的光。还同时准备未照射光的样品作为对照。
实施例9-3. 定量PCR反应溶液的制备和反应条件
分别在20μL实施例9-2.中制备的样品(包括对照样品)的各制备液中加入80μL无菌水，充分混合，然后将其中的各5μL与45μL无菌水混合。以混合后的样品中的5μL作为模板，使用Light Cycler(LC 480Ver2：Roche)实施定量PCR反应。
作为定量PCR用反应液，将以下试剂混合制备，加入无菌水制备成每1个样品的最终液量为25μL。在12.5μL的2×Premix Ex Taq(注册商标)(Takara-Bio)中分别加入各5pmol EGFR ex.21F(SEQ ID NO: 6)和EGFR ex.21R(SEQ ID NO: 7)作为扩增引物。
进一步添加2.5pmol末端荧光标记的检测探针。该检测探针的序列如下所示。
Total LNA探针：5’-Cy5/CAGCATGT+CAAGA+TCACAGA/BHQ_2-3’ (SEQ ID NO: 26)。
序列中的+表示其后的碱基为LNA，Cy5表示荧光染料，BHQ2表示荧光抑制物质。该检测探针的合成委托IDT公司。
定量PCR反应是在95℃、10秒+(95℃，3秒/56℃，30秒)×45个循环的条件下实施。
对于各试样，锁形成效率是与实施例2同样，由通过定量PCR计算的ΔCt值评价。其结果如图18所示。
引物的序列如以下所示：
EGFR ex.21F：5’-GAACGTACTGGTGAAAACACC-3’(SEQ ID NO: 6)
EGFR ex.21R：5’-GCATGGTATTCTTTCTCTTCC-3’(SEQ ID NO: 7)。
可知，在使用未导入肌苷的PREP e.时，即使以4次左右多次照射UV，ΔCt也是大致恒定(图18中三角形)，而使用导入了肌苷的PREP h.时，每次增加UV照射次数，则ΔCt增加(图19中的四边形)。
对此可以认为，未导入肌苷的PREP在PREP的自身序列内形成锁，即使多次照射光，其与PREP的模板的锁形成量也不增加，而对于导入了肌苷的PREP，PREP在自身序列内锁的形成得到抑制，因此PREP可以与模板充分形成锁，因此根据UV照射次数，其锁形成量增加。
即，通过将PREP自身序列内的交联靶标碱基置换为如肌苷这样的不形成光偶联的靶核酸的碱基，可以抑制PREP在自身序列内的光偶联，显示可以增加PREP的锁形成量。
[实施例10：使用互补性高的PREP形成锁的确认]
实施例10-1. 光偶联探针(PREP)的制备
以作为野生型序列的EGFR基因上相当于第861号亮氨酸(L861)的核酸序列为靶位点，以实施例8-1.中设计的PREP e.的序列作为与EGFR基因的编码链即有义链杂交的反义链(AS链)的PREP(SEQ ID NO: 22)，同时还设计了与EGFR基因的反义链杂交的有义链(S链)的PREP (SEQ ID NO: 27)。CNVK的导入位置表示为n。
L861 AS链：5’-GCAnCCAGCAGTTTGG-3’ (SEQ ID NO: 22)
L861 S链：5’-CTGnCCAAACTGCTGG-3’ (SEQ ID NO: 27)。
设计如下PREP：有义链的PREP与反义链的PREP的互补性是完全互补的关系，在互相的PREP之间不发生光偶联的位置配置CNVK，且将各PREP的CNVK原本可发生光偶联的靶核酸置换为肌苷的PREP。CNVK的导入位置表示为n，肌苷的导入位置表示为I。
L861 AS链：5’-GCAnCCAGCAGTITGG-3’ (SEQ ID NO: 28)
L861 S链：5’-CCAAnCTGCTGGGIGC-3’ (SEQ ID NO: 29)。
图19表示实际作为锁探针使用的PREP的序列和其互补性的示意图。
实施例10-2. EGFR外显子21(ex.21)区的野生型基因片段的制备
按照常规方法，由健康人的末梢血制备人基因组DNA，以其为模板，使用引物对EGFR ex.21F和EGFR ex.21R，按照常规的PCR反应条件扩增含有相当于L861的核酸序列的EGFR外显子21(ex.21)的区。PCR反应中使用的引物序列如下所示：
EGFR ex.21F(外)：5’-GCATGAACTACTTGGAGGAC-3’(SEQ ID NO: 30)
EGFR ex.21R(外)：5’-ACCTAAAGCCACCTCCTTAC-3’(SEQ ID NO: 31)。
按照所附方案，将所得PCR扩增产物插入pGEMT easy Vector(Promega KK)，进行克隆。
以该质粒为模板，使用所述引物对EGFR ex.21F和EGFR ex.21R，按照常规的PCR反应条件进行扩增，使用PCR纯化试剂盒(Qiagen)纯化，由此得到直链状的EGFR ex.21的野生型基因片段(SEQ ID NO: 32)。
使用NanoDrop分光光度计(Thermo Scientific)测定使用PCR纯化试剂盒(Qiagen)纯化的EGFR ex.21的野生型基因片段的重量浓度，考虑扩增片段长度，计算各基因片段的拷贝数，将其作为野生型核酸，用作以下反应的研究模板。
[SEQ ID NO: 32] EGFR ex.21野生型片段
。
实施例10-3. 光偶联反应时的试剂组成
在0.2mL管中分别加入2μL实施例5-2.中制备的靶核酸(1×107拷贝/μL)，各2μL制备为100μmol/L、实施例10-1所示的以相当于L861的核酸碱基为靶标的L861 AS链(SEQ ID NO: 28)和L861 S链(SEQ ID NO: 29)的PREP，以1×PCR缓冲液(10mmol/L Tris-HCl(pH8.3)、50mmol/L KCl、1.5mmol/L MgCl2、0.001%(W/V)明胶)终浓度，使总量为20μL。
实施例10-4. 光偶联反应时的条件
对实施例10-3.中制备的核酸样品溶液在95℃下加热处理5分钟，在45℃下静置5秒，然后在45℃下通过UV-LED照射30秒365nm的光。同时准备了未照射光的样品作为对照。
实施例10-5. 通过定量PCR确认锁量
分别向20μL实施例10-4.中的实施了光偶联反应的各反应液中加入80μL无菌水，充分混合，然后将其中的5μL与45μL无菌水混合。以混合后的样品内的5μL为模板，使用Light Cycler(LC 480 Ver2：Roche)实施定量PCR反应。
作为定量PCR用反应液，将以下试剂混合来制备，加入无菌水制备成每1个样品的最终液量为25μL。在12.5μL的2×Premix Ex Taq(注册商标)(Takara-Bio)中分别加入各5pmol EGFR ex.21F和EGFR ex.21R作为扩增引物。进一步添加2.5pmol末端荧光标记的检测探针。检测探针使用与实施例9所述的探针(SEQ ID NO: 26)相同的探针，定量PCR反应按照与实施例9-2.相同的条件进行。
对于各试样，锁形成效率是与实施例2同样，由通过定量PCR计算的ΔCt值评价。其结果如图20所示。
可知，按照现有设计方法设计的PREP(三角形)即使多次照射UV，ΔCt也在一定值处发生饱和，但通过使用导入肌苷且完全互补设计的PREP，多次照射UV都可以使ΔCt增加。
这可以认为，在PREP内导入肌苷，且提高PREP的互补性，由此可抑制PREP在自身序列内形成锁。由此可以确认，进行锁形成波长365nm的光照射时，保持PREP互补链之间的杂交、抑制PREP自身序列内的锁形成、将PREP保持在可进行锁形成的状态，这对于提高锁形成效率有效。
产业实用性
本发明涉及使用含有光响应性核酸类的探针、提高光偶联效率的方法，可以高灵敏度且高精度地分析基因。例如可以在选择性检测混入大量存在的野生型基因中的微量存在的突变型基因时使用。还可以从难以利用以往的评价方法检测的、靶核酸仅微量存在的核酸样品中检测出基因。
可以进行如上所述的分析的，并不限于通过手术摘除的组织或生物活体材料等侵袭性高的检查材料，例如血液试样这样的、靶核酸仅微量存在的试样也可以作为材料应用，因此可以进行较为困难的治疗效果的确认或监测检查。这些适用于以癌症早期发现或对于每个患者的药物感受性或药物响应性为代表的药效评价等，由此可以实现个性化医疗。
以上是按照特定的方案说明本发明，本领域技术人员可以了解的变形或改良均包含在本发明的范围内。
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SEQ ID NO: 2-5的各碱基序列是人工合成的探针序列，分别为PREPa.(第6号的n为CNVK)、PREPb.(第8号的n为CNVK)、PREPc.(第10号的n为CNVK)、PREPd.(第12号的n为CNVK)。SEQ ID NO: 8-10的各碱基序列是人工合成的探针序列，分别为PREP-A(第3号的n为CNVK)、PREP-G(第3号的n为CNVK)、PREP-AG(第3号的n为CNVK)。SEQ ID NO: 11-16的各碱基序列是人工合成的探针序列，分别为探针L861 AS(第15号的n为CNVK)、探针L861 S(第14号的n为CNVK)、探针T790 AS(第4号的n为CNVK)、探针T790 S(第3号的n为CNVK)、探针L885 AS(第3号的n为CNVK)、探针L858 S(第3号的n为CNVK)。SEQ ID NO: 20的碱基序列是人工合成的探针序列，是Total LNA探针(第4号的C、第8号的T、第11号的C为LNA)。SEQ ID NO: 22-25的各碱基序列是人工合成的探针序列，分别为PREPe.(第号的n为CNVK)、PREPf.(第4号的n为CNVK，第14号的n为肌苷)、PREPg.(第4号的n为CNVK，第13-14号的n为肌苷)、PREPh.(第4号的n为CNVK，第12-14号的n为肌苷)。SEQ ID NO: 26的碱基序列是人工合成的探针序列，为Total LNA探针(第9号的C、第14号T为LNA)。SEQ ID NO: 27-29的各碱基序列是人工合成的探针序列，分别为探针L861 S(第4号的n为CNVK)、探针T861 AS(第4号的n为CNVK、第13号的n为肌苷)、探针T861 S(第5号的n为CNVK、第14号的n为肌苷)。

Claims (20)

1. 光偶联方法，该光偶联方法是将存在于核酸样品中的靶位点、和具有与该靶位点互补的序列且含有光响应性核酸类的探针1在反应溶液中杂交，通过光照射进行光偶联，其特征在于：抑制该探针1内的起因于光响应性核酸类的自身缔合。
2. 权利要求1所述的光偶联方法，其特征在于：通过使与所述探针1具有高互补性的探针2共存，抑制起因于该探针1内的该光响应性核酸类的自身缔合。
3. 权利要求1或2所述的光偶联方法，其中，所述高互补性是所述探针1与所述探针2为互相互补的关系，在规定的光偶联条件下，该探针1中的该光响应性核酸类在自身内光偶联的碱基与探针2杂交。
4. 权利要求1-3中任一项所述的光偶联方法，其中，所述光偶联的方法是在存在于所述核酸样品中的靶位点所具有的靶核酸与所述探针1的光响应性核酸类之间进行光偶联。
5. 权利要求1-4中任一项所述的光偶联方法，其中，所述探针2含有光响应性核酸类。
6. 权利要求1-5中任一项所述的光偶联方法，其中，所述探针1和所述探针2含有光响应性核酸类，在该探针1和该探针2的非互补性区域中使用与该探针1和/或该探针2具有互补的序列的探针3，以使存在于该探针1和/或该探针2内的光响应性核酸类无法在自身内进行光偶联。
7. 权利要求1所述的光偶联方法，该光偶联方法是使存在于核酸样品中的靶位点、与该靶位点具有互补的序列且含有光响应性核酸类的探针1、以及与该靶位点具有互补的序列且含有靶核酸的探针4在反应溶液中相邻地配置，使它们杂交，通过光照射，存在于该探针4中的靶核酸与该探针1中的光响应性核酸类之间进行光偶联，其特征在于：通过使与该探针1具有高互补性的探针2共存，抑制该探针1在自身内的光偶联。
8. 权利要求1-7中任一项所述的光偶联方法，其特征在于：在所述探针1内，将与光响应性核酸类发生自身缔合的核酸置换为不与该光响应性核酸类发生光偶联的核酸，使用该探针1，抑制探针1在自身内的光偶联。
9. 权利要求8所述的光偶联方法，其中，不与所述光响应性核酸类发生光偶联的核酸是嘌呤碱基。
10. 权利要求8所述的光偶联方法，其中，不与所述光响应性核酸类发生光偶联的核酸是将嘧啶环人工变换得到的合成碱基。
11. 权利要求1-10中任一项所述的光偶联方法，其中，反应溶液中存在阴离子性物质。
12. 权利要求1-11中任一项所述的光偶联方法，其特征在于：至少一种光偶联探针在反应溶液中以0.1μmol/L以上的浓度存在。
13. 基因分析方法，该方法使用权利要求1-12中任一项所述的光偶联方法。
14. 权利要求13所述的基因分析方法，其中，所述基因分析方法是基因检测方法或核酸扩增方法。
15. 突变型核酸检测方法，其特征在于：权利要求14所述的核酸扩增方法是选择性地扩增含有突变型核酸的靶位点的扩增用核苷酸序列，由此检测该突变型核酸的有无。
16. 光偶联试剂盒，其特征在于：该试剂盒含有与核酸样品中的靶位点具有互补的序列且含有光响应性核酸类的探针1、与该探针1具有高互补性的探针2。
17. 权利要求16所述的光偶联试剂盒，其中，所述探针1与核酸样品中的靶位点的靶核酸发生光偶联。
18. 权利要求16所述的光偶联试剂盒，该试剂盒进一步含有探针4，该探针4含有可与该探针1的光响应性核酸类发生光偶联的靶核酸。
19. 权利要求16-18中任一项所述的光偶联试剂盒，其中，所述探针2含有光响应性核酸类。
20. 权利要求16-19中任一项所述的光偶联试剂盒，其中，所述探针1是将在该探针内与光响应性核酸类进行自身缔合的核酸置换为不与该光响应性核酸发生光偶联的核酸。
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