CN107988371A - 基于Sanger测序法检测人类EGFA基因突变的引物及应用 - Google Patents

基于Sanger测序法检测人类EGFA基因突变的引物及应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了基于Sanger测序法检测人类EGFA基因突变的引物及应用，属于基因检测技术领域，本发明所述EGFR基因突变包含18号外显子和20号外显子突变，检测的引物由扩增引物和连接引物组成；检测18号外显子突变的扩增引物的核苷酸序列如SEQ.ID NO.1和SEQ.ID NO.2所示，检测18号外显子突变的连接引物的核苷酸序列如SEQ.ID NO.3和SEQ.ID NO.4所示；检测20号外显子突变的扩增引物的核苷酸序列如SEQ.ID NO.5和SEQ.ID NO.6所示，检测20号外显子突变的连接引物的核苷酸序列如SEQ.ID NO.7和SEQ.ID NO.8所示。本发明的引物适合Sanger测序法，使Sanger测序、操作简单，价格低廉且能灵敏地检测人类EGFR基因突变。

Description

基于Sanger测序法检测人类EGFA基因突变的引物及应用
技术领域
本发明属于基因检测技术领域，尤其涉及基于Sanger测序法检测人类EGFA基因突变的引物及应用。
背景技术
EGFR(Epidermal Growth Factor Receptor，EGFR)是表皮生长因子受体家族成员之一，是一种多功能糖蛋白，广泛分布于哺乳动物各组织细胞膜表面。人EGFR基因位于第七号染色体的短臂上，全长200kb，由28个外显子组成，编码1186个氨基酸，其糖蛋白分子量大小约170kDa；EGFR具酪氨酸激酶活性，是一种重要的跨膜受体，其中外显子18～20编码N-lobe。相关研究指出，EGFR基因拷贝数增加或者过度表达，均能促进正常细胞的转化和恶性肿瘤的转移。EGFR信号传导关乎细胞的凋亡、增值、分化、迁移和细胞周期循环，EGFR在多种器官中都出现了过表达，如头颈部癌、肾癌和非小细胞癌等。据统计，在黄种人的非小细胞肺癌中，30％～40％有EGFR基因变异；在白种人的非小细胞肺癌中，10％～20％有EGFR基因变异。EGFR与肿瘤的形成和恶化信息相关，通过对EGFR结构的分析，选择其特点部位作为靶点，来为抗肿瘤提供新的方向。
外显子20的点突变主要是第790位密码子出现C到T的转换，引起EGFR蛋白中该位点的氨基酸由苏氨酸转变为甲硫氨酸；在药物治疗后复发者中，突变使得癌细胞对吉非替尼(Gefitinib)和厄罗替尼(Erlotinib)产生抗性。第770～775位密码子中存在碱基插入：GACAACCCCCACGTG序列之间存在8种不同的插入方式，插入的片段为3～9个碱基。
目前基因检测的技术方法有Sanger测序、RNA酶切割法、变性梯度凝胶电泳法(Denatured Gradient Gel Electrophoresi，DGGE)、杂合双链分析法(HA)、化学切割错配法(CCM)、Sorpions-ARMS(Scorpions，蝎形探针；Amplification Refractory MutationSystem，扩增阻滞突变系统)、DNA芯片技术、TaqMan-qPCR、DHPLC(Denaturing highperformance liquid chromatography)、PCR-SSCP(Single-Strand ConformationPolymorphism)、PCR-RFLP(Restriction Fragment Length Polymorphism)等，其中Sanger测序和Scorpions-ARMS在临床和科研中应用较多。德国Qiagen公司基于Scorpions-ARMS法开发了EGFR检测试剂盒，该试剂盒能同时检测EGFR基因的29种突变，优点为灵敏度高、操作简单且检测快速，但其成本过高。Sanger测序法是基因突变检测及基因多样性检测的金标准，平台和技术都较为成熟，兼备检测结果准确、全面，检测费用低廉且能检测出未知突变；但Sanger测序法受限于突变基因含量要达到10％以上，甚至需要达到20％突变基因才能被可靠检出。由于体细胞突变组份只占临床样本中的一部分，除此之外还可能存在大量的野生型基因，Sanger测序法存在准确度问题。
因此，有必要制备出一种新型检测人类EGFA基因突变的Sanger测序法，其能提高在大量正常基因背景中少量突变检测的灵敏性。
发明内容
本发明目的在于克服现有技术存在的不足，而提供一种基于Sanger测序法检测人类EGFA基因突变的引物及应用，该Sanger测序、操作简单，价格低廉且能灵敏地检测人类EGFR基因突变。
为实现上述目的，本发明采取的技术方案为：检测人类EGFR基因突变的引物，所述EGFR基因突变包含18号外显子和20号外显子突变，所述引物由扩增引物和连接引物组成；检测18号外显子突变的扩增引物的核苷酸序列如SEQ.ID NO.1和SEQ.ID NO.2所示，检测18号外显子突变的连接引物的核苷酸序列如SEQ.ID NO.3和SEQ.ID NO.4所示；检测20号外显子突变的扩增引物的核苷酸序列如SEQ.ID NO.5和SEQ.ID NO.6所示，检测20号外显子突变的连接引物的核苷酸序列如SEQ.ID NO.7和SEQ.ID NO.8所示。
本发明以EGFR基因18号外显子和20号外显子为突变对象，设计了靶向各突变位点的连接引物对(SEQ.ID NO.3和SEQ.ID NO.4，SEQ.ID NO.7和SEQ.ID NO.8)，使得各对连接引物和野生型基因对应突变位点的区域毗邻互补(两条连接引物都和模板完全互补并且毗邻)。由于在EGFR基因外显子的扩增体系中引入了耐热的DNA连接酶，则退火阶段时DNA连接酶将会连接位于野生型模板上的毗邻互补引物形成长的连接引物，而由于与突变型模板结合的两条连接引物在毗邻处(即突变位点处)没有和模板完全互补则不被连接。当体系处于72℃延伸时，由于结合于野生型模板上的长连接引物退火温度高于72℃，因此仍位于原处从而阻止野生型模板的扩增；而对于突变型模板，由于结合的是两条短的连接引物，其退火温度只有60℃左右，在72℃的温度下它们将和模板分离，因而不会阻碍模板的扩增。由于在EGFR基因片段扩增体系中引入耐热DNA连接酶和针对突变位点的特定连接引物体系，极大抑制了样品中的野生型EGFR基因片段的扩增，可以基于扩增片段条带直接判定野生型样本；或使得低突变含量样品其最后总的PCR产物中突变片段的比例高于50％，从而保证了Sanger测序法检测出样本中含量低至1％的EGFR基因18/20外显子突变，准确率极高，检测费用低廉且能检测出新的未知突变。
作为上述技术方案的改进，所述18号外显子突变包含c.2156G＞C或c.2155G＞A。
作为上述技术方案的改进，所述20号外显子突变包含c.2639C＞T。
另外，本发明还提供所述的引物在制备用于检测EGFR基因突变的试剂盒中应用。
另外，本发明还提供一种包含所述的引物的试剂盒，所述试剂盒还包含PCR缓冲液、dNTPs、DNA聚合酶、耐热DNA连接酶和耐热DNA连接酶缓冲液。
作为上述技术方案的改进，当扩增体系为20μL时，扩增体系含有以下组分：当扩增体系为50μL时，扩增体系含有以下组分：10×PCR缓冲液5μL，dNTPs5μL，每条扩增引物1.6μL，每条连接引物0.4uL，10×耐热DNA连接酶缓冲液5μL，耐热DNA连接酶0.5μL，DNA聚合酶0.3μL，基因组DNA100ng，灭菌去离子水补足至50μL；
扩增程序为：95℃预变3min；94℃变性30s，55～58℃退火35s，72℃延伸40s，循环32次；72℃终延伸5min。
本发明的有益效果在于：本发明提供一种基于Sanger测序法检测人类EGFA基因突变的引物及应用，在EGFR基因片段扩增体系中引入耐热DNA连接酶和针对突变位点的特定连接引物体系，极大抑制了样品中的野生型EGFR基因片段的扩增，可以基于扩增片段条带直接判定野生型样本；或使得低突变含量样品其最后总的扩增产物中突变片段的比例高于50％，从而保证了Sanger测序法检测出样本中含量低至1％的EGFR基因18/20外显子突变，准确率极高，检测费用低廉且能检测出新的未知突变。
附图说明
图1为EGFR基因扩增产物的琼脂糖凝胶电泳图；
图2为EGFR基因第18号外显子突变样本的测序峰局部图；
图3为EGFR基因第20号外显子突变样本的测序峰局部图。
具体实施方式
为更好地说明本发明的目的、技术方案和优点，下面将结合具体实施例、附图对本发明作进一步说明。
1.基因组DNA提取
采集待测样本，如患者的肿瘤组织或外周血等，DNA提取步骤严格按天根TIANampGenomic DNAKit说明书进行：
1)使用前请按说明向缓冲液GD和漂洗液PW中加入无水乙醇；
2)细胞样品加入200μL缓冲液GA，振荡至彻底悬浮；
3)加入20Μl Proteinase K溶液，混匀；
4)加入200μL缓冲液GB，充分颠倒混匀，70℃放置10min，溶液应变清亮，简短离心以去除管盖内壁的水珠；
5)加人200μL无水乙醇，充分振荡混匀15s，此时可能会出现絮状沉淀，简短离心以去除管盖内壁的水珠；
6)将上一步所得溶液和絮状沉淀都加入一个吸附柱CB3中(吸附柱放入收集管中)，12,000rpm(约13,400×g)离心30s，倒掉废液，将吸附柱CB3放回收集管中；
7)向吸附柱CB3中加入500μL缓冲液GD(使用前请先检查是否已加入无水乙醇)，12,000rpm(约13,400×g)离心30s，倒掉废液，将吸附柱CB3放入收集管中；
8)向吸附柱CB3中加入600μL漂洗液PW(使用前请先检查是否已加入无水乙醇)，12,000rpm(约13,400×g)离心30s，倒掉废液，将吸附柱CB3放入收集管中；
9)重复操作步骤8；
10)将吸附柱CB3放回收集管中，12,000rpm(约13,400×g)离心2min，倒掉废液；将吸附柱CB3置于室温放置数分钟，以彻底晾干吸附材料中残余的漂洗液；
11)将吸附柱CB3转入一个干净的离心管中，向吸附膜的中间部位悬空滴加50～200μL洗脱缓冲液TE，室温放置2～5min，12,000rpm(约13,400×g)离心2min，将溶液收集到离心管中。
2.引物设计
采用Primer Premier 5.0在含有突变位点的外显子两端设计引物，避开具有引物二聚体以及茎环错配的序列，使用其扩增出来的序列长度不超过400bp，且所用引物的退火温度基本一致；本发明所扩增引物和连接引物的序列如表1下。
表1
3.片段扩增
50μL正常扩增体系为：10×PCR缓冲液5μL，dNTPs 5μL，每条扩增引物1.6μL，每条连接引物0.4uL，10×耐热DNA连接酶缓冲液5μL，耐热DNA连接酶0.5μL，DNA聚合酶0.3μL，基因组DNA100ng，灭菌去离子水补足至50μL；
50μL对照扩增体系与正常扩增体系的区别在于：对照扩增体系中没有加入耐热DNA连接酶缓冲液、耐热DNA连接酶和连接引物，不足的用灭菌去离子水补充；
扩增程序为：95℃预变3min；94℃变性30s，55～58℃退火35s，72℃延伸40s，循环32次；72℃终延伸5min。
4.电泳与回收
1)煮胶：称取0.5g琼脂糖置于锥形瓶，后量取50Ml 1×TAE混匀，置于微波炉中高火煮2min，配制浓度约1％的琼脂糖凝胶；
2)凝胶：清洗凝胶槽，滤纸擦干，倒胶凝胶1h；
3)加样：取3Μl 2×Loading Buffer(含20％SYBR染料)与3μL DNA混匀，点样；
4)电泳：120V，20min。
5)电泳完成后，置于紫外仪观察并照相；参照Marker，将扩增出的浓度较高的目的片段割胶回收，并用凝胶纯化试剂盒将目的片段回收。
5.目的基因片段序列测定
将割胶回收的产物进行双向测序，并进行分析，依据所有测序峰图分析目的基因片段的最终序列。
6.结果
以6个样本为例，其中一个样本为EGFR 18c.2156G＞C突变杂合体样本为例，使用18号外显子扩增引物和连接引物进行扩增，如图1所示，第一行的泳道1～6显示6个样本的正常扩增体系的核酸产物，第二列的泳道1～6显示6个样本的对照扩增体系的核酸产物，Mark从上至下：100、250、500、750、1000、2000、3000、5000bp，对照体系的6个样本均可以成功扩增出目的基因片段，而正常体系中只有第1样本和第6样本有扩增产物，第6样本带暗淡(浓度低于10ng/μL)，其余4管肉眼未见扩增产物；由此可见，第1样本为突变体。
对第1样本图变态的条带进行回收和测序，如图2所示，测序峰图显示18号外显子出现了c.2156G＞C的突变。
参考上述方法，对EGFR18号外显子c.2155G＞A突变的样本进行扩增、测序，测序峰图显示18号外显子出现了c.2155G＞A的突变；对20号外显子的突变进行扩增、测序，如图3所示，测序峰图显示20号外显子出现了c.2639C＞T的突变。
SEQUENCE LISTING
<110> 广州誉嘉生物科技有限公司
<120> 基于Sanger测序法检测人类EGFA基因突变的引物及应用
<130> 2017
<160> 8
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 1
cctttcgtca cggtctgta 19
<210> 2
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 2
tagtcaccag gacactct 18
<210> 3
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 3
tcgtgaaact agaaaaactt aag 23
<210> 4
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 4
gcacggcttg cgtggcctc 19
<210> 5
<211> 15
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 5
ggtccacttt gcgta 15
<210> 6
<211> 17
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 6
gtttagtcac ggacagg 17
<210> 7
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 7
ggcacagctt ttcctccatg 20
<210> 8
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 8
gattgaatcc aaaataaagg aatgtgt 27

Claims (6)

1.检测人类EGFR基因突变的引物，其特征在于，所述EGFR基因突变包含18号外显子和20号外显子突变，所述引物由扩增引物和连接引物组成；检测18号外显子突变的扩增引物的核苷酸序列如SEQ.ID NO.1和SEQ.ID NO.2所示，检测18号外显子突变的连接引物的核苷酸序列如SEQ.ID NO.3和SEQ.ID NO.4所示；检测20号外显子突变的扩增引物的核苷酸序列如SEQ.ID NO.5和SEQ.ID NO.6所示，检测20号外显子突变的连接引物的核苷酸序列如SEQ.ID NO.7和SEQ.ID NO.8所示。
2.如权利要求1所述的引物，其特征在于，所述18号外显子突变包含c.2156G＞C或c.2155G＞A。
3.如权利要求1所述的引物，其特征在于，所述20号外显子突变包含c.2639C＞T。
4.如权利要求1～3任一项所述的引物在制备用于检测EGFR基因突变的试剂盒中应用。
5.一种包含如权利要求1～3任一项所述的引物的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包含PCR缓冲液、dNTPs、DNA聚合酶、耐热DNA连接酶和耐热DNA连接酶缓冲液。
6.如权利要求5所述的试剂盒，其特征在于，当扩增体系为50μL时，扩增体系含有以下组分：10×PCR缓冲液5μL，dNTPs 5μL，每条扩增引物1.6μL，每条连接引物0.4uL，10×耐热DNA连接酶缓冲液5μL，耐热DNA连接酶0.5μL，DNA聚合酶0.3μL，基因组DNA 100ng，灭菌去离子水补足至50μL；
扩增程序为：95℃预变3min；94℃变性30s，55～58℃退火35s，72℃延伸40s，循环32次；72℃终延伸5min。
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