CN108517357B - 一种检测心源性猝死相关scn5a基因上心源性猝死相关snp的试剂盒及其检测方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种检测心源性猝死相关SCN5A基因上心源性猝死相关SNP的试剂盒及其检测方法，具体包括以下步骤：一、以样本中提取的DNA为模板，制备Multiplex PCR及其纯化处理；二、SNaPshot单碱基延伸反应(SBE)及其纯化处理；三、SNaPshot单碱基延伸产物的毛细管电泳及其结果分析；四、灵敏度检测。本发明能一次性检测SCN5A基因上的45个心源性猝死(SCD)相关SNP，并得到清晰的结论。本方法不再利用一代测序和二代测序技术进行全基因组的比对。不需要特殊仪器和方法筛查心源性猝死相关的基因遗传背景。
Description
技术领域
本发明涉及基因检测及其应用领域，特别涉及到一种心源性猝死相关SCN5A基因检测试剂盒。
背景技术
心源性猝死可见于以下情况：(1)在原有器质性心脏病的基础上(如冠心病和心肌缺血)导致的猝死；(2)隐匿性离子通道类疾病或心肌病导致的猝死；(3)大量运动，情绪激动乃至不明原因的夜间猝死；(4)相关基因遗传性因素的参与等等。随着DNA测序技术和SNP突变检测技术的发展，突变位点的检测能力有了很大的提高，但是还没有专门针对SCD相关基因SCN5A的SNP筛查试剂盒。
检测基因突变常用技术可大致分为两种策略：(一)蛋白层次的检测。该层次的检测属于间接的检测，主要借助一些蛋白分析技术，分析突变体产生的变异蛋白，以及由变异蛋白引起的其他性状的改变。(二)遗传物质(DNA)层次的直接检测：包括单链构象异构多态分析技术(SSCP)，Taqman探针法，变性高效液相色谱分析(DHPLC)，测序分析(主要是一代和二代测序)，基因芯片技术等。
上述检测方法的不足之处如下：
1：单链构象异构多态分析技术(SSCP)：SSCP技术是在检测突变领域中应用较为广泛的一种方法。其基本原理是基于DNA在某一非变性环境中有特定的二级构象，通过电泳迁移率的差异从而分出正常链和异常链。缺点是这种技术的突变检出率只有50％-80％，且不能准确的找到突变的碱基类型和位置。
2：Taqman探针法：探针法准确性好，适合于较少SNP的大量样本检测。主要缺点是价格贵，是不能读出序列，不太直观。
3：变性高效液相色谱分析(DHPLC)：DHPLC技术代表了突变检测手段的新进展。该技术通过自动化程序式操作即可完成对外显子大小片段的全部检测。缺点就是本法对实验室的要求较高，价格贵，不能普遍应用于广泛的法医实验室。
4:一代测序(Sanger测序)分析：一代测序读长较长，准确性高，是法医学分析小样本DNA的主要方法。其主要缺点是(1)测序的成本较高，不能满足一部分法医实验室的需求；(2)通量较低，虽然可以准确分析出基因组的序列，但是不能检测出大片段缺失或拷贝数变异等基因突变的类型，因此对于一些与此相关的遗传性疾病还不能做出基因学诊断。
5：二代DNA测序技术：该技术可以通过软件等链接获得每一个检测的片段，从而合成分析的序列。但是该技术有以下缺点(1)仪器和试剂等造成方法昂贵且需要专业人员分析，难以普及；(2)较SNP分析而言，该方法可以得到一条DNA链上的所有信息，多态性大大提高，但有一定的错误率，对于法医学分析而言，尚需要仔细评估。
6：基因芯片(DNA芯片)分析，是目前国外较为普遍的分析方法：该方法通过激光共聚焦扫描对杂交荧光信号的有无进行检测分析，从而找出突变。该方法的缺点是技术成本昂贵、复杂、检测灵敏度较低、重复性差、分析范围狭窄等。
发明内容
为了克服现有技术中的缺陷，提供一种检测心源性猝死相关SCN5A基因上心源性猝死相关SNP的试剂盒及其检测方法。
本发明通过下述方案实现：
一种心源性猝死相关SCN5A基因检测试剂盒，其中所述SNP选自如下表1所示SNP中两个或两个以上：
表1
所述试剂盒包含针对上述SNP的位点的特异性多重PCR引物对，该多重PCR引物对通过扩增能够同时得到包含不同SNP的扩增子，每段扩增子至少含有一个SNP，最多含有5个SNP；
且所述试剂盒还包含SNP的SNaPshot单碱基延伸引物。
其中所述特异性多重PCR引物对选自如下表2中的引物对：
表2
其中所述SNP的SNaPshot单碱基延伸引物选自如下表3的引物：
表3
其包含权利要求2和权利要求3中所定义的所有的多重PCR引物和所有的SNaPshot单碱基延伸引物。
一种基于心源性猝死相关SCN5A基因检测试剂盒的检测方法，包括以下步骤：
一、以样本中提取的DNA为模板，通过选自上述权利要求2中所定义的引物对制备Multiplex PCR产物并进行纯化处理；
二、对Multiplex PCR产物通过选自上述权利要求3中所定义的单碱基延伸引物进行SNaPshot单碱基延伸反应(SBE)，并进行纯化处理；
三、对SNaPshot单碱基延伸产物进行毛细管电泳并进行结果分析。
其还包括对检测结果进行灵敏度检测。
所述样本包括健康个体构成的对照组、尸检结果为心源性猝死的甲醛固定组织样本作为心源性猝死组、尸检结果为甲醛固定组织样本作为非心源性猝死组；
所述样本中提取DNA的步骤为：采用OMEGA全血基因组DNA试剂盒提取人体静脉血DNA，用QIAGEN血液组织DNA提取试剂盒提取甲醛固定组织DNA，将样品中的DNA特异性结合到硅胶膜上，通过两次洗涤将PCR抑制剂完全去除，最后结合在离心柱上的纯核酸可用水或试剂盒中的缓冲液进行洗脱收集，对于提取的DNA按照光密度值法进行定量分析，确定基因组DNA的含量和浓度。
本发明方法的有益效果为：
本发明能一次性检测SCN5A基因上的45个心源性猝死(SCD)相关SNP，并得到清晰的结论。本方法不再利用一代测序和二代测序技术进行全基因组的比对。不需要特殊仪器和方法筛查心源性猝死相关的基因遗传背景。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明进一步说明：
SNP分析技术有很多种，由于单个SNP的突变类型较多，因此，很少用直接测序或者探针的方法检测突变；对于调查SCN5A相关SNP的突变，目前国外已有相应的试剂盒，用于分析临床上与其相关的遗传性疾病和离子通道型疾病，如心肌病，Bugada Syndrome(Brs),long QT syndrome(LQTS)等，但未见法医学中对SCD遗传背景和遗传基础的分析。
本方法采用的是多重PCR技术和SNaPshot微测序技术相结合的方法来解决位于SCN5A基因上SCD相关的45个SNP的检测问题，其过程如下：
首先选取国内外已经报道过的确定在SCN5A基因上与SCD有关联的31个SNP，为了扩大检测试剂盒的适用范围，发现山西人群潜在的特征性的突变位点，在NCBI数据库中又选取了14个位于基因SCN5A上的致病SNP。至此，该检测试剂盒一共涵盖了位于SCN5A基因上45个SCD相关的SNP以检测山西人群与SCD的联系。(1)对含有SNP位点的每一对PCR引物进行单独PCR扩增(共30对引物)，以验证每个扩增产物的特异性。其中每对上下游引物之间最少含有一个待测SNP，最多含有5个待测SNP(见表2)。(2)为了是扩增效率最大化，将30对引物分成两个体系分别进行多重PCR扩增，得到复合扩增产物。(3)对两组复合扩增产物所包含的SNP分别进行检测(体系1st含有22个SNP，体系2nd含有23个SNP)，其原理结合了SNaPshot微测序技术和毛细管电泳(CE)技术检测突变碱基的类型和位置，从而确定样本在SCN5A上45个SNP的分型。
本发明的技术方案为：一种心源性猝死相关SCN5A基因检测试剂盒，其中所述SNP选自如下表1所示SNP中两个或两个以上：
表1
所述试剂盒包含针对上述SNP的位点的特异性多重PCR引物对，该多重PCR引物对通过扩增能够同时得到包含不同SNP的扩增子，每段扩增子至少含有一个SNP，最多含有5个SNP；
且所述试剂盒还包含SNP的SNaPshot单碱基延伸引物。
其中所述特异性多重PCR引物对选自如下表2中的引物对：
表2
其中所述SNP的SNaPshot单碱基延伸引物选自如下表3的引物：
表3
其包含权利要求2和权利要求3中所定义的所有的多重PCR引物和所有的SNaPshot单碱基延伸引物。
一种基于心源性猝死相关SCN5A基因检测试剂盒的检测方法，包括以下步骤：
一、以样本中提取的DNA为模板，通过选自上述权利要求2中所定义的引物对制备Multiplex PCR产物并进行纯化处理；
二、对Multiplex PCR产物通过选自上述权利要求3中所定义的单碱基延伸引物进行SNaPshot单碱基延伸反应(SBE)，并进行纯化处理；
三、对SNaPshot单碱基延伸产物进行毛细管电泳并进行结果分析。
其还包括对检测结果进行灵敏度检测。
所述样本包括健康个体构成的对照组、尸检结果为心源性猝死的甲醛固定组织样本作为心源性猝死组、尸检结果为甲醛固定组织样本作为非心源性猝死组；
所述样本包括健康个体构成的对照组、尸检结果为心源性猝死的甲醛固定组织样本作为心源性猝死组、尸检结果为甲醛固定组织样本作为非心源性猝死组；本实施例中，共计采样88例，分为三组，如下：(1)采用50例山西健康个体(男女不限)作为健康个体组，为本实验的对照组；(2)采用25例尸检结果为心源性猝死的甲醛固定组织样本作为心源性猝死(SCD)组；(3)采用13例尸检结果为交通事故、颅脑损伤、中毒、溺死等的甲醛固定组织样本作为非心源性猝死(non-SCD)组。
所述样本中提取DNA的步骤为：采用OMEGA全血基因组DNA试剂盒提取人体静脉血DNA，用QIAGEN血液组织DNA提取试剂盒提取甲醛固定组织DNA，将样品中的DNA特异性结合到硅胶膜上，通过两次洗涤将PCR抑制剂完全去除，最后结合在离心柱上的纯核酸可用水或试剂盒中的缓冲液进行洗脱收集，对于提取的DNA按照光密度值法进行定量分析，确定基因组DNA的含量和浓度。
以样本中提取的DNA为模板(10ng)进行如下反应：
1.Multiplex PCR及其纯化处理：(1)Multiplex PCR的组成成分，体积和扩增条件如下：
多重PCR体系1st含14对引物，体系组成成分：25ul体系：DNA polymerase 1U、dNTP0.3mM、Trics-HCI(pH 8.7)20mM、KCI 100Mm、MgCl22.5Mm、Primer 2.5ul、DNA 10ng，补水至25ul。(引物序列见前文)
多重PCR体系2nd含16对引物，体系组成成分：25ul体系：DNA polymerase1U、dNTP0.4mM、Trics-HCl(pH 9.0)62.4mM、KCl 24.96mM、(NH4)2SO412.48mM、MgSO42.56mM、GCHancer 2.5ul、Primer 2.5ul、DNA 10ng，补水至25ul。(引物序列见前文)
多重PCR体系1st的扩增条件：95℃5min；95℃ 30s，58℃ 30s，72℃ 30s，共35个循环；72℃5min。
多重PCR体系2nd的扩增条件：95℃10min；95℃ 30s，56℃ 30s，72℃ 30s，共35个循环；72℃5min。
(2)多重PCR产物纯化处理的组成成分，体积和纯化条件如下：复合扩增产物3.8μl、SAP(虾碱性磷酸酶)1.3U、ExoΙ(核酸外切酶Ι)6U、补水至10ul。纯化条件37℃，1h；95℃，15min。
2.SNaPshot单碱基延伸反应(SBE)及其纯化处理：为了更清晰更准确的检测45个SNP的分型，通过在有效延伸序列的5’端加不同长度的-CT尾来区分同一延伸反应体系的所有SNP(见前文)。SNaPshot单碱基延伸反应(SBE)也分成两个反应体系，分别与上述多重PCR体系1st和2nd相对应。
(1)SNaPshot单碱基延伸反应的组成成分，体积和扩增条件如下：
SNaPshot延伸体系1st含22个SNP，体系组成成分：5ul体系：PCR纯化产物2ul，SNaPshot Mix 2ul，延伸引物1ul(延伸引物序列及浓度见前文)
SNaPshot延伸体系2nd含23个SNP，体系组成成分：5ul体系：PCR纯化产物2ul，SNaPshot Mix 2ul，延伸引物1ul(延伸引物序列及浓度见前文)
SNaPshot延伸体系1st和2nd的延伸条件相同，如下：96℃1min；96℃ 10s，50℃5s，60℃ 30s，共35个循环；60℃1min。
(2)SNaPshot延伸产物纯化处理的组成成分，体积和纯化条件如下：单碱基延伸产物1μl、SAP(虾碱性磷酸酶)1U、补水至5ul。纯化条件37℃，1h；95℃，15min。
3.SNaPshot单碱基延伸产物的毛细管电泳及其结果分析：毛细管电泳前变性处理的组成成分和条件如下：SNaPshot纯化后产物1.5ul、0.1ul内标(GeneScan-LIZ 120)、10ul甲酰胺(Hi-Di formamide)；条件：95℃ 5min，0℃ 3min后通过
DNA测序仪完成对延伸引物的检测，对延伸产物的分析通过
ID V3.2完成。4.灵敏度检测：灵敏度实验采用Multiplex PCR(复合扩增)的方法进行，将DNA按照下列浓度进行分组，10ng，5ng，1ng，0.5ng，0.1ng，0ng分成各组。多重PCR和SNaPshot延伸反应的组成成分，体积和扩增条件如上。
发现上述30对基础引物中，灵敏度均在0.5ng以上，即需要对于DNA含量在0.5ng以上的DNA扩增，本方法才有效。低于0.5ng的DNA不建议采用本方法。
为了检测本试剂盒的应用效能，对88例DNA样本进行45个SNP的检测。参与检测的88例样本分为如下三组：健康个体(normal)组50例；心源性猝死(SCD)组25例；非心源性猝死(non-SCD)组13例，各组检测具体数据如下：
(1)健康个体(normal)组：反应体系1st和2nd包含的44个SNP在50例DNA样本中均成功检rs1805124(H558R)，42(84％)例样本检测到纯合T/T(胸腺嘧啶/胸腺嘧啶)分型，8(16％)例样本检测到杂合T/C(胸腺嘧啶/胞嘧啶)分型。
(2)心源性猝死(SCD)组：反应体系1st和2nd包含的44个SNP在25例DNA样本中均成功检测到与NCBI数据库一致的SNP分型。另(位点rs1805124(H558R)，20(80％)例样本检测到杂合T/C(胸腺嘧啶/胞嘧啶)分型，4(16％)例样本检测到纯合T/T(胸腺嘧啶/胸腺嘧啶)，显示为红色(与NCBI一致)，1(4％)例样本检测到纯合C/C(胞嘧啶/胞嘧啶)。
(3)非心源性猝死(non-SCD)组10例：反应体系1st和2nd包含的44个SNP在13例DNA样本中均成功检测到与NCBI数据库一致的SNP分型。但是位点rs1805124(H558R)，5(38.5％)例样本检测到杂合T/C(胸腺嘧啶/胞嘧啶)，8(61.5％)例样本检测到纯合T/T(胸腺嘧啶)分型。
2.对心源性猝死(SCD)组和对照组、非心源性猝死(non-SCD)组分别进行检测。经对照可发现，位点rs1805124(H558R)在三组中存在差异。对照组和非心源性猝死(non-SCD)组在位点rs1805124的分型为纯合T/T(胸腺嘧啶)；心源性猝死(SCD)组在该位点为T/C(胸腺嘧啶/胞嘧啶)杂合，。另SCD组在该位点还存在分型为C/C(胞嘧啶)纯合。数据经统计学计算得出，该位点为突变型SNP，突变类型为错义突变，且有可能是潜在的SCD相关突变。
3.统计学参数：为了更具体的分析45个SNP在三组中的分型情况，对突变位点rs1805124(H558R)进行了Fisher精确检验和Ⅹ2检验，具体结果如下：
rs1805124(H558R)：Ⅹ2检验经计算得出p<0.05，即三组之间有明显差异，为了进一步的确定三组之间的差异是否有意义，针对参与检测的三组在进行两两之间的组间对比。a.健康个体(normal)组和心源性猝死(SCD)组之间Ⅹ2检验经计算得出p<0.05；b.非心源性猝死(non-SCD)组和心源性猝死(SCD)组之间Fisher精确检验经计算得出p＝0.010.(p＝0.05水平)；c.健康个体(normal)组和非心源性猝死(non-SCD)组Ⅹ2检验经计算得出p＝0.162(p＝0.05水平)。综上，心源性猝死(SCD)组与另外两组之间均有明显差异，而健康个体(normal)组和非心源性猝死(non-SCD)组无明显差异，故位点rs1805124(H558R)可作为区分三组的影响因素，该位点为突变型SNP，突变类型为错义突变，且有可能是潜在的SCD相关突变。
本发明具有以下优点：
(1)分型准确。由于SNaPshot微测序技术是以纯化后的多重PCR产物为模板，使用测序酶、四种荧光标记ddNTP和5′-端紧靠SNP位点的延伸引物进行反应，引物延伸一个碱基即终止，经测序仪检测后，根据峰的移动位置确定该延伸产物对应的SNP位点，根据峰的颜色可得知掺入的碱基种类，从而确定该样本的基因型。目标SNP的检测相对全基因组测序较为精准，降低了错配率。(2)一次性可检测两个多重PCR反应体系包含的目标SNP 45个，且无需专业的技术人员进行分析，也无需昂贵的仪器设备和试剂，节省了的检测成本并在大部分的法医实验室都可进行，适合法医学检测。(3)不受SNP位点多态性特性的限制。本申请中45个SNP位点的突变类型包括错义突变、框移突变(碱基的缺失或插入)、终止突变等，均能准确的检测到SNP的分型。另外，利用该试剂盒可以灵敏的检测到杂合的SNP位点，其应用性优于一代测序，准确性优于二代测序，适用于日常的法医学检测或者临床类诊断。(4)可能用于系统性分析SCN5A相关的遗传性心肌离子通道疾病和心肌病的构成，或对SCD患者的亲属进行基因筛查和诊断，从而达到预防和遗传咨询的意义。
尽管已经对本发明的技术方案做了较为详细的阐述和列举，应当理解，对于本领域技术人员来说，对上述实施例做出修改或者采用等同的替代方案，这对本领域的技术人员而言是显而易见，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。
序列表
<110> 山西医科大学
<120> 一种检测心源性猝死相关SCN5A基因上心源性猝死相关SNP的试剂盒及其检测方法
<130> ZXQ
<160> 105
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 上游引物
<400> 1
gttctcactc atcacgtagg c 21
<210> 2
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 2
aagcatgcct ccttcctctt 20
<210> 3
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 3
aggcttatct ggttgggctt 20
<210> 4
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 4
atcctggaga acttcagcgt 20
<210> 5
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 5
ccagcctccc acttgacata 20
<210> 6
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 6
caccagtagc cacagtctct 20
<210> 7
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 7
cagaagatcc tccccactcc 20
<210> 8
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 8
tgtccaggag agaaagccag 20
<210> 9
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 9
agagtcctga gcctcctttg 20
<210> 10
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 10
actggaccaa ggtgaaagtc a 21
<210> 11
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 11
aaggcaagtc tccctctgtc 20
<210> 12
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 12
gagccacttc tctgtccact 20
<210> 13
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 13
aatgtctcga accagctgtg 20
<210> 14
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 14
ctgctcacca tattgccctg 20
<210> 15
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 15
catgcattac ctcaccgcac 20
<210> 16
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 16
tgtggactca gctcataggc 20
<210> 17
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 以为怒
<400> 17
agaccacagc agaaatccca 20
<210> 18
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 18
tagaactggg actggatggc 20
<210> 19
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 19
cctgcagcat ctcctcgaat 20
<210> 20
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 20
acccgtttac tgacctcacc 20
<210> 21
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 21
accaacttca ctccctgctt 20
<210> 22
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 22
cctgtcatct cccagagcaa 20
<210> 23
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 23
ggcttggttt tgctcctcat 20
<210> 24
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 24
gctatttgaa cccctggcac 20
<210> 25
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 25
tcacttgtgt agcctggacc 20
<210> 26
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 26
aaagtctctg tgtgtggctg 20
<210> 27
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 27
ctagaatgga ggtggggtgg 20
<210> 28
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 28
aatgctactg tctgtcccca 20
<210> 29
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 29
ggcaaacctg ggcatcttac 20
<210> 30
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 30
ggacatcctt acggcactca 20
<210> 31
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 31
ttggacttgg cactggtgat 20
<210> 32
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 32
gagagccacc acacatcact 20
<210> 33
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 33
gagcgtcggg gagaagaagt 20
<210> 34
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 34
agtgatgctg gctggaagac 20
<210> 35
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 35
gcaggagacc acagcagaaa 20
<210> 36
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 36
tccttcagtg cagacaacct 20
<210> 37
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 37
ctgtcatagg agggtgggaa 20
<210> 38
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 38
aagcatgcct ccttcctctt 20
<210> 39
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 39
aaggcaagtc tccctctgtc 20
<210> 40
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 40
actgagccac ttctctgtcc 20
<210> 41
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 41
gcccaccaca gcaaagat 18
<210> 42
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 42
ggaataggtg tcagtgccct 20
<210> 43
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 43
tgtacatgtt gaccacgatg 20
<210> 44
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 44
gcttatgtca agtgggaggc 20
<210> 45
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
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<223> 引物
<400> 45
agagtcctga gcctcctttg 20
<210> 46
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 46
agccagtgtg agtccttgaa 20
<210> 47
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 47
gctcctcgaa gccatctaca 20
<210> 48
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 48
atcctatccc tgtggcatcc 20
<210> 49
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 49
tcacttgtgt agcctggacc 20
<210> 50
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 50
ctacaccagc ttcgattcct 20
<210> 51
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 51
tccacgatgt ggtagcaggt 20
<210> 52
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
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<223> 引物
<400> 52
ctgctcacca tattgccctg 20
<210> 53
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 53
cgtggagaag aggccctgaa 20
<210> 54
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 54
gattggcatg gactggtcac 20
<210> 55
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 55
ggatgacgat gatgctgtcg 20
<210> 56
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 56
acaattcctg ctccctcctc 20
<210> 57
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 57
cttgcttctc tgccatgcg 19
<210> 58
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 58
ctctctgtcc ctgggcatag 20
<210> 59
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 59
cccattgcag tccacagtg 19
<210> 60
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 60
ccctctcctc atgcccttag 20
<210> 61
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 61
gctcaggggc atcctcttcg 20
<210> 62
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
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<223> 引物
<400> 62
gagtggctca gacagggcat 20
<210> 63
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 63
gtcgtcctca ctcaggggct 20
<210> 64
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 64
tctgaggatg cggcctattc 20
<210> 65
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 65
agcctggctc accaggggcc 20
<210> 66
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 66
ctgcagaagg gccaggtacc 20
<210> 67
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 67
ctgcagaagg gccaggtacc 20
<210> 68
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 68
caaagaggtt cacgcccatg 20
<210> 69
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 69
gcaagacctg ctaccacatc 20
<210> 70
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 70
cccagggaag gtctggtggc 20
<210> 71
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 71
gggcctgtgt ggtgtccacc 20
<210> 72
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 72
aggggcctct gggccaccg 19
<210> 73
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 73
gcgcaggccc ctctggatgc 20
<210> 74
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 74
tcatgttgta gtgctccagc 20
<210> 75
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 75
tccagcatgg tggacacttg 20
<210> 76
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 76
ctcagagtta gaggagtctc 20
<210> 77
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 77
tggtgaacct gatcctggcc 20
<210> 78
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 78
agcagtcctg cgtcatcagg 20
<210> 79
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 79
gcagtcctgc gtcatcaggc 20
<210> 80
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 80
aaaggcccag gcaaaggaat 20
<210> 81
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 81
gaatcttcac agccgctctc 20
<210> 82
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 82
ggtcttgcct ttattcagta 20
<210> 83
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 83
ccagggcacc agcagtgatg tg 22
<210> 84
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 84
gacccagagg ccacatcccc ag 22
<210> 85
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 85
gaggggcctg cgctttgtca ag 22
<210> 86
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 86
cgggagaagt tctcactcat ca 22
<210> 87
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 87
ttcatagaag tcctgctgag gc 22
<210> 88
<211> 16
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 88
aatcatctca gcctca 16
<210> 89
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 89
tgcccaggga cagcccagtc cc 22
<210> 90
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 90
tgctctagca tcacagggcg ga 22
<210> 91
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 91
tgcagatgat gaaaacagca ca 22
<210> 92
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 92
tcctcgtctg cctcatcttc tg 22
<210> 93
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 93
tttcccacag gcactgtgct ct 22
<210> 94
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 94
gactctgaaa gttcgaagag cc 22
<210> 95
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 95
gtggctctcg ctctccccc 19
<210> 96
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 96
accggagaat tgtactggac ca 22
<210> 97
<211> 17
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 97
tccagatcac cacgtcg 17
<210> 98
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 98
ggtgctagcc atcatcgtg 19
<210> 99
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 99
cgggccccag atgctgacct cc 22
<210> 100
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 100
gcttccgcag gttcacacgg ga 22
<210> 101
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 101
actactactt ccaacagggc tg 22
<210> 102
<211> 16
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 102
aacctcggct cctggc 16
<210> 103
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 103
acacctgctg atagaggcgc tc 22
<210> 104
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 104
caggccccag ggaaggtctg gt 22
<210> 105
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<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 105
gcccagcacg accctccacc ct 22
Claims (1)
1.特异性多重PCR引物对和SNaPshot单碱基延伸引物在制备检测心源性猝死相关SCN5A基因上心源性猝死相关SNP的试剂盒中的用途，其特征在于，其中所述SNP为如下表所示：
所述试剂盒包含针对上述SNP的位点的特异性多重PCR引物对，该多重PCR引物对通过扩增能够同时得到包含不同SNP的扩增子，每段扩增子至少含有一个SNP，最多含有5个SNP；
且所述试剂盒还包含SNP的SNaPshot单碱基延伸引物；
所述特异性多重PCR引物对为如下引物对：
所述SNP的SNaPshot单碱基延伸引物为如下的引物：
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2018
- 2018-03-12 CN CN201810200859.5A patent/CN108517357B/zh not_active Expired - Fee Related
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| A SNaPshot assay for detection of 45 mutations in the SCN5A gene in the Chinese Han Population;Jiaqi Wang等;《Electrophoresis》;20180607;第39卷(第17期);第2270-2276页 * |
| SCN5A基因微测序检测体系的构建及其在心源性猝死检测中的应用_王佳琦;王佳琦;《中国优秀硕士学位论文全文数据库 医药卫生科技辑》;20181015;第E076-22页 * |
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