CN113174432B - 一种slc25a13基因突变位点检测试剂盒及方法 - Google Patents

一种slc25a13基因突变位点检测试剂盒及方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开一种SLC25A13基因突变位点检测试剂盒及方法。所述试剂盒主要成分为PCR扩增引物SEQ ID NO:1～SEQ ID NO:28和质谱延伸引物SEQ ID NO:29～SEQ ID NO:43。通过使用本发明试剂盒，能够一次性同时准确检测出SLC25A13基因15个突变位点，具有高效、高通量、低成本、自动化的优点。

Description

一种SLC25A13基因突变位点检测试剂盒及方法
技术领域
本发明属于生物技术领域，涉及一种检测SLC25A13基因位点突变试剂盒及检测方法，是一种基于MassARRAY质谱平台的SLC25A13基因突变型检测方法。
背景技术
希特林蛋白缺乏症(Citrin deficiency)是由SLC25A13基因突变引起的Citrin转运体功能障碍的一种常染色体隐性遗传疾病。本病发病时期从新生儿到成人年龄不一，根据发病年龄不同，临床表现不同，早期发病多表现为肝内胆汁淤积(NICCD)，脂肪肝，成人期发病(CTLN2)多为高氨血症、脂肪肝或合并胰腺炎、肝细胞癌等，同时不同发病期都伴有不同程度的高氨血症和高瓜氨酸血症，临床上容易与其他肝病、胆汁淤积性肝炎、氨基酸代谢疾病等混乱。
目前，我国采用串联质谱技术(MS-MS)测定新生儿末梢血中瓜氨酸浓度来对该病进行早期筛查。但据研究报道，仅40-50％的NICCD患者通过新生儿串联质谱筛查最终确诊，大多数患者出现黄疸、发育迟缓等症状后才就医确诊，原因可能为部分患者瓜氨酸迟发升高，新生儿串联筛查结果阴性，导致该疾病漏筛率较高。有研究采用分子检测技术对SLC25A13基因3个热点突变进行该疾病新生儿筛查，检出率虽有所提高但仍远低于发病率。在临床实践中随着NICCD患者数的不断增加，该病日益得到临床医生的重视。因此，急需提高NICCD新生儿筛查的敏感性。
国内外正式报道的SLC25A13突变类型超过60余种，我国人群突变频率最高主要为c.851_854del4bp、IVS16ins3kb、c.1638_1660dup、IVS6+5G>A、c.1399C>T，总体大约占NICCD患者的85％以上。该基因突变在我国患者中高度的集中性，突变热点明确，有利于进行早期新生儿基因筛查。
发明内容
本发明的目的在于提供一种SLC25A13基因突变位点检测试剂盒，是一种基于MassARRAY质谱平台的SLC25A13基因突变检测试剂盒。
本发明提供的试剂盒，由PCR扩增引物和质谱延伸引物，10×PCR反应缓冲液、dNTPMix(25mM)、MgCl2(25mM)、PCR反应Taq酶、SAP反应缓冲液、SAP酶、iPlex反应缓冲液、iPlexTermination Mix、Extension反应Taq酶、MassARRAY芯片组成。其中：PCR扩增引物序列如SEQ ID NO:1～SEQ ID NO:28所示，质谱延伸引物序列如SEQ ID NO:29～SEQ ID NO:43中所示。
所述的PCR扩增引物为包含序列如SEQ ID NO:1～SEQ ID NO:28所示的1管扩增引物的混合物，所述的PCR延伸引物为包含序列如SEQ ID NO:29～SEQ ID NO:43中所示的1管延伸引物的混合物。
本发明的另一目的在于克服现有技术的不足，提供一种检测SLC25A13基因突变试剂盒的使用方法，通过以下步骤实现：
(1)设计如SEQ ID NO:1～SEQ ID NO:28所示的扩增引物和如SEQ ID NO:29～SEQID NO:43所示的延伸引物；
(a)PCR扩增引物：
PCR扩增引物为根据SLC25A13基因设计的特异性针对15个热点突变位点的扩增引物，所述扩增引物可扩增包括突变位点在内的一段DNA序列。
本发明的扩增引物选自SEQ ID NO:1～SEQ ID NO:28中；优选地，本发明的扩增引物包括SEQ ID NO:1～SEQ ID NO:28；最优选地，本发明的扩增引物由SEQ ID NO:1～SEQID NO:28组成。
(b)延伸引物：
延伸引物的长度为15-26个碱基并且其3’端位于突变位点的上一个碱基，延伸引物在发生延伸反应时，只延伸一个碱基，延伸的碱基即为SLC25A13基因热点突变位点。
本发明的延伸引物选自SEQ ID NO:29～SEQ ID NO:43中，优选地，本发明的延伸引物包括SEQ ID NO:29～SEQ ID NO:43；最优选地，本发明的延伸引物由SEQ ID NO:29～SEQ ID NO:43组成。
(2)将SEQ ID NO:1～SEQ ID NO:28所示的扩增引物混合得到1管扩增引物混合液，将SEQ ID NO:29～SEQ ID NO:43所示的延伸引物混合得到1管延伸引物混合液；
(3)检测模板的制备：提取待测样本DNA；
(4)以步骤(3)中提取的DNA为模板，利用步骤(1)中的扩增引物进行PCR扩增，获得靶序列的PCR产物；
(5)SAP酶处理，除去步骤(4)获得的扩增产物中含有的未反应的dNTP；
(6)以步骤(5)中获得的扩增产物为模板，使用步骤(2)中的延伸引物通过延伸反应，在延伸引物的3’端连接一个碱基，从而得到延伸产物；
(7)采用树脂纯化步骤(6)中获得的延伸产物；
(8)采用飞行时间质谱基因分型系统对纯化产物进行扫描、检测，检测结果使用TYPER4.0软件分型并输出结果，通过质谱峰变异碱基处是否出峰来判断是否突变。
本发明试剂盒能一次性检测15种常见的SLC25A13突变类型，基于Massarry平台的检测方法简便，准确率高，同时还具有高通量、低成本、自动化等特点。
附图说明
图1表示以临床样本提取的DNA为模板，进行检测的质谱峰图，分析起峰在分子质量为7383.9Da的T峰位置，此数据表明该样本为纯合T，为IVS16ins3kb野生纯合型样本的质谱峰图结果。
图2表示以临床样本提取的DNA为模板，进行检测的质谱峰图，分析起峰在分子质量为7383.9Da的T峰和7399.9Da的C峰，此数据表明该样本为杂合，为IVS16ins3kb杂合型样本的质谱峰图结果。
图3表示以临床样本提取的DNA为模板，进行检测的质谱峰图，分析起峰在分子质量为5423.4Da的峰位置，此数据表明该样本为纯合，为c.852_855del野生型纯合型样本的质谱峰图结果。
图4表示以临床样本提取的DNA为模板，进行检测的质谱峰图，分析起峰在分子质量为5367.5Da的del峰位置，此数据表明该样本为纯合，为c.852_855del突变纯合型样本的质谱峰图结果。
图5表示以临床样本提取的DNA为模板，进行检测的质谱峰图，分析起峰在分子质量为5367.5Da的del峰和5423.4Da的峰位置，此数据表明该样本为杂合，为c.852_855del杂合型样本的质谱峰图结果。
图6表示以临床样本提取的DNA为模板，进行检测的质谱峰图，分析起峰在分子质量为6425.2Da的G峰位置，此数据表明该样本为纯合G，为野生纯合型样本的质谱峰图结果。
图7表示以临床样本提取的DNA为模板，进行检测的质谱峰图，分析起峰在分子质量为6425.2Da的G峰和6409.2Da的A峰位置，此数据表明该样本为杂合，为c.1177+1G>A杂合型样本的质谱峰图结果。
图8表示以临床样本提取的DNA为模板，进行检测的质谱峰图，分析起峰在分子质量为6780.5Da的G峰位置，此数据表明该样本为纯合G，为野生纯合型样本的质谱峰图结果。
图9表示以临床样本提取的DNA为模板，进行检测的质谱峰图，分析起峰在分子质量为6780.5Da的G峰和6764.5Da的A峰位置，此数据表明该样本为杂合，为c.615+5G>A杂合型样本的质谱峰图结果。
具体实施方式
下面将结合附图和具体实施例对本发明作进一步说明，但本发明并不限于以下实施例。本发明的实施例提供了对15种SLC25A13基因突变型进行检测的方法。
下述实施例中，如无特殊说明，均为常规方法，所用试剂均为市售商品。
实施例1引物设计
(1)PCR扩增引物
根据所选择的待检测的15种SLC25A13基因突变型(具体的突变未定信息见表1)，设计出特异性针对每种SLC25A13基因突变型的PCR扩增引物，PCR扩增引物可扩增包括突变位点在内的一段DNA序列。所述PCR扩增引物在3’端具有与其所针对的基因序列完全匹配的至少15个碱基，在5’端具有10个碱基(ACGTTGGATG)的标签序列，以区分PCR扩增引物与延伸引物，所设计的PCR扩增引物详见表2所示。
(2)延伸引物：
设计延伸引物，所述延伸引物长度为15-26个碱基，并且其3’端位于SLC25A13基因突变位点的上一个碱基，延伸引物在发生延伸反应时，只延伸一个碱基，延伸的碱基即为SLC25A13基因突变位点。
表1：SLC25A13(NM_014251.2)基因突变信息
Figure BDA0003004894230000041
其中，上述符号“>”表示碱基突变。
表2：针对所述PCR扩增的PCR扩增引物序列
Figure BDA0003004894230000042
Figure BDA0003004894230000051
表3：针对所述延伸反应的延伸引物
SEQ ID NO 检测位点 延伸引物序列5’→3’
29 c.1399C_T ATCACCACTGGTCCT
30 c.1177+1G>A GAGCATGTGGCACTAA
31 c.852_855del TTTTTCCCCTACAGACG
32 c.1231G>A TCCCTCACAAAATCGTTCA
33 c.1638_1660dup GGGCAGCCACCTGTAATCTC
34 c.955C>T AACTTGTAGAAGAACTGGTC
35 IVS6+5G>A AAGAATGTCTAGTAGCTGTAA
36 IVS4ins6kb cTCCTCTGAAAAGAGAAAAGAC
37 c.754G>A AATTCAGATATATTCTCACTCAC
38 IVS16ins3kb AGCTTTAAAAAAATGGAGAAATC
39 c.775C>T TGGGTGTAACCTGACCAAATTTCT
40 c.550C>T GGCGGATGGTGACCATGATGTCTC
41 c.265delG aGAAAGGCTACCATAAACAAAGCAT
42 c.1095delT tgTTTATACATGAGTTCTCCCACAAA
43 c.1063C>G/T ggaAGTTGATCGTTGGTTCTGCATTC
实施例2检测模板的制备
应用Tiangen的干血斑基因组DNA提取试剂盒提取收集血样的基因组DNA，具体操作过程按说明书要求进行。
实施例3SLC25A13基因突变型的检测方法
(1)以实施例2中提取的DNA为模板，使用实施例1中的PCR扩增引物通过PCR扩增，获得靶序列扩增产物。PCR扩增反应体系参见表4.其中，所用试剂购自Agena Bioscience公司。PCR扩增反应条件见表5。
表4：PCR扩增反应体系
试剂 体积(ul)/反应
水 1.8
10×PCR反应缓冲液 0.5
dNTP Mix(25mM) 0.1
MgCl<sub>2</sub>(25mM) 0.4
表2中PCR扩增引物混合物 1.0
PCR反应Taq酶 0.2
模板DNA 1.0
总体积 5.0
表5：PCR扩增反应条件
Figure BDA0003004894230000061
(2)通过SAP酶处理，除去步骤(1)获得的扩增产物中含有的未反应的dNTP。SAP酶反应体系见表6。所用试剂购自Agena Bioscience公司。SAP反应条件见表7。
表6：SAP酶反应体系
试剂 体积(ul)/反应
水 1.53
SAP反应缓冲液 0.17
SAP酶 0.3
步骤(1)中获得PCR扩增产物 5.0
总体积 7.0
表7：SAP反应条件
温度 时间
37℃ 40min
85℃ 5min
4℃ Hold
(3)以步骤(2)中获得的扩增产物为模板，使用实施例1中的延伸引物通过延伸反应，在延伸引物的3’端链接一个碱基，从而得到延伸产物。延伸反应体系见表8。所用试剂购自Agena Bioscience公司。延伸反应条件见表9。
表8：延伸反应体系
试剂 体积(ul)/反应
水 0.659
iPlex反应缓冲液 0.2
iPlex Termination Mix 0.2
表3中延伸引物混合物 0.9
Extension反应Taq酶 0.041
步骤(2)中获得PCR扩增产物 7.0
总体积 9.0
表9：延伸反应条件
Figure BDA0003004894230000071
(4)采用树脂resin纯化步骤(3)中获得延伸产物，去除干扰离子。
在延伸产物中加入20ul水和6mg洁净干燥的树脂，低速垂直旋转30min，使树脂与反应物充分接触。4000rpm离心5min使树脂沉入孔底部，上清可直接用于质谱检测。
(5)芯片点样
启动MassARRAYNanodispenserRS1000点样仪，将树脂纯化后的延伸产物移至384孔SpectroCHIP(Sequenom)芯片上。
(6)质谱分析
将点样后的SpectroCHIP芯片使用MALDI-TOF分析，检测结果使用TYPER4.0软件分型并输出结果。
(7)SLC25A13基因检测结果
图1为IVS16ins3kb野生纯合型样本的检测结果，起峰在分子质量为7383.9Da的T峰位置，此数据表明该样本为纯合T；图2为IVS16ins3kb杂合型样本的检测结果，起峰在分子质量为7383.9Da的T峰和7399.9Da的C峰，此数据表明该样本为杂合。图3为c.852_855del野生型纯合型样本的检测结果，起峰在分子质量为5423.4Da的峰位置，此数据表明该样本为纯合；图4为c.852_855del突变纯合型样本的检测结果，起峰在分子质量为5367.5Da的del峰位置，此数据表明该样本为纯合；图5为c.852_855del杂合型样本的检测结果，起峰在分子质量为5367.5Da的del峰和5423.4Da的峰位置，此数据表明该样本为杂合。图6为野生纯合型样本的检测结果，起峰在分子质量为6425.2Da的G峰位置，此数据表明该样本为纯合G；图7为c.1177+1G>A杂合型样本的检测结果，起峰在分子质量为6425.2Da的G峰和6409.2Da的A峰位置，此数据表明该样本为杂合。图8为野生纯合型样本的检测结果，起峰在分子质量为6780.5Da的G峰位置，此数据表明该样本为纯合G；图9为c.615+5G>A杂合型样本的检测结果，起峰在分子质量为6780.5Da的G峰和6764.5Da的A峰位置，此数据表明该样本为杂合。
以上所述的实验结果，仅为表示本发明的SLC25A13基因的突变位点的检测方法实际应用效果，因此不应以此实验结果限制本发明的范围。
序列表
<110> 浙江大学
<120> 一种SLC25A13基因突变位点检测试剂盒及方法
<160> 43
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 29
<212> DNA
<213> 人工合成(Unknow)
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<212> DNA
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acgttggatg tcacctaaca ggtattgagc 30
<210> 3
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<212> DNA
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<210> 26
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<212> DNA
<213> 人工合成(Unknow)
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acgttggatg caatgctagg actgggagag 30
<210> 27
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工合成(Unknow)
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<211> 33
<212> DNA
<213> 人工合成(Unknow)
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acgttggatg tgctgtgtat cctatcgatc ttg 33
<210> 29
<211> 15
<212> DNA
<213> 人工合成(Unknow)
<400> 29
atcaccactg gtcct 15
<210> 30
<211> 16
<212> DNA
<213> 人工合成(Unknow)
<400> 30
gagcatgtgg cactaa 16
<210> 31
<211> 17
<212> DNA
<213> 人工合成(Unknow)
<400> 31
tttttcccct acagacg 17
<210> 32
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工合成(Unknow)
<400> 32
tccctcacaa aatcgttca 19
<210> 33
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工合成(Unknow)
<400> 33
gggcagccac ctgtaatctc 20
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<212> DNA
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aacttgtaga agaactggtc 20
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<212> DNA
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aagaatgtct agtagctgta a 21
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ctcctctgaa aagagaaaag ac 22
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<212> DNA
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aattcagata tattctcact cac 23
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agctttaaaa aaatggagaa atc 23
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tgggtgtaac ctgaccaaat ttct 24
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ggcggatggt gaccatgatg tctc 24
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agaaaggcta ccataaacaa agcat 25
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tgtttataca tgagttctcc cacaaa 26
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<212> DNA
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<400> 43
ggaagttgat cgttggttct gcattc 26

Claims (2)

1.一种检测SLC25A13基因位点突变试剂盒，其特征在于：由PCR扩增引物和质谱延伸引物，10×PCR反应缓冲液、25mM dNTP Mix、25mM MgCl2、PCR反应Taq酶、SAP反应缓冲液、SAP酶、iPlex反应缓冲液、iPlex Termination Mix、Extension反应Taq酶、MassARRAY芯片组成，所述PCR扩增引物序列如SEQ ID NO:1～SEQ ID NO:28所示，所述质谱延伸引物序列如SEQ ID NO:29～SEQ ID NO:43所示。
2.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于：所述的PCR扩增引物为包含扩增引物的混合物，扩增引物序列如SEQ ID NO:1～SEQ ID NO:28所示；所述的PCR延伸引物为包含延伸引物的混合物，延伸引物序列如SEQ ID NO:29～SEQ ID NO:43中所示。
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