CN109468372A - 基于高通量测序构建多种遗传代谢性肝病靶向文库的引物组合、方法及试剂盒 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种基于高通量测序构建多种遗传代谢性肝病靶向文库的引物组合、方法及试剂盒，物组合的碱基序列为SEQ ID No.1～SEQ ID No.2245，覆盖了SERPINA1、G6PC、SLC37A4、AGL等43个基因全部的703个外显子和剪接区，可同时一次性检测全部20种遗传代谢性肝病的41个亚型的基因变异位点，包括：α1抗胰蛋白酶缺陷、糖原储积病、瓜氨酸血症、精氨琥珀酸尿症、血色病、卟啉病、囊性纤维变性、先天性胆汁酸合成障碍、胆汁酸合成障碍、戈谢病、遗传性果糖不耐受、胆固醇酯贮积病、Gilbert综合征、杜宾综合征、Rotor综合征、进行性家族性肝内胆汁淤积症等20种遗传代谢性肝病。本发明操作简单、准确性高、耗时短，大大的节约了Sanger测序逐个基因逐个片段去检测所用的时间成本和人力成本。

Description

基于高通量测序构建多种遗传代谢性肝病靶向文库的引物组 合、方法及试剂盒

技术领域

本发明涉及生物技术领域，具体涉及基于高通量测序构建多种遗传代谢性肝病靶向文库的引物组合、方法及试剂盒。

背景技术

遗传代谢性肝病(Inherited metabolic liver disorder,IMLD)是一类由于遗传性酶缺陷引起的肝脏代谢障碍性疾病。遗传代谢性肝病种类繁多，目前已鉴定的遗传代谢性肝病已有600余种，主要包括碳水化合物代谢病、氨基酸代谢病、脂肪酸代谢病、有机酸代谢病、线粒体肝病、溶酶体病、过氧化物酶体病、金属代谢障碍及α1-抗胰蛋白酶缺乏症等9大类。就单一病种而言，发病率并不高，但总体发病率却不容忽视。遗传代谢性肝病主要是代谢产物或胆汁淤积导致的对肝细胞的损伤，但肝脏的反应形式很有限，所以代谢性肝病的临床表现缺乏特异性，同时可与其他获得性肝损伤重叠，如病毒性肝炎、酒精性肝损伤等，使得临床表现更加复杂、诊断较为困难，容易造成漏诊和误诊。据文献报道30％以上的遗传代谢性疾病要经过5-10位医生的诊治；48.3％的患者被误诊为其他疾病；误诊时间长达5年或更长。因此，建立快速、精准的检测技术，对我国遗传代谢性肝病的早期识别和诊治有极其重要的意义。

由于这类疾病是遗传性酶缺陷所致，因此大多具有明确的致病基因和变异，例如，肝豆状核变性(Wilson’s病)是由位于13号染色体长臂的ATP7B基因变异，导致其编码的铜转运P型ATP酶功能异常引起铜代谢异常而致病；而α1抗胰蛋白酶缺陷症、精氨琥珀酸尿症、戈谢病、遗传性果糖不耐受、胆固醇酯贮积病和假性胆碱酯酶缺乏症等疾病则是分别由于SERPINA1、ASL、GBA、ALDOB、LIPA和BCHE基因异常导致α1抗胰蛋白酶缺陷、精氨琥珀酸裂解酶缺陷、葡糖脑苷脂酶缺乏、果糖-1,6-二磷酸醛缩酶缺陷、酸性脂酶缺乏和丁酰胆碱酯酶缺乏而致病。有的遗传代谢性肝病由不同的基因发生变异导致多个亚型，例如糖原储积病有十七个已知的亚型，其中累及肝脏的包括Ia、Ib/Ic、III、VI、IXd、IXa1、IXb、IXc、0A等九个亚型，分别由G6PC、SLC37A4、AGL、PYGL、PHKA1、PHKA2、PHKB、PHKG2、GYS2基因变异而致病；进行性家族性肝内胆汁淤积症(Progressive familial interhepatic cholestasis，PFIC)六个亚型，目前已明确的有ATP8B1、ABCB11、ABCB4、TJP2及NR1H4等基因的变异可分别导致PFIC1、PFIC2、PFIC3、PFIC4和PFIC5亚型。因此，遗传代谢性肝病数量众多、亚型各异，涉及的致病基因数量大、变异类型多样。

基因检测被认为是诊断代谢性肝病的“金标准”，但由于涉及到的基因数量大、复杂性高，分子生物学检测和诊断极具挑战性。另一方面，由于人群遗传异质性和个体差异等原因，致病基因的突变位点和类型在群体中不是固定的几个热点突变，以肝豆状核变性的致病基因ATP7B为例，目前收录在美国NCBI临床疾病相关变异数据库的ATP7B基因致病的和可能致病的突变有172个，分布在其1～21号全部的外显子以及部分内含子的剪接区，其中我国以Arg778Leu、Pro992Leu和Ala874Val为主(累计占27％～48％)，除了3个主要的突变，我们在我院的肝豆状核变性患者中检出Met769HisfsX26、Ile1148Th、Arg919Gly、Tyr715Stop等18个致病突变，其中13个为新发现的致病突变，并且文献报道不断有新的致病基因发现(Li X,et al.BMC Med Genet 2011,12:6)。因此，基因突变的异质性和个体差异性，决定了遗传代谢性肝病基因突变检测需要覆盖致病基因的所有外显子及内含子剪接区，才能准确的、全覆盖、无遗漏的识别其致病突变，单纯检测某个基因的几个热点突变位点将会产生很大的漏检。而目前还没有一次性同时检测多种遗传代谢性肝病的遗传学检测试剂盒面市。

国内外目前多采用Sanger测序的方法进行单个遗传代谢性肝病的检测，这种方法一次只能检测一个基因的某几个热点突变，难以对整个基因的潜在致病位点和新的突变位点全部检出，可出现50％以上的假阴性，并且一次只能检测一个基因，在疑诊方向模糊的时候需要逐个基因逐个位点检测，操作繁琐、耗时耗力。而目前国内能检索到的同时检测多种遗传代谢性肝病的方法只有CN 106957901 A文件所公示的方法，该方法采用PCR-测序的方法逐个PCR反应再测序，只能检测高胆红素血症、威尔森氏病和/或血色病的少部分热点突变。随着技术的进步，全外显子组高通量测序实现了同时检测多个基因变异，但全外显子组高通量测序价格昂贵，用于少数单基因病的检测非常的浪费，并且因为人类基因组的庞大、全外显子组测序技术本身的局限，会有少部分基因不能覆盖和随机漏检。因此，选择需要的目的基因进行靶基因建库测序(即NGS Panel测序)是同时检测多种基因的最佳选择，既能覆盖所选基因的所有靶区域、又能避免全外显子组测序高昂的价格。

发明内容

鉴于此，本发明克服遗传代谢性肝病种类繁多、亚型各异、基因变异广泛、复杂性高等技术障碍，开发了一套基于高通量测序的多种遗传代谢性肝病靶向文库的构建方法及相应试剂盒，可用于多种遗传代谢性肝病的同时精准检测，在遗传代谢性肝病致病突变检测、产前筛查和家系成员筛查中的应用。本发明试剂盒检测包含了43个明确的致病基因、覆盖目标基因的703个外显子区及剪接区共计116.8kb靶区域，可同时对包括肝豆状核变性、α1-抗胰蛋白酶缺陷、糖原储积病、遗传性高胆红素血症、卟啉病、遗传性血色病、瓜氨酸血症、戈谢病、进行性家族性肝内胆汁淤积症等在内的20种遗传代谢性肝病的41个亚型的基因变异进行一次性精准检测和分型。操作简单、耗时短，大大的节约了Sanger测序逐个基因逐个片段去检测所用的时间成本和人力成本。

本发明为实现上述目的提出的一种技术方案是：即一种基于高通量测序构建多种遗传代谢性肝病靶向文库的引物组合，包含碱基序列为SEQ ID No.1～SEQ ID No.2245的共1119对引物以及7条简并引物；检测覆盖SERPINA1、G6PC、SLC37A4、AGL、PYGL、PHKA1、PHKA2、PHKB、PHKG2、GYS2、ASS1、SLC25A13、ASL、HFE、TFR2、SLC40A1、ALAS2、FECH、CFTR、HSD3B7、CYP7B1、AKR1D1、AMACR、CYP27A1、BAAT、GBA、ALDOB、LIPA、UGT1A1、ABCC2、SLCO1B1、SLCO1B3、ATP8B1、ABCB11、ABCB4、TJP2、NR1H4、VPS33B、VIPAS39、JAG1、ATP7B、NOTCH2和BCHE共43个基因全部的703个外显子和剪接区。

上述引物组合在制备检测遗传代谢性肝病试剂中的应用。

本发明还提供一种基于高通量测序构建多种遗传代谢性肝病靶向文库的试剂盒，包含碱基序列为SEQ ID No.1～SEQ ID No.2245的全部引物或部分引物对。所述试剂盒还包括PCR缓冲液、DNA聚合酶等。

所述碱基序列为SEQ ID No.1～SEQ ID No.2245的全部引物或部分引物对装载于同一个包装管或至多2个包装管里，组成引物混合池。可同时一次性检测20种遗传代谢性肝病的41个亚型或至少其中一种亚型的基因变异位点。

本发明另一方面提供基于高通量测序构建多种遗传代谢性肝病靶向文库的构建方法，碱基序列为SEQ ID No.1～SEQ ID No.2245的全部引物或部分引物对，用待检测的标化人基因组DNA作为模板进行超高重PCR扩增、纯化、去除非特异性产物、再纯化，获得多种遗传代谢性肝病目标基因的靶向文库。

所述超高重PCR扩增体系为：

所述扩增体系为上述体系的倍比体积或等浓度体系。

所述超高重PCR扩增条件为：95℃10min；98℃15s，60℃5mim，10个循环；10℃∞。

本发明的有益技术效果为：本发明引物覆盖了43个基因全部的703个外显子区及剪接区，且1119对引物装载于同一个包装管或至多2个包装管里，可同时一次性检测20种遗传代谢性肝病的41个亚型的基因变异，覆盖了肝豆状核变性、α1抗胰蛋白酶缺陷、糖原储积病、瓜氨酸血症、精氨琥珀酸尿症、血色病、卟啉病、囊性纤维变性、先天性胆汁酸合成障碍、胆汁酸合成障碍、戈谢病、遗传性果糖不耐受、胆固醇酯贮积病、Gilbert综合征、杜宾综合征、Rotor综合征、进行性家族性肝内胆汁淤积症、关节炎/肾功不全并胆汁淤积症、Alagille综合征和假性胆碱酯酶缺乏症共20种遗传代谢性肝病的致病基因。本发明可应用于遗传代谢性肝病致病突变检测、产前筛查和家系成员筛查及相应致病变异研究。本发明的43个基因的703个片段可同时在一个反应管里完成建库，不需要像Sanger测序那样做703次反应，大大的节约了时间成本。与Sanger测序比较，本发明技术的准确性为100％、并且操作简单、耗时短，避免了Sanger测序一次只能测单个基因的单个片段带来的繁重的工作量和经济成本。

附图说明

附图1为合格的DNA样本示意图；

附图2为本发明所构建多种遗传代谢性肝病靶向文库质检示意图。

具体实施方式

下面结合具体的实施例对本发明的实施方案进行详细的描述。应理解，这些实施例意在说明实施本发明的现已知的一个最佳的实施方案，但是不应该认为本发明局限于这些实施例。实施例中未注明具体条件的实验方法，按照本领域技术人员熟知的常规条件，或者按照制造厂商建议的条件。

实施例1引物组合

针对SERPINA1、G6PC、SLC37A4、AGL、PYGL、PHKA1、PHKA2、PHKB、PHKG2、GYS2、ASS1、SLC25A13、ASL、HFE、TFR2、SLC40A1、ALAS2、FECH、CFTR、HSD3B7、CYP7B1、AKR1D1、AMACR、CYP27A1、BAAT、GBA、ALDOB、LIPA、UGT1A1、ABCC2、SLCO1B1、SLCO1B3、ATP8B1、ABCB11、ABCB4、TJP2、NR1H4、VPS33B、VIPAS39、JAG1、ATP7B、NOTCH2和BCHE共43个基因全部的703个外显子和剪接区，其中UGT1A1基因还包括了启动子区TATA-box、苯巴比妥增强子区以及近端元件区，共设计合成了1119对引物，另外PYGL基因的第17扩增子设计合成了另外7条正向简并引物。共计2245条引物，其碱基序列如SEQ ID No.1～SEQ ID No.2245所示。

检测的基因及区域：

优化后引物如下表：

上述SEQ ID No.1～SEQ ID No.2245全部引物或部分引物对混合，装载在同一个包装管或至多2个包装管里，组成引物混合池，可同时一次性检测20种遗传代谢性肝病的41个亚型或至少其中一种亚型的基因变异位点。

实施例2检测样本处理和DNA提取

本发明的检测样本可以是全血、血凝块、新鲜病理组织、石蜡包埋组织，本实施例仅以全血样本为例进行说明。

为减少各种抗凝剂对PCR反应的干扰，应采用EDTA-K2抗凝的采血管采集静脉血，静脉血应当天进行DNA的提取和纯化，如果当天不能及时提取，则应放4℃冰箱保存。可采用DNA提取试剂盒或者全自动DNA提取仪等常规DNA提取纯化的方法进行。于Nanodrop 2000微量核酸蛋白检测仪检测DNA浓度，测定260/280比值以及260/230比值。所提DNA经0.5％琼脂糖凝胶电泳，可见清晰的电泳条带，长度大于20kb，无明显降解(如图1所示)，且样本浓度大于10ng/μL、260/280控制在1.8-2.0之间视为合格。DNA短期保存可存于4℃，长期保存需置于-20℃或-70℃冰箱。

实施例3构建多种遗传代谢性肝病靶向文库

将实施例2中提取的样本DNA进行标化处理，调整浓度至40-50ng/ul作为扩增模板，采用实施例1所述SEQ ID No.1～SEQ ID No.2245引物中的全部或者部分引物组成的引物混合池，进行超高重PCR扩增。按照以下扩增体系和条件进行PCR扩增，也可按照以下体系的倍比体积或等浓度体系进行超高重PCR扩增：

优选的，超高重PCR扩增条件为：95℃10min；98℃15s，60℃5mim，10个循环；10℃∞。即95℃预变性10分钟；98℃变性15秒，60℃退火5分钟，共10个循环。

扩增产物磁珠纯化、去除非特异性产物、再纯化，获得目标基因的靶向文库。可采用常规方法添加高通量测序引物及barcode标签，以减少后期测序费用。

实施例4方法学评价及样本验证

选取10例有明确变异位点的患者，采用本发明方法构建多种遗传代谢性肝病靶向文库，常规二代高通量测序、生物信息学分析，筛选和解读SNV和indel变异位点，评价本发明检测的所有43个基因的703个外显子区及剪接区的覆盖情况。与样本已明确的变异位点比较，评价本方法的准确性。

覆盖度：10个样本的检测结果显示，对于目标区域的703个片段的116777bp范围内，有116454bp检出、323bp未检测到，覆盖度达99.72％，经数据库比对，这些未覆盖到的局部区域不存在致病变异，不影响结果判读。具体情况见下表：

准确性评估：与46个已明确的变异比较，本发明方法检出变异位点的位置和基因型的符合率和准确性为100％。见下表：

实施例5本发明试剂盒的使用方法

(1)DNA模板准备：采用常规方法提取样本DNA，质检合格后放冰箱4℃暂时存放。对于冻存DNA于用前从-20℃或-70℃冰箱取出解冻，然后置于冰上。

(2)试剂准备及批量配置：酶取出置冰上，混合引物池及其他试剂取出解冻。

(3)加样：优选的，按10μL体系加样。也可以按12.5μL、25μL以及50μL等体系加样，按倍比调整各试剂的加样量即可。10μL加样体系如下：

(4)扩增：加样完成后，对PCR管可瞬时离心将样本和试剂聚于管底，取出PCR管置于PCR扩增仪上进行扩增。优选的，超高重PCR扩增条件为：95℃10min；98℃15s，60℃5mim，10个循环；10℃∞。得到的扩增产物4℃保存。

(5)纯化及加接头：扩增产物磁珠纯化、去除非特异性产物、再纯化后，采用常规方法添加高通量测序引物及标签，纯化后获得目标基因的靶向文库。

(6)质检、测序及分析：采用Agilent2100对文库质量进行质检，主峰在280-470bp区间(如图2所示)。合格文库采用常规方法对文库进行高通量二代测序及生物信息学分析，得到样本的变异位点。

综上所述，本发明开发建立了一种基于高通量测序构建多种遗传代谢性肝病靶向文库的引物组合、方法及试剂盒，可用于多种遗传代谢性肝病的致病突变检测、产前筛查和家系成员筛查，该方法覆盖了43个基因的703个外显子区及剪接区，可同时一次性检测20种遗传代谢性肝病的41个亚型的基因变异，该方法操作简单、耗时短、结果准确可靠，大大的节约了Sanger测序逐个基因逐个片段去检测所用的时间成本和人力成本。

Claims (8)

1.基于高通量测序构建多种遗传代谢性肝病靶向文库的引物组合，其特征在于：所述物组合包含碱基序列为SEQ ID No.1～SEQ ID No.2245的共1119对引物以及7条简并引物；检测覆盖SERPINA1、G6PC、SLC37A4、AGL、PYGL、PHKA1、PHKA2、PHKB、PHKG2、GYS2、ASS1、SLC25A13、ASL、HFE、TFR2、SLC40A1、ALAS2、FECH、CFTR、HSD3B7、CYP7B1、AKR1D1、AMACR、CYP27A1、BAAT、GBA、ALDOB、LIPA、UGT1A1、ABCC2、SLCO1B1、SLCO1B3、ATP8B1、ABCB11、ABCB4、TJP2、NR1H4、VPS33B、VIPAS39、JAG1、ATP7B、NOTCH2和BCHE共43个基因全部的703个外显子和剪接区。

2.根据权利要求1所述引物组合在制备检测遗传代谢性肝病试剂中的应用。

3.基于高通量测序构建多种遗传代谢性肝病靶向文库的试剂盒，包含碱基序列为SEQID No.1～SEQ ID No.2245的全部引物或部分引物对。

4.根据权利要求3所述基于高通量测序构建多种遗传代谢性肝病靶向文库的试剂盒，其特征在于：所述碱基序列为SEQ ID No.1～SEQ ID No.2245的全部引物或部分引物对装载于同一个包装管或至多2个包装管里。

5.根据权利要求3或4所述基于高通量测序构建多种遗传代谢性肝病靶向文库的试剂盒，其特征在于：使用所述试剂盒构建的体系为，无核酸酶的超纯水2.8μL，2×PCR缓冲液5μL，DNA聚合酶0.2μL，浓度为250nM的引物组合1μL，浓度为40-50ng/μL的样本DNA模板1μL。

6.基于高通量测序构建多种遗传代谢性肝病靶向文库的构建方法，其特征在于：碱基序列为SEQ ID No.1～SEQ ID No.2245的全部引物或部分引物对，用待检测的标化人基因组DNA作为模板进行超高重PCR扩增、纯化、去除非特异性产物、再纯化，获得多种遗传代谢性肝病目标基因的靶向文库。

7.根据权利要求6所述基于高通量测序构建多种遗传代谢性肝病靶向文库的构建方法，其特征在于：所述超高重PCR扩增体系为：

或所述扩增体系为上述体系的倍比体积或等浓度体系。

8.根据权利要求6或7所述基于高通量测序构建多种遗传代谢性肝病靶向文库的构建方法，其特征在于：所述超高重PCR扩增条件为：95℃10min；98℃15s，60℃5mim，10个循环；10℃∞。