CN106399504A - 基于靶向新一代测序的耳聋基因检测集合、试剂盒及检测方法 - Google Patents

基于靶向新一代测序的耳聋基因检测集合、试剂盒及检测方法 Download PDF

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CN106399504A CN201610832589.0A CN201610832589A CN106399504A CN 106399504 A CN106399504 A CN 106399504A CN 201610832589 A CN201610832589 A CN 201610832589A CN 106399504 A CN106399504 A CN 106399504A
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Abstract

本发明公开了一种基于靶向新一代测序的耳聋基因检测集合、试剂盒及检测方法。耳聋基因检测集合包括258个基因和81个非CDS区域以及全线粒体组。检测方法包括：针对所述的部分或全部的耳聋病的基因及位点设计引物；以待测样本的DNA为模板，利用所述的引物进行PCR扩增，并基于扩增产物构建耳聋检测基因文库；根据所述的耳聋检测基因文库建立测序模板，进行高通量测序，分析测序数据信息。本发明还公开了相关试剂盒。本发明不仅能够检出现有已知突变，还能够检出新发突变类型等优点；另外能短时间内完成大量目的区域的测序和分析，对于耳聋相关的几百个基因的全部外显子和调控区有可能发生致病突变的位置进行相关测序和分析。

Description

基于靶向新一代测序的耳聋基因检测集合、试剂盒及检测 方法
技术领域
本发明属于基因工程领域，尤其涉及一种基于靶向新一代测序的耳聋基因检测集合、试剂盒及检测方法。
背景技术
耳聋是语言学习及交流的最大的障碍，其中50％～70％可能与遗传因素有关。在世界范围内，每1000名新生儿中就有1名先天性耳聋患儿。在发达国家，先天性耳聋患者中至少50％是由遗传因素造成的。据我国卫生部2012年出生缺陷防治报告显示，先天性听力障碍在目前出生缺陷中位居首位约1‰-3‰，每年新发出生缺陷达90万例，先天性听力障碍约3.5万例，听力语言残疾者达2780万以上，并以每年新生2-3万聋儿快速增长。绝大部分遗传性耳聋为非综合征性耳聋，不伴随其他系统疾病。
遗传性耳聋主要有隐性、显性、伴性染色体遗传和线粒体母系遗传四种遗传方式。目前已发现近300个耳聋疾病相关基因。在我国，常见的耳聋相关基因及突变热点包括GJB2、(35delG、176del16bP、235delC及299-300delAT)，GJB3(538C>T及547G>A)、SLC26A4(IVS7-2A>G、2168A>G)和线粒体DNA12SrRNA(A1555G)。
传统耳聋基因研究主要采用定位克隆技术，集中在候选基因克隆和位置候选基因克隆，但流程复杂效率不高。Sanger测序是临床分子诊断的金标准，但是检测效率低、成本高，传统的酶切、杂交、TaqMan探针、DHPLC和HRM等方法针对突变热点进行检测，但检测通量较低。近几年微阵列芯片技术的发展可以同时针对数百个突变位点进行高通量检测，极大提高了诊断效率，降低了检测成本。但微阵列芯片技术存在检测周期长、检测成本相对较高，对除点突变之外的其他突变类型的检出能力有限的缺点。以上策略均不适于大量的耳聋散发病例和小家系的研究，特别是对一些罕见的综合征型耳聋。
发明内容
发明目的：针对现有技术中存在的问题，本发明的其中一个目的是提供基于靶向新一代测序的耳聋基因检测集合，较为全面的展现了与聋病相关的基因及位点。本发明的第二个目的是提供高通量、检测成本低、检测区域大、适用范围广的基于靶向新一代测序的耳聋基因检测方法，本发明的第三个目的是提供基于靶向新一代测序的耳聋基因检测试剂盒。
技术方案：一种基于靶向新一代测序的耳聋基因检测集合，包括：人聋病的基因及位点，其中，
所述聋病的基因包括ACSL4、ACTB、ACTG1、ADCY1、ADD1、AGAP1、AIFM1、ALDH7A1、ALMS1、ALX3、AQP1、AQP2、AQP3、ATP2B2、ATP6V0A4、ATP6V1B1、ATP6V1B2、BAI1、BCS1L、BSND、CABP2、CACNA1D、CAMSAP3、CATSPER2、CCDC50、CDH23、CEACAM16、CEMIP、CHD7、CIB2、CISD2、CLDN14、CLIC5、CLPP、CLRN1、COCH、COL11A1、COL11A2、COL2A1、COL4A3、COL4A4、COL4A5、COL4A6、COL9A1、COL9A2、COL9A3、CRYM、DCDC2、DFNA5、DFNB31、DFNB59、DIABLO、DIAPH1、DIAPH3、DLX5、DNMT1、DSPP、ECE1、ECM1、EDN3、EDNRA、EDNRB、ELMOD3、EPS8、ERCC2、ERCC3、ESPN、ESRRB、ESRRG、EYA1、EYA4、FAM107B、FAM65B、FAS、FBXO33、FCGR2A、FCGR3A、FGF3、FGF8、FGFR1、FGFR2、FGFR3、FLNA、FOXI1、FOXO3、FREM1、FXN、GATA3、GIPC3、GJA1、GJB1、GJB2、GJB3、GJB4、GJB6、GJC3、GLI3、GPR152、GPR98、GPSM2、GRHL2、GRXCR1、GRXCR2、GSTP1、HAL、HARS、HARS2、HCFC1、HGF、HLA-DRB1、HMX1、HOXA1、HOXA2、HSD17B4、HSPA1A、IGF1、IL13、IL1A、ILDR1、JAG1、KARS、KCNE1、KCNE3、KCNJ10、KCNQ1、KCNQ4、KLC2、KLHL18、KRT9、LAMA3、LARS2、LHFPL5、LHX3、LOXHD1、LRIG1、LRP2、LRTOMT、MARVELD2、MASP1、MCPH1、MIR96、MITF、MKRN2、MPZ、MSRB3、MTAP、MYH14、MYH9、MYO15A、MYO1A、MYO1C、MYO1F、MYO3A、MYO6、MYO7A、NDP、NDRG1、NF2、NOS1、NOS2、NR2F1、OCM、OPA1、OSBPL2、OTOA、OTOF、OTOG、OTOGL、OTOR、P2RX2、PABPN1、PAN3、PARP1、PAX2、PAX3、PAX9、PCDH15、PCDH9、PDSS1、PDZD7、PEPD、PEX3、PEX6、PHEX、PHF20、PMP22、PNPT1、POLR1C、POLR1D、POU3F4、POU4F3、PROK2、PROKR2、PRPS1、PRRX1、PTPN22、PTPRQ、RDX、RPGR、SALL1、SALL4、SCARF2、SEC23A、SEMA3E、SERAC1、SERPINB6、SETD5、SIX1、SIX2、SIX5、SLC12A1、SLC17A8、SLC19A2、SLC25A21、SLC26A4、SLC26A5、SLC4A11、SLITRK6、SMAD4、SMPX、SNAI2、SOBP、SOX10、SOX2、SOX9、SPINK5、SPNS2、SRSF7、STRC、SYNE4、TBC1D24、TBL1X、TCF21、TCOF1、TECTA、TFCP2、TIMM8A、TJP2、TMC1、TMEM126A、TMIE、TMPRSS3、TMPRSS5、TNC、TNFRSF11B、TPRN、TRAM2、TRIOBP、TRMU、TSHZ1、TSPEAR、USH1C、USH1G、USH2A、WBP2、WFS1、YWHAE和ZCCHC14；
所述位点如下表所示：
申请人经过在OMIM、Clinvar、The Hereditary Hearing loss Homepage、DVD等数据库中收集与整理，并参考美国医学遗传学与基因组学学会(ACMG)联合分子病理学学会(AMP)发布的基因变异的解读标准及指导原则筛选出致病和可能致病的位点和基因。基因：只要该基因的突变能导致耳聋的发生(致病和可能致病)；线粒体：考虑到线粒体基因的突变能导致聋病，加之部分位点的突变能否导致聋病尚未有确切的答案，所以把所有线粒体序列都包含进去。非CDS：部分能导致或可能导致耳聋发生的位点不在以上所述位置，将这类位点单独列出来。另外申请人还进行了大量的耳聋相关样本收集、测序和数据筛选，结合数据库筛选和实际样本检测筛选，申请人获得了上述基因和位点，上述核基因共计258个，位点包括81个核的非CDS区域以及全线粒体组，能够较为全面的展现与聋病相关的基因与位点，这些基因和位点也是目前耳聋相关疾病涵盖面最广的、适用人群最广的panel。上述具体的基因和位点可以在文献或者本领域通用数据库中进行查询。
本发明还公开了一种用于疾病或非疾病诊断目的的基于靶向新一代测序的耳聋基因检测方法，包括：
(1)针对所述的部分或全部的聋病的基因及位点设计引物；
(2)以待测样本的DNA为模板，利用所述的引物进行PCR扩增，并基于扩增产物构建耳聋检测基因文库；
(3)根据所述的耳聋检测基因文库建立测序模板，进行高通量测序，分析测序数据信息。
步骤(1)中，“部分”的含义为：所述的耳聋基因检测集合(panel)中的所有基因或位点可以自由组合，如可以是任意的2个、3个、30个、150-339个、200-339个、250-339个、300-339个等等自由组合，至于选择哪些基因和位点可以根据自己的需求(如耳聋的表型或用途)进行设置，例如筛选药物致聋的时候可以选择线粒体的12SrRNA，筛选大前庭水管综合症可以选择SLC26A4、FOXI1、KCNJ10等。同时选择基因或位点时也可兼顾基于高通量测序的成本和速度等。当选择全部的基因和位点时可以较为全面的进行检测。
基于测序方法设计引物时，一对引物的扩增的片段长度通常为150-275bp，因此对某一基因或位点设计引物时可能需要多对引物。对于引物设计的扩增区域选择原则为：针对基因设计引物时，所有引物对扩增区域应覆盖基因的所有外显子序列、外显子上游5bp内的序列。针对位点设计引物时，所有引物对扩增区域应覆盖上述位点序列。对于上述扩增区域，可采用一般通用的引物设计原则利用常用引物设计软件如primer、Oligo、在线软件等进行设计。
步骤(2)中，PCR扩增时，10μL体系中，DNA模板的加入量为10～100ng，优选为20～50ng，更优选为30～40ng。所述PCR扩增的程序为：99℃酶活化2min；99℃变性15s，60℃退火与延伸16min，15个循环；10℃持续结束。通过提高DNA的量、延迟反应的时间增加扩增的均一性。
耳聋检测基因文库的构建步骤包括：
1)引物的消化：将PCR扩增后的反应液加入消化试剂进行消化反应；
2)加接头：消化后的产物连接接头，加接头结束后纯化得到文库。
所述的消化试剂为FuPa试剂。
所述的接头为P1接头和barcode接头。
连接接头时，对反应条件进行优化，反应条件为：22℃，30min；68℃，5min；72℃，5min；10℃，不超过60min。
纯化后的文库可根据实际需要选择是否需要进行扩增。
构建基因文库可采用市售试剂盒，测序模板的制备可采用测序仪配套的试剂及使用说明进行。测序仪可以采用DA8600测序仪。
测序技术后，对测序数据进行分析即可获得耳聋相关基因变异信息。
本发明所述待检测样本为血液、干血斑或羊水。
本发明还提供了所述的基于靶向新一代测序的耳聋基因检测试剂盒，包括：
引物：针对所述的部分或全部的耳聋病的基因及位点进行设计，用于对待检测DNA进行PCR扩增；
PCR扩增试剂，用于对待检测DNA进行PCR扩增；
文库构建试剂，用于对PCR扩增产物进行文库构建；
测序试剂，用于对文库进行高通量测序模板的制备和上机测序。
其中关于引物，可以采用关于上述测序方法中关于步骤(1)论述的内容进行基因及位点的选择以及引物设计原则设计引物。
PCR扩增试剂、文库构建试剂以及测序试剂可采用市售的相关试剂即可。
与现有技术相比，本发明的有益效果为：
本发明所提供的基因集合能够较为全面的展现与聋病相关的基因与位点，是目前耳聋相关疾病涵盖面最广的、适用人群最广的panel。
本发明提供的检测方法及检测试剂盒具有如下优点：
1.通量高：不仅能够检出现有已知突变，还能够检出新发突变类型等优点。
2.检测区域大：能在短时间内完成大量目的区域的测序和分析，对于耳聋相关的几百个基因的全部外显子和调控区有可能发生致病突变的位置进行相关测序和分析，含SNP、indel、CNV等。
3.平均成本低、速度快：通过本方法均能一次性全面检测耳聋相关基因的所有变异情况，而且平均每个基因全外显子检测成本低于10元。
4.适用范围广：从适用人群来看，不仅仅满足患者的检测需求，还能满足疑似患者和正常人的检测需求；从样本类型上看，可以有多种选择，如足跟血、全血、羊水等；从功能上看，能为受检者提供干预指导，包括耳聋防治的婚前指导、耳聋相关用药指导、早期干预与防治等。
附图说明
图1为靶向高通量测序检测流程图；
图2为基因靶向捕获数据分析流程。
具体实施方式
下面结合具体实施例，进一步阐明本发明，应理解这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围，在阅读了本发明之后，本领域技术人员对本发明的各种等价形式的修改均落于本申请所附权利要求所限定的范围。
实现本发明方法主要包括检测遗传性耳聋的目的基因的确定和检测方法的开发。
(1)遗传性耳聋目的基因的确定
耳聋具有高度的遗传异质性，通常分为非综合征型遗传性耳聋和综合征型遗传性耳聋。目前已发现近300个耳聋疾病相关基因，截止2015年11月，本研究通过在OMIM、Clinvar、The Hereditary Hearing loss Homepage、DVD等数据库中收集，并自主进行大量样本收集、测序和数据筛选，汇总所有与人的耳聋相关的基因，汇总结果包括258个基因和81个非CDS区域，以及全线粒体组。
上述258个基因为：ACSL4、ACTB、ACTG1、ADCY1、ADD1、AGAP1、AIFM1、ALDH7A1、ALMS1、ALX3、AQP1、AQP2、AQP3、ATP2B2、ATP6V0A4、ATP6V1B1、ATP6V1B2、BAI1、BCS1L、BSND、CABP2、CACNA1D、CAMSAP3、CATSPER2、CCDC50、CDH23、CEACAM16、CEMIP、CHD7、CIB2、CISD2、CLDN14、CLIC5、CLPP、CLRN1、COCH、COL11A1、COL11A2、COL2A1、COL4A3、COL4A4、COL4A5、COL4A6、COL9A1、COL9A2、COL9A3、CRYM、DCDC2、DFNA5、DFNB31、DFNB59、DIABLO、DIAPH1、DIAPH3、DLX5、DNMT1、DSPP、ECE1、ECM1、EDN3、EDNRA、EDNRB、ELMOD3、EPS8、ERCC2、ERCC3、ESPN、ESRRB、ESRRG、EYA1、EYA4、FAM107B、FAM65B、FAS、FBXO33、FCGR2A、FCGR3A、FGF3、FGF8、FGFR1、FGFR2、FGFR3、FLNA、FOXI1、FOXO3、FREM1、FXN、GATA3、GIPC3、GJA1、GJB1、GJB2、GJB3、GJB4、GJB6、GJC3、GLI3、GPR152、GPR98、GPSM2、GRHL2、GRXCR1、GRXCR2、GSTP1、HAL、HARS、HARS2、HCFC1、HGF、HLA-DRB1、HMX1、HOXA1、HOXA2、HSD17B4、HSPA1A、IGF1、IL13、IL1A、ILDR1、JAG1、KARS、KCNE1、KCNE3、KCNJ10、KCNQ1、KCNQ4、KLC2、KLHL18、KRT9、LAMA3、LARS2、LHFPL5、LHX3、LOXHD1、LRIG1、LRP2、LRTOMT、MARVELD2、MASP1、MCPH1、MIR96、MITF、MKRN2、MPZ、MSRB3、MTAP、MYH14、MYH9、MYO15A、MYO1A、MYO1C、MYO1F、MYO3A、MYO6、MYO7A、NDP、NDRG1、NF2、NOS1、NOS2、NR2F1、OCM、OPA1、OSBPL2、OTOA、OTOF、OTOG、OTOGL、OTOR、P2RX2、PABPN1、PAN3、PARP1、PAX2、PAX3、PAX9、PCDH15、PCDH9、PDSS1、PDZD7、PEPD、PEX3、PEX6、PHEX、PHF20、PMP22、PNPT1、POLR1C、POLR1D、POU3F4、POU4F3、PROK2、PROKR2、PRPS1、PRRX1、PTPN22、PTPRQ、RDX、RPGR、SALL1、SALL4、SCARF2、SEC23A、SEMA3E、SERAC1、SERPINB6、SETD5、SIX1、SIX2、SIX5、SLC12A1、SLC17A8、SLC19A2、SLC25A21、SLC26A4、SLC26A5、SLC4A11、SLITRK6、SMAD4、SMPX、SNAI2、SOBP、SOX10、SOX2、SOX9、SPINK5、SPNS2、SRSF7、STRC、SYNE4、TBC1D24、TBL1X、TCF21、TCOF1、TECTA、TFCP2、TIMM8A、TJP2、TMC1、TMEM126A、TMIE、TMPRSS3、TMPRSS5、TNC、TNFRSF11B、TPRN、TRAM2、TRIOBP、TRMU、TSHZ1、TSPEAR、USH1C、USH1G、USH2A、WBP2、WFS1、YWHAE、ZCCHC14。
上述81个非CDS区域和全线粒体组位置如表1。
表1 81个非CDS区域和线粒体位置
该方法能够检测出258个基因和81个非CDS区域以及全线粒体组的突变情况及具体突变类型(含SNP、indel、CNV等)，并针对这些基因的外显子、外显子上游5bp以及非CDS区域和全线粒体组进行多重PCR的引物设计，总共6140对引物，这六千多对引物的扩增产物覆盖上述258个基因的所有外显子序列、外显子上游5bp内序列(即外显子上游第1～5bp范围)，以及覆盖上述81个非CDS区域和线粒体序列，每对引物的扩增的片段长度通常为150-275bp，对于上述确定的扩增区域，可采用一般通用的引物设计原则利用常用引物设计软件如primer、Oligo、在线软件等进行设计。序列表中列举了部分引物，其他引物不再一一列举，本领域技术人员根据上述引物设计的指导可以自主设计，并不影响本发明的实施。申请人将将这些引物分在不同的管内，标记为DGP Primer Pool 1和DGP Primer Pool 2。也可以组合识别，即选择在上述基因、非CDS区域和线粒体中任意组合，将所选择的基因对应的引物混合即可检测以下含有的目的区域。
(2)检测方法的开发
基本流程如图2所示，首先需要将接受的样本中进行全基因组DNA的提取，并将检测合格的DNA进行多重PCR，然后再进行文库的构建，文库的构建包括引物的消化、加接头、文库扩增(此步骤也可以省略)，再通过qPCR或者qubit质检，质检通过则进行乳液PCR，再进行ES富集，之后再进行上机测序，测序下机的数据通过质检，则进行生物信息分析，生物信息的过程见图2。得到的突变位点进一步进行sanger验证，验证之后即可进行报告的发放和对受检者进行遗传咨询。
为了更加清楚明白的表达本方法的目的、技术方案，以下结合具体实施例和附图对本方法做进一步说明。
实施例1 外周血耳聋相关基因检测
1.样本
先天性听力损失患者的外周血样本，对其进行基因检测，检测致病突变。
2.基因组核酸抽提
离心柱法抽提血液样本的基因组DNA，采用核酸纯化试剂纯化基因组DNA。采用Qubit 2.0荧光计检测所提取核酸质量。
3.多重PCR
多重PCR及“4.耳聋检测基因文库构建”采用市售的多重PCR文库构建试剂盒，本实施例采用的试剂盒品牌为life，名称为Ion AmpliSeqTMLibrary Kit 2.0-96LV，货号为4480441。但试剂盒并不仅限于此。
按表2配制PCR反应体系，按表3程序进行PCR扩增。
表2 基因组DNA目标区域PCR扩增体系
表3 基因组DNA目标区域PCR扩增程序
4.耳聋检测基因文库构建
4.1 部分消化引物序列
上述扩增后的PCR反应液中加入1μL FuPa试剂，按表4程序进行消化反应。
表4 部分消化引物序列反应程序
温度 时间
50℃ 10min
55℃ 10min
60℃ 20min
10℃ 持续(最长1h)
4.2 连接接头
按表5配置连接反应，按表6在PCR仪上运行连接反应。
表5 接头连接反应体系
表6 接头连接反应过程
温度 时间
22℃ 30min
68℃ 5min
72℃ 5min
10℃ 持续(不超过1h)
4.3 纯化
核酸纯化试剂(磁珠法)纯化上述文库。
需要说明的是：
上述核酸纯化试剂应于室温平衡30min并充分振荡将磁珠混匀，使用时缓慢吸取。70％乙醇需要新鲜配置。
4.4 扩增文库(选择性的做)
(1)上述含有文库的磁珠中加入25μL文库扩增混合液和1μL的文库扩增引物混合液。置于磁力架，静置2min，转移至PCR管中。按表7进行扩增反应。
表7 扩增文库反应过程
(2)文库的纯化
使用核酸纯化试剂纯化上述扩增后文库。最后加入25μL low TE缓冲液充分洗涤磁珠，混匀。室温静置5min。置于磁力架上，静置2分钟或待溶液变清澈。移上清至新离心管。
4.5 文库的定量
qubit 2.0荧光计检测上述文库质量。文库浓度低于0.2ng/μL为不合格，需要重建库。若用qPCR对上述文库进行检测，文库浓度不低于100pM。
5.高通量测序模板制备(乳液PCR和ES富集)
高通量测序模板制备操作流程参考DA8600测序仪配套的试剂及使用说明。
6.高通量测序
高通量测序使用DA8600测序仪，按照测序仪标准操作规程进行。
7.信息分析
7.1 原始数据的分析
从测序仪获取原始数据(FASTQ数据)，对原始数据进行质量控制，把trim score小于13的数据去除。再参考hg19，运用但不仅限于SOAP软件对过滤后的数据进行序列比对，再运用但不仅限于GATK软件包进行序列的校正。再运用variantCaller进行SNP、indel、CNV等突变分析，生成一个vcf文件。
7.2 结果过滤
将上一步骤中筛选出来的突变信息(vcf文件)进行筛选。筛选内容包括reads小于5的片段去除。再主要参考ExAC、Clinvar、1000Genomes、DVD等数据库，将数据分成三类：I对数据库里已有报道致病的突变直接按照ACMG(美国医学遗传学与基因组学学会)的分类标准进行分类，II未标注的突变需要进一步除去高频(等位基因频率大于1％)的突变，III把未知突变中的稀有突变(MAF(最小等位基因频率)小于1％)的进行下一步分析。
7.3 基因筛选
将上一步骤中的III类数据进一步进行假阳性估计和过滤，再运用Annovar软件包进行突变位点的注释，再和I类数据一起按照ACMG的分类标准进行分类，并结合临床信息和家系信息挑选位点。
7.sanger验证
根据上一步骤中筛选出的位点，运用Primer Premier 5或者Primer-BLAST等软件进行对应位点的引物设计并对样本进行PCR。Sanger测序参考3730xl等测序仪及试剂进行。
8.结果分析
测序数据统计结果见表8，检出的候选突变信息如表9。
表8：测序数据统计表
目标区长度(bp) 730.05kb 目标区覆盖度 99.6％
数据产量 8M reads 捕获特异性 100％
目标区平均深度 1139 均一性 88％
总变异位点数 1337 变异分数 0.1％
目的区SNP数 1258 INDEL数 62
内含子突变数 763 外显子突变数 507
致病位点数 2 Splicing位点数 5
表9：检出的候选突变信息表

Claims (10)

1.一种基于靶向新一代测序的耳聋基因检测集合，其特征在于，包括：人聋病的基因及位点，其中，
所述聋病的基因包括ACSL4、ACTB、ACTG1、ADCY1、ADD1、AGAP1、AIFM1、ALDH7A1、ALMS1、ALX3、AQP1、AQP2、AQP3、ATP2B2、ATP6V0A4、ATP6V1B1、ATP6V1B2、BAI1、BCS1L、BSND、CABP2、CACNA1D、CAMSAP3、CATSPER2、CCDC50、CDH23、CEACAM16、CEMIP、CHD7、CIB2、CISD2、CLDN14、CLIC5、CLPP、CLRN1、COCH、COL11A1、COL11A2、COL2A1、COL4A3、COL4A4、COL4A5、COL4A6、COL9A1、COL9A2、COL9A3、CRYM、DCDC2、DFNA5、DFNB31、DFNB59、DIABLO、DIAPH1、DIAPH3、DLX5、DNMT1、DSPP、ECE1、ECM1、EDN3、EDNRA、EDNRB、ELMOD3、EPS8、ERCC2、ERCC3、ESPN、ESRRB、ESRRG、EYA1、EYA4、FAM107B、FAM65B、FAS、FBXO33、FCGR2A、FCGR3A、FGF3、FGF8、FGFR1、FGFR2、FGFR3、FLNA、FOXI1、FOXO3、FREM1、FXN、GATA3、GIPC3、GJA1、GJB1、GJB2、GJB3、GJB4、GJB6、GJC3、GLI3、GPR152、GPR98、GPSM2、GRHL2、GRXCR1、GRXCR2、GSTP1、HAL、HARS、HARS2、HCFC1、HGF、HLA-DRB1、HMX1、HOXA1、HOXA2、HSD17B4、HSPA1A、IGF1、IL13、IL1A、ILDR1、JAG1、KARS、KCNE1、KCNE3、KCNJ10、KCNQ1、KCNQ4、KLC2、KLHL18、KRT9、LAMA3、LARS2、LHFPL5、LHX3、LOXHD1、LRIG1、LRP2、LRTOMT、MARVELD2、MASP1、MCPH1、MIR96、MITF、MKRN2、MPZ、MSRB3、MTAP、MYH14、MYH9、MYO15A、MYO1A、MYO1C、MYO1F、MYO3A、MYO6、MYO7A、NDP、NDRG1、NF2、NOS1、NOS2、NR2F1、OCM、OPA1、OSBPL2、OTOA、OTOF、OTOG、OTOGL、OTOR、P2RX2、PABPN1、PAN3、PARP1、PAX2、PAX3、PAX9、PCDH15、PCDH9、PDSS1、PDZD7、PEPD、PEX3、PEX6、PHEX、PHF20、PMP22、PNPT1、POLR1C、POLR1D、POU3F4、POU4F3、PROK2、PROKR2、PRPS1、PRRX1、PTPN22、PTPRQ、RDX、RPGR、SALL1、SALL4、SCARF2、SEC23A、SEMA3E、SERAC1、SERPINB6、SETD5、SIX1、SIX2、SIX5、SLC12A1、SLC17A8、SLC19A2、SLC25A21、SLC26A4、SLC26A5、SLC4A11、SLITRK6、SMAD4、SMPX、SNAI2、SOBP、SOX10、SOX2、SOX9、SPINK5、SPNS2、SRSF7、STRC、SYNE4、TBC1D24、TBL1X、TCF21、TCOF1、TECTA、TFCP2、TIMM8A、TJP2、TMC1、TMEM126A、TMIE、TMPRSS3、TMPRSS5、TNC、TNFRSF11B、TPRN、TRAM2、TRIOBP、TRMU、TSHZ1、TSPEAR、USH1C、USH1G、USH2A、WBP2、WFS1、YWHAE和ZCCHC14；
所述位点如下表所示：
2.一种用于非疾病诊断目的的基于靶向新一代测序的耳聋基因检测方法，其特征在于，包括：
(1)针对权利要求1所述的部分或全部的聋病的基因及位点设计引物；
(2)以待测样本的DNA为模板，利用所述的引物进行PCR扩增，并基于扩增产物构建耳聋检测基因文库；
(3)根据所述的耳聋检测基因文库建立测序模板，进行高通量测序，分析测序数据信息。
3.根据权利要求2所述的耳聋基因检测方法，其特征在于，步骤(1)中，针对基因设计引物时，所有引物对扩增区域覆盖基因的所有外显子序列、外显子上游5bp内的序列。
4.根据权利要求2所述的耳聋基因检测方法，其特征在于，步骤(1)中，针对位点设计引物时，所有引物对扩增区域覆盖上述位点序列。
5.根据权利要求2所述的耳聋基因检测方法，其特征在于，步骤(2)中，PCR扩增时，10μL体系中，DNA模板的加入量为10～100ng。
6.根据权利要求2所述的耳聋基因检测方法，其特征在于，步骤(2)中，所述PCR扩增的程序为：99℃酶活化2min；99℃变性15s，60℃退火与延伸16min，15个循环；10℃持续结束。
7.根据权利要求2所述的耳聋基因检测方法，其特征在于，步骤(2)中，耳聋检测基因文库的构建步骤包括：
1)引物的消化：将PCR扩增后的反应液加入消化试剂进行消化反应；
2)加接头：消化后的产物连接接头，加接头结束后纯化得到文库。
8.根据权利要求7所述的耳聋基因检测方法，其特征在于，连接接头时，反应条件为：22℃，30min；68℃，5min；72℃，5min；10℃，不超过60min。
9.根据权利要求2所述的耳聋基因检测方法，其特征在于，所述待检测样本为血液、干血斑或羊水。
10.一种基于靶向新一代测序的耳聋基因检测试剂盒，其特征在于，包括：
引物：针对权利要求1所述的部分或全部的聋病的基因及位点进行设计，用于对待检测DNA进行PCR扩增；
PCR扩增试剂，用于对待检测DNA进行PCR扩增；
文库构建试剂，用于对PCR扩增产物进行文库构建；
测序试剂，用于对文库进行高通量测序模板的制备和上机测序。
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