CN108753959B - 一种位于disc1fp1基因的与放疗引起的放射性脑损伤相关的snp标志物及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了DISC1FP1基因上的SNP位点rs10501719作为与肿瘤放疗引起的放射性脑损伤发病风险相关的标志物的应用。同时,制备得到一种预测肿瘤放疗引起的放射性脑损伤发病风险的试剂盒,利用该试剂盒检测SNP标志物分型,联合患者临床信息可以更加全面准确的评估鼻咽癌患者发生放射性脑损伤的患病风险。将本发明运用于临床中,针对高危患者提前采取保护措施,有助于实现患者的个体化治疗,提高鼻咽癌患者的长期生存质量。同时,可以为其他放疗引起的正常组织损伤的风险预测提供方法和策略上的借鉴。
Description
技术领域
本发明涉及基因工程和肿瘤学技术领域,更具体地,涉及一种位于DISC1FP1基因的与放疗引起的放射性脑损伤相关的SNP标志物及其应用。
背景技术
放疗是鼻咽癌首选的治疗方式,而放疗引起的放射性脑损伤是鼻咽癌患者最严重的晚期不良反应之一。该不良反应往往具有不可逆性,其临床症状包括头晕、头痛、记忆下降、认知功能障碍等,极大地影响患者的生活质量。放射性脑损伤一旦发生,治疗颇为困难,临床上一般给予激素、神经节苷脂或胞二磷胆碱等药物治疗,或者高压氧或手术治疗。近年来发现贝伐单抗和神经生长因子也有一定的疗效。这些治疗方式大多数只能一定程度上缓解患者的症状,而且部分药物长期使用将可能引起其他的不良反应。因此,对接受放疗的鼻咽癌患者进行放射性脑损伤发病风险预测,对高危个体提前采取针对性的保护措施,实现鼻咽癌的个体化治疗,显得尤为重要。
研究表明,多种临床因素与放射性脑损伤的发病风险相关,例如,放疗剂量、肿瘤分期、放疗技术等。然而,在相同的临床因素和治疗手段下,放射性脑损伤的发生及严重程度在不同的病人中仍具有很大差异,这提示,遗传因素可能是放射性脑损伤发生的重要内因。
目前的研究发现,单核苷酸多态性(Single Nucleotide Polymorphism, SNP)是引起正常组织放射性损伤的重要遗传因素。关于放疗引起的正常组织损伤的遗传易感性研究分为候选基因研究和全基因组关联研究。候选基因研究重点关注了DNA损伤修复、细胞周期、炎症反应等通路上的基因在放疗引起的皮肤纤维化、消化道黏膜反应、勃起功能障碍、放射性食管炎和放射性肺炎等早期/晚期副反应中的作用;而全基因组关联研究成功揭示了与乳腺癌和前列腺癌急性/晚期不良反应显著相关的易感位点。这些发现提示我们,遗传因素在放射敏感性的个体差异中起到了重要的作用。
然而,目前关于放射性脑损伤的相关遗传学研究还未见报道。若能筛选出与放疗引起的放射性脑损伤相关的SNP位点,并研制出相应的诊断试剂盒,将可以对放射性脑损伤高危病人进行预测和提前干预,同时还可以推广应用到除了鼻咽癌之外的其他接受治疗性或预防性放疗的肿瘤,提高肿瘤病人的生活质量。
发明内容
本发明的目的是为了克服现有技术的不足,提供位于DISC1FP1基因的与放疗引起的放射性脑损伤相关的SNP标志物及其检测方法。
本发明的第一个目的是提供DISC1FP1基因上的SNP位点rs10501719作为与肿瘤放疗引起的放射性脑损伤发病风险相关的标志物的应用。
本发明的第二个目的是提供一对用于检测以上所述的SNP位点的特异性扩增引物。
本发明的第三个目的是提供一对用于检测以上所述的SNP位点的特异性探针。
本发明的第四个目的是提供以上所述SNP标志物,以上所述特异性扩增引物或以上所述特异性探针在制备于预测肿瘤放疗引起的放射性脑损伤发病风险的试剂盒中的应用。
本发明的第五个目的是提供一种用于预测肿瘤放疗引起的放射性脑损伤发病风险的试剂盒。
为了实现上述目的,本发明是通过以下技术方案予以实现的:
发明人通过分离和研究接受放疗并在放疗后不同时间发生放射性脑损伤的鼻咽癌患者外周血DNA中的单核苷酸多态性,寻找与放射性脑损伤高度相关的高特异性和敏感性的SNP,并研制出便于临床应用的预测肿瘤放疗引起的放射性脑损伤发病风险的试剂盒,为放射性脑损伤的预防和控制提供理论依据,为探索和发现具有潜在治疗价值的新药物提供线索。
因此本发明要求保护DISC1FP1基因上的SNP位点rs10501719作为与肿瘤放疗引起的放射性脑损伤发病风险相关的标志物的应用。
优选地,所述肿瘤为鼻咽癌。
优选地,对样本进行危险评分,当危险评分大于2.52时该样本是放射性脑损伤的高危人群,危险评分小于2.52时该样本是放射性脑损伤的低危人群;
危险评分=(0.601×T分期的评分)+(-0.8841×放疗技术的评分)+(0.0196×年龄的评分)+(0.5948×rs10501719分型的评分);
公式中,T分期的评分:对于临床变量T分期,T1=“0”,T2=“1”,T3=“2”,T4=“3”;
放疗技术的评分:对于放疗技术,传统适形放疗=“0”,调强放疗=“1”;
年龄的评分:以实际的年龄代入;
分型的评分:对于SNP分型,野生纯合型=“0”,杂合型=“1”,突变纯合型=“2”。
一对用于检测以上所述的任一SNP位点的特异性扩增引物。
优选地,其核苷酸序列如SEQ ID No:1~2所示。
一对用于检测以上所述的任一SNP位点的特异性探针。
优选地,其核苷酸序列如SEQ ID No:3~4所示。
以上所述SNP标志物,以上所述特异性扩增引物或以上所述特异性探针在制备用于预测肿瘤放疗引起的放射性脑损伤发病风险的试剂盒中的应用,也属于本发明的保护范围。
一种用于预测肿瘤放疗引起的放射性脑损伤发病风险的试剂盒,包含有能对以上所述SNP位点进行分型检测的组分。
优选地,所述组分包括以上所述特异性扩增引物和/或以上所述特异性探针。
优选地,所述组分包括核苷酸序列如SEQ ID No:1~2所示的特异性扩增引物和/或核苷酸序列如SEQ ID No:3~4所示的特异性探针。
优选地,所述试剂盒还含有PCR反应酶和试剂。
优选地,PCR反应酶和试剂包括反应酶、dNTP混合液、MgCl2溶液、去离子水;还可以包含标准品和对照品。
优选地,PCR反应体系为:正向引物、反向引物和分型探针混合物0.3μl ,dNTPMixture (10mM) 0.2μl,MgCl2 (25mM)0.4μl,反应buffer 1μl,反应酶0.1μl,2μl双蒸水和1μl待测 DNA。
优选地,所述试剂盒的PCR反应程序为:60℃,30s,1个循环;95℃,10min,1个循环;95℃,15s和60℃,1min,45个循环;60℃,30s,1个循环。
优选地,所述试剂盒的使用方法,包括以下步骤:
S1. 统计样品SNP分型,临床变量T分期,放疗技术,年龄进行评分。
对于SNP分型,野生纯合型=“0”,杂合型=“1”,突变纯合型=“2”;对于临床变量T分期T1=“0”,T2=“1”,T3=“2”,T4=“3”;对于放疗技术,传统适形放疗=“0”,调强放疗=“1”;对于年龄的评分以实际的年龄(连续型变量)代入。
S2. 根据各项评分计算危险评分,公式如下:
危险评分=(0.601×T分期的评分)+(-0.8841×放疗技术的评分)+(0.0196×年龄的评分)+(0.5948×rs10501719分型的评分)。
当危险评分大于2.52时该样本是放射性脑损伤的高危人群,危险评分小于2.52时该样本是放射性脑损伤的低危人群。
具体地说,本发明解决问题的技术方案包括:
(1)建立统一标准的标本库和数据库:以标准操作程序(SOP)采集符合标准的血液标本,系统收集完整的人口学资料和临床资料。
(2)对患者进行定期MR随访,并根据MR影像进行放射性脑损伤诊断。
(3)基因型检测:对具有完整临床资料和放疗后MR随访的病人,利用全基因组SNP芯片,寻找与放射性脑损伤相关的SNP。
(4)对于筛选出来的显著相关的SNP,进一步采用TaqMan(Applied Biosystems)基因分型平台进行检测,验证将其应用于风险预测的可重复性。
(5)预测肿瘤放疗引起的放射性脑损伤发病风险的试剂盒的研制:根据进展为放射性脑损伤的患者和没有进展为放射性脑损伤的患者中的基因型分布频率有显著差异的SNP开发预测肿瘤放疗引起的放射性脑损伤发病风险的试剂盒。
本发明人以标准操作程序(SOP)采集符合标准的血液标本,系统收集并随访符合纳入标准的病人,采用Illumina Human 610-Quad 芯片进行全基因组SNP扫描,筛选出来的位点采用TaqMan(Applied Biosystems)基因分型进行验证。
具体来说,研究的实验方法主要包括以下几个部分:
1. 研究样本的选择
纳入标准:
(1)具有明确病理诊断及临床分期的鼻咽癌患者;
(2)预期生存大于6个月;
(3)功能状态评分(KPS)≥70分;
(4)年龄18岁-80岁;
(5)具有完整的病历资料(病史、体检、相关检查、既往治疗);
(6)完成放射治疗并定期进行MR影像复查;
(7)自愿参加且签署知情同意书。
同时,排除出现以下任意情况的患者:
(1)患者未完成所有放疗计划;
(2)由于心理、社会、家庭及地理原因不能配合随访的患者;
(3)患者初诊时已发生远处转移;
(4)患者放疗前的鼻咽/颅脑MR影像存在不明原因的异常信号;
(5)患者曾因其他疾病(除鼻咽癌)接受过头颈部放疗。
本研究共采用1082例符合标准的样本纳入发现阶段,进行全基因组SNP扫描;分别采用1119例和741例符合标准的样本纳入两个独立的验证阶段,进行模型的验证。
2. 利用酚-氯仿法提取外周血基因组DNA,按常规方法操作。通常可得到20ng/μl~50ng/μl DNA,纯度(OD 260/280)在1.6-2.0。
3. Illumina Human 610-Quad芯片检测;
(1)取受试者DNA样本;
(2)在Illumina Human 610-Quad芯片进行全基因组扫描;
(3)检测并比较携带各基因型的个体在放射性脑损伤发生率和发生时间的差异。
4. TaqMan(Applied Biosystems)基因分型检测
(1)取受试者DNA样本;
(2)设计SNP特异性扩增引物和特异性探针序列;
(3)进行PCR扩增反应;
(4)根据荧光颜色判读SNP分型结果;
(5)分析并验证携带各基因型的个体在放射性脑损伤发生率和发生时间的差异。
5. 预测肿瘤放疗引起的放射性脑损伤发病风险的试剂盒制备方法
利用Human 610-Quad芯片进行全基因组SNP扫描,确定与放射性脑损伤发生显著相关的SNP位点(rs10501719),作为放射性脑损伤风险预测指标,制作预测肿瘤放疗引起的放射性脑损伤发病风险的试剂盒。试剂盒可以包括这个SNP的特异性引物和特异性荧光探针对,以及反应酶,dNTP等试剂。
6. 统计分析方法
在发现阶段,利用Cox回归模型,分析了人口学因素和临床因素(性别、鼻咽癌患病年龄、临床分期、T分期、治疗方式、放疗技术等)与放射性脑损伤发生的相关性。利用加性模型,将与放射性脑损伤发生显著相关的因素(年龄、T分期、放疗技术(调强放疗vs传统放疗))作为协变量,计算每个SNP的风险比(Hazard Ratio,HR)以及他们的95%置信区间。定义HR值大于1的为危险型SNP,定义HR值小于1的为保护型SNP。
为进一步研究SNP联合临床因素构成的综合指征用于放射性脑损伤风险预测的效果,构建出数学公式,综合考虑SNP的三种基因型以及临床因素进行评分。其中,对于SNP分型,野生纯合型=“0”,杂合型=“1”,突变纯合型=“2”;对于临床变量T分期T1=“0”,T2=“1”,T3=“2”,T4=“3”;对于放疗技术,传统适形放疗=“0”,调强放疗=“1”;对于年龄的评分以实际的年龄(连续型变量)代入。分析时以多因素Cox回归系数β为权重,得到基于rs10501719分型的危险评分的公式如下:
危险评分=(0.601×T分期的评分)+(-0.8841×放疗技术的评分)+(0.0196×年龄的评分)+(0.5948×rs10501719分型的评分)。
获得的危险评分与最优界限值2.52进行比较,应用于全基因组关联研究以及后续两阶段验证的所有随访时间超过3年的样本。
统计学分析均通过分析软件R和plink(v1.9)完成,统计学显著性水平P值设为0.05,所有统计学检验均为双侧检验。
以下是本发明的进一步说明:
对上述接受放射治疗且满足入组条件的1082例鼻咽癌患者进行定期的MR随访并根据影像检查结果记录他们是否发生放射性脑损伤以及发生放射性脑损伤的时间,该事件发生时间数据(time-to-event data)作为结局变量。同时,对这1082例鼻咽癌患者进行Illumina Human610-Quad全基因组芯片扫描,通过全基因组关联分析获得相关结果。
根据Illumina Human610-Quad检测,本发明人检测到与放射性脑损伤发生最为显著相关的SNP位于DISC1FP1内含子位点rs10501719。将这个SNP在Taqman(AppliedBiosystems)基因分型平台进行检测,结果与Illumina检测一致。
多因素Cox回归发现,这个SNP位点与放射性脑损伤的发生风险存在剂量-反应关系(dose-response),随着变异等位基因型个数的增加,放射性脑损伤的发生风险也随之增加。
进一步分析这个SNP联合临床指标(T分期、放疗技术)和年龄用于放射性脑损伤风险预测的效果,发现这个模型可以很好地区分发生和不发生放射性脑损伤的鼻咽癌患者。
根据上述实验结果,本发明制备了一种能用于临床的放射性脑损伤风险评估的试剂盒,包含测定受试者血标本DNA中上述SNP的特异性扩增引物、探针和其他检测试剂。利用该试剂盒检验rs10501719位点,同时联合患者信息(T分期、放疗技术和年龄),有助于患者放射性脑损伤的风险预测和评估,可以对高危个体提前采取针对性的保护措施,例如预防性用药等,从而真正实现患者的个体化治疗。
与现有技术相比,本发明具有如下有益效果:
(1)SNP最为一种新型的基因生物标志物,区别于传统生物标志物,具有稳定、微创、易于检测的有点,其高特异性和高敏感性将为放射性脑损伤发病风险的预测提供更加高效便捷的评估方法。
(2)预测肿瘤放疗引起的放射性脑损伤发病风险的试剂盒是一种系统、全面的诊断试剂盒,可用于评估患者发生放射性脑损伤的风险,帮助临床医生迅速准确地评价患者放射性脑损伤的遗传易感性,为及时采取预防治疗方案提供支持。
(3)采取严密的验证和评价体系,采用大样本的全基因组关联研究联合两个独立阶段的人群验证,最后通过量化的危险评分得到高敏感度、高特异度的模型确保其在临床上可以得到有效的应用。
综上所述,本发明提供的试剂盒以及风险预测模型提供了尚未被公开的与放射性脑损伤相关的位于DISC1FP1基因上的SNP标志物组合,该标志物组合联合患者临床信息可以更加全面准确的评估鼻咽癌患者发生放射性脑损伤的患病风险。将本发明运用于临床中,针对高危患者提前采取保护措施,有助于实现患者的个体化治疗,提高鼻咽癌患者的长期生存质量。同时,可以为其他放疗引起的正常组织损伤的风险预测提供方法和策略上的借鉴。
附图说明
图1为显示联合临床因素(年龄、T分期、放疗技术)和DISC1FP1基因上的位点rs10501719,构建预测放射性脑损伤是否发生的模型的ROC曲线。
具体实施方式
下面结合说明书附图和具体实施例对本发明作出进一步地详细阐述,所述实施例只用于解释本发明,并非用于限定本发明的范围。下述实施例中所使用的试验方法如无特殊说明,均为常规方法;所使用的材料、试剂等,如无特殊说明,为可从商业途径得到的试剂和材料。
实施例1 SNP标志物的筛选
1、样本的收集和资料的整理
于2002年至2010年从中山大学肿瘤医院生物样本库收集了大量的血标本,通过对样本信息的整理,选择了符合下列标准的2942例样本进行全基因组芯片扫描和单个SNPTaqman基因分型:
纳入标准:
(1)具有明确病理诊断及临床分期的鼻咽癌患者;
(2)预期生存大于6个月;
(3)功能状态评分(KPS)≥70分;
(4)年龄18岁-80岁;
(5)具有完整的病历资料(病史、体检、相关检查、既往治疗);
(6)完成放射治疗并定期进行MR影像复查;
(7)自愿参加且签署知情同意书。
同时,排除出现以下任意情况的患者:
(1)患者未完成所有放疗计划;
(2)由于心理、社会、家庭及地理原因不能配合随访的患者;
(3)患者初诊时已发生远处转移;
(4)患者放疗前的鼻咽/颅脑MR影像存在不明原因的异常信号;
(5)患者曾因其他疾病(除鼻咽癌)接受过头颈部放疗。
2、外周血DNA的全基因组扫描
在符合上述条件的1082例样本中,通过定期的MR随访(随访时间至2016年12月31日),得到243例发生放射性脑损伤的鼻咽癌患者以及839例截止至末次MR随访未发现放射性脑损伤的鼻咽癌患者。将两组人群经Illumina Human610 Quad芯片检测获得相关结果。具体步骤为:
(1)用EDTA抗凝管采集外周静脉血3mL,3500r/min离心10分钟后吸出血浆。
(2)去除红细胞:剩余血液成分中加入等体积红细胞裂解液(10mmol/L TrispH7.6;5 mmol/L MgCl2;10 mmol/L NaCl),上下颠倒充分混匀,4000r/min离心10分钟后弃去上清。再加入5mL红细胞裂解液,上下颠倒充分混匀,4000r/min离心10分钟后弃去上清。
(3)裂解有核细胞:加入1mL白细胞裂解液(50mmol/L Tris HCl pH8.0; 50mmol/LEDTA 二钠盐;10 mmol/L NaCl;1%十二烷基硫酸钠(w/v)),再加入10g RNA酶10g蛋白酶K,振荡器上充分振荡混匀,65℃水浴30分钟,每隔5分钟振荡混匀1次。
(4)去除蛋白质:加入1mL饱和酚于振荡器上充分震荡混匀后,12000r/min离心10分钟,上层水相转移至新的EP管;加入等体积氯仿/异戊醇(24:1,v/v),振荡器上充分振荡混匀,12000r/min离心10分钟,上层水相转移至新的EP管。
(5)DNA沉淀:加入1/10体积的 3M醋酸钠,等体积预冷的异丙醇,上下轻摇混匀可见白色絮状沉淀物,再12000r/min离心5分钟。
(6)DNA漂洗:弃上清,加入1ml 75%乙醇,上下颠倒,12000r/min离心5分钟。
(7)重复步骤6。
(8)干燥DNA:弃上清,于清洁环境中打开盖子让乙醇充分挥发,加入适量(50μL)TE缓冲液溶解DNA。
(9)测量浓度:用NanoDrop 2000测量DNA浓度和纯度。通常能得到20ng/μl~100ng/μlDNA,纯度(OD 260/280)在1.6-2.0。
(10)在Illumina Human610 Quad芯片上进行全基因组扫描;
(11)数据分析与处理:
利用Cox比例风险模型对数据进行分析,假定SNP的风险效应满足加性模型,校正T分期、放疗技术、年龄这三个与放射性脑损伤发生相关的因素。
3、分析结果
分析得到DISC1FP1基因上rs10501719位点与放射性脑损伤的发生显著相关,结果如表1所示。
表1:利用Cox回归对1082例鼻咽癌患者进行全基因组分析结果
实施例2 单个SNP的TaqMan(Applied Biosystems)基因分型检测
将实施例1经过全基因组扫描发现的与放射性脑损伤相关的位点rs10501719分别在两个验证人群进行检测,分别包括1119例和741例鼻咽癌患者,其中分别包括发生放射性脑损伤的患者177例和261例。再利用Taqman基因分型对这些样本进行检测,
1、具体步骤为:
(1)用EDTA抗凝管采集外周静脉血3mL,3500r/min离心10分钟后吸出血浆。
(2)去除红细胞:剩余血液成分中加入等体积红细胞裂解液(10mmol/L TrispH7.6;5 mmol/L MgCl2;10 mmol/L NaCl),上下颠倒充分混匀,4000r/min离心10分钟后弃去上清。再加入5mL红细胞裂解液,上下颠倒充分混匀,4000r/min离心10分钟后弃去上清。
(3)裂解有核细胞:加入1mL白细胞裂解液(50mmol/L Tris HCl pH8.0;50mmol/LEDTA 二钠盐;10 mmol/L NaCl;1%十二烷基硫酸钠(w/v)),再加入10g RNA酶10g蛋白酶K,振荡器上充分振荡混匀,65℃水浴30分钟,每隔5分钟振荡混匀1次。
(4)去除蛋白质:加入1mL饱和酚于振荡器上充分震荡混匀后,12000r/min离心10分钟,上层水相转移至新的EP管;加入等体积氯仿/异戊醇(24:1,v/v),振荡器上充分振荡混匀,12000r/min离心10分钟,上层水相转移至新的EP管。
(5)DNA沉淀:加入1/10体积的 3M醋酸钠,等体积预冷的异丙醇,上下轻摇混匀可见白色絮状沉淀物,再12000r/min离心5分钟。
(6)DNA漂洗:弃上清,加入1ml 75%乙醇,上下颠倒,12000r/min离心5分钟。
(7)重复步骤6。
(8)干燥DNA:弃上清,于清洁环境中打开盖子让乙醇充分挥发,加入适量(50μL)TE缓冲液溶解DNA。
(9)测量浓度:用NanoDrop 2000测量DNA浓度和纯度。通常能得到20ng/μl~100ng/μlDNA,纯度(OD 260/280)在1.6-2.0。
(10)在Taqman(Applied Biosystems)基因分型平台进行检测。对全基因组扫描发现的与鼻咽癌放疗引起的放射性脑损伤相关的位于DISC1FP1基因上的SNP设计特异性的扩增引物和特异性的探针序列。
利用 384孔板上样,每孔5μl的反应体系包括:正向引物、反向引物和分型探针混合物0.3μl,dNTP Mixture (10mM) 0.2μl,MgCl2 (25mM)0.4μl,反应buffer 1μl,反应酶0.1μl,2μl双蒸水和 1μl待测 DNA。
扩增体系如下:60℃,30s,1个循环;95℃,10min,1个循环;95℃,15s和60℃,1min,45个循环;60℃,30s,1个循环。
使用的仪器为ABI7900型PCR仪。检测结果采用QuantStudio Real-Time PCRSoftware v1.3软件导出。
2、利用危险评分方法进一步分析SNP与放射性脑损伤的关系
根据上述结果,采用以多因素Cox回归系数β的遗传风险评分方法,以实施例1得到的多因素Cox回归系数β代入公式,对上述验证阶段的样本进行风险估算以验证模型效果,其中包括发生放射性脑损伤的样本以及随访满三年且未发现放射性脑损伤的鼻咽癌患者。
危险评分公式为:
危险评分=(0.601×T分期的评分)+(-0.8841×放疗技术的评分)+(0.0196×年龄的评分)+(0.5948×rs10501719分型的评分)。
其中,对于SNP分型,野生纯合型=“0”,杂合型=“1”,突变纯合型=“2”;对于临床变量T分期T1=“0”,T2=“1”,T3=“2”,T4=“3”;对于放疗技术,传统适形放疗=“0”,调强放疗=“1”;对于年龄的评分以实际的年龄(连续型变量)代入。
当危险评分大于2.52时该样本是放射性脑损伤的高危人群,危险评分小于2.52时该样本是放射性脑损伤的低危人群。
具体统计结果见表2.
表2:放射性脑损伤危险评分模型效果
对该危险评分绘制ROC曲线评估预测的敏感度和特异度,该危险评分以70%的曲线下面积(AUC)将发生放射性脑损伤的样本与无放射性脑损伤的样本区分开,最佳临界点的特异度为66.29%,敏感度为65.42%(如图1)。
因此,证明了采用DISC1FP1上的SNP位点rs10501719并联合临床因素可以很好地预测鼻咽癌患者的放射性脑损伤风险。
实施例3 用于预测肿瘤放疗引起的放射性脑损伤发病风险的试剂盒
用于预测肿瘤放疗引起的放射性脑损伤发病风险的试剂盒的制作和操作流程是基于Taqman(Applied Biosystems)基因分型检测技术。
1、试剂盒含有1对SNP特异性扩增引物(rs10501719特异性扩增引物的核苷酸序列如SEQ ID No:1~2所示),以及特异性探针(rs10501719的特异性探针的核苷酸序列如SEQID No:3~4)。还包括了相应PCR技术所需的常用试剂,如:dNTP Mixture,MgCl2,双蒸水,反应酶,反应buffer;另外还包含有标注品和对照(确定基因型的标准品和空白对照)。
特异性引物和特异性探针信息见表3。
表3. SNP特异性引物和特异性探针信息:
2,试剂盒的PCR体系
正向引物、反向引物和分型探针混合物0.3μl,dNTP Mixture (10mM) 0.2μl,MgCl2 (25mM)0.4μl,反应buffer 1μl,反应酶0.1μl,2μl双蒸水和 1μl待测 DNA。
3,PCR扩增体系
60℃,30s,1个循环;95℃,10min,1个循环;95℃,15s和60℃,1min,45个循环;60℃,30s,1个循环。
4,发病风险的判断标准
首先,统计样品SNP分型,临床变量T分期,放疗技术,年龄进行评分。
对于SNP分型,野生纯合型=“0”,杂合型=“1”,突变纯合型=“2”;对于临床变量T分期T1=“0”,T2=“1”,T3=“2”,T4=“3”;对于放疗技术,传统适形放疗=“0”,调强放疗=“1”;对于年龄的评分以实际的年龄(连续型变量)代入。
之后,根据各项评分计算危险评分。
危险评分=(0.601×T分期的评分)+(-0.8841×放疗技术的评分)+(0.0196×年龄的评分)+(0.5948×rs10501719分型的评分)。
当危险评分大于2.52时该样本是放射性脑损伤的高危人群,危险评分小于2.52时该样本是放射性脑损伤的高危人群。
序列表
<110> 中山大学
<120> 一种位于DISC1FP1基因的与放疗引起的放射性脑损伤相关的SNP标志物及其应用
<160> 4
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 18
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 1
agaccttgaa gtaccaaa 18
<210> 2
<211> 18
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 2
gcatgttacc tgaaagag 18
<210> 3
<211> 25
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 3
ctcagtttca ccagctctct tacac 25
<210> 4
<211> 25
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 4
ctcagtttca ccggctctct tacac 25
Claims (3)
1.DISC1FP1基因上的SNP位点rs10501719的检测试剂在制备用于预测肿瘤放疗引起的放射性脑损伤发病风险的试剂盒中的应用。
2.根据权利要求1所述应用,其特征在于,对样本进行危险评分,当危险评分大于2.52时该样本是放射性脑损伤的高危人群,危险评分小于2.52时该样本是放射性脑损伤的低危人群;
危险评分=(0.601×T分期的评分)+(-0.8841×放疗技术的评分)+(0.0196×年龄的评分)+(0.5948×rs10501719分型的评分);
公式中,T分期的评分:对于临床变量T分期,T1=“0”,T2=“1”,T3=“2”,T4=“3”;
放疗技术的评分:对于放疗技术,传统适形放疗=“0”,调强放疗=“1”;
年龄的评分:以实际的年龄代入;
分型的评分:对于SNP分型,野生纯合型=“0”,杂合型=“1”,突变纯合型=“2”。
3.根据权利要求1所述应用,其特征在于,所述检测试剂为其核苷酸序列如SEQ ID No:1~2所示特异性扩增引物和其核苷酸序列如SEQ ID No:3~4所示特异性探针。
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