CN104789572A - Gprasp2突变型基因、其鉴定方法和检测试剂盒 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了GPRASP2突变型基因、其鉴定方法和检测试剂盒,GPRASP2突变型基因,其在人的GPRASP2基因序列的第5外显子编码区序列第1717~1718位核苷酸GC突变成为核苷酸AA,本发明利用人基因组外显子捕获技术发现该遗传性疾病的致病基因。该方法方便、便捷,而且由于只需取一个或少量的基因突变样本进行人基因组外显子序列捕获,大大降低了成本。该基因的鉴定对综合征型耳聋(Syndromic Hearing Loss,SHL)易感和发生人群的基因诊断具有重要价值,对探索SHL发病机制和开辟新的治疗途径具有重要意义。
Description
技术领域
本发明属于遗传学、分子生物学,具体涉及遗传性疾病致病基因的鉴定方法,特别涉及GPRASP2突变型基因、其鉴定方法和检测试剂盒。
背景技术
耳聋是导致交流障碍最常见的疾病,至2013年为止,在全球约有3.6亿人患有耳聋[1],其中约有50%的患者发病与遗传有关。遗传性耳聋可分为综合征型耳聋(SyndromicHearing Loss,SHL)和非综合征型耳聋(Non-syndromic Hearing Loss,NSHL),其中SHL约占30%,其临床表型除了耳聋外,还有眼、骨肾、皮肤等其他病变。迄今为止约有300种SHL,其中约有70种为X连锁遗传的SHL[2-3]。虽然在世界范围内不断有新的SHL大家系被定位及新的致病基因被发现,但新的X连锁遗传的SHL大家系甚少被定位。并且由于听觉系统结构、功能的复杂性,涉及听觉相关的基因种类和数量多,至今定位与克隆的SHL基因与预期的还相距甚远。
在包括连锁分析和纯合子定位在内的传统的疾病基因检测方法中[4,5],利用遗传标记来发现基因组区域,然后在基因组区域中通过原位克隆以及对候选基因的研究来发现致病突变。而在对耳聋基因的检测和定位过程中,由于该疾病所表现出的的极端异质性使得该过程变得更加繁琐。随着高通量测序(High-Throughput Sequencing)技术的引入以及外显子组测序(Exome sequencing)的发展,基于其高通量,低成本和高准确率的特点,在遗传性疾病基因检测中得到了广泛应用,已有一系列高水平的相关外显子组测序用于遗传性疾病的基因研究的报道[6-8]。
发明人采集到一个罕见的呈典型的X染色体隐性遗传的先天性SHL大家系,该家系患者的临床特征除了耳聋外,还伴有耳廓及外耳道畸形、小眼以及双眼睑下垂等为特征的面部畸形,研究排除了已知的常染色体显性遗传性耳聋致病基因与家系耳聋表型的相关性,结合孟德尔遗传方式分析,认为该家系是一个新的呈X连锁遗传的SHL,并且是由一个新的基因致病。如果采用传统的单基因遗传性疾病基因的定位方法,由于连锁区域将涉及已知基因、未知基因和预测基因,这将是一个耗时费力的过程。因此,外显子组测序技术结合生物信息学分析、候选致聋基因新突变致病性分析等实现对耳聋性基因的鉴定。
参考文献
[1]http://www.who.int
[2]Pediatric Sensorineural Hearing Loss,Part 2:Syndromic and Acquired Causes.AJNR AmJ Neuroradiol,2012,33(2):211-217.
[3]http://hereditaryhearingloss.org(last update:May 19th,2014)
[4]Lander ES,Botstein D.Strategies for studying heterogeneous genetic traits in humans byusing a linkage map of restriction fragment length polymorphism.Proc Nat Acad SciUSA,1986,83:7353–7735.
[5]Lander ES,Botstein D.Homozygosity mapping.A way to map human recessive traitswith the DNA of inbred children.Science,1987,236:1567–1570.
[6]Rehman AU,Morell RJ,Belyantseva IA,et al.Targeted capture and next-generationsequencing identifies C9orf75,encoding taperin,as the mutated gene in nonsyndromicdeafness DFNB79.Am J Hum Genet,2010,86:378–388.
[7]Walsh T,Shahin H,Elkan-Miller T,et al.Whole exome sequencing and homozygositymapping identify mutation in the cell polarity protein GPSM2as the cause ofnonsyndromic hearing loss DFNB82.Am J Hum Genet,2010,87:90-94.
[8]Jones S,Hruban RH,Kamiyama M,et al.Exomic sequencing identifies PALB2as apancreatic cancer susceptibility gene.Science,2009,324:217.
发明内容
本发明所要解决的技术问题是提供一种GPRASP2突变型基因。
本发明还要解决的技术问题是提供上述突变型基因的鉴定方法。
本发明最后要解决的技术问题是提供检测上述突变型基因的检测试剂盒。
针对上述问题,发明人首先采用人基因组外显子捕获与高通量测序技术获得候选SHL相关基因的突变位点,再结合常规测序的方法对候选基因突变位点逐一进行遗传共分离验证、外显子以及外显子-内含子边界的序列比对与分析,最终找到了一个SHL相关的新基因。由此可见,本发明发现致病基因的方法高效、快捷和准确度高,同时仅需对部分家系成员的样本进行外显子捕获测序,大大降低了成本。
为解决上述技术问题,本发明采用的技术方案如下:
一种GPRASP2突变型基因,其在人的GPRASP2基因(NM_001004051.3)序列的第5外显子编码区第1717~1718位核苷酸GC突变成为核苷酸AA(c.1717-1718GC>AA)。
其中,突变后的人的GPRASP2基因序列的第5外显子区,其核苷酸序列如SEQ IDNo:5所示。
一种重组载体,其含有上述的GPRASP2突变型基因。
一种重组细胞,其含有上述的重组载体。
一种综合征型耳聋(SHL)检测试剂盒,其至少包括:根据GPRASP2基因所有5个外显子及其外显子-内含子交界区序列设计的PCR引物;所述PCR引物用于PCR扩增,其扩增产物包含GPRASP2基因第5外显子区的核苷酸序列;
所述的PCR引物序列为如下引物对中的至少一对:SEQ ID No:6和SEQ ID No:7、SEQ ID No:8和SEQ ID No:9、SEQ ID No:10和SEQ ID No:11、SEQ ID No:12和SEQ IDNo:13、SEQ ID No:14和SEQ ID No:15、SEQ ID No:16和SEQ ID No:17;
其中,引物SEQ ID No:12和SEQ ID No:13其扩增产物为GPRASP2基因第5外显子编码区第1-744位核苷酸序列;SEQ ID No:14和SEQ ID No:15其扩增产物为GPRASP2基因第5外显子编码区第689-1879位核苷酸序列;SEQ ID No:16和SEQ ID No:17其扩增产物为GPRASP2基因第5外显子编码区第1857-2517位核苷酸序列。
其中,所述编码区是从SEQ ID No:5中第334位的atg开始起始,到第2850位的taa处终止。
其中,上述综合征型耳聋(SHL)检测试剂盒还包括用于PCR的DNA扩增酶和相应缓冲液。
一种遗传性疾病的相关基因的鉴定方法,包括以下步骤:
1)利用人X染色体外显子组捕获和高通量测序技术对采集的综合征型耳聋(SHL)家系的患者以及正常个体X染色体外显子组捕获和分析,获得候选的遗传性疾病相关基因的突变位点;
2)结合常规的测序方法对候选的遗传性疾病相关基因的突变位点进行鉴定:
2A)家系内未参与X染色体外显子组捕获的其余样本进行遗传共分离验证;
2B)对步骤2A)验证基因的外显子及外显子-内含子交界区的序列进行PCR扩增和检测;
2C)扩大样本量验证,以此鉴定遗传性疾病的相关基因。
本发明中,所述遗传性疾病是指生殖细胞或受精卵的遗传物质(染色体和基因)发生突变(或畸变)所引起的疾病,通常具有垂直传递的特征,具有以上特征的家族成员及其关系称为遗传性疾病家系。
本发明中,DNA样本来自于组织、血液或各种体液等。
上述GPRASP2突变型基因、或试剂盒在制备综合征型耳聋(SHL)检测试剂中的应用。
一种鉴定GPRASP2突变型基因的方法,其包括以下步骤:
1)测定待测样本中GPRASP2基因中外显子和外显子-内含子交界区序列;
2)与野生型相比较,如果存在缺失、替换、插入则认定该基因存在突变;
步骤1)中,采用如下引物中的至少一对分别扩增外显子或外显子-内含子交界区的序列:SEQ ID No:6和SEQ ID No:7、SEQ ID No:8和SEQ ID No:9、SEQ ID No:10和SEQID No:11、SEQ ID No:12和SEQ ID No:13、SEQ ID No:14和SEQ ID No:15、SEQ ID No:16和SEQ ID No:17;
上述鉴定GPRASP2突变型基因的方法,具体来说包括以下步骤:
1)测定待测样品中GPRASP2基因第5外显子区的序列;
2)GPRASP2基因第5外显子编码区第1717-1718位核苷酸GC,则所述的综合征型耳聋(SHL)相关基因为野生型;GPRASP2基因第5外显子的上述对应位置突变为核苷酸AA,则所述的综合征型耳聋(SHL)相关基因为突变型。
步骤1)中,GPRASP2基因第5外显子编码区的第1717-1718位核苷酸GC的核苷酸序列的测定采用PCR的方法,所述PCR引物序列如SEQ ID NO:14与SEQ ID NO:15所示。
有益效果:本发明利用人X染色体外显子组捕获和高通量测序技术发现遗传性疾病的相关基因。该方法方便、便捷,而且由于只需取一个或少量的个体样本进行X染色体外显子组捕获,大大降低了成本。基于上述方法,本发明发现了一种SHL相关基因GPRASP2,该基因编码的G蛋白偶联受体相关蛋白,这是首次发现该基因及其突变型与SHL的发生相关。该基因的鉴定对SHL的易感和发生人群的基因诊断具有重要价值,对探索SHL致病机制和开辟新的治疗途径具有重要意义。
附图说明
图1SHL相关基因突变位点的筛选与验证流程图。
图2该SHL家系参与X染色体外显子组捕获及测序的2例耳聋患者的典型听力图(图2-A:患者-1,男,57岁,右侧外耳道闭锁,左侧外耳道过度狭窄,纯音测听示双耳不对称的混合性听力损失;图2-B:患者-2,男,41岁,双侧外耳道闭锁,纯音测听示双耳对称的混合性听力损失。
图3GPRASP2基因第5外显子编码区1717-1718位及其侧翼序列(参见SEQ IDNO:5)的测序结果(图3-A:SHL家系内男性患者,GPRASP2基因第5外显子编码区存在c.1717-1718GC>AA半合子突变;图3-B:SHL家系内女性携带者,GPRASP2基因第5外显子编码区存在c.1717-1718GC>AA杂合子突变;图3-C:听力正常人,测序图无突变现象)。
具体实施方式
下面将结合实施例对本发明的实施方案进行详细描述,但是本领域技术人员将会理解,下列实施例仅用于说明本发明,而不应视为限定本发明的范围。实施例中未注明具体条件者,按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者,均为可以通过市购获得的常规产品。
实施例1:
发明人以SHL为例,检测出一个新的耳聋相关基因(流程图如图1所示),其包括以下步骤:
1)发明人采集到一个五代遗传的X染色体隐性遗传的SHL家系,问诊和听力测试结果显示,家系内患者均表现为先天性、进行性的中、重度SHL。收集该家系成员外周血并提取基因组DNA。
2)采用人基因组外显子捕获技术对1)所述家系中2个患者和1个携带者的全基因组DNA进行外显子捕获和分析,获得候选的遗传性耳聋相关基因的突变位点。
3)结合常规的测序方法对候选的遗传耳聋相关基因的突变位点进行鉴定:a.对家系内未参与外显子捕获的其余样本进行遗传共分离验证;b.对a验证基因的外显子及外显子-内含子交界区的序列进行PCR扩增和检测;c.扩大样本量(家系外正常对照)验证。
发明人采集到一个五代遗传的X染色体隐性遗传的SHL家系(先证者的听力资料图如图2所示),问诊和听力测试结果显示,家系内患者均表现为先天性、进行性的中、重度SHL。收集该家系成员外周血4ml,EDTA抗凝,取600μl抽提基因组DNA,使用RelaxGene Blood DNA mini Kit试剂盒(Tiangen Biotech Co.,Beijing,China)严格按照说明书进行。
实施例2:利用X染色体外显子组捕获测序该SHL家系的致病基因
随后发明人采用Agilent SureSelect Human All Exon Kit(38M)结合Solexa高通量测序技术对实施例1所述SHL家系中的2名男性患者和1名女性携带者的X染色体外显子组序列进行了测序,成功地发现了一个新的SHL相关基因—GPRASP2基因的突变体。具体操作步骤如下:
1)将基因组DNA随机打断成150-200bp左右的片段,然后在片段两端分别连接上接头制备杂交文库(参见http://www.illumina.com/提供的Illumina/Solexa标准建库说明书;Accurate wholehuman genome sequencing using reversible terminator chemistry.Nature2008,456:53-59)。
2)文库经纯化后经过Ligation-mediated PCR(LM-PCR)的线性扩增与SureSelectBiotiny Lated RNA Library(BAITS)进行杂交富集,再经过LM-PCR的线性扩增后进行上机测序。测序平台为Illumina Hiseq 2000,读取长度为90bp,每个样本的平均测序深度最少为50。
3)测序获得的原始数据由Illumina Basecalling Software v1.7进行处理,经过过滤去污染、使用SOAPaligner 2.20(Li R,Li Y,Kristiansen K,et al,SOAP:short oligonucleotidealignment program.Bioinformatics 2008,24(5):713-714;Li R,Yu C,Li Y,et al,SOAP2:animproved ultrafast tool for short read alignment.Bioinformatics 2009,25(15):1966-1967.)比对参考基因组,获得比对到基因组上的Unique Mapped Reads。靶区域的基因由SOAPsnp(Li R,Li Y,Fang X,et al.SNP detection for massively parallel whole-genome resequencing.Genome Res 2009,19(6):1124-1132.)确定。然后对数据进行标准的信息分析流程,包括对SNP、Indel等进行检测、注释和统计分析。同时对数据进行质控检测,包括测序温度、覆盖度均一性等分析的检测报告。
每个个体的平均测序长度为5.9GB,去除了由重复起始点的Reads后,发明人得到了由RefSeq genes(Pruitt KD,Tatusova T,Maglott DR:NCBI reference sequences(RefSeq):a curated non-redundant sequence database of genomes,transcripts and proteins.NucleicAcids Res 2007,35(Database issue):D61-65)定义的测序深度为100X、长度为492.06MB的外显子组。平均98.00%的X染色体外显子组被覆盖,平均每个个体发现的遗传变异有375个SNP和8个Indels。
为了从所有突变中找到可能的致病突变,发明人重点关注了非同义突变,认为同义突变致病的可能性较小。与此同时,实验室前期已排除了中国人常见的耳聋突变基因的突变,导致该案例SHL的突变应该是稀有突变,因此它应该在一般人群中缺失。因此,定义一个新突变如下:它同时不存在于公认的数据库中,包括:dbSNP129、8个HapMap个体的外显子组数据(Ng SB,Turner EH,Robertson PD,et al.Targeted capture andmassively parallel sequencing of 12human exomes.Nature 2009,461(7261):272-276.)、1000人基因组计划(Siva N.1000Genomes project.Nat Biotechnol 2008,26(3):256.)、该家系中正常对照的X染色体外显子组数据和已知SHL相关基因的突变(http://hereditaryhearingloss.org/)。
经过上述数据库以及家系正常对照的筛选后,这2名男性患者和1名女性携带者有的突变还剩6个SNP和2个Indel。接下来,发明人使用ANNOVAR软件(Wang K,Li M,Hakonarson H.ANNOVAR:Functional annotation of genetic variants from high-throughputsequencing data.Nucleic Acids Res 2010,38(16):e164.)预测可能有害的基因,将候选基因的范围缩小到5个。发明人进一步限定以下条件对上述位点进行筛选分析:筛选突变频率(mutratio)大于30%的变异位点;筛选患者和携带者样本中均出现的变异位点;筛选男性患者中基因型为半合子突变,女性携带者中基因型为杂合子突变的变异位点。发明人观察到在这5个候选基因中位于GPRASP2中的突变位点是错义突变(预测的序列如下所示SEQ ID NO:18),且在家系中符合遗传共分离,该突变位于GPRASP2基因的第5外显子的编码区,存在一个两个核苷酸(GC)的错义突变(c.1717-1718GC>AA),该突变导致从密码子发生改变,并造成所编码的氨基酸发生改变(p.A573N)。所以发明人推测GPRASP2与SHL的致病可能相关。
TTCTGGACTGGAGAAGAGACAAGTGTCAGATCATGGCCCAGGGAAGAGTCCAATACCAGGTCCAGGCACAGGGCTAAACATCAGACTAATCCCAGGTCCAGGCCCAGATCCAAGCAAGAAGCCTATGTTGATTCCTGGTCTGGATCTGAGGATGAGGCCAGCAACCCATTCTCCTTCTGGGTTGGAGAAAATACCAATAACTTGTTCAGGCCCAGAGTCAGGGAGGAGGCAAATATCAGGTCCAAGCTCAGGACAAATAGAGAAGATTGTTTTGAATCTGAGTCTGAAGATGAGTTCTATAAGCAGTCCTGGGTTTTGCCTGGAGAAGAGGCCAATAGTAGATTCAGGCACAGAGACAAAGAAGATCCTAATACTGCCTTGAAACTCAGGGCCCAGAAAGATGTTGACAGTGATAGGGTCAAACAAGAACCCAGGTTTGAGGAGGAAGTCATTATTGGGTCCTGGTTCTGGGCAGAAAAAGAGGCCAGTTTGGAGGGTGGAGCTTCAGCAATCTGTGAATCTGAGCCAGGAACTGAGGAGGGGGCCATTGGCGGATCCGCGTACTGGGCTGAGGAAAAGTCCAGTTTGGGGGCTGTGGCCAGAGAAGAGGCCAAGCCGGAGTCTGAAGAAGAGGCCATATTTGGGTCCTGGTTCTGGGACAGAGATGAGGCCTGCTTTGACCTAAATCCCTGTCCTGTGTACAAGGTCAGTGATAGGTTCAGAGATGCAGCTGAGGAGCTTAATGCATCCTCCAGGCCCCAAACCTGGGACGAGGTCACTGTTGAATTCAAACCTGGTCTTTTTCATGGGGTTGGCTTCCGATCCACAAGCCCCTTTGGAATTCCCGAAGAGGCTTCTGAAATGCTTGAGGCAAAGCCCAAGAACCTGGAACTTAGCCCAGAAGGAGAAGAGCAGGAATCTTTGCTTCAGCCTGATCAGCCTAGTCCTGAGTTCACATTTCAGTATGATCCTTCCTACCGGTCAGTCCGGGAAATTCGAGAGCATCTTAGGCAGGGAGAGTGCAGAGTCTGAGAGTTGGTCCTGCAGCTGCATACAATGTGAGCTGAAAATTGGTTCTGAAGAGTTTGAAGAATTCCTTTTATTAATGGACAAAATTCGGGATCCTTTTATTCATGAAAT(SEQ ID NO:18)深底色斜体标记的为c.1717-1718GC>AA突变。
在本实施例中,只需取该SHL家系中的2名患者和1名携带者的基因组DNA进行人X染色体外显子组捕获和测序,而无需检测所有患者,因而大大降低了成本。
实施例3:GPRASP2基因第5外显子编码区c.1717-1718GC>AA突变位点的进一步验证
发明人结合常规的测序方法对GPRASP2基因第5外显子编码区c.1717-1718GC>AA突变位点进行了验证:①对实施例1所述家系中所有样本进行遗传共分离验证;②对①验证基因的外显子及外显子-内含子交界区的序列进行PCR扩增和检测;③扩大样本量(家系外正常对照)验证。
1)利用PCR扩增该突变
按实施例1的方法对家系中所有患者的外周血样本进行基因组DNA的制备。将浓度调至25ng/μl后进行PCR反应。
PCR引物由GeneTool进行设计,序列如下:
上游引物:CCTCTACAGCGTCTTCTTTCT(SEQ ID NO:14)
下游引物:AAGCACTTCTCATACCCATTG(SEQ ID NO:15)
PCR反应体系25μl,包含:12.5μl PCR Mix(TaKaRa Co.,Japan),上下游引物各0.5μl,基因组DNA(25ng/μl)0.5μl,ddH2O 11μl。PCR反应条件如下:预变性94℃10分钟;94℃、57.5℃、72℃各1分钟;共32个循环;最后72℃延伸10分钟。
PCR反应产物由QIAquick PCR纯化试剂盒(Qiagen)进行纯化后由ABI PRISM 3730自动测序仪(Applied Biosystems)进行测序。
扩增产物纯化后进行Sanger测序(序列如SEQ ID NO:19、SEQ ID NO:20、SEQ IDNO:21所示),测序结果表明(反向测序结果),第5外显子编码区c.1717-1718GC>AA在家系内4名男性患者以及2名女性携带者中被验证出来,而8名家系内正常人均未发现此突变,出现了明显的X连锁的遗传共分离现象。在PubMed Blast数据库中进行核酸同源性检测,发现只有与人GPRASP2基因(NM_001004051.3)同源性最高。
CCTCTACAGCGTCTTCTTTCTGGACTGGAGAAGAGACAAGTGTCAGATCATGGCCCAGGGAAGAGTCCAATACCAGGTCCAGGCACAGGGCTAAACATCAGACTAATCCCAGGTCCAGGCCCAGATCCAAGCAAGAAGCCTATGTTGATTCCTGGTCTGGATCTGAGGATGAGGCCAGCAACCCATTCTCCTTCTGGGTTGGAGAAAATACCAATAACTTGTTCAGGCCCAGAGTCAGGGAGGAGGCAAATATCAGGTCCAAGCTCAGGACAAATAGAGAAGATTGTTTTGAATCTGAGTCTGAAGATGAGTTCTATAAGCAGTCCTGGGTTTTGCCTGGAGAAGAGGCCAATAGTAGATTCAGGCACAGAGACAAAGAAGATCCTAATACTGCCTTGAAACTCAGGGCCCAGAAAGATGTTGACAGTGATAGGGTCAAACAAGAACCCAGGTTTGAGGAGGAAGTCATTATTGGGTCCTGGTTCTGGGCAGAAAAAGAGGCCAGTTTGGAGGGTGGAGCTTCAGCAATCTGTGAATCTGAGCCAGGAACTGAGGAGGGGGCCATTGGCGGATCCGCGTACTGGGCTGAGGAAAAGTCCAGTTTGGGGGCTGTGGCCAGAGAAGAGGCCAAGCCGGAGTCTGAAGAAGAGGCCATATTTGGGTCCTGGTTCTGGGACAGAGATGAGGCCTGCTTTGACCTAAATCCCTGTCCTGTGTACAAGGTCAGTGATAGGTTCAGAGATGCAGCTGAGGAGCTTAATGCATCCTCCAGGCCCCAAACCTGGGACGAGGTCACTGTTGAATTCAAACCTGGTCTTTTTCATGGGGTTGGCTTCCGATCCACAAGCCCCTTTGGAATTCCCGAAGAGGCTTCTGAAATGCTTGAGGCAAAGCCCAAGAACCTGGAACTTAGCCCAGAAGGAGAAGAGCAGGAATCTTTGCTTCAGCCTGATCAGCCTAGTCCTGAGTTCACATTTCAGTATGATCCTTCCTACCGGTCAGTCCGGGAAATTCGAGAGCATCTTAGGCAGGGAGAGTGCAGAGTCTGAGAGTTGGTCCTGCAGCTGCATACAATGTGAGCTGAAAATTGGTTCTGAAGAGTTTGAAGAATTCCTTTTATTAATGGACAAAATTCGGGATCCTTTTATTCATGAAATATCTAAAATTGCAATGGGTATGAGAA(SEQ ID NO:19)。
以上序列为男性患者样本的测序结果(覆盖GPRASP2突变基因第5外显子区及其侧翼序列),深色底色的斜体加下划线的为半合子突变c.1717-1718GC>AA(测序结果的截图如图3-A所示)。
CCTCTACAGCGTCTTCTTTCTGGACTGGAGAAGAGACAAGTGTCAGATCATGGCCCAGGGAAGAGTCCAATACCAGGTCCAGGCACAGGGCTAAACATCAGACTAATCCCAGGTCCAGGCCCAGATCCAAGCAAGAAGCCTATGTTGATTCCTGGTCTGGATCTGAGGATGAGGCCAGCAACCCATTCTCCTTCTGGGTTGGAGAAAATACCAATAACTTGTTCAGGCCCAGAGTCAGGGAGGAGGCAAATATCAGGTCCAAGCTCAGGACAAATAGAGAAGATTGTTTTGAATCTGAGTCTGAAGATGAGTTCTATAAGCAGTCCTGGGTTTTGCCTGGAGAAGAGGCCAATAGTAGATTCAGGCACAGAGACAAAGAAGATCCTAATACTGCCTTGAAACTCAGGGCCCAGAAAGATGTTGACAGTGATAGGGTCAAACAAGAACCCAGGTTTGAGGAGGAAGTCATTATTGGGTCCTGGTTCTGGGCAGAAAAAGAGGCCAGTTTGGAGGGTGGAGCTTCAGCAATCTGTGAATCTGAGCCAGGAACTGAGGAGGGGGCCATTGGCGGATCCGCGTACTGGGCTGAGGAAAAGTCCAGTTTGGGGGCTGTGGCCAGAGAAGAGGCCAAGCCGGAGTCTGAAGAAGAGGCCATATTTGGGTCCTGGTTCTGGGACAGAGATGAGGCCTGCTTTGACCTAAATCCCTGTCCTGTGTACAAGGTCAGTGATAGGTTCAGAGATGCAGCTGAGGAGCTTAATGCATCCTCCAGGCCCCAAACCTGGGACGAGGTCACTGTTGAATTCAAACCTGGTCTTTTTCATGGGGTTGGCTTCCGATCCACAAGCCCCTTTGGAATTCCCGAAGAGGCTTCTGAAATGCTTGAGGCAAAGCCCAAGAACCTGGAACTTAGCCCAGAAGGAGAAGAGCAGGAATCTTTGCTTCAGCCTGATCAGCCTAGTCCTGAGTTCACATTTCAGTATGATCCTTCCTACCGGTCAGTCCGGGAAATTCGAGAGCATCTTAGGCAGGGAGAGTGCAGAGTCTGAGAGTTGGTCCTGCAGCTGCATACAATGTGAGCTGAAAATTGGTTCTGAAGAGTTTGAAGAATTCCTTTTATTAATGGACAAAATTCGGGATCCTTTTATTCATGAAATATCTAAAATTGCAATGGGTATGAGAA(SEQ ID NO:20)
以上序列为女性携带者样本的测序结果(覆盖GPRASP2突变基因第5外显子区及其侧翼序列),深色底色的斜体加下划线的为c.1717-1718GC>AA的杂合子突变(测序结果的截图如图3-B所示)。
CCTCTACAGCGTCTTCTTTCTGGACTGGAGAAGAGACAAGTGTCAGATCATGGCCCAGGGAAGAGTCCAATACCAGGTCCAGGCACAGGGCTAAACATCAGACTAATCCCAGGTCCAGGCCCAGATCCAAGCAAGAAGCCTATGTTGATTCCTGGTCTGGATCTGAGGATGAGGCCAGCAACCCATTCTCCTTCTGGGTTGGAGAAAATACCAATAACTTGTTCAGGCCCAGAGTCAGGGAGGAGGCAAATATCAGGTCCAAGCTCAGGACAAATAGAGAAGATTGTTTTGAATCTGAGTCTGAAGATGAGTTCTATAAGCAGTCCTGGGTTTTGCCTGGAGAAGAGGCCAATAGTAGATTCAGGCACAGAGACAAAGAAGATCCTAATACTGCCTTGAAACTCAGGGCCCAGAAAGATGTTGACAGTGATAGGGTCAAACAAGAACCCAGGTTTGAGGAGGAAGTCATTATTGGGTCCTGGTTCTGGGCAGAAAAAGAGGCCAGTTTGGAGGGTGGAGCTTCAGCAATCTGTGAATCTGAGCCAGGAACTGAGGAGGGGGCCATTGGCGGATCCGCGTACTGGGCTGAGGAAAAGTCCAGTTTGGGGGCTGTGGCCAGAGAAGAGGCCAAGCCGGAGTCTGAAGAAGAGGCCATATTTGGGTCCTGGTTCTGGGACAGAGATGAGGCCTGCTTTGACCTAAATCCCTGTCCTGTGTACAAGGTCAGTGATAGGTTCAGAGATGCAGCTGAGGAGCTTAATGCATCCTCCAGGCCCCAAACCTGGGACGAGGTCACTGTTGAATTCAAACCTGGTCTTTTTCATGGGGTTGGCTTCCGATCCACAAGCCCCTTTGGAATTCCCGAAGAGGCTTCTGAAATGCTTGAGGCAAAGCCCAAGAACCTGGAACTTAGCCCAGAAGGAGAAGAGCAGGAATCTTTGCTTCAGCCTGATCAGCCTAGTCCTGAGTTCACATTTCAGTATGATCCTTCCTACCGGTCAGTCCGGGAAATTCGAGAGCATCTTAGGCAGGGAGAGTGCAGAGTCTGAGAGTTGGTCCTGCAGCTGCATACAATGTGAGCTGAAAATTGGTTCTGAAGAGTTTGAAGAATTCCTTTTATTAATGGACAAAATTCGGGATCCTTTTATTCATGAAATATCTAAAATTGCAATGGGTATGAGAA(SEQ ID NO:21)(其中大写字母代表外显子序列)。
以上序列为正常人的测序结果(覆盖GPRASP2基因第5外显子区及其侧翼序列),同时与UCSC Genome Bioinformatics中GPRASP2基因序列(hg18)(第5外显子及其侧翼序列)相符,在深底色斜体加下划线部分无缺失(测序结果的截图如图3-C所示)。
测序结果表明存在第5外显子编码区c.1717-1718GC>AA半合子突变的检测样本都是患病样本,且均为男性,存在第5外显子编码区c.1717-1718GC>AA杂合子突变的检测样本都是携带者样本,且均为女性,符合X连锁隐性遗传病遗传特征。
2)GPRASP2基因各外显子及外显子-内含子交界区的扩增
发明人对家系中4名男性患者及2名女性携带者的GPRASP2基因除第5外显子编码区外的其他4个外显子(SEQ ID NO:1~4)及外显子-内含子交界区进行了PCR扩增。扩增引物见表1。PCR反应体系和反应条件同1)。结果表明表1中的引物能够有效扩增目标序列,并同时进行目标序列的突变检测。测序结果发现家系内患病样本除第5外显子外的其他4个外显子均未出现突变,家系内正常人样本的全部外显子的验证结果也均为阴性。
表1 GPRASP2基因各外显子及外显子-内含子交界区扩增引物
3)扩大样本量验证
与此同时,发明人在实施例1所述300例正常人对照,针对每例个体采用SEQ ID NO:6~17引物对GPRASP2基因各外显子及外显子-内含子交界区的扩增,Sanger测序结果均为阴性结果,进一步表明该突变c.1717-1718GC>AA的存在与SHL的有无存在正相关性。
实施例4:检测GPRASP2基因第5外显子突变的试剂盒组成及使用方法
A、试剂盒组成
引物:SEQ ID NO:14和SEQ ID NO:15所示序列,或选自SEQ ID NO:6~17所示序列中的至少一对;
其他成分:PCR反应缓冲液,MgCl2(25mmol/l),dNTP,Taq(TaKaRa Co.Japan),ddH2O。
B、使用方法
1)在试剂盒的组成成分中加入待测样本后进行PCR反应;
2)PCR反应产物经纯化后测序,将所得到的序列与GPRASP2正常基因序列比对,确定第5外显子序列是否存在突变。
尽管本发明的具体实施方式已经得到详细描述,本领域技术人员将会理解。根据已经公开的所有教导,可以对那些细节进行各种修改和替换,这些均在本发明的保护范围内。本发明的全部范围由所附专利要求及其任何等同物给出。
Claims (11)
1.一种GPRASP2突变型基因,其在人的GPRASP2基因序列的第5外显子编码区序列第1717~1718位核苷酸GC突变成为核苷酸AA。
2.根据权利要求1所述的GPRASP2突变型基因,其特征在于,突变后的人的GPRASP2基因序列的第5外显子区,其核苷酸序列如SEQ ID No:5所示。
3.一种重组载体,其含有权利要求1或2所述的GPRASP2突变型基因。
4.一种重组细胞,其含有权利要求3所述的重组载体。
5.一种综合征型耳聋检测试剂盒,其至少包括:根据GPRASP2基因所有5条外显子及其外显子-内含子交界区序列设计的PCR引物;所述PCR引物用于PCR扩增,其扩增产物包含GPRASP2基因第5外显子编码区的1-2517位核苷酸序列;
所述的PCR引物序列为如下引物对中的至少一对:SEQ ID No:6和SEQ ID No:7、SEQ ID No:8和SEQ ID No:9、SEQ ID No:10和SEQ ID No:11、SEQ ID No:12和SEQ ID No:13、SEQ ID No:14和SEQ ID No:15、SEQ ID No:16和SEQ ID No:17;
其中,引物SEQ ID No:12和SEQ ID No:13其扩增产物为GPRASP2基因第5外显子编码区第1-744位核苷酸序列;SEQ ID No:14和SEQ ID No:15其扩增产物为GPRASP2基因第5外显子编码区第689-1879位核苷酸序列;SEQ ID No:16和SEQ ID No:17其扩增产物为GPRASP2基因第5外显子编码区第1857-2517位核苷酸序列。
6.根据权利要求5所述的综合征型耳聋检测试剂盒,其特征在于,它包括用于PCR的DNA扩增酶和相应缓冲液。
7.一种遗传性疾病的相关基因的鉴定方法,其特征在于,包括以下步骤:
1)利用人X染色体外显子组捕获和高通量测序技术对采集的综合征型耳聋家系的患者以及正常个体全基因组DNA进行外显子捕获和分析,获得候选的遗传性疾病相关基因的突变位点;
2)结合常规的测序方法对候选的遗传性疾病相关基因的突变位点进行鉴定:
2A)家系内未参与外显子捕获和测序的其余样本进行遗传共分离验证;
2B)对步骤2A)验证基因的外显子及外显子-内含子交界区的序列进行PCR扩增和检测;
2C)扩大样本量验证,以此鉴定遗传性疾病的相关基因。
8.权利要求1或2的GPRASP2突变型基因、或权利要求5所述的试剂盒在制备综合征型耳聋检测试剂中的应用。
9.一种鉴定GPRASP2突变型基因的方法,其包括以下步骤:
1)测定待测样本中GPRASP2基因中外显子和外显子-内含子交界区序列;
2)与野生型相比较,如果存在缺失、替换、插入则认定该基因存在突变;
步骤1)中,采用如下引物中的至少一对分别扩增外显子或外显子-内含子交界区的序列:SEQ ID No:6和SEQ ID No:7、SEQ ID No:8和SEQ ID No:9、SEQ ID No:10和SEQ ID No:11、SEQ ID No:12和SEQ ID No:13、SEQ ID No:14和SEQ ID No:15、SEQ ID No:16和SEQ ID No:17。
10.根据权利要求9所述的鉴定GPRASP2突变型基因的方法,其包括以下步骤:
1)测定待测样品中GPRASP2基因第5外显子区的序列;
2)GPRASP2基因第5外显子编码区第1717-1718位核苷酸为GC,则所述的综合征型耳聋相关基因为野生型;GPRASP2基因第5外显子的上述对应位置突变为核苷酸AA,则所述的综合征型耳聋相关基因为突变型。
11.根据权利要求10所述的鉴定GPRASP2突变型基因的方法,其特征在于,步骤1)中,GPRASP2基因第5外显子编码区的1717-1718位核苷酸GC的核苷酸序列的测定采用PCR的方法,所述PCR引物序列如SEQ ID NO:14与SEQ ID NO: 15所示。
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