CN103757028B - Osbpl2突变型基因、其鉴定方法和检测试剂盒 - Google Patents

Abstract

本发明公开了OSBPL2突变型基因、其鉴定方法和检测试剂盒，OSBPL2突变型基因，其在人的OSBPL2基因序列的第3外显子区第152位核苷酸C和155位核苷酸C之间存在核苷酸C和T的缺失，和/或在人的OSBPL2基因序列在第7外显子区第583位核苷酸C突变为核苷酸A。本发明利用人基因组外显子捕获技术发现遗传性疾病的致病基因。该方法方便、便捷，而且由于只需取一个或少量的基因突变样本进行人基因组外显子序列捕获，大大降低了成本。该基因的鉴定对NSHL的易感和发生人群的基因诊断具有重要价值，对探索NSHL发病机制和开辟新的治疗途径具有重要意义。

Description

OSBPL2突变型基因、其鉴定方法和检测试剂盒

技术领域

本发明属于遗传学、分子生物学，具体涉及遗传性疾病致病基因的鉴定方法，特别涉及遗传性非综合征型耳聋相关基因、其鉴定方法和检测试剂盒。

背景技术

耳聋是一种较常见的人类感觉系统缺陷，是影响人类健康和造成残疾的常见疾病。耳聋的病因复杂，遗传因素占重要地位，超过60%的先天性耳聋是由遗传因素引起^[1-2]。研究表明，分布在细胞核和线粒体中的约有60多个不同类型的基因变异参与了遗传性非综合征型耳聋（Nonsyndromic Hearing Loss,NSHL）的发生，这些基因主要排列在常染色体上，仅少数位于性染色体及线粒体DNA中，他们在耳聋遗传表型传递中，呈现典型的单基因遗传及线粒体母系遗传方式，与听觉功能相关的基因变异已是遗传性NSHL的最主要的分子发病基础^[3-4]。由于听觉系统结构、功能的复杂性，涉及听觉相关的基因种类和数量多，至今定位与克隆的NSHL基因与预期的还相距甚远，且在世界范围内不断有新的DFNA大家系被定位及新的基因被发现。因此，对遗传性NSHL基因的定位、克隆及进一步的功能研究仍是任重而道远。

先前，研究疾病基因主要采取定位候选克隆的方法，通过家系收集和基因组扫描把与遗传病有关的基因定位到图谱的某一区域，然后利用已有数据筛选候选基因。这一过程非常繁琐，致使许多疾病的致病基因虽被定位于染色体某一区域但仍然未被找到。新一代测序技术——“外显子组测序（Exome sequencing）”为疾病基因组学研究开辟了新的方向，相关的研究成果也令人鼓舞。从2009年4月第1篇论文至迄今^[5]，已有一系列高水平的相关外显子组测序用于遗传性疾病的基因研究的报道^[6-10]。这些研究表明，外显子组测序技术以其高通量、低成本和高准确率等特点，在疾病基因鉴定方面具有得天独厚的优势。

发明人采集到一个典型的常染色体显性遗传、迟发型、进行性的NSHL大家系，研究排除了已知的常染色体显性遗传性耳聋致病基因与家系耳聋表型的相关性，认为该家系是由一个新的耳聋基因致病。如果采用传统的单基因遗传性疾病基因的定位方法，由于连锁区域将涉及已知基因、未知基因和预测基因，这将是一个耗时费力的过程。因此，外显子组测序技术结合生物信息学分析、候选致聋基因新突变致病性分析等实现对耳聋性基因的鉴定。

参考文献：

[1]Cohen MM,Gorlin RJ(1995)Hereditary hearing loss and its syndromes.In:Gorlin RJ,Toriello HV,Cohen MM,editors.In Origins of Oxford monographs on medical genetics,No28.New York:Oxford University Press.pp.9-21.

[2]Dror AA,Avraham KB(2009).Hearing loss:Mechanisms revealed by genetics and cellbiology.Annu Rev Genet43,411-437.

[3]Keats BJB,Berlin CI,Gregory P.Epidemiology of Genetic Hearing Loss.Seminars inHearing,2006,7:136-147.

[4]http://hereditaryhearingloss.org(last update:June3th,2013)

[5]Jones S,Hruban RH,Kamiyama M,et al.Exomic sequencing identifies PALB2as apancreatic cancer susceptibility gene.Science,2009,324:217.

[6]Walsh T,Shahin H,Elkan-Miller T,et al.Whole exome sequencing and homozygositymapping identify mutation in the cell polarity protein GPSM2 as the cause ofnonsyndromic hearing loss DFNB82.Am J Hum Genet,2010,87:90-94.

[7]Ng SB,Turner EH,Robertson PD,et al,Targeted capture and massively parallelsequencing of12human exome.Nature2009,461(7261):272-276.

[8]Ng SB,Buckingham KJ,Lee C,Bigham AW,Tabor HK,et al.Exome sequencingidentifies the cause of a Mendelian disorder.Nat Genet2010,42:30-35.

[9]Bilguvar K,Ozturk AK,Louvi A,et al.Whole-exome sequencing identifies recessiveWDR62mutations in severe brain malformations.Nature2010,467(7312):207-210.

[10]Majewski J,Rosenblatt DS.Exome and Whole-Genome Sequencing for Gene Discovery:The Future is Now.Human Mutation2012,33(4):591-592.

发明内容

本发明所要解决的技术问题是提供一种OSBPL2突变型基因。

本发明还要解决的技术问题是提供上述突变型基因的鉴定方法。

本发明最后要解决的技术问题是提供检测上述突变型基因的检测试剂盒。

针对上述问题，发明人首先采用人基因组外显子捕获与高通量测序技术获得候选NSHL相关基因的突变位点，再结合常规测序的方法对候选基因突变位点逐一进行遗传共分离验证、外显子以及外显子-内含子边界的序列比对与分析，最终找到了一个NSHL相关的新基因。由此可见，本发明发现致病基因的方法高效、快捷和准确度高，同时仅需对部分家系成员的样本进行外显子捕获测序，大大降低了成本。

为解决上述技术问题，本发明采用的技术方案如下：

一种OSBPL2突变型基因，其在人的OSBPL2基因（GENEBANK ID No.:NW_001838669.2）序列的第3外显子区第152位核苷酸C和155位核苷酸C之间存在核苷酸C和T的缺失（c.153del CT），和/或在人的OSBPL2基因序列在第7外显子区第583位核苷酸C突变为核苷酸A（c.583C＞A）。

其中，突变后的人的OSBPL2基因序列的第3外显子区，其核苷酸序列如SEQ IDNo:4所示；突变后的人的OSBPL2基因序列的第7外显子区，其核苷酸序列如SEQ IDNo:9所示。

一种重组载体，其含有权利要求1或2所述的OSBPL2突变型基因。

一种重组细胞，其含有权利要求3所述的重组载体。

一种非综合征型耳聋检测试剂盒，其至少包括：根据OSBPL2基因所有14个外显子及其外显子-内含子交界区序列设计的PCR引物；所述PCR引物用于PCR扩增，其扩增产物包含OSBPL2基因第3外显子区的核苷酸序列和/或OSBPL2基因第7外显子区的核苷酸序列；

所述的PCR引物序列为如下引物对中的至少一对：SEQ ID No:17和SEQ ID No:18、SEQ ID No:19和SEQ ID No:20、SEQ ID No:21和SEQ ID No:22、SEQ ID No:23和SEQID No:24、SEQ ID No:25和SEQ ID No:26、SEQ ID No:27和SEQ ID No:28、SEQ ID No:29和SEQ ID No:30、SEQ ID No:31和SEQ ID No:32、SEQ ID No:33和SEQ ID No:34、SEQID No:35和SEQ ID No:36、SEQ ID No:37和SEQ ID No:38、SEQ ID No:39和SEQ IDNo:40、SEQ ID No:41和SEQ ID No:42、SEQ ID No:43和SEQ ID No:44；

其中，引物SEQ ID No:21和SEQ ID No:22，其扩增产物为OSBPL2基因第3外显子区的核苷酸序列；引物SEQ ID No:29和SEQ ID No:30，其扩增产物为OSBPL2基因第7外显子区的核苷酸序列。

其中，上述非综合征型耳聋检测试剂盒还包括用于PCR的DNA扩增酶和相应缓冲液。

一种遗传性疾病的相关基因的鉴定方法，包括以下步骤：

1）利用人基因组外显子捕获和高通量测序技术对采集的遗传性疾病家系的患者以及正常个体全基因组DNA进行外显子捕获和分析，获得候选的遗传性疾病相关基因的突变位点；

2）结合常规的测序方法对候选的遗传性疾病相关基因的突变位点进行鉴定：

2A）家系内未参与外显子捕获的其余样本进行遗传共分离验证；

2B）对步骤2A）验证基因的外显子及外显子-内含子交界区的序列进行PCR扩增和检测；

2C）扩大样本量验证，以此鉴定遗传性疾病的相关基因。

其中，所述的遗传性疾病为单基因遗传性疾病，优选为非综合征型耳聋(NSHL)。

本发明中，所述遗传性疾病是指生殖细胞或受精卵的遗传物质（染色体和基因）发生突变（或畸变）所引起的疾病，通常具有垂直传递的特征，具有以上特征的家族成员及其关系称为遗传性疾病家系。

本发明中，DNA样本来自于组织、血液或各种体液等。

上述OSBPL2突变型基因、或试剂盒在制备非综合征型耳聋检测试剂中的应用。

一种鉴定OSBPL2突变型基因的方法，其包括以下步骤：

1）测定待测样本中OSBPL2基因中外显子和外显子-内含子交界区序列；

2）与野生型相比较，如果存在缺失、替换、插入则认定该基因存在突变；

步骤1）中，采用如下引物中的至少一对分别扩增外显子或外显子-内含子交界区的序列：SEQ ID No:17和SEQ ID No:18、SEQ ID No:19和SEQ ID No:20、SEQ ID No:21和SEQ ID No:22、SEQ ID No:23和SEQ ID No:24、SEQ ID No:25和SEQ ID No:26、SEQID No:27和SEQ ID No:28、SEQ ID No:29和SEQ ID No:30、SEQ ID No:31和SEQ IDNo:32、SEQ ID No:33和SEQ ID No:34、SEQ ID No:35和SEQ ID No:36、SEQ ID No:37和SEQ ID No:38、SEQ ID No:39和SEQ ID No:40、SEQ ID No:41和SEQ ID No:42、SEQID No:43和SEQ ID No:44。

上述鉴定OSBPL2突变型基因的方法，具体来说包括以下步骤：

1）测定待测样品中OSBPL2基因第3外显子区和/或第7外显子区的序列；

2）OSBPL2基因第3外显子区第152位核苷酸C和155位核苷酸C之间的核苷酸为CT，以及第7外显子区第583位的核苷酸为C，则所述的非综合征型耳聋相关基因为野生型；OSBPL2基因第3外显子的上述对应位置发生CT的缺失，和/或第7外显子区的第583位的核苷酸C突变为核苷酸A，则所述的非综合征型耳聋相关基因为突变型。

步骤1）中，OSBPL2基因第3外显子的152位核苷酸C和155位核苷酸C之间序列和/或第7外显子583位核苷酸序列的测定采用PCR的方法，所述PCR引物序列如SEQ ID NO:21与SEQ ID NO:22、SEQ ID NO:29与SEQ ID NO:30所示。

有益效果：

本发明利用人基因组外显子捕获和高通量测序技术发现遗传性疾病的相关基因。该方法方便、便捷，而且由于只需取一个或少量的个体样本进行人基因组外显子序列捕获，大大降低了成本。基于上述方法，本发明发现了一种NSHL相关基因OSBPL2，该基因编码的为氧化固醇结合蛋白相关蛋白2，这是首次发现该基因及其突变型与NSHL的发生相关。该基因的鉴定对NSHL的易感和发生人群的基因诊断具有重要价值，对探索NSHL致病机制和开辟新的治疗途径具有重要意义。

附图说明

图1NSHL相关基因突变位点的筛选与验证流程图。

图2该NSHL家系参与外显子组捕获及测序的2例耳聋患者的典型听力图（左图：患者-1，男，17岁，纯音测听示双耳对称的高频感音神经性听力损失；右图：患者-2，男，38岁，17岁发现双侧高音调耳鸣、听力下降，进行性加重，30岁以后交流明显困难。纯音测听示双耳对称的重～极重度感音神经性聋。）

图3OSBPL2基因第3外显子区152～155位及其侧翼序列（参见SEQ ID NO:3或SEQ ID NO:4）的测序结果（采用反向引物测序）（图3-A：听力正常人，测序图无移码现象；图3-B：NSHL家系内患者，OSBPL2基因第3外显子区存在c.153del CT突变，测序图存在移码突变）

图4OSBPL2基因第7外显子区583位及其侧翼序列（参见SEQ ID NO:8或SEQ IDNO:9）的测序结果（图4-A：听力正常人；图4-B：NSHL家系内患者，OSBPL2基因第7外显子区第583位核苷酸C杂合突变为A，其氨基酸序列由赖氨酸Lys替换为甲硫氨酸Met）。

具体实施方式

下面将结合实施例对本发明的实施方案进行详细描述，但是本领域技术人员将会理解，下列实施例仅用于说明本发明，而不应视为限定本发明的范围。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规产品。

实施例1：

发明人以NSHL为例，检测出一个新的耳聋相关基因（流程图如图1所示），其包括以下步骤：

1）发明人采集到一个七代遗传的常染色体显性遗传的NSHL家系，问诊和听力测试结果显示，家系内患者均表现为迟发型、进行性的中、重度非综合征型耳聋。收集该家系成员外周血并提取基因组DNA。

2）采用人基因组外显子捕获技术对1）所述家系中3个患者和1个正常对照的全基因组DNA进行外显子捕获和分析，获得候选的遗传性耳聋相关基因的突变位点。

3）结合常规的测序方法对候选的遗传耳聋相关基因的突变位点进行鉴定：a.对家系内未参与外显子捕获的其余样本进行遗传共分离验证；b.对a验证基因的外显子及外显子-内含子交界区的序列进行PCR扩增和检测；c.扩大样本量（家系外正常对照、散发聋病例）验证。

发明人采集到一个七代遗传的常染色体显性遗传的NSHL家系（先证者的听力资料图如图2所示），问诊和听力测试结果显示，家系内患者均表现为迟发型、进行性的中、重度非综合征型耳聋。收集该家系成员外周血4ml，EDTA抗凝，取300μl抽提基因组DNA，使用RelaxGene Blood DNA mini Kit试剂盒（Tiangen Biotech Co.,Beijing,China）严格按照说明书进行。

实施例2：利用人基因组外显子组捕获测序该NSHL家系的致病基因

随后发明人采用Agilent SureSelect Human All Exon Kit(38M)结合Solexa高通量测序技术对实施例1所述NSHL家系中的3名患者和1名正常人的外显子组序列进行了测序，成功地发现了一个新的NSHL相关基因—OSBPL2基因的突变体。具体操作步骤如下：

1）将基因组DNA随机打断成150-200bp左右的片段，然后在片段两端分别连接上接头制备杂交文库（参见http://www.illumina.com/提供的Illumina/Solexa标准建库说明书；Accurate wholehuman genome sequencing using reversible terminator chemistry.Nature2008,456:53-59）。

2）文库经纯化后经过Ligation-mediated PCR(LM-PCR)的线性扩增与SureSelectBiotiny Lated RNA Library(BAITS)进行杂交富集，再经过LM-PCR的线性扩增后进行上机测序。测序平台为Illumina Hiseq2000，读取长度为90bp，每个样本的平均测序深度最少为50。

3）测序获得的原始数据由Illumina Basecalling Software v1.7进行处理，经过过滤去污染、使用SOAPaligner2.20(Li R,Li Y,Kristiansen K,et al,SOAP:short oligonucleotidealignment program.Bioinformatics2008,24(5):713-714;Li R,Yu C,Li Y,et al,SOAP2:animproved ultrafast tool for short read alignment.Bioinformatics2009,25(15):1966-1967.)比对参考基因组，获得比对到基因组上的Unique Mapped Reads。靶区域的基因由SOAPsnp（Li R,Li Y,Fang X,et al.SNP detection for massively parallel whole-genome resequencing.Genome Res2009,19(6):1124-1132.）确定。然后对数据进行标准的信息分析流程，包括对SNP、Indel等进行检测、注释和统计分析。同时对数据进行质控检测，包括测序温度、覆盖度均一性等分析的检测报告。

每个个体的平均测序长度为5.9GB，去除了由重复起始点的Reads后，发明人得到了由RefSeq genes（Pruitt KD,Tatusova T,Maglott DR:NCBI reference sequences(RefSeq):a curated non-redundant sequence database of genomes,transcripts and proteins.NucleicAcids Res2007,35(Database issue):D61-65）定义的测序深度为50、长度为2.2Gb的外显子组。平均98.55%的外显子组被覆盖，平均每个个体发现的遗传变异有17397个SNP和4409个Indel。

为了从所有突变中找到可能的致病突变，发明人重点关注了非同义突变，认为同义突变致病的可能性较小。与此同时，实验室前期已排除了中国人常见的耳聋突变基因的突变，导致该案例NSHL的突变应该是稀有突变，因此它应该在一般人群中缺失。因此，定义一个新突变如下：它同时不存在于公认的数据库中，包括：dbSNP129、8个HapMap个体的外显子组数据（Ng SB,Turner EH,Robertson PD,et al.Targeted capture andmassively parallel sequencing of12human exomes.Nature2009,461(7261):272-276.）、1000人基因组计划（Siva N.1000Genomes project.Nat Biotechnol2008,26(3):256.）、该家系中正常对照的外显子组数据和已知NSHL相关基因的突变（http://hereditaryhearingloss.org/）。

经过上述数据库以及家系正常对照的筛选后，这三个患者共有的突变还剩66个SNP和11个Indel。接下来，发明人使用ANNOVAR软件（Wang K,Li M,Hakonarson H.ANNOVAR:Functional annotation of genetic variants from high-throughput sequencing data.Nucleic Acids Res2010,38(16):e164.）预测可能有害的基因，将候选基因的范围缩小到11个。

发明人进一步对参与外显子测序的样本及家系内病例进行常规测序分析。发明人观察到在这11个候选基因中位于OSBPL2中的突变位点是缺失突变（预测的序列如下所示SEQ ID NO:45），在家系中符合遗传共分离，该突变位于OSBPL2基因的第3外显子区，存在一个两个核苷酸（CT）的缺失突变（c.153del CT），该缺失导致从密码子发生移码从而改变了读码框，并造成新读码框的提前终止。所以发明人推测OSBPL2与NSHL的致病可能相关。

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在本实施例中，只需取该NSHL家系中的三个患者和一个正常人的基因组DNA进行人基因组外显子序列捕获和测序，而无需检测所有患者，因而大大降低了成本。

实施例3：OSBPL2基因c.153del CT突变位点的进一步验证

发明人结合常规的测序方法对OSBPL2基因c.153del CT突变位点进行了验证：①对实施例1所述家系中所有样本进行遗传共分离验证；②对①验证基因的外显子及外显子-内含子交界区的序列进行PCR扩增和检测；③扩大样本量（家系外正常对照、常染色体显性遗传小家系、散发聋病例）验证。

1）利用PCR扩增该突变

按实施例1的方法对家系中所有患者的外周血样本进行基因组DNA的制备。将浓度调至25ng/μl后进行PCR反应。

PCR引物由Primer v5.0进行设计，序列如下：

上游引物：CTGGATCTCACTCACATTCT（SEQ ID NO:21）

下游引物：TCACTGGACTCTACCTACAT（SEQ ID NO:22）

PCR反应体系25μl，包含：12.5μl PCR Mix(TaKaRa Co.,Japan)，上下游引物各0.5μl，基因组DNA（25ng/μl）0.5μl，ddH₂O11μl。PCR反应条件如下：预变性94℃10分钟；94℃、57℃、72℃各1分钟；共32个循环；最后72℃延伸10分钟。

PCR反应产物由QIAquick PCR纯化试剂盒（Qiagen）进行纯化后由ABI PRISM3730自动测序仪（Applied Biosystems）进行测序。

扩增产物纯化后进行Sanger测序（序列如SEQ ID NO:46、SEQ ID NO:47所示），测序结果表明，c.153del CT在家系内25名患者被验证出来，而26名家系内正常人均未发现此突变，出现了明显的遗传共分离现象。在PubMed Blast数据库中进行核酸同源性检测，发现只有与人OSBPL2基因同源性最高。

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以上序列为病例样本的测序结果（覆盖OSBPL2突变基因第3外显子及其侧翼序列），在深色底色的斜体C和C之间缺失CT（测序结果的截图如图3-B所示）。

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以上序列为正常人的测序结果（覆盖OSBPL2突变基因第3外显子及其侧翼序列），同时与UCSC Genome Bioinformatics中OSBPL2基因序列（hg18）（第3外显子及其侧翼序列）相符，在深底色斜体部分无CT的缺失（测序结果的截图如图3-A所示）。

测序结果表明存在c.153del CT突变的检测样本都是患病样本，换言之，两者存在正相关性。

2）OSBPL2基因各外显子及外显子-内含子交界区的扩增

发明人对家系中25名患者的OSBPL2基因除第3外显子外的其他13个外显子（SEQID NO:1、2、4～14）及外显子-内含子交界区进行了PCR扩增。扩增引物见表1。PCR反应体系和反应条件同1）。结果表明表1中的引物能够有效扩增目标序列，并同时进行目标序列的突变检测。测序结果发现家系内患病样本除第3外显子外的其他13个外显子均未出现突变，家系内正常人样本的全部外显子的验证结果也均为阴性。

表1OSBPL2基因各外显子及外显子-内含子交界区扩增引物

3）扩大样本量验证

与此同时，发明人在实施例1所述300例正常人对照，针对每例个体采用SEQ ID NO:17～44引物对OSBPL2基因各外显子及外显子-内含子交界区的扩增，Sanger测序结果均为阴性结果，进一步表明该突变c.153del CT的存在与NSHL的有无存在正相关性。

实施例4：NSHL家系以及散发聋病例样本中OSBPL2基因14条外显子及外显子-内含子交界区突变位点的检测

收集38个常染色体显性遗传家系先证者及452例未知原因的散发聋患者的外周血抽提基因组DNA（方法同实施例1）。将浓度调至25ng/μl后进行PCR反应（方法同实施例3中步骤1)和2)），扩增产物纯化后进行Sanger测序。

其中一例散发聋病例样本及其正常对照的测序结果如SEQ ID NO:48、SEQ ID NO:49所示（以SEQ ID NO:29与SEQ ID NO:30为引物），在PubMed Blast数据库中进行核酸同源性检测，发现只有与人OSBPL2基因同源性最高。

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以上序列为一例散发聋病例样本的测序结果（覆盖OSBPL2突变基因第7外显子及其侧翼序列），在深色底色加框位置的核苷酸由C突变为A（c.583C＞T），氨基酸序列由赖氨酸Lys替换为甲硫氨酸Met（测序结果的截图如图4-B所示）。

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以上序列为正常人的测序结果（覆盖OSBPL2突变基因第7外显子及其侧翼序列），同时与UCSC Genome Bioinformatics中OSBPL2基因序列（hg18）（第3外显子及其侧翼序列）相符，在深底色斜体位置的核苷酸C未发生改变（测序结果截图如图4-A所示）。

实施例5：检测OSBPL2基因第3外显子和/或第7外显子突变的试剂盒组成及使用方法A、试剂盒组成

引物：SEQ ID NO:21和SEQ ID NO:22所示序列，和/或SEQ ID NO:29和SEQ IDNO:30，或选自SEQ ID NO:17～44所示序列中的至少一对；

其他成分：PCR反应缓冲液，MgCl₂（25mmol/l），dNTP，Taq(TaKaRa Co.Japan)，ddH₂O。

B、使用方法

1）在试剂盒的组成成分中加入待测样本后进行PCR反应；

2）PCR反应产物经纯化后测序，将所得到的序列与OSBPL2正常基因序列比对，确定第3外显子和/或第7外显子序列是否存在突变。

尽管本发明的具体实施方式已经得到详细描述，本领域技术人员将会理解。根据已经公开的所有教导，可以对那些细节进行各种修改和替换，这些均在本发明的保护范围内。本发明的全部范围由所附专利要求及其任何等同物给出。

Claims (4)

1.一种OSBPL2突变型基因，其在人的OSBPL2基因序列的第3外显子区第152位核苷酸C和155位核苷酸C之间存在核苷酸C和T的缺失；或者，其在人的OSBPL2基因序列的第3外显子区第152位核苷酸C和155位核苷酸C之间存在核苷酸C和T的缺失，并且在人的OSBPL2基因序列的第7外显子区第583位核苷酸C突变为核苷酸A；

其中，突变后的人的OSBPL2基因序列的第3外显子区，其核苷酸序列如SEQ ID No:4所示的核苷酸序列；突变后的人的OSBPL2基因序列的第7外显子区，其核苷酸序列如SEQ ID No:9所示核苷酸序列。

2.一种重组载体，其含有权利要求1所述的OSBPL2突变型基因。

3.一种重组细胞，其含有权利要求2所述的重组载体。

4.权利要求1或2所述的OSBPL2突变型基因在制备非综合征型耳聋检测试剂中的应用。