CN109457031B - BRCA2基因g.32338309A＞G突变体及其在乳腺癌辅助诊断中的应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种BRCA2基因g.32338309A>G突变体及其在乳腺癌辅助诊断中的应用，该BRCA2基因突变与BRCA2正常基因序列相比具有g.32338309A>G位点突变，并公开了一种用于检测该突变体的特异性引物、包含该特异性引物的试剂盒以及该突变体在乳腺癌辅助诊断中的应用。本发明提供了乳腺癌致病的新突变位点，以便辅助诊断乳腺癌。

Description

BRCA2基因g.32338309A＞G突变体及其在乳腺癌辅助诊断中 的应用

技术领域

本发明属于基因工程及肿瘤医学领域，具体涉及一种BRCA2基因g.32338309A＞G突变体及其在乳腺癌辅助诊断中的应用。

背景技术

乳腺癌是女性中常见的一种癌症，近年来我国乳腺癌的发生率和死亡率呈上升趋势。乳腺癌的发生发展受到遗传、激素水平、生活习惯和环境等多种因素的影响，其中遗传背景、年龄和性别是乳腺癌发生的高危因素，约5～10％的乳腺癌是遗传性乳腺癌。与乳腺癌发生高度相关的易感基因主要是BRCAl和BRCA2基因，约15％的家族性乳腺癌与BRCAl和BRCA2基因突变相关。突变位点的存在被认为赋予了个体不同的表型性状，以及对于环境暴露、药物治疗等因素的不同反应性。因此，突变点可能导致个体对常见疾病发病易感性差异的重要遗传基础。将疾病的突变位点谱用于疾病的辅助诊断，具有广阔的应用前景。近年来，利用突变位点对疾病进行辅助诊断已经成为临床和科研工作者的研究热点，在肿瘤、先天性疾病和心脑血管疾病等常见重大疾病上的应用价值已初见端倪。

BRCA1和BRCA2基因是迄今发现的与乳腺癌发生发展密切相关的两个重要的易感基因，在临床应用较普遍，且受到国内外专家学者的重视。BRCA1基因定位在人类染色体17q21区域，位于两遗传标D17S1321和D1781325之间，并跨越D17S855基因全长约100kb，由24个外显子构成，其中包括22个编码外显子和2个非编码外显子(外显子1和4)。BRCA2基因定位于人类染色体13q12-13，全基因组长约70kb由10254个核苷酸组成包含27个外显子。这两个抑癌基因在DNA损伤修复、细胞生长与凋亡、转录调控及维持基因稳定等多种生物学途径都起重要作用。BRCA1、BRCA2基因突变导致的蛋白功能缺失或异常，将会导致肿瘤的发生以及对各种导致DNA损伤的因素更加敏感。

携带BRCA2功能性突变的个体极有可能发展为乳腺癌患者，尤其是乳腺癌家族史携带者。针对突变携带者采取一系列的预防措施，例如较早的进入乳腺癌筛查，并提高筛查频率，以及预防性手术的实施将早期发现乳腺癌而取得较好的干预和治疗效果。中国的BRCA2基因检测起步较晚，尽管有几项相关的研究，但是尚未发现足够量的突变“热点”，尤其是中国人群特异的乳腺癌相关突变。并且由于种族差异，欧美国家的突变谱也不完全适用于中国人群，若能筛选出乳腺癌发病相关的突变位点作为生物标志物，并研制相应的诊断试剂盒，对我国乳腺癌筛查和早期诊断必将是一次有力的推动。

发明内容

发明目的：为了克服现有技术中存在的不足，本发明提供一种BRCA2基因g.32338309A＞G突变体、检测该突变体的特异性引物、包含该特异性引物的诊断试剂盒和该突变体在乳腺癌辅助诊断中的应用，以实现快速方便的辅助判断乳腺癌。

技术方案：为实现上述目的，本发明的一种BRCA2基因g.32338309A＞G突变体，其野生型BRCA2基因DNA序列如SEQ ID NO:1所示，其突变型BRCA2基因DNA序列如SEQ ID NO:2所示。

进一步的，一种用于检测所述BRCA2基因g.32338309A＞G突变体的特异性引物，所述特异性引物的上游引物序列如SEQ ID NO:3所示，下游引物序列如SEQ ID NO:4所示。

进一步的，一种乳腺癌辅助诊断试剂盒，包括用于检测所述BRCA2基因g.32338309A＞G突变体的特异性引物。

进一步的，一种BRCA2基因g.32338309A＞G突变体在乳腺癌辅助诊断中的应用，利用外周血通过权利要求3所述一种乳腺癌辅助诊断试剂盒检测BRCA2基因g.32338309A＞G位点突变，再通过突变位点谱辅助判断乳腺癌；所述一种乳腺癌辅助诊断试剂盒检测BRCA2基因g.32338309A＞G位点突变的具体步骤如下，

(1)提取全血基因组DNA；

(2)利用权利要求2所述用于检测BRCA2基因g.32338309A＞G突变体的特异性引物进行PCR扩增反应，并得到PCR扩增产物；

(3)检测BRCA2基因是否存在g.32338309A＞G突变基因。

进一步的，所述检测BRCA2基因是否存在g.32338309A＞G突变基因的具体步骤如下，

(1)利用琼脂糖凝胶将所述PCR扩增产物进行电泳；

(2)将电泳后的PCR扩增产物进行纯化回收，以方便测序；

(3)将纯化后的PCR扩增产物在DNA测序仪上进行测序，将测序结果与野生型BRCA2参考序列NCBI Reference Sequence:NC_000013.11进行比对。

进一步的，PCR扩增反应的总体积为50μL，含PCR 5×缓冲液10μL，DNA模板5.0μL，Taq聚合酶1.0μL，MgCl₂终浓度2.0mmol/L，dNTP终浓度200nmol/L，以及特异性的上游引物和下游引物终浓度200nmol/L，并加消毒双蒸水至总体积50μL；反应条件为95℃预变性5分钟，然后依次95℃变性30秒，接着58℃退火30秒，72℃延伸30秒，共35个循环。

有益效果：本发明的有益效果如下所述：一种乳腺癌辅助诊断试剂盒只需要外周血而不需要其它组织样品，通过最精简和特异的引物对检测突变位点，再通过突变位点谱辅助判断乳腺癌，不仅稳定，检测方便，且精确，大大提高疾病诊断的敏感性和特异性，因此将此试剂盒投入实践，可以帮助指导诊断和更有效的个体化治疗；本发明获得了乳腺癌发病相关突变位点谱和特异性标志物。通过突变位点序列的改变进行相关诊断试剂盒的研制和应用，可使得乳腺癌的诊断更加方便易行，为临床医生快速准确掌握患者病情，为临床治疗效果评价奠定基础，并为发现具有潜在治疗价值的新型小分子药物靶标提供帮助。

附图说明

附图1为BRCA2基因g.32338309A＞G突变基因检测凝胶电泳图；

附图2为BRCA2基因g.32338309A＞G突变基因测序图。

具体实施方式

下面结合附图对本发明作更进一步的说明。

一种BRCA2基因g.32338309A＞G突变体，其野生型BRCA2基因DNA序列如SEQ IDNO:1所示，其突变型BRCA2基因DNA序列如SEQ ID NO:2所示。

所述BRCA2基因g.32338309A＞G位点突变是指突变位点为在SEQ ID NO:1序列的第140位碱基A突变为G。

本研究采用PCR扩增和Sanger测序技术在58例具有乳腺癌家族史的中国汉族女性乳腺癌患者中，我们发现有1例患者存在BRCA2基因组第13号染色体的g.32338309A＞G位置发生碱基A到G的突变：随后进行无家族史乳腺癌样本验证，在1850例无家族史中国汉族乳腺癌女性乳腺癌患者中，存在5例患者携带该突变；在1850例无肿瘤家族史，年龄匹配的正常女性对照人群中，未发现突变个体。为进一步提高该突变致乳腺癌的可靠性，我们建立了正常人群队列(排除任何肿瘤患者，排除乳腺癌家族史患者)中女性3000名(35～65岁)检测该突变，发现突变阳性1例(基线时为45岁)，经追踪随访查出9例新发乳腺癌患者，其中包含该突变阳性者。该突变位点为本研究首次在中国汉族女性乳腺癌患者中发现，且在正常人群中不存在该突变，通过纳入前瞻性队列研究，证明了携带该突变的患者最终发展成了乳腺癌，证明了该位点是乳腺癌的致病因素。

与乳腺癌辅助诊断相关的突变位点为g.32338309A＞G，该突变发生于第13号染色体的32338309位置，该基因在NCBl参考数据库GRCh38.pl2中的编号为NC_000013.11(32315480-32399672)，这里列出在该数据库中包含有本位点野生型的部分碱基序列供参考，如SEQ ID NO:1所示，BRCA2基因突变相对应的序列如SEQ ID NO:2所示，其中突变位点在SEQ ID NO:1序列的第140位由碱基A突变为G。其中

SEQ ID NO:1

TGTTTAAGATAGAAAATCATAATGATAAAACTGTAAGTGAAAAAAATAATAAATGCCAACTGATATTACAAAATAATATTGAAATGACTACTGGCACTTTTGTTGAAGAAATTACTGAAAATTACAAGAGAAATACTGAAAATGAAGATAACAAATATACTGCTGCCAGTAGAAATTCTCATAACTTAGAATTTGATGGCAGTGATTCAAGTAAAAATGATACTGTTTGTATTCATAAAGATGAAACGGACTTGCTATTTACTGATCAGC

SEQ ID NO:2

TGTTTAAGATAGAAAATCATAATGATAAAACTGTAAGTGAAAAAAATAATAAATGCCAACTGATATTACAAAATAATATTGAAATGACTACTGGCACTTTTGTTGAAGAAATTACTGAAAATTACAAGAGAAATACTGAGAATGAAGATAACAAATATACTGCTGCCAGTAGAAATTCTCATAACTTAGAATTTGATGGCAGTGATTCAAGTAAAAATGATACTGTTTGTATTCATAAAGATGAAACGGACTTGCTATTTACTGATCAGC

一种用于检测所述BRCA2基因g.32338309A＞G突变体的特异性引物，所述特异性引物的上游引物序列如为SEQ ID NO:3所示，下游引物序列如SEQ ID NO:4所示。

一种乳腺癌辅助诊断试剂盒，包括用于检测所述BRCA2基因g.32338309A＞G突变体的特异性引物。

突变位点试剂盒的制作和操作流程是基于PCR扩增和Sanger测序扫描检测技术。试剂盒含有一批突变位点特异性引物(包括下列引物：g.32338309A＞G突变位点的引物序列为SEQ ID NO:3和SEQ ID NO:4)，该试剂盒还可以包括PCR反应常用的试剂，如Taq酶、dNTP混合液、MgCl₂溶液、去离子水等；这些常用试剂都是本领域技术人员熟知的，另外还可以含有标准品和/或对照品(如确定基因型的标准品和空白对照等)。此试剂盒的价值在于只需要外周血而不需要其它组织样品，通过最精简和特异的引物对检测突变位点，再通过突变位点谱辅助判断乳腺癌，不仅稳定，检测方便，且精确，大大提高疾病诊断的敏感性和特异性，因此将此试剂盒投入实践，可以帮助指导诊断和更有效的个体化治疗。

一种BRCA2基因g.32338309A＞G突变体在乳腺癌辅助诊断中的应用，利用外周血通过权利要求3所述一种乳腺癌辅助诊断试剂盒检测BRCA2基因g.32338309A＞G位点突变，再通过突变位点谱辅助判断乳腺癌；所述一种乳腺癌辅助诊断试剂盒检测BRCA2基因g.32338309A＞G位点突变的具体步骤如下，

(1)提取全血基因组DNA；

(2)利用权利要求2所述用于检测BRCA2基因g.32338309A＞G突变体的特异性引物进行PCR扩增反应，并得到PCR扩增产物；

(3)检测BRCA2基因是否存在g.32338309A＞G突变基因。

所述提取全血DNA的具体步骤如下所述，

(1)取无菌2.0mL离心管一只，加入1mL细胞裂解液。

(2)轻轻震荡然经EDTA抗凝的全血样本，直到彻底混匀；然后吸取500μL血样加入上述含有细胞裂解液的离心管中，轻轻倾倒离心管5-6次混匀。

(3)室温孵育10分钟(期间颠倒离心管2-3次混匀)。

(4)12000rpm室温离心5分钟。

(5)用移液器缓慢的尽可能将上清液移弃干净，注意勿将两相交界处的白色物质吸出。

(6)使用涡旋振荡器(Votex)剧烈混匀，直至白细胞重悬(10-15秒)。

(7)向重悬细胞溶液中加入核裂解液300μL。用移液枪头吸放溶液5-6次裂解白细胞。此时溶液应变得很粘稠。若混合后可见细胞团块，则将溶液置于37℃孵育直至团块消散。若孵育1小时后仍可见细胞团块，则另加核裂解液100μL并重复置于37℃孵育。

(8)向核裂解物中加入蛋白沉淀液100μL，用涡旋振荡器剧烈震荡10-20秒。

(9)12000rpm室温离心5分钟。

(10)将其上清液转至对应编号的已加入300μL室温异丙醇的2.0mL离心管中。

(11)轻轻颠倒以混匀溶液，直至白色线状DNA形成沉淀。

(12)12000rpm室温离心1分钟。

(13)弃去上清液，加入与样本量等体积的室温70％乙醇，轻轻颠倒离心管数次。

(14)用移液器缓慢的尽可能将乙醇液移弃干净。将离心管置于50℃烘烤5-10分钟，尽量让残余的乙醇液挥发干净。

(15)向离心管中加入50-100μL的DNA溶解液，轻轻混匀。

(16)用1％琼脂糖凝胶电泳来评估DNA提取效果，Nanodrop核酸仪检测含量，定量到20-50ng/μL，-20℃保存。

所述检测BRCA2基因是否存在g.32338309A＞G突变基因的具体步骤如下，

仪器：Veriti 96型PCR仪、BIO-RAD Gel Doc XR+型凝胶成像仪(美国伯乐公司)、凝胶电泳仪(北京六一公司)。

试剂：QIAamp DNA提取试剂盒(德国Qiagen公司)；DNAIsolation Kit提取试剂盒(北京PELFREEZ公司)；PCR缓冲液、dNTP、Taq酶(美国ABI公司)；引物由上海生工生物有限公司合成。

(1)引物设计：根据美国国家生物信息中心(NCBI)GenBank记录的BRCA2基因(序列号:NC_000013.11)，通过Oligo 6.0引物软件设计引物，最终确定1对特异性寡核苷酸引物序列为F:5’-AATTACAAGAGAAATACTGAG-3’(SEQ ID NO:3)和R:5’-CTTCATAAACTGGCCAGATAAT-3’，扩增产物片段长度为189bp。

(2)反应总体积：50μL，含PCR 5×缓冲液10μL，DNA模板5.0μL，Taq聚合酶(1U/μL)1.0μL，MgCl₂终浓度2.0mmol/L，dNTP终浓度200nmol/L，以及特异性上、下引物终浓度200nmol/L，并加消毒双蒸水至总体积50μL。

反应条件：95℃预变性5分钟，然后依次95℃变性30秒，接着58℃退火30秒，72℃延伸30秒分钟，共35个循环。

(3)BRCA2基因g.32338309A＞G突变基因检测：用1.5％琼脂糖凝胶对将步骤(2)所得的增扩产物进行电泳，以检测其是否有目的片段。通过凝胶成像仪观察结果并拍照，PCR产物经电泳后显示为单一条带，无杂带，则提示PCR产物单一，无非特异扩增。若条带位置位于适当大小的位置，则为目的片段。如图1所示，M：50bp梯度分子量标记物，1：空白对照，2：野生型对照，3：BRCA2基因g.32338309A＞G突变样本。

(4)扩增产物纯化：本研究采用Takara公司的Agarose Gel DNAPurification Kit试剂盒将琼脂糖凝胶电泳后的PCR产物进行纯化回收，准备测序。

(5)Sanger测序和结果判断：纯化后PCR产物在ABI3730型全自动DNA测序仪上进行测序。将测序结果与BRCA2野生型参考序列(NCBI Reference Sequence:NC_000013.11)进行比对，根据实际突变情况对结果进行报告。检测所得基因突变测序图如图2所示，图中箭头所示为BRCA2基因显示g.32338309A＞G位点突变。

相关突变位点寡核苷酸引物序列如表1所述，

表1

其中F＝上游引物序列；R＝下游引物序列。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出：对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

Claims (3)

1.一种BRCA2基因g.32338309A>G突变体，其特征在于：其野生型BRCA2基因DNA序列如SEQ ID NO:1所示，其突变型BRCA2基因DNA序列如SEQ ID NO:2所示。

2.一种用于检测权利要求1所述的一种BRCA2基因g.32338309A>G突变体的特异性引物，其特征在于：所述特异性引物的上游引物序列如SEQ ID NO:3所示，下游引物序列如SEQID NO:4所示。

3.一种乳腺癌辅助诊断试剂盒，其特征在于：包括权利要求2所述的用于检测BRCA2基因g.32338309A>G突变体的特异性引物。

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