CN105969859A - 乳腺癌易感基检测芯片及其制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种乳腺癌易感基检测芯片,包括固体支持物及固定在所述固定支持物上的基因检测探针;所述基因检测探针包括24个乳腺癌易感基因的31个SNP位点;24个所述乳腺癌易感基因分别为CHEK2、PALB2、ZNF350、ESR1、C6orf97、USP7、MRPS30、AURKA、ATM、CASC16、TOX3、DNMT1、ZMIZ1、TGFB1、FGFR2、ZNF365、SLC4A7、TNRC9、TNP1、HER2、BRCA2、CCDC170、BRCA1、CYP11A1。本发明中基因检测探针包括24个乳腺癌易感基因的31个SNP位点,该位点经过文献论证,具有较高的实用性,可用于疾病的早期诊断和大规模筛查,并且位点检出成功率高、技术重现性好、性价比高,为乳腺癌的诊断、分型、预后判断提供重要依据,以实现对疾病的早期诊断。
Description
技术领域
本发明涉及检测乳腺癌领域,尤其涉及一种乳腺癌易感基检测芯片及其制备方法。
背景技术
对常见疾病相关多种遗传标识进行早期检测和系统评估将有助于对疾病的早期预防、诊断和治疗。目前,研究已经发现大量与各种常见疾病相关的遗传学标识,然而,由于缺乏有足够的灵敏度和可以对多种疾病相关标识进行广泛(高通量检测位点、高通量检测样本)筛查和检验的方法,使得这些常见疾病的遗传学标识无法广泛应用。此外,目前常见疾病遗传标识缺乏系统、有效的整合,大大制约了常见疾病早期预防、诊断和治疗方面的发展。现有检测只有单一种疾病或一类疾病的遗传标识检测,检测范围有限,且某些常见疾病尚无早期检测的方法。
目前,一些传统医学手段,如组织细胞检测存在着其固有的缺陷,取材位置不当、组织细胞标本材料不足或认为经验不足等都将导致乳腺癌误诊。其他技术例如影响学虽然已被广泛应用于疾病的检查和诊断,但其在疾病程度的定性上仍存在着很大的局限性。
发明内容
有鉴于此,本发明的目的是提供一种乳腺癌易感基检测芯片及其制备方法,能够解决检查诊断准确率高的技术问题。
为了实现上述目的,本发明提供如下技术方案:
一种乳腺癌易感基检测芯片,包括固体支持物及固定在所述固定支持物上的基因检测探针;所述基因检测探针包括24个乳腺癌易感基因的31个SNP位点;24个所述乳腺癌易感基因分别为CHEK2、PALB2、ZNF350、ESR1、C6orf97、USP7、MRPS30、AURKA、ATM、CASC16、TOX3、DNMT1、ZMIZ1、TGFB1、FGFR2、ZNF365、SLC4A7、TNRC9、TNP1、HER2、BRCA2、CCDC170、BRCA1、CYP11A1;
所述CHEK2的SNP位点为rs17879961;
所述PALB2的SNP位点为rs249954、rs120963和rs16940342;
所述ZNF350的SNP位点为rs4986773;
所述ESR1的SNP位点为rs2046210;
所述C6orf97的SNP位点为rs3757318;
所述USP7的SNP位点为rs2304467和rs12924995;
所述MRPS30的SNP位点为rs10941679;
所述AURKA的SNP位点为rs2273535;
所述ATM的SNP位点为rs1003623;
所述CASC16的SNP位点为rs4784227;
所述TOX3的SNP位点为rs8051542;
所述DNMT1的SNP位点为rs16999593;
所述ZMIZ1的SNP位点为rs1250009;
所述TGFB1的SNP位点为rs1982073;
所述FGFR2的SNP位点为rs1219648;
所述ZNF365的SNP位点为rs10822013;
所述SLC4A7的SNP位点为rs4973768;
所述TNRC9的SNP位点为rs3803662;
所述TNP1的SNP位点为rs13387042;
所述HER2的SNP位点为rs1136201;
所述BRCA2的SNP位点为rs206116和rs144848;
所述CCDC170的SNP位点为rs9383935;
所述BRCA1的SNP位点为rs80357887、rs80357272、rs80357546和rs80357086;
所述CYP11A1的SNP位点为rs2279357。
优选地,所述固体支持物为载玻片、硅片、膜或高分子材料。
本发明还提供了上述乳腺癌易感基检测芯片的制作方法,包括以下步骤:
1)在含有DNA的组织或细胞样本中并加入蛋白酶盐酸胍,涡旋、离心,得到含有DNA分子的上层清液;
2)在PCR反应液中加入步骤1)得到含有DNA分子的上层清液,进行扩增,得到扩增产物;
3)将步骤2)得到的扩增产物依次进行碱性磷酸酶处理、单碱基延伸反应,反应结束后进行树脂纯化;
4)将步骤3)得到树脂纯化的延伸产物在固体支持物上进行点样,得到乳腺癌易感基检测芯片。
优选地,所述含有DNA的组织或细胞样本为口腔拭子或全血。
从上述技术方案可以看出,本发明一种乳腺癌易感基检测芯片,基因检测探针包括24个乳腺癌易感基因的31个SNP位点,该位点经过文献论证,具有较高的实用性,可用于疾病的早期诊断和大规模筛查,并且位点检查正确率高、技术重现性好、性价比高,为乳腺癌的诊断、分型、预后判断提供重要依据,以实现对疾病的早期诊断。
具体实施方式
为了进一步了解本发明,下面结合实施例对本发明的优选实施方案进行描述,但是应当理解,这些描述只是为进一步说明本发明的特征和优点而不是对本发明专利要求的限制。
本发明提供的一种乳腺癌易感基检测芯片,包括固体支持物及固定在所述固定支持物上的基因检测探针;所述基因检测探针包括24个乳腺癌易感基因的31个SNP位点;24个所述乳腺癌易感基因分别为CHEK2、PALB2、ZNF350、ESR1、C6orf97、USP7、MRPS30、AURKA、ATM、CASC16、TOX3、DNMT1、ZMIZ1、TGFB1、FGFR2、ZNF365、SLC4A7、TNRC9、TNP1、HER2、BRCA2、CCDC170、BRCA1、CYP11A1;
所述CHEK2的SNP位点为rs17879961;
所述PALB2的SNP位点为rs249954、rs120963和rs16940342;
所述ZNF350的SNP位点为rs4986773;
所述ESR1的SNP位点为rs2046210;
所述C6orf97的SNP位点为rs3757318;
所述USP7的SNP位点为rs2304467和rs12924995;
所述MRPS30的SNP位点为rs10941679;
所述AURKA的SNP位点为rs2273535;
所述ATM的SNP位点为rs1003623;
所述CASC16的SNP位点为rs4784227;
所述TOX3的SNP位点为rs8051542;
所述DNMT1的SNP位点为rs16999593;
所述ZMIZ1的SNP位点为rs1250009;
所述TGFB1的SNP位点为rs1982073;
所述FGFR2的SNP位点为rs1219648;
所述ZNF365的SNP位点为rs10822013;
所述SLC4A7的SNP位点为rs4973768;
所述TNRC9的SNP位点为rs3803662;
所述TNP1的SNP位点为rs13387042;
所述HER2的SNP位点为rs1136201;
所述BRCA2的SNP位点为rs206116和rs144848;
所述CCDC170的SNP位点为rs9383935;
所述BRCA1的SNP位点为rs80357887、rs80357272、rs80357546和rs80357086;
所述CYP11A1的SNP位点为rs2279357。
本发明选择检测的遗传标识是SNP,SNP即单核苷酸多态性;是单个核苷酸突变而导致的核酸序列多态性。SNP在人类基因组中的分布相当广泛,大约平均每1000个碱基就有1个SNP,总数达到300万个左右。由于SNP密度很高,数量众多,可进行自动化的大规模检测,所以它是很好的遗传标识。本发明筛选的24个乳腺癌易感基因的31个SNP位点,具有较高的实用价值,可以为乳腺癌的诊断、分型、预后判断提供重要依据,且位点检出成功率高、技术重现性好。
固体支持物经过醛基化修饰,每个基因检测探针在合成时加上氨基化修饰,通过氨基和醛基的结合将基因检测探针固定在固体支持物上;其中固体支持物为载玻片、硅片、膜或高分子材料。
本发明提供了一种乳腺癌易感基检测芯片的制作方法,包括以下步骤:
1)在含有DNA的组织或细胞样本中并加入蛋白酶缓冲液,涡旋、离心,得到含有DNA分子的上层清液;
2)在PCR反应液中加入步骤1)得到含有DNA分子的上层清液,进行扩增,得到扩增产物;
3)将步骤2)得到的扩增产物依次进行碱性磷酸酶处理、单碱基延伸反应,反应结束后进行树脂纯化;
4)将步骤3)得到树脂纯化的延伸产物在固体支持物上进行点样,得到乳腺癌易感基检测芯片。
上述方案制作的乳腺癌易感基检测芯片,储存着24个乳腺癌易感基因的31个SNP位点;24个乳腺癌易感基因分别为CHEK2、PALB2、ZNF350、ESR1、C6orf97、USP7、MRPS30、AURKA、ATM、CASC16、TOX3、DNMT1、ZMIZ1、TGFB1、FGFR2、ZNF365、SLC4A7、TNRC9、TNP1、HER2、BRCA2、CCDC170、BRCA1、CYP11A1;CHEK2的SNP位点为rs17879961;PALB2的SNP位点为rs249954、rs120963和rs16940342;ZNF350的SNP位点为rs4986773;ESR1的SNP位点为rs2046210;C6orf97的SNP位点为rs3757318;USP7的SNP位点为rs2304467和rs12924995;MRPS30的SNP位点为rs10941679;AURKA的SNP位点为rs2273535;ATM的SNP位点为rs1003623;CASC16的SNP位点为rs4784227;TOX3的SNP位点为rs8051542;DNMT1的SNP位点为rs16999593;ZMIZ1的SNP位点为rs1250009;TGFB1的SNP位点为rs1982073;FGFR2的SNP位点为rs1219648;ZNF365的SNP位点为rs10822013;SLC4A7的SNP位点为rs4973768;TNRC9的SNP位点为rs3803662;TNP1的SNP位点为rs13387042;HER2的SNP位点为rs1136201;BRCA2的SNP位点为rs206116和rs144848;CCDC170的SNP位点为rs9383935;BRCA1的SNP位点为rs80357887、rs80357272、rs80357546和rs80357086;CYP11A1的SNP位点为rs2279357。该方法可快速、灵敏地检测乳腺癌易感基因SNP位点信息,检测相关乳腺癌易感基因SNP位点突变情况,分析受试者乳腺癌发生风险,以实现对疾病的早期诊断。
在本发明的实施例中,含有DNA的组织或细胞样本为口腔拭子或全血。
下面结合实施例进一步说明本发明:
1、DNA的提取
1.1 口腔拭子DNA提取
1)将口腔拭子放在2ml离心管中,加入400μl PBS。
2)加入20μl QIAGEN Protease和400μl Buffer AL。立即涡旋15s混匀。为了保证有效的裂解,样品和Buffer AL必须立即并充分混合。
3)56℃孵育10min。短暂离心。
4)加入400μl乙醇(96-100%)到样品中,涡旋混匀。短暂离心以使管盖上无液体。
5)将液体转移至离心柱,8000rpm(6000×g)离心1min。
6)柱子放入新的2mlEP管(试剂盒提供),加500μl Buffer AW1,8000rpm离心1min,弃EP管和废液。
7)柱子放入新的2mlEP管(试剂盒提供),加500μl Buffer AW2,14000rpm(20,000×g)离心3min,丢弃EP管和废液。
8)将柱子放入新的2mlEP管,14000rpm空管离心1min,丢弃EP管。
9)将柱子放入新的1.5mlEP管,加120μl Buffer AE,室温孵育5min,8000rpm离心1min,-20℃保存。
1.2 全血DNA提取
1)向1.5ml EP管中加入20μl QIAGEN Protease。
2)向管中加200μl全血样品。注:先加入酶的目的是保证酶与血液的混匀。
3)加200μl Buffer AL,涡旋混匀15s。
4)56℃孵育10min,短暂离心。注:延长孵育时间不能增加产量或提高质量。
5)加入200μl无水乙醇,涡旋15s后,短暂离心以使管盖上无液体。
6)继续口腔拭子5~10步骤。
2、PCR扩增
2.1 在一个新的1.5mlEP管中配制PCR扩增反应体系
以上试剂混匀后每孔各加2μl。
2.2 每孔依次加入DNA 10ng/ul 1μl,0.25uM Primer Mix 2μl,总体积5μl。
2.3在兼容96孔板的PCR仪上设定PCR反应条件为:94℃4min,94℃20s,56℃30min,72℃1min,45个循环;72℃3min;4℃保持。将96孔PCR反应板放置于PCR仪上,启动PCR反应。
3、PCR产物碱性磷酸酶处理
3.1 在PCR反应结束后,将PCR产物用SAP(shrimp alkaline phosphatase,虾碱性磷酸酶)处理,以去除体系中游离的dNTPs。
3.2 配制碱性磷酸酶处理反应体系
以上试剂混匀后每孔加2μl
3.3 在兼容96孔板的PCR仪上,设定PCR反应条件:37℃40min;85℃5min;4℃保持,启动PCR仪进行碱性磷酸酶处理。
4 单碱基延伸
4.1 在碱性磷酸酶处理结束后,进行单碱基延伸反应。
4.2 配制单碱基延伸反应体系
以上试剂混匀后每孔加1.06μl
4.3 每孔加入iPLEX Extend Primer Mix 0.94μl,总体积9μl。
4.4 在兼容96孔板的PCR仪上,设定PCR反应条件:94℃30s,94℃5s,52℃5s,80℃5s;52℃5s,80℃5s 4个循环;94℃5s,52℃5s,80℃5s 39个循环;72℃3min;4℃维持。启动PCR仪进行单碱基延伸反应。
5、树脂纯化
5.1 将Clean Resin树脂平铺到6mg的树脂板中;
5.2 加16μl水到延伸产物的对应孔内;
5.3 将干燥后的树脂倒入延伸产物板中,封膜,低速垂直旋转15min,使树脂与反应物充分接触;
5.4 3000rpm 5min离心使树脂沉入孔底部。
6、芯片点样
启动MassARRAY Nanodispenser RS1000点样仪,将树脂纯化后的延伸产物移至96孔固体支持物上,制作出芯片。
7、质谱检测
将芯片使用MALDI-TOF(matrix-assisted laser desorption/ionization-time offligh,基质辅助激光解吸附电离飞行时间质谱)分析,检测结果使用TYPER4.0软件(sequenom)分型并输出结果,分析受试者乳腺癌发生风险,以实现对疾病的早期诊断。
以上对本发明提供的一种乳腺癌易感基检测芯片及其制作方法进行了详细的介绍,本文中应用了具体个例对本发明的原理及实施方式进行了阐述,以上实施例的说明只是用于帮助理解本发明的方法及其核心思想,应当指出,对于本技术领域的普通技术人员来说,在不脱离本发明原理的前提下,还可以对本发明进行若干改进和修饰,这些改进和修饰也落入本发明权利要求的保护范围内。
Claims (4)
1.一种乳腺癌易感基检测芯片,其特征在于,包括固体支持物及固定在所述固定支持物上的基因检测探针;所述基因检测探针包括24个乳腺癌易感基因的31个SNP位点;24个所述乳腺癌易感基因分别为CHEK2、PALB2、ZNF350、ESR1、C6orf97、USP7、MRPS30、AURKA、ATM、CASC16、TOX3、DNMT1、ZMIZ1、TGFB1、FGFR2、ZNF365、SLC4A7、TNRC9、TNP1、HER2、BRCA2、CCDC170、BRCA1、CYP11A1;
所述CHEK2的SNP位点为rs17879961;
所述PALB2的SNP位点为rs249954、rs120963和rs16940342;
所述ZNF350的SNP位点为rs4986773;
所述ESR1的SNP位点为rs2046210;
所述C6orf97的SNP位点为rs3757318;
所述USP7的SNP位点为rs2304467和rs12924995;
所述MRPS30的SNP位点为rs10941679;
所述AURKA的SNP位点为rs2273535;
所述ATM的SNP位点为rs1003623;
所述CASC16的SNP位点为rs4784227;
所述TOX3的SNP位点为rs8051542;
所述DNMT1的SNP位点为rs16999593;
所述ZMIZ1的SNP位点为rs1250009;
所述TGFB1的SNP位点为rs1982073;
所述FGFR2的SNP位点为rs1219648;
所述ZNF365的SNP位点为rs10822013;
所述SLC4A7的SNP位点为rs4973768;
所述TNRC9的SNP位点为rs3803662;
所述TNP1的SNP位点为rs13387042;
所述HER2的SNP位点为rs1136201;
所述BRCA2的SNP位点为rs206116和rs144848;
所述CCDC170的SNP位点为rs9383935;
所述BRCA1的SNP位点为rs80357887、rs80357272、rs80357546和rs80357086;
所述CYP11A1的SNP位点为rs2279357。
2.如权利要求1所述的乳腺癌易感基检测芯片,其特征在于,所述固体支持物为载玻片、硅片、膜或高分子材料。
3.一种如权利要求1~2任一项所述的乳腺癌易感基检测芯片的制作方法,其特征在于,包括以下步骤:
1)在含有DNA的组织或细胞样本中并加入蛋白酶盐酸胍,涡旋、离心,得到含有DNA分子的上层清液;
2)在PCR反应液中加入步骤1)得到含有DNA分子的上层清液,进行扩增,得到扩增产物;
3)将步骤2)得到的扩增产物依次进行碱性磷酸酶处理、单碱基延伸反应,反应结束后进行树脂纯化;
4)将步骤3)得到树脂纯化的延伸产物在固体支持物上进行点样,得到乳腺癌易感基检测芯片。
4.如权利要求3所述的制作方法,其特征在于,所述含有DNA的组织或细胞样本为口腔拭子或全血。
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