CN111662981A - 一种基于二代测序探针捕获方法的癌症的基因检测试剂盒 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种基于二代测序探针捕获方法的癌症的基因检测试剂盒，包括质控品、建库试剂、RNA探针；质控品：阴性质控品和阳性质控品；建库试剂：末端修复&加A试剂、加接头试剂、扩增试剂、杂交试剂、捕获试剂、扩增试剂；RNA探针为探针panel；RNA探针的合成类型为RNA单链，长度区间在90‑120 nt，并标记有生物素；本发明针对肺癌、结直肠癌、乳腺癌、卵巢癌的患者，通过进行该18基因panel的检测，从基因层面全方位解读靶向、化疗等药物对患者的受用性，根据个体基因水平上的差异，制定精准的个性化治疗方案、指导免疫用药治疗、预测化疗药物的敏感性和毒副作用以及动态监测用药预后情况等。
Description
技术领域
本发明属于基因检测试剂盒领域，具体为一种基于二代测序探针捕获方法的癌症的基因检测试剂盒。
背景技术
自1977年第一代测序技术（Sanger法）应运而生，测序技术已发展至第四代，但就目前的应用场景以及形势，二代测序技术仍为主流。二代测序技术的核心原理，简而言之就是边合成边测序，通过捕捉新合成末端的标记来确定DNA的序列；具有通量高、读长短、周期快等特点。现在二代测序仪的主要供应商为国外的Illumina和Life Tech，而国内华大智造的测序仪也在逐渐崛起。
二代测序技术的完整过程分为实验端和生信端。实验端的目的在于将gDNA通过一些操作步骤构建成一个可以进行测序的文库，包括建库和上机两部分。简要步骤如下：双链DNA片段化处理；进行末端修复；在3’端加A；连接测序所需的接头；PCR富集产物（或捕获后PCR富集产物）、QC质控合格后即可上机测序；通过高通量的平行PCR（桥式PCR）和平行测序（边合成边测序）反应，结合微流体检测技术，对后期产出的大规模测序数据进行分析。生信端的目的在于将测序下机的数据进行分析处理，得到最终所需的结果。简要步骤如下：原始数据FASTQ文件比对到参考基因组；处理对比后的数据（去除重复、indel重比对、碱基质量校正）；变异识别；变异注释；对变异进行过滤等；查询疾病相关数据库等；复核出报告。
目前，市场上针对肿瘤的产品分化成大致两种类型。一种是泛癌种大panel，检测范围囊括有明确用药解读的、数据库中的及通路中的重要基因，基因数量则动辄几百起步。这种产品的优点是可以满足于肿瘤手术样本的检测需求，且适用癌种不受限；但缺点是无法在液体活检中适用。由于panel自身基因数量众多导致所需数据量过大，因此面对游离DNA样本测序深度需达到10000X时，其所需的数据量也要扩大10倍，导致成本直线上升。例如，组织样本1000×深度，只需测1G；而游离DNA样本达到10000X深度，需测10G数据量。另一种则是针对专一癌种的小panel，检测范围一般是NCCN指南中推荐的基因，用于指导已获批的靶向用药。这种产品的优点是制定精准化个性治疗方案，可用于液体活检，可动态监测用药后结果；缺点是检测基因局限，癌种过于单一。
根据WHO国际疾病分类编码：疾病和有关健康问题的国际统计分类第十版（ICD-10）。目前癌症的编码从C00一直到D48，其中C22肝胆系统癌症下又有C22.0-C22.9。因此，粗略估计不细分亚型的癌症总数也有200以上。但是，只有14种癌症占据了全部癌症的80%左右，分别是：肺癌、胃癌、肝癌、结直肠癌、乳腺癌、前列腺癌、膀胱癌、鼻咽癌、食道癌、子宫癌、卵巢癌、黑色素瘤以及白血病。在我国，最常见的癌是肺癌、结直肠癌、胃癌及肝癌，四种相加一起共占据了全部癌发病率的一半以上，其中又以肺癌的死亡率最高。基于以上中国癌症人群患者数据，参考各相关的NCCN指南、借鉴数据库信息、整合文献报道等，最终确立将以下四种癌症——肺癌/结直肠癌/乳腺癌/卵巢癌的18个相关基因检测并入至一个panel中。
发明内容
本发明的目的就在于为了解决的问题，而提出一种基于二代测序探针捕获方法的癌症的基因检测试剂盒。
本发明的目的可以通过以下技术方案实现：
一种基于二代测序探针捕获方法的癌症的基因检测试剂盒，包括质控品、建库试剂、RNA探针；
质控品：阴性质控品和阳性质控品；建库试剂：末端修复&加A 试剂、加接头试剂、扩增试剂、杂交试剂、捕获试剂、扩增试剂；
RNA探针为探针panel，探针panel根据NCCN指南推荐的检测基因及相关数据库、文献资源，结合肺癌、结直肠癌、乳腺癌、卵巢癌这四大癌种的靶基因，最终并集为18个目的基因panel，根据所筛基因，明确基因的具体变异位置及所测突变类型；
RNA探针的合成类型为RNA单链，长度区间在90-120 nt，并标记有生物素。
优选的，该试剂盒的实验操作流程如下：S1、DNA片段化操作；S2、末端修复&加A尾；S3、加接头；S4、第一步纯化步骤；S5、文库扩增；S6、第二步纯化步骤；S7、杂交反应；S8、捕获反应；S9、PCR富集反应；S10、纯化；S11、质控；S12、上机测序和数据分析。
优选的，DNA片段化操作包括S11、FFPE样本片段化操作；S12、物理打断程序；S13、cfDNA样本片段化操作；
末端修复&加A尾包括S21、末端修复&加A尾反应体系；S22、加A尾反应程序。
优选的，加接头包括S31、加接头反应体系；S32、加接头反应程序；
第一步纯化步骤包括S41、纯化磁珠提前在室温孵育30 min；S42、取80 μL纯化磁珠加入至加接头的溶液中，vortex 30 s，室温孵育10 min；S43、配置新鲜的75%乙醇；S44、孵育后的混合液放置磁力架上，待上清澄清后，弃去；S45、加300 μL 75%乙醇，停留1 min，弃去，重复两次；S46、离心，弃去残液，待磁珠干燥；S47、加水18 μL洗脱磁珠上的DNA，室温孵育5min。放置磁力架上，回收。
优选的，文库扩增包括S51、文库扩增反应体系；S52、文库扩增反应程序；
第二步纯化步骤包括S61、纯化磁珠提前在室温孵育30 min；S62、取50 μL纯化磁珠加入至扩增文库的溶液中，vortex 30 s，室温孵育10 min；S63、配置新鲜的75%乙醇；S64、孵育后的混合液放置磁力架上，待上清澄清后，弃去；S65、加300 μL 75%乙醇，停留1 min，弃去，重复两次；S66、离心，弃去残液，待磁珠干燥；S67、加18 μL水洗脱磁珠上的DNA，室温孵育5 min。放置磁力架上，回收，用于杂交反应。
优选的，杂交反应包括S71、杂交体系配置；S72、杂交反应程序；
捕获反应包括S81、准备链霉亲和素磁珠，提前室温孵育30 min，用前混匀；S82、每个样本用50 μL链霉亲和素磁珠，弃去上清；S83、加入200 μL 结合液至链霉亲和素磁珠，vortex混匀，然后放置磁力架上弃去；重复该步骤三次；S84、加入200 μL 结合液至链霉亲和素磁珠，吹打混匀，重悬链霉亲和素磁珠；S85、将杂交组分A+B的混合液加入至重悬的链霉亲和素磁珠中，室温孵育30 min，磁力架上去上清；S86、加200 μL洗脱液1至8.6中的链霉亲和素磁珠中，室温孵育15 min，磁力架上去上清；S87、加200 μL洗脱液2至8.7中的链霉亲和素磁珠中，65 ℃ 10 min，磁力架上去上清，重复四次；S88、加入20 μL水至8.7中，重悬链霉亲和素磁珠，作为扩增的样品。
优选的，PCR富集反应包括S91、文库扩增反应体系；S92、文库扩增反应程序；
纯化包括S101、纯化磁珠提前在室温孵育30 min；S102、取50 μL纯化磁珠，加入至扩增文库的溶液中，vortex 30 s，室温孵育10 min；S103、配置新鲜的75%乙醇；S104、孵育后的混合液放置磁力架上，待上清澄清后，弃去；S105、加300 μL 75%乙醇，停留1 min，弃去，重复两次；S106、离心，弃去残液，待磁珠干燥；S107、加18 μL水洗脱磁珠上的DNA，室温孵育5min，放置磁力架上，回收，上机。
优选的，质控包括S111、取1 μL文库，采用qubit或者qpcr进行定量；S112、取1 μL文库，采用片段仪器等进行片段评估。
与现有技术相比，本发明的有益效果是：本测试剂盒在MSI的实验方法上选用了NGS技术，其优势在于检测位点多——筛选后覆盖多达40个微卫星位点，对微卫星覆盖区域广泛，RNA探针调整后均一性良好，可对患者有较好的用药指导，适用于多肿瘤如结直肠癌、子宫内膜癌、胃肠道肿瘤等。本专利在MSI的计算方法基于mSINGS进行了优化和改良，制定出了适宜于自己平台的MSI评估准则，如下：MSI得分即不稳定的微卫星位点占比(MSIscore=Unstable loci/Passing loci)， MSI得分越高，微卫星不稳定可能性越大，免疫治疗有效应答的概率越高。若 MSI得分大于 0.3 则判定为高度微卫星不稳定 (MSI-H)，若MSI得分介于0.1至0.3之间则判定为低度微卫星不稳定(MSI-L)，若 MSI得分小于 0.1 则判定为微卫星稳定(MSS)。
附图说明
为了便于本领域技术人员理解，下面结合附图对本发明作进一步的说明。
图1为本发明中建库流程图。
图2为本发明中物理打断程序的参数图表。
图3为本发明中加接头反应体系的图表。
图4为本发明中文库扩增反应体系的图表。
图5为本发明中杂交体系配置的图表。
图6为本发明中文库扩增反应体系的图表。
具体实施方式
下面将结合实施例对本发明的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其它实施例，都属于本发明保护的范围。
请参阅图1-6所示，一种基于二代测序探针捕获方法的癌症的基因检测试剂盒，包括质控品、建库试剂、RNA探针；
质控品：阴性质控品和阳性质控品；建库试剂：末端修复&加A 试剂、加接头试剂、扩增试剂、杂交试剂、捕获试剂、扩增试剂；
RNA探针为探针panel，探针panel根据NCCN指南推荐的检测基因及相关数据库、文献资源，结合肺癌、结直肠癌、乳腺癌、卵巢癌这四大癌种的靶基因，最终并集为18个目的基因panel，根据所筛基因，明确基因的具体变异位置及所测突变类型；
RNA探针的合成类型为RNA单链，长度区间在90-120 nt，并标记有生物素。
本试剂盒实验操作流程：
S1、DNA片段化操作
FFPE样本片段化操作
1.1.1 FFPE物理打断前准备
仪器：Covaris M220
耗材：microTUBE类型（50 μL 和130 μL）
片段要求：200~300 bp；
1.1.2物理打断程序
cfDNA样本片段化操作
由于cfDNA已经是小片段，所以无需打断操作，直接从步骤2末端修复&加A尾开始；
S2、末端修复&加A尾
2.1末端修复&加A尾反应体系
2.2加A尾反应程序（PCR热盖85℃）
20 ℃ 30 min；65 ℃ 30 min；10 ℃ 加热；
S3、加接头
3.1 加接头反应体系；
3.2 加接头反应程序；
20 ℃ 15 min；70 ℃ 10 min ；10 ℃加热。
S4、第一纯化步骤
纯化磁珠提前在室温孵育30 min，使用之前vortex混匀；
取80 μL纯化磁珠（样本：磁珠=1:0.8）加入至加接头的溶液中，vortex 30 s，室温孵育10 min；
配置新鲜的75%乙醇；
孵育后的混合液放置磁力架上，待上清澄清后，弃去；
加300 μL 75%乙醇，停留1 min，弃去，重复两次；
离心，弃去残液，待磁珠干燥；
加水18 μL洗脱磁珠上的DNA，室温孵育5 min。放置磁力架上，回收，继续下步操作。
S5、文库扩增
5.1文库扩增反应体系；
5.2文库扩增反应程序（PCR热盖105℃）
95 ℃ 5 min；
(98 ℃ 20 s，60 ℃ 15 s，72 ℃ 30 s) 10 循环 ；
10 ℃加热。
S6、第二纯化步骤
纯化磁珠提前在室温孵育30 min，使用之前vortex混匀；
取50 μL纯化磁珠（样本：磁珠=1:1）加入至扩增文库的溶液中，vortex 30 s，室温孵育10 min；
配置新鲜的75%乙醇；
孵育后的混合液放置磁力架上，待上清澄清后，弃去；
加300 μL 75%乙醇，停留1 min，弃去，重复两次；
离心，弃去残液，待磁珠干燥；
加18 μL水洗脱磁珠上的DNA，室温孵育5 min。放置磁力架上，回收，用于杂交反应。
S7、杂交反应
杂交体系配置：
杂交反应程序：
组分A， 先行95 ℃ 5 min；65 ℃ hold；
组分B ，预热65 ℃ 5 min；加入至组分A中，65 ℃ 16 - 24 h；
S8、捕获反应
准备链霉亲和素磁珠，提前室温孵育30 min，用前混匀；
每个样本用50 μL链霉亲和素磁珠，弃去上清。
加入200 μL 结合液至链霉亲和素磁珠，vortex混匀，然后放置磁力架上弃去；重复该步骤三次；
加入200 μL 结合液至链霉亲和素磁珠，吹打混匀，重悬链霉亲和素磁珠；
将杂交组分A+B的混合液加入至重悬的链霉亲和素磁珠中，室温孵育30 min，磁力架上去上清；
加200 μL洗脱液1至8.6中的链霉亲和素磁珠中，室温孵育15 min，磁力架上去上清；
加200 μL洗脱液2至8.7中的链霉亲和素磁珠中，65 ℃ 10 min，磁力架上去上清，重复四次；
加入20 μL水至8.7中，重悬链霉亲和素磁珠，作为扩增的样品。
S9、PCR富集反应
9.1文库扩增反应体系；
9.2文库扩增反应程序（PCR热盖105℃）
95 ℃ 45 s；
(98 ℃ 15 s，60 ℃ 15 s，72 ℃ 30 s) 10 循环 ；
10 ℃ 加热。
S10、纯化
纯化磁珠提前在室温孵育30 min，使用之前vortex混匀；
取50 μL纯化磁珠（样本：磁珠=1:1）加入至扩增文库的溶液中，vortex 30 s，室温孵育10 min；
配置新鲜的75%乙醇；
孵育后的混合液放置磁力架上，待上清澄清后，弃去；
加300 μL 75%乙醇，停留1 min，弃去，重复两次。
离心，弃去残液，待磁珠干燥；
加18 μL水洗脱磁珠上的DNA，室温孵育5 min。放置磁力架上，回收，上机。
S11、质控
取1 μL文库，采用qubit或者qpcr进行定量；
取1 μL文库，采用片段仪器等进行片段评估。
S12、上机测序和数据分析
本试剂盒的检测样本有标准品（采购）、临床阳性样本和临床阴性样本。经过建库、测序、数据分析：
其捕获效率在55-75%，1000×测序深度下灵敏度DNA可达1%，10000×测序深度下灵敏度cfDNA可达0.1%。
该探针在各大测序平台上的测序结果均稳定，适用于多个测序平台。
本发明的工作原理：本测试剂盒在MSI的实验方法上选用了NGS技术，其优势在于检测位点多——筛选后覆盖多达40个微卫星位点，对微卫星覆盖区域广泛，RNA探针调整后均一性良好，可对患者有较好的用药指导，适用于多肿瘤如结直肠癌、子宫内膜癌、胃肠道肿瘤等。本专利在MSI的计算方法基于mSINGS进行了优化和改良，制定出了适宜于自己平台的MSI评估准则，如下：MSI得分即不稳定的微卫星位点占比(MSI score=Unstable loci/Passing loci)， MSI得分越高，微卫星不稳定可能性越大，免疫治疗有效应答的概率越高。若 MSI得分大于 0.3 则判定为高度微卫星不稳定 (MSI-H)，若MSI得分介于0.1至0.3之间则判定为低度微卫星不稳定(MSI-L)，若 MSI得分小于 0.1 则判定为微卫星稳定(MSS)。
以上公开的本发明优选实施例只是用于帮助阐述本发明。优选实施例并没有详尽叙述所有的细节，也不限制该发明仅为的具体实施方式。显然，根据本说明书的内容，可作很多的修改和变化。本说明书选取并具体描述这些实施例，是为了更好地解释本发明的原理和实际应用，从而使所属技术领域技术人员能很好地理解和利用本发明。本发明仅受权利要求书及其全部范围和等效物的限制。
Claims (8)
1.一种基于二代测序探针捕获方法的癌症的基因检测试剂盒，其特征在于：包括质控品、建库试剂、RNA探针；
质控品：阴性质控品和阳性质控品；建库试剂：末端修复&加A 试剂、加接头试剂、扩增试剂、杂交试剂、捕获试剂、扩增试剂；
RNA探针为探针panel，探针panel根据NCCN指南推荐的检测基因及相关数据库、文献资源，结合肺癌、结直肠癌、乳腺癌、卵巢癌这四大癌种的靶基因，最终并集为18个目的基因panel，根据所筛基因，明确基因的具体变异位置及所测突变类型；
RNA探针的合成类型为RNA单链，长度区间在90-120 nt，并标记有生物素。
2.根据权利要求1所述的一种基于二代测序探针捕获方法的癌症的基因检测试剂盒，其特征在于，该试剂盒的实验操作流程如下：S1、DNA片段化操作；S2、末端修复&加A尾；S3、加接头；S4、第一步纯化步骤；S5、文库扩增；S6、第二步纯化步骤；S7、杂交反应；S8、捕获反应；S9、PCR富集反应；S10、纯化；S11、质控；S12、上机测序和数据分析。
3.根据权利要求1所述的一种基于直扩型的人MTHFR基因多态性检测试剂盒，其特征在于，DNA片段化操作包括S11、FFPE样本片段化操作；S12、物理打断程序；S13、cfDNA样本片段化操作；
末端修复&加A尾包括S21、末端修复&加A尾反应体系；S22、加A尾反应程序。
4.根据权利要求2所述的一种基于直扩型的人MTHFR基因多态性检测试剂盒，其特征在于，加接头包括S31、加接头反应体系；S32、加接头反应程序；
第一步纯化步骤包括S41、纯化磁珠提前在室温孵育30 min；S42、取80 μL纯化磁珠加入至加接头的溶液中，vortex 30 s，室温孵育10 min；S43、配置新鲜的75%乙醇；S44、孵育后的混合液放置磁力架上，待上清澄清后，弃去；S45、加300 μL 75%乙醇，停留1 min，弃去，重复两次；S46、离心，弃去残液，待磁珠干燥；S47、加水18 μL洗脱磁珠上的DNA，室温孵育5min;放置磁力架上，回收。
5.根据权利要求2所述的一种基于直扩型的人MTHFR基因多态性检测试剂盒，其特征在于，文库扩增包括S51、文库扩增反应体系；S52、文库扩增反应程序；
第二步纯化步骤包括S61、纯化磁珠提前在室温孵育30 min；S62、取50 μL纯化磁珠加入至扩增文库的溶液中，vortex 30 s，室温孵育10 min；S63、配置新鲜的75%乙醇；S64、孵育后的混合液放置磁力架上，待上清澄清后，弃去；S65、加300 μL 75%乙醇，停留1 min，弃去，重复两次；S66、离心，弃去残液，待磁珠干燥；S67、加18 μL水洗脱磁珠上的DNA，室温孵育5 min;放置磁力架上，回收，用于杂交反应。
6.根据权利要求2所述的一种基于直扩型的人MTHFR基因多态性检测试剂盒，其特征在于，杂交反应包括S71、杂交体系配置；S72、杂交反应程序；
捕获反应包括S81、准备链霉亲和素磁珠，提前室温孵育30 min，用前混匀；S82、每个样本用50 μL链霉亲和素磁珠，弃去上清；S83、加入200 μL 结合液至链霉亲和素磁珠，vortex混匀，然后放置磁力架上弃去；重复该步骤三次；S84、加入200 μL 结合液至链霉亲和素磁珠，吹打混匀，重悬链霉亲和素磁珠；S85、将杂交组分A+B的混合液加入至重悬的链霉亲和素磁珠中，室温孵育30 min，磁力架上去上清；S86、加200 μL洗脱液1至8.6中的链霉亲和素磁珠中，室温孵育15 min，磁力架上去上清；S87、加200 μL洗脱液2至8.7中的链霉亲和素磁珠中，65 ℃ 10 min，磁力架上去上清，重复四次；S88、加入20 μL水至8.7中，重悬链霉亲和素磁珠，作为扩增的样品。
7.根据权利要求2所述的一种基于直扩型的人MTHFR基因多态性检测试剂盒，其特征在于，PCR富集反应包括S91、文库扩增反应体系；S92、文库扩增反应程序；
纯化包括S101、纯化磁珠提前在室温孵育30 min；S102、取50 μL纯化磁珠，加入至扩增文库的溶液中，vortex 30 s，室温孵育10 min；S103、配置新鲜的75%乙醇；S104、孵育后的混合液放置磁力架上，待上清澄清后，弃去；S105、加300 μL 75%乙醇，停留1 min，弃去，重复两次；S106、离心，弃去残液，待磁珠干燥；S107、加18 μL水洗脱磁珠上的DNA，室温孵育5min，放置磁力架上，回收，上机。
8.根据权利要求2述的一种基于直扩型的人MTHFR基因多态性检测试剂盒，其特征在于，质控包括S111、取1 μL文库，采用qubit或者qpcr进行定量；S112、取1 μL文库，采用片段仪器等进行片段评估。
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