CN117327789A - 一种淋系血液肿瘤检测基因panel的捕获探针及其设计方法、检测方法 - Google Patents

一种淋系血液肿瘤检测基因panel的捕获探针及其设计方法、检测方法 Download PDF

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Abstract

本发明提供了一种淋系血液肿瘤检测基因panel的捕获探针及其设计方法、检测方法，属于基因检测技术领域。本发明的探针包括panelADNA捕获探针和panel B cDNA捕获探针；所述panelADNA捕获探针包括如SEQ ID NO.1～2706所示的核苷酸序列，所述panel B cDNA捕获探针包括如SEQ ID NO.2707～9668所示的核苷酸序列。本发明的panel中包含了用于检测淋系血液肿瘤检测的全部类型基因，能够实现淋系血液肿瘤基因突变、拷贝数变异、融合基因、基因表达的检测，检测内容覆盖度广，可移植性强，适用于市场上的大部分测序仪器或新开发的检测平台。

Description

一种淋系血液肿瘤检测基因panel的捕获探针及其设计方法、 检测方法
技术领域
本发明涉及基因检测技术领域，尤其涉及一种淋系血液肿瘤检测基因panel的捕获探针及其设计方法、检测方法。
背景技术
淋系血液肿瘤是一类起源于B淋巴细胞和T淋巴细胞的恶性肿瘤，主要包括急性淋巴细胞白血病(ALL)和慢性淋巴细胞白血病(CLL)。根据国际癌症研究机构(IARC)的数据，2018年全球约有12.2万人患有淋系血液肿瘤，其中ALL占69％，CLL占31％。淋系血液肿瘤好发于儿童和老年人。儿童ALL的五年生存率可达90％以上，而老年CLL患者的中位生存期仅为3～5年。
淋系血液肿瘤的诊断需要进行骨髓细胞形态学、流式细胞术免疫分型、细胞遗传学等检测，以明确肿瘤细胞的免疫表型和遗传学异常。常见的遗传学异常包括超二倍体、复杂核型等。还需要进行基因检测，发现特异的分子标志物，如BCR-ABL融合基因、NOTCH1突变等。这些标志物与预后和治疗反应相关。
淋系血液肿瘤的发生发展与淋巴细胞中的多种基因异常有关，主要包括基因重排、点突变和拷贝数变异。靶向捕获测序技术可以同时检测多个淋系血液肿瘤相关的基因突变和重排，提供更全面和精确的分子信息，有助于淋系血液肿瘤的诊断分型和预后判断。儿童ALL中常见的融合基因有ETV6-RUNX1、BCR-ABL、KMT2A重排等。成人ALL和CLL常见的突变基因有NOTCH1、SF3B1、TP53等。这些基因异常可引起信号通路失调，导致淋巴细胞的恶性克隆增殖。淋系血液肿瘤患者的基因检测可以帮助明确诊断、判断预后、选择治疗方案。如Ph+ALL需联合酪氨酸激酶抑制剂治疗，NOTCH1突变预示针对CD20的治疗反应良好。监测残留病和评估治疗反应也需要采用敏感特异的分子标志物。因此，对淋系血液肿瘤患者进行基因组检测具有重要的临床意义。
靶向捕获测序技术是一种利用特定的探针捕获目标基因区域，然后进行高通量测序的方法。它可以提高测序的效率和灵敏度，降低测序的成本和时间。在淋系血液肿瘤诊断中，靶向捕获测序技术有以下必要性和优势：淋系血液肿瘤是一类异质性高的疾病，其发病机制与多种基因突变有关。靶向捕获测序技术可以同时检测多个相关基因的突变情况，提供更全面的分子信息，有助于诊断分型、预后判断和指导治疗。淋系血液肿瘤的基因突变往往是体细胞突变，其突变频率和水平在不同患者和不同病程中有差异。靶向捕获测序技术可以提高检测的灵敏度和准确度，发现低频或亚克隆的突变，反映肿瘤的克隆演化和异质性。淋系血液肿瘤的治疗效果与微小残留病(MRD)的水平密切相关。靶向捕获测序技术可以作为MRD的分子标志物之一，监测治疗后肿瘤细胞的消除情况，评估复发风险和预后。
目前淋系血液肿瘤的检测存在一些局限:1.检测内容单一，目前的测序检测技术多数只针对基因突变或融合基因的其中一种。2.无法进行胚系突变的验证及分析，胚系突变可能与遗传性血液肿瘤或家族性血液肿瘤有关，对于患者的遗传咨询和家庭筛查具有重要意义。3.融合基因检测多针对已知融合形式，无法预测未知融合基因。大部分融合基因的检测方法只能检测特定的融合基因或融合伴侣，无法发现新的或罕见的融合基因，从而可能忽略一些具有诊断、预后或治疗意义的融合基因。4.无法进行基因表达的检测及分析，RNA靶向测序技术中通常无法进行基因表达的分析。
发明内容
本发明的目的在于提供一种淋系血液肿瘤检测基因panel的捕获探针及其设计方法、检测方法。本发明的panel中包含了用于检测淋系血液肿瘤检测的全部类型基因，能够实现淋系血液肿瘤基因突变、拷贝数变异、融合基因、基因表达的检测，检测内容覆盖度广，可移植性强，适用于市场上的大部分测序仪器或新开发的检测平台。
为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：
本发明提供了一种淋系血液肿瘤检测基因panel的捕获探针，所述捕获探针包括panel A DNA捕获探针和panel B cDNA捕获探针；所述panel A DNA捕获探针包括如SEQ IDNO.1～2706所示的核苷酸序列，所述panel B cDNA捕获探针包括如SEQ ID NO.2707～9668所示的核苷酸序列。
本发明还提供了一种上述捕获探针在制备淋系血液肿瘤基因的检测试剂或试剂盒中的应用。
本发明还提供了一种上述淋系血液肿瘤检测基因panel的捕获探针的设计方法，包括如下步骤：
(1)筛选淋系血液肿瘤相关基因，并分为panel A和panel B；
(2)根据所述panel A和panel B中基因的标准基因名、基因转录本号及相关基因的外显子所在染色体位置，设计并合成探针；
(3)对所述探针进行性能验证。
优选的，所述panel A为淋系血液肿瘤相关突变基因；所述panel B为淋系血液肿瘤相关融合基因、基因表达。
优选的，所述panel A中的基因包括ABCB1、BRCA2、CYP2C19、EZH2、IL7R、MTHFR、PPM1D、SP140、ABL1、BTK、CYP3A5、FAM46C、JAK1、MYD88、PRDM1、SRSF2、APC、CARD11、DIS3、FAT1、JAK2、NFKB1、PRKD2、STAT3、ARID1A、CCND1、DNM2、FBXW7、JAK3、NFKBIE、PSMB5、SUZ12、ASXL1、CDKN2A、DNMT3A、FGFR3、KDM6A、NOTCH1、PTEN、TET2、ATM、CDKN2B、EBF1、FLT3、KIT、NOTCH2、PTPN11、TP53、ATR、CEBPA、EGFR、GATA2、KLHL6、NRAS、RB1、TPMT、ATRX、CREBBP、EGR2、GSTP1、KMT2D、NT5C2、RELN、WHSC1、BCL2、CRLF2、EP300、IDH1、KRAS、PAX5、RUNX1、WT1、BCL7A、CSF1R、EPOR、IDH2、LRP1B、PDGFRA、SETD2、XBP1、BCOR、CSF3R、ERBB3、IKZF1、LTB、PDGFRB、SF3B1、ZRSR2、BIRC3、CXCR4、ERG、IKZF2、MAX、PHF6、SH2B3、NQO1、BRAF、CYLD、ETV6、IKZF3、MPL、PLCG2、SLC52A2；
所述panel B中的基因包括ABL1、AFDN、AFF1、ALK、BCL11B、BCL3、BCL6、BCL9、BCR、BMP2K、C17orf50、CBFA2T3、CBFB、CDK1、CEBPA、CEBPE、CREBBP、CRLF2、DAZAP1、DUX4、ELL、EP300、ETV6、FGFR1、FIP1L1、FUS、HOXA10、HOXA9、IKZF1、JAK2、KAT6A、KMT2A、LMO1、LMO2、LYL1、MALT1、MEF2C、MEF2D、MLLT1、MLLT10、MLLT3、MYB、MYC、NFKB2、NKX2-1、NKX2-2、NUP214、PAX5、PBX1、PIM3、TAL1、TCF3、TFE3、TLX1、TLX3、ZNF362、ZNF384。
优选的，所述探针的设计方法为采用遍历法，基于机器学习算法，通过序列相似性比对排除相似性高于50％的探针序列；所述探针特异的与目标核酸区域结合，单碱基偶联效率为99.4％～99.6％，合成的探针通过电喷雾质谱法进行质量控制。
优选的，所述性能验证包括捕获效率验证、精密度验证、准确度验证、分析灵敏度验证。
本发明还提供了一种非疾病诊断目的或治疗目的的淋系血液肿瘤相关基因的检测方法，包括如下步骤：
(1)提取样本核酸；
(2)将所述核酸中的DNA打断，经接头连接、PCR扩增、纯化，得到panel A文库；
(3)将所述核酸中的RNA打断，经反转录、接头连接、PCR扩增、纯化，得到panel B文库；
(4)用上述的panel A DNA捕获探针对panel A文库进行杂交捕获；用上述的panelB cDNA捕获探针对panel B文库进行杂交捕获；
(5)将所述杂交捕获后的panel A文库和panel B文库分别进行二代测序，对测序结果进行数据分析。
优选的，所述panel A文库的数据分析包括数据过滤、质量控制、比对、突变检测、拷贝数分析、结果注释；所述panel B文库的数据分析包括数据过滤、质量控制、比对、融合检测、表达分析、结果注释。
优选的，对所述杂交捕获后的panel A文库的测序结果进行数据分析时，还包括进行胚系突变验证，所述胚系突变验证的方法为将口腔黏膜样本和骨髓样本经数据分析后的低深度测序结果进行对比分析。
本发明提供了一种淋系血液肿瘤检测基因panel的捕获探针及其设计方法、检测方法。本发明的基因panel包含了用于淋系血液肿瘤检测的全部类型基因，针对这些基因设计捕获探针，能够一站式解决淋系血液肿瘤基因突变、拷贝数变异、融合基因、基因表达的检测，检测内容覆盖度广，可以用于从风险评估到诊断、治疗、预后等各个阶段的检测，可移植性强，适用于目前国内市场的测序仪器或新开发的检测平台。并且，本发明的检测方法中包括口腔黏膜样本与骨髓样本的对比分析，通过低深度口腔黏膜样本测序与高通量骨髓样本测序，在不增加测序成本的前提下，能够实现胚系突变和体细胞突变的注释，解决了血液肿瘤基因突变检测中胚系突变验证这一难题。
附图说明
图1为本发明实施例2中基于42例患者的胚系突变验证结果图。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明提供的技术方案进行详细的说明，但是不能把它们理解为对本发明保护范围的限定。
实施例1
本实施例提供了一种淋系血液肿瘤基因panel的捕获探针，具体设计过程如下：
1.Panel设计：从已公开的文献资料中选择淋系血液肿瘤相关基因，包括：公共数据库中的高频突变基因、高频融合基因、高频表达相关基因，应用标准、治疗指南、药物标签及通用数据库中的淋系血液肿瘤治疗相关基因，已公开文献中报道的与淋系血液肿瘤分子分型、治疗、预后、诱发相关的基因。根据检测方法的不同分为Panel A：淋系血液肿瘤相关突变基因(基因种类如表1所示)，Panel B：淋系血液肿瘤相关融合、表达基因(基因种类如表2所示)。
表1 Panel A：淋系血液肿瘤相关突变基因
ABCB1 BRCA2 CYP2C19 EZH2 IL7R MTHFR PPM1D
SP140 ABL1 BTK CYP3A5 FAM46C JAK1 MYD88
PRDM1 SRSF2 APC CARD11 DIS3 FAT1 JAK2
NFKB1 PRKD2 STAT3 ARID1A CCND1 DNM2 FBXW7
JAK3 NFKBIE PSMB5 SUZ12 ASXL1 CDKN2A DNMT3A
FGFR3 KDM6A NOTCH1 PTEN TET2 ATM CDKN2B
EBF1 FLT3 KIT NOTCH2 PTPN11 TP53 ATR
CEBPA EGFR GATA2 KLHL6 NRAS RB1 TPMT
ATRX CREBBP EGR2 GSTP1 KMT2D NT5C2 RELN
WHSC1 BCL2 CRLF2 EP300 IDH1 KRAS PAX5
RUNX1 WT1 BCL7A CSF1R EPOR IDH2 LRP1B
PDGFRA SETD2 XBP1 BCOR CSF3R ERBB3 IKZF1
LTB PDGFRB SF3B1 ZRSR2 BIRC3 CXCR4 ERG
IKZF2 MAX PHF6 SH2B3 NQO1 BRAF CYLD
ETV6 IKZF3 MPL PLCG2 SLC52A2 / /
表2 Panel B：淋系血液肿瘤相关融合基因、基因表达
将上述淋系血液肿瘤相关基因合并，去冗余，通过HGNC数据库(HUGO GeneNomenclature Committee)确定标准基因名、基因转录本号及相关基因的外显子所在染色体位置，以用于探针设计合成。
2.探针设计和合成：根据提取的相关基因全部转录本的外显子所在染色体位置，采用遍历法设计探针，基于机器学习算法，通过序列相似性比对排除相似性高于50％的探针序列，确保探针覆盖99％以上的目标区域。探针能够特异性的与目标核酸区域结合，探针合成要求单独合成，单碱基偶联效率在99.4％和99.6％之间，合成的探针通过电喷雾质谱法进行质量控制，以保证合成的准确性。最终合成的Panel A DNA捕获探针包括2706条探针，覆盖目标区域99.98％，探针序列如SEQ ID NO.1～2706所示；Panel B cDNA捕获探针包括6962条探针，覆盖目标区域99.99％，探针序列如SEQ ID NO.2707～9668所示。
3.性能验证：对合成的探针分别进行捕获效率验证、精密度验证、准确度验证、分析灵敏度验证。
3.1样本准备：
a)阳性样本：前期采用数字PCR技术检测，将包含有表1/表2中一种或几种的突变基因/融合基因的临床样本为阳性原始样本，抽提核酸，并检测所得核酸浓度与纯度，符合质控要求后，按核酸浓度进行等比例混合，使用经确认为阴性的核酸对混合阳性标本进行稀释，以得到阳性样本。
b)细胞系样本：为已知某种突变类型的细胞系培养样本，根据相关要求提取核酸，并进行梯度稀释保存。
c)阴性样本：采用数字PCR技术检测证实为阴性的标本(低于检测下限或零浓度)。
3.2精密度验证
3.2.1样本准备
Panel A：按精密度检测要求，分别在高突变率组和临界突变率组下进行精密度检测，其中高突变率组选取突变频率为50％的SNP位点(包含CYP2C19和ABCB1两个基因)，低突变率组选取突变频率为1％的混合细胞(为CYP2C19阳性细胞和无此突变的细胞混合得到)。
Panel B：按精密度检测要求，分别在高融合基因频率组和低融合基因频率组下进行精密度检测，其中，高融合基因频率组和低融合基因频率组分别由K562细胞(NUP214-XKR3阳性)和正常人外周血细胞按比例混合得到。K562细胞在高融合基因频率组中的占比为30％，在低融合基因频率组中的占比为5％。
3.2.2测序检测
Panel A检测：高突变率组选取CYP2C19和ABCB1两个基因的100个突变位点，分5批次，每批次20个进行检测，分别计算高突变率组的批内、批间SD值和变异系数(CV)值；低突变率组选取ABCB1混合后突变频率为1％的50个突变位点，分5批次，每批次10个进行检测，分别计算低突变率组的批内和批间SD值和变异系数(CV)值。
Panel B检测：高融合基因频率组共50个，分5批次，每批次10个进行检测，分别计算高融合基因频率组的批内、批间SD值和变异系数(CV)值；低融合基因频率组共50个，分5批次，每批次10个进行检测，分别计算低融合基因频率组的批内和批间SD值和变异系数(CV)值。
3.2.3测序结果
Panel A：高突变率组，批内平均值为47.04％，批内变异系数为6.12％，批间平均值为46.95％，批间变异系数为7.37％；低突变率组，批内平均值为1.36％，批内变异系数为9.48％，批间平均值为1.65％，批间变异系数为22.19％。
Panel B：高融合基因频率组，批内平均值为8.4％，批内变异系数为24.99％，批间平均值为5.3％，批间变异系数为12.62％；低融合基因频率组，批内平均值为1.33％，批内变异系数为20.46％，批间平均值为1.95％，批间变异系数为43.6％。
3.3准确度验证
3.3.1定性测定的准确性评价方法：数字PCR和荧光定量PCR是目前单位点检测最为灵敏的方法之一，选择这两种方法与本方法进行准确度验证。
3.3.2参比方法
Panel A DNA捕获探针检测参比方法：数字PCR
Panel B cDNA捕获探针检测参比方法：荧光定量PCR
3.3.3样本准备：(1)50例基因突变(MYD88 c.794T>C或JAK2 c.1849G>T突变)阳性样本和50例基因突变阴性样本；(2)50例融合基因阳性样本和50例融合基因阴性样本。
3.3.4检测方法：所选样本同时采用两种方法进行检测：Panel A采用二代测序(NGS)法和数字PCR法分别进行检测，Panel B采用二代测序(NGS)和荧光定量PCR法进行检测，分5批次，每批次10个样本。
3.3.5结果分析与判断
检测结果如表3所示。
表3准确度检测结果
从表3可以看出，与数字PCR和荧光定量PCR结果比对后，二代测序(NGS)的基因突变检测敏感性为100％，特异性为100％；融合基因检测，敏感性为100％，特异性为100％。
3.4分析灵敏度验证
分析灵敏度通常通过一系列稀释含有已知突变的样本来验证，即在同一个实验条件下采用同一个批号的试剂，重复测定高稀释度的样本，结果采用统计学分析。
3.4.1检测流程
Panel A：采用已知阴性的标本稀释已知的阳性样本(MYD88 c.794T>C或JAK2c.1849G>T突变)标本，稀释至突变频率为0.5％、1％、5％，稀释后各浓度样本按常规样本的检测程序每个浓度进行10次重复检测，并按照标准分析步骤进行分析。
Panel B：将K562细胞(NUP214-XKR3阳性)和正常人外周血细胞按比例混合，K562细胞所占比例分别为1％、5％、50％，对不同稀释浓度样本按照常规样本检测程序每个浓度进行10次重复检测，并按照标准分析步骤进行分析。
3.4.2检测结果
Panel A检测灵敏度(最低检测下限)为1％，Panel B检测灵敏度(最低检测下限)为5％。
3.5探针捕获效率质控
探针捕获能力验证主要包括捕获效率和比对率。捕获效率：对于目标区域捕获项目，能够比对到目标区域的reads占所有reads的比例。经检测，Panel A、B探针的捕获效率均≥70％。比对率：可以比对到目标区域reads的比例。经检测，Panel A探针的比对率≥99％，Panel B探针的比对率≥90％。
实施例2
本实施例提供了一种利用实施例1中捕获探针检测淋系血液肿瘤相关基因的方法，具体过程如下：
本实施例中所使用的仪器包括：Lad-Aid 824s核酸自动提取仪，厦门致善生物科技有限公司；ABI-Veriti核酸扩增仪，美国Thermo Fisher公司；ABI-Mini-AMP核酸扩增仪，美国Thermo Fisher公司；ABI-Qubit 4.0核酸定量仪，美国Thermo Fisher公司；Illumina-Nextseq-500高通量测序仪，美国Illumina公司。
在本发明中，其它厂家相同功能的仪器如核酸提取仪、扩增仪、高通量测序仪均可进行替换。
本实施例中所使用的试剂包括：文库构建试剂xGenTMDNA Library Prep EZ Kit、xGenTMRNA Library Prep Kit，购自上海埃德特生物科技有限公司；杂交捕获试剂xGenHybridization and Wash Kit，购自上海埃德特生物科技有限公司；测序上机试剂NextSeq500/550High Output Kit 2.5，购自美国Illumina公司。
在本发明中，其它厂家相同功能的试剂如文库构建试剂、杂交捕获试剂、测序上机试剂均可进行替换。
1.提取样本
从100例确诊淋系血液疾病患者(在2021～2023年间，来自河南省肿瘤医院血液科就诊的患者)中采集骨髓样本，使用Lab-Aid 824s/808核酸提取仪提取样本中的DNA和RNA。
2.文库构建
2.1 Panel A文库构建
2.1.1 DNA打断
将上一步提取的样本DNA加入0.2mL PCR管中，DNA投入量为300ng，补水至18.5μL，并加入EDTA溶液，使总体积为19.5μL。配制如表4所示的反应液，试剂在冰上融化，向每个PCR管中加入配置好的反应液，使总体积为30μL。然后将PCR管按照表5所示的反应程序进行DNA打断处理。
表4反应液体系
试剂 体积(μL)
Buffer K1 3
Reagent K2 1.5
Enzyme K3 6
总体积 10.5
表5 DNA打断反应程序
注：若是口腔黏膜样本的DNA，投入量调整为25ng，打断时间为16min。
2.1.2连接接头
按照表6所示配制反应液，试剂在冰上融化。配制完成后，将反应液加入完成DNA打断后的PCR管中，使总体积为60μL。
表6反应液
试剂 体积(μL)
Buffer W1 12
Enzyme W3 4
Raegent W5 5
Low EDTA TE 9
总体积 30
注：若是口腔黏膜样本DNA，Raegent W5的添加量需按表7所示进行稀释。
表7口腔黏膜样本DNA的投入量与Raegent W5稀释倍数的关系
将混匀后的PCR管按照表8所示的反应程序进行接头连接处理。
表8接头连接反应程序
温度(℃) 时间
20 20min
4 +∞
2.1.3纯化
向完成接头连接的PCR管中加入48μL磁珠，震荡混匀，室温放置5min，瞬离，磁力架放置2min至液体澄清，弃上清。用180μL 80％乙醇洗两遍(PCR管需来回移动，使磁珠前后壁移动几次)，瞬离，用10μL排枪吸取剩余残余乙醇，晾干。加入22μL Low EDTA TE(0.1mMEDTA)，震荡混匀，室温放置5min，瞬离，磁力架放置2min至液体澄清。转移20μL上清至新PCR管中。
2.1.4 PCR扩增
向2.1.3的新PCR管中加入5μL的indexing primers，再加25μL的PCR Master Mix，震荡混匀，按照表9所示的反应程序进行PCR扩增。
表9 PCR扩增反应程序
注：若是口腔黏膜样本，按8个cycle进行PCR扩增。
2.1.5二次纯化
向PCR扩增后的PCR管中加入90μL磁珠，震荡混匀，室温孵育5min，瞬离，放磁力架2min，至溶液澄清，弃上清。用180μL 80％乙醇洗两遍(PCR管需来回移动，使磁珠前后壁移动几次)，瞬离，用10μL排枪吸取剩余残余乙醇，晾干。加入22μL水，震荡混匀，室温放置5min，瞬离，放磁力架2min，至溶液澄清，转移20μL上清至新的八连管中。
2.1.6使用Qubit对文库浓度进行定量。
2.2 Panel B文库构建
Panel B文库的建库标本为RNA，所有建库操作均在冰上进行。
2.2.1 RNA打断
检测待测样本RNA的RIN值。RNA投入量为500ng，将RNA加入0.2mL PCR管中，补水至5μL。按照表10所示配制反应液，将反应液加入PCR管中，使总体积为14μL。并按照表11所示的反应程序进行RNA打断处理。
表10反应液
试剂 体积(μL)
Reagent F1 1
Reagent F2 2
Reagent F3 4
Reagent F4 2
总体积 9
表11 RNA打断反应程序
RIN值 片段长度(bp) 温度(℃) 时间(min)
≥7 200-250 94 15
2-7 200-250 94 10
程序结束后，立即将PCR管放置冰上2min，随后立即加入反转试剂。
2.2.2反转录
按照表12所示配制反转试剂，试剂均在冰上融化，将反转试剂加入RNA打断之后的PCR管中(总体积为20μL)。并按照表13所示的反应程序进行反转录。
表12反转试剂
表13反转录程序
温度 时间(min)
25 10
42 30
70 15
4 hold
2.2.3纯化
向反转录后的PCR管中加入30μL Low EDTA TE，总体积为50μL。每个PCR管加入90μL磁珠，震荡混匀，室温放置5min，瞬离，磁力架放置2min至液体澄清，弃上清。200μL 80％乙醇洗两遍，瞬离，弃残余乙醇，晾干。加入22μL Low EDTA TE，震荡混匀，室温放置5min，瞬离，磁力架放置2min至液体澄清。转移20μL上清至新PCR管中，不能有磁珠。每管加入36μL磁珠，震荡混匀，室温放置5min，瞬离，磁力架放置2min至液体澄清，弃上清。200μL 80％乙醇洗两遍，瞬离，弃残余乙醇，晾干。加入12μL Low EDTA TE，震荡混匀，室温放置5min，瞬离，磁力架放置2min至液体澄清，转移10μL上清至新的PCR管中。
2.2.4连接接头
PCR仪提前预热至95℃，温度达到后将2.2.3的新PCR管放入95℃PCR仪中，孵育2min，结束后，迅速转移样本至冰上，孵育2min，结束后立即加入提前配制好的反应液(如表14所示)，震荡混匀，放入PCR仪，按照表15所示的反应程序进行接头连接。
表14反应液
表15接头连接反应程序
温度(℃) 时间
37 15min
95 2min
4 hold
2.2.5 PCR扩增
向2.2.4接头连接后的PCR管中加入5μL的indexing primers，再加25μL的PCRMaster Mix，震荡混匀，按照表16所示的反应程序进行PCR扩增。
表16 PCR扩增反应程序
2.2.6 PCR后纯化
向PCR扩增后的PCR管中加入40.4μL磁珠，震荡混匀，室温孵育5min，瞬离，放磁力架2min，至溶液澄清，弃上清。用200μL 80％乙醇洗两遍，瞬离，弃残余乙醇，晾干。加入22μLLow EDTA TE，震荡混匀，室温放置5min，瞬离，放磁力架2min，至溶液澄清，转移20μL上清至新的八连管中。
2.2.7使用Qubit对文库浓度进行定量。
3.杂交捕获(Panel A文库、Panel B文库分别操作，但步骤相同)
3.1文库杂交
根据测定的文库浓度，按文库所需捕获质量为500ng计算体积，吸取文库加入低吸附1.5mL离心管中。按照表17所示配制捕获试剂，将该捕获试剂加入到上述含有文库的离心管中。用封口膜封住离心管，用枪头把封口膜扎几个孔，方便液体蒸发，离心管放入真空离心浓缩仪中蒸干(60℃预热)。注意随时查看是否已蒸干。
表17捕获试剂
试剂 体积/μL
Human Cot DNA(IDT) 5
Blockers 2
3.2 DNA变性与杂交
向蒸干后的离心管中加入根据表18所示配制的Hybridization Master Mix。充分震荡混匀，短暂离心，室温孵育5min后，再次振荡混匀，短暂离心，室温孵育5min。
表18 Hybridization Master Mix
试剂 体积/μL
xGen 2×Hybridization Buffer 8.5
xGen Hybridization Buffer Enhancer 2.7
实施例1的Panel A/Panel B探针 4
水 1.8
将孵育后的液体转移至PCR管中，放置于PCR仪中，按照表19所示的程序进行杂交反应。
表19杂交反应程序
3.3杂交后纯化
3.3.1 Wash Buffer工作液的配制
纯化过程中所需的Wash Buffer工作液的配制方法如表20所示。
表20 Wash Buffer工作液原液及配制方法
将上表中需要65℃使用的试剂分装出来，并于65℃下孵育保存。
3.3.2纯化
3.3.2.1链霉素亲和素磁珠清洗
取50μL Capture beads于八连排中，加入100μL 1×Bead Wash Buffer震荡混匀。置于磁力架上1min至液体澄清，弃去上清。加入100μL 1×Bead Wash Buffer震荡混匀。置于磁力架上1min至液体澄清，弃去上清。加入100μL 1×Bead Wash Buffer震荡混匀。置于磁力架上1min至液体澄清，弃去上清。从磁力架取下八连排，短暂离心，置于磁力架上，用10μL枪头彻底弃去离心管底部的残留液体。向清洗好的磁珠里加入根据表21配制的BeadResuspension Mix。
表21 Bead Resuspension Mix
试剂 体积/μL
xGen 2×Hybridization Buffer 8.5
xGen Hybridization Buffer Enhancer 2.7
Nuclease-Free Water 5.8
3.3.2.2热洗
将捕获过夜的杂交液转移至65℃孵育后带有磁珠的Bead Resuspension Mix中，移液器吹打混匀。置于PCR仪中65℃孵育45min，每隔一段用枪吹打一次保证磁珠悬浮。时间间隔是11min、11min、11min和12min。期间需暂停计时器。孵育完成后，将PCR管中的液体转移至八连排中，加入100μL 65℃预热的1×Wash Buffer 1，移液器吹打混匀。置于磁力架上1min至液体澄清，弃去上清。从磁力架取下八连排，快速短暂离心(防止温度降低太多)，置于磁力架上，用10μL枪头彻底弃去离心管底部的残留液体。加入150μL 65℃预热的1×Stringent Wash Buffer，移液器吹打混匀，65℃孵育5min，置于磁力架上1min至液体澄清，弃去上清。加入150μL 65℃预热的1×Stringent Wash Buffer，移液器吹打混匀，65℃孵育5min，置于磁力架上1min至液体澄清，弃去上清。从磁力架取下八连排，短暂离心，置于磁力架上，用10μL枪头彻底弃去离心管底部的残留液体。
3.3.2.3常温清洗
加入150μL室温放置的1×Wash Buffer 1，振荡30s，静止30s，再振荡30s，静止30s(共2min)，短暂离心，置于磁力架上1min至液体澄清，弃去上清。加入150μL室温放置的1×Wash Buffer 2，振荡30s，静止30s，再振荡30s，静止30s(共2min)，短暂离心，置于磁力架上1min至液体澄清，弃去上清。加入150μL室温放置的1×Wash Buffer 3，振荡30s，静止30s，再振荡30s，静止30s(共2min)，短暂离心，置于磁力架上1min至液体澄清，弃去上清。从磁力架取下八连排，短暂离心，置于磁力架上，用10μL枪头彻底弃去离心管底部的残留液体。向离心管中加入20μL超纯水洗脱，震荡混匀，进行下一步扩增试验。
3.3.3 Post-LM-PCR
按照表22所示配制Post-LM-PCR Mix，震荡混匀，短暂离心后，分装至PCR管中，每管30μL。置于PCR仪上，按表23所示程序进行PCR反应。
表22 Post-LM-PCR Mix
试剂 体积/μL
KAPA HiFi HotStart ReadyMix 25
xGen Library Amplification Primer Mix 1.25
水 3.75
上一步洗脱的DNA 20
表23反应程序
循环数根据panel大小以及混合杂交的样本数量进行调整，如表24所示。
表24循环数、panel大小以及混合杂交的样本数量的关系
3.3.4扩增后纯化
将扩增后的捕获DNA文库置于磁力架上，取75μL(1.5×)纯化磁珠于新的八连排管中，加入50μL扩增后的捕获DNA文库上清，振荡混匀，室温孵育10min。瞬离，置于磁力架上1min至液体澄清，弃去上清。从磁力架取下八连排管，短暂离心，置于磁力架上，用10μL枪头彻底弃去离心管底部的残留液体。加入200μL 80％乙醇，静置30s后弃去，并重复一次。从磁力架取下八连排管，短暂离心，置于磁力架上，用10μL枪头彻底弃去离心管底部的残留液体，室温干燥至乙醇完全挥发。从磁力架取下离心管，加入22μL Low TE，振荡混匀。室温孵育2min。短暂离心，置于磁力架上1min至液体澄清，转移20μL上清至新的1.5ml离心管中，得到杂交捕获后的文库。
3.3.5使用Qubit对杂交捕获后的文库浓度进行定量。
4.二代测序(NGS)
4.1打开Illumina Next-seq 500电源，等待几分钟，开机初始化通过。系统将自动打开Nextseq500 Control Software软件。按仪器要求清洗仪器。
4.2文库上机前准备，文库变性稀释
将文库均稀释为1ng/μL。根据“1×样本个数/浓度＝混库体积V”，确定混为一管中各杂合库加入的体积，Qubit多测几个浓度，取平均值，即为终文库浓度C。取5μL终文库+5μL0.2M NaOH混合后，静置变性5min，加5μL超纯水吹打混匀，终止变性，在变性管中加入985μLHT1 Buffer补足体积1mL。准备1个1.5mL离心管，标记为1300，按照“变性后文库取样体积X：X＝1.5PM×1300×350×660/(5×100000×终文库浓度C)”的公式计算，从变性管中吸取XμL至标记1300的EP管中，用HT1 Buffer补充至总体积1300μL，震荡混匀后离心，得到最终上机的文库。
4.3上机测序
根据仪器导向进行操作，并按要求填写各个参数，点击Next，进入自检界面等待自检完成，点击Star Run，开始测序。
5.下机数据生信分析
Panel A文库测序结果分析流程：以illumina测序平台的下机FastQ文件为输入，经数据过滤、质量控制、比对、突变检测、拷贝数分析、结果注释等步骤得出最终突变结果以及数据的质控信息。
Panel B文库测序结果分析流程：以FastQ文件为输入，经数据过滤、质量控制、比对、融合检测、表达分析、结果注释等步骤得出最终融合基因和基因表达结果以及数据的质控信息。
其中，数据过滤的具体过程为：通过fastp软件过滤掉接头序列、低质量序列，包括质量过滤：碱基质量值≥15，单read中不合格碱基的百分比不超过40％；长度过滤：read的最小长度为15bp；复杂度过滤：read的复杂度≥30，复杂度的定义为一个碱基与其下一个相邻碱基不同的碱基个数占比；接头过滤：自动识别接头序列，并去除接头；每条read的质量切割：使用滑动窗口评估每条read的5’和3’端的平均质量值，当平均质量值低于15时，切除该窗口及其后面的所有碱基；碱基校正：对重叠区域的错配碱基进行校正，如果一个碱基质量高而另一个碱基质量低，则用高质量碱基替换低质量碱基；ployG/ployX尾修剪：去除3’端的ployG和ployX尾巴。
质量控制的具体过程为：过滤后的序列通过samtools、bamdst进行质量控制，分别统计比对率、重复率、总覆盖度、Q20\Q30比率、探针捕获效率。其中：
(1)比对率：靶向捕获建库比对率：表示从测序数据中成功匹配到参考基因组的比对比例。计算方式如下：
比对率＝(成功比对到参考基因组的reads数/总测序reads)×100％
(2)重复率：表示在测序数据中具有相同序列的reads的比例，通常认为该部分序列为PCR产生，分析中应去除。计算方式如下：
重复率＝(重复的reads数/总测序reads数)×100％
重复率的解释：测序数据中有多大比例的读段是技术性复制或PCR扩增引起的。
(3)总覆盖度：表示能够覆盖目标区域的比例。计算方式如下：
总覆盖度＝目标区域内检测到的碱基数/目标区域总碱基数
总覆盖度的解释：测序数据对于目标区域有多全面的覆盖。更高的总覆盖度通常表示更全面的数据。
(4)Q20和Q30：质量评分的指标，用于衡量每个碱基的质量，质量评分是基于碱基测序过程中测量的信号质量而得出的，通常以Phred质量分数表示。Q20表示Phred质量分数大于等于20的碱基的百分比，代表低于1％的碱基错误率，Q30表示Phred质量分数大于等于30的碱基的百分比，代表低于0.1％的碱基错误率。计算方式如下：
Q20百分比＝(Q20及以上质量分数的碱基数/总碱基数)×100％
Q30百分比＝(Q30及以上质量分数的碱基数/总碱基数)×100％
(5)探针捕获效率：表示能够检测到的基因序列占所有基因序列的比率。计算方式如下：
探针捕获效率＝(成功比对到目标区域的reads数/总测序reads)×100％
探针捕获效率的解释：捕获效率越高代表探针的捕获特异性越高。
Panel A使用BWA将过滤后的reads与人类参考基因组hg19进行比对，比对生成的bam文件使用sambamba去除多重比对、PCR重复和未比对序列。使用GATK软件包进行局部重比对、碱基质量分数重校对和变异检测，通过口腔黏膜样本与骨髓样本的对比分析，实现胚系突变和体细胞突变的注释。使用cnvkit软件包，通过口腔黏膜样本与骨髓样本的对比分析，进行拷贝数变异分析，得到每个目的基因的拷贝数值，确定与口腔黏膜样本相比，骨髓样本的拷贝数差异，得到最终的CNV结果；使用manta进行插入、缺失、倒位、串联重复、染色体易位的检测。
Panel B使用SATR将过滤后的reads与人类参考基因组hg38进行比对，比对生成的bam文件分别使用arriba、STAR-Fusion、Fusioncatcher三种软件进行融合基因检测，结果判读原则为：
在QC合格的前提下，一般情况下，检测到的融合基因阳性reads数≤3条的为假阳性，>3条的为真阳性；
注：a)当形成融合的基因都在panel中时，阳性reads数＝split_reads1+split_reads2；
b)当形成融合的基因中只一个在panel中时，阳性reads数＝split_reads1或2(panel内基因)；
3个软件中有2个以上检出，reads数≥1个，或者3个软件中有1个检出，reads数>3个时，需通过荧光定量PCR法进行验证；
当检出未知融合时，检出融合reads数>3个时，需通过荧光定量PCR法进行验证。
使用featureCounts提取Panel B比对结果中的各基因counts数据，根据基本分析流程分析：统计各基因的基因长度，根据公式计算标准化因子＝(基因counts数/基因长度)×1,000,000，然后计算各基因的表达量TPM＝(标准化因子/所有基因的标准化因子之和)×1,000,000。基因高表达阈值计算方式为300例样本各基因表达量的中位数+3×标准差。
6.检测结果
6.1
Panel A 100例样本检测结果如表25所示
表25 Panel A DNA捕获探针100例样本检测结果
Panel B 100例样本检测结果如表26所示
表26 Panel B cDNA捕获探针100例样本检测结果
6.2胚系突变验证：进行panel A检测时，同时送检口腔黏膜样本和骨髓样本，经比对可判断检出的突变位点是否为胚系突变。
对2022年12月～2023年9月期间，同时送检骨髓样本和口腔黏膜的42例淋系血液肿瘤患者进行panel A检测和结果数据分析(按照上述步骤1～5操作)，结果如图1所示，经验证后为体系突变且VAF值大于40％部分(图中紫色区)占17％，如没有口腔粘膜对比，存在误判为胚系突变可能；验证后为胚系突变且没有rs号部分(图中深红色区)占36％，该部分位点无相关文献报道和数据库记录，如没有口腔粘膜对比，存在误判为体系突变可能。由此可见，panel A增加的胚系突变验证与常规分析方法相比，能够明确50％以上患者的突变来源。
6.3检出率
按照上述1～5的步骤，对74例急性淋巴细胞白血病患者(在2021～2023年间，来自河南省肿瘤医院血液科的患者)的骨髓样本进行检测和分析。同时，采用常规56种融合基因筛查方法对上述患者的样本进行检测和分析。对比两种方法的阳性检出率。
经检测，本发明方法的融合基因阳性检出率为47.3％(35例)。而采用56种融合基因筛查方法检测相同的患者样本，阳性检出率为25％，本发明的方法相比常规方法提高了约22.3％，并检出少见融合(未见报道或报道少于10例)10例，如表27所示。
表27常规方法未检出的融合基因
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

Claims (10)

1.一种淋系血液肿瘤检测基因panel的捕获探针，其特征在于，所述捕获探针包括panelADNA捕获探针和panel B cDNA捕获探针；所述panelADNA捕获探针包括如SEQ IDNO.1～2706所示的核苷酸序列，所述panel B cDNA捕获探针包括如SEQ ID NO.2707～9668所示的核苷酸序列。
2.一种权利要求1所述捕获探针在制备淋系血液肿瘤基因的检测试剂或试剂盒中的应用。
3.一种权利要求1所述淋系血液肿瘤检测基因panel的捕获探针的设计方法，其特征在于，包括如下步骤：
(1)筛选淋系血液肿瘤相关基因，并分为panelA和panel B；
(2)根据所述panelA和panel B中基因的标准基因名、基因转录本号及相关基因的外显子所在染色体位置，设计并合成探针；
(3)对所述探针进行性能验证。
4.根据权利要求3所述的设计方法，其特征在于，所述panelA为淋系血液肿瘤相关突变基因；所述panel B为淋系血液肿瘤相关融合基因、基因表达。
5.根据权利要求4所述的设计方法，其特征在于，所述panelA中的基因包括ABCB1、BRCA2、CYP2C19、EZH2、IL7R、MTHFR、PPM1D、SP140、ABL1、BTK、CYP3A5、FAM46C、JAK1、MYD88、PRDM1、SRSF2、APC、CARD11、DIS3、FAT1、JAK2、NFKB1、PRKD2、STAT3、ARID1A、CCND1、DNM2、FBXW7、JAK3、NFKBIE、PSMB5、SUZ12、ASXL1、CDKN2A、DNMT3A、FGFR3、KDM6A、NOTCH1、PTEN、TET2、ATM、CDKN2B、EBF1、FLT3、KIT、NOTCH2、PTPN11、TP53、ATR、CEBPA、EGFR、GATA2、KLHL6、NRAS、RB1、TPMT、ATRX、CREBBP、EGR2、GSTP1、KMT2D、NT5C2、RELN、WHSC1、BCL2、CRLF2、EP300、IDH1、KRAS、PAX5、RUNX1、WT1、BCL7A、CSF1R、EPOR、IDH2、LRP1B、PDGFRA、SETD2、XBP1、BCOR、CSF3R、ERBB3、IKZF1、LTB、PDGFRB、SF3B1、ZRSR2、BIRC3、CXCR4、ERG、IKZF2、MAX、PHF6、SH2B3、NQO1、BRAF、CYLD、ETV6、IKZF3、MPL、PLCG2、SLC52A2；
所述panel B中的基因包括ABL1、AFDN、AFF1、ALK、BCL11B、BCL3、BCL6、BCL9、BCR、BMP2K、C17orf50、CBFA2T3、CBFB、CDK1、CEBPA、CEBPE、CREBBP、CRLF2、DAZAP1、DUX4、ELL、EP300、ETV6、FGFR1、FIP1L1、FUS、HOXA10、HOXA9、IKZF1、JAK2、KAT6A、KMT2A、LMO1、LMO2、LYL1、MALT1、MEF2C、MEF2D、MLLT1、MLLT10、MLLT3、MYB、MYC、NFKB2、NKX2-1、NKX2-2、NUP214、PAX5、PBX1、PIM3、TAL1、TCF3、TFE3、TLX1、TLX3、ZNF362、ZNF384。
6.根据权利要求5所述的设计方法，其特征在于，所述探针的设计方法为采用遍历法，基于机器学习算法，通过序列相似性比对排除相似性高于50％的探针序列；所述探针特异的与目标核酸区域结合，单碱基偶联效率为99.4％～99.6％，合成的探针通过电喷雾质谱法进行质量控制。
7.根据权利要求6所述的设计方法，其特征在于，所述性能验证包括捕获效率验证、精密度验证、准确度验证、分析灵敏度验证。
8.一种非疾病诊断目的或治疗目的的淋系血液肿瘤相关基因的检测方法，其特征在于，包括如下步骤：
(1)提取样本核酸；
(2)将所述核酸中的DNA打断，经接头连接、PCR扩增、纯化，得到panel A文库；
(3)将所述核酸中的RNA打断，经反转录、接头连接、PCR扩增、纯化，得到panel B文库；
(4)用权利要求1所述的panel A DNA捕获探针对panel A文库进行杂交捕获；用权利要求1所述的panel B cDNA捕获探针对panel B文库进行杂交捕获；
(5)将所述杂交捕获后的panel A文库和panel B文库分别进行二代测序，对测序结果进行数据分析。
9.根据权利要求8所述的检测方法，其特征在于，所述panel A文库的数据分析包括数据过滤、质量控制、比对、突变检测、拷贝数分析、结果注释；所述panel B文库的数据分析包括数据过滤、质量控制、比对、融合检测、表达分析、结果注释。
10.根据权利要求9所述的检测方法，其特征在于，对所述杂交捕获后的panel A文库的测序结果进行数据分析时，还包括进行胚系突变验证，所述胚系突变验证的方法为将口腔黏膜样本和骨髓样本经数据分析后的测序结果进行对比分析。
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