CN108374047A - 一种基于高通量测序技术检测膀胱癌的试剂盒 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种基于高通量测序技术检测膀胱癌的试剂盒，包括如SEQ ID NO.1至SEQ ID NO.64所示的膀胱癌突变基因多重PCR特异性引物和接头元件。本发明的试剂盒能够通过尿液核酸同时扩增多个膀胱癌突变基因位点构建测序文库，通过高通量测序以及生物信息分析受检者患膀胱癌的风险，采样方便，准确性高，且为无创式，减轻了病人痛苦。

Description

一种基于高通量测序技术检测膀胱癌的试剂盒
技术领域
本发明涉及基因检测领域，更具体的，涉及一种基于高通量测序技术检测膀胱癌的试剂盒。
背景技术
膀胱癌是泌尿生殖系统中最常见的恶性肿瘤之一，膀胱内窥镜检查被视为膀胱癌诊断的金标准，但膀胱内窥镜检查会带来许多负面影响，如尿液路感染、尿液道损伤、膀胱损伤。尿液脱落细胞学检查是另一种用于诊断膀胱癌的常规方法，其优点是无创伤，特异性高、非侵入性，克服了膀胱内窥镜检查的缺点，但其检出率受到多种因素的影响，尿液脱落细胞学检测膀胱癌的敏感性为13％～75％，特异性为85％～100％，敏感性与肿瘤细胞分级密切相关。FISH技术可以诊断膀胱肿瘤的有效方法，有助于术后监测及评估复发危险性。2016年，屈志义等研究显示FISH检测的阳性率和敏感度分别为77.0％和82.02％，FISH检测的敏感性和总阳性率略微高于尿脱落细胞检测，但是特异性上的差异无统计学意义。因此，有必要寻求一种无创、高灵敏性、高准确性的膀胱癌肿瘤标志物检测方法。
随着二代测序技术的不断发展和成本的大幅度降低，基因检测在膀胱方面的应用越来越来越广，膀胱癌由于其发病灶的特殊性，目前正在使用或研究的大多数非侵入性膀胱癌检测都依赖于从尿液细胞中提取出的DNA，联合检查DNA体细胞突变和相关基因的甲基化变化情况，2016年，Dahmcke等在尿液中检测到TERT(C228T，C250T)，FGFR3的突变位点(p.R248C，p.S249C，p.G370C，p.Y373C)以及部分基因的甲基化异常(SALL3，ONECUT2，CCNA1，BCL2，EOMES，VIM)，该结果显示其敏感性为97.0％，特异性为69％；2017年，van等通过尿液中FGFR3，TERT，HRA S，OTX 1，ONECUT2，TWIST1等基因突变和甲基化研究，综合诊断其敏感性和特异性分别为93％和86％，但是依然缺乏一种能从单一维度检测就能体系出较高特异性和敏感性的方法。
膀胱镜检查和活检是膀胱癌诊断的金标准，其敏感性约为90～97％。但该方法属有创检查，可导致尿路感染、尿道膀胱损伤等并发症，费用较高且对于微小肿瘤容易漏诊。
尿液脱落细胞学检查是一种膀胱癌无创诊断方法，虽有较高的特异性，但敏感性低(13％～75％)，尤其对低级别肿瘤的敏感性更低。
其它无创诊断方法如荧光原位杂交(FISH)、尿核基质蛋白22(Nuclear matrixprotein 22,NMP22)、膀胱肿瘤抗原(bladder tumor antigen,BTA)等，敏感性虽较尿液脱落细胞学检查稍有提高(70～80％)，对分期低(Ta、T1)，低级别的肿瘤敏感性更低，同时特异性降低，均未达到临床需求的理想水平。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是提供一种基于高通量测序技术检测膀胱癌的试剂盒，通过对尿液核酸的DNA超低频的体细胞突变信息建立生物信息模型来分析受检者患膀胱癌的风险性，提供一种无创、高效、特异性和灵敏度高的膀胱癌检测试剂盒。
本发明解决上述技术问题的技术方案如下：一种基于高通量测序技术检测膀胱癌的试剂盒，包括膀胱癌突变基因多重PCR特异性引物和接头元件，所述膀胱癌突变基因多重PCR特异性引物包括上游特异性引物组1和上游特异性引物组2，用于对待测样品中多个目标区域进行扩增，所述上游特异性引物组1的核酸序列如SEQ ID NO.1-SEQ ID NO.32所示所示，所述上游特异性引物2的核酸序列如SEQ ID NO.33-SEQ ID NO.64所示,所述接头元件用于与待测样品核酸片段连接构建高通量测序文库。
进一步，所述试剂盒还包括接头元件通用引物、酶混合物、质控品和无核酸酶水。
进一步，所述待测样品核酸片段与所述接头元件连接之前先进行去磷酸化处理，去除5’端磷酸基团。
进一步，所述膀胱癌突变基因包括PIK3CB、PIK3CA、FBXW7、FGFR3、NFE2L2、SF3B1、NRAS、EIF2AK3、TERT、CDKN1A、PRKAA1、ARID1A、APC、EGFR、ELF3、CTNNB1、ACTB、mTOR、IDH1。
进一步，所述膀胱癌突变基因有多个，与每个目标区域对应的一对特异性引物均能够与目标区域上游部分互补，所述上游特异性引物组2相比所述上游特异性引物组1更靠近对应的扩增目标位点，所述上游特异性引物组1与所述接头元件通用引物的下游引物配合，用于对待测样品和接头元件的连接产物进行扩增，得到特异性扩增产物1，所述上游特异性引物组2与所述接头元件通用引物的下游引物配合，用于对所述特异性扩增产物1进行扩增，得到特异性扩增产物2，进行两轮扩增能够显著提高引物扩增的特异性，且在序列的一端保留接头序列，便于后续高通量测序的进行。
进一步，所述ACTB的特异性引物为SEQ ID NO.21和SEQ ID NO.53、SEQ ID NO.26和SEQ ID NO.58；所述APC的特异性引物为SEQ ID NO.17和SEQ ID NO.49；所述ARID1A的特异性引物为SEQ ID NO.16和SEQ ID NO.48、SEQ ID NO.23和SEQ ID NO.55；所述CDKN1A的特异性引物为SEQ ID NO.13和SEQ ID NO.45、SEQ ID NO.29和SEQ ID NO.61；所述CTNNB1的特异性引物为SEQ ID NO.20和SEQ ID NO.52；所述EGFR的特异性引物为SEQ ID NO.18和SEQ ID NO.40、SEQ ID NO.25和SEQ ID NO.57、SEQ ID NO.28和SEQ ID NO.60；所述EIF2AK3的特异性引物为SEQ ID NO.9和SEQ ID NO.41；所述ELF3的特异性引物为SEQ IDNO.19和SEQ ID NO.51；所述PBXW7的特异性引物为SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.35、SEQ IDNO.10和SEQ ID NO.42，所述FGFR3的特异性引物为SEQ ID NO.4和SEQ ID NO.36、SEQ IDNO.24和SEQ ID NO.56、SEQ ID NO.30和SEQ ID NO.52；所述IDH1的特异性引物为SEQ IDNO.31和SEQ ID NO.63；所述mTOR的特异性引物为SEQ ID NO.27和SEQ ID NO.59、SEQ IDNO.32和SEQ ID NO.64；所述NFE2L2的特异性引物为SEQ ID NO.5和SEQ ID NO.37、SEQ IDNO.22和SEQ ID NO.54；所述NRAS的特异性引物为SEQ ID NO.7和SEQ ID NO.39、SEQ IDNO.14和SEQ ID NO.46；所述PIK3CA的特异性引物为SEQ ID NO.2和SEQ ID NO.34、SEQ IDNO.8和SEQ ID NO.40、SEQ ID NO.11和SEQ ID NO.43；所述PIK3CB的特异性引物为SEQ IDNO.1和SEQ ID NO.33；所述PRKAA1的特异性引物为SEQ ID NO.15和SEQ ID NO.47；所述SF3B1的特异性引物为SEQ ID NO.6和SEQ ID NO.38；所述TERT的特异性引物为SEQ IDNO.12和SEQ ID NO.44.
进一步，所述上游特异性引物组2的5’端均含有用于高通量测序的接头元件序列。
所述接头元件通用引物还用于对所述特异性扩增产物2进行扩增，以得到可以用于高通量测序的文库。
进一步，所述接头元件中包含第一标签序列和第二标签序列，所述第一标签序列用于在扩增目标区域过程中，对不同待测样品的扩增产物上做上相应的标记，所述第二标签序列用于为DNA模板连接barcode进行测序后数据分析。
所述第一标签优选为带有特定碱基序列的核酸分子，其碱基数不限，优选为6-12,所述第二标签碱基序列优选为带有特定碱基序列的核酸分子，其碱基数不限，优选为4-12。
本发明的有益效果是：本发明提供的基于高通量测序技术检测膀胱癌的试剂盒，针对膀胱癌突变基因设计多重PCR特异性引物，通过尿液核酸同时扩增多个膀胱癌基因突变位点并构建文库，通过高通量测序以及生物信息分析受检者患膀胱癌的风险，采样方便，准确性高，且为无创式，减轻病人痛苦。
附图说明
图1为本发明打断的DNA凝胶电泳图，其中泳道1和泳道12为DNAmarker，泳道2至泳道11为样品；
图2为本发明使用Caliper检测文库片段大小及引物二聚体残留情况的库检峰图，其中LM和UM为marker；
具体实施方式
以下结合附图及具体实施例对本发明的原理和特征进行描述，所举实例只用于解释本发明，并非用于限定本发明的范围。
实施例1引物和接头的设计
1.1多重PCR特异性引物设计
所述膀胱癌突变基因包括PIK3CB、PIK3CA、FBXW7、FGFR3、NFE2L2、SF3B1、NRAS、EIF2AK3、TERT、CDKN1A、PRKAA1、ARID1A、APC、EGFR、ELF3、CTNNB1、ACTB、mTOR、IDH1。
所述ACTB的特异性引物为SEQ ID NO.21和SEQ ID NO.53、SEQ ID NO.26和SEQ IDNO.58；所述APC的特异性引物为SEQ ID NO.17和SEQ ID NO.49；所述ARID1A的特异性引物为SEQ ID NO.16和SEQ ID NO.48、SEQ ID NO.23和SEQ ID NO.55；所述CDKN1A的特异性引物为SEQ ID NO.13和SEQ ID NO.45、SEQ ID NO.29和SEQ ID NO.61；所述CTNNB1的特异性引物为SEQ ID NO.20和SEQ ID NO.52；所述EGFR的特异性引物为SEQ ID NO.18和SEQ IDNO.40、SEQ ID NO.25和SEQ ID NO.57、SEQ ID NO.28和SEQ ID NO.60；所述EIF2AK3的特异性引物为SEQ ID NO.9和SEQ ID NO.41；所述ELF3的特异性引物为SEQ ID NO.19和SEQ IDNO.51；所述PBXW7的特异性引物为SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.35、SEQ ID NO.10和SEQ IDNO.42，所述FGFR3的特异性引物为SEQ ID NO.4和SEQ ID NO.36、SEQ ID NO.24和SEQ IDNO.56、SEQ IDNO.30和SEQ ID NO.52；所述IDH1的特异性引物为SEQ ID NO.31和SEQ IDNO.63；所述mTOR的特异性引物为SEQ ID NO.27和SEQ ID NO.59、SEQ ID NO.32和SEQ IDNO.64；所述NFE2L2的特异性引物为SEQ ID NO.5和SEQ ID NO.37、SEQ ID NO.22和SEQ IDNO.54；所述NRAS的特异性引物为SEQ ID NO.7和SEQ ID NO.39、SEQ ID NO.14和SEQ IDNO.46；所述PIK3CA的特异性引物为SEQ ID NO.2和SEQ ID NO.34、SEQ ID NO.8和SEQ IDNO.40、SEQ ID NO.11和SEQ ID NO.43；所述PIK3CB的特异性引物为SEQ ID NO.1和SEQ IDNO.33；所述PRKAA1的特异性引物为SEQ ID NO.15和SEQ ID NO.47；所述SF3B1的特异性引物为SEQ ID NO.6和SEQ ID NO.38；所述TERT的特异性引物为SEQ ID NO.12和SEQ IDNO.44。所述SEQ ID NO.1-SEQ ID NO.64的序列如下所示：
与每个目标区域对应的一对特异性引物均能够与目标区域上游部分互补，所述上游特异性引物组1的核酸序列如SEQ ID NO.1-SEQ ID NO.32所示，所述上游特异性引物组2的核酸序列如SEQ ID NO.33-SEQ ID NO.64所示，所述上游特异性引物组2相比所述上游特异性引物组1更靠近对应的扩增目标位点，所述上游特异性引物组1与所述接头元件通用引物的下游引物配合，用于对待测样品和接头元件的连接产物进行扩增，得到特异性扩增产物1，所述上游特异性引物组2与所述接头元件通用引物的下游引物配合，用于对所述特异性扩增产物1进行扩增，得到特异性扩增产物2。
所述上游特异性引物组2的5’端均含有用于高通量测序的接头元件序列。
1.2接头以及通用引物设计
所述接头元件用于与待测样品核酸片段连接构建高通量测序文库，所述接头元件采用平末端接头、突出末端接头、带颈环结构的接头和分叉接头中的至少一种。接头元件中包含第一标签序列和第二标签序列，第一标签序列用于在扩增目标区域的过程中，对不同待测样品的扩增产物上做上相应的标记，这样，在分别获得目标区域测序文库后，不同的待测样品的测序文库可以混合在同一个反应体系中，进行单分子扩增反应，进而同时进行高通量测序，提高测序反应的效率，降低了样品检测的成本，该第一标签序列优选为带有特定序列的核酸分子，其碱基数不限，在综合考虑各种情况后，如标签的特异性、接头的成本、接头的长度等，第一标签的碱基数优选为6-12，这样，每次至少能够对46个样品同时进行检测。所述第二标签序列用于为DNA模板连接barcode进行测序后数据分析，优选为带有特定碱基序列的核酸分子，其碱基数不限，优选为4-12。
实施例2高通量测序文库构建
在本实施例中，采用接头元件通用引物P5和P7，其序列分别为SEQ ID NO.65和SEQID NO.66,接头元件采用突出末端接头，该接头是双核酸链分子，该双链核酸分子至少包括一突出末端，接头选为8个(即同时对8个样本进行检测)，短链序列为SEQ ID NO.67，长链序列为SEQ ID NO.68-SEQ ID NO.75。SEQ ID NO.65-SEQ ID NO.75序列如下表所示:
2.1 DNA提取以及打断
收集受检者晨尿，1600g离心收集尿液脱落细胞，上清再使用16000g离心，收集尿上清，使用商业提取试剂盒进行尿液脱落细胞或尿上清进行DNA提取。取200-500ng DNA使用商业DNA打断试剂或超声打断仪器将DNA打断至200bp左右，提取的DNA凝胶电泳图谱如图1所示。
2.2末端修复
将除酶以外的试剂解冻，并震荡混匀，稍加离心于管底，反应体系如下：
将反应体系在20℃金属浴中反应30min，加入已平衡至室温的Ampure XP磁珠90ul(1.8倍体积),用移液器吹打10次，静置5min后，将1.5ml离心管放置在磁力架上约3min，待液体完全澄清，吸取上清液体丢弃，注意不要吸到磁珠。加入200ul 80％的乙醇，移液器吹打约5次，吸取上清液体丢弃，再加入200ul 80％乙醇重复洗涤1次，并将残留80％乙醇吸尽，室温开盖放置5min，加入45ul TE洗脱。
2.3末端加A
将除酶以外的试剂解冻，并震荡均匀，稍加离心于管底，反应体系如下：
将反应体系在37℃金属浴中反应30min，加入已平衡至室温的Ampure XP磁珠90ul(1.8倍体积),用移液器吹打10次，静置5min后，将1.5ml离心管放置在磁力架上约3min，待液体完全澄清，吸取上清液体丢弃，注意不要吸到磁珠。加入200ul 80％的乙醇，移液器吹打约5次，吸取上清液体丢弃，再加入200ul 80％乙醇重复洗涤1次，并将残留80％乙醇吸尽，室温开盖放置5min，加入35ul TE洗脱。
2.4去磷酸化
将除酶以外的试剂解冻，并震荡均匀，稍加离心于管底，反应体系如下：
将反应体系在50℃金属浴中反应30min，加入已平衡至室温的Ampure XP磁珠72ul(1.8倍体积),用移液器吹打10次，静置5min后，将1.5ml离心管放置在磁力架上约3min，待液体完全澄清，吸取上清液体丢弃，注意不要吸到磁珠。加入200ul 80％的乙醇，移液器吹打约5次，吸取上清液体丢弃，再加入200ul 80％乙醇重复洗涤1次，并将残留80％乙醇吸尽，室温开盖放置5min，加入21ul TE洗脱。
2.5 barcode接头连接
将除酶以外的试剂解冻，并震荡均匀，稍加离心于管底，反应体系如下：
将反应体系在20℃金属浴中反应20min，加入已平衡至室温的Ampure XP磁珠90ul(1.8倍体积),用移液器吹打10次，静置5min后，将1.5ml离心管放置在磁力架上约3min，待液体完全澄清，吸取上清液体丢弃，注意不要吸到磁珠。加入200ul 80％的乙醇，移液器吹打约5次，吸取上清液体丢弃，再加入200ul 80％乙醇重复洗涤1次，并将残留80％乙醇吸尽，室温开盖放置5min，加入15ul TE洗脱。
2.6多重PCR捕获目的片段
利用上述特异性引物，对膀胱癌突变基因的目标区域进行扩增，得到扩增产物。其中32条外侧引物按一定比例混合成primer mix 1、32条外侧引物按一定比例混合成primermix 2。
第一轮多重PCR的反应体系如下：
PCR反应条件如下：
95℃，5min；10-15cycs(95℃，30s；60℃，90s；72℃，30s)；68℃，10min，4℃。
加入已平衡至室温的Ampure XP磁珠75ul(1.5倍体积),用移液器吹打10次，静置5min后，将1.5ml离心管放置在磁力架上约3min，待液体完全澄清，吸取上清液体丢弃，注意不要吸到磁珠。加入200ul 80％的乙醇，移液器吹打约5次，吸取上清液体丢弃，再加入200ul 80％乙醇重复洗涤1次，并将残留80％乙醇吸尽，室温开盖放置5min，加入15ul TE洗脱
第二轮多重PCR反应体系如下：
PCR反应条件如下：
95℃，5min；10-15cycs(95℃，30s；60℃，90s；72℃，30s)；68℃，10min，4℃
加入已平衡至室温的Ampure XP磁珠75ul(1.5倍体积),用移液器吹打10次，静置5min后，将1.5ml离心管放置在磁力架上约3min，待液体完全澄清，吸取上清液体丢弃，注意不要吸到磁珠。加入200ul 80％的乙醇，移液器吹打约5次，吸取上清液体丢弃，再加入200ul 80％乙醇重复洗涤1次，并将残留80％乙醇吸尽，室温开盖放置5min，加入40ul TE洗脱。
2.7 PCR扩增富集，引入接头序列
PCR反应体系如下所示
PCR反应条件如下：
94℃，2min；15cycs(94℃，10s；60℃，30s；72℃，30s)；72℃，5min，4℃
PCR扩增完毕后，加入已平衡至室温的Ampure XP磁珠90ul(1.8倍体积),用移液器吹打10次，静置5min后，将1.5ml离心管放置在磁力架上约3min，待液体完全澄清，吸取上清液体丢弃，注意不要吸到磁珠。加入200ul 80％的乙醇，移液器吹打约5次，吸取上清液体丢弃，再加入200ul 80％乙醇重复洗涤1次，并将残留80％乙醇吸尽，室温开盖放置5min，加入25ul TE洗脱
3、文库质检
使用Qubit/QPCR检测试剂盒对扩增后文库进行浓度定量。不同样品文库浓度在25ng/ul-32.6ng/ul之间。
使用Caliper、agilent 2100或琼脂糖凝胶电泳检测文库片段大小及引物二聚体残留情况。如图2所示，caliper检测主峰在260bp左右，微量或无引物二聚体污染。如果拖尾严重，大片段较多，可以使用磁珠或切胶回收去除大片段。
4、使用illumina测序仪及测序试剂，用PE75或PE150进行测序。
5、结果分析
使用Illumina bcl2fastq软件把测序的bcl文件转化成常见的测序原始数据格式FASTQ，同时使用样本标签序列区分出不同的样本。使用cutadapt软件去除双端测序(PE)序列中的测序引物序列。使用双端测序数据中的一端read1，截取其中的前Nbp(N为单分子标签序列长度加1)，识别出设计的单分子标签序列，如果read2中也存在单分子标签序列则一同去除，同时记录每对序列的单分子标签序列，最后得到可用于下一步分析的序列c leanreads。
使用BWA软件比对clean reads和人类参考基因组GRCh38，根据目标位点引物的位置准确识别出各目标位点的序列，结合序列的单分子标签序列，输出支持目标位点的分子的起始、终止位置以及比对质量值等信息，根据分子的起始、终止位置和单分子标签序列，比较其目标位点的碱基，选取其中支持数最多的一种碱基，并计该位点分子支持数加1，最后得到各位点上不同碱基的分子支持数。选取其中支持分子数目较多的碱基，计算出各目标位点的等位基因型和突变频率。根据突变情况判断是否患膀胱癌。
收集临床病人尿液进行检测，以临床诊断结果为对照。收集了肿瘤患者和血尿患者晨尿65例，其中包括43例膀胱癌，22例增生或炎症患者，65例患者都获得了临床诊断报告，将实验结果以临床诊断为标准进行比对分析。
与临床诊断报告对比，真阴性样本21例，真阳性样本40例，假阳性1例，假阴性3例，特异性达到95.5％，敏感性达到93％。
使用本试剂盒通过高通量测序以及信息分析方法，检测出尿沉淀细胞中是否含引起肿瘤的基因突变，本发明阳性预测值和阴性预测值明显高于常规尿检和膀胱镜，在临床上有很高的运用价值。
以上所述仅为本发明的较佳实施例，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
序列表
<110> 湖南优品司生物科技有限公司
<120> 一种基于高通量测序技术检测膀胱癌的试剂盒
<160> 75
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 28
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
agatctgtag tctttccgaa ctgtgtgg 28
<210> 2
<211> 28
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
tccctttggg ttataaatag tgcactca 28
<210> 3
<211> 28
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
ctttaccata aaatcatatg ctccacta 28
<210> 4
<211> 28
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
ctcactcacc cgcccgcgtc ccggtgca 28
<210> 5
<211> 28
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
ttttttctgt ttttccagct catactct 28
<210> 6
<211> 28
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
caaatattaa agttagtagc aatgtgcc 28
<210> 7
<211> 28
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 7
atattcatct acaaagtggt tctggatt 28
<210> 8
<211> 28
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 8
ttacacagac actctagtat ctggaaaa 28
<210> 9
<211> 28
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 9
aaccatgatt cttaccctgt gaggatga 28
<210> 10
<211> 28
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 10
gaagaagtcc caaccatgac aagatttt 28
<210> 11
<211> 28
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 11
cattttcgta agtgttactc aagaagca 28
<210> 12
<211> 28
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 12
gcgccgcgag gagagggcgg ggccgcgg 28
<210> 13
<211> 28
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 13
catccaggag gcccgtgagc gatggaac 28
<210> 14
<211> 28
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 14
acacagagga agccttcgcc tgtcctca 28
<210> 15
<211> 28
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 15
catgggatcc acctgcagca tatgtttc 28
<210> 16
<211> 28
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 16
agagccagcc cccctactca cagccaca 28
<210> 17
<211> 28
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 17
aaccccaaaa gcatgttagt tttacacc 28
<210> 18
<211> 28
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 18
acgtaccaga tggatgtgaa ccccgagg 28
<210> 19
<211> 28
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 19
tggcccaact atggggccaa aagaaaaa 28
<210> 20
<211> 28
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 20
tggccatgga accagacaga aaagcggc 28
<210> 21
<211> 28
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 21
aggggccgga ctcgtcatac tcctgctt 28
<210> 22
<211> 28
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 22
tccactggtt tctgactgga tgtgctgg 28
<210> 23
<211> 28
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 23
cctcagcccc ctcaatgacc tccagtaa 28
<210> 24
<211> 28
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 24
gcagtggcgg tggtggtgag ggaggggg 28
<210> 25
<211> 28
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 25
gcatccttca tgggaattta aaggagct 28
<210> 26
<211> 28
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 26
acgcaggatg gcatggggga gggcatac 28
<210> 27
<211> 28
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 27
ttgatgatac tcactgtcca tcagcctc 28
<210> 28
<211> 28
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 28
gtagagattg gtgatcaata atcaccct 28
<210> 29
<211> 28
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 29
agcagctgag ccgcgactgt gatgcgct 28
<210> 30
<211> 28
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 30
caggcctcaa cgcccatgtc tttgcagc 28
<210> 31
<211> 28
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 31
tgagaaatca atgtaaacac catcttac 28
<210> 32
<211> 28
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 32
ctcttccagg ccttcatgcc acatctca 28
<210> 33
<211> 48
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 33
nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn gccatccagt tcactttagt agtccagc 48
<210> 34
<211> 48
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 34
nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn gaataaaaat tctttgtgca acctacgt 48
<210> 35
<211> 48
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 35
nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn acaaccctcc tgccatcata ttgaacac 48
<210> 36
<211> 48
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 36
nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn gctgcggcat cagcagtgga gcctggtc 48
<210> 37
<211> 48
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 37
nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn ttccgtcgct gactgaagtc aaatactt 48
<210> 38
<211> 48
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 38
nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn ataatagttt tcattacctc tgtagtct 48
<210> 39
<211> 48
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 39
nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn agctggattg tcagtgcgct tttcccaa 48
<210> 40
<211> 48
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 40
nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn atggctttga atctttggcc agtacctc 48
<210> 41
<211> 48
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 41
nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn ggatggaaaa gcctgcgcac aataaacg 48
<210> 42
<211> 48
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 42
nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn cccttacctt ttttcatgaa gatgcata 48
<210> 43
<211> 48
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 43
nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn gaaagggaag aattttttga tgaaacaa 48
<210> 44
<211> 48
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 44
nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn gaaagggaag aattttttga tgaaacaa 48
<210> 45
<211> 48
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 45
nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn ttcgactttg tcaccgagac accactgg 48
<210> 46
<211> 48
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 46
nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn tgtattggtc tctcatggca ctgtactc 48
<210> 47
<211> 48
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 47
nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn aaaaggctaa tcacagaagg atttaaat 48
<210> 48
<211> 48
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 48
nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn ggctcagtct ccttaccagc agcagcaa 48
<210> 49
<211> 48
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 49
nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn gggggatgat atgccacggg tgtattgt 48
<210> 50
<211> 48
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 50
nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn gcaaatacag ctttggtgcc acctgcgt 48
<210> 51
<211> 48
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 51
nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn gaacagcaac atgacctacg agaagctg 48
<210> 52
<211> 48
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 52
nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn tgttagtcac tggcagcaac agtcttac 48
<210> 53
<211> 48
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 53
nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn gctgatccac atctgctgga aggtggac 48
<210> 54
<211> 48
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 54
nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn gctggctgaa ttgggagaaa ttcacctg 48
<210> 55
<211> 48
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 55
nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn gggagggcaa gaagatatga acctgagc 48
<210> 56
<211> 48
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 56
nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn tggcccctga gcgtcatctg cccccaca 48
<210> 57
<211> 48
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 57
nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn ggaaagagtg ctcaccgcag ttccattc 48
<210> 58
<211> 48
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 58
nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn ccctcgtaga tgggcacagt gtgggtga 48
<210> 59
<211> 48
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 59
nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn cagttcagca aggggtcata gacaaagg 48
<210> 60
<211> 48
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 60
nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn gttgtttgtt tcagtgactc cttcacac 48
<210> 61
<211> 48
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 61
nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn aatggcgggc tgcatccagg aggcccgt 48
<210> 62
<211> 48
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 62
nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn cgaggaggag ctggtggagg ctgacgag 48
<210> 63
<211> 48
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 63
nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn caatgggatt ggtggacgtc tcctgtcc 48
<210> 64
<211> 48
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 64
nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn tgccagagga tggccactcg gatcagct 48
<210> 65
<211> 58
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 65
aatgatacgg cgaccaccga gatctacact ctttccctac acgacgctct tccgatct 58
<210> 66
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 66
caagcagaag acggcatacg a 21
<210> 67
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 67
attggcgctc ttccgatct 19
<210> 68
<211> 67
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 68
gatcggaaga gcacacgtct gaactccagt cacatcacgn nnnatctcgt atgccgtctt 60
ctgcttg 67
<210> 69
<211> 67
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 69
gatcggaaga gcacacgtct gaactccagt caccgatgtn nnnatctcgt atgccgtctt 60
ctgcttg 67
<210> 70
<211> 67
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 70
gatcggaaga gcacacgtct gaactccagt catctacgan nnnatctcgt atgccgtctt 60
ctgcttg 67
<210> 71
<211> 67
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 71
gatcggaaga gcacacgtct gaactccagt cactggtatn nnnatctcgt atgccgtctt 60
ctgcttg 67
<210> 72
<211> 67
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 72
gatcggaaga gcacacgtct gaactccagt cacggtagtn nnnatctcgt atgccgtctt 60
ctgcttg 67
<210> 73
<211> 67
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 73
gatcggaaga gcacacgtct gaactccagt cagccattgn nnnatctcgt atgccgtctt 60
ctgcttg 67
<210> 74
<211> 67
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 74
gatcggaaga gcacacgtct gaactccagt cacagatgan nnnatctcgt atgccgtctt 60
ctgcttg 67
<210> 75
<211> 67
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 75
gatcggaaga gcacacgtct gaactccagt cacgggtgcn nnnatctcgt atgccgtctt 60
ctgcttg 67

Claims (9)

1.一种基于高通量测序技术检测膀胱癌的试剂盒，其特征在于，包括膀胱癌突变基因多重PCR特异性引物和接头元件，所述膀胱癌突变基因多重PCR特异性引物包括上游特异性引物组1和上游特异性引物组2,用于对待测样品中多个目标区域进行扩增，所述上游特异性引物组1的核酸序列如SEQ ID NO.1-SEQ ID NO.32所示，所述上游特异性引物组2的核酸序列如SEQ ID NO.33-SEQ ID NO.64所示，所述接头元件用于与待测样品的核酸片段连接构建高通量测序文库。
2.根据权利要求1所述的一种基于高通量测序技术检测膀胱癌的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括接头元件通用引物、酶混合物、质控品和无核酸酶水。
3.根据权利要求1所述的一种基于高通量测序技术检测膀胱癌的试剂盒，其特征在于，所述待测样品的核酸片段与所述接头元件连接之前先进行去磷酸化处理，去除5’端磷酸基团。
4.根据权利要求1-3任一项所述的一种基于高通量测序技术检测膀胱癌的试剂盒，其特征在于，所述膀胱癌突变基因有多个，与每个目标区域对应的一对特异性引物均能够与目标区域上游部分互补，所述上游特异性引物组2相比所述上游特异性引物组1更靠近对应的扩增目标位点，所述上游特异性引物组1与所述接头元件通用引物的下游引物配合，用于对待测样品和接头元件的连接产物进行扩增，得到特异性扩增产物1，所述上游特异性引物组2与所述接头元件通用引物的下游引物配合，用于对所述特异性扩增产物1进行扩增，得到特异性扩增产物2。
5.根据权利要求1所述的一种基于高通量测序技术检测膀胱癌的试剂盒，其特征在于，所述上游特异性引物组2的5’端均含有用于高通量测序的接头元件序列。
6.根据权利要求4所述的一种基于高通量测序技术检测膀胱癌的试剂盒，其特征在于，所述接头元件通用引物还用于对所述特异性扩增产物2进行扩增，以得到可以用于高通量测序的文库。
7.根据权利要求1所述的一种基于高通量测序技术检测膀胱癌的试剂盒，其特征在于，所述接头元件中包含第一标签序列和第二标签序列，所述第一标签序列用于在扩增目标区域过程中，对不同待测样品的扩增产物上做上相应的标记，所述第二标签序列用于为DNA模板连接barcode进行测序后数据分析。
8.根据权利要求1所述的一种基于高通量测序技术检测膀胱癌的试剂盒，其特征在于，所述膀胱癌突变基因包括PIK3CB、PIK3CA、FBXW7、FGFR3、NFE2L2、SF3B1、NRAS、EIF2AK3、TERT、CDKN1A、PRKAA1、ARID1A、APC、EGFR、ELF3、CTNNB1、ACTB、mTOR、IDH1。
9.根据权利要求8所述的一种基于高通量测序技术检测膀胱癌的试剂盒，其特征在于，所述ACTB的特异性引物为SEQ ID NO.21和SEQ ID NO.53、SEQ ID NO.26和SEQ ID NO.58；所述APC的特异性引物为SEQ ID NO.17和SEQ ID NO.49；所述ARID1A的特异性引物为SEQID NO.16和SEQ ID NO.48、SEQ ID NO.23和SEQ ID NO.55；所述CDKN1A的特异性引物为SEQID NO.13和SEQ ID NO.45、SEQ ID NO.29和SEQ ID NO.61；所述CTNNB1的特异性引物为SEQID NO.20和SEQ ID NO.52；所述EGFR的特异性引物为SEQ ID NO.18和SEQ ID NO.40、SEQID NO.25和SEQ ID NO.57、SEQ ID NO.28和SEQ ID NO.60；所述EIF2AK3的特异性引物为SEQ ID NO.9和SEQ ID NO.41；所述ELF3的特异性引物为SEQ ID NO.19和SEQ ID NO.51；所述PBXW7的特异性引物为SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.35、SEQ ID NO.10和SEQ ID NO.42，所述FGFR3的特异性引物为SEQ ID NO.4和SEQ ID NO.36、SEQ ID NO.24和SEQ ID NO.56、SEQID NO.30和SEQ ID NO.52；所述IDH1的特异性引物为SEQ ID NO.31和SEQ ID NO.63；所述mTOR的特异性引物为SEQ ID NO.27和SEQ ID NO.59、SEQ ID NO.32和SEQ ID NO.64；所述NFE2L2的特异性引物为SEQ ID NO.5和SEQ ID NO.37、SEQ ID NO.22和SEQ ID NO.54；所述NRAS的特异性引物为SEQ ID NO.7和SEQ ID NO.39、SEQ ID NO.14和SEQ ID NO.46；所述PIK3CA的特异性引物为SEQ ID NO.2和SEQ ID NO.34、SEQ ID NO.8和SEQ ID NO.40、SEQID NO.11和SEQ ID NO.43；所述PIK3CB的特异性引物为SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.33；所述PRKAA1的特异性引物为SEQ ID NO.15和SEQ ID NO.47；所述SF3B1的特异性引物为SEQ IDNO.6和SEQ ID NO.38；所述TERT的特异性引物为SEQ ID NO.12和SEQ ID NO.44。
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