CN116891899A - 一种基因标志物组合、试剂盒及检测方法 - Google Patents
一种基因标志物组合、试剂盒及检测方法 Download PDFInfo
- Publication number
- CN116891899A CN116891899A CN202311160819.XA CN202311160819A CN116891899A CN 116891899 A CN116891899 A CN 116891899A CN 202311160819 A CN202311160819 A CN 202311160819A CN 116891899 A CN116891899 A CN 116891899A
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- gene
- seq
- primer
- probe
- nucleic acid
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Granted
Links
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 title claims abstract description 145
- 238000001514 detection method Methods 0.000 title abstract description 83
- 239000003550 marker Substances 0.000 title abstract description 62
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 claims abstract description 147
- 230000011987 methylation Effects 0.000 claims abstract description 125
- 238000007069 methylation reaction Methods 0.000 claims abstract description 125
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 claims abstract description 112
- 239000012634 fragment Substances 0.000 claims abstract description 103
- 206010044412 transitional cell carcinoma Diseases 0.000 claims abstract description 94
- 206010064571 Gene mutation Diseases 0.000 claims abstract description 65
- 101150018417 VIM gene Proteins 0.000 claims abstract description 65
- 238000012360 testing method Methods 0.000 claims abstract description 56
- 102100027842 Fibroblast growth factor receptor 3 Human genes 0.000 claims abstract description 19
- 238000004393 prognosis Methods 0.000 claims abstract description 17
- 101710182396 Fibroblast growth factor receptor 3 Proteins 0.000 claims abstract description 15
- 239000000523 sample Substances 0.000 claims description 237
- 230000035772 mutation Effects 0.000 claims description 109
- 150000007523 nucleic acids Chemical group 0.000 claims description 80
- 206010028980 Neoplasm Diseases 0.000 claims description 69
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 claims description 61
- 108091008794 FGF receptors Proteins 0.000 claims description 34
- 102000052178 fibroblast growth factor receptor activity proteins Human genes 0.000 claims description 34
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 claims description 29
- 101150025764 FGFR3 gene Proteins 0.000 claims description 28
- 101150010175 ONECUT2 gene Proteins 0.000 claims description 27
- 101150047500 TERT gene Proteins 0.000 claims description 25
- 210000002700 urine Anatomy 0.000 claims description 24
- 238000011319 anticancer therapy Methods 0.000 claims description 10
- 101150087690 ACTB gene Proteins 0.000 claims description 7
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 claims description 5
- 101150028074 2 gene Proteins 0.000 abstract description 19
- 230000036952 cancer formation Effects 0.000 abstract description 9
- 208000005623 Carcinogenesis Diseases 0.000 abstract description 7
- 231100000504 carcinogenesis Toxicity 0.000 abstract description 7
- 239000003814 drug Substances 0.000 abstract description 2
- 238000000034 method Methods 0.000 description 75
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 20
- 230000035945 sensitivity Effects 0.000 description 18
- LSNNMFCWUKXFEE-UHFFFAOYSA-M Bisulfite Chemical compound OS([O-])=O LSNNMFCWUKXFEE-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 14
- 238000013399 early diagnosis Methods 0.000 description 14
- 230000007170 pathology Effects 0.000 description 14
- 238000011144 upstream manufacturing Methods 0.000 description 14
- 102100035071 Vimentin Human genes 0.000 description 13
- OPTASPLRGRRNAP-UHFFFAOYSA-N cytosine Chemical compound NC=1C=CNC(=O)N=1 OPTASPLRGRRNAP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 13
- 101000992164 Homo sapiens One cut domain family member 2 Proteins 0.000 description 12
- 239000002699 waste material Substances 0.000 description 12
- 101000803403 Homo sapiens Vimentin Proteins 0.000 description 11
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 11
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 description 11
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 description 11
- 102100031943 One cut domain family member 2 Human genes 0.000 description 10
- PCHJSUWPFVWCPO-UHFFFAOYSA-N gold Chemical compound [Au] PCHJSUWPFVWCPO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 10
- 108091092584 GDNA Proteins 0.000 description 9
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 9
- 238000003745 diagnosis Methods 0.000 description 9
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 9
- 108091008146 restriction endonucleases Proteins 0.000 description 9
- 201000011510 cancer Diseases 0.000 description 8
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 8
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 8
- 238000003753 real-time PCR Methods 0.000 description 8
- 206010005003 Bladder cancer Diseases 0.000 description 7
- 208000006750 hematuria Diseases 0.000 description 7
- 238000003384 imaging method Methods 0.000 description 7
- 238000012544 monitoring process Methods 0.000 description 7
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 7
- 230000009466 transformation Effects 0.000 description 7
- 102100032938 Telomerase reverse transcriptase Human genes 0.000 description 6
- 208000007097 Urinary Bladder Neoplasms Diseases 0.000 description 6
- 230000003187 abdominal effect Effects 0.000 description 6
- 230000003321 amplification Effects 0.000 description 6
- 238000001574 biopsy Methods 0.000 description 6
- 238000002156 mixing Methods 0.000 description 6
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 6
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 6
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 description 6
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 6
- 201000005112 urinary bladder cancer Diseases 0.000 description 6
- 210000001635 urinary tract Anatomy 0.000 description 6
- 101000917148 Homo sapiens Fibroblast growth factor receptor 3 Proteins 0.000 description 5
- 101000655352 Homo sapiens Telomerase reverse transcriptase Proteins 0.000 description 5
- 238000012408 PCR amplification Methods 0.000 description 5
- 229940104302 cytosine Drugs 0.000 description 5
- 230000009615 deamination Effects 0.000 description 5
- 238000006481 deamination reaction Methods 0.000 description 5
- 239000000047 product Substances 0.000 description 5
- 239000011541 reaction mixture Substances 0.000 description 5
- 239000013049 sediment Substances 0.000 description 5
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 5
- 238000011282 treatment Methods 0.000 description 5
- 210000001124 body fluid Anatomy 0.000 description 4
- 239000010839 body fluid Substances 0.000 description 4
- 238000003776 cleavage reaction Methods 0.000 description 4
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 4
- 239000008188 pellet Substances 0.000 description 4
- 230000007017 scission Effects 0.000 description 4
- 239000011534 wash buffer Substances 0.000 description 4
- FZWGECJQACGGTI-UHFFFAOYSA-N 2-amino-7-methyl-1,7-dihydro-6H-purin-6-one Chemical compound NC1=NC(O)=C2N(C)C=NC2=N1 FZWGECJQACGGTI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 201000009030 Carcinoma Diseases 0.000 description 3
- 101000756632 Homo sapiens Actin, cytoplasmic 1 Proteins 0.000 description 3
- LSNNMFCWUKXFEE-UHFFFAOYSA-N Sulfurous acid Chemical compound OS(O)=O LSNNMFCWUKXFEE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 238000004364 calculation method Methods 0.000 description 3
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 3
- 238000002591 computed tomography Methods 0.000 description 3
- 125000002637 deoxyribonucleotide group Chemical group 0.000 description 3
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 3
- 238000001839 endoscopy Methods 0.000 description 3
- 238000011156 evaluation Methods 0.000 description 3
- 238000000605 extraction Methods 0.000 description 3
- 239000007850 fluorescent dye Substances 0.000 description 3
- 238000007901 in situ hybridization Methods 0.000 description 3
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 3
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 description 3
- 230000036210 malignancy Effects 0.000 description 3
- 239000013642 negative control Substances 0.000 description 3
- 238000003752 polymerase chain reaction Methods 0.000 description 3
- 238000010998 test method Methods 0.000 description 3
- 238000002604 ultrasonography Methods 0.000 description 3
- 108700028369 Alleles Proteins 0.000 description 2
- 108091029523 CpG island Proteins 0.000 description 2
- 101100295776 Drosophila melanogaster onecut gene Proteins 0.000 description 2
- 101100263693 Homo sapiens VIM gene Proteins 0.000 description 2
- 206010061309 Neoplasm progression Diseases 0.000 description 2
- -1 PFBMFT1 Proteins 0.000 description 2
- ISAKRJDGNUQOIC-UHFFFAOYSA-N Uracil Chemical compound O=C1C=CNC(=O)N1 ISAKRJDGNUQOIC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 108010065472 Vimentin Proteins 0.000 description 2
- 125000003277 amino group Chemical group 0.000 description 2
- 239000012148 binding buffer Substances 0.000 description 2
- 238000002574 cystoscopy Methods 0.000 description 2
- 239000005547 deoxyribonucleotide Substances 0.000 description 2
- 238000012165 high-throughput sequencing Methods 0.000 description 2
- 210000000244 kidney pelvis Anatomy 0.000 description 2
- 230000003902 lesion Effects 0.000 description 2
- 238000007855 methylation-specific PCR Methods 0.000 description 2
- 238000010827 pathological analysis Methods 0.000 description 2
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 2
- 238000003908 quality control method Methods 0.000 description 2
- 230000000391 smoking effect Effects 0.000 description 2
- 241000894007 species Species 0.000 description 2
- 231100000331 toxic Toxicity 0.000 description 2
- 230000002588 toxic effect Effects 0.000 description 2
- 230000001131 transforming effect Effects 0.000 description 2
- 230000005751 tumor progression Effects 0.000 description 2
- 210000000626 ureter Anatomy 0.000 description 2
- 230000002485 urinary effect Effects 0.000 description 2
- 201000000365 urinary system benign neoplasm Diseases 0.000 description 2
- 208000029584 urinary system neoplasm Diseases 0.000 description 2
- 210000005048 vimentin Anatomy 0.000 description 2
- HWPZZUQOWRWFDB-UHFFFAOYSA-N 1-methylcytosine Chemical compound CN1C=CC(N)=NC1=O HWPZZUQOWRWFDB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108020004463 18S ribosomal RNA Proteins 0.000 description 1
- 102100022900 Actin, cytoplasmic 1 Human genes 0.000 description 1
- 108010085238 Actins Proteins 0.000 description 1
- 208000031868 Calculus ureteric Diseases 0.000 description 1
- 208000009458 Carcinoma in Situ Diseases 0.000 description 1
- 206010063057 Cystitis noninfective Diseases 0.000 description 1
- 102000053602 DNA Human genes 0.000 description 1
- 230000004544 DNA amplification Effects 0.000 description 1
- 238000000018 DNA microarray Methods 0.000 description 1
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 1
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 1
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102100031181 Glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase Human genes 0.000 description 1
- 108091027305 Heteroduplex Proteins 0.000 description 1
- 101150016456 Hexa gene Proteins 0.000 description 1
- 101100334738 Homo sapiens FGFR3 gene Proteins 0.000 description 1
- 101001067140 Homo sapiens Porphobilinogen deaminase Proteins 0.000 description 1
- 101100313319 Homo sapiens TERT gene Proteins 0.000 description 1
- 206010027476 Metastases Diseases 0.000 description 1
- 101710195305 Nuclear transition protein 2 Proteins 0.000 description 1
- 108091005461 Nucleic proteins Proteins 0.000 description 1
- 108091034117 Oligonucleotide Proteins 0.000 description 1
- 208000031481 Pathologic Constriction Diseases 0.000 description 1
- 102000035195 Peptidases Human genes 0.000 description 1
- 108091005804 Peptidases Proteins 0.000 description 1
- 102100034391 Porphobilinogen deaminase Human genes 0.000 description 1
- 238000012300 Sequence Analysis Methods 0.000 description 1
- DWAQJAXMDSEUJJ-UHFFFAOYSA-M Sodium bisulfite Chemical compound [Na+].OS([O-])=O DWAQJAXMDSEUJJ-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 108010017842 Telomerase Proteins 0.000 description 1
- 102000040945 Transcription factor Human genes 0.000 description 1
- 108091023040 Transcription factor Proteins 0.000 description 1
- 208000000014 Ureteral Calculi Diseases 0.000 description 1
- 208000023915 Ureteral Neoplasms Diseases 0.000 description 1
- 208000004608 Ureteral Obstruction Diseases 0.000 description 1
- 206010046392 Ureteric cancer Diseases 0.000 description 1
- 208000006568 Urinary Bladder Calculi Diseases 0.000 description 1
- 206010046528 Urinary bladder haemorrhage Diseases 0.000 description 1
- 206010061397 Urinary tract injury Diseases 0.000 description 1
- 230000006578 abscission Effects 0.000 description 1
- 238000007605 air drying Methods 0.000 description 1
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 description 1
- BBFQZRXNYIEMAW-UHFFFAOYSA-N aristolochic acid I Chemical compound C1=C([N+]([O-])=O)C2=C(C(O)=O)C=C3OCOC3=C2C2=C1C(OC)=CC=C2 BBFQZRXNYIEMAW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 208000032908 autosomal dominant 2 dyskeratosis congenita Diseases 0.000 description 1
- 201000000123 autosomal dominant dyskeratosis congenita 2 Diseases 0.000 description 1
- 201000000152 autosomal recessive dyskeratosis congenita 4 Diseases 0.000 description 1
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 1
- 238000007664 blowing Methods 0.000 description 1
- 231100000357 carcinogen Toxicity 0.000 description 1
- 239000003183 carcinogenic agent Substances 0.000 description 1
- 239000000969 carrier Substances 0.000 description 1
- 201000009856 cataract 30 Diseases 0.000 description 1
- 230000006037 cell lysis Effects 0.000 description 1
- 230000002759 chromosomal effect Effects 0.000 description 1
- 238000003759 clinical diagnosis Methods 0.000 description 1
- 230000000295 complement effect Effects 0.000 description 1
- 201000003146 cystitis Diseases 0.000 description 1
- CTMZLDSMFCVUNX-VMIOUTBZSA-N cytidylyl-(3'->5')-guanosine Chemical compound O=C1N=C(N)C=CN1[C@H]1[C@H](O)[C@H](OP(O)(=O)OC[C@@H]2[C@H]([C@@H](O)[C@@H](O2)N2C3=C(C(N=C(N)N3)=O)N=C2)O)[C@@H](CO)O1 CTMZLDSMFCVUNX-VMIOUTBZSA-N 0.000 description 1
- 230000007547 defect Effects 0.000 description 1
- 238000002405 diagnostic procedure Methods 0.000 description 1
- 238000007847 digital PCR Methods 0.000 description 1
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 1
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 1
- 239000012149 elution buffer Substances 0.000 description 1
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 1
- 238000009585 enzyme analysis Methods 0.000 description 1
- 238000002509 fluorescent in situ hybridization Methods 0.000 description 1
- 238000001502 gel electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 108020004445 glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase Proteins 0.000 description 1
- 239000011544 gradient gel Substances 0.000 description 1
- 102000055709 human FGFR3 Human genes 0.000 description 1
- 102000048808 human ONECUT2 Human genes 0.000 description 1
- 238000009396 hybridization Methods 0.000 description 1
- 239000012535 impurity Substances 0.000 description 1
- 239000003317 industrial substance Substances 0.000 description 1
- 208000014674 injury Diseases 0.000 description 1
- 238000009830 intercalation Methods 0.000 description 1
- 238000007169 ligase reaction Methods 0.000 description 1
- 230000004807 localization Effects 0.000 description 1
- 230000007774 longterm Effects 0.000 description 1
- 210000004995 male reproductive system Anatomy 0.000 description 1
- 230000003211 malignant effect Effects 0.000 description 1
- 208000020984 malignant renal pelvis neoplasm Diseases 0.000 description 1
- 238000004949 mass spectrometry Methods 0.000 description 1
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 1
- 238000011880 melting curve analysis Methods 0.000 description 1
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 1
- 230000009401 metastasis Effects 0.000 description 1
- 210000000754 myometrium Anatomy 0.000 description 1
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 description 1
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 description 1
- 238000004806 packaging method and process Methods 0.000 description 1
- 201000010198 papillary carcinoma Diseases 0.000 description 1
- 230000001575 pathological effect Effects 0.000 description 1
- 230000035755 proliferation Effects 0.000 description 1
- 235000019833 protease Nutrition 0.000 description 1
- 238000012175 pyrosequencing Methods 0.000 description 1
- 239000002096 quantum dot Substances 0.000 description 1
- 238000007430 reference method Methods 0.000 description 1
- 201000007444 renal pelvis carcinoma Diseases 0.000 description 1
- 238000012552 review Methods 0.000 description 1
- 150000003839 salts Chemical class 0.000 description 1
- 238000012163 sequencing technique Methods 0.000 description 1
- 235000010267 sodium hydrogen sulphite Nutrition 0.000 description 1
- 239000002904 solvent Substances 0.000 description 1
- 230000036262 stenosis Effects 0.000 description 1
- 208000037804 stenosis Diseases 0.000 description 1
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 1
- 208000024891 symptom Diseases 0.000 description 1
- 230000008733 trauma Effects 0.000 description 1
- 229940035893 uracil Drugs 0.000 description 1
- 201000011294 ureter cancer Diseases 0.000 description 1
- 210000003932 urinary bladder Anatomy 0.000 description 1
- 208000023747 urothelial carcinoma Diseases 0.000 description 1
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
- C12Q1/6876—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes
- C12Q1/6883—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for diseases caused by alterations of genetic material
- C12Q1/6886—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for diseases caused by alterations of genetic material for cancer
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
- C12Q2600/118—Prognosis of disease development
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
- C12Q2600/154—Methylation markers
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
- C12Q2600/156—Polymorphic or mutational markers
Landscapes
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Immunology (AREA)
- Pathology (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Zoology (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Hospice & Palliative Care (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Oncology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
Abstract
本申请涉及生物医药领域,具体的涉及一种尿路上皮癌的基因标志物组合、检测方法、试剂盒及检测模型。本申请采用一种试剂组合用于确认尿路上皮癌是否存在、评估尿路上皮癌发生风险和/或评估尿路上皮癌的预后/进展,所述试剂组合包含能够检测待测样本中VIM基因和ONECUT2基因所在的DNA区域或其片段的甲基化水平,以及TERT和FGFR3的基因突变的试剂。
Description
技术领域
本申请涉及生物医药领域,具体的涉及一种尿路上皮癌的检测方法、试剂盒及检测模型。
背景技术
众多癌症中,泌尿系统肿瘤发病率在逐年增高,因此目前对泌尿系统肿瘤精准诊疗需求也进一步扩大。尿路上皮癌(UC)包括上尿路尿路上皮癌(UTUC)和下尿路尿路上皮癌(主要是膀胱癌,BC),存在发病率高、多点原发、术后容易复发等特点。临床上目前常用的膀胱癌检查方法有膀胱镜检查(可对疑似病变组织进行活检)、尿脱落细胞学检测、影像学检查以及荧光原位杂交等。
临床对于UC诊断以及治疗后监测主要依赖影像学、尿液检测以及内镜检查和活检。传统影像检查对于病灶微小或形态不典型,导致定位以及定性诊断困难。尿液检测作为重要的助诊手段在临床中广泛使用,但均存在一定的不足,例如尿液脱落细胞学和FISH检查均存在敏感性和特异性相对不高的局限性,尚无法替代镜检以及活检。内镜(输尿管镜检/膀胱镜)联合活检作为尿路上皮肿瘤诊断以及复查的金标准,但因其有创性且成本相对较高,患者依从性较差,使得在部分患者身上难以发现早期肿瘤及肿瘤复发,因而错失治疗时机。
在临床实践中,UC的早诊及监控效果仍不佳。例如:CT检查肌层浸润性膀胱癌(MIBC)准确率仅54.9%;尿脱落细胞学检查和荧光原位杂交(FISH)检测灵敏度低且易受到泌尿系统感染、膀胱炎症、结石以及血尿的影响;膀胱镜是膀胱癌确诊的金标准,但因其有创的缺点,导致患者存在心理抗拒,使该方法的依从性无法保证,且原位癌在膀胱镜下不易发现并且易与膀胱炎性改变混淆,需活检确诊。
上尿路尿路上皮癌(UTUC)的早期诊断仍然存在很大困难。高度怀疑UTUC而影像学检查无法明确时,输尿管镜检查可直接观察到肿瘤并可进行活检。但镜检受肿瘤位置、角度的影响,导致常规输尿管硬镜常无法进入肿瘤部位,而无法诊断肿瘤;输尿管梗阻同样会影响镜检结果,导致镜检无法分辨梗阻原因,引起梗阻的原因包含输尿管结石、肾盂输尿管连接处狭窄、输尿管恶性肿瘤。同时,输尿管镜检查本身也存在一定的问题,除了输尿管镜本身存在的创伤、感染风险之外,输尿管镜检查之后周围组织渗出粘连的几率明显增加,根治手术难度会增加,不宜轻易开展。
因此,提供一种无创的、敏感性和特异性高的准确进行尿路上皮癌的早期诊断以及预后效果的检测产品是必要的。
发明内容
为了提高尿路上皮癌早期诊断的敏感性和特异性,以实现准确早期诊断尿路上皮癌以及复发监控,本申请提供一种确认尿路上皮癌是否存在、评估尿路上皮癌发生风险和/或评估尿路上皮癌的预后/进展的方法,以及相应的检测试剂盒和/或检测模型。
本申请以特殊选定的突变位点以及甲基化基因片段为检测指标来进行尿路上皮癌早期诊断以及预后效果判定。首先,本申请的检测方法以尿液gDNA为模板作为初始样本进行检测,是一种无创的检测方法,有效避免了泌尿男生殖系统感染、尿道及膀胱出血、尿道损伤和尿道狭窄等并发症的发生,并且容易实施,可以居家检测。其次,常规的尿液细胞学检测的敏感度不够,有假阴性的风险,尤其G1级(G1级,高分化乳头状癌)和低级别肿瘤的敏感性为16%:单纯甲基化或者突变marker的检测试剂盒有漏检的风险;而本申请的检测方法将点突变和甲基化多组学并用,有效利用有限样本内的多重信息,可有效区分尤其是早期肿瘤,具有灵敏度和特异性高的优点;另外本申请的检测方法得到数据结果快速,例如利用荧光定量PCR法,有利于患者及时接受后续治疗。本申请的方法、试剂盒和/或检测模型具有灵敏度和特异性高的优点
一方面,本申请提供了一种确认尿路上皮癌是否存在、评估尿路上皮癌发生风险和/或评估尿路上皮癌的预后/进展的方法,包含检测待测样本中VIM基因所在的DNA区域或其片段的甲基化水平,以及选自TERT和FGFR3中一种或多种基因的基因突变。
一方面,本申请提供了一种确认尿路上皮癌是否存在、评估尿路上皮癌发生风险和/或评估尿路上皮癌的预后/进展的方法,包含检测待测样本中VIM基因所在的DNA区域或其片段的甲基化水平,ONECUT2基因所在的DNA区域或其片段的甲基化水平,以及选自TERT和FGFR3中一种或多种基因的基因突变。在某些实施方式中,所述待测样本来自肿瘤患者、肿瘤疑似患者、肿瘤易感人群、肿瘤高危人群或健康人群。
在某些实施方式中,所述肿瘤患者包括未经过抗癌疗法治疗后的患者和/或经过抗癌疗法治疗后的患者。
在某些实施方式中,所述待测样本包含组织、细胞和/或体液。
在某些实施方式中,所述待测样本包含尿液。
在某些实施方式中,TERT的基因突变包括选自C250T和C228T中的一种或多种。本申请中提到的TERT C250T点突变,位于TERT基因ATG起始位点上游146 bp处,在本领域中也可以被称为Chr5:1295250 C>T(GRCh37)或“c.-146C>T”,TERT C228T点突变,位于TERT基因ATG起始位点上游124 bp处,在本领域也可以被称为Chr5:1295228 C >T(GRCh37)或“c.-124C>T”。
在某些实施方式中,FGFR3的基因突变包括选自R248C和S249C 中的一种或多种。本申请中提到的FGFR3 R248C点突变时,在本领域中也可被称为Chr4: 1803564 C>T(GRCh37),或“NM_000142(FGFR3):c.742C>T (p.R248C)”,本申请中提到的FGFR3 S249C点突变时,在本领域中也可被称为Chr4: 1803568 C>G(GRCh37),或NM_000142(FGFR3):c.746C>G (p.S249C)”。
在某些实施方式中,所述VIM基因所在DNA区域包含chr10:17270951-17271151、chr10:17271330-17271493、chr10:17271498-17271632和/或chr10:17272405-17272436。
在某些实施方式中,所述方法包括获取所述待测样本中的核酸。
在某些实施方式中,所述方法包括转化所述核酸,使得具有甲基化的碱基以及不具有甲基化的碱基在转化后形成不同的物质。
在某些实施方式中,所述转化包括通过脱氨基试剂和/或甲基化敏感限制性内切酶转化。
在某些实施方式中,所述脱氨基试剂包含亚硫酸氢盐。
在某些实施方式中,所述方法包括将所述待测样本与能够特异性识别和/或结合所述VIM基因所在的DNA区域或其片段,和/或所述基因突变的试剂接触。
在某些实施方式中,所述试剂包括能够特异性识别和/或结合所述VIM基因所在的DNA区域或其片段的引物和/或探针。
在某些实施方式中,所述引物和/或探针包括SEQ ID NO. 13-27中任一项所示的核酸序列。
在某些实施方式中,所述方法还包括检测待测样本中ONECUT2基因所在DNA区域或其片段的甲基化水平。
在某些实施方式中,所述ONECUT2基因所在DNA区域包含chr18:55107803-55107828、chr18:55108590-55108672、chr18:55108794-55108826和/或chr18:55109012-55109014。
在某些实施方式中,所述方法包括将所述待测样本与能够特异性识别和/或结合所述ONECUT2基因所在的DNA区域或其片段的试剂接触。
在某些实施方式中,所述试剂包括能够特异性识别和/或结合所述ONECUT2基因所在的DNA区域或其片段的引物和/或探针。
在某些实施方式中,所述引物和/或探针包括SEQ ID NO. 1-12中任一项所示的核酸序列。
在某些实施方式中,所述方法包括将所述待测样本与能够特异性识别和/或结合TERT基因突变的试剂接触。
在某些实施方式中,所述试剂包括能够特异性识别和/或结合TERT基因突变C250T的引物和/或探针。
在某些实施方式中,所述引物和/或探针包括SEQ ID NO. 29-31中任一项所示的核酸序列。
在某些实施方式中,所述试剂包括能够特异性识别和/或结合TERT基因突变C228T的引物和/或探针。
在某些实施方式中,所述引物和/或探针包括SEQ ID NO. 28、30和31中任一项所示的核酸序列。
在某些实施方式中,所述方法包括将所述待测样本与能够特异性识别和/或结合FGFR3基因突变的试剂接触。
在某些实施方式中,所述试剂包括能够特异性识别和/或结合FGFR3基因突变R248C的引物和/或探针。
在某些实施方式中,所述引物和/或探针包括SEQ ID NO. 32、34和35中任一项所示的核酸序列。
在某些实施方式中,所述试剂包括能够特异性识别或结合FGFR3基因突变S249C的引物和/或探针。
在某些实施方式中,所述引物和/或探针包括SEQ ID NO. 33-35中任一项所示的核酸序列。
在某些实施方式中,所述方法还包括将所述待测样本与能够特异性结合参照基因所在的DNA区域或其片段的试剂接触。
在某些实施方式中,所述参照基因为ACTB基因。
在某些实施方式中,所述能够特异性结合参照基因所在的DNA区域或其片段的试剂包括引物和/或探针,且所述引物和/或探针包括SEQ ID NO. 39-44中任一项所示的核酸序列。
在某些实施方式中,所述引物和/或探针的总浓度为2-15μM。
在某些实施方式中,所述检测包括使用荧光PCR,得到荧光Ct值。在某些实施方式中,如果检测到所述待测样本中一种或多种甲基化水平为阳性,或一种或多种基因突变为阳性,则认为检测结果为阳性;如果检测到所述待测样本中甲基化水平均为阴性,以及基因突变均为阴性,则认为检测结果为阴性。
另一方面,本申请提供了用于确认尿路上皮癌是否存在、评估尿路上皮癌形成风险和/或评估尿路上皮癌的进展的试剂组合,所述试剂组合包含能够检测待测样本中VIM基因所在的DNA区域或其片段的甲基化水平的试剂,以及能够检测选自TERT和FGFR3中一种或多种基因的基因突变的试剂。
另一方面,本申请提供了用于确认尿路上皮癌是否存在、评估尿路上皮癌形成风险和/或评估尿路上皮癌的进展的试剂组合,所述试剂组合包含能够检测待测样本中VIM基因所在的DNA区域或其片段的甲基化水平的试剂、ONECUT2基因所在的DNA区域或其片段的甲基化水平的试剂,以及能够检测选自TERT和FGFR3中一种或多种基因的基因突变的试剂。
在某些实施方式中,所述待测样本来自肿瘤患者、肿瘤疑似患者、肿瘤易感人群、肿瘤高危人群或健康人群。
在某些实施方式中,所述肿瘤患者包括未经过抗癌疗法治疗后的患者和/或经过抗癌疗法治疗后的患者。
在某些实施方式中,所述待测样本包含组织、细胞和/或体液。
在某些实施方式中,所述待测样本包含尿液。
在某些实施方式中,所述VIM基因所在DNA区域包含chr10:17270951-17271151、chr10:17271330-17271493、chr10:17271498-17271632和/或chr10:17272405-17272436。
在某些实施方式中,所述能够检测待测样本中VIM基因所在的DNA区域或其片段的甲基化水平的试剂包含能够特异性识别和/或结合所述VIM基因所在的DNA区域或其片段的引物和/或探针。
在某些实施方式中,所述能够特异性识别和/或结合所述VIM基因所在的DNA区域或其片段的引物和/或探针包含SEQ ID NO. 13-27中任一项所示的核酸序列。
在某些实施方式中,所述能够特异性识别和/或结合所述VIM基因所在的DNA区域或其片段的引物和/或探针包含选自以下任意一组:(1)引物:SEQ ID NO. 13-14,探针:SEQID NO. 15;(2)引物:SEQ ID NO. 16-17,探针:SEQ ID NO. 18;(3)引物:SEQ ID NO. 19-20,探针:SEQ ID NO. 21;(4)引物:SEQ ID NO. 22-23,探针:SEQ ID NO. 24;和(5)引物:SEQ ID NO. 25-26,探针:SEQ ID NO. 27。
在某些实施方式中,TERT的基因突变包括选自C250T和C228T中的一种或多种。
在某些实施方式中,所述试剂组合包含能够特异性识别和/或结合TERT基因突变C250T的引物和/或探针。
在某些实施方式中,所述能够特异性识别和/或结合TERT基因突变C250T的引物和/或探针包含SEQ ID NO. 29-31中任一项所示的核酸序列。
在某些实施方式中,所述试剂组合包含能够特异性识别和/或结合TERT基因突变C228T的引物和/或探针。
在某些实施方式中,所述能够特异性识别和/或结合TERT基因突变C228T的引物和/或探针包含SEQ ID NO. 28、30和31中任一项所示的核酸序列。
在某些实施方式中,FGFR3的基因突变包括选自R248C和S249C中的一种或多种。
在某些实施方式中,所述试剂组合包含能够特异性识别和/或结合FGFR3基因突变R248C的引物和/或探针。
在某些实施方式中,所述能够特异性识别和/或结合FGFR3基因突变R248C的引物和/或探针包含SEQ ID NO. 32、34和35中任一项所示的核酸序列。
在某些实施方式中,所述试剂组合包含能够特异性识别和/或结合FGFR3基因突变S249C的引物和/或探针。
在某些实施方式中,所述能够特异性识别和/或结合FGFR3基因突变S249C的引物和/或探针包含SEQ ID NO. 33-35中任一项所示的核酸序列。
在某些实施方式中,所述试剂组合还包括检测待测样本中ONECUT2基因所在DNA区域或其片段的甲基化水平。
在某些实施方式中,所述ONECUT2基因所在DNA区域包含chr18:55107803-55107828、chr18:55108590-55108672、chr18:55108794-55108826和/或chr18:55109012-55109014。
在某些实施方式中,所述能够检测待测样本中ONECUT2基因所在的DNA区域或其片段的甲基化水平的试剂包含能够特异性识别和/或结合所述ONECUT2基因所在的DNA区域或其片段的引物和/或探针。
在某些实施方式中,所述能够特异性识别和/或结合所述ONECUT2基因所在的DNA区域或其片段的引物和/或探针包含SEQ ID NO. 1-12中任一项所示的核酸序列。
在某些实施方式中,所述能够特异性识别和/或结合所述ONECUT2基因所在的DNA区域或其片段的引物和/或探针包含选自以下任意一组:(1)引物:SEQ ID NO. 1-2,探针:SEQ ID NO. 3;(2)引物:SEQ ID NO. 4-5,探针:SEQ ID NO. 6;(3)引物:SEQ ID NO. 7-8,探针:SEQ ID NO. 9;(4)引物:SEQ ID NO. 10-11,探针:SEQ ID NO. 12和引物:SEQ IDNO. 36-37,探针:SEQ ID NO. 38。
在某些实施方式中,所述试剂组合还包括能够特异性结合参照基因所在的DNA区域或其片段的试剂。
在某些实施方式中,所述参照基因为ACTB基因。
在某些实施方式中,所述能够特异性结合参照基因所在的DNA区域或其片段的试剂包括引物和/或探针,且所述引物和/或探针包括SEQ ID NO. 39-44中任一项所示的核酸序列。
在某些实施方式中,所述引物和/或探针的总浓度为2-15μM。
在某些实施方式中,所述试剂组合还包括脱氨基试剂和/或甲基化敏感限制性内切酶。
在某些实施方式中,所述脱氨基试剂包含亚硫酸氢盐。
另一方面,本申请提供了所述试剂组合在制备试剂盒中的用途。
另一方面,本申请提供了一种试剂盒,其包含所述试剂组合。
另一方面,本申请提供了一种确认尿路上皮癌是否存在、评估尿路上皮癌发生风险和/或评估尿路上皮癌的/预后进展的模型,所述模型基于所述试剂盒实施。
本领域技术人员能够从下文的详细描述中容易地洞察到本申请的其它方面和优势。下文的详细描述中仅显示和描述了本申请的示例性实施方式。如本领域技术人员将认识到的,本申请的内容使得本领域技术人员能够对所公开的具体实施方式进行改动而不脱离本申请所涉及发明的精神和范围。相应地,本申请的说明书中的描述仅仅是示例性的,而非为限制性的。
具体实施方式
以下由特定的具体实施例说明本申请发明的实施方式,熟悉此技术的人士可由本说明书所公开的内容容易地了解本申请发明的其他优点及效果。
术语定义
在本申请中,术语“VIM”通常是指编码波形蛋白(vimentin)的基因,也可称为CTRCT30或HEL113。人类VIM基因的位置在Chromosome 10: 17,270,258-17,279,592正向链(GRCh37:CM000672.1)。关于人类VIM基因的更多信息可参考ensemble号ENSG00000026025。
在本申请中,术语“ONECUT2”通常是指编码转录因子onecut家族成员2的基因。人类ONECUT2的位置在Chromosome 18: 55,102,917-55,158,529正向链(GRCh37:CM000680.1)。关于人类ONECUT2基因的更多信息可参考ensemble号ENSG00000119547。
在本申请中,术语“TERT”通常是指编码端粒酶逆转录酶的基因,也可称为CMM9、DKCA2、DKCB4、EST2、PFBMFT1、TCS1、TP2、TRT、hEST2或hTRT。人类TERT的位置在Chromosome5: 1,253,262-1,295,184反向链(GRCh37:CM000667.1)。关于人类TERT基因的更多信息可参考ensemble号ENSG00000164362。本申请中的涉及TERT基因的点突变,可以用一种或多种方式表示,例如,本申请中TERT基因常见的两个启动子突变分别位于ATG起始位点上游124bp和146bp处,包括Chr5:1295228 C>T(称为C228T,在本领域也可以被称为c.-124C>T)和Chr5:1295250 C>T(称为C250T,在本领域也可以被称为c.-146C>T)。
在本申请中,术语“FGFR3”通常是指编码成纤维细胞生长因子受体3的基因,也可称为ACH、CD333、CEK2、HSFGFR3EX或JTK4。人类FGFR3的位置在Chromosome 4: 1,795,034-1,810,599正向链(GRCh37:CM000666.1)。关于人类FGFR3基因的更多信息可参考ensemble号ENSG00000068078。本申请中的涉及FGFR3基因的点突变,可以用一种或多种方式表示,例如,本申请中提到的FGFR3 R248C点突变时,在本领域中也可被称为Chr4: 1803564 C>T(GRCh37),或“NM_000142(FGFR3):c.742C>T (p.R248C)”,本申请中提到的FGFR3 S249C点突变时,在本领域中也可被称为Chr4: 1803568 C>G(GRCh37),或NM_000142(FGFR3):c.746C>G (p.S249C)”。
在本申请中,术语“待测样本”通常是指需要进行检测的样本。例如,可以检测待测样本上的一个或者多个基因区域是否存在有修饰状态,或者是否存在突变。
在本申请中,术语“健康人群”通常是指通过肿瘤检测方法目前检测不到肿瘤的人群。健康人群可以发展为肿瘤患者、肿瘤高危人群、肿瘤疑似患者或肿瘤易感人群。“健康人群”是相对于“肿瘤患者”的概念,“肿瘤患者”通常是指经过病理诊断等检测方法确认为患有肿瘤的人群。
在本申请中,术语“肿瘤高危人群”通常是指具有较高风险发展产生肿瘤的人群。例如,具有肿瘤患病家族史的人群、携带肿瘤易感基因的人群、不健康生活方式(如吸烟、酗酒者、常熬夜等)人群、生活或工作环境中常接触有毒有害物质的人群。
在本申请中,术语“肿瘤疑似患者”通常是指具有肿瘤症状,但未经过病理诊断等检测方法确认为患有肿瘤的人群。
在本申请中,术语“肿瘤易感人群”通常是指容易发生肿瘤的人群。例如,具有肿瘤患病家族史的人群、携带肿瘤易感基因的人群、不健康生活方式(如吸烟、酗酒者、常熬夜等)人群、生活或工作环境中常接触有毒有害物质的人群。
对于尿路上皮癌,例如,膀胱癌,所述肿瘤易感人群或肿瘤高危人群,可以包括但不限于以下人群:临床诊断不明患者、尿路上皮癌高危人群(年龄>50岁;长期吸烟者;长期接触工业化学产品等致癌物的人群;具有膀胱癌家族史的人群;以及,摄入马兜铃酸中草药者。
在本申请中,术语“DNA区域”通常是指两个或更多个共价键合的天然存在的或经修饰的脱氧核糖核苷酸的序列。例如,基因的DNA区域可以是指该基因所位于的特定的脱氧核糖核苷酸的序列的位置,例如该脱氧核糖核苷酸的序列编码所述基因。例如,本申请的DNA区域包含DNA区域的全长、其互补区域,或者上述的片段。例如,本申请所提供的检测区域的上下游至少约20kb的序列可以作为检测的位点。例如,本申请所提供的检测区域的上下游至少约20kb、至少约15kb、至少约10kb、至少约5kb、至少约3kb、至少约2kb、至少约1kb、或至少约0.5kb的序列可以作为检测的位点。例如,可以根据所述位点设计合适的引物和探针进行样品的甲基化检测。在本申请中,当说到DNA区域或提到碱基位置时,如果没有特别说明,通常是指人类参考基因组版本GRCh37,UCSC对应版本号hg19。
在本申请中,术语“甲基化”通常是指本申请中基因片段、核苷酸或其碱基具有的甲基化状态。例如,本申请中基因所在的DNA片段可以在一条链或多条链上具有甲基化。例如,本申请中基因所在的DNA片段可以在一个位点或多个位点上具有甲基化。例如,甲基化可以指DNA序列上CpG岛的二核苷酸5′端胞嘧啶转变为5′甲基胞嘧啶(5mC),还可以包含形成N6-甲基嘌呤(N6-mA)及7-甲基鸟嘌呤(7-mG)
在本申请中,术语“转化”通常是指将一种或多种结构转变为另一种结构。例如,本申请的转化可以是具有特异性。例如,不具有甲基化修饰的胞嘧啶经过转化可以变为其它结构(例如尿嘧啶),且具有甲基化修饰的胞嘧啶经过转化可以基本不发生变化。例如,不具有甲基化修饰的胞嘧啶经过转化可以被剪切,且具有甲基化修饰的胞嘧啶经过转化可以基本不发生变化。
在本申请中,术语“脱氨基试剂”通常是指具有移除氨基能力的物质。例如,脱氨基试剂可以将未修饰的胞嘧啶的氨基脱除。
在本申请中,术语“亚硫酸氢盐”通常是指一种可以区分具有修饰状态和不具有修饰状态的DNA区域的试剂。例如,亚硫酸氢盐可以包括亚硫酸氢盐、或其类似物或上述的组合。例如,亚硫酸氢盐可以使未修饰的胞嘧啶的氨基脱氨基化,以使其与修饰的胞嘧啶区分。在本申请中,术语“类似物”通常是指具有类似结构和/或功能的物质。例如亚硫酸氢盐的类似物可以与亚硫酸氢盐具有类似的结构。例如,亚硫酸氢盐的类似物可以是指一种同样可以区分具有修饰状态和不具有修饰状态的DNA区域的试剂。
在本申请中,术语“甲基化敏感限制性内切酶”通常是指一种根据其识别位点的甲基化状态而选择性消化核酸的酶。例如,对于当识别位点未被甲基化时才特异剪切的限制性内切酶来说,当识别位点被甲基化时,可以不会发生剪切,或以显著降低的效率剪切。对于当识别位点被甲基化时才特异剪切的限制性内切酶来说,当识别位点未被甲基化时,可以不会发生剪切,或以显著降低的效率剪切。例如,甲基化特异的限制性内切酶可以识别含有CG二核苷酸(例如cgcg或cccggg)的序列。
在本申请中,术语“尿路上皮癌”通常是指与尿路上皮细胞恶性增殖有关的癌症。尿路上皮癌可以包括上尿路尿路上皮癌(UTUC,例如,肾盂癌和输尿管癌)和下尿路尿路上皮癌(例如,膀胱癌)。尿路上皮癌可以发生在肾盂、输尿管或膀胱。
在本申请中,术语“进展”通常是指疾病从不太严重状态到较严重状态的变化。例如,肿瘤进展可以包括肿瘤的数量或严重性、癌细胞转移程度、癌症生长或扩散的速度等增大。例如,肿瘤进展可以包括这种癌症从不太严重状态到较严重状态的阶段时期,例如从I期到II期、从II期到III期等的进展。
在本申请中,术语“发生”通常是指个体体内出现病灶。例如,当肿瘤发生时,可以将该个体确诊为肿瘤患者。
在本申请中,术语“荧光PCR”通常是指一种定量或半定量的PCR技术。例如,可以是实时定量聚合酶链反应、定量聚合酶链反应或动力学聚合酶链反应的PCR技术。例如,可以利用PCR扩增并借助嵌入性荧光染料或序列特异性探针定量检测起始的靶核酸量,所述序列特异性探针可以含有仅与靶核酸杂交才可检出的荧光报道分子。
在本申请中,术语“PCR扩增”通常是指聚合酶链扩增反应。例如,本申请中的PCR扩增可以包含目前已知的用于DNA扩增的任意聚合酶链扩增反应。
在本申请中,术语“荧光Ct值”通常是指一种定量或半定量评估靶核酸的测量值。例如,可以是指荧光信号到达设定的阈值时所经历的扩增反应循环数。
发明详述
基因标志物组合
本申请提供了一种基因标志物组合,所述基因标志物组合可用于确认尿路上皮癌是否存在、评估尿路上皮癌发生风险和/或评估尿路上皮癌的预后/进展。由此,本申请提供了一种检测确认尿路上皮癌是否存在、评估尿路上皮癌发生风险和/或评估尿路上皮癌的预后/进展的方法。所述方法可用于尿路上皮癌早期诊断和/或复发监控。本申请还提供了检测该基因标志物组合的试剂组合,以及包含该试剂组合的试剂盒。
本申请的发明人发现,通过检测待测样本中VIM基因的甲基化水平和TERT的点突变,能以高灵敏度和特异性确认尿路上皮癌是否存在、评估尿路上皮癌发生风险和/或评估尿路上皮癌的预后/进展。
在本申请中,所述基因标志物组合包含VIM基因所在的DNA区域或其片段的甲基化水平,以及选自下表2的一种或多种基因的基因突变,例如,选自下表的1种突变、2种突变、3种突变、4种突变、5种突变或更多。在某些实施方式中,所述包含VIM基因所在的DNA区域或其片段的甲基化水平,以及选自下组的一种或多种基因的基因突变:TERT、FGFR和下表2列出的其他基因突变,例如,选自下表的下表2列出的1种其他突变、2种其他突变、3种其他突变、4种其他突变或更多。
在本申请中,所述基因标志物组合可以包含VIM基因所在的DNA区域或其片段的甲基化水平。在本申请中,所述VIM基因所在的DNA区域可以为chr10: 17,270,258-17,279,592。例如,所述VIM基因所在的DNA区域可以为chr10:17,271,345-17,271,493,或其上下游各延长约100bp的区域。例如,所述VIM基因所在的DNA区域可以为chr10: 17,271,051-17,271,051,或其上下游各延长约100bp的区域。例如,所述VIM基因所在的DNA区域可以为chr10: 17,270,951-17,271,151,或其上下游各延长约100bp的区域。例如,所述VIM基因所在的DNA区域可以为chr10: 17,272,405-17,272,436,或其上下游各延长约100bp的区域。例如,所述VIM基因所在的DNA区域可以为chr10: 17,271,498-17,271,632,或其上下游各延长约100bp的区域。可以通过检测VIM基因所在的DNA区域的甲基化水平来确认尿路上皮癌是否存在、评估尿路上皮癌发生风险和/或评估尿路上皮癌的预后/进展。如果VIM基因所在的DNA区域的甲基化水平为阳性,则可以认为尿路上皮癌存在、尿路上皮癌发生风险高和/或尿路上皮癌的复发风险大。
在本申请中,所述基因标志物组合可以包含TERT基因突变,例如,TERT启动子突变。TERT启动子突变可包含位于C228和/或C250的点突变。例如,TERT基因突变可包含C228T点突变。又例如,TERT基因突变可包含C250T点突变。可以通过检测TERT基因突变是否存在来确认尿路上皮癌是否存在、评估尿路上皮癌发生风险和/或评估尿路上皮癌的预后/进展。如果检测到待测样本中存在TERT基因突变,特别是存在TERT C228T和/或TERT C250T点突变,则可以认为尿路上皮癌存在、尿路上皮癌发生风险高和/或尿路上皮癌的复发风险大。
在本申请中,所述基因标志物组合可以包含FGFR3基因突变,例如,FGFR3基因突变。FGFR3基因突变可包含引起R248C和/或S249C氨基酸突变的基因突变。例如,FGFR3基因突变可包含引起R248C的点突变,例如,C742T点突变。例如,FGFR3基因突变可包含引起S249C的点突变,例如,C746G点突变。可以通过检测FGFR3基因突变是否存在来确认尿路上皮癌是否存在、评估尿路上皮癌发生风险和/或评估尿路上皮癌的预后/进展。如果检测到待测样本中存在FGFR3基因突变,特别是存在R248C和/或S249C突变,则可以认为尿路上皮癌存在、尿路上皮癌发生风险高和/或尿路上皮癌的复发风险大。
在本申请中,所述基因标志物组合可以包含ONECUT2基因所在的DNA区域或其片段的甲基化水平。在本申请中,所述ONECUT2基因所在的DNA区域可以为chr 18: 55,102,917-55,158,529。例如,所述ONECUT2基因所在的DNA区域可以为chr18: 55,107,803-55,107,828,或其上下游各延长约100bp的区域。例如,所述ONECUT2基因所在的DNA区域可以为chr18: 55,108,590-55,108,672,或其上下游各延长约100bp的区域。例如,所述ONECUT2基因所在的DNA区域可以为chr18: 55,109,012-55,109,014,或其上下游各延长约100bp的区域。例如,所述ONECUT2基因所在的DNA区域可以为chr18: 55,108,794-55,108,826,或其上下游各延长约100bp的区域。可以通过检测ONECUT2基因所在的DNA区域的甲基化水平来确认尿路上皮癌是否存在、评估尿路上皮癌发生风险和/或评估尿路上皮癌的预后/进展。如果VIM基因所在的ONECUT2区域的甲基化水平为阳性,则可以认为尿路上皮癌存在、尿路上皮癌发生风险高和/或尿路上皮癌的复发风险大。
本申请通过检测上述基因标志物的组合来确认尿路上皮癌是否存在、评估尿路上皮癌发生风险和/或评估尿路上皮癌的预后/进展。
在一个具体的实施方式中,所述基因标志物组合可以包含所述VIM基因所在的DNA区域或其片段的甲基化水平,以及选自下组的一种或多种点突变:TERT C228T、TERTC250T、FGFR3 R248C和FGFR3 S249C,例如二种、三种或四种点突变。
在一个具体的实施方式中,所述基因标志物组合可以包含所述VIM基因所在的DNA区域或其片段的甲基化水平,以及选自下组的任意一种点突变:TERT C228T、TERT C250T、FGFR3 R248C和FGFR3 S249C。
在一个具体的实施方式中,所述基因标志物组合可以包含VIM基因所在的DNA区域或其片段的甲基化水平和TERT启动子点突变。
在一个具体的实施方式中,所述基因标志物组合可以包含VIM基因所在的DNA区域或其片段的甲基化水平和TERT C228T点突变。
在一个具体的实施方式中,所述基因标志物组合可以包含所述VIM基因所在的DNA区域或其片段的甲基化水平和所述TERT C250T点突变。
在一个具体的实施方式中,所述基因标志物组合可以包含所述VIM基因所在的DNA区域或其片段的甲基化水平和所述FGFR3 R248C点突变。
在一个具体的实施方式中,所述基因标志物组合可以包含所述VIM基因所在的DNA区域或其片段的甲基化水平和所述FGFR3 S249C点突变。
在一个具体的实施方式中,所述基因标志物组合可以包含所述VIM基因所在的DNA区域或其片段的甲基化水平、所述FGFR3点突变和所述FGFR3点突变。
在一个具体的实施方式中,所述基因标志物组合可以包含所述VIM基因所在的DNA区域或其片段的甲基化水平,以及选自下组的任意二种点突变:TERT C228T、TERT C250T、FGFR3 R248C和FGFR3 S249C。
在一个具体的实施方式中,所述基因标志物组合可以包含所述VIM基因所在的DNA区域或其片段的甲基化水平、所述TERT C228T点突变和所述FGFR3 S248C点突变。
在一个具体的实施方式中,所述基因标志物组合可以包含所述VIM基因所在的DNA区域或其片段的甲基化水平、所述TERT C250T点突变和所述FGFR3 R249C点突变。
在一个具体的实施方式中,所述基因标志物组合可以包含所述VIM基因所在的DNA区域或其片段的甲基化水平,以及选自下组的任意三种点突变:TERT C228T、TERT C250T、FGFR3 R248C和FGFR3 S249C。
在一个具体的实施方式中,所述基因标志物组合可以包含所述VIM基因所在的DNA区域或其片段的甲基化水平,以及以下四种点突变:TERT C228T、TERT C250T、FGFR3 R248C和FGFR3 S249C。
在一个具体的实施方式中,所述基因标志物组合可以包含所述VIM基因所在的DNA区域或其片段的甲基化水平、所述ONECUT2基因所在的DNA区域或其片段的甲基化水平,以及以下任意一种或多种点突变:TERT C228T、TERT C250T、FGFR3 R248C和FGFR3 S249C,例如,二种、三种或四种点突变。
在一个具体的实施方式中,所述基因标志物组合可以包含所述VIM基因所在的DNA区域或其片段的甲基化水平、所述ONECUT2基因所在的DNA区域或其片段的甲基化水平,以及以下任意一种点突变:TERT C228T、TERT C250T、FGFR3 R248C和FGFR3 S249C。
在一个具体的实施方式中,所述基因标志物组合可以包含所述VIM基因所在的DNA区域或其片段的甲基化水平、所述ONECUT2基因所在的DNA区域或其片段的甲基化水平,以及TERT C228T。
在一个具体的实施方式中,所述基因标志物组合可以包含所述VIM基因所在的DNA区域或其片段的甲基化水平、所述ONECUT2基因所在的DNA区域或其片段的甲基化水平,以及TERT C250T。
在一个具体的实施方式中,所述基因标志物组合可以包含所述VIM基因所在的DNA区域或其片段的甲基化水平、所述ONECUT2基因所在的DNA区域或其片段的甲基化水平,以及FGFR3 R248C。
在一个具体的实施方式中,所述基因标志物组合可以包含所述VIM基因所在的DNA区域或其片段的甲基化水平、所述ONECUT2基因所在的DNA区域或其片段的甲基化水平,以及FGFR3 S249C。
在一个具体的实施方式中,所述基因标志物组合可以包含所述VIM基因所在的DNA区域或其片段的甲基化水平、所述ONECUT2基因所在的DNA区域或其片段的甲基化水平,以及以下任意二种点突变:TERT C228T、TERT C250T、FGFR3 R248C和FGFR3 S249C。
在一个具体的实施方式中,所述基因标志物组合可以包含所述VIM基因所在的DNA区域或其片段的甲基化水平、所述ONECUT2基因所在的DNA区域或其片段的甲基化水平,以及TERT C228T和FGFR3 R248C。
在一个具体的实施方式中,所述基因标志物组合可以包含所述VIM基因所在的DNA区域或其片段的甲基化水平、所述ONECUT2基因所在的DNA区域或其片段的甲基化水平,以及TERT C250T和FGFR3 S249C。
在一个具体的实施方式中,所述基因标志物组合可以包含所述VIM基因所在的DNA区域或其片段的甲基化水平、所述ONECUT2基因所在的DNA区域或其片段的甲基化水平,以及以下任意三种点突变:TERT C228T、TERT C250T、FGFR3 R248C和FGFR3 S249C。
在一个具体的实施方式中,所述基因标志物组合可以包含所述VIM基因所在的DNA区域或其片段的甲基化水平、所述ONECUT2基因所在的DNA区域或其片段的甲基化水平,以及以下四种点突变:TERT C228T、TERT C250T、FGFR3 R248C和FGFR3 S249C。
本申请的发明人发现,通过检测待测样本中VIM基因的甲基化水平、ONECUT2基因的甲基化水平、TERT的点突变C250T和C228T,和FGFR3的点突变R248C和S249C,能以高灵敏度和特异性确认尿路上皮癌是否存在、评估尿路上皮癌发生风险和/或评估尿路上皮癌的预后/进展。
在一个实施方式中,本申请的试剂组合可以包含检测VIM的DNA区域chr10:17271330-17271493甲基化水平的试剂,检测ONECUT2的DNA区域chr18:55107803-55107828甲基化水平的试剂,检测TERT C228T点突变的试剂,检测TERT C250T点突变的试剂,检测FGFR3 R248C点突变的试剂,以及,检测FGFR3 S249C点突变的试剂。
基因标志物检测方法
检测基因所在的DNA区域或DNA区域片段的甲基化水平的方法为本领域技术人员熟知,包括但不限于:甲基化特异性PCR(MS-PCR)、亚硫酸氢盐转化测序(BS-Seq)、联合亚硫酸氢钠的限制性内切酶分析法、荧光定量法、甲基化敏感性高分辨率熔解曲线分析、焦磷酸测序、基于芯片的甲基化图谱分析、高通量测序、飞行质谱。
在一个具体的实施例中,可以使用,采用荧光定量法,根据待测基因(例如,VIM或ONECUT2)的CpG岛信息,结合荧光探针技术,设计针对待测基因甲基化的特异性引物和探针序列以检测甲基化水平。也可以使用引物和荧光染料进行检测。
例如,可以检测选自下组的一个或多个ONECUT2的DNA区域的甲基化水平:chr18:55107803-55107828、chr18:55108794-55108826、chr18:55108590-55108672和chr18:55109012-55109014。例如,至少可以检测一个上述DNA区域的甲基化水平。
例如,检测上述ONECUT2的DNA区域甲基化水平的引物可以包含SEQ ID NO. 1-2所示的核酸序列,探针可以包含SEQ ID NO. 3所示的核酸序列。
例如,检测上述ONECUT2的DNA区域甲基化水平的引物可以包含SEQ ID NO. 4-5所示的核酸序列,探针可以包含SEQ ID NO. 6所示的核酸序列。
例如,检测上述ONECUT2的DNA区域甲基化水平的引物可以包含SEQ ID NO. 7-8所示的核酸序列,探针可以包含SEQ ID NO. 9所示的核酸序列。
例如,检测上述ONECUT2的DNA区域甲基化水平的引物可以包含SEQ ID NO. 10-11所示的核酸序列,探针可以包含SEQ ID NO. 12所示的核酸序列。
例如,检测选自下组的一个或多个VIM的DNA区域的甲基化水平:chr10:17270951-17271151、chr10:17271330-17271493、chr10: 17271051-17271051、chr10:17272405-17272436和chr10: 17271498-17271632。例如,至少可以检测一个上述DNA区域的甲基化水平。
例如,检测上述VIM的DNA区域甲基化水平的引物可以包含SEQ ID NO. 13-14所示的核酸序列,探针可以包含SEQ ID NO. 15所示的核酸序列。
例如,检测上述VIM的DNA区域甲基化水平的引物可以包含SEQ ID NO. 16-17所示的核酸序列,探针可以包含SEQ ID NO. 18所示的核酸序列。
例如,检测上述VIM的DNA区域甲基化水平的引物可以包含SEQ ID NO. 19-20所示的核酸序列,探针可以包含SEQ ID NO. 21所示的核酸序列。
例如,检测上述VIM的DNA区域甲基化水平的引物可以包含SEQ ID NO. 22-23所示的核酸序列,探针可以包含SEQ ID NO. 24所示的核酸序列。
例如,检测上述VIM的DNA区域甲基化水平的引物可以包含SEQ ID NO. 25-26所示的核酸序列,探针可以包含SEQ ID NO. 27所示的核酸序列。
检测目标基因突变或点突变的方法为本领域技术人员熟知,例如,基于PCR技术的检测方法,包括但不限于:PCR-SSCP、异源双链分析法(HA)、突变体富集PCR、变形梯度凝胶电泳法(DGGE)、化学切割错配法(CCM)、等位基因特异性寡核苷酸分析法(ASO)、DNA芯片连接酶反应(LCR)、等位基因特异性扩增法、RNA酶A切割法、染色体原位杂交、荧光原位杂交技术、DNA序列分析、荧光定量PCR、数字PCR和/或高通量测序。例如,可以根据基因突变涉及引物,如多重特异性引物,使用荧光定量PCR进行检测。也可以使用引物和荧光标记的探针进行检测。
例如,可以检测TERT C228T点突变和/或TERT C250T点突变。
例如,检测TERT点突变的引物可以包含SEQ ID NO. 28和30所示的核酸序列,探针可以包含SEQ ID NO. 21所示的核酸序列。
例如,检测TERT点突变的引物可以包含SEQ ID NO. 29-30所示的核酸序列,探针可以包含SEQ ID NO. 21所示的核酸序列。
例如,可以检测FGFR3 R248C点突变和/或FGFR3 S249C点突变。
例如,检测FGFR3点突变的引物可以包含SEQ ID NO. 32和34所示的核酸序列,探针可以包含SEQ ID NO. 35所示的核酸序列。
例如,检测FGFR3点突变的引物可以包含SEQ ID NO. 33-34所示的核酸序列,探针可以包含SEQ ID NO. 35所示的核酸序列。
在本申请中,所述方法还包括以下一个或多个步骤:(1)获取所述待测样本中的核酸(例如,gDNA),(2)使用脱氨基试剂(例如,亚硫酸氢盐)转化所述核酸,(3)加入本申请所述的引物和/或探针组合,以及参照基因的引物和/或探针组合,(4)进行实时荧光定量PCR,和(5)得到值,分析结果。所述/>值可以为:甲基化片段的/>值=甲基化片段的Ct值-参照基因的Ct值,点突变的/>值=点突变的Ct值-参照基因的Ct值。所述参照基因(也可称为内参基因)可以包含ACTB基因(β-actin)、GAPDH、18S rRNA、28S rRNA、β2-MG和PBGD。例如,参照基因可以是ACTB基因。
在一个实施方式中,组合中各基因标志物的引物和/或探针浓度可以相同,也可以不同。例如,组合中基因标志物的引物和/或探针混合物的浓度可以为约2-15μM。又例如,浓度可以为组合中基因标志物的引物和/或探针混合物的浓度可以为约6-12μM。又例如,浓度可以为组合中基因标志物的引物和/或探针混合物的浓度可以为约9μM。
本申请包括检测待测样品中上述基因标志物组合的情况来确认尿路上皮癌是否存在、评估尿路上皮癌发生风险和/或评估尿路上皮癌的预后/进展。例如,根据各基因标志物的点突变的值,如果上述基因标志物组合中存在一个或多个阳性,则可以认为所述待测样本为阳性,可以认为该待测样本来源的受试者存在尿路上皮癌、尿路上皮癌发生风险高或尿路上皮癌复发风险高。例如,根据/>值判断各基因标志物是否为阳的方法可以是,甲基化片段的/>值小于某一数值时,认为检测结果为阳性,判定为该靶基因高甲基化,否则该靶基因低甲基化,或者,点突变的/>值小于某一数值时,认为检测结果为阳性,判定为该位点有突变,否则该位点无突变。与/>比较的数值可参考下表1。本领域技术人员也可以根据实际需求选择合适的判断数值。
表1
在本申请中,还可以通过打分模型计算所述待测样本的打分值,例如UC-Score值,判断所述待测样本的阴性或阳性。若样本UC-Score>0,则判断所述待测样本为阳性;若UC-Score≦0,则判断所述待测样本为阴性。本领域技术人员可以通过对样本库数据的分析得到合适的UC-Score打分模型。
另一方面,本申请提供了检测所述基因标志物组合的一种或多种试剂或试剂组合。所述一种或多种试剂可以包含引物和/或探针。
另一方面,本申请提供了所述一种或多种试剂或试剂组合在制备试剂盒中的用途。所述试剂盒可以包含检测所述基因标志物组合的引物和/或探针,以及任选地药学上可接受的溶剂、载体,和/或介绍使用方法的说明书等。在所述试剂盒中,检测各所述基因标志物引物和/或探针,以及其他所需的试剂可以置于同一容器中,也可以置于不同容器中。
另一方面,本申请提供了可以运行所述方法的程序。
另一方面,本申请提供了以下实施方式:
1.一种确认尿路上皮癌是否存在、评估尿路上皮癌发生风险和/或评估尿路上皮癌的预后/进展的方法,包含检测待测样本中VIM基因所在的DNA区域或其片段的甲基化水平,以及选自TERT和FGFR3中一种或多种基因的基因突变。
2.根据实施方式1所述的方法,其中所述待测样本来自肿瘤患者、肿瘤疑似患者、肿瘤易感人群、肿瘤高危人群或健康人群。
3.根据实施方式2所述的方法,其中所述肿瘤患者包括未经过抗癌疗法治疗后的患者和/或经过抗癌疗法治疗后的患者。
4.根据实施方式1-3中任一项所述的方法,其中所述待测样本包含组织、细胞和/或体液。
5.根据实施方式1-4中任一项所述的方法,其中所述待测样本包含尿液。
6.根据实施方式1-5中任一项所述的方法,其中TERT的基因突变包括选自C250T和C228T中的一种或多种。
7.根据实施方式1-6中任一项所述的方法,其中FGFR3的基因突变包括选自R248C和S249C 中的一种或多种。
8.根据实施方式1-7中任一项所述的方法,其中所述VIM基因所在DNA区域包含chr10:17270951-17271151、chr10:17271330-17271493、chr10:17271498-17271632和/或chr10:17272405-17272436。
9.根据实施方式1-8中任一项所述的方法,其中所述方法包括获取所述待测样本中的核酸。
10.根据实施方式9所述的方法,其中所述方法包括转化所述核酸,使得具有甲基化的碱基以及不具有甲基化的碱基在转化后形成不同的物质。
11.根据实施方式10所述的方法,其中所述转化包括通过脱氨基试剂和/或甲基化敏感限制性内切酶转化。
12.根据实施方式11所述的方法,其中所述脱氨基试剂包含亚硫酸氢盐。
13.根据实施方式1-12中任一项所述的方法,其中所述方法包括将所述待测样本与能够特异性识别和/或结合所述VIM基因所在的DNA区域或其片段,和/或所述基因突变的试剂接触。
14.根据实施方式13所述的方法,其中所述试剂包括能够特异性识别和/或结合所述VIM基因所在的DNA区域或其片段的引物和/或探针。
15.根据实施方式14所述的方法,其中所述引物和/或探针包括SEQ ID NO. 13-27中任一项所示的核酸序列。
16.根据实施方式1-13中任一项所述的方法,其还包括检测待测样本中ONECUT2基因所在DNA区域或其片段的甲基化水平。
17.根据实施方式16所述的方法,其中所述ONECUT2基因所在DNA区域包含chr18:55107803-55107828、chr18:55108590-55108672、chr18:55108794-55108826和/或chr18:55109012-55109014。
18.根据实施方式16-17中任一项所述的方法,其中所述方法包括将所述待测样本与能够特异性识别和/或结合所述ONECUT2基因所在的DNA区域或其片段的试剂接触。
19.根据实施方式18所述的方法,其中所述试剂包括能够特异性识别和/或结合所述ONECUT2基因所在的DNA区域或其片段的引物和/或探针。
20.根据实施方式19所述的方法,其中所述引物和/或探针包括SEQ ID NO. 1-12中任一项所示的核酸序列。
21.根据实施方式1-20中任一项所述的方法,其中所述方法包括将所述待测样本与能够特异性识别和/或结合TERT基因突变的试剂接触。
22.根据实施方式21所述的方法,其中所述试剂包括能够特异性识别和/或结合TERT基因突变C250T的引物和/或探针。
23.根据实施方式22所述的方法,其中所述引物和/或探针包括SEQ ID NO. 29-31中任一项所示的核酸序列。
24.根据实施方式21所述的方法,其中所述试剂包括能够特异性识别和/或结合TERT基因突变C228T的引物和/或探针。
25.根据实施方式24所述的方法,其中所述引物和/或探针包括SEQ ID NO. 28、30和31中任一项所示的核酸序列。
26.根据实施方式1-25中任一项所述的方法,其中所述方法包括将所述待测样本与能够特异性识别和/或结合FGFR3基因突变的试剂接触。
27.根据实施方式26所述的方法,其中所述试剂包括能够特异性识别和/或结合FGFR3基因突变R248C的引物和/或探针。
28.根据实施方式27所述的方法,其中所述引物和/或探针包括SEQ ID NO. 32、34和35中任一项所示的核酸序列。
29.根据实施方式26所述的方法,其中所述试剂包括能够特异性识别或结合FGFR3基因突变S249C的引物和/或探针。
30.根据实施方式29所述的方法,其中所述引物和/或探针包括SEQ ID NO. 33-35中任一项所示的核酸序列。
31.根据实施方式1-30中任一项所述的方法,其还包括将所述待测样本与能够特异性结合参照基因所在的DNA区域或其片段的试剂接触。
32.根据实施方式31所述的方法,其中所述参照基因为ACTB基因。
33.根据实施方式31-32中任一项所述的方法,其中所述能够特异性结合参照基因所在的DNA区域或其片段的试剂包括引物和/或探针,且所述引物和/或探针包括SEQ IDNO. 39-44中任一项所示的核酸序列。
34.根据实施方式1-33中任一项所述的方法,其中所述检测包括使用荧光PCR,得到荧光Ct值。
35.根据实施方式1-34中任一项所述的方法,其还包括:如果检测到所述待测样本中一种或多种甲基化水平为阳性,或一种或多种基因突变为阳性,则认为检测结果为阳性;如果检测到所述待测样本中甲基化水平均为阴性,以及基因突变均为阴性,则认为检测结果为阴性。
36.用于确认尿路上皮癌是否存在、评估尿路上皮癌形成风险和/或评估尿路上皮癌的进展的试剂组合,所述试剂组合包含能够检测待测样本中VIM基因所在的DNA区域或其片段的甲基化水平的试剂,以及能够检测选自TERT和FGFR3中一种或多种基因的基因突变的试剂。
37.根据实施方式36所述的试剂组合,其中所述待测样本来自肿瘤患者、肿瘤疑似患者、肿瘤易感人群、肿瘤高危人群或健康人群。
38.根据实施方式37所述的试剂组合,其中所述肿瘤患者包括未经过抗癌疗法治疗后的患者和/或经过抗癌疗法治疗后的患者。
39.根据实施方式36-38中任一项所述的试剂组合,其中所述待测样本包含组织、细胞和/或体液。
40.根据实施方式36-39中任一项所述的试剂组合,其中所述待测样本包含尿液。
41.根据实施方式36-40中任一项所述的试剂组合,其中所述VIM基因所在DNA区域包含chr10:17270951-17271151、chr10:17271330-17271493、chr10:17271498-17271632和/或chr10:17272405-17272436。
42.根据实施方式36-41中任一项所述的试剂组合,其中所述能够检测待测样本中VIM基因所在的DNA区域或其片段的甲基化水平的试剂包含能够特异性识别和/或结合所述VIM基因所在的DNA区域或其片段的引物和/或探针。
43.根据实施方式42所述的试剂组合,其中所述能够特异性识别和/或结合所述VIM基因所在的DNA区域或其片段的引物和/或探针包含SEQ ID NO. 13-27中任一项所示的核酸序列。
44.根据实施方式42-43中任一项所述的试剂组合,其中所述能够特异性识别和/或结合所述VIM基因所在的DNA区域或其片段的引物和/或探针包含选自以下任意一组核酸序列:
(1)引物:SEQ ID NO. 13-14,探针:SEQ ID NO. 15;
(2)引物:SEQ ID NO. 16-17,探针:SEQ ID NO. 18;
(3)引物:SEQ ID NO. 19-20,探针:SEQ ID NO. 21;
(4)引物:SEQ ID NO. 22-23,探针:SEQ ID NO. 24;和
(5)引物:SEQ ID NO. 25-26,探针:SEQ ID NO. 27。
45.根据实施方式36-44中任一项所述的试剂组合,其中TERT的基因突变包括选自C250T和C228T中的一种或多种。
46.根据实施方式45所述的试剂组合,其包含能够特异性识别和/或结合TERT基因突变C250T的引物和/或探针。
47.根据实施方式46所述的试剂组合,其中所述能够特异性识别和/或结合TERT基因突变C250T的引物和/或探针包含SEQ ID NO. 29-31中任一项所示的核酸序列。
48.根据实施方式36-47中任一项所述的试剂组合,其包含能够特异性识别和/或结合TERT基因突变C228T的引物和/或探针。
49.根据实施方式48所述的试剂组合,其中所述能够特异性识别和/或结合TERT基因突变C228T的引物和/或探针包含SEQ ID NO. 28、30和31中任一项所示的核酸序列。
50.根据实施方式36-49中任一项所述的试剂组合,其中FGFR3的基因突变包括选自R248C和S249C中的一种或多种。
51.根据实施方式50所述的试剂组合,其包含能够特异性识别和/或结合FGFR3基因突变R248C的引物和/或探针。
52.根据实施方式51所述的试剂组合,其中所述能够特异性识别和/或结合FGFR3基因突变R248C的引物和/或探针包含SEQ ID NO. 32、34和35中任一项所示的核酸序列。
53.根据实施方式50中任一项所述的试剂组合,其包含能够特异性识别和/或结合FGFR3基因突变S249C的引物和/或探针。
54.根据实施方式53所述的试剂组合,其中所述能够特异性识别和/或结合FGFR3基因突变S249C的引物和/或探针包含SEQ ID NO. 33-35中任一项所示的核酸序列。
55.根据实施方式36-54中任一项所述的试剂组合,其还包括检测待测样本中ONECUT2基因所在DNA区域或其片段的甲基化水平。
56.根据实施方式55所述的试剂,其中所述ONECUT2基因所在DNA区域包含chr18:55107803-55107828、chr18:55108590-55108672、chr18:55108794-55108826和/或chr18:55109012-55109014。
57.根据实施方式55-56中任一项所述的试剂组合,其中所述能够检测待测样本中ONECUT2基因所在的DNA区域或其片段的甲基化水平的试剂包含能够特异性识别和/或结合所述ONECUT2基因所在的DNA区域或其片段的引物和/或探针。
58.根据实施方式57所述的试剂组合,其中所述能够特异性识别和/或结合所述ONECUT2基因所在的DNA区域或其片段的引物和/或探针包含SEQ ID NO. 1-12中任一项所示的核酸序列。
59.根据实施方式55-58中任一项所述的试剂组合,其中所述能够特异性识别和/或结合所述ONECUT2基因所在的DNA区域或其片段的引物和/或探针包含选自以下任意一组的核酸序列:
(1)引物:SEQ ID NO. 1-2,探针:SEQ ID NO. 3;
(2)引物:SEQ ID NO. 4-5,探针:SEQ ID NO. 6;
(3)引物:SEQ ID NO. 7-8,探针:SEQ ID NO. 9;和
(4)引物:SEQ ID NO. 10-11,探针:SEQ ID NO. 12。
60.根据实施方式36-59中任一项所述的试剂组合,其还包括能够特异性结合参照基因所在的DNA区域或其片段的试剂。
61.根据实施方式60所述的试剂组合,其中所述参照基因为ACTB基因。
62.根据实施方式60-61中任一项所述的试剂组合,其中所述能够特异性结合参照基因所在的DNA区域或其片段的试剂包括引物和/或探针,且所述引物和/或探针包括SEQID NO. 39-44中任一项所示的核酸序列。
63.根据实施方式36-62中任一项所述的试剂组合,其还包括脱氨基试剂和/或甲基化敏感限制性内切酶。
64.根据实施方式63所述的试剂组合,其中所述脱氨基试剂包含亚硫酸氢盐。
65.实施方式37-64中任一项所述的试剂组合在制备试剂盒中的用途。
66.试剂盒,其包含实施方式37-64中任一项所述的试剂组合。
67.一种确认尿路上皮癌是否存在、评估尿路上皮癌发生风险和/或评估尿路上皮癌的/预后进展的模型,所述模型基于实施方式66所述的试剂盒实施。
表2
不欲被任何理论所限,下文中的实施例仅仅是为了阐释本申请的基因标志物组合、试剂组合、试剂盒、检测方法和用途等,而不用于限制本申请发明的范围。
实施例
本申请实施例中使用的引物探针序列如下表3所示:
表3
其中,序列中Y代表C或T,R代表A或G。
实施例1 尿路上皮癌的非诊断检测方法
S1 提取尿液样本中的gDNA并进行亚硫酸氢盐转化
1、尿液沉淀gDNA提取
以细胞提取试剂盒进行尿液沉淀gDNA的提取,该细胞提取试剂盒购自zymo,产品型号Quick-DNA Urine Kit(D3061)。具体步骤如下:
尿液预处理:收集到的50ml尿液样本,1600g离心10min,离心完成后,弃上清,加入1ml PBS缓冲液吹打混匀并转移至1.5ml离心管中。将包含尿液沉淀的1.5ml管,以12000g离心1min,随后弃废液。加入1ml PBS缓冲液漂洗1.2得到的沉淀1次,以12000g离心1min,随后弃废液,将沉淀重复清洗一次,弃废液。直接加入200ul GA缓冲液(GA buffer,用于悬浮细胞)至包含沉淀的1.5ml离心管中,吹打混匀;再加入20ul蛋白酶k,震荡混匀;再加入200ulGB缓冲液(GB buffer,用于细胞裂解并使核酸和蛋白分离),震荡混匀,瞬时离心;随后在70℃孵育10min。孵育完成后,加入200ul无水乙醇,震荡混匀15s;溶液加CB3柱上,以12000g离心1min,并弃废液。然后在该CB3柱内加500μl GD漂洗液(用于去除蛋白杂质的漂洗液),以12000rpm离心30s,弃废液。随后在该CB3柱内加600μl PW(用于去除盐的漂洗液),以12000rpm离心1min,弃废液,重复1次。以12000rpm离心2min,弃废液,并环吸柱子,随后将CB3柱置于室温5min,晾干。将上述CB3柱转干净1.5ml管内,柱膜上滴加53μl TE(用于溶解DNA),室温放置5min,以12000g离心2min,弃废液。
2、尿液沉淀gDNA亚硫酸盐转化
以zymo 试剂盒进行尿液沉淀gDNA亚硫酸盐转化,zymo 试剂盒购自天漠生物,产品型号EZ DNA Methylation-Lightning Kit(D3051)。具体步骤如下:
取80ng 通过1得到的gDNA补无核酸酶水(NFW)至20ul,并加入130ul 光转化试剂(Lightning Conversion Reagent),震荡混匀,在以下反应条件下反应:98℃反应8min,随后54℃反应60min,维持4℃放置即可。在Zymo-Spin™ IC柱子中加入600μl结合缓冲液(M-Binding Buffer),同时将上述孵育完成后的溶液全部转移至Zymo-Spin™ IC,颠倒10次混匀,完成后以10000g离心1min,并弃废液。在Zymo-Spin™ IC柱子中加入100ul清洗缓冲液(M-Wash Buffer),随后以10000g离心1min,弃废液。然后在Zymo-Spin™ IC柱子中加入200ul 脱硫酸缓冲液(L-Desulphonation Buffer),在室温静置15min,随后以10000g离心30s,弃废液。接着在Zymo-Spin™ IC柱子中加入200ul 清洗缓冲液(M-Wash Buffer),以10000g离心1min,弃废液,重复1次。将得到的Zymo-Spin™ IC放置于新的1.5ml离心管中,加入10µl洗脱缓冲液(M-Elution Buffer),随后以10000g离心30s,收集样本,使用Qubit™ssDNA检测试剂盒进行定量检测。
S2、以亚硫酸盐转化后的gDNA为模板,并和所述甲基化基因片段的引物探针组、点突变位点的引物探针组、以及对照基因的引物探针组混合,进行实时荧光定量PCR。
按检测反应mix 12μl、探针及引物mix 9 μl、模板30 ng的配置方案于冰上配制反应混合液(为了保证反应液配制的准确性,进行各项反应时,应先按反应数+2的量配制检测反应mix和探针及引物mix,然后再分装到每个反应管中,最后加入转化后DNA样品)。加入待测样本的同时,加入阳性质控品,阴性质控品,阴性样本,判别此次实验是否合格。反应条件如表4所示。
表4 PCR反应条件
S3、对数据结果进行分析。
反应结束后,使用实时荧光定量PCR仪Real-Time PCR Instrument 7500配套软件对数据进行读取、分析。分别得到各甲基化基因片段和突变位点的值。
读取值时参照方法为:
I、甲基化探针及引物混合液的PCR反应结果读取:
①基线设置:手动设置基线,基线(Baseline)的起始点(Start Cycle)一般设定在3,终止点(End Cycle)—般设定在15。②阈值设置:手动设置阈值(Threshold),一般设定在PCR扩增的指数期,为扩增曲线升起的拐点处。③Ct值确定:设定基线及荧光阈值后,点击“分析(Analyze)键”,即可得到各样本的Ct值。
甲基化片段的值=甲基化片段的Ct值-参照基因的Ct值。
根据上表1,甲基化片段的值≤8时,判定为阳性,有该靶基因高甲基化,否则该靶基因低甲基化。
II、点突变探针及引物的PCR反应混合液的结果读取:①基线设置:手动设置基线,ACTB-M基线(Baseline)的起始点(Start Cycle)一般设定在3,终止点(End Cycle)—般设定在15。②荧光阈值设置:手动设置阈值(Threshold),一般设定在PCR扩增的指数期,为扩增曲线升起的拐点处。③Ct值确定:设定基线及荧光阈值后,点击“分析(Analyze)键”,即可得到各样本的Ct值。
点突变的值=点突变的Ct值-参照基因的Ct值。
根据上表1,点突变的值≤11或12时,判定为该位点有突变,否则该位点无突变。
实施例2 二基因标志物在尿路上皮癌早期诊断中的检测结果
收集尿路上皮癌疑似患者252例(从近五年无恶性病史、具有微观或肉眼可见血尿的患者收集尿液样本。所有病理阳性组患者均经内镜,腹部超声,CT扫描或腹部和骨盆MRI检查,病理证实。对于金标准阴性组患者,在内镜检查和影像学评估后,患者被排除在尿路上皮肿瘤的诊断之外),分别用实施例1的检测流程进行检测。实验结束后,根据仪器的软件进行分析,调节阈值至基线荧光值以上,使阴性对照Ct值不出现任何数值,记录仪器自动分析计算出的样本Ct值。检测结果为未检出或高于45的Ct视为低于检测限,将其转变为45,然后计算(/>=检测基因的Ct-内参基因ACTB的Ct)。
判断标准:基因标志物组合包括基因突变和甲基化,如果基因突变和甲基化中发生任一者或两者为阳性,则判断患者为检测结果阳性。对于包括1个以上基因位点突变的基因标志物组合,如果1个或2个位点突变判定为阳性,则判定该基因标志物组合的基因突变为阳性。
与金标准膀胱镜病理检测结果进行比较,膀胱镜病理检测结果为阳性131例,阴性121例。所使用的基因标志物组合如表5所示,检测结果如表6-1至6-5和表7所示。结果显示,与对照组相比,实验组的检测灵敏度和特异性均较高,在80%以上。
表5 二基因标志物组合
表6-1 实验组1检测结果
表6-2 实验组2检测结果
表6-3 实验组3检测结果
表6-4 对照组1检测结果
表6-5 对照组2检测结果
表7 二基因组合用于早期诊断的检测结果总结
实施例3 二基因标志物在尿路上皮癌复发监控中的检测结果
收集尿路上皮癌疑似复发患者47例,分别用实施例2的方法进行检测,与金标准膀胱镜病理检测结果进行比较。所使用的基因标志物组合如表5所示,检测结果如表8-1、表8-2、表8-3、表8-4和表9所示。结果显示,与对照组相比,实验组的检测灵敏度和特异性均较高,在80%以上。
表8-1 实验组1检测结果
表8-2 实验组2检测结果
表8-3 对照组1检测结果
表8-4 对照组2检测结果
表9 二基因组合用于复发监控的检测结果总结
实施例4 三基因标志物在尿路上皮癌早期诊断中的检测结果
收集尿路上皮癌疑似患者252例(从近五年无恶性病史、具有微观或肉眼可见血尿的患者收集尿液样本。所有病理阳性组患者均经内镜,腹部超声,CT扫描或腹部和骨盆MRI检查,病理证实。对于金标准阴性组患者,在内镜检查和影像学评估后,患者被排除在尿路上皮肿瘤的诊断之外),分别用实施例1的检测流程进行检测,实验结束后,根据仪器的软件进行分析,调节阈值至基线荧光值以上,使阴性对照Ct值不出现任何数值,记录仪器自动分析计算出的样本Ct值。检测结果为未检出或高于45的Ct视为低于检测限,将其转变为45,然后计算(/>=检测基因的Ct-内参基因ACTB的Ct)。
判断标准:基因标志物组合包括基因突变和甲基化,如果基因突变和甲基化中发生任一者或两者为阳性,则判断患者为检测结果阳性。对于包括1个以上基因位点突变的基因标志物组合,如果1个或2个位点突变判定为阳性,则判定该基因标志物组合的基因突变为阳性。
与金标准膀胱镜病理检测结果进行比较,膀胱镜病理检测结果为阳性131例,阴性121例。所使用的基因标志物组合如表10所示,检测结果如表11-1、表11-2和表12所示。结果显示,实验组1和实验组2的检测灵敏度和特异性均较高,在70%以上,并且实验组1在85%以上。
表10 三基因标志物组合
表11-1 实验组1检测结果
表11-2 实验组2检测结果
表12 三基因组合用于早期诊断的检测结果总结
实施例5 六基因标志物在尿路上皮癌早期诊断中的检测结果
收集尿路上皮癌疑似患者252例(从近五年无恶性病史、具有微观或肉眼可见血尿的患者收集尿液样本。所有病理阳性组患者均经内镜,腹部超声,CT扫描或腹部和骨盆MRI检查,病理证实。对于金标准阴性组患者,在内镜检查和影像学评估后,患者被排除在尿路上皮肿瘤的诊断之外),分别用实施例1的检测流程进行检测,实验结束后,根据仪器的软件进行分析,调节阈值至基线荧光值以上,使阴性对照Ct值不出现任何数值,记录仪器自动分析计算出的样本Ct值。检测结果为未检出或高于45的Ct视为低于检测限,将其转变为45,然后计算(/>=检测基因的Ct-内参基因ACTB的Ct)。
判断标准:基因标志物组合包括基因突变和甲基化,如果基因突变和甲基化中发生任一者或两者为阳性,则判断患者为检测结果阳性。对于包括1个以上基因位点突变的基因标志物组合,如果1个或2个位点突变判定为阳性,则判定该基因标志物组合的基因突变为阳性。
与金标准膀胱镜病理检测结果进行比较,膀胱镜病理检测结果为阳性131例,阴性121例。所使用的基因标志物组合如表13所示,检测结果如表14-1、表14-2和表15所示。结果显示,与对照组相比,实验组1的检测灵敏度和特异性均较高,在90%以上,而对照组的灵敏度和特异性均在70%以下。
表13 六基因标志物组合
表14-1 实验组1检测结果
表14-2 对照组1检测结果
/>
表15 六基因组合用于早期诊断的检测结果总结
实施例6 六基因标志物在尿路上皮癌复发监控中的检测结果
收集尿路上皮癌疑似复发患者47例,分别用实施例5的方法进行检测,与金标准膀胱镜病理检测结果进行比较。所使用的基因标志物组合如表13所示,检测结果如表16-1、表16-2和表17所示。结果显示,与对照组相比,实验组的检测灵敏度和特异性均较高,在90%以上,而对照组则不到60%。
表16-1 实验组1检测结果
表16-2 对照组1检测结果
表17 六基因组合用于早期诊断的检测结果总结
实施例7 六基因组合中不同引物/探针序列的检测结果
根据VIM或ONECUT2的多个甲基化区域,设计不同的引物探针组合,按照实施例5的或实施例6的方法,对252例尿路上皮癌疑似患者以及47例复发患者的尿液样本进行检测。六基因标志物组合的引物探针组合如实施例5,仅将VIM或ONECUT2甲基化的引物探针替换为表18中的引物探针,检测结果如表19所示。结果显示,针对不同的甲基化片段,六基因的检测灵敏度和特异性均较高,都在85%以上。
表18
表19
/>
实施例8 六基因标志物在尿路上皮癌早期诊断中的检测结果
收集尿路上皮癌疑似患者529例(296例经病理诊断阳性,233例经病理诊断阴性),使用实施例5的方法进行检测,所使用的基因标志物组合如表13所示,检测结果如表20所示。结果显示,六基因检测实验组的检测灵敏度和特异性均较高,在85%以上。
表20 实验组检测结果
本申请检测结果的灵敏度和特异性分别为:灵敏度=258/296=87.2%,特异性=200/233=85.8%。
Claims (21)
1.用于确认尿路上皮癌是否存在、评估尿路上皮癌发生风险和/或评估尿路上皮癌的预后/进展的试剂组合,所述试剂组合包含能够检测待测样本中VIM基因和ONECUT2基因所在的DNA区域或其片段的甲基化水平,以及TERT和FGFR3的基因突变的试剂,其中,所述VIM基因所在的DNA区域包含chr10:17270951-17271151、chr10:17271498-17271632、chr10:17271330-17271493和/或chr10:17272405-17272436中的一种或多种,
所述ONECUT2基因所在DNA区域包含chr18:55108590-55108672、chr18:55107803-55107828、chr18:55108794-55108826和chr18:55109012-55109014中的一种或多种,
所述TERT的基因突变包括C250T和C228T,
所述FGFR3的基因突变包括R248C和S249C。
2.根据权利要求1所述的试剂组合,其中所述待测样本来自肿瘤患者、肿瘤疑似患者、肿瘤易感人群、肿瘤高危人群或健康人群。
3.根据权利要求2所述的试剂组合,其中所述肿瘤患者包括未经过抗癌疗法治疗后的患者和/或经过抗癌疗法治疗后的患者。
4.根据权利要求1所述的试剂组合,其中所述待测样本包含尿液。
5.根据权利要求1所述的试剂组合,其包括引物和/或探针。
6.根据权利要求1所述的试剂组合,其包含能够特异性识别和/或结合所述VIM基因所在的DNA区域或其片段的引物和/或探针,所述引物和/或探针的核酸序列如SEQ ID NO.13-27中任一项所示。
7.根据权利要求6所述的试剂组合,其中所述引物和/或探针选自以下任意一组:
(1)引物:SEQ ID NO. 13-14,探针:SEQ ID NO. 15;
(2)引物:SEQ ID NO. 16-17,探针:SEQ ID NO. 18;
(3)引物:SEQ ID NO. 19-20,探针:SEQ ID NO. 21;
(4)引物:SEQ ID NO. 22-23,探针:SEQ ID NO. 24;和
(5)引物:SEQ ID NO. 25-26,探针:SEQ ID NO. 27。
8.根据权利要求1所述的试剂组合,其包含能够特异性识别和/或结合TERT基因突变C250T的引物和/或探针,所述引物和/或探针的核酸序列如SEQ ID NO. 29-31中任一项所示。
9.根据权利要求1所述的试剂组合,其包含能够特异性识别和/或结合TERT基因突变C228T的引物和/或探针,所述引物和/或探针的核酸序列如SEQ ID NO. 28、30和31中任一项所示的。
10.根据权利要求1所述的试剂组合,其包含能够特异性识别和/或结合FGFR3基因突变R248C的引物和/或探针,所述引物和/或探针的核酸序列如SEQ ID NO. 32、34和35中任一项所示。
11.根据权利要求1所述的试剂组合,其包含能够特异性识别和/或结合FGFR3基因突变S249C的引物和/或探针,所述引物和/或探针的核酸序列如SEQ ID NO. 33-35中任一项所示。
12.根据权利要求1所述的试剂组合,其包含能够特异性识别和/或结合所述ONECUT2基因所在的DNA区域或其片段的引物和/或探针,所述引物和/或探针的核酸序列如SEQ IDNO. 1-12中任一项所示。
13.根据权利要求12所述的试剂组合,其中所述引物和/或探针选自以下任意一组:
(1)引物:SEQ ID NO. 1-2,探针:SEQ ID NO. 3;
(2)引物:SEQ ID NO. 4-5,探针:SEQ ID NO. 6;
(3)引物:SEQ ID NO. 7-8,探针:SEQ ID NO. 9;和
(4)引物:SEQ ID NO. 10-11,探针:SEQ ID NO. 12。
14.根据权利要求1所述的试剂组合,其包含:
(1)能够检测待测样本中VIM基因所在的DNA区域或其片段的甲基化水平的引物和/或探针,所述引物和/或探针的核酸序列如SEQ ID NO. 13-15任一项所示;
(2)能够检测待测样本中ONECUT2基因所在的DNA区域或其片段的甲基化水平的引物和/或探针,所述引物和/或探针的核酸序列如SEQ ID NO.1-3任一项所示;
(3)能够检测待测样本中TERT C250T基因突变的引物和/或探针,所述引物和/或探针的核酸序列如SEQ ID NO.29-31任一项所示;
(4)能够检测待测样本中TERT C228T基因突变的引物和/或探针,所述引物和/或探针的核酸序列如SEQ ID NO. 28、30-31任一项所示;
(3)能够检测待测样本中FGFR3 R248C基因突变的引物和/或探针,所述引物和/或探针的核酸序列如SEQ ID NO. 32、34-35任一项所示;以及
(4)能够检测待测样本中FGFR3 S249C基因突变的引物和/或探针,所述引物和/或探针的核酸序列如SEQ ID NO. 33-35任一项所示。
15.根据权利要求1所述的试剂组合,其还包括能够特异性结合参照基因所在的DNA区域或其片段的引物和/或探针。
16.根据权利要求15所述的试剂组合,其中所述参照基因为ACTB基因。
17.根据权利要求16所述的试剂组合,其中所述能够特异性结合参照基因所在的DNA区域或其片段的引物和/或探针的核酸序列如SEQ ID NO. 39-44中任一项所示。
18.根据权利要求1所述的试剂组合,其还包括脱氨基试剂。
19.试剂盒,其包含权利要求1-18中任一项所述的试剂组合。
20.权利要求1-18中任一项所述的试剂组合在制备试剂盒中的用途。
21.一种确认尿路上皮癌是否存在、评估尿路上皮癌发生风险和/或评估尿路上皮癌的/预后进展的模型,所述模型基于权利要求20所述的试剂盒实施。
Priority Applications (2)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
CN202311584988.6A CN117604101A (zh) | 2023-09-11 | 2023-09-11 | 一种基因标志物组合、试剂盒及检测方法 |
CN202311160819.XA CN116891899B (zh) | 2023-09-11 | 2023-09-11 | 一种基因标志物组合、试剂盒及检测方法 |
Applications Claiming Priority (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
CN202311160819.XA CN116891899B (zh) | 2023-09-11 | 2023-09-11 | 一种基因标志物组合、试剂盒及检测方法 |
Related Child Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
CN202311584988.6A Division CN117604101A (zh) | 2023-09-11 | 2023-09-11 | 一种基因标志物组合、试剂盒及检测方法 |
Publications (2)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
CN116891899A true CN116891899A (zh) | 2023-10-17 |
CN116891899B CN116891899B (zh) | 2024-02-02 |
Family
ID=88312442
Family Applications (2)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
CN202311584988.6A Pending CN117604101A (zh) | 2023-09-11 | 2023-09-11 | 一种基因标志物组合、试剂盒及检测方法 |
CN202311160819.XA Active CN116891899B (zh) | 2023-09-11 | 2023-09-11 | 一种基因标志物组合、试剂盒及检测方法 |
Family Applications Before (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
CN202311584988.6A Pending CN117604101A (zh) | 2023-09-11 | 2023-09-11 | 一种基因标志物组合、试剂盒及检测方法 |
Country Status (1)
Country | Link |
---|---|
CN (2) | CN117604101A (zh) |
Citations (5)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US20160083797A1 (en) * | 2012-03-30 | 2016-03-24 | Biotype Diagnostic Gmbh | Biomarker for bladder cancer |
CN108374047A (zh) * | 2018-02-09 | 2018-08-07 | 湖南优品司生物科技有限公司 | 一种基于高通量测序技术检测膀胱癌的试剂盒 |
CN110621788A (zh) * | 2017-05-18 | 2019-12-27 | 基美健有限公司 | 用于膀胱癌监视的dna甲基化和突变分析方法 |
CN116121380A (zh) * | 2022-11-30 | 2023-05-16 | 神州医疗科技股份有限公司 | 一种用于检测膀胱癌相关基因的引物探针组合及检测方法 |
WO2023092097A1 (en) * | 2021-11-19 | 2023-05-25 | Foundation Medicine, Inc. | Fragment consensus methods for ultrasensitive detection of aberrant methylation |
-
2023
- 2023-09-11 CN CN202311584988.6A patent/CN117604101A/zh active Pending
- 2023-09-11 CN CN202311160819.XA patent/CN116891899B/zh active Active
Patent Citations (5)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US20160083797A1 (en) * | 2012-03-30 | 2016-03-24 | Biotype Diagnostic Gmbh | Biomarker for bladder cancer |
CN110621788A (zh) * | 2017-05-18 | 2019-12-27 | 基美健有限公司 | 用于膀胱癌监视的dna甲基化和突变分析方法 |
CN108374047A (zh) * | 2018-02-09 | 2018-08-07 | 湖南优品司生物科技有限公司 | 一种基于高通量测序技术检测膀胱癌的试剂盒 |
WO2023092097A1 (en) * | 2021-11-19 | 2023-05-25 | Foundation Medicine, Inc. | Fragment consensus methods for ultrasensitive detection of aberrant methylation |
CN116121380A (zh) * | 2022-11-30 | 2023-05-16 | 神州医疗科技股份有限公司 | 一种用于检测膀胱癌相关基因的引物探针组合及检测方法 |
Non-Patent Citations (2)
Title |
---|
CHRISTINA M. DAHMCKE等: "A Prospective Blinded Evaluation of Urine-DNA Testing for Detection of Urothelial Bladder Carcinoma in Patients with Gross Hematuria", EUROPEAN UROLOGY, vol. 70, no. 6, pages 916 - 919, XP029779984, DOI: 10.1016/j.eururo.2016.06.035 * |
GANG WANG等: "Urine-based liquid biopsy in bladder cancer: Opportunities and challenges", WILEY, pages 1 - 24 * |
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
CN116891899B (zh) | 2024-02-02 |
CN117604101A (zh) | 2024-02-27 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
CN108977543B (zh) | 一种基于联合检测sdc2和sfrp2基因甲基化水平的结直肠癌早期诊断试剂 | |
JP4195508B2 (ja) | 糞便サンプルから結腸ガンを検出する方法 | |
US9493839B2 (en) | Non-invasive cancer diagnosis | |
CN110387421A (zh) | 用于肺癌检测的DNA甲基化qPCR试剂盒及使用方法 | |
CN106893784A (zh) | 用于预测肝癌预后的lncRNA标志物 | |
CN111549135A (zh) | 一种用于宫颈癌检测的DNA甲基化qPCR试剂盒及使用方法、应用 | |
WO2010118559A1 (zh) | 一种癌症筛检的方法 | |
CN109112216A (zh) | 三重qPCR检测DNA甲基化的试剂盒和方法 | |
JP2021019587A (ja) | 婦人科新生物の診断方法 | |
CN111500731A (zh) | 一种甲状腺癌早期诊断、检测或者筛查的试剂盒及其使用方法、应用 | |
CN108374047B (zh) | 一种基于高通量测序技术检测膀胱癌的试剂盒 | |
CN111455053B (zh) | 用于结直肠腺瘤诊断的外泌体rna分子标记物组合及其应用 | |
CN111793690A (zh) | 用于宫颈癌检测的DNA甲基化qPCR试剂盒及其使用方法 | |
CN116891899B (zh) | 一种基因标志物组合、试剂盒及检测方法 | |
JP2008048668A (ja) | Dnaコピー数多型を用いた癌発症体質の判定方法 | |
US7217515B2 (en) | HURP gene as a molecular marker for bladder cancer | |
CN114717311B (zh) | 用于检测尿路上皮癌的标志物、试剂盒和装置 | |
JP2021524750A (ja) | 腫瘍マーカー、メチル化検出試薬、キット及びその使用 | |
WO2021185275A1 (zh) | 一种检测11种癌症的探针组合物 | |
CN111154880B (zh) | 一种膀胱癌体液活检生物标志物及其应用 | |
CN116064786A (zh) | 一种用于检测胃癌的组合物,试剂盒及其用途 | |
JP6608424B2 (ja) | 前癌性結腸直腸ポリープおよび結腸直腸癌を特定するための方法およびキット | |
CN105779612A (zh) | 一种Lynch综合征基因检测试剂盒及其应用 | |
CN112322743A (zh) | 检测人sept9基因甲基化的试剂盒及其使用方法、应用 | |
CN111549136A (zh) | 一种用于甲状腺癌检测的试剂盒及其使用方法、应用 |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
PB01 | Publication | ||
PB01 | Publication | ||
SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
GR01 | Patent grant | ||
GR01 | Patent grant |