CN111549136A - 一种用于甲状腺癌检测的试剂盒及其使用方法、应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种用于甲状腺癌检测或者筛查的试剂盒及其使用方法、应用。该试剂盒包括检测或测量受试样品DNA中一种或多种特定基因的甲基化状态或水平的特异性引物和探针，所述特定基因为NR2F1和ACTB。本发明试剂盒能够显著提高早期甲状腺癌的阳性检出率和特异性(真实阴性率)，可将生物标记物的检测灵敏度提高到皮克/纳克级DNA分子，检测灵敏度的提高是通过优化特定核苷酸序列引物及DNA探针以及改进血浆游离DNA的亚硫酸氢盐处理方法来实现的。
Description
技术领域
本发明属于生物技术和DNA检测技术领域，尤其涉及一种用于甲状腺癌检测的DNA甲基化qPCR试剂盒及其使用方法、应用，具体而言，涉及一种利用血浆游离DNA进行甲基化qPCR以确定一个目标基因靶点(例如NR2F1和NR2F1)的甲基化状态来用于甲状腺癌检测或筛查的试剂盒及其使用方法，此外，本发明还涉及上述检测试剂盒在生物医学中的应用。
背景技术
甲状腺癌发病率占内分泌肿瘤的首位，也是头颈部最常见的恶性肿瘤之一。2018年全国最新癌症报告指出甲状腺癌主要出现在女性人群中，发达国家女性甲状腺癌发病排名第7位，发展中国家女性甲状腺癌发病排名第9位。我国东部地区甲状腺癌发病率远高于中、西部地区，女性发病率远高于男性。甲状腺癌是30岁以下女性人群的最主要癌症类型。近年来，我国甲状腺癌发病率明显上升，但死亡率则相对稳定在较低水平，其他国家也发现了类似趋势，这可能与甲状腺癌的过度诊断有关。我国甲状腺癌发病率存在地区差异，这可能是由于不同地区甲状腺癌筛查率不同所导致的。
甲状腺结节是指甲状腺细胞在局部异常生长所引起的散在病变。颈部超声检查是对甲状腺结节进行初始癌症风险分层的主要检查方法，随后决定是否对可疑结节进行细针穿刺活检(fine needle aspiration biopsy，FNAB)。然而，在某些情况下，由于恶性和良性甲状腺结节之间的细胞学特征重叠，约20％至40％的术前活检组织难以将良性甲状腺结节与甲状腺癌区分开来。此外，实验室血清学检查(促甲状腺激素(TSH)、甲状腺球蛋白(Tg)及降钙素(Ct))也是目前临床上鉴别良恶性结节的常用方法，但由于其在甲状腺非肿瘤疾病中也存在较高的含量，从而特异性较低。报道指出TC诊断的不确定性仅在美国每年就导致多达50,000名患者接受不必要的甲状腺切除术。因此，传统的TC患者诊断方法的补充和完善仍然是亟待解决的问题。
DNA甲基化改变是癌症进程中最早发生的分子变化之一，且具有组织特异性，肿瘤抑制基因的高甲基化水平已被确定为抑制基因表达和促进癌细胞生长和扩增的重要机制。肿瘤患者外周血中可检测到肿瘤细胞坏死、凋亡所释放的ctDNA(circulating tumorDNA)，由于其携带有与原发肿瘤组织相一致的分子遗传学改变，理论上可以利用ctDNA甲基化对肿瘤进行诊断。研究表明，多个抑癌基因如CDKN2A、RASSF1、ECAD、NIS-L、ATM等在甲状腺癌中都有相当高的比例因发生甲基化而失活。
发明内容
在上述资料的基础上，我们通过更加广泛和深入的研究，发现了可用于早期甲状腺癌筛查的更好的甲基化基因靶点，并设计出数套可针对这些靶点进行甲基化检测的引物及探针组合，利用新发现的基因靶标检测组合制成了早期甲状腺癌的检测和筛查以及甲状腺良性和恶性结节鉴别的试剂盒。
本发明的目的在于提供一种用于甲状腺癌早期诊断、检测或者筛查的血液单基因检测引物探针组合试剂盒，以解决现有技术中存在的检测方法特异性和敏感性过低的缺陷。
本发明的第一方面在于提供一种用于甲状腺癌检测的试剂盒，包括检测或测量受试样品DNA中一种或多种特定基因的甲基化状态或水平的特异性引物和探针，所述特定基因为NR2F 1和ACTB。
在一些实施方式中，用于检测或测量受试样品DNA中NR2F1基因的甲基化状态或水平的的特异性引物和探针选自下述三种特异性引物和探针组合中的任一种：特异性引物SEQ ID NO:1-2和探针SEQ ID NO:3、特异性引物SEQ ID NO:4-5和探针SEQ ID NO:6、特异性引物SEQ ID NO:7-8和探针SEQ ID NO:9。
在一些实施方式中，用于检测或测量受试样品DNA中ACTB基因的甲基化状态或水平的的特异性引物为特异性引物SEQ ID NO:10-11和探针SEQ ID NO:12。
在一些实施方式中，所述SEQ ID NO:1、2、4、5、7、8、10、11均经过硫代磷酸酯修饰，且在严格条件下与甲基化或非甲基化的目标基因区域杂交。
在一些实施方式中，所述SEQ ID NO:3、6、9、12是基于TaqManTM设计的，且在严格条件下与甲基化或非甲基化的目标基因区域杂交。
在一些实施方式中，所述SEQ ID NO:3、6、9核苷酸序列5’端标记Cy5，3’端标记QSY。
在一些实施方式中，所述SEQ ID NO:12核苷酸序列5’端标记VIC，3’端标记MGBNFQ。
在一些实施方式中，所述特异性引物SEQ ID NO:1、2、4、5、7、8、10、11和所述探针SEQ ID NO:3、6、9、12的长度为10-50nt。
在一些实施方式中，所述试剂盒中还包含下述组成部分：dNTP混合溶液、MgCl2溶液、DNA聚合酶、PCR反应缓冲液、PCR去离子水。
在一些实施方式中，所述试剂盒中还包含下述组成部分：血浆游离DNA提取试剂和血浆游离DNA甲基化转化试剂。
在一些实施方式中，所述血浆游离DNA甲基化转化试剂为亚硫酸氢盐。
在一些实施方式中，所述受试样品DNA为完整基因组、无细胞DNA或循环肿瘤DNA。
在一些实施方式中，具体的特异性引物和探针序列如下表1所示：
表1本发明试剂盒中包含的特异性引物和探针
本发明的第二方面在于提供一种根据第一方面所述的试剂盒的使用方法，包括以下步骤：
(1)提取血浆游离DNA；
(2)将提取的血浆游离DNA进行甲基化转化并纯化，优选采用亚硫酸氢盐为血浆游离DNA甲基化转化试剂；
(3)将进行甲基化转化并纯化的血浆游离DNA进行荧光定量PCR扩增，PCR反应结束后，将Ct阈值设定在线性扩增区间，Ct值小于40的扩增认定为阳性；
(4)结果判定：当内部参照位点ACTB检测结果阳性，NR2F1靶点的三个重复扩增中至少两个为阳性则确定为该靶点结果阳性；
优选地，所述第(3)步骤中，每个模板的PCR扩增做三个重复。
在一些实施方式中，每个反应体系10μL，其中含(0.5-1.5μL)1xPCR反应缓冲液、200-400μm dNTPs、3-6mM MgCl2、1-3U AmpliTaq Gold DNA聚合酶。
在一些实施方式中，NR2F1基因区域靶点的引物各300-500nM。
在一些实施方式中，NR2F1基因区域靶点的探针各200-300nM。
在一些实施方式中，ACTB基因区域靶点的引物150-250nM，ACTB基因区域靶点的探针50-150nM。
在一些实施方式中，PCR扩增条件为：90-100℃预变性8-12min；90-100℃变性10-20s，60-70℃退火和延伸60-70s，40-50个循环。
在一些实施方式中，所述第(3)步骤选用下述方法中的任一种：甲基化特异性定量PCR、实时甲基化特异性PCR、使用甲基化DNA特异性结合蛋白的PCR。
本发明的第三方面在于提供根据第一方面所述的试剂盒在制备甲状腺癌检测试剂或医疗器械中的医用。
本发明的有益效果在于：
经实验测试，本发明试剂盒能够显著提高甲状腺癌的阳性检出率和特异性(真实阴性率)，可将生物标记物的检测灵敏度提高到皮克/纳克级DNA分子，检测灵敏度的提高是通过优化特定核苷酸序列引物及DNA探针以及改进血浆游离DNA的亚硫酸氢盐处理方法来实现的。
附图说明
图1为本发明一种实施方式的试剂盒的健康人血液样本的甲基化qPCR扩增曲线图；
图2为本发明一种实施方式的试剂盒的甲状腺癌患者血液样本的甲状腺癌甲基化qPCR扩增曲线图。
具体实施方式
以下通过特定的具体实例说明本发明的实施方式，本领域技术人员可由本说明书所揭露的内容轻易地了解本发明的其他优点与功效。本发明还可以通过另外不同的具体实施方式加以实施或应用，本说明书中的各项细节也可以基于不同观点与应用，在没有背离本发明的精神下进行各种修饰或改变。
在进一步描述本发明具体实施方式之前，应理解，本发明的保护范围不局限于下述特定的具体实施方案；还应当理解，本发明实施例中使用的术语是为了描述特定的具体实施方案，而不是为了限制本发明的保护范围。
下述实施例中所用材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
定义
术语“患者”、“个体”或“受试者”可以在本文中互换使用，可以指哺乳动物，特别是人类。所述受试者可能有轻度、中度或重度疾病。所述患者可能是未治、易治或难治。所述患者可能是基于特定症状或家族病史需要治疗或需要诊断的个体。
术语“样本”、“患者样本”、“生物样本”等包括从患者、个体或受试者获得的各种样本类型，并且可用于诊断或监测检测。所述患者样本可以从健康受试者、患病患者或患有甲状腺癌相关症状的患者获得。而且，从患者获得的样本可以被分割，并且只有一部分可以用于诊断。此外，所述样本或其一部分可以在保持样本用于以后分析的条件下储存。该定义具体包括血液和其他生物来源的液体样本(包括但不限于外周血、血清、血浆、尿、唾液、痰、粪便和滑液)，固体组织样本(如活检标本或组织培养物或由其衍生的细胞及其后代)。该定义还包括在获取后以任何方式操作的样本，如通过离心、过滤、沉淀、透析、色谱法、试剂处理、洗涤或富集某些细胞群。这些术语还包括临床样本、培养细胞、细胞上清液、组织样本、器官等。所述样本还可以包含新鲜冷冻和/或福尔马林固定的石蜡包埋组织块，例如由临床或病理活组织检查制备的块，其被制备用于病理分析或通过免疫组织化学研究。
术语“测量”、“确定”、“检测”或“检查”在全文中可互换使用，并且可以指包括获得患者样本和/或检测患者样本中的生物标志物甲基化状态或水平的方法。在一个实施方式中，这些术语是指获得患者样本并检测样本中一种或多种生物标志物的甲基化状态或水平。在另一个实施方式中，术语“测量”、“确定”或“检测”是指检测患者样本中一种或多种生物标志物的甲基化状态或水平。测量可以通过本领域已知的方法和本文进一步描述的方法完成，包括但不限于甲基化特异性定量聚合酶链式反应(qPCR)。
术语“甲基化”是指在胞嘧啶的C5或N4位置、腺嘌呤的N6位置的胞嘧啶甲基化或其他类型的核酸甲基化。体外扩增的DNA是未甲基化的，因为体外DNA扩增方法不保留扩增模板的甲基化模式。然而，“未甲基化的DNA”或“甲基化的DNA”也可以分别指其原始模板是未甲基化或甲基化的扩增DNA。
术语“CpG岛”是指具有高密度CpG的基因组DNA的连续区域。
术语“甲基化状态”或“甲基化水平”是指特定核苷酸或部分DNA中的核苷酸处的甲基化的存在、不存在和/或量。
应该理解的是，无论在何处使用语言“包括”描述实施例，还提供了以“由…组成”和/或“基本上由…组成”描述的其他类似实施例。
实施例1：利用本发明试剂盒对健康人cfDNA样本进行甲状腺癌甲基化qPCR检测
(一)实验材料
1.5份健康人血浆；
2.QIAamp循环系统核酸提取试剂盒(购自Qiagen公司)；
3.EZ DNA Methylation-Lightning试剂盒(购自Zymo Research公司)；
4.本发明试剂盒(其中包含检测靶点NR2F1的组合1引物及探针组合、ACTB扩增引物及探针)；
5.AmpliTaq GoldTMDNA聚合酶及缓冲试剂(购自Thermo Fisher公司)。
(二)实验方法
1.血浆游离DNA提取
使用QIAamp循环系统核酸提取试剂盒从5份健康人血浆样本中提取cfDNA，步骤按照试剂盒说明书进行。
2.游离DNA甲基化转化
使用Zymo Research公司的EZ DNA Methylation-Lightning试剂盒对提取的5份血浆cfDNA进行亚硫酸氢盐处理并随后进行纯化。
3.qPCR扩增
对亚硫酸氢盐处理过的血浆cfDNA使用Thermo Fisher公司Quant Studio 5仪器进行qPCR扩增，每个模板的PCR扩增做三个重复。每个反应体系10μL，其中含1xPCR反应缓冲液、400μm dNTPs、4mM MgCl2、2U AmpliTaq Gold DNA聚合酶；NR2F1基因区域靶点的引物各800nM(每个靶点只选择一对引物)，NR2F1基因区域靶点的探针各500nM(每个靶点选择一条与所选引物相对应的探针)；ACTB基因区域靶点的引物200nM，ACTB基因区域靶点的探针100nM；50nM ROX染料。
PCR扩增条件为：95℃预变性10min；
95℃变性15s，65℃退火和延伸30s，45个循环；
PCR反应结束后，将Ct阈值设定在线性扩增区间(本实验中，设定ΔRn为0.1)，Ct值小于40的扩增认定为阳性。
(三)实验结果
对于结果的判定标准是，当内部参照位点(ACTB)检测结果阳性，NR2F1检测位/靶点的三个重复扩增中至少两个为阳性则确定为该样本结果阳性。
下表2显示的是使用本发明所测定的5份健康人血浆样品的结果(图1)。由表2可见，本方案检测特异性非常高。
表2利用本发明试剂盒对健康人血液样本的检测结果
实施例2：利用本发明试剂盒对甲状腺癌患者ctDNA样本进行甲状腺癌甲基化qPCR检测
(一)实验材料
1.5份甲状腺癌患者血浆；
2.QIAamp循环系统核酸提取试剂盒(购自Qiagen公司)；
3.EZ DNA Methylation-Lightning试剂盒(购自Zymo Research公司)；
4.本发明试剂盒(其中包含检测靶点NR2F1的组合1引物及探针组合、ACTB扩增引物及探针)；
5.AmpliTaq GoldTMDNA聚合酶及缓冲试剂(购自Thermo Fisher公司)。
(二)实验方法
1.血浆游离DNA提取
使用QIAamp循环系统核酸提取试剂盒从5份甲状腺癌患者血浆样本中提取ctDNA，步骤按照试剂盒说明书进行。
2.游离DNA甲基化转化
使用Zymo Research公司的EZ DNA Methylation-Lightning试剂盒对提取的5份血浆ctDNA进行亚硫酸氢盐处理并随后进行纯化。
3.qPCR扩增
对亚硫酸氢盐处理过的血浆ctDNA使用Thermo Fisher公司Quant Studio 5仪器进行qPCR扩增，每个模板的PCR扩增做三个重复。每个反应体系10μL，其中含1xPCR反应缓冲液、400μm dNTPs、4mM MgCl2、2U AmpliTaq Gold DNA聚合酶；NR2F1基因区域靶点的引物各800nM(每个靶点只选择一对引物)，NR2F1基因区域靶点的探针各500nM(每个靶点选择一条与所选引物相对应的探针)；ACTB基因区域靶点的引物200nM，ACTB基因区域靶点的探针100nM；50nM ROX染料。
PCR扩增条件为：95℃预变性10min；
95℃变性15s，65℃退火和延伸30s，45个循环；
PCR反应结束后，将Ct阈值设定在线性扩增区间(本实验中，设定ΔRn为0.1)，Ct值小于40的扩增认定为阳性。
(三)实验结果
对于结果的判定标准是，当内部参照位点(ACTB)检测结果阳性，NR2F1检测位/靶点的三个重复扩增中至少两个为阳性则确定为该样本结果阳性。
下表3显示的是使用本发明所测定的5例甲状腺癌患者的血浆样品的结果(图2)。由表3可见，本方案阳性检出率非常高。
表3利用本发明试剂盒对甲状腺癌患者血液样本的检测结果
综合实施例1和实施例2，可以看出，利用本发明试剂盒进行甲状腺癌筛查，其阳性检出率为80％，特异性(真实阴性率)为100％，曲线下面积为0.90。
与实施例2不同的，采用包含检测靶NR2F1的组合2引物及探针组合和包含检测靶点NR2F1的组合3引物及探针组合的试剂盒，对5例甲状腺癌患者血液样本检测均取得了与实施例2相当的结果，其阳性检出率均为80％。
以上对本发明优选的具体实施方式和实施例作了详细说明，但是本发明并不限于上述实施方式和实施例，在本领域技术人员所具备的知识范围内，还可以在不脱离本发明构思的前提下作出各种变化。
序列表
<110> 深圳市新合生物医疗科技有限公司
<120> 一种用于甲状腺癌检测的试剂盒及其使用方法、应用
<160> 12
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列()
<400> 1
cgtggggttg gattgggac 19
<210> 2
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列()
<400> 2
acgaaaacga accgatcccg 20
<210> 3
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列()
<400> 3
attcggatta cggtttgggc 20
<210> 4
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列()
<400> 4
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<210> 5
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列()
<400> 5
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<210> 6
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列()
<400> 6
ttaggtcggt tgggggtttt 20
<210> 7
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列()
<400> 7
aaaggtttcg cggtttaggg 20
<210> 8
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列()
<400> 8
aaactacgcg aatctcccga 20
<210> 9
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列()
<400> 9
ttaggtcggt tgggggtttt 20
<210> 10
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列()
<400> 10
tagggagtat ataggttggg gaagtt 26
<210> 11
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列()
<400> 11
aacacacaat aacaaacaca aattcac 27
<210> 12
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列()
<400> 12
tggtgatgga ggaggtttag gcagt 25
Claims (10)
1.一种用于甲状腺癌检测的试剂盒，包括检测或测量受试样品DNA中一种或多种特定基因的甲基化状态或水平的特异性引物和探针，所述特定基因为NR2F1和ACTB。
2.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，用于检测或测量受试样品DNA中NR2F1基因的甲基化状态或水平的的特异性引物和探针选自下述三种特异性引物和探针组合中的任一种：特异性引物SEQ ID NO:1-2和探针SEQ ID NO:3、特异性引物SEQ ID NO:4-5和探针SEQ ID NO:6、特异性引物SEQ ID NO:7-8和探针SEQ ID NO:9。
3.根据权利要求1或2所述的试剂盒，其特征在于，用于检测或测量受试样品DNA中ACTB基因的甲基化状态或水平的的特异性引物为特异性引物SEQ ID NO:10-11和探针SEQ IDNO:12。
4.根据权利要求1-3任一所述的试剂盒，其特征在于，所述SEQ ID NO:1、2、4、5、7、8、10、11均经过硫代磷酸酯修饰，且在严格条件下与甲基化或非甲基化的目标基因区域杂交；
和/或，所述SEQ ID NO:3、6、9、12是基于TaqManTM设计的，且在严格条件下与甲基化或非甲基化的目标基因区域杂交。
5.根据权利要求1-4任一所述的试剂盒，其特征在于，所述SEQ ID NO:3、6、9核苷酸序列5’端标记Cy5，3’端标记QSY；
和/或，所述SEQ ID NO:12核苷酸序列5’端标记VIC，3’端标记MGBNFQ。
6.根据权利要求1-5任一所述的试剂盒，其特征在于，所述特异性引物SEQ ID NO:1、2、4、5、7、8、10、11和所述探针SEQ ID NO:3、6、9、12的长度为10-50nt。
7.根据权利要求1-6任一所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒中还包含下述组成部分：dNTP混合溶液、MgCl2溶液、DNA聚合酶、PCR反应缓冲液、PCR去离子水；
和/或，所述试剂盒中还包含下述组成部分：血浆游离DNA提取试剂和血浆游离DNA甲基化转化试剂；
和/或，所述血浆游离DNA甲基化转化试剂为亚硫酸氢盐；
和/或，所述受试样品DNA为完整基因组、无细胞DNA或循环肿瘤DNA。
8.一种根据权利要求1-7任一所述的试剂盒的使用方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)提取血浆游离DNA；
(2)将提取的血浆游离DNA进行甲基化转化并纯化，优选采用亚硫酸氢盐为血浆游离DNA甲基化转化试剂；
(3)将进行甲基化转化并纯化的血浆游离DNA进行荧光定量PCR扩增，PCR反应结束后，将Ct阈值设定在线性扩增区间，Ct值小于40的扩增认定为阳性；
(4)结果判定：当内部参照位点ACTB检测结果阳性，NR2F1靶点的三个重复扩增中至少两个为阳性则确定为该靶点结果阳性；
优选地，所述第(3)步骤中，每个模板的PCR扩增做三个重复；
和/或，每个反应体系10μL，其中含(0.5-1.5μL)1xPCR反应缓冲液、200-400μm dNTPs、3-6mM MgCl2、1-3U AmpliTaq Gold DNA聚合酶；
和/或，NR2F1基因区域靶点的引物各300-500nM；
和/或，NR2F1基因区域靶点的探针各200-300nM；
和/或，ACTB基因区域靶点的引物150-250nM，ACTB基因区域靶点的探针50-150nM；
和/或，PCR扩增条件为：90-100℃预变性8-12min；90-100℃变性10-20s，60-70℃退火和延伸60-70s，40-50个循环。
9.根据权利要求8所述的方法，其特征在于，所述第(3)步骤选用下述方法中的任一种：甲基化特异性定量PCR、实时甲基化特异性PCR、使用甲基化DNA特异性结合蛋白的PCR。
10.根据权利要求1-7任一所述的试剂盒在制备甲状腺癌检测试剂或医疗器械中的医用。
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