CN113652490B - 一种用于膀胱癌早期筛查和/或预后监测的引物探针组合及试剂盒 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种用于膀胱癌早期筛查和/或预后监测的引物探针组合及试剂盒。所述引物探针组合包括HIST1H4F基因的甲基化引物和探针,所述HIST1H4F基因的甲基化引物包括如SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示的核苷酸序列,所述HIST1H4F基因的探针包括如SEQ ID NO.3所示的核苷酸序列。所述试剂盒包括所述引物探针组合、PCR反应液、阳性质控品和阴性质控品。本发明提供的试剂盒能够用于膀胱癌的早期筛查、复发监测,具有灵敏度高、特异性强、方便快捷的优点,且样本为尿沉渣细胞,能够进行无创检测,可应用性强,具有很高的临床应用价值。
Description
技术领域
本发明涉及基因检测技术领域,具体涉及一种用于膀胱癌早期筛查和/或预后监测的引物探针组合及试剂盒。
背景技术
膀胱癌作为最常见的泌尿系统恶性肿瘤之一,其发病率在2014年约为57.1%,死亡率约为23.5%,其发病率随年龄增长而增加,其中男性发病率为女性的3~4倍。有研究表明50%~70%的非肌层浸润性膀胱癌会出现复发,且多在1~2年内复发,有10%~20%伴有恶性程度增加或向浸润性肿瘤发展,严重影响患者的生存率。目前常用的膀胱癌检查方法有膀胱镜检查及其对可疑病变组织进行活检、尿脱落细胞学检测、影像学检查以及荧光原位杂交等。
膀胱镜作为一种侵袭性的检查方法,属于有创性检查且价格昂贵,给患者带来痛苦以及经济负担;尿脱落细胞学检查灵敏度低,给临床应用带来不便;影像学检查放射副作用大,难以作为早期诊断和密切术后监测的普适手段。荧光原位杂交方法检测膀胱癌的敏感度高但特异性相对较低,尚未在临床上广泛应用。因此,找到一种灵敏度高、特异性好、高度准确的膀胱癌无创检测技术,对膀胱癌的早期诊断、治疗和预后监测具有非常重要的现实意义。
由于DNA甲基化往往发生在癌症发生过程的早期,所以在肿瘤诊断中应用越来越广泛。由于抑癌基因启动子高甲基化在膀胱癌中很常见,潜在的DNA甲基化标记在血清、膀胱冲洗液、尿液样本和癌症组织中已鉴定出膀胱癌。因此,检测DNA甲基化状态可以作为膀胱癌早期发现、有效治疗和准确预后的可靠途径。
CN105274100A公开了一种人TWIST1/Vimentin基因甲基化检测标志物以及试剂盒。所述人TWIST1/Vimentin基因甲基化检测标志物包括TWIST1、Vimentin和ACTB三种基因的甲基化引物和探针,能够用于膀胱癌的检测、辅助诊断以及复发的预测、疗效评价,具有灵敏度高、特异性强、检测成本低的优点。但该研究并没有公开其他基因的甲基化引物和探针应用于膀胱癌检测。
CN111826446A公开了一种用于膀胱癌早期筛查与辅助诊断的引物、探针和试剂盒。所述用于膀胱癌早期筛查与辅助诊断的引物,包括用于检测PCDH17基因的引物、POU4F2基因的引物和PENK基因的引物,得到的试剂盒能够用于膀胱癌早期筛查与辅助诊断,具有无创便捷、高敏感度以及特异性强的优点。但该研究仅针对PCDH17、POU4F2和PENK基因引物做了探究。
CN108441561A公开了一种双重甲基化荧光定量PCR法用于膀胱癌早期筛查检测的试剂盒。所述试剂盒包括p16和RASSF1A两个靶基因的引物及探针及GAPDH的正向引物及探针,能够用于膀胱癌的检测,检测灵敏性高且特异性好。但该研究同样仅针对特定基因做了探究。
基于以上研究,通过检测DNA甲基化状态可以有效进行膀胱癌早期筛查和临床诊断。但膀胱癌DNA分子甲基化检测并没有其特有的基因,多数研究是联合几个基因同时检测尿液中基因甲基化水平,以此来提高灵敏度和特异性。因此,找到一种基于特定基因的引物和探针的灵敏度高、特异性好、高度准确的膀胱癌无创检测技术,是目前临床上亟需解决的问题。
发明内容
针对现有技术的不足和现实实际的需求,本发明的目的在于一种用于膀胱癌早期筛查和/或预后监测的引物探针组合及试剂盒。本发明提供的利用所述探针引物组合制备的试剂盒能够对膀胱癌基因进行特异性检测,具有高灵敏度、高准确度的优点,且操作简便,可应用性强。
为达到此发明目的,本发明采用以下技术方案:
第一方面,本发明提供了一种用于膀胱癌早期筛查和/或预后监测的引物探针组合,所述引物探针组合包括HIST1H4F基因甲基化引物和探针;所述HIST1H4F基因的甲基化引物包括如SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示的核苷酸序列;所述HIST1H4F基因的探针包括如SEQ ID NO.3所示的核苷酸序列。
本发明选择HIST1H4F作为膀胱癌甲基化检测基因,通过设计引物探针测试,用样本进行验证测试,与其他研究中报道的与膀胱癌发生有关的甲基化基因相比,HIST1H4F基因的检测效果更好,准确度更高,所述HIST1H4F基因的引物探针组合的序列,偏长会导致合成难度较大,退火温度提高;偏短会导致特异性变差。本发明涉及的序列长度在18-27bp之间,可以满足后续PCR扩增的要求,保证检测结果的稳定性。
根据第一方面所述的用于膀胱癌早期筛查和/或预后监测的引物探针组合,所述引物探针组合还包括内参基因的甲基化引物和探针。
优选地,所述内参基因包括ACTB基因。
优选地,所述ACTB基因的甲基化引物,包括如SEQ ID NO.4和SEQ ID NO.5所示的核苷酸序列。
优选地,所述ACTB基因的探针包括如SEQ ID NO.6所示的核苷酸序列。
所述内参基因包括ACTB基因,本发明选择ACTB基因作为内参基因,在细胞中表达相对稳定,用于实时监控样本质量以及亚硫酸盐转化过程,保证结果的稳定性,所述ACTB基因的引物和探针的序列,有扩增效率高及特异性强的优点,可以满足后续PCR扩增的要求,保证检测结果的稳定性。
根据第一方面所述的用于膀胱癌早期筛查和/或预后监测的引物探针组合,所述HIST1H4F基因的探针的5'端标记有荧光基团A,3'端标记有淬灭基团A。
优选地,所述内参基因的探针的5'端标记有荧光基团B,3'端标记有淬灭基团B,其中,所述荧光基团A与荧光基团B不同,所述淬灭基团A和淬灭基团B相同或不同。
第二方面,本发明提供了一种如第一方面所述的引物探针组合在制备用于膀胱癌早期筛查和/或预后监测的试剂盒中的应用。
本发明提供的HIST1H4F基因和ACTB基因的引物探针组合能够用于制备膀胱癌早期筛查检测和预后监测的试剂盒。
第三方面,本发明提供了一种用于膀胱癌早期筛查和/或预后监测的试剂盒,所述试剂盒包括第一方面所述的引物探针组合。
根据第三方面所述的试剂盒,所述试剂盒还包括PCR反应液、阳性质控品和阴性质控品。
优选地,所述PCR反应液包括PCR反应缓冲液、dNTPs、Mg2+和Taq酶。
第四方面.本发明提供了一种如第三方面所述的试剂盒的使用方法,所述使用方法包括以下步骤:
(1)提取样本的基因组DNA;
(2)对步骤(1)中所述提取的DNA进行亚硫酸盐转化,得到转化后的DNA;
(3)将步骤(2)所述甲基化的DNA与引物探针组合混合,制备得到PCR反应体系,并进行PCR扩增检测,根据所述PCR扩增的结果得到检测结果;
优选地,步骤(1)所述样本包括尿沉渣细胞。
本发明提供的所述试剂盒的使用方法操作简便,检测灵敏度高,准确性高,且样本为尿沉渣细胞,在减少患者的痛苦的基础上可以进行无创检测。
需要说明的是,本发明所述的试剂盒不仅能够应用于早期膀胱癌的诊断,在一些以非治疗和诊断疾病为目的的应用中也具有较为重要的现实意义,例如,在膀胱癌患者的预后监测中或一些治疗膀胱癌的相关药物开发方面,也可以使用本发明所述的试剂盒进行检测。
根据第四方面所述的试剂盒的使用方法,所述PCR扩增条件设置如下:
95℃变性5分钟;随后95℃变性20秒、60℃退火30秒,并进行45个循环;而后,38℃维持30秒。
本发明采用所述的PCR扩增条件,能够保证样本依次进行模板DNA的变性、模板DNA与引物的复性和引物的延伸,实现正确完整的扩增目的,得到复制后的样本DNA以用于后续检测;若退火温度或者退火的循环数有偏差,则会导致扩增效率降低,影响检测效果。
试剂盒检测结果的判读标准:
优选地,所述检测结果的判读标准为:
内参基因的Ct值Ct≤36,HIST1H4F基因的Ct值≤40,则结果为阳性;
内参基因的Ct值≤36,HIST1H4F基因的Ct值>40或无扩增,则结果为阴性;
内参基因的Ct值>36或无扩增,HIST1H4F基因的Ct值为任何结果,结果皆为无效,需要重新提取转化样本后检测。
所述内参基因和HIST1H4F基因的Ct值是指PCR扩增过程中每个反应管内的荧光信号达到设定阈值所经历的循环数,Ct值越小,PCR扩增到达平台期所需循环数越少,则目的基因起始含量越高;反之,Ct值越大,PCR扩增到达平台期所需循环数越多,则目的基因起始含量越低。
本发明提供的试剂盒能够用于检测膀胱癌,操作简便,取样方便,可应用性强。
相对于现有技术,本发明具有以下有益效果:
(1)本发明提供了HIST1H4F基因的引物探针组合,其中HIST1H4F作为膀胱癌甲基化检测基因,能够特异性检测出相关基因的甲基化;
(2)本发明提供的用于膀胱癌早期筛查和/或预后监测引物探针组合还包括内参基因的甲基化引物和探针,本发明优选ACTB基因作为内参基因,用于实时监控样本质量和样本DNA的亚硫酸盐转化过程,保证检测结果的有效性。
(3)本发明提供了一种利用HIST1H4F基因和ACTB基因的引物探针组合的试剂盒,能够对疑似膀胱癌病人的尿液进行检测以筛查膀胱癌,检测灵敏度能够达到100%,特异性能达到92.9%,且能够针对于膀胱癌术后病人可进行肿瘤预后监测随访,减少膀胱镜镜检频率;
(4)本发明提供的检测方法操作简便、快速,安全无创,仅需要30mL尿液便可完成检测,在减少患者痛苦的基础上能够得到准确的检测结果,具有很高的临床应用价值。
附图说明
图1是实施例4中提供的临床确诊为膀胱癌患者尿液样本进行甲基化检测的扩增曲线图;
图2是实施例4中提供的临床确诊为正常体检人群的尿液样本进行甲基化检测的扩增曲线图;
图3是实施例4中提供的受试者工作特征曲线(Receiver OperatingCharacteristic Curve,ROC)。
具体实施方式
下面通过具体实施方式来进一步说明本发明的技术方案。本领域技术人员应该明了,所述实施例仅仅是帮助理解本发明,不应视为对本发明的具体限制。
实施例中未注明具体技术或条件者,按照本领域内的文献所描述的技术或条件,或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者,均为可通过正规渠道商购获得的常规产品。
实施例1
本实施例提供了一种用于检测HIST1H4F和ACTB基因的引物探针组合。
根据美国国立生物技术信息中心(National Biotechnology InformationCenter,NCBI)公开的人类全基因组序列HIST1H4F基因和内参基因ACTB基因序列,针对亚硫酸盐修饰后的序列设计用于膀胱癌检测的特异性的引物探针组合,引物和探针在赛默飞(Thermo Fisher Scientific)公司合成。
HIST1H4F基因扩增引物序列如SEQ ID NO.1-2所示:
SEQ ID NO.1:
5'-GCAAAGGTGGTAAAGGTTTAG-3';
SEQ ID NO.2:
5'-AGATAGAGGTTTCGTTTTCGTT-3'
HIST1H4F基因扩增探针的序列如SEQ ID NO.3所示:
SEQ ID NO.3:
5'-FAM-TGAGTCGAGATTACGTTATTGTATTT-BHQ1-3';
内参基因ACTB扩增引物序列如SEQ ID NO.4-5所示:
SEQ ID NO.4:
5'-GTATGGAGTTTTGTGGTATTTATGA-3'
SEQ ID NO.5:
5'-TAATCTCCTTCTACATCCTATCAAC-3';
ACTB基因扩增探针序列如SEQ ID NO.6所示:
SEQ ID NO.6:
5'-VIC-AGATGTGGATCAGCAAGCAG-BHQ1-3'。
实施例2
本实施例提供一种用于膀胱癌早期筛查和/或预后监测的试剂盒。
所述试剂盒包括实施例1中的HIST1H4F和ACTB基因的引物探针组合,还包括PCR反应液、阳性质控品和阴性质控品。
所述PCR反应液包括10×buffer、dNTPs、Mg2+和Taq酶,均购置于TAKALA公司。
其中,阳性质控品组分为5637人膀胱细胞株DNA,阴性质控品组分为293T细胞DNA。
HIST1H4F基因的正向引物序列如SEQ ID NO.1所示,反向引物序列如SEQ ID NO.2所示,所述荧光探针序列为SEQ ID NO.3,探针5'端标记FAM,探针3'端标记BHQ1。
ACTB基因的正向引物序列如SEQ ID NO.4所示,反向引物序列如SEQ ID NO.5所示,所述荧光探针序列为SEQ ID NO.6,探针5'端标记VIC,探针3'端标记BHQ1。
实施例3
本实施例提供了一种利用实施例1所述的引物探针组合检测尿沉渣细胞样本中的HIST1H4F基因,其中,样本DNA的提取方法和尿沉渣细胞基因组DNA的亚硫酸盐转化方法步骤参考基因组DNA提取(购于广州凯普医药科技有限公司)和亚硫酸盐转化试剂盒(购于广州凯普医药科技有限公司)的说明书进行,具体步骤如下:
1、提取样本的基因组DNA:
(1)将尿液样本混匀后在3000rpm下离心10分钟,弃上清,保留沉淀;
(2)尿沉淀用200μL磷酸盐缓冲液(Phosphate-Buffered Saline,PBS)溶液重悬分装到1.5mL离心管中,加20μL蛋白酶K,混匀;
(3)加入200μL的裂解液,震荡混匀,70℃温水浴中处理10min;
(4)将液体转入带硅胶柱的2mL离心管中,12000rpm下离心30sec,弃废液;
(5)在硅胶柱中加入500μL提取漂洗液W1,12000rpm下离心30sec,重复一次,弃废液;
(6)12000rpm下空管离心1min,弃废液,将吸附柱放入新的1.5mL离心管中,开盖静置2min,彻底挥发乙醇;
(7)往吸附柱中心加入60μL的TE洗脱液,静置2min,12000rpm离心2min后将溶液收集到离心管中。
2、尿沉渣细胞基因组DNA的亚硫酸盐转化:
(1)取0.2mL离心管,加入10μL的DNA溶液,120μL亚硫酸盐溶液,振荡混匀,短暂离心;
(2)在98℃处理10min,64℃处理30min,4℃处理3min;
(3)向吸附柱中加入上一步骤处理后的混合液和500μL结合液充分颠倒混匀,12000rpm下离心30sec,弃废液;
(5)加入600μL漂洗液W1,12000rpm下离心30sec,弃废液;
(6)加入600μL漂洗液W2,室温振荡5min,12000rpm下离心30sec,弃废液;
(7)12000rpm下空管离心1min,弃废液,将吸附柱放入新的1.5mL离心管中,开盖静置2min,彻底挥发乙醇;
(8)向吸附柱加入60μL洗脱缓冲液TE,静置2min,12000rpm离心2min后将溶液收集到离心管中。
3、PCR扩增与检测:
按照下列表1配制20μL的PCR反应液:
表1
将商标配制体系分装于PCR八联管中,做好标记置于ABI 7500进行反应。
仪器荧光通道设置如下表2:
表2
靶基因 | 荧光基团 | 淬灭集团 |
HIST1H4F | FAM | 无 |
ACTB | VIC | 无 |
扩增程序设定如下表3:
表3
PCR结果判读如下表4所示:
若判读结果为阴性,患膀胱癌的风险较低,建议定期随访;若判读结果为阳性,患膀胱癌的风险较高,建议镜检或组织活检确认。
表4
实施例4
本实施例按照实施例3所述的方法检测膀胱癌患者和非膀胱癌患者的尿液样本。
取71位经过膀胱镜或组织病理学确认的膀胱癌患者和非膀胱癌患者的尿液30mL,提取尿液DNA,并把DNA经过亚硫酸盐转化后,进行检测。
检测结果如下表5所示(其中NoCt表示无扩增):
表5
验证评估结果如表5所示,可以看到29例膀胱癌患者和42例非膀胱癌患者(包括其他癌症,膀胱炎等良性疾病,膀胱癌术后无复发者)的尿液样本,HIST1H4F指标在29例膀胱癌患者中,检测阳性为29例,灵敏度为100%;在42例非膀胱癌患者样本中,有3例检测为阳性(1例为输尿管癌,1例为前列腺癌,1例为膀胱癌术后未复发),特异性为92.9%,对于17例正常体检样本,检测皆为阴性,特异性为100%。
本实施例中提供的临床确诊为膀胱癌患者尿液样本进行甲基化检测的扩增曲线如图1所示,可以看出内参基因的Ct值≤36,HIST1H4F基因的Ct值≤40且有“S”扩增曲线,表明检测结果为阳性,HIST1H4F基因发生了甲基化;本实施例中提供的临床确诊为正常体检人群尿液样本进行甲基化检测的扩增曲线如图2所示,可以看出内参基因的Ct值≤36,HIST1H4F基因无扩增,表明检测结果为阴性,HIST1H4F基因未发生甲基化;本实施例中提供的受试者工作特征曲线如图3所示,可以看出ROC曲线接近左上角,说明得到的预测结果准确率高。
实施例5
本实施例与实施例2相比,除PCR扩增程序设定如下表6外,其余参数与实施例2保持一致:
表6
对比例1
本对比例提供了一种与实施例1不同的引物探针组合,所述基因探针组合包括VIM基因和内参基因B2M基因的引物探针组合,根据美国国立生物技术信息中心(NationalBiotechnology Information Center,NCBI)公开的人类全基因组序列HIST1H4F基因和内参基因ACTB基因序列,针对亚硫酸盐修饰后的序列设计用于膀胱癌检测的特异性的引物探针组合,引物和探针在赛默飞(Thermo Fisher Scientific)公司合成。
对比例2
本对比例提供一种试剂盒,所述试剂盒包括对比例1中的VIM基因和内参基因B2M基因的引物探针组合,还包括PCR反应液、阳性质控品和阴性质控品。所述PCR反应液包括10×buffer、dNTPs、Mg2+和Taq酶,均购置于TAKALA公司。
其中,阳性质控品组分为T24细胞系DNA,阴性质控品组分为293细胞DNA。
VIM检测基因的正向引物序列如SEQ ID NO.7所示,反向引物序列如SEQ ID NO.8所示,所述荧光探针序列为SEQ ID NO.9,探针5'端标记FAM,探针3'端标记BHQ1。
B2M基因的正向引物序列如SEQ ID NO.10所示,反向引物序列如SEQ ID NO.11所示,所述荧光探针序列为SEQ ID NO.12,探针5'端标记VIC,探针3'端标记BHQ1。
VIM基因扩增引物序列如SEQ ID NO.7-8所示:
SEQ ID NO.7:
5'-CCGTGTCCTCGTCCTCCTACCGC-3';
SEQ ID NO.8:
5'-CAGCGCGCTGCGCCCCAGC-3'
VIM基因扩增探针的序列如SEQ ID NO.9所示:
SEQ ID NO.9:
5'-FAM-TGCCGTGCGCCTGCGGAGCA-BHQ1-3';
内参基因B2M扩增引物序列如SEQ ID NO.10-11所示:
SEQ ID NO.10:
5'-CTATGTGGGCGACGAGGCCCAG-3'
SEQ ID NO.11:
5'-CGCGAGAAGATGACCCAGGTGA-3';
B2M基因扩增探针序列如SEQ ID NO.12所示:
SEQ ID NO.12:
5'-VIC-CTGGGACGACATGGAGAAA-BHQ1-3'。
对比例3
本对比例按照实施例3所述的方法检测膀胱癌患者和非膀胱癌患者的尿液样本。
取20位经过膀胱镜或组织病理学确认的膀胱癌患者和非膀胱癌患者的尿液30mL,提取尿液DNA,并把DNA经过亚硫酸盐转化后,进行检测。
以20例膀胱癌患者和20例非膀胱癌患者(包括其他癌症,膀胱炎等良性疾病,膀胱癌术后无复发者)的尿液样本,VIM指标在20例膀胱癌患者中,检测阳性为8例,灵敏度为40%;在10例非膀胱癌患者样本中,有1例检测为阳性(1例为输尿管癌),特异性为90%,对于10例正常体检样本,检测4例为阳性,特异性为60%。
综上所述,本发明提供的HIST1H4F引物探针组合,HIST1H4F作为膀胱癌甲基化检测基因,能够特异性检测出膀胱癌相关基因的甲基化,同时优选ACTB基因作为内参基因,实时监控样本质量,利用HIST1H4F基因和ACTB基因的引物探针组合制备的试剂盒,可以用于膀胱癌的早期筛查和预后检测,与采用其他基因的引物探针组合制备的试剂盒相比,具有灵敏度更高、特异性更强的优点,同时操作简单、方便快捷、安全无创,有利于临床应用和推广,对膀胱癌的早期诊断、治疗和复发监测,具有非常重要的现实意义。
申请人声明,以上所述仅为本发明的具体实施方式,但本发明的保护范围并不局限于此,所属技术领域的技术人员应该明了,任何属于本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内,可轻易想到的变化或替换,均落在本发明的保护范围和公开范围之内。
SEQUENCE LISTING
<110> 广州凯普医药科技有限公司,潮州凯普生物化学有限公司,广东凯普生物科技股份有限公司
<120> 一种用于膀胱癌早期筛查和/或预后监测的引物探针组合及试剂盒
<130> 20210927
<160> 12
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 1
gcaaaggtgg taaaggttta g 21
<210> 2
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 2
agatagaggt ttcgttttcg tt 22
<210> 3
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 3
tgagtcgaga ttacgttatt gtattt 26
<210> 4
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 4
gtatggagtt ttgtggtatt tatga 25
<210> 5
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 5
taatctcctt ctacatccta tcaac 25
<210> 6
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 6
agatgtggat cagcaagcag 20
<210> 7
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 7
ccgtgtcctc gtcctcctac cgc 23
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<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 8
cagcgcgctg cgccccagc 19
<210> 9
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 9
tgccgtgcgc ctgcggagca 20
<210> 10
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 10
ctatgtgggc gacgaggccc ag 22
<210> 11
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 11
cgcgagaaga tgacccaggt ga 22
<210> 12
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 12
ctgggacgac atggagaaa 19
Claims (9)
1.一种用于膀胱癌早期筛查和/或预后监测的引物探针组合,其特征在于,所述引物探针组合包括HIST1H4F基因的甲基化引物和探针;
所述HIST1H4F基因的甲基化引物包括如SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示的核苷酸序列;
所述HIST1H4F基因的探针包括如SEQ ID NO.3所示的核苷酸序列;
所述引物探针组合还包括内参基因的甲基化引物和探针;
所述内参基因包括ACTB基因;
所述ACTB基因的甲基化引物包括如SEQ ID NO.4和SEQ ID NO.5所示的核苷酸序列;
所述ACTB基因的探针包括如SEQ ID NO.6所示的核苷酸序列。
2.根据权利要求1所述的用于膀胱癌早期筛查和/或预后监测的引物探针组合,其特征在于,所述HIST1H4F基因的探针的5'端标记有荧光基团A,3'端标记有淬灭基团A;
所述内参基因的探针的5'端标记有荧光基团B,3'端标记有淬灭基团B,其中,所述荧光基团A与荧光基团B不同,所述淬灭基团A和淬灭基团B相同或不同。
3.一种如权利要求1-2中任一项所述的引物探针组合在制备用于膀胱癌早期筛查和/或预后监测的试剂盒中的应用。
4.一种用于膀胱癌早期筛查和/或预后监测的试剂盒,其特征在于,所述试剂盒包括权利要求1-2中任一项所述的引物探针组合。
5.根据权利要求4所述的试剂盒,其特征在于,所述试剂盒还包括PCR反应液、阳性质控品和阴性质控品。
6.根据权利要求5所述的试剂盒,其特征在于,所述PCR反应液包括PCR反应缓冲液、dNTPs、Mg2+和Taq酶。
7.一种如权利要求4-6中任一项所述的试剂盒的非治疗和诊断疾病为目的的使用方法,其特征在于,所述使用方法包括以下步骤:
(1)提取样本的基因组DNA;
(2)对步骤(1)中所述提取得到的DNA进行亚硫酸盐转化,得到转化后的DNA;
(3)将步骤(2)所述甲基化的DNA与引物探针组合混合,制备得到PCR反应体系,并进行PCR扩增检测,根据所述PCR扩增的结果得到检测结果。
8.根据权利要求7所述的试剂盒的非治疗和诊断疾病为目的的使用方法,其特征在于,步骤(1)所述样本包括尿沉渣细胞。
9.根据权利要求7所述的试剂盒的非治疗和诊断疾病为目的的使用方法,其特征在于,所述PCR扩增条件为:
95℃变性5分钟;随后95℃变性20秒、60℃退火30秒,并进行45个循环;而后,38℃维持30秒;
其中,所述检测结果的判读标准为:
内参基因的Ct值Ct≤36,HIST1H4F基因的Ct值≤40,则结果为阳性;
内参基因的Ct值≤36,HIST1H4F基因的Ct值>40或无扩增,则结果为阴性;
内参基因的Ct值>36或无扩增,HIST1H4F基因的Ct值为任何结果,结果皆为无效,需要重新提取转化样本后检测。
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