CN118006781A - 用于检测尿路上皮癌的标志物、引物组、高敏感性和高特异性的试剂盒及检测方法 - Google Patents
用于检测尿路上皮癌的标志物、引物组、高敏感性和高特异性的试剂盒及检测方法 Download PDFInfo
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Abstract
本发明属于生物技术领域，特别涉及一种用于检测尿路上皮癌的标志物、引物组、高敏感性和高特异性的试剂盒及检测方法。本发明通过重新选择标志物，设计引物和探针，避免非特异性扩增；然后通过调整引物探针的浓度比例以及PCR反应条件，通过基于最低检出限研究设定阳性阈值和三次重复实验，避免群体偏差和随机噪声，开发出的检测试剂盒，在80例UC和130例非癌个体中进行检测。结果敏感性高达97.5％，特异性高达96.9％，与现有产品相比，敏感性和特异性均有显著提高，比现有产品更适合于临床辅助诊断和群体筛查。
Description
技术领域
本发明涉及生物技术领域，特别是涉及一种用于检测尿路上皮癌的标志物、引物组、高敏感性和高特异性的试剂盒及检测方法。
背景技术
尿路上皮癌(urothelial carcinoma,UC)是泌尿系最常见的恶性肿瘤之一，包括位于下尿路的膀胱和尿道恶性肿瘤及位于上尿路的肾盂和输尿管恶性肿瘤，其中约90％为膀胱UC。根据世界卫生组织的数据，全球每年新增膀胱UC近80万例，而我国仅每年新增膀胱UC近10万例。我国目前膀胱UC发病人数已达到130万人，位居全球第六位。男性发病率是女性的4-5倍。45岁以上男性是高发人群。
UC的术前定性诊断主要依靠输尿管镜检查和病理活检，目前的无创尿液诊断技术如尿脱落细胞学和荧光原位杂交(fluorescence in situ hybridization，FISH)等检查的敏感性较低(分别为：40-50％和60-70％)，难以满足临床需求。最近，广州市基准医疗有限责任公司(简称基准医疗)开发的基于人ONECUT2和VIM基因的尿液DNA甲基化qPCR检测试剂盒(专利号：CN110872631B)，在两组疑似膀胱UC患者(一组192人，另一组98人)中进行检测(Clin Epigenet.2021,13:91)，敏感性分别为88.1％和91.2％，特异性分别为89.7％和85.7％。接着，该试剂盒又在两组疑似上尿路UC(一组153人，另一组75人)中进行检测(中华泌尿外科杂志，2023，44(10)：725-730)，敏感性分别为83.0％和85.2％，特异性分别为92.0％和85.7％。总之，该试剂盒检测UC的敏感性和特异性都在80-90％，远高于传统的无创技术(脱落细胞学和FISH)而且操作方便，价格便宜，有望在临床应用。
但是，该试剂盒敏感性和特异性都还有待提高，只有80-90％，容易造成误诊。而UC的特点是发病隐匿；患者即使出现血尿，也有80-90％不是UC。大量的误诊会给患者和医院造成负担，不得不进行大量的内窥镜检查，既有创而且费用高昂。
发明内容
针对上述问题，本发明针对现有检测体系的缺陷(非特异性扩增和系统偏差)做出改进，提供一种高敏感性和高特异性的用于尿路上皮癌检测的试剂盒及检测方法，敏感性高达97.5％，特异性高达96.9％，与现有产品相比，显著性和敏感性均有显著提高，更适合于临床辅助诊断和群体筛查。
本发明的第一方面提供了一种用于尿路上皮癌检测的标志物，所述标志物为由CG指示的共甲基化区域的核苷酸序列如SEQ ID NO.1的靶基因1和核苷酸序列如SEQ ID NO.2的靶基因2的组合或其完全互补序列的组合。
本发明的第二方面提供了一种用于检测尿路上皮癌的引物组，所述引物组包括：
针对靶基因1SEQ ID NO.1的引物组5584-1216-2，其由核苷酸序列如SEQ ID NO.3的正向引物和核苷酸序列如SEQ ID NO.4的反向引物，以及核苷酸序列如SEQ ID NO.5的探针组成；
针对靶基因2SEQ ID NO.2的引物组4092-0204，其由核苷酸序列如SEQ ID NO.6的正向引物和核苷酸序列如SEQ ID NO.7的反向引物以及核苷酸序列如SEQ ID NO.8的探针组成。
在一种或多种实施方式中，所述的引物组还包括针对内参基因ACTB的内参ACTB引物组，其由核苷酸序列如SEQ ID NO.9的正向引物和核苷酸序列如SEQ ID NO.10的反向引物，以及核苷酸序列如SEQ ID NO.11的探针组成。
本发明的第三方面提供了一种高敏感性和高特异性的用于检测尿路上皮癌的试剂盒，包括上述的引物组5584-1216-2和引物组4092-0204，或包括上述的引物组5584-1216-2和引物组4092-0204以及内参引物组，优选地，所述内参引物组为上述的内参ACTB引物组。
在一种或多种实施方式中，所述的试剂盒还包括核酸提取试剂、核酸转化试剂中的至少1种。
在一种或多种实施方式中，所述试剂盒为qPCR试剂盒。
在一种或多种实施方式中，所述qPCR试剂盒反应体积25μl。
在一种或多种实施方式中，所述qPCR试剂盒中，所述5584-1216-2引物组中正向引物和反向引物浓度均为0.2μM，探针浓度为0.1μM；
所述4092-0204引物组中正向引物和反向引物浓度均为0.4μM，探针浓度为0.2μM；
所述内参ACTB引物组中正向引物和反向引物浓度均为0.4μM，探针浓度为0.2μM。
本发明的第四方面提供了一种高敏感性和高特异性的用于尿路上皮癌的qPCR检测方法，包括如下步骤：
(1)提取尿液样本中的DNA；
(2)对提取的DNA样品进行亚硫酸氢盐转化；
(3)样品DNA检测：使用引物组5584-1216-2和引物组4092-0204或含有引物组5584-1216-2和引物组4092-0204的上述检测盒，以ACTB为内参基因，对转化后的DNA样本进行三重qPCR检测，并根据检测数据判定检测结果；
判定标准如下：最低检出限为1.25％，①当内参基因Ct值Ct ACTB≤35时，检测结果有效；Ct ACTB＞35，检测结果无效；②当标志物靶基因1或2与内参基因ACTB的Ct差值ΔCt≤8时；判定为样本阳性；③当标志物靶基因1或2与内参基因ACTB的Ct差值ΔCt均＞8时，判定为样本阴性；以避免群体偏差和随机噪声。
在一种或多种实施方式中，所述步骤(3)中，qPCR检测反应程序为：95℃30秒；95℃15秒，62℃15秒，于62℃收集荧光信号，45个循环。
在一种或多种实施方式中，每个样品进行三次重复实验，进一步避免群体偏差和随机噪声。
与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：
本发明通过重新设计引物和探针，避免非特异性扩增；然后通过调整引物探针的浓度比例以及PCR反应条件，通过基于最低检出限研究设定阳性阈值和三次重复实验，避免群体偏差和随机噪声，开发出的检测试剂盒，在80例UC和130例非癌个体中进行检测。结果敏感性高达97.5％，特异性高达96.9％，与现有产品相比，敏感性和特异性均有显著提高，比现有产品更适合于临床辅助诊断和群体筛查。
附图说明
图1为人VIM基因(cg12874092位点)和ONECUT2基因(cg10835584位点)在阳性对照和阴性对照中的一代测序结果；蓝色峰代表胞嘧啶信号，即甲基化水平；
图2为基准医疗和本发明的引物组的空白、阴性和阳性对照实验研究结果示意；
图3为本发明的引物探针设计示意图，图A为4092-0204引物组设计示意，图B为5584-1216-2引物组设计示意图；
图4为本发明的最低检出限研究临床样品测试结果；
图5为本发明的试剂盒与基准医疗中试剂盒性能对比示意图，*代表P<＝0.05。
具体实施方式
为了便于理解本发明，下面将参照相关附图对本发明进行更全面的描述。附图中给出了本发明的较佳实施例。但是，本发明可以以许多不同的形式来实现，并不限于本文所描述的实施例。相反地，提供这些实施例的目的是使对本发明的公开内容的理解更加透彻全面。
下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如Sambrook等人，分子克隆：实验室手册(New York:Cold Spring Harbor Laboratory Press,1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。实施例中所用到的各种常用化学试剂，均为市售产品。
本发明的描述中，参考术语“一些实施例”、“示例”等的描述意指结合该实施例或示例描述的具体方法、材料包含于本发明的至少一个实施例或示例中。在本说明书中，对上述术语的示意性表述不一定指的是相同的实施例或示例。而且，描述的具体方法、材料可以在任何的一个或多个实施例或示例中以合适的方式结合。
除非另有定义，本文所使用的所有的技术和科学术语与属于本发明的技术领域的技术人员通常理解的含义相同。本文中在本发明的说明书中所使用的术语只是为了描述具体的实施例的目的，不是旨在于限制本发明。
术语：
如本发明所用，“标志物(标记物)”是指生物分子或生物分子片段，其变化和/或检测可以与特定身体状况或状态相关。术语“标志物(标记物)”、“分子标志物(标记物)”或“生物标志物(标记物)”在整个发明公开中可互换使用。本发明中，除非另外说明，所述“标志物(标记物)”是指“癌症(肿瘤)标志物”。本发明中，除非另外说明，所述癌症为尿路上皮癌。
如本发明所用，所述的“检测”包括“评估”、“测定”、“分析”、“预测”、“评价”；所述的“评价”或“评估”也包括“评分”。
如本发明所用，所述“患者”、“受试者”或“个体”可以指生物体，在某些方面，受试者可以是人。提供样品的受试者可以包括潜在疾病风险的人群或确诊为疾病的人群。本发明中所述疾病指尿路上皮癌。
如本发明所用，所述的“样本”与“样品”可互换使用，其包括从个体或分离的组织、细胞(例如上皮细胞)或体液(例如尿液、血清、血浆)中获得的、适合于进行肿瘤标志物检测的物质。
如本发明所用，所述的“尿路上皮癌”是指在包含膀胱、肾盂、输尿管、尿道的尿路的上皮细胞发生的癌。尿路上皮癌由于异时性或同时性多发，因此，本发明的“尿路上皮癌”包含原发癌和已在组织内转移的癌。在一些具体的实施方案中，按肿瘤发生的部位进行分类，所述尿路上皮癌包括但不限于：肾盂癌、输尿管癌、膀胱癌和尿道癌。应理解，所述尿路上皮癌包括高级别的尿路上皮癌，也包括低级别的尿路上皮癌。
如本发明所用，“互补”和“互补性”是指与碱基配对规则相关的核苷酸(例如，1个核苷酸)或多核苷酸(例如核苷酸的序列)。例如，序列5′-A-G-T-3′与序列3′-T-C-A-5′互补。互补可以是“部分的”，其中仅一些核酸碱基根据碱基配对规则进行匹配。或者，核酸之间可能存在“完全”或“总”互补。核酸链之间的互补程度影响核酸链之间杂交的效率和强度。这在扩增反应和依赖核酸之间的结合的检测方法中尤其重要。
如本发明所用，“甲基化”是指胞嘧啶位置C5或N4的胞嘧啶甲基化，腺嘌呤的N6位点或其他类型的核酸甲基化。体外扩增的DNA通常是未甲基化的，因为通常体外DNA扩增方法不能保留扩增模板的甲基化模式。然而，“未甲基化DNA”或“甲基化DNA”也可以分别指原始模板未甲基化或甲基化的扩增DNA。
甲基化状态可任选地由“甲基化值”表示或指示(例如，表示甲基化频率、分数、比例、百分比等)。甲基化值可以例如在用甲基化依赖性限制酶限制性消化之后定量存在的完整核酸的量，或者通过比较亚硫酸氢盐反应后的扩增谱，或者通过比较亚硫酸氢盐处理和未处理的核酸的序列来产生。因此，诸如甲基化值的值代表甲基化状态，因此可用作基因座的多个拷贝中甲基化状态的定量指标。共甲基化程度由多于一个甲基化位点的甲基化状态表示或指示，在一段甲基化区域内，当多于一个甲基化位点的甲基化状态均为甲基化时定义为共甲基化。
共甲基化检测方法包括：甲基化特异性PCR(MSP)、DNA甲基化芯片、靶向DNA甲基化测序、数字PCR定量及荧光定量PCR。
在一些实施方案中，通过本领域中的任何标准手段，包括使用可商购的试剂盒，来分离DNA(例如，基因组DNA，如提取的基因组DNA或经处理的基因组DNA)。
如本发明所用，“甲基化测定”是指用于确定核酸序列内的一个或多个CpG二核苷酸序列的甲基化状态的任何测定。
本发明实施例所用试剂、材料、设备如无特殊说明，均为市售来源；试验方法如无特殊说明，均为本领域的常规试验方法。
材料与方法
1、样本收集
210例尿液样本(80例UC和130非UC)收集自南方医科大学珠江医院,在广州中鑫基因医学科技有限公司进行检测。每个样本采尿液50ml～100ml，均为疑似UC病例且未治疗。本研究遵循的程序符合2013年修订的《世界医学协会赫尔辛基宣言》要求。
2、尿液脱落细胞DNA提取
实施例中采用广州美基生物科技有限公司生产的HiPure Tissue DNA MicroKits微量DNA提取试剂盒(过柱法)提取膀胱脱落细胞DNA。回收得到的DNA片段用qubit测试浓度。也可以采用其他市售的试剂进行DNA提取。
3、DNA转化
通常通过亚硫酸氢盐转化的DNA进行全基因组的扩增，进而进行MSP测序。本发明实施例中采用zymo research的Lightning Conversion Reagent的亚硫酸氢盐转化试剂盒来转化DNA，用于下游的甲基化qPCR MSP检测(针对甲基化片段进行检测)。按照说明书进行亚硫酸氢盐进行转化。
4、一代测序分析
使用olig7或methyl express软件，针对设计BSP引物。扩增产物送到广州艾基生物技术有限公司进行一代测序。测序结果用SnapGene 4.3.6软件进行分析。
5、统计分析：
采用R语言4.3.1统计软件处理数据。2种检查方法效能采用率表示，组间比较采用χ2检验。统计柱状图数据以均数和95％CI表示，采用Wald法计算95％CI。以P＜0.05为差异有统计学意义。
实施例1现有技术CN110872631B的重现及测序分析
基准医疗的专利(专利号：CN110872631B)针对标志物(序列如表1所示)，包括针对人VIM基因SEQ ID NO.2(cg12874092位点)和ONECUT2基因SEQ ID NO.1(cg10835584位点)设计了三组引物和探针，分别是文中：
(1)针对SEQ ID NO.1的SEQ ID NO.23和SEQ ID NO.45，以及SEQ ID NO.67；
针对SEQ ID NO.2的SEQ ID NO.24和SEQ ID NO.46，以及SEQ ID NO.68；
(2)针对SEQ ID NO.1的SEQ ID NO.89和SEQ ID NO.111，以及SEQ ID NO.133；
针对SEQ ID NO.2的SEQ ID NO.90和SEQ ID NO.112，以及SEQ ID NO.134；
(3)针对SEQ ID NO.1的SEQ ID NO.155和SEQ ID NO.177，以及SEQ ID NO.199；
针对SEQ ID NO.2的SEQ ID NO.156和SEQ ID NO.178，以及SEQ ID NO.200。
同时，说明书实施例6中，给出相应的实验条件(反应体积25μl，最终引物/探针浓度为0.24μM/0.12μM，qPCR反应程序为：95℃5分钟；95℃15秒，62℃40秒，于62℃收集荧光信号，60个循环。
发明人先采用上述的用基准医疗的体系进行qPCR实验：空白对照、阴性对照(健康人)和阳性对照(UC病人)，并进行一代测序分析。针对设计BSP引物如表1所示。
表1 BSP测序引物
一代测序结果如图1所示，可以看出阳性对照在两个位点均有甲基化，而阴性对照在两个位点均无甲基化。
qPCR结果如图2所示，结果表明基准医疗的三组引物探针在空白对照或者阴性对照靶基因均有起信号(图2A-C)，说明均有不同程度非特异性扩增。其中，基准医疗的第二组引物探针非特异性扩增信号最少。因此，接下来发明人选择这一组做临床实验，并进行改进，以克服现有技术基准医疗实验体系的非特异性扩增问题。
实施例2新的标志物及引物组设计
在实施例1的基础上，为了克服现有技术基准医疗实验体系的非特异性扩增问题，重新设计检测区域，提出了新的用于尿路上皮癌检测的标志物，所述标志物序列如表2所示。新的检测区域与基准医疗专利CN110872631B中标志物检测区域虽然有重叠，但低于基准医疗>70％的专利要求。
表2标志物序列
针对表2中的标志物序列重新设计引物和探针(图3)。其中针对人ONECUT2基因(cg10835584位点)设计的引物组名称为5584-1216-2。其与基准医疗的SEQ ID NO.1的SEQID NO.155和SEQ ID NO.177，以及SEQ ID NO.199的相似度分别是：100％，84％，54％和74％。针对人VIM基因(cg12874092位点)设计的引物组名称为4092-0204，其与基准医疗的SEQ ID NO.2的SEQ ID NO.90和SEQ ID NO.112，以及SEQ ID NO.134的相似度分别是：62％，0％，0％和67％。与基准医疗专利中的引物探针组序列并不相同。重新设计的引物组5584-1216-2和4092-0204的序列如表3所示。
表3引物组序列
实施例3qPCR检测
根据实施例2建立的引物组，以ACTB为内参基因，把新设计的引物组5584-1216-2和4092-0204以及内参ACTB的引物探针进行组合，建立三重qPCR体系。试剂采用康为世纪的FastStar Probe Kit，对转化后的尿液DNA样本进行qPCR测试。
qPCR反应体积25μl，5584-1216-2的引物组的引物/探针浓度为0.2μM/0.1μM，内参ACTB和4092-0204引物组的引物/探针浓度是5584-1216-2引物组的的两倍(0.4μM/0.2μM)，
qPCR反应程序为：95℃30秒；95℃15秒，62℃15秒，于62℃收集荧光信号，45个循环。
开展空白对照、阴性对照和阳性对照实验，结果显示不会出现非特异性扩增，不影响准确性，详细如图2D所示。
实施例4判定方法改进
基准医疗的专利(专利号：CN110872631B)评价体系采用基于一个明确诊断人群(116个UC和76个非癌个体)，训练评价模型的方法(引自Cl i n Ep igenet.2021,13:91和专利CN110872631B的实施例7)。训练的原则是寻找一个阈值，使得能够最好地区分癌与非癌。结果评价体系(引自中华泌尿外科杂志，2023，44(10)：725-730.)如下：
根据ONECUT2与内参基因ACTB的Ct差值(ΔCt值)和VIM基因Ct值，分别与临界值进行比较，获得样本的甲基化情况。结果判定：①当ACTB≤32时，可以进行结果判断，否则样本检测结果无效；②当ONECUT2ΔCt值≤5.7或VIM Ct值≤38.6时，即ONECUT2、VIM任意一个结果为阳性时，判定为样本阳性；③当ONECUT2ΔCt值＞5.7(或结果为未检出)且VIM Ct值＞38.6(或结果为未检出)时，即ONECUT2、VIM结果均为阴性时，判定为样本阴性。
采用这个评价体系，他们在两组疑似膀胱UC患者(一组192人，另一组98人)中进行检测(Clin Epigenet.2021,13:91)，敏感性分别为88.1％和91.2％，特异性分别为89.7％和85.7％。接着，又在两组疑似上尿路UC(一组153人，另一组75人)中进行检测(中华泌尿外科杂志，2023，44(10)：725-730)，敏感性分别为83.0％和85.2％，特异性分别为92.0％和85.7％。
经分析，我们认为基准医疗的专利评价体系会出现系统偏差。理由如下：
基准医疗基于一个不足200人的样本集进行模型训练；面对每年超10万的UC发病人群，该样本集是小样本，无法代表整个发病人群，因此所训练出来的评价模型必然有系统偏差。这也是他们在其它测试人群敏感性和特异性下降的原因。
现有的DNA转化体系容易产生假阳性。现有的甲基化qPCR检测之前，要先用亚硫酸氢盐对DNA进行转化，把未甲基化的C碱基转化成T碱基，而甲基化的C碱基保持不变。但是转化效率通常是99％左右，有将近1％的C碱基不能正常转化，尤其在高GC的区域转化率较差，背景噪音甚至高达10％(Nat Biotechnol.2024.PMID:38168991)。而基准医疗专利体系检测的两个区域正好均落在高GC区域(CpG岛)，因此更容易出现假阳性。
为了克服基准医疗专利评价体系会出现系统偏差问题，本申请进行以下改进：
1)基于最低检出限研究设定阳性判断阈值。
收集3个UC病人的尿液DNA，与健康人的尿液DNA按照1:19比例进行混合，即病人尿液DNA占比为5％；然后进行梯度稀释，得到2.5％、1.25％和0.625％浓度的模版DNA，进行转化和qPCR检测(图4)。目前市面上唯一获得国家三类医疗器械证的膀胱UC尿液检测试剂盒-安徽达健医学科技有限公司(简称达健)的《人Twist1基因甲基化检测试剂盒(荧光PCR法)》的最低检出限是5％。如图4所示，我们根据检测结果的稳定性，将最低检出限设为1.25％，检出精度比达健提高4倍；此处的ΔCt值阈值为8。因此，本申请评价体系对结果判定的标准如下：
①当内参基因Ct值Ct ACTB≤35时，检测结果有效；可以进行结果判断，否则样本检测结果无效；②当标志物靶基因1或2与内参基因ACTB的Ct差值ΔCt≤8时，即其中任一一个靶基因与内参基因的差值结果为阳性时，判定为样本阳性；③当标志物靶基因1或2与内参基因ACTB的Ct差值均为阴性时，判定为样本阴性。
2)阳性结果重复出现，方可判定为阳性。
由于本申请的检测的区域(标志物序列)落在CpG岛位置，而CpG岛的转化效率较低，大约10％的C碱基不能有效转化为T碱基，因此容易出现假阳性。为了避免假阳性，采用重复实验。由两个实验员分别对同一份样本进行转化和qPCR。如果两人的判定结果一致，则直接报告结果。如果两人的判定结果不一致，则需要做第三次实验，取两次一致的结果报告。
实施例5
一种试剂盒，包括引物组4092-0204和5584-1216-2引物、探针，及内参ACTB的引物探针和配套试剂。
然后使用该试剂盒进行尿路上皮癌qPCR检测，所述检测包括如下步骤：
(1)提取尿液样本中的DNA；
(2)对提取的DNA样品进行亚硫酸氢盐转化；
(3)样品DNA检测：使用组装的检测盒，以ACTB为内参基因，对转化后的DNA样本进行三重qPCR检测，并根据检测数据判定检测结果；
qPCR反应体积25μl，5584-1216-2的引物组的引物/探针浓度为0.2μM/0.1μM，内参ACTB和4092-0204引物组的引物/探针浓度是5584-1216-2引物组的的两倍(0.4μM/0.2μM)
qPCR检测反应程序为：95℃30秒；95℃15秒，62℃15秒，于62℃收集荧光信号，45个循环。
判定标准如下：最低检出限为1.25％，①当内参基因Ct值Ct ACTB≤35时，检测结果有效；Ct ACTB＞35，检测结果无效；②当标志物靶基因1或2与内参基因ACTB的Ct差值ΔCt≤8时；判定为样本阳性；③当标志物靶基因1或2与内参基因ACTB的Ct差值ΔCt均＞8时，判定为样本阴性，以避免群体偏差和随机噪声。
两个实验员分别对同一份样本进行转化和qPCR。如果两人的判定结果一致，则直接报告结果。如果两人的判定结果不一致，则需要做第三次实验，取两次一致的结果报告。
对210个疑似UC(80例UC和130例非UC)进行检测，结果如图5所示。
对比例1
根据基准医疗的专利说明书实施例2的第二组引物探针以及实施例6的实验条件，重现了其试剂盒，其中引物探针为CN110872631B中针对SEQ ID NO.1的SEQ ID NO.155和SEQ ID NO.177；及针对SEQ ID NO.2的SEQ ID NO.90和SEQ ID NO.112，以及SEQ IDNO.134；以及内参引物和探针SEQ ID NO.221和SEQ ID NO.222，以及SEQ ID NO.223。
对同样的210个疑似UC(80例UC和130例非UC)进行检测，和实施例5的结果进行对比，结果如图5所示。基准医疗的敏感性为87.5％，特异性为90％，与先前报道的结果一致；而本发明实施例的试剂盒的敏感性为97.5％，特异性则高达96.9％，二者均显著高于基准医疗。因此，本发明试剂盒的检测性能显著优于基准医疗专利CN110872631B的试剂盒，更适合临床辅助诊断以及人群筛查。
以上所述实施例的各技术特征可以进行任意的组合，为使描述简洁，未对上述实施例中的各个技术特征所有可能的组合都进行描述，然而，只要这些技术特征的组合不存在矛盾，都应当认为是本说明书记载的范围。
以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。
Claims (10)
1.一种用于尿路上皮癌检测的标志物，其特征在于，所述标志物为由CG指示的共甲基化区域的核苷酸序列如SEQ ID NO.1的靶基因1和核苷酸序列如SEQ ID NO.2的靶基因2的组合或其完全互补序列的组合。
2.一种用于检测尿路上皮癌的引物组，其特征在于，所述引物组包括：
针对靶基因1的引物组5584-1216-2，其由核苷酸序列如SEQ ID NO.3的正向引物和核苷酸序列如SEQ ID NO.4的反向引物，以及核苷酸序列如SEQ ID NO.5的探针组成；
针对靶基因2的引物组4092-0204，其由核苷酸序列如SEQ ID NO.6的正向引物和核苷酸序列如SEQ ID NO.7的反向引物以及核苷酸序列如SEQ ID NO.8的探针组成。
3.根据权利要求2所述的引物组，还包括针对内参基因ACTB的内参ACTB引物组，其由核苷酸序列如SEQ ID NO.9的正向引物和核苷酸序列如SEQ ID NO.10的反向引物，以及核苷酸序列如SEQ ID NO.11的探针组成。
4.一种高敏感性和高特异性的用于检测尿路上皮癌的试剂盒，其特征在于，包括如权利要求2或3所述的引物组。
5.根据权利要求4所述的试剂盒，其特征在于，还包括核酸提取试剂、核酸转化试剂中的至少1种。
6.根据权利要求4所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒为qPCR试剂盒。
7.根据权利要求4所述的试剂盒，其特征在于，所述5584-1216-2引物组中正向引物和反向引物浓度均为0.2μM，探针浓度为0.1μM；
所述4092-0204引物组中正向引物和反向引物浓度均为0.4μM，探针浓度为0.2μM；
所述内参ACTB引物组中正向引物和反向引物浓度均为0.4μM，探针浓度为0.2μM。
8.一种高敏感性和高特异性的用于尿路上皮癌的qPCR检测方法，其特征在于，包括如下步骤：
(1)提取尿液样本中的DNA；
(2)对提取的DNA样品进行亚硫酸氢盐转化；
(3)样品DNA检测：使用如权利要求2-3任一项所述的引物组或如权利要求4-7任一项所述的检测盒，以ACTB为内参基因，对转化后的DNA样本进行三重qPCR检测，并根据检测数据判定检测结果；
判定标准如下：最低检出限为1.25％，①当内参基因Ct值Ct ACTB≤35时，检测结果有效；Ct ACTB＞35，检测结果无效；②当标志物靶基因1或2与内参基因ACTB的Ct差值ΔCt≤8时；判定为样本阳性；③当标志物靶基因1或2与内参基因ACTB的Ct差值ΔCt均＞8时，判定为样本阴性。
9.根据权利要求8所述的检测方法，其特征在于，所述步骤(3)中，qPCR检测反应程序为：95℃30秒；95℃15秒，62℃15秒，于62℃收集荧光信号，45个循环。
10.根据权利要求8所述的检测方法，其特征在于，每个样品进行三次重复实验。
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