CN117165688A - 用于尿路上皮癌的标志物及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种与尿路上皮癌相关的生物标志物及其应用。所述生物标志物包括TRPS1、HAND2、ZNF154及其甲基化位点，其可以用于尿路上皮癌风险的诊断和/或预测。本发明也提供了适用于尿路上皮癌诊断和/或预测的试剂盒。
Description
技术领域
本发明属于生物医学领域，更具体地，本发明涉及用于尿路上皮癌的标志物及其应用。
背景技术
尿路上皮癌是泌尿外科中常见的临床疾病之一，其中包括膀胱癌、肾盂癌以及输尿管癌等疾病。膀胱内长期慢性炎症刺激及长期异物刺激(留置导尿管、结石)与发生膀胱癌关系密切，主要病理类型为移行细胞癌、鳞状细胞癌和腺癌。既往接受过环磷酰胺化疗、盆腔放疗、滥用非那西汀等均可增加患膀胱癌的风险。膀胱癌占整个尿路上皮癌的90％以上，多数受试者初诊时为非肌层浸润性膀胱癌，其发病具有多中心、易复发、易侵袭、易耐药等生物学特性。尿路上皮癌治疗前基本诊断手段主要包括内镜(膀胱镜和输尿管镜)、影像学检查及活检等，用于尿路上皮癌的定性诊断、定位诊断和分期诊断。其他还包括病史采集、症状评估、体格检查、实验室检查。
血尿检查：全程、无痛、间歇性肉眼血尿是尿路上皮癌的典型症状，但血尿检测具有较高假阳性，导致受试者过度接受了膀胱镜、病理活检等诊断过程。
膀胱镜检查：膀胱镜是最重要的检查，而上尿路上皮癌的诊断往往还需结合输尿管镜检查。由于膀胱镜检查需经过尿道口进入膀胱，这种侵入式的检测方式过程耗时、对原位癌敏感性较差，可能导致尿道损伤、膀胱损伤等并发症且有感染的风险，加上频繁的监测和昂贵的检查费用，多种因素共同造成了受试者对膀胱镜检查的依从性差，不便于病情的管理。
影像学检查：胸、腹、盆腔CT检查是治疗前分期的基本手段，MRI、骨扫描及PET/CT可作为CT疑诊肝转移、淋巴结转移、骨转移及全身转移时的备选手段，上尿路的影像学检查可了解是否合并肾盂和(或)输尿管肿瘤。影像学检查主要目的是了解膀胱病变程度、胸腹盆腔脏器、腹膜后和盆腔淋巴结及上尿路情况，利于判断膀胱癌临床分期。影像学由于自身技术特点只能检测到生长到一定程度的肿瘤，且影像学检查带有辐射伤害。
活检：内镜活检或穿刺活检组织病理学是尿路上皮癌确诊和治疗的依据，通过膀胱镜下活检进行病理检查是诊断尿路上皮癌的金标准，但这种方法从受试者身体获取肿瘤组织，不但操作技术难度大、成本高、效率低、过程会导致受试者非常痛苦、术后容易导致受试者的尿路感染，并且在膀胱癌的早期诊断中，这种传统的检测方法敏感性和特异性较低，容易出现较高的假阳性。活检依从性较差，无法大批量进行筛查、不便于病情的管理，而且受到医生技术水平及受试者身体状况等诸多因素影响，不能用于早期筛查和大面积临床诊断。
尿细胞学及肿瘤标志物检查：液体活检相比膀胱镜更加简便化，且随着技术不断进步，尿细胞学及肿瘤标志物检测的无创诊断方式越来越受到青睐。尿脱落细胞学检查具有高度特异性，但缺乏敏感性(25％-35％)，特别是对低级别的BCa(4％-15％)。UroVysion荧光原位杂交(FISH)具有较高的敏感性(60％～80％)，广泛应用于临床常规检测BCa，但对低级别或小肿瘤的敏感性较低。
肿瘤标志物检测常采用免疫组织化学(Immunohistochemistry,IHC)检测的方法。免疫组织化学检测利用了抗原抗体特异性结合的原理，通过化学反应使标记抗体的显色剂(荧光素、酶、金属离子、同位素)显色来确定组织或细胞内的抗原(多肽和蛋白)，对其定位、定性及相对定量的研究。由于免疫组化具有特异性强、敏感性高、定位准确等特点，且能将形态研究与功能研究有机的结合在一起，其已经广泛地应用于生物学和医学研究的许多领域。肿瘤标志物检测在多种肿瘤的诊断中起着非常重要的作用，虽然已经有多个生物标志物产品，如BTA-Track，NMP22、UroVysion等批准上市，但这些产品均存在敏感性或特异性明显偏低的现象。
因此，需要探究敏感性和特异性均较高的检测尿路上皮癌的标志物。
发明内容
本发明的目的在于提供一种与尿路上皮癌相关的生物标志物及其应用。所述生物标志物包括TRPS1、HAND2、ZNF154及其甲基化位点，其可以用于尿路上皮癌风险的诊断和/或预测。本发明也提供了适用于尿路上皮癌诊断和/或预测的试剂盒。
在本发明的第一方面，提供一种用于检测标志物甲基化水平的试剂在制备用于尿路上皮癌的检测系统中的应用；所述标志物包括TRPS1；或所述标志物包括TRPS1中至少1个CpG位点。
在一种或多种实施方式中，所述标志物还包括HAND2，和/或ZNF154。
在一种或多种实施方式中，所述标志物选自如下的任一组：
(1)TRPS1；
(2)TRPS1和HAND2；
(3)TRPS1和ZNF154；
(4)TRPS1、HAND2和ZNF154。
在一种或多种实施方式中，以GRCh37.p13，hg19为参考基因组，所述TRPS1包括或为Chromosome 8:116679699-116681623区域；所述HAND2包括或为Chromosome 4:174450190-174450702区域；所述ZNF154包括或为Chromosome 19:58220195-58220937区域。
在一种或多种实施方式中，所述标志物包括TRPS1、HAND2和ZNF154中至少1个基因中的至少1个CpG位点。
在一种或多种实施方式中，以GRCh37.p13，hg19为参考基因组，所述TRPS1的CpG位点选自Chromosome 8:116679699-116681623区域中的CpG位点；所述HAND2的CpG位点选自Chromosome 4:174450190-174450702区域中的CpG位点；所述ZNF154的CpG位点选自Chromosome 19:58220195-58220937区域中的CpG位点。
在一种或多种实施方式中，以GRCh37.p13，hg19为参考基因组，所述TRPS1的CpG位点选自Chromosome 8:116679699-116679792(T1)、116679824-116679911(T2)、116680057-116680142(T3)、116680166-116680258(T4)、116680292-116680493(T5)、116680528-116680685(T6)、116680689-116680881(T7)、116681000-116681149(T8)、116681171-116681317(T9)、116681321-116681463(T10)、116681494-116681623(T11)、116680395-116680396(T12)任一区域中的CpG位点；所述HAND2的CpG位点选自Chromosome 4:174450701-174450610(H1)或174450526-174450487(H2)区域中的CpG位点；所述ZNF154的CpG位点选自Chromosome 19:58220378-58220316(Z1)或58220262-58220208(Z2)区域中的CpG位点。
在一种或多种实施方式中，所述检测系统包括：检测试剂、试剂盒或检测装置。
在一种或多种实施方式中，所述检测试剂包括：PCR检测试剂、测序试剂。
在一种或多种实施方式中，所述检测试剂包括：特异性扩增所述标志物基因的引物、特异性识别标志物基因的探针。
在一种或多种实施方式中，所述试剂盒中包括所述的检测试剂。
在一种或多种实施方式中，所述试剂盒还包括核酸提取试剂、核酸转化试剂、对照体系中的至少1种。
在一种或多种实施方式中，所述检测装置包括：基因测序仪器、芯片、探针组、引物组或内参基因组。
在一种或多种实施方式中，所述对照体系包括内控试剂和/或外控试剂。
在一种或多种实施方式中，所述对照体系包括或为ACTB。
在一种或多种实施方式中，所述引物的核苷酸序列为如SEQ ID NO：1～4、6～9、11～14、16～19、21～24、26～29、31～34、36～39、41-42、44-45、47-48、50-51、53-54、56-57、59-60、62-63任一所示，或与SEQ ID NO：1～4、6～9、11～14、16～19、21～24、26～29、31～34、36～39、41-42、44-45、47-48、50-51、53-54、56-57、59-60、62-63任一所示的序列具有85％以上(例如88％以上、90％以上、92％以上、95％以上、97％以上、98％以上、99％以上、99.9％以上)的同源性。
在一种或多种实施方式中，所述探针的核苷酸序列为如SEQ ID NO：5、10、15、20、25、30、35、40、43、46、49、52、55、58、61、64任一所示，或与SEQ ID NO：5、10、15、20、25、30、35、40、43、46、49、52、55、58、61、64任一所示的序列具有85％以上(例如88％以上、90％以上、92％以上、95％以上、97％以上、98％以上、99％以上、99.9％以上)的同源性。
在一种或多种实施方式中，所述的引物或探针是由SEQ ID NO：1、3、5所示，SEQ IDNO：7、8、10所示，SEQ ID NO：11、14、15所示，SEQ ID NO：17、19、20所示，SEQ ID NO：21、24、25所示，SEQ ID NO：26、28、30所示，SEQ ID NO：32、33、35所示、SEQ ID NO：37、39、40所示、SEQ ID NO：41、42、43所示、SEQ ID NO：44、45、46所示、SEQ ID NO：47、48、49所示、SEQ IDNO：50、51、52所示、SEQ ID NO：53、54、55所示、SEQ ID NO：56、57、58所示、SEQ ID NO：59、60、61所示或SEQ ID NO：62、63、64所示的多核苷酸或者它们的互补链的组合构成的引物组。
在一种或多种实施方式中，所述检测的方法包括：
(a)对于待测样本，获得其中标志物的甲基化信息；
(b)根据(a)的甲基化信息，分析标志物的甲基化水平，从而判断待测样本患有尿路上皮癌的风险。
在一种或多种实施方式中，(a)中，甲基化信息包括甲基化比例、平均甲基化比例、logFC中的至少1个信息，至少2个信息或全部信息。
在一种或多种实施方式中，(b)中，若标志物的甲基化水平高，评价为：存在较高的患有尿路上皮癌的风险，或肿瘤恶性的风险高，或生存期短的可能性大；若标志物的甲基化水平低，评价为：存在较低的患有尿路上皮癌的风险，或肿瘤恶性的风险低，或生存期长的可能性大。
在一种或多种实施方式中，所述甲基化水平高是指：当标志物为一个时，甲基化水平判定为阳性；当标志物为多个时，至少一个(单阳判阳)、至少两个(二阳判阳)、至少三个(三阳判阳)或更多个标志物的甲基化水平判定为阳性。
在一种或多种实施方式中，所述尿路上皮癌包括：肾盂癌、输尿管癌、膀胱癌和尿道癌。
在本发明的第二方面，提供用于尿路上皮癌的风险判定的引物或探针，其与经甲基化(较佳为亚硫酸氢盐)处理后的标志物所含的至少1个CpG位点杂交。
在一种或多种实施方式中，所述杂交包括与CpG位点的正义链或反义链杂交。
在一种或多种实施方式中，所述标志物包括TRPS1；较佳地还包括HAND2和/或ZNF154；更佳地，所述标志物选自如下的任一组：(1)TRPS1；(2)TRPS1和HAND2；(3)TRPS1和ZNF154；(4)TRPS1、HAND2和ZNF154。
在一种或多种实施方式中，以GRCh37.p13，hg19为参考基因组，所述TRPS1的CpG位点选自Chromosome 8:116679699-116681623区域中的CpG位点；所述HAND2的CpG位点选自Chromosome 4:174450190-174450702区域中的CpG位点；所述ZNF154的CpG位点选自Chromosome 19:58220195-58220937区域中的CpG位点。
在一种或多种实施方式中，所述引物的核苷酸序列包括或为如SEQ ID NO：1～4、6～9、11～14、16～19、21～24、26～29、31～34、36～39、41-42、44-45、47-48、50-51、53-54、56-57、59-60、62-63任一所示，或与SEQ ID NO：1～4、6～9、11～14、16～19、21～24、26～29、31～34、36～39、41-42、44-45、47-48、50-51、53-54、56-57、59-60、62-63任一所示的序列具有85％以上(例如88％以上、90％以上、92％以上、95％以上、97％以上、98％以上、99％以上、99.9％以上)的同源性。
在一种或多种实施方式中，所述探针的核苷酸序列包括或为如SEQ ID NO：5、10、15、20、25、30、35、40、43、46、49、52、55、58、61、64任一所示，或与SEQ ID NO：5、10、15、20、25、30、35、40、43、46、49、52、55、58、61、64任一所示的序列具有85％以上(例如88％以上、90％以上、92％以上、95％以上、97％以上、98％以上、99％以上、99.9％以上)的同源性。
在一种或多种实施方式中，所述的引物或探针是由SEQ ID NO：1、3、5所示，SEQ IDNO：7、8、10所示，SEQ ID NO：11、14、15所示，SEQ ID NO：17、19、20所示，SEQ ID NO：21、24、25所示，SEQ ID NO：26、28、30所示，SEQ ID NO：32、33、35所示、SEQ ID NO：37、39、40所示、SEQ ID NO：41、42、43所示、SEQ ID NO：44、45、46所示、SEQ ID NO：47、48、49所示、SEQ IDNO：50、51、52所示、SEQ ID NO：53、54、55所示、SEQ ID NO：56、57、58所示、SEQ ID NO：59、60、61所示或SEQ ID NO：62、63、64所示的多核苷酸或者它们的互补链的组合构成的引物组。
在本发明的第三方面，提供一种用于检测尿路上皮癌的系统，其包括检测单元以及数据分析单元；
所述检测单元包括：测定标志物甲基化水平的检测试剂，或含有所述检测试剂的试剂盒或检测装置的试剂或装置；
所述数据分析单元包括：用于对检测单元的检测结果进行分析处理的处理单元，获得尿路上皮癌的检测结果。
在一种或多种实施方式中，所述标志物包括TRPS1，较佳地还包括HAND2和/或ZNF154；更佳地，所述标志物选自如下的任一组：(1)TRPS1；(2)TRPS1和HAND2；(3)TRPS1和ZNF154；(4)TRPS1、HAND2和ZNF154；更更佳地，以GRCh37.p13，hg19为参考基因组，所述TRPS1包括或为Chromosome 8:116679699-116681623区域；所述HAND2包括或为Chromosome4:174450190-174450702区域；所述ZNF154包括或为Chromosome 19:58220195-58220937区域。
在一种或多种实施方式中，其中所述标志物包括TRPS1、HAND2和ZNF154中至少1个基因的CpG位点；较佳地，所述TRPS1的CpG位点选自Chromosome 8:116679699-116681623区域中的CpG位点；所述HAND2的CpG位点选自Chromosome 4:174450190-174450702区域中的CpG位点；所述ZNF154的CpG位点选自Chromosome 19:58220195-58220937区域中的CpG位点。
在一种或多种实施方式中，所述检测试剂或试剂盒如本发明任一实施方式所定义。
在本发明的第四方面，提供一种尿路上皮癌的检测方法，包括：利用特异性检测标志物的检测系统进行针对标志物的检测。
在一种或多种实施方式中，其中所述标志物包括TRPS1，较佳地还包括HAND2和/或ZNF154；更佳地，所述标志物选自如下的任一组：(1)TRPS1；(2)TRPS1和HAND2；(3)TRPS1和ZNF154；(4)TRPS1、HAND2和ZNF154；更更佳地，以GRCh37.p13，hg19为参考基因组，所述TRPS1包括或为Chromosome 8:116679699-116681623区域；所述HAND2包括或为Chromosome4:174450190-174450702区域；所述ZNF154包括或为Chromosome 19:58220195-58220937区域。
在一种或多种实施方式中，其中所述标志物包括TRPS1、HAND2和ZNF154中至少1个基因的CpG位点；较佳地，所述TRPS1的CpG位点选自Chromosome 8:116679699-116681623区域中的CpG位点；所述HAND2的CpG位点选自Chromosome 4:174450190-174450702区域中的CpG位点；所述ZNF154的CpG位点选自Chromosome 19:58220195-58220937区域中的CpG位点。
在一种或多种实施方式中，所述检测系统如本发明任一实施方式所述。
本发明的其它方面由于本文的公开内容，对本领域的技术人员而言是显而易见的。
附图说明
图1、筛选获得的8种荧光PCR引物探针检测曲线。
图2、利用筛选获得的8种标志物组合，通过荧光PCR检测临床样本的检测曲线。
具体实施方式
针对现有技术中缺乏敏感性和特异性均较高的检测尿路上皮癌的标志物的缺陷，本发明人经过深入的研究，提供一种与尿路上皮癌相关的生物标志物及其应用。所述生物标志物包括TRPS1、HAND2、ZNF154及其甲基化位点，其可以用于尿路上皮癌风险的诊断和/或预测。本发明也提供了适用于尿路上皮癌诊断和/或预测的试剂盒。本发明为临床上尿路上皮癌的诊断和治疗提供了新方案。
术语
如本发明所用，“标志物(标记物)”是指生物分子或生物分子片段，其变化和/或检测可以与特定身体状况或状态相关。术语“标志物(标记物)”、“分子标志物(标记物)”或“生物标志物(标记物)”在整个发明公开中可互换使用。本发明中，除非另外说明，所述“标志物(标记物)”是指“癌症(肿瘤)标志物”。本发明中，除非另外说明，所述癌症为尿路上皮癌。
如本发明所用，所述的“检测”包括“评估”、“测定”、“分析”、“预测”、“评价”；所述的“评价”或“评估”也包括“评分”。
如本发明所用，所述“患者”、“受试者”或“个体”可以指生物体，在某些方面，受试者可以是人。提供样品的受试者可以包括潜在疾病风险的人群或确诊为疾病的人群。本发明中所述疾病指尿路上皮癌。
如本发明所用，所述的“样本”与“样品”可互换使用，其包括从个体或分离的组织、细胞(例如上皮细胞)或体液(例如尿液、血清、血浆)中获得的、适合于进行肿瘤标志物检测的物质。
如本发明所用，所述的“尿路上皮癌”是指在包含膀胱、肾盂、输尿管、尿道的尿路的上皮细胞发生的癌。尿路上皮癌由于异时性或同时性多发，因此，本发明的“尿路上皮癌”包含原发癌和已在组织内转移的癌。在一些具体的实施方案中，按肿瘤发生的部位进行分类，所述尿路上皮癌包括但不限于：肾盂癌、输尿管癌、膀胱癌和尿道癌。应理解，所述尿路上皮癌包括高级别的尿路上皮癌，也包括低级别的尿路上皮癌。
如本发明所用，所述的“甲基化位点”与“CpG位点”可互换使用，“CpG位点”是指在DNA序列中胞嘧啶(C)与鸟嘌呤(G)之间进行磷酸二酯键合(p)的碱基位点。CpG位点以高频率出现的区域被称为“CpG岛”或“CpG簇”。通常，“CpG岛”需要同时满足3个条件：(1)CpG岛的序列长度超过500碱基；(2)CpG岛内的GC碱基比例超过55％(3)CpG位点的密度指数超过0.65。由于CpG岛多存在于接近基因的编码区域的位置、例如启动子区域，因此，基因的CpG位点大量存在于CpG岛或该基因的启动子区域，所述CpG岛存在于接近该基因的编码区域的位置。如本发明所用，在没有另行定义时，“(某)基因的CpG位点”优选是指存在于接近该基因的编码区域的位置的CpG岛中所含的CpG位点，更优选是指存在于该基因的启动子区域、1号外显子、1号内含子上的CpG位点。
如本发明所用，所述“甲基化”是指在DNA中，胞嘧啶的第5位碳原子被甲基化修饰的状态，在没有另行定义时，“甲基化”优选是指DNA的甲基化及其衍生物(5mC、5hmC、5fC、5caC等)的甲基化。如本发明所用，某CpG位点的“甲基化水平”是指在该CpG位点中DNA被甲基化的比例。
在本说明书中，DNA甲基化水平高和低分别是指DNA被甲基化的比例高和低。
所述的“甲基化水平高”是指与“对照”相比较，至少有5％、10％或20％，较佳地至少有30％或50％，更佳地至少有80％或100％或更为显著的提高。
所述的“甲基化水平低”是指与“对照”相比较，至少有5％、10％或20％，较佳地至少有30％或50％，更佳地至少有80％或100％或更为显著的降低。
如本发明所用，所述的“试剂盒”可以指用于实施本发明公开的方法的材料或试剂的系统。
如本发明所用，“/”可表示“和”，也可表示“或”。
如本发明所用，所述的“以上”或“以下”均指包含本数。
本发明的生物标志物
本发明中，通过对尿路上皮癌临床患者的样本进行深入的分析，鉴定与尿路上皮癌相关的模块，筛选获得核心基因TRPS1，还获得了HAND2、ZNF154基因。由于DNA甲基化是基因表达的关键表观遗传调控因子，DNA甲基化模式的改变，是与肿瘤发生相关的最早可检测到的肿瘤变化之一，本发明进一步筛选并确定了TRPS1、HAND2、ZNF154基因的甲基化位点。所述TRPS1、HAND2、ZNF154及其甲基化位点与尿路上皮癌的发生发展密切相关。它们作为标志物的联合应用，对于疾病的预后评估更有意义。
基于本发明的新发现，揭示了尿路上皮癌具有诊断意义的标志物：TRPS1，TRPS1和HAND2，TRPS1和ZNF154，或TRPS1、HAND2和ZNF154。特别地，本发明揭示了TRPS1、HAND2和/或ZNF154基因的甲基化位点，可作为尿路上皮癌的诊断标记和临床靶标。本发明也揭示了尿路上皮癌诊断及疗法疗效评估的标志物、试剂盒及方法。
在一种或多种实施方式中，所述标志物包括TRPS1。在一种或多种实施方式中，所述标志物还包括HAND2和/或ZNF154。在一种或多种实施方式中，所述标志物选自如下的任一组：(1)TRPS1；(2)TRPS1和HAND2；(3)TRPS1和ZNF154；(4)TRPS1、HAND2和ZNF154。
所述的TRPS1基因的序列位置可参考Chromosome 8:116679699-116681623，序列信息可参考https://www.ncbi.nlm.nih.gov/gene/7227#reference-sequences，本发明也可以涵盖其在生物体中的序列变体。
所述的HAND2基因的序列位置可参考Chromosome 4:174450190-174450702，序列信息可参考https://www.ncbi.nlm.nih.gov/gene/9464#reference-sequences，本发明也可以涵盖其在生物体中的序列变体。
所述的ZNF154基因的序列位置可参考Chromosome 19:58220195-58220937，序列信息可参考https://www.ncbi.nlm.nih.gov/gene/7710#reference-sequences，本发明也可以涵盖其在生物体中的序列变体。
在一种或多种实施方式中，以GRCh37.p13，hg19为参考基因组，所述TRPS1的CpG位点包括Chromosome 8:116679699-116681623区域中的CpG位点；所述HAND2的CpG位点包括Chromosome 4:174450190-174450702区域中的CpG位点；所述ZNF154的CpG位点包括Chromosome 19:58220195-58220937区域中的CpG位点。
应理解，本领域技术人员可以根据需要，在本发明公开的TRPS1基因、HAND2基因、ZNF154基因的序列位置(TRPS1的Chromosome 8:116679699-116681623区域、HAND2的Chromosome 4:174450190-174450702区域、ZNF154的Chromosome 19:58220195-58220937区域)上，选择合适大小(例如50-180bp)的甲基化区段作为标志物，或选择合适数量(例如1个以上)的甲基化位点作为标志物，所获得的标志物均可以预知具有优异的检测性能。
然而，应理解，虽然本发明公开的TRPS1基因的甲基化区段均位于该基因的CpG岛上，但除本发明所公开的序列位置(TRPS1的Chromosome 8:116679699-116681623区域)外，TRPS1基因CpG岛上的其他位置并不具有优异的检测性能，例如，实施例6中在TRPS1基因116679699-116681623范围外设计的组合17与组合18，敏感性或特异性降低，检测性能严重下降。
如本领域技术人员已知的，所述TRPS1、HAND2和ZNF154的CpG岛的位置为：以GRCh37.p13，hg19为参考基因组，所述TRPS1的CpG岛为Chromosome 8:116679567-116681884区域；所述HAND2的CpG岛为Chromosome 4:174449580-174453224区域；所述ZNF154的CpG岛为Chromosome 19:58219595-58221220区域。
在一种或多种实施方式中，以GRCh37.p13，hg19为参考基因组，所述TRPS1的CpG位点包括Chromosome 8:116679699-116679792(T1)、116679824-116679911(T2)、116680057-116680142(T3)、116680166-116680258(T4)、、116680292-116680493(T5)、116680528-116680685(T6)、116680689-116680881(T7)、116681000-116681149(T8)、116681171-116681317(T9)、116681321-116681463(T10)、116681494-116681623(T11)、116680395-116680396(T12)任一区域中的CpG位点。
在一种或多种实施方式中，以GRCh37.p13，hg19为参考基因组，所述HAND2的CpG位点包括Chromosome 4:174450701-174450610(H1)、174450526-174450487(H2)区域中的CpG位点。
在一种或多种实施方式中，以GRCh37.p13，hg19为参考基因组，所述ZNF154的CpG位点包括Chromosome 19:58220378-58220316(Z1)、58220262-58220208(Z2)区域中的CpG位点。
在一种或多种实施方式中，基于NCBI数据库基因组版本(GRCh37.p13，hg19)，所述的TRPS1的CpG位点选自8号染色体如下位点中的至少1个、至少2个、至少3个或全部：116679699、116679700、116679707、116679708、116679723、116679724、116679744、116679745、116679763、116679764、116679765、116679766、116679767、116679768、116679777、116679778、116679786、116679787、116679791、116679792、116679824、116679825、116679830、116679831、116679834、116679835、116679861、116679862、116679877、116679878、116679881、116679882、116679900、116679901、116679910、116679911、116679928、116679929、116679935、116679936、116680049、116680050、116680057、116680058、116680074、116680075、116680083、116680084、116680089、116680090、116680127、116680128、116680132、116680133、116680141、116680142、116680166、116680167、116680169、116680170、116680172、116680173、116680175、116680176、116680178、116680179、116680186、116680187、116680211、116680212、116680216、116680217、116680220、116680221、116680257、116680258、116680275、116680276、116680292、116680293、116680343、116680344、116680346、116680347、116680394、116680395、116680492、116680493、116680528、116680529、116680539、116680540、116680626、116680627、116680630、116680631、116680632、116680633、116680636、116680637、116680649、116680650、116680651、116680652、116680657、116680658、116680661、116680662、116680665、116680666、116680674、116680675、116680676、116680677、116680679、116680680、116680681、116680682、116680684、116680685、116680689、116680690、116680695、116680696、116680699、116680700、116680706、116680707、116680710、116680711、116680712、116680713、116680719、116680720、116680721、116680722、116680728、116680729、116680737、116680738、116680743、116680744、116680745、116680746、116680750、116680751、116680754、116680755、116680784、116680785、116680799、116680800、116680807、116680808、116680820、116680821、116680822、116680823、116680825、116680826、116680842、116680844、116680880、116680881、116681000、116681001、116681006、116681007、116681068、116681069、116681080、116681081、116681088、116681089、116681090、116681091、116681127、116681128、116681148、116681149、116681171、116681172、116681193、116681194、116681195、116681196、116681202、116681203、116681246、116681247、116681248、116681249、116681258、116681259、116681271、116681272、116681292、116681293、116681294、116681295、116681296、116681297、116681302、116681303、116681304、116681305、116681307、116681308、116681310、116681311、116681313、116681314、116681316、116681317、116681321、116681322、116681325、116681326、116681331、116681332、116681339、116681340、116681342、116681343、116681345、116681346、116681348、116681349、116681352、116681353、116681355、116681356、116681361、116681362、116681367、116681368、116681371、116681372、116681373、116681374、116681375、116681376、116681381、116681382、116681387、116681388、116681389、116681390、116681398、116681399、116681402、116681403、116681407、116681408、116681412、116681413、116681415、116681416、116681427、116681428、116681430、116681431、116681432、116681433、116681445、116681446、116681457、116681458、116681462、116681463、116681494、116681495、116681504、116681505、116681508、116681509、116681532、116681533、116681536、116681537、116681538、116681539、116681561、116681562、116681605、116681606、116681611、116681612、116681619、116681620、116681622、116681623。
在一种或多种实施方式中，所述的HAND2的CpG位点选自4号染色体如下位点中的至少1个、至少2个、至少3个或全部：174450701、174450700、174450697、174450696、174450680、174450679、174450677、174450676、174450675、174450674、174450660、174450659、174450657、174450656、174450653、174450652、174450648、174450647、174450637、174450636、174450631、174450630、174450619、174450618、174450611、174450610、174450604、174450603、174450582、174450581、174450575、174450574、174450571、174450570、174450565、174450564、174450561、174450560、174450557、174450556、174450526、174450525、174450523、174450522、174450519、174450518、174450503、174450502、174450498、174450497、174450492、174450491、174450490、174450489、174450487、174450486、174450479、174450478、174450477、174450476、174450473、174450472、174450465、174450464、174450463、174450462、174450453、174450452、174450451、174450450、174450444、174450443、174450409、174450408、174450396、174450395、174450385、174450384、174450378、174450377、174450375、174450374、174450372、174450371、174450369、174450368、174450366、174450365、174450357、174450356、174450354、174450353、174450351、174450350、174450348、174450347、174450341、174450340、174450297、174450296、174450288、174450287、174450280、174450279、174450273、174450272、174450243、174450242、174450231、174450230、174450228、174450227、174450225、174450224、174450222、174450221、174450201、174450200、174450190。
在一种或多种实施方式中，所述的ZNF154的CpG位点选自19号染色体如下位点中的至少1个、至少2个、至少3个或全部：58220838、58220837、58220819、58220818、58220774、58220773、58220767、58220766、58220754、58220753、58220719、58220718、58220707、58220706、58220670、58220669、58220663、58220662、58220658、58220657、58220628、58220627、58220596、58220595、58220573、58220572、58220568、58220567、58220536、58220535、58220517、58220516、58220514、58220513、58220501、58220500、58220495、58220494、58220483、58220482、58220480、58220479、58220467、58220466、58220461、58220460、58220447、58220446、58220444、58220443、58220441、58220440、58220425、58220424、58220404、58220403、58220395、58220394、58220378、58220377、58220374、58220373、58220371、58220370、58220365、58220364、58220350、58220349、58220332、58220331、58220317、58220316、58220299、58220298、58220296、58220295、58220288、58220287、58220262、58220260、58220238、58220237、58220230、58220229、58220222、58220221、58220209、58220208。
在一种或多种实施方式中，本发明所述的CpG位点包括如表1所示的CpG位点。
表1 TRPS1、HAND2、ZNF154基因甲基化位点坐标
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可以利用本发明披露的上述标志物或其甲基化位点，来作为评估尿路上皮癌的发展及疗法疗效的判断标志(标志物)，从而可用于了解患病个体处于怎样的疾病状态，评价或预测疾病风险、制定治疗/用药方案。
作为一种方式，应用所述的标志物或其甲基化位点检测尿路上皮癌的方法包括：
(a)对于待测样本，获得其中标志物的甲基化信息；
(b)根据(a)的甲基化信息，分析标志物的甲基化水平，从而判断待测样本患有尿路上皮癌的风险；
(a)中，甲基化信息包括甲基化比例、平均甲基化比例、logFC中的至少1个信息，至少2个信息或全部信息；
(b)中，若标志物的甲基化水平高，评价为：存在较高的患有尿路上皮癌的风险，或肿瘤恶性的风险高，或生存期短的可能性大；若标志物的甲基化水平低，评价为：存在较低的患有尿路上皮癌的风险，或肿瘤恶性的风险低，或生存期长的可能性大。
本发明所述的DNA甲基化水平的测定可根据本领域熟知的已建立的标准程序(reference)。例如通过NGS测序法、实时荧光定量PCR法、质谱分析、Sanger测序法、BSP甲基化测序法、数字PCR法、焦磷酸测序法、微珠阵列法或离子交换色谱。
作为一种可选的方式，可采用NGS测序法：经亚硫酸氢盐处理后胞嘧啶可转化为尿嘧啶，而尿嘧啶残基被当作胸腺嘧啶复制，通过这种方式可有效保留DNA的甲基化信息。分别将经亚硫酸氢盐处理的DNA和未经亚硫酸氢盐处理的DNA进行NGS测序，可以通过序列比对，获得DNA中的甲基化位点的序列信息；甲基化位点为固定的“CG”连续二碱基，通过序列分析，获得DNA中的甲基化位点的序列信息。
作为一种可选的方式，可采用实时荧光PCR检测法：在PCR扩增时，在加入一对针对基因CpG位点引物的同时加入一个特异性的标记有荧光素的探针，该探针为一寡核苷酸，其两端分别标记一个报告荧光基团(例如FAM、HEX、VIC、ROX、CY3、CY5等)和一个淬灭荧光基团(例如BHQ1、BHQ2、BHQ3、MGB、dabcly等)。探针完整时，报告基团发射的荧光信号被淬灭基团吸收；PCR扩增时，Taq酶的5’→3’外切酶活性将探针酶切降解，使报告荧光基团和淬灭荧光基团分离，荧光素游离于反应体系中，在特定光激发下发出荧光，随着循环次数的增加，被扩增的目的基因片段呈指数规律增长，通过实时检测与之对应的随扩增而变化荧光信号强度，求得Ct(cycle threshold，Ct)值。Ct值，即PCR扩增过程中扩增产物的荧光信号达到设定的阈值时所经过的扩增循环次数，它与模板的起始拷贝数的对数存在线性关系，含DNA甲基化的模板量越多时，荧光达阈值的循环数越少，也即Ct值越小，从而实现对甲基化水平的定量及定性分析。也可以在PCR扩增过程中引入内参(又称内控)，将获得的待测Ct值减去内参的Ct值，即为ΔCt值。含DNA甲基化的模板量越多，ΔCt值越小。
本发明还提供了用于尿路上皮癌的风险判定的引物或探针，其与经亚硫酸氢盐处理后的标志物所含的至少1个CpG位点(例如2个、3个、4个、5个、8个、10个、15个或更多个CpG位点)杂交。
在一种或多种实施方式中，所述杂交包括与所述CpG位点的正义链或反义链杂交。
在一种或多种实施方式中，所述的引物的核苷酸序列为如SEQ ID NO：1～4、6～9、11～14、16～19、21～24、26～29、31～34、36～39、41-42、44-45、47-48、50-51、53-54、56-57、59-60、62-63所示，或与该序列具有85％以上(例如88％以上、90％以上、92％以上、95％以上、97％以上、98％以上、99％以上、99.9％以上)的同源性。
在一种或多种实施方式中，所述的探针的核苷酸序列为如SEQ ID NO：5、10、15、20、25、30、35、40、43、46、49、52、55、58、61、62-63所示，或与该序列具有85％以上(例如88％以上、90％以上、92％以上、95％以上、97％以上、98％以上、99％以上、99.9％以上)的同源性。
在一种或多种实施方式中，所述的引物或探针的核苷酸序列如表2所示。
在一种或多种实施方式中，所述的引物或探针是由SEQ ID NO：1、2、3、4、5所示的多核苷酸或者它们的互补链的组合(例如SEQ ID NO：1、3、5的组合、SEQ ID NO：2、3、5的组合、SEQ ID NO：1、4、5的组合、SEQ ID NO：2、4、5的组合)构成的引物组。
在一种或多种实施方式中，所述的引物或探针是由SEQ ID NO：6、7、8、9、10所示的多核苷酸或者它们的互补链的组合(例如SEQ ID NO：6、8、10的组合、SEQ ID NO：7、8、10的组合、SEQ ID NO：6、9、10的组合、SEQ ID NO：7、9、10的组合)构成的引物组。
在一种或多种实施方式中，所述的引物或探针是由SEQ ID NO：11、12、13、14、15所示的多核苷酸或者它们的互补链的组合(例如SEQ ID NO：11、13、15的组合、SEQ ID NO：12、13、15的组合、SEQ ID NO：11、14、15的组合、SEQ ID NO：12、14、15的组合)构成的引物组。
在一种或多种实施方式中，所述的引物或探针是由SEQ ID NO：16、17、18、19、20所示的多核苷酸或者它们的互补链的组合(例如SEQ ID NO：16、18、20的组合、SEQ ID NO：17、18、20的组合、SEQ ID NO：16、19、20的组合、SEQ ID NO：17、19、20的组合)构成的引物组。
在一种或多种实施方式中，所述的引物或探针是由SEQ ID NO：21、22、23、24、25所示的多核苷酸或者它们的互补链的组合(例如SEQ ID NO：21、23、25的组合、SEQ ID NO：22、23、25的组合、SEQ ID NO：21、24、25的组合、SEQ ID NO：22、24、25的组合)构成的引物组。
在一种或多种实施方式中，所述的引物或探针是由SEQ ID NO：26、27、28、29、30所示的多核苷酸或者它们的互补链的组合(例如SEQ ID NO：26、28、30的组合、SEQ ID NO：27、28、30的组合、SEQ ID NO：26、29、30的组合、SEQ ID NO：27、29、30的组合)构成的引物组。
在一种或多种实施方式中，所述的引物或探针是由SEQ ID NO：31、32、33、34、35所示的多核苷酸或者它们的互补链的组合(例如SEQ ID NO：31、33、35的组合、SEQ ID NO：32、33、35的组合、SEQ ID NO：31、34、35的组合、SEQ ID NO：32、34、35的组合)构成的引物组。
在一种或多种实施方式中，所述的引物或探针是由SEQ ID NO：36、37、38、39、40所示的多核苷酸或者它们的互补链的组合(例如SEQ ID NO：36、38、40的组合、SEQ ID NO：37、38、40的组合、SEQ ID NO：36、39、40的组合、SEQ ID NO：37、39、40的组合)构成的引物组。
在一种或多种实施方式中，所述的引物或探针是由SEQ ID NO：41、42、43所示的多核苷酸或者它们的互补链的组合构成的引物组。
在一种或多种实施方式中，所述的引物或探针是由SEQ ID NO：44、45、46所示的多核苷酸或者它们的互补链的组合构成的引物组。
在一种或多种实施方式中，所述的引物或探针是由SEQ ID NO：47、48、49所示的多核苷酸或者它们的互补链的组合构成的引物组。
在一种或多种实施方式中，所述的引物或探针是由SEQ ID NO：50、51、52所示的多核苷酸或者它们的互补链的组合构成的引物组。
在一种或多种实施方式中，所述的引物或探针是由SEQ ID NO：53、54、55所示的多核苷酸或者它们的互补链的组合构成的引物组。
在一种或多种实施方式中，所述的引物或探针是由SEQ ID NO：56、57、58所示的多核苷酸或者它们的互补链的组合构成的引物组。
在一种或多种实施方式中，所述的引物或探针是由SEQ ID NO：59、60、61所示的多核苷酸或者它们的互补链的组合构成的引物组。
在一种或多种实施方式中，所述的引物或探针是由SEQ ID NO：62、63、64所示的多核苷酸或者它们的互补链的组合构成的引物组。
本发明还提供一种用于检测尿路上皮癌发展及疗法疗效的试剂盒或检测装置，包括用于检测尿路上皮癌发展及疗法疗效的检测试剂，包括：针对标志物甲基化水平的检测试剂，所述标志物包括TRPS1。
在一种或多种实施方式中，所述标志物还包括HAND2和/或ZNF154。
在一种或多种实施方式中，所述标志物为TRPS1，TRPS1和HAND2，TRPS1和ZNF154，或TRPS1、HAND2和ZNF154的组合。
在一种或多种实施方式中，所述标志物甲基化水平的检测试剂可以配置在一个或多个存储装置内。例如，可以将多个标志物的组合存储在一个存储装置内(又称为并管)，以简化试剂盒。
在一种或多种实施方式中，所述试剂盒可包括针对内参基因的检测试剂，从而对检测过程进行质控。
所述试剂盒还可包括用于存储、运输反应试剂或装置(例如在适当容器中的引物、探针等)和/或配合材料(例如：缓冲液、执行评估的书面说明等)或将其从一个位置递送到另一个位置的系统。例如，试剂盒可包括一个或多个包含相关反应试剂和/或配合材料的外壳(例如：盒子)。这些内容物可以同时或单独地投递给预期的接收者。
此外，所述的试剂盒中还可包括用于提取DNA、PCR、杂交、显色等所需的各种试剂，包括但不限于：抽提液、扩增液、杂交液、酶、对照液、显色液、洗液等。此外，所述的试剂盒中还可包括使用说明书和/或芯片图像分析软件等。
本发明也提供了一种用于评估尿路上皮癌的发展及疗法疗效的系统，其包括检测单元以及数据分析单元；所述检测单元包括：测定所述标志物的甲基化水平的检测试剂，或含有所述检测试剂的试剂盒或检测装置的试剂或装置；所述数据分析单元包括：用于对检测单元的检测结果进行分析处理的处理单元，获得尿路上皮癌的检测或预后结果。所述检测试剂包括(但不限于)：特异性扩增所述标志物基因CpG位点的引物、特异性识别标志物基因的探针等。特异性用于检测的装置可包括但不限于：基因测序仪器、芯片、探针组(模块)、引物探针组(模块)、内参基因组(模块)等。所述检测结果包括：诊断结果，或风险评估/评分(如分级)结果。
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件如J.萨姆布鲁克等编著，分子克隆实验指南，第三版，科学出版社中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。
实验材料与方法
1、引物探针
本发明针对TRPS1、HAND2、ZNF154基因的甲基化区域设计引物探针，引物探针序列如SEQ ID NO.1-40。
表2标志物引物探针信息
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表2中F表示正义链的引物，R表示反义链的引物，P表示探针。
2、临床尿路上皮癌样本及其处理方法
临床尿路上皮癌样本
(1)前瞻性收集样本：
经知情同意，收集来源于医院临床105位门诊诊断认为泌尿系统健康，或患有泌尿系统良性疾病受试者的尿液样本，其中膀胱炎20例、膀胱结石25例、膀胱增生15例、输尿管结石15例、尿道肉阜10例、肾结石20例，作为特异性样本。
经知情同意，收集来源于医院临床80位门诊诊断确诊为罹患尿路上皮癌受试者的尿液样本，其中膀胱癌50例、输尿管癌20例、肾盂癌8例、尿道癌2例，作为尿路上皮癌样本。
特异性样本和尿路上皮癌样本共同组成前瞻性收集样本，用于建库，以判断标志物基因中每个甲基化位点区分特异性样本与尿路上皮癌样本的能力。
在所有前瞻性收集样本中，中位年龄为59.1岁，其中女性占比35.0％。
(2)检测样本：
经知情同意，收集来源于医院临床100位门诊诊断认为泌尿系统健康，或患有泌尿系统良性疾病受试者的尿液样本，其中膀胱炎20例、膀胱结石20例、膀胱增生15例、输尿管结石20例、尿道肉阜5例、肾结石20例，作为特异性样本。
经知情同意，收集来源于医院临床100位门诊诊断确诊为罹患尿路上皮癌受试者的尿液样本，其中膀胱癌50例、输尿管癌30例、肾盂癌15例、尿道癌5例，作为尿路上皮癌样本。
特异性样本和尿路上皮癌样本共同组成检测样本，用于考察PCR体系筛选后的8组标志物。
样本处理
前瞻性收集样本、测试样本均采用尿液BisDNA核酸提取及甲基化处理试剂盒(厦门艾德生物医药科技股份有限公司，核酸提取及甲基化处理纯化试剂，型号：尿液BisDNA)，参考说明书中实验步骤进行核酸提取和甲基化处理(甲基化处理又称为转化)。使用核酸定量试剂盒(Promega，ssDNA System，目录号：E3190)并参考说明书中实验步骤测定转化后核酸的浓度。
实施例1、鉴定尿路上皮癌早期筛查相关基因
1.前瞻性收集样本
经知情同意，收集来源于医院临床105位门诊诊断认为泌尿系统健康，或患有泌尿系统良性疾病受试者的尿液样本，其中膀胱炎20例、膀胱结石25例、膀胱增生15例、输尿管结石15例、尿道肉阜10例、肾结石20例，作为特异性样本。经知情同意，收集来源于医院临床80位门诊诊断确诊为罹患尿路上皮癌受试者的尿液样本，其中膀胱癌50例、输尿管癌20例、肾盂癌8例、尿道癌2例，作为尿路上皮癌样本。
特异性样本和尿路上皮癌样本共同组成前瞻性收集样本，用于建库，以判断标志物基因中每个甲基化位点区分特异性样本与尿路上皮癌样本的能力。
在所有前瞻性收集样本中，中位年龄为59.1岁，其中女性占比35.0％。
2.鉴定具有尿路上皮癌潜力的甲基化相关基因
筛选过程使用前瞻性收集样本，进行核酸提取和转化，将转化后的核酸进行全基因组甲基化测序(Whole Genome Bisulfite Sequencing,WGBS)，得到每个样本中不同基因甲基化区段的甲基化比例信息，设置甲基化比例的阈值，甲基化比例高于阈值时判定为甲基化阳性，甲基化比例低于阈值是判定为甲基化阴性，由此得出每个样本的甲基化阴阳性情况，计算出AUC、敏感性、特异性，将特异性样本与尿路上皮癌样本中不同甲基化基因区分度明显的位点作为与尿路上皮癌早期筛查相关的甲基化基因，初步获得的甲基化相关基因如表3所示。
表3 NGS测序鉴定的基因信息
| 序号 | 基因 | 染色体位置 | AUC | 敏感性 | 特异性 |
| 1 | ZNF154 | chr19:58220195_58220937 | 0.94 | 90.9％ | 94.1％ |
| 2 | HAND2 | chr4:174450190_174450702 | 0.93 | 90.9％ | 94.1％ |
| 3 | TRPS1 | chr8:116679699_116681623 | 0.91 | 87.9％ | 94.1％ |
| 4 | LAMB3 | chr1:209825572_209826043 | 0.88 | 75.8％ | 94.1％ |
| 5 | IRX4 | chr5:1878399_1878772 | 0.90 | 70.6％ | 100.0％ |
| 6 | TP73 | chr1:3606997_3607525 | 0.89 | 81.8％ | 94.1％ |
| 7 | CALCR | chr7:93113164_93113477 | 0.90 | 78.8％ | 100.0％ |
| 8 | FXYD3 | chr19:35606434_35606977 | 0.89 | 70.6％ | 100.0％ |
| 9 | GDF7 | chr2:20865551_20865947 | 0.88 | 72.7％ | 100.0％ |
2.公共数据库验证
通过WGBS鉴定出甲基化潜在标志物后，结合TCGA、GEO等公共数据库甲基化信息进一步挑选甲基化相关标志物。
TCGA数据库(https://www.cancer.gov/ccg/research/genome-sequencing/tcga)验证：按“TCGA Cancers Selected for Study”进行筛选，从中挑选尿路上皮癌样本数据进行基因的甲基化分析，数据库中涵盖组织、癌旁等样本类型。GEO数据库(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/)验证：在“Scope”位置通过筛选“self/platform/samples”等对样本进行聚类收集甲基化信息。
结果显示，标志物基因ZNF154、HAND2和TRPS1在检测尿路上皮癌时均具有较优性能，敏感性高于85％，特异性高于90％，AUC均在0.9以上。
实施例2、NGS筛选标志物基因
本实施例中使用的前瞻性收集样本与实施例1相同。
经实施例1公共数据库验证，挑选出尿路上皮癌早期筛查相关标志物基因后，本实施例利用前瞻性收集样本，针对DNA序列中的正义链和反义链，分别设计ZNF154、HAND2和TRPS1甲基化位点的NGS探针(如表4所示)，与尿路上皮癌甲基化相关基因ZNF154、HAND2和TRPS1的DNA序列中的正义链和反义链进行杂交，将目标区域序列进行捕获并富集后，通过NGS测序检测，从而进一步确定甲基化位点，并确定基因ZNF154、HAND2和TRPS1区分特异性样本与尿路上皮癌样本的能力。
表4 NGS探针信息
收集标志物基因的测序深度信息、甲基化位点的染色体坐标信息、甲基化位点碱基长度信息。测序后每个区段的探针内序列被测序到的次数确定为测序深度。根据“深度高于200×”的过滤标准，过滤深度不足的位点，整理每个标志物样本序列的正义链、反义链信息，CpG位点的甲基化比例，CpG簇的碱基长度等信息。
根据每个标志物基因甲基化位点的染色体坐标，计算出每一标志物基因对应的甲基化位点数目，明确甲基化簇碱基长度。获得的甲基化位点如表1所示，表1中所有甲基化位点均在癌化时上调(即肿瘤患者甲基化比例高、非癌人群甲基化比例低)。
分别计算出特异性样本与尿路上皮癌样本的甲基化比例，分析两类样本中的甲基化差异，计算logFC。
甲基化比例＝(甲基化深度)÷(总测序深度)，针对单个样本的每个CpG位点分别计算甲基化比例。
平均甲基化比例为一段CpG簇内，每个CpG位点的甲基化比例的平均值。
logFC＝log2[(尿路上皮癌患者对应位点平均甲基化比例+0.0001)/(健康人对应位点平均甲基化比例+0.0001)]。用于衡量对应位点癌患者和非癌人群差异甲基化水平。
给每个标志物基因设定平均甲基化比例阈值，通过生信计算出不同阈值的检测性能，选择出最优性能的阈值，作为为该标志物基因的平均甲基化比例阈值(如表5所示)。利用阈值分析各个样本检测阴阳性，平均甲基化比例高于阈值判定为样本阳性，相反，平均甲基化比例低于阈值则判定为样本阴性，根据检测的准确度进一步确定标志物基因检测敏感性及特异性。
敏感性＝尿路上皮癌甲基化阳性样本数/尿路上皮癌样本数；
特异性＝非癌甲基化阴性样本数/非癌样本总数；
AUC是以真阳性率为纵坐标、假阳性率为横坐标绘制曲线的下面积。
表5 NGS筛选标志物基因的结果
实施例3、标志物基因甲基化位点的PCR筛选
本实施例中使用的前瞻性收集样本与实施例1相同。
为进一步确定表2中标志物基因甲基化位点是否具备早期诊断尿路上皮癌的能力，本实施例中，使用前瞻性样本，利用荧光PCR体系，针对这些标志物基因的甲基化位点进行筛选。
1.PCR体系的筛选
将表2中的探针进行荧光标记后，使用表2所示的引物和探针，进行荧光PCR体系的筛选。建立荧光PCR扩增体系，体系包括扩增缓冲液、镁离子、dNTPs、DNA聚合酶、引物、探针，反应体系为25μL；检测程序包含预变性步骤、扩增步骤(含变性、退火和/或延伸)，PCR检测程序为：
第一阶段：95℃5min；
第二阶段：95℃15s，64℃10s，72℃10s，15个循环；
第三阶段：93℃15s，60℃30s，72℃10s，31个循环。60℃时收集荧光信号。
通过荧光PCR，以ACTB基因作为内控，获得各个标志物基因甲基化CpG簇在特异性样本与尿路上皮癌样本中的Ct值、内控Ct值、PCR检测曲线。通过设置Cut-off值确定标志物基因甲基化CpG簇的检测性能(敏感性、特异性、AUC数值)。
筛选引物探针时，综合检测性能、检测曲线、荧光强度指标满足如下条件，优选出8种荧光PCR引物探针组合。
检测性能：检测阳性样本时表现出良好的扩增效率，检测阴性样本是表现为无扩增Ct值；
检测曲线：荧光PCR的检测曲线应具有“S”形；
荧光强度：荧光PCR检测出的荧光高度应适中，且不同浓度样本的平台期荧光高度应相对一致。选出的基因甲基化位点见表6，8种组合的检测曲线如图1所示。
表6 8种引物探针组合的甲基化位点和甲基化区段
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/>
/>
实施例4、甲基化位点作为标志物的检测性能
检测样本：经知情同意，收集来源于医院临床100位门诊诊断认为泌尿系统健康，或患有泌尿系统良性疾病受试者的尿液样本，其中膀胱炎20例、膀胱结石20例、膀胱增生15例、输尿管结石20例、尿道肉阜5例、肾结石20例，作为特异性样本。经知情同意，收集来源于医院临床100位门诊诊断确诊为罹患尿路上皮癌受试者的尿液样本，其中膀胱癌50例、输尿管癌30例、肾盂癌15例、尿道癌5例，作为尿路上皮癌样本。特异性样本和尿路上皮癌样本共同组成检测样本，用于考察PCR体系筛选后的8组标志物，结合参考临床诊断结果，分析敏感性和特异性，检测程序为：
第一阶段：95℃5min；
第二阶段：95℃15s，64℃10s，72℃10s，10个循环；
第三阶段：93℃15s，60℃30s，72℃10s，36个循环。60℃时收集荧光信号。
本实施例中，使用检测样本，考察PCR体系筛选后的8组基因甲基化位点作为标志物的检测性能。通过荧光PCR，检测各个基因甲基化位点在特异性样本与尿路上皮癌样本中的Ct值，同时检测内控Ct值。以ACTB基因作为内控，通过设置Cut-off值，计算出不同阈值的检测性能，选择出最优性能的阈值，作为为该标志物基因的平均甲基化比例阈值。标志物的Cut-off值明确后就可以确定每个样本的阴阳性，进而判断出标志物的敏感性、特异性、AUC数值，使用针对ZNF154、HAND2和TRPS1基因不同甲基化区域的引物和探针组合进行检测时，检测性能如表7所示，检测结果如图2所示。
结果如下：
a)在TRPS1基因中，4个甲基化区段作为标志物单独检测的敏感性为84％-86％，特异性为91％-93％；
b)在HAND2基因中，2个甲基化区段作为标志物单独检测的敏感性为80％-83％，特异性为92％-94％；
c)在ZNF154基因中，2个甲基化区段作为标志物单独检测的敏感性为81％-83％，特异性为92％-93％；
可见，标志物ZNF154、HAND2和TRPS1具有早期诊断尿路上皮癌的能力，可很好地区分特异性样本与尿路上皮癌样本。
结果发现TRPS1基因具有优异的检测尿路上皮癌的能力，特别是其具有更高的敏感性，在早期筛查尿路上皮癌中具有优势。针对TRPS1基因chr8:116679699-116681623区段开展检测，该区段内包含1925bp碱基，并且经实施例2验证具备早期筛查尿路上皮癌的能力。在TRPS1基因区段内设计4个甲基化区段用于荧光PCR检测，每个区段均表现出优异的尿路上皮癌早期筛查能力。
表7 8个引物、探针组合的检测性能
| 序号 | 引物、探针组合 | 敏感性 | 特异性 | AUC | Cut-off值 |
| 组合1 | T1-F1、T1-R1、T1-P1 | 86％ | 92％ | 0.89 | 19.2 |
| 组合2 | T2-F2、T2-R1、T2-P1 | 84％ | 93％ | 0.90 | 20.3 |
| 组合3 | T3-F1、T3-R2、T3-P1 | 85％ | 92％ | 0.89 | 21.0 |
| 组合4 | T4-F2、T4-R2、T4-P1 | 84％ | 91％ | 0.88 | 20.7 |
| 组合5 | H1-F1、H1-R2、H1-P1 | 80％ | 94％ | 0.87 | 22.9 |
| 组合6 | H2-F1、H2-R1、H2-P1 | 83％ | 92％ | 0.88 | 21.5 |
| 组合7 | Z1-F2、Z1-R1、Z1-P1 | 83％ | 92％ | 0.88 | 17.5 |
| 组合8 | Z2-F2、Z2-R2、Z2-P1 | 81％ | 93％ | 0.87 | 17.8 |
本实施例证明在TRPS1基因的多个区段设计荧光PCR体系均表现出较优异的尿路上皮癌检测性能。除了实施例指出的4个区段之外，通过设计不同位置的引物探针，均可预知具备优异的检测性能。
实施例5、标志物基因组合、甲基化位点组合的检测性能
本实施例中使用的检测样本与实施例4相同。
标志物基因ZNF154、HAND2和TRPS1在本发明中均被证实具有早期诊断尿路上皮癌的潜力。如需开发为试剂盒时，可进行多个标志物组合或单个标志物内多个甲基化位点组合，以进一步提高试剂盒检测尿路上皮癌的性能。
使用检测样本，通过PCR体系结合参考临床诊断结果，考察标志物组合或同一标志物中不同甲基化位点组合的敏感性和特异性(检测方法同实施例4)。通过荧光PCR平台，以ACTB基因作为内控，检测各个标志物或其甲基化位点在特异性样本与尿路上皮癌样本中的Ct值，同时检测内控Ct值。通过设置Cut-off值确定标志物检测性能。
进行标志物阈值分析时可采用Ct值、△Ct值等多种方式。Ct值为标志物基因引物探针检测待测样品是的荧光阈值，按Ct值计算出不同阈值的检测性能，Ct值小于阈值判定为样本阳性，Ct值大于阈值则判定为样本阴性，选择出最优性能的阈值，作为为该标志物基因的Ct值阈值(cut-off值)；△Ct值＝标志物基因引物探针检测Ct值-内控ACTB基因引物探针检测Ct值，按△Ct值计算出不同阈值的检测性能，△Ct值小于阈值判定为样本阳性，△Ct值大于阈值则判定为样本阴性，选择出最优性能的阈值，作为为该标志物基因的Ct值阈值(cut-off值)。
由于采用多个标志物或同一标志物的不同甲基化位点，在结果判读时，可采用如下方法：
(1)单阳判阳：其中一个标志物(或一个CpG岛)检测结果为阳性时，判断该检测样本为尿路上皮癌阳性样本。
(2)两阳判阳：两个标志物(或两个CpG岛)检测结果为阳性时，判断该检测样本为尿路上皮癌阳性样本。
(3)三阳判阳：三个标志物(或三个CpG岛)检测结果为阳性时，判断该检测样本为尿路上皮癌阳性样本。
1.标志物基因组合
使用TRPS1、HAND2、ZNF154三个标志物进行组合时，可进行两个标志物组合，也可进行三个标志物组合，示例性的组合情况及其检测性能如表8所示。
表8示例性标志物组合及其检测性能
结果表明，以TRPS1进行多标志物的组合，尿路上皮癌检测敏感性与特异性均较优异，相比传统检测表现出不俗的检测性能，且甲基化检测为无创诊断，降低了受试者的伤害，在尿路上皮癌早期诊断领域具有重要应用空间。
2.单一基因甲基化位点组合
单一基因的不同甲基化位点也可以组合起来，作为标志物，用于检测尿路上皮癌。表9提供了示例性的单个基因中不同甲基化位点组合及其检测性能。
表9单一基因甲基化位点组合及其检测性能
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结果表明，以TRPS1、HAND2或ZNF154的CpG岛组合作为标志物检测尿路上皮癌的敏感性与特异性均较优异。
实施例6、TRPS1标志物其他检测区域的检测性能
本实施例中使用的检测样本与实施例4相同。
标志物基因TRPS1在实施例4、5中被证实具有早期诊断尿路上皮癌的潜力，本实施例进一步分析TRPS1甲基化位点的检测性能。如需开发为试剂盒时，可进行多个组合结合分析，以进一步提高试剂盒检测尿路上皮癌的性能。
使用检测样本，通过PCR体系结合参考临床诊断结果，考察标志物组合或同一标志物中不同甲基化位点组合的敏感性和特异性(检测方法同实施例4)。通过荧光PCR平台，以ACTB基因作为内控，检测各个标志物或其甲基化位点在特异性样本与尿路上皮癌样本中的Ct值，同时检测内控Ct值。通过设置Cut-off值确定标志物检测性能。
进行标志物阈值分析时可采用Ct值、△Ct值等多种方式。Ct值为标志物基因引物探针检测待测样品是的荧光阈值，按Ct值计算出不同阈值的检测性能，Ct值小于阈值判定为样本阳性，Ct值大于阈值则判定为样本阴性，选择出最优性能的阈值，作为为该标志物基因的Ct值阈值(cut-off值)；△Ct值＝标志物基因引物探针检测Ct值-内控ACTB基因引物探针检测Ct值，按△Ct值计算出不同阈值的检测性能，△Ct值小于阈值判定为样本阳性，△Ct值大于阈值则判定为样本阴性，选择出最优性能的阈值，作为为该标志物基因的Ct值阈值(cut-off值)。
1.TRPS1标志物使用不同甲基化区域引物探针考察检测性能
针对实施例4以外的TRPS1基因区域设计引物探针考察对尿路上皮癌的检测性能，设计引物探针如表10所示。
表10 TRPS1标志物116679699-116681623范围内引物探针信息
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表11 TRPS1标志物116679699-116681623范围外位点引物探针信息
特异性样本和尿路上皮癌样本共同组成检测样本，用于考察TRPS1基因116679699-116681623范围内位点的组合9-16、考察TRPS1基因116679699-116681623范围外位点的组合17-18，结合参考临床诊断结果，分析敏感性和特异性，检测程序为：
第一阶段：95℃5min；
第二阶段：95℃15s，64℃10s，72℃10s，10个循环；
第三阶段：93℃15s，60℃30s，72℃10s，36个循环。60℃时收集荧光信号。
表12引物探针组合的检测性能
| 序号 | 引物、探针组合 | 敏感性 | 特异性 | AUC | Cut-off值 |
| 组合9 | T5-F1、T5-R1、T5-P1 | 85％ | 92％ | 0.89 | 20.4 |
| 组合10 | T6-F1、T6-R1、T6-P1 | 82％ | 94％ | 0.88 | 18.5 |
| 组合11 | T7-F1、T7-R1、T7-P1 | 81％ | 95％ | 0.88 | 20.5 |
| 组合12 | T8-F1、T8-R1、T8-P1 | 83％ | 92％ | 0.88 | 20.3 |
| 组合13 | T9-F1、T9-R1、T9-P1 | 84％ | 91％ | 0.88 | 20.6 |
| 组合14 | T10-F1、T10-R1、T10-P1 | 83％ | 93％ | 0.88 | 19.8 |
| 组合15 | T11-F1、T11-R1、T11-P1 | 83％ | 91％ | 0.87 | 21.3 |
| 组合16 | T12-F1、T12-R1、T12-P1 | 83％ | 92％ | 0.88 | 20.5 |
| 组合17 | T13-F1、T13-R1、T13-P1 | 88％ | 42％ | 0.65 | 16.3 |
| 组合18 | T14-F1、T14-R1、T14-P1 | 25％ | 98％ | 0.62 | 22.6 |
结果表明，在TRPS1基因116679699-116681623范围内设计的组合9-组合16，针对其中的CpG位点设计引物探针进行PCR检测，均具备优异的检测性能；而116679699-116681623范围外设计的组合17与组合18均表现出检测性能严重下降的表现。
以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对本发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。同时，在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。
Claims (11)
1.用于检测标志物甲基化水平的试剂在制备用于尿路上皮癌的检测系统中的应用；所述标志物包括TRPS1；或所述标志物包括TRPS1中至少1个CpG位点。
2.如权利要求1所述的应用，其特征在于，所述标志物还包括HAND2，和/或ZNF154；
较佳地，所述标志物选自如下的任一组：
(1)TRPS1；
(2)TRPS1和HAND2；
(3)TRPS1和ZNF154；
(4)TRPS1、HAND2和ZNF154；
更佳地，以GRCh37.p13，hg19为参考基因组，所述TRPS1包括或为Chromosome 8:116679699-116681623区域；所述HAND2包括或为Chromosome 4:174450190-174450702区域；所述ZNF154包括或为Chromosome 19:58220195-58220937区域。
3.如权利要求1或2所述的应用，其特征在于，所述标志物包括TRPS1、HAND2和ZNF154中至少1个基因中的至少1个CpG位点；
较佳地，以GRCh37.p13，hg19为参考基因组，所述TRPS1的CpG位点选自Chromosome 8:116679699-116681623区域中的CpG位点；所述HAND2的CpG位点选自Chromosome 4:174450190-174450702区域中的CpG位点；所述ZNF154的CpG位点选自Chromosome 19:58220195-58220937区域中的CpG位点；
更佳地，以GRCh37.p13，hg19为参考基因组，所述TRPS1的CpG位点选自Chromosome 8:116679699-116679792、116679824-116679911、116680057-116680142、116680166-116680258、116680292-116680493、116680528-116680685、116680689-116680881、116681000-116681149、116681171-116681317、116681321-116681463、116681494-116681623、116680395-116680396任一区域中的CpG位点；所述HAND2的CpG位点选自Chromosome 4:174450701-174450610或174450526-174450487区域中的CpG位点；所述ZNF154的CpG位点选自Chromosome 19:58220378-58220316或58220262-58220208区域中的CpG位点。
4.如权利要求1所述的应用，其特征在于，所述检测系统包括：检测试剂、试剂盒或检测装置；
较佳地，所述检测试剂包括：PCR检测试剂、测序试剂；更佳地，所述检测试剂包括：特异性扩增所述标志物基因的引物、特异性识别标志物基因的探针；
较佳地，所述试剂盒中包括所述的检测试剂；更佳地，所述试剂盒还包括核酸提取试剂、核酸转化试剂、对照体系中的至少1种；
较佳地，所述检测装置包括：基因测序仪器、芯片、探针组、引物组或内参基因组。
5.如权利要求4所述的应用，其特征在于，所述引物的核苷酸序列为如SEQ ID NO：1～4、6～9、11～14、16～19、21～24、26～29、31～34、36～39、41-42、44-45、47-48、50-51、53-54、56-57、59-60、62-63任一所示，或与SEQ ID NO：1～4、6～9、11～14、16～19、21～24、26～29、31～34、36～39、41-42、44-45、47-48、50-51、53-54、56-57、59-60、62-63任一所示的序列具有85％以上的同源性；
所述探针的核苷酸序列为如SEQ ID NO：5、10、15、20、25、30、35、40、43、46、49、52、55、58、61、64任一所示，或与SEQ ID NO：5、10、15、20、25、30、35、40、43、46、49、52、55、58、61、64任一所示的序列具有85％以上的同源性；
较佳地，所述的引物或探针是由SEQ ID NO：1、3、5所示，SEQ ID NO：7、8、10所示，SEQID NO：11、14、15所示，SEQ ID NO：17、19、20所示，SEQ ID NO：21、24、25所示，SEQ ID NO：26、28、30所示，SEQ ID NO：32、33、35所示、SEQ ID NO：37、39、40所示、SEQ ID NO：41、42、43所示、SEQ ID NO：44、45、46所示、SEQ ID NO：47、48、49所示、SEQ ID NO：50、51、52所示、SEQID NO：53、54、55所示、SEQ ID NO：56、57、58所示、SEQ ID NO：59、60、61所示或SEQ ID NO：62、63、64所示的多核苷酸或者它们的互补链的组合构成的引物组。
6.如权利要求1～5任一项所述的应用，其特征在于，所述检测的方法包括：
(a)对于待测样本，获得其中标志物的甲基化信息；
(b)根据(a)的甲基化信息，分析标志物的甲基化水平，从而判断待测样本患有尿路上皮癌的风险；
较佳地，
(a)中，甲基化信息包括甲基化比例、平均甲基化比例、logFC中的至少1个信息，至少2个信息或全部信息；
(b)中，若标志物的甲基化水平高，评价为：存在较高的患有尿路上皮癌的风险，或肿瘤恶性的风险高，或生存期短的可能性大；若标志物的甲基化水平低，评价为：存在较低的患有尿路上皮癌的风险，或肿瘤恶性的风险低，或生存期长的可能性大。
7.如权利要求1～6任一项所述的应用，其特征在于，所述尿路上皮癌包括：肾盂癌、输尿管癌、膀胱癌和尿道癌。
8.用于尿路上皮癌的风险判定的引物或探针，其与经甲基化(较佳为亚硫酸氢盐)处理后的标志物所含的至少1个CpG位点杂交；较佳地，所述杂交包括与CpG位点的正义链或反义链杂交；
较佳地，所述标志物包括TRPS1；更佳地还包括HAND2和/或ZNF154；更更佳地，所述标志物选自如下的任一组：(1)TRPS1；(2)TRPS1和HAND2；(3)TRPS1和ZNF154；(4)TRPS1、HAND2和ZNF154；
较佳地，以GRCh37.p13，hg19为参考基因组，所述TRPS1的CpG位点选自Chromosome 8:116679699-116681623区域中的CpG位点；所述HAND2的CpG位点选自Chromosome 4:174450190-174450702区域中的CpG位点；所述ZNF154的CpG位点选自Chromosome 19:58220195-58220937区域中的CpG位点。
9.如权利要求8所述的引物或探针，其特征在于，所述引物的核苷酸序列包括或为如SEQ ID NO：1～4、6～9、11～14、16～19、21～24、26～29、31～34、36～39、41-42、44-45、47-48、50-51、53-54、56-57、59-60、62-63任一所示，或与SEQ ID NO：1～4、6～9、11～14、16～19、21～24、26～29、31～34、36～39、41-42、44-45、47-48、50-51、53-54、56-57、59-60、62-63任一所示的序列具有85％以上的同源性；
所述探针的核苷酸序列包括或为如SEQ ID NO：5、10、15、20、25、30、35、40、43、46、49、52、55、58、61、64任一所示，或与SEQ ID NO：5、10、15、20、25、30、35、40、43、46、49、52、55、58、61、64任一所示的序列具有85％以上的同源性；
较佳地，所述的引物或探针是由SEQ ID NO：1、3、5所示，SEQ ID NO：7、8、10所示，SEQID NO：11、14、15所示，SEQ ID NO：17、19、20所示，SEQ ID NO：21、24、25所示，SEQ ID NO：26、28、30所示，SEQ ID NO：32、33、35所示、SEQ ID NO：37、39、40所示、SEQ ID NO：41、42、43所示、SEQ ID NO：44、45、46所示、SEQ ID NO：47、48、49所示、SEQ ID NO：50、51、52所示、SEQID NO：53、54、55所示、SEQ ID NO：56、57、58所示、SEQ ID NO：59、60、61所示或SEQ ID NO：62、63、64所示的多核苷酸或者它们的互补链的组合构成的引物组。
10.一种用于检测尿路上皮癌的系统，其包括检测单元以及数据分析单元；
所述检测单元包括：测定标志物甲基化水平的检测试剂，或含有所述检测试剂的试剂盒或检测装置的试剂或装置；
所述数据分析单元包括：用于对检测单元的检测结果进行分析处理的处理单元，获得尿路上皮癌的检测结果；
其中所述标志物包括TRPS1，较佳地还包括HAND2和/或ZNF154；更佳地，所述标志物选自如下的任一组：(1)TRPS1；(2)TRPS1和HAND2；(3)TRPS1和ZNF154；(4)TRPS1、HAND2和ZNF154；更更佳地，以GRCh37.p13，hg19为参考基因组，所述TRPS1包括或为Chromosome 8:116679699-116681623区域；所述HAND2包括或为Chromosome 4:174450190-174450702区域；所述ZNF154包括或为Chromosome 19:58220195-58220937区域；或
其中所述标志物包括TRPS1、HAND2和ZNF154中至少1个基因的CpG位点；较佳地，所述TRPS1的CpG位点选自Chromosome 8:116679699-116681623区域中的CpG位点；所述HAND2的CpG位点选自Chromosome 4:174450190-174450702区域中的CpG位点；所述ZNF154的CpG位点选自Chromosome 19:58220195-58220937区域中的CpG位点；
较佳地，所述检测试剂或试剂盒如权利要求4或5所定义。
11.一种尿路上皮癌的检测方法，包括：利用特异性检测标志物的检测系统进行针对标志物的检测；
其中所述标志物包括TRPS1，较佳地还包括HAND2和/或ZNF154；更佳地，所述标志物选自如下的任一组：(1)TRPS1；(2)TRPS1和HAND2；(3)TRPS1和ZNF154；(4)TRPS1、HAND2和ZNF154；更更佳地，以GRCh37.p13，hg19为参考基因组，所述TRPS1包括或为Chromosome 8:116679699-116681623区域；所述HAND2包括或为Chromosome 4:174450190-174450702区域；所述ZNF154包括或为Chromosome 19:58220195-58220937区域；或
其中所述标志物包括TRPS1、HAND2和ZNF154中至少1个基因的CpG位点；较佳地，所述TRPS1的CpG位点选自Chromosome 8:116679699-116681623区域中的CpG位点；所述HAND2的CpG位点选自Chromosome 4:174450190-174450702区域中的CpG位点；所述ZNF154的CpG位点选自Chromosome 19:58220195-58220937区域中的CpG位点；
较佳地，所述检测系统如权利要求10所述。
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