CN111349700B

CN111349700B - 用于尿路上皮癌检测的基因标志物组合、试剂盒和方法

Info

Publication number: CN111349700B
Application number: CN202010004611.9A
Authority: CN
Inventors: 李宏召; 徐衍盛; 马鑫; 张旭; 郑乔松; 师晓; 李乐; 毛凯晟; 艾星; 高江平
Original assignee: Genetron Health Beijing Co ltd
Current assignee: Genetron Health Beijing Co ltd
Priority date: 2020-01-03
Filing date: 2020-01-03
Publication date: 2022-12-16
Anticipated expiration: 2040-01-03
Also published as: CN111349700A

Abstract

本发明提供了用于尿路上皮癌检测的基因标志物组合、试剂盒和方法。本发明的基因标志物组合已证实有效实现尿路上皮癌检测，特别是在血尿群体中。

Description

用于尿路上皮癌检测的基因标志物组合、试剂盒和方法

技术领域

本发明涉及用于尿路上皮癌检测的基因标志物组合、试剂盒和方法。

背景技术

医学上位于膀胱、肾盂、输尿管和尿道的肿瘤中的90％来源于尿路上皮，即为尿路上皮细胞癌(简称尿路上皮癌，urothelial carcinoma，UC)。

尿路上皮癌在检测时按病理一般可分为非肌层浸润性和肌层浸润性，其中非肌层浸润性尿路上皮癌的治疗方式更多(如手术，BCG灌注，化疗等)，预后也更好，5年生存率为约80～90％；而在发展为肌层浸润性尿路上皮癌后，肿瘤一般容易进一步发生远处转移，5年生存率通常不到40％。可见，尿路上皮癌的早期检测对于提高患者的生存率意义极为重大。

对于尿路上皮癌而言，早期症状包括血尿、腰痛等，但并非所有血尿都因尿路上皮癌引起，而是还可包括其他原因，如膀胱炎症，前列腺增生，药物副作用等。目前，尿路上皮癌的检测方法包括影像学技术(如尿路造影，B超，CT，MRI)、膀胱镜(或输尿管镜)结合尿脱落细胞学，和尿沉渣FISH检测等。近年来通过蛋白标记物NMP22，BTA定性定量的方式也逐渐得到普及。膀胱镜结合尿脱落细胞学是目前检测尿路上皮癌的最常用方法，然而膀胱镜检查具有侵入性、操作不便，患者较痛苦，具有感染、出血等风险，敏感性低等问题，其他检测也有容易受尿路感染等干扰的问题。

因此，本领域需要具有更高检测性能的针对尿路上皮癌的无创检测，包括治疗之前和之后，特别是在血尿群体中。

发明内容

近年来基于游离DNA(cfDNA)的液体活检技术不断发展成熟，在癌症早期检测中表现出非常令人期待的优势。本发明提供了一种用于尿路上皮癌检测的生物标记物组合，特别是用于血尿患者，适合于辅助评估血尿症状患者罹患尿路上皮癌的风险，辅助鉴别尿路上皮占位性病变的良恶性，动态监测不同时段尿路上皮癌患者的尿液中的风险基因分子病理学改变情况。本发明证实了所述生物标记物组合在识别具有血尿症状的群体中的尿路上皮癌患者的效用，与常规检测相比具有更高的灵敏度和特异性。本发明提供了无创、敏感、特异性高且简单可行的肿瘤标志物作为尿路上皮癌检测的依据。

在一个方面，本发明提供了一种用于受试者尿路上皮癌检测的基因标志物组合，其包括ONECUT2甲基化和其他基因的突变，所述其他基因包括TERT和TP53，如果检测到ONECUT2甲基化或所述其他基因中的一种或多种的突变为阳性，则确定所述受试者具有尿路上皮癌；如果检测到ONECUT2甲基化和所述其他基因的突变均为阴性，则排除所述受试者具有尿路上皮癌。

在另一个方面，本发明提供了一种用于受试者尿路上皮癌检测的基因标志物组合，其包括ONECUT2甲基化和其他基因的突变，所述其他基因由ASXL2、SF3B1、RHOA、PIK3CA、FGFR3、FBXW7、TERT、HRAS、KRAS、ERBB3、AKT1、CREBBP、ERBB2、ERCC2、U2AF1、KDM6A和TP53组成，如果检测到ONECUT2甲基化或所述其他基因中的一种或多种的突变为阳性，则确定所述受试者具有尿路上皮癌；如果检测到ONECUT2甲基化和所述其他基因的突变均为阴性，则排除所述受试者具有尿路上皮癌。

在又一个方面，本发明提供了本发明的基因标志物组合在用于检测受试者尿路上皮癌的试剂制备中的用途。

在又一个方面，本发明提供了用于检测本发明的基因标志物组合的试剂在用于检测尿路上皮癌试剂盒的制备中的用途。

在又一个方面，本发明提供了一种用于尿路上皮癌检测的试剂盒，其包括用于检测本发明的基因标志物组合的试剂。

在又一个方面，本发明提供了一种用于检测尿路上皮癌的方法，其包括：

(1)提供来自受试者的尿液样本；

(2)检测所述尿液样本中本发明的基因标志物组合；和

(3)如果检测到ONECUT2甲基化或所述其他基因中的一种或多种的突变为阳性，则确定所述受试者具有尿路上皮癌；如果检测到ONECUT2甲基化和所述其他基因的突变均为阴性，则排除所述受试者具有尿路上皮癌。

具体实施方式

通过阅读以下详细描述和所附权利要求，这些和其它方面、特征和优点对于本领域普通技术人员将变得显而易见。为了避免疑问，本发明的一个方面的任何特征都可以用于本发明的任何其它方面。词语“包含”旨在表示“包括”，但不一定是“由...组成”或“由...构成”。换句话说，所列出的步骤或选项不需要是穷举性的。应注意，以下描述中给出的实施例旨在阐明本发明，而非旨在使本发明限于这些实施例本身。类似地，除非另有说明，否则所有百分比均为重量/重量百分比。除非是在工作实施例和比较实施例中，或者是在另外明确指出的情况下，否则本说明书中表示材料量或反应条件、材料物理性质和/或用途的所有数字都应理解为由词语“约”修饰。以“x至y”的形式表示的数值范围应理解为包括x和y。当针对特定特征以“x至y”的形式描述多个优选范围时，应理解还预期组合不同端点的所有范围。换句话说，在规定值的任何范围时，任何特定的上限值可以与任何特定的下限值相关联。最后，通过不定冠词“一个/种(a/an)”指代要素并不排除存在多于一个/种要素的可能性，除非上下文明确要求只有一个/种要素。因此，不定冠词“一个/种(a/an)”通常表示“至少一个/种”。

在公开关于本发明的特定方面(例如本发明的方法)的特征时，这样的公开也被认为适用于本发明的任何其他方面(例如本发明的试剂盒和用途)，并作出必要的修正。

本发明适合于采用尿沉渣样本的无创活检，用于定性检测从血尿患者的尿沉渣样本提取的尿沉渣DNA以及游离DNA中的基因突变和甲基化，适合于辅助评估血尿症状患者罹患尿路上皮癌的风险，辅助鉴别尿路上皮占位性病变的良恶性，动态监测不同时段尿路上皮癌患者的尿液中的风险基因分子病理学改变情况。

在一个实施方式中，所述其他基因还包括U2AF1。

在一个优选实施方式中，本发明的基因标志物组合包括ONECUT2甲基化和其他基因的突变，所述其他基因包括TERT、TP53和U2AF1。

在一个实施方式中，所述其他基因还包括AKT1、ERBB2、HRAS、FGFR3、KRAS、SF3B1和PIK3CA中的一种或多种。

在一个优选实施方式中，本发明的基因标志物组合包括ONECUT2甲基化和其他基因的突变，所述其他基因包括TERT和TP53；以及AKT1、ERBB2、HRAS、FGFR3、KRAS、SF3B1、PIK3CA中的一种或多种。

在一个优选实施方式中，本发明的基因标志物组合包括ONECUT2甲基化和其他基因的突变，所述其他基因包括TERT、TP53和U2AF1；以及AKT1、ERBB2、HRAS、FGFR3、KRAS、SF3B1、PIK3CA中的一种或多种。

在一个实施方式中，所述其他基因还包括ASXL2、RHOA、FBXW7、ERBB3、CREBBP、ERCC2和KDM6A中的一种或多种。

在一个优选实施方式中，本发明的基因标志物组合包括ONECUT2甲基化和其他基因的突变，所述其他基因包括TERT和TP53；以及ASXL2、RHOA、FBXW7、ERBB3、CREBBP、ERCC2和KDM6A中的一种或多种。

在一个优选实施方式中，根据本发明的基因标志物组合ONECUT2甲基化和其他基因的突变，所述其他基因包括TERT、TP53和U2AF1；以及ASXL2、RHOA、FBXW7、ERBB3、CREBBP、ERCC2和KDM6A中的一种或多种。

在一个优选实施方式中，本发明的基因标志物组合包括ONECUT2甲基化和其他基因的突变，所述其他基因包括TERT、TP53和U2AF1；以及AKT1、ERBB2、HRAS、FGFR3、KRAS、SF3B1和PIK3CA中的一种或多种；以及ASXL2、RHOA、FBXW7、ERBB3、CREBBP、ERCC2和KDM6A中的一种或多种。

在一个特别优选的实施方式中，本发明的基因标志物组合ONECUT2甲基化和其他基因的突变，所述其他基因包括TERT、TP53和U2AF1；以及AKT1、ERBB2、HRAS、FGFR3、KRAS、SF3B1和PIK3CA；以及ASXL2、RHOA、FBXW7、ERBB3、CREBBP、ERCC2和KDM6A。

在一个特别优选的实施方式中，本发明的基因标志物组合ONECUT2甲基化和其他基因的突变，所述其他基因由以下组成：TERT、TP53和U2AF1；以及AKT1、ERBB2、HRAS、FGFR3、KRAS、SF3B1和PIK3CA；以及ASXL2、RHOA、FBXW7、ERBB3、CREBBP、ERCC2和KDM6A。

本发明的生物标志物组合涉及如表1中示例的基因突变，其中对于各个基因，如存在任何一个或多个相应突变，则确定该基因具有突变。本发明的生物标志物组合涉及ONECUT2基因甲基化，其中对于ONECUT2基因，如存在任何一个或多个核苷酸的甲基化，则确定ONECUT2基因具有甲基化。

表1.根据本发明的基因标志物组合涉及的基因突变

在一些实施方式中，ASXL2基因的突变包括、基本上由以下组成、或由以下组成：c.988G>A。

在一些实施方式中，SF3B1基因的突变包括、基本上由以下组成、或由以下组成：c.2704G>C，c.2704G>A。

在一些实施方式中，RHOA基因的突变包括、基本上由以下组成、或由以下组成：c.145G>A，c.139G>A。

在一些实施方式中，PIK3CA基因的突变包括、基本上由以下组成、或由以下组成：c.278G>A，c.316G>C，c.317G>T，c.323G>A，c.1357G>A，c.1624G>A，c.1625A>T，c.1633G>A，c.1633G>C，c.1634A>G，c.1636C>A，c.2176G>A，c.3139C>T，c.3140A>G，c.3140A>T。

在一些实施方式中，FGFR3基因的突变包括、基本上由以下组成、或由以下组成：c.742C>T，c.746C>G，c.749C>A，c.1102G>T，c.1111_1112insACC，c.1111A>T，c.1118A>G，c.1127T>C，c.1138G>A，c.1271C>T，c.1277A>G，c.1280C>G。

在一些实施方式中，FBXW7基因的突变包括、基本上由以下组成、或由以下组成：c.1637C>T，c.1595C>T，c.1594A>C，c.1394G>A。

在一些实施方式中，TERT基因的突变包括、基本上由以下组成、或由以下组成：c.-45G>T，c.-54C>A，c.-57A>C，c.-63T>CATTT，c.-80C>T，c.-86C>T，c.-89C>T，c.-93T>G，c.-124C>T，c.-124C>A，c.-124_-125GG>AA，c.-138C>T，c.-139_-140GG>TT，c.-139C>T，c.-141G>A，c.-146C>T。

在一些实施方式中，HRAS基因的突变包括、基本上由以下组成、或由以下组成：c.218G>A，c.182A>T，c.182A>G，c.38G>A，c.37G>C，c.35G>A，c.34G>A，c.19G>C。

在一些实施方式中，KRAS基因的突变包括、基本上由以下组成、或由以下组成：c.76A>T，c.57G>C，c.38G>A，c.35G>T，c.35G>C，c.35G>A，c.34G>C。

在一些实施方式中，ERBB3基因的突变包括、基本上由以下组成、或由以下组成：c.889G>T，c.994G>A，c.1009G>A。

在一些实施方式中，AKT1基因的突变包括、基本上由以下组成、或由以下组成：c.49G>A。

在一些实施方式中，CREBBP基因的突变包括、基本上由以下组成、或由以下组成：c.3217C>T。

在一些实施方式中，ERBB2基因的突变包括、基本上由以下组成、或由以下组成：c.291G>C，c.308G>A，c.829G>C，c.829G>T，c.874G>C，c.914C>G，c.929C>A，c.929C>T，c.937C>G，c.1979G>A，c.2183C>T，c.2324_2325ins12。

在一些实施方式中，ERCC2基因的突变包括、基本上由以下组成、或由以下组成：c.713A>G，c.705G>T，c.702C>A。

在一些实施方式中，U2AF1基因的突变包括、基本上由以下组成、或由以下组成：c.101C>T，c.101C>A。

在一些实施方式中，KDM6A基因的突变包括、基本上由以下组成、或由以下组成：c.1870delC，c.1896G>A，c.1906_1909delCTAT，c.1909_1912delTCTA，c.1910_1911insT，c.1916_1917insTA，c.1921C>T。

在一些实施方式中，TP53基因的突变包括、基本上由以下组成、或由以下组成：外显子SNP突变。

在本文所述的突变中，“c.数字”表示在染色体上的位置，“>”表示置换，del表示缺失(或称删除)，“ins”表示插入。例如，“c.1909_1912delTCTA”表示使染色体第1909-1912位的TCTA缺失；“c.1916_1917insTA”表示在染色体第1916位与第1917位之间插入TA；“c.1921C>T”表示使染色体第1921位的C置换为T。另外，“c.2324_2325ins12”中的“ins12”是指插入12个碱基对(bp)，碱基对本身未作限定。

本发明涉及的基因突变可以使用各种本领域已知的方法检测，包括，但不限于，荧光定量PCR、数字PCR、高通量测序。例如在一些实施方式中，，根据基因突变设计引物，如多重特异性引物，以通过高通量深度测序(平均深度如在20000X以上)技术分析是否存在基因突变，从而确定患者尿液样本中是否存在与尿路上皮癌相关的基因突变。

根据本发明的生物标志物组合包括ONECUT2甲基化。ONECUT2基因的甲基化是作为判断阴性和阳性的因素之一。本发明涉及的甲基化可以使用各种本领域已知的方法检测，包括，但不限于，甲基化特异性PCR(MS-PCR)、亚硫酸氢盐处理+测序、联合亚硫酸氢钠的限制性内切酶分析法、荧光定量法、甲基化敏感性高分辨率熔解曲线分析、焦磷酸测序、基于芯片的甲基化图谱分析、高通量测序、飞行质谱。例如在一些实施方式中，采用荧光定量法，根据ONECUT2的CpG岛信息，结合荧光探针技术，设计针对ONECUT2甲基化的特异引物序列以检测ONECUT2基因的甲基化。

根据本发明的基因突变与甲基化两者的组合为尿路上皮癌检测提供了指导，使得在维持或改善检测的特异性的情况下，检测的敏感性极大提高，从而使得本发明在应用于尿路上皮癌检测时具有优异的性能。

在一个实施方式中，所述试剂是根据本发明的基因标志物组合设计的引物和/或探针。

在一个实施方式中，所述试剂是根据本发明所述的基因标志物组合设计的引物和/或探针。

(1)提供来自受试者的尿液样本；

(2)检测所述尿液样本中本发明的基因标志物组合；和

在根据本发明的基因标志物组合的上下文中优选的方面也适用于在根据本发明的试剂盒、方法和用途的上下文中的优选方面，加以必要的改变。

现将通过以下非限制性实施例说明本发明。

实施例

材料：

从受试者的尿沉渣样本提取的尿沉渣DNA以及游离DNA作为样本。

方法：

1核酸提取

1)提取DNA

使用核酸提取纯化试剂盒(QIAamp DNA Mini Kit 250，QIAGEN)，进行DNA提取。

2)DNA检测和定量

使用DNA核酸定量试剂盒，(Qubit dsDNAHS Assay Kits,Thermo FisherScientific)对提取的DNA进行浓度检测。

3)DNA浓度调整

扩增反应体系中共需要40ng(最低20ng)的DNA量，甲基化转化体系需要60ng(最低30ng)的DNA量。在分离纯化完成后将DNA储备液的浓度调整至合适范围。使用TE缓冲液(pH8.0)进行调整。

2基因突变检测

2.1测序文库构建

1)概述

采用一步法进行建库，其是用于检测各类型样本的基因突变的快速高效建库方法，其中涉及以下引物：

Barcode引物，F1：测序接头1+Barcode序列+通用序列1；

上游引物，F2：通用序列1+分子标签+上游特异性引物序列；

下游外引物，R1：测序接头2+通用序列2；

下游内引物，R2：通用序列2+下游特异性引物序列；

Barcode序列是用于区分不同样本的序列。上游和下游特异性引物序列是用于扩增特定目标区域的引物序列，根据基因标志物的序列而设计。分子标签是用于标记模板分子。通用序列1和2是两段不同的特定核酸序列，该序列可根据需要变化。测序接头1和2为测序所需的接头序列，可根据测序平台确定，如对于Ion Torrent平台为A和P接头。

将各个序列相应组合成上游引物和下游引物。引物序列在合成后溶解以配制DNA扩增混合液。

本实施例中，通用序列1为：GGCATACGTCCTCGTCTA(SEQ ID NO:1)；通用序列2为：CCTCTCTATGGGCAGTCGGTGAT(SEQ ID NO:2)；测序接头1为：CCATCTCATCCCTGCGTGTCTCCGACTCAG(SEQ ID NO:3)；测序接头2为：CCACTACGCCTCCGCTTT(SEQ ID NO:4)。

本实施例中，DNA扩增引物混合液1是由基因标志物的上游引物F2溶液(引物序列见表2)和基因标志物的下游内引物R2(引物序列见表3)溶液、下游外引物即反向通用引物R1(引物序列见表4)溶液，按一定比例混合后形成，其中R1、F2、R2引物加入初始浓度均为50μM，R1:F2:R2(体积比)＝10:(1-5):(1-5)，本实施例中，例如，选择R1:F2:R2(体积比)为10:5:5。

DNA扩增引物混合液2是由TERT基因的上下游引物溶液(引物序列见表5)按一定比例混合后形成，其中R1、F2、R2引物加入初始浓度均为50μM，且R1:F2:R2(体积比)＝10:(1-5):(1-5)，本实施例中，例如，选择R1:F2:R2(体积比)为10:5:5。

上游引物中的分子标签包括随机序列和特定序列，本实施例中的分子标签为：NNNNACNNNN，其中AC为特定序列，其他为随机序列，其中N随机选自A、T、G或C。

将Barcode引物F1溶液(引物序列见表6)分别与TE buffer缓冲液1:1混合稀释使用，其中Barcode引物F1混合后浓度为50μM。

本实施例中在Ion Torrent平台上进行测序，测序接头1和2为A和P接头。

表2.DNA扩增引物混合液1的上游引物(F2)序列

表3.DNA扩增引物混合液1的下游内引物(R2)

表4.反向通用引物(R1)序列

表5.DNA扩增引物混合液2的上下游引物序列

SEQ ID NO:	基因标志物	引物序列
			80	TERT-上游引物F2	GGCATACGTCCTCGTCTANNNNACNNNNTGCCCGTCCCGACCCCT
81	TERT-下游内引物R2	CCTCTCTATGGGCAGTCGGTGATGCTTCCCACGTGCGCA
			82	TERT-下游外引物R1	CCACTACGCCTCCGCTTTCCTCTCTATGGGCAGTCGGTGAT

表6.Barcode引物(F1)序列

2)实验前将DNA扩增引物混合液1和2分别与稀释后的Barcode引物F1溶液、聚合酶混合液(赛默飞)、GC enhancer混合液(赛默飞)涡旋混匀，瞬时离心后备用。

3)PCR扩增

对不同的样本使用不同的特异性接头，取DNA样品个数+2(DNA阳性对照品和阴性对照品中提取的DNA)个0.2mL PCR管，DNA文库构建需要配制2个反应体系，按不同PCR反应程序同时进行，按照表7配制反应体系1：

表7.PCR扩增反应体系1

组分	体积(μL)
		DNA扩增引物混合液1	2
特异性接头	1
		DNA样本	20ng
聚合酶混合液	15
		无核酸酶水	补足至30
总体积	30

注：根据提取浓度计算加入PCR扩增反应体系中的DNA样本的体积。

按照表8配制反应体系2：

表8.PCR扩增反应体系2

配制完成后盖紧PCR管盖，涡旋振荡混匀，进行短暂离心。

反应体系1按照表9进行扩增反应，反应体系2按照表10进行扩增反应：

表9.PCR扩增反应条件1

表10.PCR扩增反应条件2

注：此步骤DNA文库溶液可4℃保存过夜(不超过16小时)，如需保存更长时间应在-18℃以下保存。

2.2文库纯化

2.2.1试剂准备

1)混匀磁珠(Agencourt AMPure XP,Beckman Coulter,A63880)：将文库纯化磁珠恢复至室温，室温放置30min后彻底涡旋混匀以分散磁珠。使用时应缓慢地吸取溶液。

2)配制足量新鲜的80％乙醇溶液(必须现配现用)。

2.2.2文库纯化

1)PCR结束后，将每个样本的反应体系1和反应体系2按1:1混合，混合后体积若不足60μL，则用无核酸酶水补齐。

2)分别加入72μL(文库体积:纯化磁珠体积＝1:1.2)文库纯化磁珠，涡旋混匀，室温静置10min，瞬时离心后置于磁力架上静置约5min，待液体澄清后，弃上清；注意吸取上清时避免吸到磁珠。

3)分别加入200μL现配的80％乙醇溶液，孵育30s，弃上清；注意吸取上清时避免吸到磁珠。此步骤在磁力架上操作。

4)重复3)的步骤，除尽乙醇，在磁力架上室温晾干，但晾干时间应不超过3min。

5)分别加入33μL无核酸酶水洗脱，涡旋混匀，室温静置10min，瞬时离心后置于磁力架上静置约5min，待液体澄清后，吸取30μL上清至新的0.2mL的PCR管中，弃磁珠，收集的上清即为最终用于测序的文库。至此，测序文库构建完成。

6)文库浓度应大于0.1ng/μL。经PCR扩增后所得PCR产物集中在230-240bp范围内。若文库质量不符合要求，则重新构建文库。

2.3上机测序及结果分析

对上述通过一步法获得的测序文库进行测序，测序结果经过数据处理、生物信息学分析之后得到检测的基因的突变情况。数据处理过程包括测序数据的转换、质控、序列比对(参考基因组为NCBI GRCh37/Hg19)、突变位点分析等过程，通过数据处理分析后得到检测样本的突变信息。

3甲基化检测

3.1重亚硫酸盐转化

甲基化检测需要将DNA进行重亚硫酸盐转化，本实验使用商用的重亚硫酸盐转化试剂盒(EZ DNA Methylation-Lightning^TMKit，ZYMO，D5031)进行核酸转化，反应体系按表11配制：

表11.重亚硫酸转化体系

组分	体积(μL)
		Lightning Conversion Reagent	130
DNA样本	60ng
		无核酸酶水	补足至150
总体积	150

注：DNA溶液和无核酸酶水的体积视具体情况而定，但总和必须为20μL。若样本DNA总量较少，DNA模板量可减少，最低30ng。

体系配制完成混匀，将PCR管放入PCR仪，(此步是控温过程，没有扩增循环)重亚硫酸盐转化反应条件按表12进行：

表12.重亚硫酸盐转化反应条件

温度	时间
		98℃	8min
54℃	60min
		4℃	保持

3.2转化产物回收(使用EZ DNA Methylation-Lightning^TMKit，ZYMO，D5031)

1)加600μl的M-Binding Buffer到Zymo-Spin^TMIC Column柱子中，把柱子放到收集管内。

2)把DNA样本加入到有M-Binding Buffer的柱子内，盖盖颠倒混匀数次(大于等于5次)。离心转速12000g，30s，弃废液，加100μl的M-Wash Buffer(需加入96ml无水乙醇后使用)到柱子中，离心30s。

3)加200μl的L-Desulphonation Buffer到柱子中，室温放置15-20min，离心30s。

4)加200μl的M-Wash Buffer到柱子中，离心30s。重复1次此步骤。

5)把柱子放到1.5ml的离心管中，加10-16μl的M-Elution Buffer离心30s，收集转化核酸样本。

3.3PCR扩增

甲基化反应混合液是由针对甲基化基因的引物探针(引物序列见表13)溶液、内参基因的引物探针(引物序列见表13)溶液、无核酸水以及聚合酶溶液按表14混合而成，其中引物和探针的浓度分别为10μM。

表13.甲基化引物探针

甲基化位点	引物序列
		ONECUT2-上游	ATTTTTGTATTATTCGTTTTTGTGCGTATA
ONECUT2-下游	GCGTTTTCGGCGATTCGTTTGGGCGGTT
		ONECUT2-探针	CCGTTCAACGCATTAACTTCGCGA
GAPDH-上游	GGGTGGTTATTGTGAAAAG
		GAPDH-下游	CTCCAATCCCTAACCCTACCTT
GAPDH-探针	CTACTAAAACCCAAAACCAAAC

表14.甲基化反应混合液

组分	体积	单位
			ONECUT2-F2	0.5	μL
ONECUT2-R2	0.5	μL
			ONECUT2-RP2	0.3	μL
GADPH-F	0.5	μL
			GADPH-R	0.5	μL
GADPH-P	0.3	μL
			无核酸水	2.4	μL
聚合酶溶液	10	μL

按表15配制甲基化PCR反应体系，将PCR 96孔板(或者8连排PCR管)放入QPCR仪样品槽中并记录放置顺序，按照表16设置仪器相关参数：

表15.甲基化PCR扩增体系

对每个样本一次检测1个孔，需使用阳性对照(EpiTect Control DNA,methylated，QIAGEN，59655)和阴性对照(

Control DNA(human),unmethylated，QIAGEN,59665)作对比，根据上表配制反应体系，混匀瞬离。

表16.仪器核酸扩增相关参数

3.4结果分析判断

阈值设定：CFX 96系统，阈值设定为200。

计算△Ct值：△Ct值＝突变Ct值-内参Ct值(△Ct＝Ct FAM-Ct VIC)。突变Ct值是指样品突变信号(FAM信号)对应的Ct值；内参Ct值是指样品对应的内参信号(VIC信号)的Ct值。

阳性判断

1.基因突变检测：

结果判定：经生信分析后基因突变的频率≥0.5％，认为样本的基因突变为阳性。

生信分析过程：

在测序数据下机后，首先对下机的样本数据进行质量控制判断，之后将原始BAM数据转换成FASTQ文件，将FASTQ文件与人参考基因组进行比对，并提取分子标签，每个位点根据分子标签将reads聚类，形成families(要求在分子标签相同的基础上，reads需要>＝2条，80％的reads支持同样的碱基型则认为是同一个family)，并统计每个位点的ref(Reference：参考基因组上位点的野生型碱基序列)型和alt(Alternative：突变后位点上的突变型碱基序列)型的family的数量，分别得到各自对应的family深度(family数量)，随后根据位点质控标准对每个位点进行质控(合格或者不合格)，根据每个位点的ref型和alt型的family的数量，计算突变频率，计算方法为：突变频率＝alt型family深度/(alt型family深度+ref型family深度)。

2.甲基化检测：

i.待测样本根据检测所用的不同机型设置对应的阈值，得到突变信号(FAM信号)和内参信号(VIC信号)。

ii.确认试验结果是否有效：

1)空白对照品VIC、FAM通道应无扩增曲线，否则试验结果无效。

2)若检测到VIC的荧光信号且26≤Ct≤33，说明DNA模板正常，检测结果有效；若检测到VIC的荧光信号Ct>33，说明DNA质量不好或样本量不够，建议重新调整模板，再次实验。

3)阳性对照品的FAM信号Ct值应≤33；VIC信号在26-33之间；△Ct≤8，检测结果应为阳性，否则试验结果无效。

4)确认空白对照品、阳性对照品有效后，再判断待测样本VIC信号是否有明显指数增长期的扩增曲线，且Ct值应在26-33之间，否则视为无效结果。

iii.结果判定：

若待测样本△Ct≤8，认为样本的甲基化为阳性；若待测样本△Ct＞8或FAM通道无Ct值，认为样本的甲基化为为阴性。

实施例1：临床样本的基因突变和ONECUT2甲基化的检测

采用根据本发明的基因标志物组合对临床样本进行检测。从中国解放军海军总医院第一、第四和第七医疗中心的肿瘤部，从近五年无恶性病史、在2017年5月至2018年5月具有微观或肉眼可见血尿的患者收集尿液样本。70份尿液样本来自尿路上皮癌患者(UTUC+)，70份尿液样本来自非尿路上皮癌(良性病变)患者(UTUC-)。另有94份尿液样本来自健康对照组。所有UTUC+组患者均经内镜，腹部超声，CT扫描或腹部和骨盆MRI检查，病理证实。对于UTUC-组患者，在内镜检查和影像学评估后，患者被排除在尿路上皮肿瘤的诊断之外。健康对照组的纳入标准为近5年内无微观或肉眼可见的血尿史，无任何恶性病史。

对三组合计234份尿液样本根据前述方法检测基因标志物，包括基因突变和甲基化，以评估相应个体是否具有UTUC。

判断标准：基因标志物组合包括基因突变和甲基化，如果基因突变和甲基化中发生任一者或两者为阳性，则判断患者为UTUC阳性。对于包括多个基因突变的基因标志物组合，如果一个或多个基因突变判定为阳性，则判定该基因标志物组合的基因突变为阳性。举例而言，对于基因标志物组合，其包括ONECUT2甲基化和其他基因的突变，所述其他基因包括TERT和TP53；如果TERT和/或TP53基因突变为阳性(即，TERT基因突变为阳性且TP53基因突变为阴性，TERT基因突变为阴性且TP53基因突变为阳性，或者TERT基因突变为阳性且TP53基因突变为阳性)，则判定该基因标志物组合的基因突变为阳性；进一步地，如果该基因标志物组合的ONECUT2甲基化和/或基因突变为阳性(即，ONECUT2甲基化为阴性且基因突变为阳性；ONECUT2甲基化为阳性且基因突变为阴性；ONECUT2甲基化为阳性且基因突变为阳性)，则判定相应个体为UTUC阳性。

根据以下公式分别计算敏感性、特异性、阳性预测率和阴性预测率。计算结果如下表17所示。

1.敏感性：是指将阳性患者正确地判断为阳性(即，真阳性)的百分率。

计算公式为：TP/(TP+FN)×100％。TP为真阳性，FN为假阴性。

2.特异性：是指将实际无病者(阴性个体)正确地判断为阴性(即，真阴性)的百分率。

计算公式为：TN/(TN+FP)×100％。TN为真阴性，FP为假阳性。

3.阳性预测率：是指通过特定试验方法测定得到的阳性结果中的真阳性的比率。

计算公式为：PPV＝TP/(TP+FP)×100％。

4.阴性预测率：是指通过特定试验方法测定得到的阴性结果中的真阴性的比率。

计算公式为：NPV＝TN/(TN+FN)×100％。

表17.根据本发明的基因标志物组合对临床样本的检测结果

此外，对81％(n＝57)的UTUC+样品和11％(n＝8)的UTUC-样本进行FISH测试。敏感性为49％(28/57)，特异性为100％(8/8)，阳性预测率为100％，阴性预测率为21.6％。

实施例2：与组织一致性对比

本发明的尿路上皮癌检测方法是基于尿液离心后的尿沉渣细胞。为了验证该方法的可靠性，对临床样本相应的患者手术提取组织进行了检测，以比较本发明方法基于尿液的检测结果与从手术组织检测到的结果。即根据本实施例1的方法，利用二代测序方法检测基因突变，利用QPCR检测甲基化。组织样本包括3例阴性样本和55例阳性样本。

对比58例组织样本检测结果，总体阴阳性结果一致性达91.38％，部分病例尿液变异检出情况更是优于组织，具体结果见表18。总体阴阳性结果一致性是根据本发明方法判定的阴性或阳性与组织样本的阴性或阳性相一致的案例数(53例)除以总体案例数(58例)而得。

表18.本发明尿液样本与组织样本的检测结果的比较

注：其中1表示阳性，0表示阴性。

实施例3：与FISH对比

目前FISH是尿路上皮癌检测中敏感度较高的诊断方法，尤其对肾盂癌和输尿管癌等膀胱镜无法观察到的肿瘤。上文已经完成本发明方法检测的临床样本中的许多是肾盂癌和输尿管癌样本，且已经进行过FISH检测。通过与病理信息对比发现，FISH的敏感性不佳，仅为56.2％。许多病理阳性样本的FISH结果为阴性，而本发明方法的结果为阳性。对于FISH检测为阳性的样本，本发明方法(除1例未过质检外)均检测为阳性。

表19.本发明与FISH对比

注：加？号为疑似阳性或阴性

实施例4.与各种商业方法和产品对比

本发明是以最新的癌症基因组学数据为基础设计，理论上相关生物标记物能够在成本控制范围内最大限度覆盖尿路上皮癌病例。并且本检测是从DNA水平进行分析，选取检测的癌症驱动基因可以很好地提升检测的特异度。实际实施数据也显示其性能与既往文献报道的各种基于尿液检测评估尿路上皮肿瘤风险的检测相比，敏感性(％)与特异性(％)均更优。

表20.本发明的基因标志物组合与商业方法和产品的对比

前述实施例和实施方式的描述应当视为是说明，而非限制由权利要求限定的本发明。如将容易理解的，在不脱离如权利要求中所阐述的本发明的情况下，可以利用上述特征的许多变化和组合。这样的变化不被视为脱离本发明的精神和范围，并且所有这样的变化旨在包括在所附权利要求的范围内。

Claims

1.一种用于受试者尿路上皮癌检测的基因标志物组合，其由ONECUT2甲基化和其他基因的突变组成，所述其他基因由ASXL2、SF3B1、RHOA、PIK3CA、FGFR3、FBXW7、TERT、HRAS、KRAS、ERBB3、AKT1、CREBBP、ERBB2、ERCC2、U2AF1、KDM6A和TP53组成，如果检测到ONECUT2甲基化或所述其他基因中的一种或多种的突变为阳性，则确定所述受试者具有尿路上皮癌；如果检测到ONECUT2甲基化和所述其他基因的突变均为阴性，则排除所述受试者具有尿路上皮癌。

2.权利要求1所述的基因标志物组合在用于检测受试者尿路上皮癌的试剂制备中的用途。

3.用于检测权利要求1所述的基因标志物组合的试剂在用于检测尿路上皮癌试剂盒的制备中的用途。

4.根据权利要求2或3所述的用途，其中所述试剂是根据权利要求1所述的基因标志物组合设计的引物和/或探针。

5.一种用于尿路上皮癌检测的试剂盒，其包括用于检测权利要求1所述的基因标志物组合的试剂。

6.根据权利要求5所述的试剂盒，其中所述试剂是根据权利要求1所述的基因标志物组合设计的引物和/或探针。