CN108138242A - 确定基因组dna中突变的方法、该方法的用途以及实施该方法的试剂盒 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种确定基因组DNA中突变的方法。该方法的特征在于，用基因组DNA进行突变分析，其中预先将包含的至少一部分胞嘧啶转换为尿嘧啶或另一种具有与胞嘧啶可区分的碱基配对行为或分子量的碱基。

Description

确定基因组DNA中突变的方法、该方法的用途以及实施该方法 的试剂盒
在先申请的引用
本专利申请要求德国专利申请第10 2015 009 187.5号的优先权，其公开内容通过引用并入本文。
序列表
本申请包括作为说明书的一部分的根据WIPO ST.25标准的txt格式的具有94个序列的电子序列表。
发明领域
本发明涉及用于确定基因组DNA中的突变的肿瘤学领域中的分子诊断方法。本发明进一步涉及与恶性疾病的诊断、预后、预测和随访相关的此种分子诊断方法的用途。此外本发明涉及用于实施所述方法或用于所述用途的试剂盒。特别是根据本发明的方法是体外方法。
背景技术
靶向治疗在个性化医疗时代起着重要作用。在肿瘤领域，一些药物已经成功使用，这些药物靶向抑制肿瘤中突变的蛋白质。为此一个实例是药物威罗菲尼(vemurafenib)(通用名：佐博伏(Zelboraf))，其选择性抑制癌基因BRAF。在约70％的恶性黑色素瘤肿瘤中，该基因发生了突变。所得到的基因产物通过该突变具有增加的活性。因此，其肿瘤具有此种突变的患者对BRAF抑制剂威罗菲尼的治疗反应良好。因此，BRAF的突变是对威罗菲尼治疗的反应的预测性生物标志物。因此，目前建立了确定BRAF的突变作为常规诊断，以鉴定可以对其使用威罗菲尼的患者。
其中基因突变状态相关的此种靶向治疗的另一个实例是药物西妥昔单抗(通用名：爱必妥)。西妥昔单抗选择性地抑制表皮生长因子受体(EGFR)，并用于例如治疗转移性肠癌。然而，如果另一个基因(KRAS)在信号传导途径中有突变，则这种药物不起作用。因此，KRAS突变的确定预示着患者对西妥昔单抗治疗无反应。
因此确定相应基因的突变相应地起着决定性的作用。它通常通过DNA测序来完成。通常为此目的首先病理学评估手术切除的肿瘤或肿瘤的活组织检查，并标记组织样品中包含的肿瘤组织。如果随后在由病理学家鉴定的肿瘤材料中测序为阴性，则显示该突变不存在。如果测序产生阳性结果，则证明突变的存在。
问题是，在这个诊断链(Diagnosekette)的每个阶段，样品材料可能被错误鉴定、处理或分析，并由此导致假阴性结果。例如可能的是，组织病理学家将健康的正常组织鉴定为肿瘤材料，或者将太多健康的正常组织带到进一步的分析工作流程中。在此前提下，分子水平上的突变通常仅仅还难以识别或甚至不可识别。在某些情况下，由几位病理学家对样品材料的评估可以弥补这种情况。但是，这就导致处理时间增加和人工开支增加，并因而导致成本增加。此外，这并不能消除肿瘤仅含有少量肿瘤细胞或肿瘤细胞在正常组织中高度分散的额外危险，并且因此尽管经过仔细评估，分子分析仍可能产生假阴性结果。错误的分子诊断结果会有致命的后果。在最坏的情况下，可治疗或需要治疗的患者没有得到治疗或未得到适当的治疗。但另一方面还可能的是，患者得到的是不必要的治疗或在错误的时间接受治疗。
因此，本发明的目的是提供方法及其用途以及试剂盒，其允许突变或恶性疾病的有力、特别是更敏感和/或更特异性的，和成本低廉的分子诊断并且帮助区别性临床决策，并以这种方式至少部分减少或解决上述问题。
发明概述
在本发明的第一方面，该目的通过用于确定基因组DNA中的至少一个突变的方法来实现。根据本发明的方法特征在于，用基因组DNA进行突变分析，其中预先将包含的至少一部分胞嘧啶的转换为尿嘧啶或另一种具有与胞嘧啶可区分的碱基配对行为和/或分子量的碱基。
根据本发明的第二方面，该目的通过使用用于恶性疾病的诊断、预后、预测和/或随访的第一方面的方法来实现。
在本发明的第三方面中，该目的通过用于实施第一方面的方法或第二方面的用途的试剂盒来实现。
这些方面的优选变化方案将从说明书和从属权利要求得到。
定义和一般性解释
在本说明书中，引用了各种文献，以提供关于本发明的一般技术背景。在以下说明的补充中全部参考这些文件的公开内容和教导，以避免重复。
以下定义和一般性解释旨在指导和帮助本专业的读者理解、解释和实践本发明。除非另有说明，所有技术和科学术语应具有相应于本发明领域的普通技术人员通常的术语理解的那些含义。
本发明的各个方面和变化方案涉及来自分子生物学常规实践的技术和方法。这些技术和方法的合适的实验室手册对于本领域技术人员来说是容易获得的，例如，M.R.的“Molecular Cloning，A Laboratory Manual”。Green和J.Sambrook，第4版，2012，冷泉港实验室出版社；“Next-Generation Sequencing:Current Technologies andApplications”，Jianping Xu，2014，Caister Academic Press；“Next-Generation DNASequencing Informatics”，Stuart M.Brown，第2版，2015，冷泉港实验室出版社。
引物和寡核苷酸探针的设计属于分子生物学家或遗传学家的专业知识。允许用于转换(亚硫酸氢盐转换的)DNA的引物和探针的设计的合适算法是MethPrimer(Li,L.C.andDahiya,R.,Bioinformatics,2002,18,1427-31)。BiSearch(Tusnády G.E.et al.,NucleicAcids Research,2005,33,e9)是另一种合适的引物设计的算法，该算法既适用于转换的(亚硫酸氢盐转换的)又适用于基因组的、未转换的DNA。
MethBlast(Pattyn,F.et al.,BMC Bioinformatics,2006,7,496)是用于计算机转换的(亚硫酸氢盐转换的)DNA分析的搜索程序，既在甲基化状态又在未甲基化状态中。该程序主要用于寻找引物结合位点，并从而发展PCR扩增的特异性的优化。
因此，如本文所使用的，诸如“一个(ein)”或“一个(eine)”的不定冠词包括这些特征中的两个或更多个也可能存在的可能性。
DNA上的片段本文称作“基因”，其包括调控、转录和/或功能序列区域，并且因此包含用于生产生物活性RNA的基本信息。
对于基因及其核苷酸的名称的命名相应地遵循截至2015年6月30日的“人类基因组组织基因命名委员会”(HGNC)的建议。例如，用斜体拉丁大写字母(例如，EGFR，BRAF)表示基因家族(Genstamm)。在适当时，家族符号后面是一个或多个阿拉伯数字或阿拉伯数字和拉丁字母的组合以命名基因家族的家族成员(例如BRCA1，BRCA2，SHOX2)。
DNA水平上的基因的描述，即，例如核苷酸、序列变异和突变的命名，遵循截至2015年6月30日“人类基因组变异协会”(HGVS)关于序列变体描述的建议(den Dunnen,J.T.andAntonarakis,S.E.,Human Mutation,2000,15,7-12)。
本文所述的基因截至2015年6月30日通过美国国立卫生研究院的“GenBank”可公开获得(Benson D.A.et al.,Nucleic Acids Research,2013,41,D36-42)。
当在下面提到“至少95％的序列同一性”时，这包括更高的序列同一性，例如具有至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％的序列同一性。两个核酸序列的序列同一性例如可以用ClustalW算法确定(Thompson et al.,Nucleic Acids Research,1994,22,4673-4680)。
出于本发明的目的，“基因组DNA”是指至少部分形成或已经形成一个或多个细胞的基因组的DNA的任何部分。特别地，基因组DNA也可以作为无细胞DNA存在，例如从肿瘤的一个或多个细胞释放的循环DNA。因此，“基因组DNA”也包括从细胞分离并且任选纯化的DNA。
“突变”包括遗传上永久的变化，其起源于单细胞，并随后传递给子细胞。在本发明的各种变体中，“突变”包括基因突变，例如点突变、缺失、插入、重复、扩增、易位、融合或倒位。在本发明的某些变体中，突变的特征可以在于全球人群中小于等于1％的等位基因频率，并且因此不同于多态性，该多态性根据定义在世界人群中具有多于1％的等位基因频率。
因此，如本文所使用的术语，突变还包括在插入突变的意义上的病毒来源的DNA整合到基因组DNA中。对于具有整合到感染细胞的基因组中并导致插入突变能力的此类病毒的非限制性实例是Epstein-Barr病毒(EBV)、乙型肝炎病毒(HBV)、人乳头瘤病毒(HPV)、人T淋巴细胞病毒1(HTLV-1)和默克尔细胞多瘤病毒(MCPyV)。
“突变分析”相应地包括检测是否和任选在遗传中以何种形式或以何种程度存在这种变化。在本发明的各种变体中，这可以例如通过碱基序列、分子量、杂交强度或待分析的基因组DNA的片段的另一合适性质与标准值的偏差来确定。作为标准值，例如，基因组DNA的相应片段的相应性质，特别是碱基序列是合适的，该DNA没有变化，在下文中也称为野生型、野生型状态或还成为参照DNA。例如，来自相同个体的正常组织，特别是健康组织的基因组DNA适合作为野生型。例如，就体细胞突变的确定而言，这可以是优选的野生型。也可以使用参照基因组作为野生型。合适的参照基因组包括截至2015年7月16日的基因组参照序列联盟(Genome Reference Consortium)的人类基因组版本的人类版本38(Human Build 38)补丁版本2(GRCh38.p2)。例如，参照基因组可以是有关确定生殖细胞系突变和/或体细胞突变的优选野生型。在某些变体中，“突变分析”被理解为确定待分析的基因组DNA是否在碱基序列中具有与野生型DNA，特别是与某些基因或野生型DNA的某些序列的偏差。这些变体明确包括仅还包括突变分析的基因或某些序列的部分与野生型DNA的偏差，以确定突变。
“多态性”被理解为在群体内的多个由序列变异引起的基因变体的出现。多态性影响生殖细胞系，可以从一个个体遗传到另一个个体，并且在生物体的所有细胞中同样发生。根据定义，不同于序列变异或生殖细胞系突变，群体内较少的基因变异必须具有大于百分之一的发生频率(等位基因频率)。
“生殖细胞系”是产生生殖细胞(生殖的细胞、配子)的细胞系(Zellenfolge)(谱系)。从生殖细胞系分化出来的体细胞系形成身体(Soma)。因此，“生殖细胞系突变”是指在生物体的生殖细胞系的细胞中发生的突变，均等地影响生物体的所有细胞并且可以从一个个体遗传到另一个个体。相反，“体细胞突变”是指在生殖细胞系以外发生的突变，即在体细胞(体细胞)中。这种突变仅影响生物体的一部分细胞，例如肿瘤细胞。这种变异不能从一个个体遗传到另一个个体。
“频发突变”是指在某些恶性疾病中非常频繁发生的突变。如果这在这种某些恶性疾病的至少1％、至少3％或至少10％的情况下发生时，特别存在频发突变。“频发突变的基因”是指在某些恶性疾病中非常频繁地具有至少一个突变的基因。如果这在这种某些恶性疾病的至少5％、至少10％或至少20％的情况下发生时，特别存在频发突变的基因。
“CpG-二核苷酸”是一种DNA基序，其在从5′至3′的通常有效的阅读方向上具有核苷酸序列胞苷-磷酸-鸟苷。鸟苷由核碱基鸟嘌呤和糖β-D-核糖组成。胞苷由核碱基胞嘧啶和糖β-D-核糖组成。
本发明上下文中的“甲基化分析”包括从某些序列背景确定一个CpG-二核苷酸或多个CpG-二核苷酸的甲基化状态。在本发明的各种变体中，“甲基化分析”是指在胞嘧啶中或在CpG-二核苷酸中是否存在胞嘧啶甲基化。甲基化分析可以包含CpG-二核苷酸的单拷贝。例如，当基因组DNA中含有多个细胞的DNA时，甲基化分析还可以包括多个CpG-二核苷酸的拷贝。在这种情况下，甲基化分析可以提供甲基化状态或CpG-二核苷酸的甲基化值，即，包括CpG-二核苷酸的多个拷贝的甲基化状态的横截面值(Querschnittswert)。
CpG-二核苷酸可以在组织或细胞类型中是“异常甲基化”的或具有“异常甲基化状态”，其中此处CpG-二核苷酸意味着，与标准值相比基因组DNA中存在过甲基化或低甲基化。例如在相同的组织或细胞类型的基因组DNA中相应的CpG-二核苷酸的甲基化状态可以用作标准值，其中该相同的组织或细胞类型在性质上不同，根据该性质CpG-二核苷酸是“异常甲基化”。例如，在肿瘤细胞中比在肿瘤产生自其的组织中具有更高或更低的甲基化的基因是“异常甲基化”的。当基因组DNA从肿瘤或细胞释放时，例如以循环DNA形式进入血液，维持“异常甲基化状态”。以相同细胞类型或相同组织类型进行甲基化分析的方式，但该类型不具有根据其的确定至少一个CpG-二核苷酸应为“异常甲基化”的性质，因此例如可以通过实验确定合适的标准值。因此，相对于标准值，更高或更低的甲基化可以显示过甲基化和低甲基化。过甲基化的CpG-二核苷酸显示高于标准值的甲基化值，特别是高于标准值至少25％。低甲基化的CpG-二核苷酸显示低于标准值的甲基化值，特别是比标准值低至少25％。如果某些CpG-二核苷酸的标准值是零，则某些CpG-二核苷酸不是低甲基化的。
恶性(Maligne或)疾病包括以逐渐破坏性并且还可能导致患者死亡的疾病过程为特征的疾病。恶性疾病包括恶性组织再生，例如肿瘤(Neoplasie或Tumor)()()，其中其可以以不受控制的、需求空间的、排挤性的、浸润性的和/或侵袭性生长为特征。恶性肿瘤通常能够形成继发性生长(转移)。恶性肿瘤例如是癌、肉瘤、黑素瘤、母细胞瘤和畸胎瘤。恶性疾病还包括血液恶性疾病，即影响血液系统或造血系统的恶性疾病，如白血病、淋巴瘤、骨髓增生性疾病和骨髓增生异常综合征。白血病包括一组恶性疾病，其中未成熟的造血细胞发生恶性变化、过度增殖并导致在外周血中细胞积聚。淋巴瘤包括淋巴系统细胞退化的疾病。骨髓增生性疾病包括一组疾病，其中一种或多种造血细胞系大量增殖。骨髓增生异常综合征包括所有造血细胞系的前体细胞的克隆扩增，造血干细胞是慢性分化障碍的基础。
生物标志物是特征性指标或生物学特征，其可以客观地测量并允许关于生物体中正常生物学或患病过程的状态，或者关于正常或患病过程对干预(例如外科手术、辐射、或药物治疗)的应答的推断。生物标志物通常是(生物)化学物质，如蛋白质、激素、代谢物、糖和核酸以及其修饰物。
因此，如本文所用的术语，“诊断”包括恶性疾病的查明或确定，“预后”包含关于未来恶性疾病发展的表述，特别是在没有治疗措施的情况下，“预测”包含恶性疾病对某些治疗的相应行为的预测，以及“随访”包含在不同的时间，例如在治疗之前、期间和之后，查明恶性疾病的状况。特别地，这些术语是指与之前的体外方法相关的演绎步骤，因此在人体或动物体上不会发生本发明所必需的技术步骤。
不仅前面的一般性描述而且下面的详细描述都被认为是示例性的，并且旨在说明要求保护的发明。从下面的描述、附图和权利要求中，本发明的其它优点和特征是显而易见的。虽然本发明根据其优选实施方式进行阐述，但是在不脱离本发明的范围的情况下可以做出许多其它变化方案。因此设计为，即使没有在权利要求中明确列举，所附专利权利要求覆盖包括在本发明的真正范围内的特征的变化和组合。
附图说明
图1示出了具有来自正常组织(A)和来自恶性组织(B)的未转换的基因组DNA的BRAF基因的序列的参考分析的结果，以及根据本发明具有来自正常组织(C)和恶性组织(D)的转换的基因组DNA的BRAF基因的序列的分析的结果。
图2示出了黑素瘤患者的血浆中由SHOX2的甲基化分析和BRAF的突变分析组成的组合的结果。左：BRAF DNA序列上的总拷贝数的实时PCR(实线)和甲基化SHOX2的DNA序列上的拷贝数(虚线)的结果。右：在实时PCR定量过程中产生的BRAF PCR扩增片段的测序。A：在原发性肿瘤中具有较低肿瘤负荷和BRAF野生型的患者。B：在原发性肿瘤中具有较低肿瘤负荷和BRAF V600E突变的患者。C：在原发性肿瘤中具有高肿瘤负荷和BRAF野生型的患者。D：在原发性肿瘤中具有高肿瘤负荷和BRAF V600E突变的患者。
图3示出了具有L858R突变的EGFR基因座(外显子21)的测序结果。A：健康的、与肿瘤相邻的组织的未转换的基因组DNA的参考分析。B：肿瘤组织的未转换的基因组DNA的参考分析。C：根据本发明的健康组织的转换的基因组DNA的分析。D：根据本发明的肿瘤组织的转换的基因组DNA的分析。
图4示出了具有缺失的EGFR基因座(外显子19)的测序结果。A：健康的、与肿瘤相邻的组织的未转换的基因组DNA的参考分析。B：肿瘤组织的未转换的基因组DNA的参考分析。C：根据本发明的健康组织的转换的基因组DNA的分析。D：根据本发明的肿瘤组织的转换的基因组DNA的分析。
图5示出了图4D的PCR产物的两个等位基因的克隆测序结果。A：带有突变的肿瘤的转换的基因组DNA的野生型等位基因。B：具有15个碱基缺失的带有突变的肿瘤的转换的基因组DNA的突变等位基因。
图6示出了KRAS基因座(外显子4)的测序结果。A：健康的、与肿瘤相邻的组织的未转换的基因组DNA的参考分析。正向链的测序。B：肿瘤组织的未转换的基因组DNA的参考分析。正向链的测序。C：根据本发明的健康组织的转换的基因组DNA的分析。亚硫酸氢盐-I链的正向测序。D：根据本发明的肿瘤组织的转换的基因组DNA的分析。亚硫酸氢盐-I链的正向测序。E：如A，但为反向链的测序。F：如B，但为反向链的测序。G：根据本发明的健康组织的转换的基因组DNA的分析。亚硫酸氢盐-II链的反向测序。H：根据本发明的肿瘤组织的转换的基因组DNA的分析。亚硫酸氢盐-II链的反向测序。
序列的简述
SEQ ID NO：1用于扩增未转换的(SEQ ID NO：3)和转换的(SEQ ID NO：4)BRAFV600E基因座的正向引物。
SEQ ID NO：2用于扩增未转换的(SEQ ID NO：3)和转换的(SEQ ID NO：4)BRAFV600E基因座的反向引物。
SEQ ID NO：3BRAF基因座，其包含V600E突变的位置。
SEQ ID NO：4转换的BRAF基因座(亚硫酸氢盐-II链)，其包含V600E突变的位置。
SEQ ID NO：5qPCR检测探针，该探针靶向亚硫酸氢盐转换的BRAF基因座(SEQ IDNO：4)，该基因座包含V600E突变。
SEQ ID NO：6SHOX2基因座，其在甲基化分析的范围内检查。
SEQ ID NO：7用于扩增转换的SHOX2基因座(SEQ ID NO：10)的正向引物。
SEQ ID NO：8用于扩增转换的SHOX2基因座(SEQ ID NO：10)的反向引物。
SEQ ID NO：9用于当SHOX2基因座未甲基化时阻止正向引物(SEQ ID NO：7)结合到该转换的SHOX2基因座(SEQ ID NO：10)上的阻断剂寡核苷酸。
SEQ ID NO：10来源于基因组序列SEQ ID NO：6的转换的(亚硫酸氢盐-I链)SHOX2基因座。
SEQ ID NO：11qPCR检测探针，其靶向转换的甲基化SHOX2基因座(SEQ ID NO：10)。
SEQ ID NO：12用于转换的BRAF基因座(SEQ ID NO：4)的Sanger测序的测序引物。
SEQ ID NO：13用于扩增未转换的EGFR外显子21基因座(SEQ ID NO：15)的正向引物，该基因座包含L858R突变。
SEQ ID NO：14用于扩增未转换的EGFR外显子21基因座(SEQ ID NO：15)的反向引物，该基因座包含L858R突变。
SEQ ID NO：15未转换的EGFR外显子21基因座，其包含L858R突变。
SEQ ID NO：16用于扩增包含L858R突变的转换的EGFR外显子21基因座(SEQ IDNO：18)的正向引物。
SEQ ID NO：17用于扩增包含L858R突变的转换的EGFR外显子21基因座(SEQ IDNO：18)的反向引物。
SEQ ID NO：18转换的源自SEQ ID NO：15的EGFR外显子21基因座(亚硫酸氢盐-I链)，其包含L858R突变。
SEQ ID NO：19用于扩增未转换的EGFR外显子19基因座(SEQ ID NO：21)的正向引物。
SEQ ID NO：20用于扩增未转换的EGFR外显子19基因座(SEQ ID NO：21)的反向引物。
SEQ ID NO：21未转换的EGFR外显子19基因座。
SEQ ID NO：22用于扩增转换的EGFR外显子19基因座(SEQ ID NO：24)的正向引物。
SEQ ID NO：23用于扩增转换的EGFR外显子19基因座(SEQ ID NO：24)的反向引物。
SEQ ID NO：24转换的来自SEQ ID NO：21的EGFR外显子19基因座(亚硫酸氢盐-I链)。
SEQ ID NO：25用于扩增未转换的KRAS外显子4基因座(SEQ ID NO：27)的正向引物。
SEQ ID NO：26用于扩增未转换的KRAS外显子4基因座(SEQ ID NO：27)的反向引物。
SEQ ID NO：27未转换的KRAS外显子4基因座。
SEQ ID NO：28转换的来自SEQ ID NO：27的KRAS外显子4基因座(亚硫酸氢盐-I链)。
SEQ ID NO：29用于扩增转换的KRAS外显子4基因座(SEQ ID NO：28)的正向引物。
SEQ ID NO：30用于扩增转换的KRAS外显子4基因座(SEQ ID NO：28)的反向引物。
SEQ ID NO：31转换的来自SEQ ID NO：27的KRAS外显子4基因座(亚硫酸氢盐-II链)。
SEQ ID NO：32用于扩增转换的KRAS外显子4基因座(SEQ ID NO：31)的正向引物。
SEQ ID NO：33用于扩增转换的KRAS外显子4基因座(SEQ ID NO：31)的反向引物。
SEQ ID NO：34BRCA2，“感兴趣的区域”(ROI)1。
SEQ ID NO：35BRCA2，ROI 2。
SEQ ID NO：36BRCA2，ROI 3。
SEQ ID NO：37BRCA2，ROI 4。
SEQ ID NO：38BRCA2，ROI 5
SEQ ID NO：39BRCA2，ROI 6，优选用于甲基化分析。
SEQ ID NO：40BRCA2，ROI 7。
SEQ ID NO：41BRCA2，ROI 8。
SEQ ID NO：42BRCA2，ROI 9。
SEQ ID NO：43BRCA2，ROI 10。
SEQ ID NO：44BRCA2，ROI 11。
SEQ ID NO：45BRCA2，ROI12。
SEQ ID NO：46BRCA1，“感兴趣的区域”(ROI)1。
SEQ ID NO：47BRCA1，ROI 2。
SEQ ID NO：48BRCA1，ROI 3。
SEQ ID NO：49BRCA1，ROI 4。
SEQ ID NO：50BRCA1，ROI 5。
SEQ ID NO：51BRCA1，ROI 6。
SEQ ID NO：52BRCA1，ROI 7。
SEQ ID NO：53BRCA1，ROI 8。
SEQ ID NO：54BRCA1，ROI 9。
SEQ ID NO：55BRCA1，ROI 10。
SEQ ID NO：56BRCA1，ROI 11，优选用于突变分析。
SEQ ID NO：57BRCA1，ROI 12。
SEQ ID NO：58BRCA1，ROI 13。
SEQ ID NO：59BRCA1，ROI 14。
SEQ ID NO：60BRCA1，ROI 15。
SEQ ID NO：61BRCA1，ROI 16，优选用于甲基化分析。
SEQ ID NO：62BRCA1，ROI 17。
SEQ ID NO：63BRCA1，ROI 18。
SEQ ID NO：64EGFR，“感兴趣的区域”(ROI)1，外显子19。
SEQ ID NO：65EGFR，ROI 2，外显子21。
SEQ ID NO：66EGFR，ROI 3，外显子20。
SEQ ID NO：67EGFR，ROI 4，外显子18。
SEQ ID NO：68KRAS，“感兴趣的区域”(ROI)1，外显子2。
SEQ ID NO：69KRAS，ROI 2，外显子3。
SEQ ID NO：70KRAS，ROI 3，外显子4。
SEQ ID NO：71BRAF，“感兴趣的区域”(ROI)1，外显子15。
SEQ ID NO：72BRAF，ROI 2，外显子11。
SEQ ID NO：73AKT1，“感兴趣的区域”(ROI)1。
SEQ ID NO：74DDR2，“感兴趣的区域”(ROI)1，外显子19。
SEQ ID NO：75DDR2，ROI 2，外显子18。
SEQ ID NO：76DDR2，ROI 3，外显子16和17。
SEQ ID NO：77ERBB2(HER2)，“感兴趣的区域”(ROI)1。
SEQ ID NO：78MAP2K1(MEK1)，“感兴趣的区域”(ROI)1。
SEQ ID NO：79NRAS，“感兴趣的区域”(ROI)1，密码子61。
SEQ ID NO：80NRAS，ROI 2，密码子12。
SEQ ID NO：81PIK3CA，“感兴趣的区域”(ROI)1，外显子9。
SEQ ID NO：82PIK3CA，ROI 2，外显子20。
SEQ ID NO：83PTEN，“感兴趣的区域”(ROI)1，外显子7。
SEQ ID NO：84IDH1，“感兴趣的区域”(ROI)1。
SEQ ID NO：85IDH2，“感兴趣的区域”(ROI)1。
SEQ ID NO：86适用于BRCA1甲基化分析的正向引物(F1)。
SEQ ID NO：87适用于BRCA1甲基化分析的反向引物(R1)。
SEQ ID NO：88适合于BRCA1甲基化分析的正向引物(F2)。
SEQ ID NO：89适用于BRCA1甲基化分析的反向引物(R2)。
SEQ ID NO：90PITX2，“感兴趣的区域”(ROI)1，启动子A，优选用于甲基化分析。
SEQ ID NO：91PITX2，ROI 2，启动子C，优选用于甲基化分析。
SEQ ID NO：92MGMT，“感兴趣的区域”(ROI)1，优选用于甲基化分析。
SEQ ID NO：93SEPT9，“感兴趣的区域”(ROI)1，优选用于甲基化分析。
SEQ ID NO：94TP53“感兴趣的区域”(ROI)1。
发明详述
本发明的第一方面涉及用于确定基因组DNA中至少一个突变的方法。该方法包括以下步骤：A)将基因组DNA中包含的至少一部分胞嘧啶转换为尿嘧啶或另一种具有与胞嘧啶可区分的碱基配对行为和/或分子量的碱基，B)用从步骤A)获得的基因组DNA进行突变分析，以确定所述至少一个突变。从步骤A)获得的基因组DNA在下文中也称为“转换的DNA(umgewandelte DNA)或“转换的DNA(konvertierte DNA)”。因此，“未转换的DNA”是指未经历过步骤A)的此种基因组DNA。
本发明特别根据发明人的发现：许多临床相关样品，例如活组织检查、细针吸出物、激光显微切割的细胞、血浆或游离循环肿瘤细胞仅含有非常少量的基因组DNA，但同时在临床常规中，对于患者的个性化和优化的治疗越来越需要更多数量的遗传参数。在血浆中，例如，每毫升血浆通常只有几百到几千个游离循环DNA的DNA拷贝。循环肿瘤细胞甚至仅以每10毫升全血几个单细胞至几十个肿瘤细胞数量级的形式出现。在激光显微切割细胞的情况下，DNA的量取决于显微切割细胞的数量，并且可以从具有两个DNA拷贝的单个细胞到超过1000个细胞。通常用福尔马林固定的和石蜡包埋的样品进行激光显微切割，该样品中的大部分DNA被降解，因此不能用于分子诊断方法。在这里问题是，在通过常规分子诊断方法后基因组DNA通常不能保持不变或根本不能恢复。因此，进一步的分子诊断方法或分子诊断方法的重复是不可能的。
对于进一步的分子诊断方法的实例是甲基化分析，其中首先必须转换基因组DNA，例如通过亚硫酸氢盐处理。此时未甲基化的胞嘧啶例如转换为尿嘧啶，而甲基化的胞嘧啶(甲基胞嘧啶，meC)保持不变。尿嘧啶具有与胸腺嘧啶相同的碱基配对性质。因此在随后扩增转换的基因组DNA的情况下，两者不能再相互区分。因此有一个C到U的转换，由于T和U的相同的碱基配对行为，它的行为就像一个C到T的转换。因此胞嘧啶的转换大大降低了DNA的序列复杂性，并因此通常导致遗传信息的显著丢失。出于这个原因，分子医学医生直到现在还被迫确切地在小样品和最小样品中决定进行哪种分析，如突变分析或甲基化分析。
尽管为了甲基化分析的目的，基因组DNA的转换自大约四分之一个世纪就已知(Frommer,M.et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,1992,89,1827-1831)，但本领域技术人员长期以来没有证明在转换的DNA中对突变的分析也是可能的。与主流观点相符，即通过基因组DNA转换，遗传信息的损失使得突变的鉴定变得困难直至不可能，特别是当胞嘧啶受突变影响时。
在本发明的范围内已经克服了这种在本领域中普遍的观点。它首次显示，转换的DNA中的突变分析是可能的。本发明的认识实现了各种意想不到的优点。例如，根据本发明的转换DNA中的突变分析首次允许突变分析与相同样品内的进一步分析如甲基化分析的直接组合。以这种方式，可以大量地进行多重和平行分析各种临床相关的遗传和表观遗传学参数。这不仅可以实现更加成本低廉的疾病分子诊断，而且同时还使在较短的分析时间内的区别性临床决策成为可能。令人惊讶的是，还发现甚至可以比用未转换的基因组DNA的常规突变分析更好地分析某些突变。就此而言，也参考以下实施例。
基因组DNA可以来自多种来源，例如来自手术或活检获得的组织的细胞。细胞也可以来自涂片和来自抽吸物，例如灌注液、细针抽吸物或痰。
基因组DNA也可以来自血液、血清和血浆，例如以游离循环DNA、外来体DNA的形式，或以从其获得基因组DNA的游离循环细胞的形式。基因组DNA还可以来自其它体液，例如尿液、胸腔积液或腹水，例如以游离DNA的形式或以从其获得基因组DNA的细胞的形式。DNA还可以从非保存的(新鲜的)细胞、组织和体液，以及从固定的细胞、组织和体液获得。细胞、组织和体液的固定可以通过沉淀固定剂如乙醇和其它醇或通过交联固定剂如甲醛来实现。基因组DNA也可以来自这些来源的任意组合。也可从上述来源提取DNA。也可以富集基因组DNA，例如通过沉淀或提取。这可出现在例如来自所述体液的游离循环基因组DNA的情况下。也可以富集细胞，例如，通过尺寸过滤或表面结合的抗体(例如，在磁性珠、膜或聚合物上)，其抗原位于富集细胞的表面上，例如抗-EpCAM抗体。这可出现在例如来自所述体液的游离循环细胞的情况下。例如，在WO2010/145824A1中描述了用于从患者的血液中富集游离循环细胞的合适装置，参考其全部以补充本发明的技术背景。相应的商业上可获得的装置例如是CellCollector检测器CANCER01(DC01)和检测器CANCER02(DC02)(两者均获自GILUPI GmbH，Potsdam，Germany)。基因组DNA的其它合适来源是新鲜组织的裂解物或匀浆物以及固定组织的裂解物。
步骤A)中基因组DNA转换原则上可以用现有技术中用于此目的的所有已知和合适的方法进行。典型地是一种化学或酶促转换，例如通过使基因组DNA与亚硫酸氢盐(例如亚硫酸氢钠或亚硫酸氢铵)或与胞苷脱氨酶接触。
如果需要，可以在步骤A)中的转换之后且在步骤B)中的突变分析之前，进行从步骤A)获得的基因组DNA的纯化。合适的纯化方法和方案对本领域技术人员而言是已知的，并且例如可以包括DNA提取、沉淀或聚合物负载的富集(聚合物介导的富集)。
步骤B)中的突变分析类型没有特别的限制。根据本公开，本领域技术人员可以容易地确定合适的方法。就此而言，也参考了上述实验室手册。在优选变化方案中，首先用寡核苷酸(所谓的引物)进行聚合酶链反应(PCR)，其设计成用于扩增怀疑其含有突变的转换的基因组DNA片段。随后优选进行扩增子的至少一部分的测序，例如Sanger测序、焦磷酸测序、质谱测序或第二代或第三代测序，其也称为“大规模平行测序”、“下一代测序”(NGS)或纳米孔测序。也可以在PCR之后用突变特异性寡核苷酸(探针)进行杂交，例如以DNA微阵列的形式。也可以通过定量实时PCR(qPCR)，任选地进行解链曲线分析来确定突变。突变也可以通过修饰的根据PCR的方法如ARMES(扩增折射突变系统)来确定。
在另一优选的变化方案中，例如在“全基因组鸟枪亚硫酸氢盐测序”(WGSBS)或直接纳米孔测序的情况下，可以省略PCR。在WGSBS中，将DNA片段化，然后将衔接子连接到DNA片段上。随后通过衔接子的扩增和测序是可能的。也可以在WGSBS中省略片段化步骤，因为例如通过亚硫酸氢盐处理的转换，DNA可能已经存在片段化。用于实施WGSBS的方案对于本领域技术人员是容易获得的(Johnson,M.D.et al.,Curr.Protoc.Mol.Biol.,2012,99,21.23.1-21.23.28；Lister,R.et al.,Nature,2009,462,315-322；Berman,B.P.et al.,Nat.Genet.,2011,44,40-46)。
在纳米孔测序中，DNA分子穿过孔。在穿过时核苷酸发出可测量的电信号，这对处于纳米孔中核苷酸是特征性的，并且可以以这种方式分配给它们。
在另一优选的变化方案中，可以在PCR扩增之前进行与特定寡核苷酸(探针)的杂交，其在结合的情况下连接并随后通过PCR扩增。例如“多重连接依赖性探针扩增”(MLPA)的合适的方法和方案对于本领域技术人员的使用是没有问题的，例如由B.D.M.Theophilus和R.Rapley所著的“PCR Mutation Detection Protocols”，第二版，2011，Springer。
在另一优选的变化方案中，通过定量实时PCR进行突变分析。然后可以通过将处理的基因组DNA的确定性质，即例如核苷酸序列、分子量或杂交强度与标准值进行比较来确定突变。例如，野生型DNA的相应性质适于作为标准值。任选地，在此还可以考虑如步骤A)中野生型DNA的相应转换，例如通过合适的生物信息学方法或以野生型DNA的方式同样进行本发明的方法，例如作为参照样品。
该突变基本上可以包含生殖系突变或体细胞突变或还包含其组合。在该方法的优选变化方案中，突变包含体细胞突变。虽然生殖系突变基本上可以在生物体的所有细胞中检测到，但是体细胞突变通常仅在某些组织的细胞中可检测到，例如肿瘤的肿瘤细胞。本发明的令人惊讶的优点还在于，通过本发明的方法可以以高特异性和灵敏性检测生物体中的此种具有较低丰度的突变。
在优选的变化方案中，突变分析包括基因组DNA中包含的基因中的至少一个或多个部分。可选地或额外地，突变分析还可以包括分别在基因组DNA中包含的两个或更多个基因的至少一个或多个部分。
在优选的变化方案中，突变分析包括基因的至少一部分或多个部分，该基因选自由BRAF、EGFR、KRAS、NRAS、BRCA1、BRCA2、AKT1、VGFR、IDH1、IDH2、CRLF2、TSC1、PDGFRA、NF1、GNAQ、GNA11、CTNNB1、ASXL1、BCOR、DNMT3A、ETV6、EZH2、SF3B1、SRSF2、STAG2、TET2、TP53、U2AF1、ZRSR2、HRAS、TERT(hTERT)、SMO、FLT3、JAK2、ESR1、BCR、SMAD4、DNMT3A、AR、ERBB2(HER2)、MAP2K1(MEK1)、PIK3CA、PTEN、PALB2、DDR2、及其任意组合组成的组。
在另一优选的变化方案中，为此将突变分析设计为确定基因的至少一部分或多个部分的融合、易位和/或倒位，该基因选自NTRK1(TRKA)、RET、DEK-NUP214、MLL-MLLT3、CBFB-MYH11、RPN1-EVI1、RUNX1-RUNX1T1、PML-RARA、RBM15-MKL、KIT、ALK、ROS1、及其任意组合组成的组。
在另一优选的变化方案中，为此将突变分析设计为确定基因的至少一部分或多个部分的扩增，该基因选自FGFR1、MET、ERBB2(HER2)、FGFR1、FGFR2、BCR-ABL1、RET、MEK、mTOR和VEGFR、及其任意组合组成的组。
在优选的变化方案中，突变分析包括BRAF基因的至少一部分或多个部分。特别地，为此将突变分析设计为确定序列的至少一部分中的突变，其在野生型状态中与SEQ ID NO：71和/或SEQ ID NO：72具有至少95％的序列同一性。在特别优选的变化方案中，突变分析包括BRAF突变c.1799T>A(V600E)。例如，在BRAF基因内具有点突变V600E的肿瘤对用威罗菲尼的治疗反应特别好。突变分析也可以包括这些变化方案的任何组合。
在另一优选的变化方案中，突变分析包含EGFR基因的至少一部分或多个部分。特别地，为此将突变分析设计为确定序列的至少一部分中的突变，其在野生型状态中与SEQID NO：64、SEQ ID NO：65、SEQ ID NO：66或SEQ ID NO：67、及其组合具有至少95％的序列同一性。
在另一优选的变化方案中，突变分析包含KRAS基因的至少一部分或多个部分。特别地，为此将突变分析设计为确定序列的至少一部分中的突变，其在野生型状态中与SEQID NO：68、SEQ ID NO：69或SEQ ID NO：70、及其组合具有至少95％的序列同一性。
在另一优选的变化方案中，突变分析包含NRAS基因的至少一部分或多个部分。特别地，为此将突变分析设计为确定序列的至少一部分中的突变，其在野生型状态中与SEQID NO：79或SEQ ID NO：80、及其组合具有至少95％的序列同一性。
为此优选地将ERBB2(HER2)的突变分析设计为确定序列的至少一部分中的突变，其在野生型状态中与SEQ ID NO：77具有至少95％的序列同一性。为此优选地将MAP2K1(MEK1)的突变分析设计为确定序列的至少一部分中的突变，其在野生型状态中与SEQ IDNO：78具有至少95％的序列同一性。为此优选地将PIK3CA的突变分析设计为确定序列的至少一部分中的突变，其在野生型状态中与SEQ ID NO：81或SEQ ID NO：82、及其组合具有至少95％的序列同一性。为此优选地将PTEN的突变分析设计为确定序列的至少一部分中的突变，其在野生型状态中与SEQ ID NO：83具有至少95％的序列同一性。为此优选地将DDR2的突变分析设计为确定序列的至少一部分中的突变，其在野生型状态中与SEQ ID NO：74、SEQID NO：75或SEQ ID NO：76、及其组合具有至少95％的序列同一性。为此优选地将AKT1的突变分析设计为确定序列的至少一部分中的突变，其在野生型状态中与SEQ ID NO：73具有至少95％的序列同一性。
在另一变化方案中，为此将突变分析设计为确定整合到基因组DNA中的病毒DNA，特别是一个或多个人类乳头状瘤病毒(HPV)的DNA的至少一部分或多个部分。特别优选地，为此将突变分析设计为确定基因组DNA中一个或多个人类乳头状瘤病毒亚型HPV 16、18、31、33、35、39、45、51、52、56、58、59、68、73和/或82中的DNA的至少一部分或多个部分。
在另一变化方案中，为此将突变分析设计为确定与重复DNA序列有关的扩增和/或缺失。特别可以确定短串联重复序列(STR)的扩增和缺失。特别地这使微卫星不稳性的确定成为可能(MSI)。微卫星不稳性表明细胞中有缺陷的DNA修复系统，因此预示对DNA损伤性化学疗法的反应。
在优选的变化方案中，基因组DNA包括游离循环DNA、来自外来体的DNA和/或来自体液游离循环细胞的DNA，所谓的液体活检或“液体活检”。液体活检目前代表肿瘤学研究的一个主要领域。此时，不分析可疑组织本身，例如，肿瘤组织，而是分析体液样品，例如血液样品。在该样品中可以检测来自肿瘤的各种物质，因为游离循环的基因组DNA、外来体DNA或游离循环的细胞从肿瘤释放到血管中。如果不能对肿瘤或转移进行活组织检查，或者如果活检会对肿瘤晚期患者造成过高的风险，则根据本发明的方法有利地用于液体活组织检查的分析。
用根据本发明的方法分析游离循环基因组DNA中或游离循环细胞中的突变是可能的。特别是，在健康来源的游离循环基因组DNA的背景下也可以检测到很少的携带突变的DNA分子。例如可能的是，基因组DNA，特别是转换后的基因组DNA包含较大比例健康来源的DNA(野生型DNA)和较少比例包含至少一个突变的基因组DNA。然而，在本发明的范围内已经认识到，当使用常规方法时，这可能导致在确定突变时有关灵敏性的问题。例如，如果对具有恶性疾病的患者用游离循环DNA样品进行常规突变分析，并且检测到游离循环DNA中的突变为阴性，则这可能有两个原因。恶性疾病实际上不携带这种突变，或者患者的血液中或样品中恶性疾病的DNA太少或完全没有DNA。因此在后一种情况下检测是假阴性的。
因此，本发明的另一个目的在于通过减少假阴性结果的数量来提高突变分析的灵敏性。根据本发明，该目的如此实现，特别优选的方法的变化方案还包括：C)用从步骤A)获得的基因组DNA进行甲基化分析，以确定至少一种基因组DNA中包含的CpG-二核苷酸的甲基化状态。
DNA甲基化是恶性疾病例如肿瘤的发生和发展的重要过程。这种甲基化主要发生在CpG-二核苷酸序列环境中的胞嘧啶上。在恶性疾病例如肿瘤中许多基因是过甲基化的，这意味着，这些基因含有CpG-二核苷酸，其比肿瘤产生自其的相应正常组织更频繁地甲基化。因此CpG-二核苷酸的甲基化状态非常适合于确定恶性疾病的包含在基因组DNA中的DNA。由此可以根据CpG-二核苷酸的甲基化状态将恶性疾病的DNA与健康来源的基因组DNA区分开。
以此方式，首次在单一分析中用根据本发明的方法可以建立突变分析和甲基化分析之间的功能关系，例如以标准化或内部标准化的形式。例如可以根据CpG-二核苷酸的甲基化状态确定基因组DNA中恶性疾病DNA的存在或不存在，并与突变的存在或不存在相关联。例如可以通过检测异常甲基化的CpG-二核苷酸显示基因组DNA中包含恶性疾病的DNA，并且同时可以显示没有突变，则证明恶性疾病不携带突变，并且可以开始适当的治疗。另一方面，如果甲基化分析显示没有恶性疾病的DNA存在，则也不能相应地检测到突变。因此，仍不排除肿瘤携带突变。需要补充分析以找到最合适的治疗方法。
突变分析和甲基化分析的这种协同相互作用实现了比常规突变分析显著的改善。例如与常规突变分析相比，在反应中进行根据本发明突变分析和甲基化分析导致例如测量准确性的显著提高并因此导致方法的分析性能的显著提高。分子诊断测试方法的测量准确性可以取决于许多参数。诊断测试方法的质量特征例如是在中间条件下的精度和鲁棒性。中间条件下的精度包括在不同时间使用测试方法时，由不同用户使用不同测试仪器和不同试剂批次，但在同一实验室在使用相同样品和相同测量方法时产生的变异性。分析方法的鲁棒性表明分析方法在多大程度上不受工艺参数的小的、有意的变化的影响，并表明在正常使用条件下它是多么可靠。通过在反应中进行根据本发明的突变分析和甲基化分析，中间条件下的精度和鲁棒性显著改善，因为测量方法内的差异和变化由两个分析的内部相关性补偿并归一化或标准化。例如，可以有效地避免假阴性诊断，这最终实现灵敏性的提高以及为了患者的健康更好和更有效地使用治疗可能性。当然，这些好处不仅影响液体活检，还影响其它基因组DNA来源。例如，由于在分析工作流程中高比例的健康正常组织，由于在恶性疾病中低比例的肿瘤细胞或者由于在正常组织中细胞的强烈扩散，导致误诊的风险大大降低。
在另一优选的变化方案中，甲基化分析包括测定基因组DNA中包含的基因内的两个或更多个CpG-二核苷酸的甲基化状态。可选地或额外地，甲基化分析还可以包括在两个或更多个在基因组DNA包含的基因中的至少每个CpG-二核苷酸。以这种方式，本发明解决了CpG-二核苷酸可能存在于恶性疾病的DNA中，有时异质性甲基化的问题，从而实现恶性疾病DNA的有力检测。因此避免了假阴性和假阳性的诊断，进一步改善了诊断过程的特异性和灵敏性。
甲基化分析可以包括基因的至少一部分，其选自由SHOX2、SEPT9、BRCA1、LIMK1、APC、VIM、RASSF2、RASSF1、GSTP1、FOXL2、CDKN2A(p16蛋白)、RARB、及其任意组合组成的组。这些基因内的CpG-二核苷酸的甲基化状态已被确定为特别可靠的，以检测基因组DNA内恶性疾病DNA的存在或不存在。在优选的变化方案中，甲基化分析包含SEPT9的至少一部分。为此特别地，将甲基化分析设计为确定序列的一个或多个CpG-二核苷酸的甲基化状态，其在野生型、未转换的状态中与SEQ ID NO：93具有至少95％的序列同一性。在另一优选的变化方案中，甲基化分析包含SHOX2的至少一部分。为此特别地，将甲基化分析设计为确定序列的一个或多个CpG-二核苷酸的甲基化状态，其在野生型状态中与SEQ ID NO：6具有至少95％的序列同一性。
甲基化分析可以进一步包括基因至少一部分，为了此目的其在WO 2009/036922A2和/或US 2012/0101023 A1中描述。突变分析还可以包括基因至少一部分，其在US2014/0303001A1中公开。特别优选地，甲基化分析包括来自TWIST1、ONECUT2和OTX1组的至少一个基因的至少一部分和/或突变分析包括来自FGFR3，TERT，KRAS，NRAS和PIK3CA组的至少一个基因的至少一部分。在该组合中，设计该方法用于根据以下第二发明方面检测膀胱癌疾病的存在和/或复发。有利地，用基因组DNA进行膀胱癌的检测，其包含来自尿液的游离DNA和/或来自尿沉淀物的细胞的基因组DNA。
在另一实施方案中，甲基化分析包括SEPT9基因的至少一部分，突变分析包括TP53基因的至少一部分。在特别多的恶性疾病中SEPT9异常甲基化，并且进一步地在健康患者的血浆中在游离循环的DNA中经常未甲基化。因此，该基因的甲基化分析特别适于检测血液中的恶性疾病。TP53在各种恶性疾病中反复发生突变。由TP53编码的蛋白质相对小，具有393个氨基酸。393个氨基酸由1179个碱基编码，优选分析的突变位于其中。突变的86％位于氨基酸125和300内。此外，因此特别地将TP53的突变分析设计为确定序列的至少一部分，其在未转换、野生型的状态中与SEQ ID NO：94具有至少95％的序列同一性。特别地参考以下第二发明方面，设计TP53的突变分析和SEPT9的甲基化分析用于肠癌、头颈部肿瘤、肺癌、黑色素瘤和卵巢癌和食管癌的诊断。
在另一变化方案中，突变分析包括TP53基因的至少一部分和确定病毒DNA的插入，特别是一个或多个人类乳头状瘤病毒(HPV)的DNA的至少一个或多个部分，特别是结合对SEPT9的至少一部分的甲基化分析。例如，对于头颈部肿瘤，吸烟以及HPV病毒的插入是最常见的原因。通过插入HPV诱导的头颈部肿瘤通常不携带TP53突变。因此，在该方法的优选变化方案中用插入HPV的分析进行TP53突变分析，因为发明人已经认识到，通过要么一种或要么另一种突变的存在检测肿瘤的大部分。在头颈部肿瘤中SEPT9特别频繁地异常甲基化。因此，特别优选地进行将SEPT9的甲基化分析与TP53的突变分析和/或插入HPV的突变分析的组合，因为以这种方式能以非常高的精度检测这种疾病。
在该方法的优选变化方案中，在允许定量测定至少一种突变的条件下进行步骤B)中的突变分析。可选地或额外地，也可在允许定量测定至少一个CpG二的甲基化状态的条件下进行步骤C)中的甲基化分析。
例如可能的是，基因组DNA包含恶性疾病的至少一部分DNA，其中恶性疾病DNA具有至少一种，任选地异常甲基化的CpG-二核苷酸和/或(如果存在)至少部分地具有至少一个突变。然后，根据步骤B)中的突变分析和/或步骤C)中的甲基化分析确定基因组DNA内的恶性疾病DNA的比例。
还可能的是，将步骤B)中的突变的定量测定与步骤C)中的甲基化状态的定量测定相关联。以此种方式例如可以确定恶性疾病基因组DNA内携带突变的基因组DNA的比例。这是特别有利的，因为恶性疾病通常是异质的，并且例如不是所有的疾病细胞都携带突变。以这种方式，除了诊断方面之外，也可以获得有关恶性疾病的预后、预测或随访的有利发现。突变分析和甲基化分析的这种功能性相互作用属于本发明的独特特征(Alleinstellungsmerkmal)。此外，上面已经提到的与方法的鲁棒性和精度也有关的优点以及最小量的基因组DNA的分析也在这里起作用。
在另一变化方案中，定量测定包括分布到一个或多个基因中的几个突变和/或在一个或多个基因中的多个CpG-二核苷酸的甲基化状态。随后，可以对获得的数量进行平均(Mittlung)。为了对基因组DNA内的恶性疾病的基因组DNA的相对定量，例如可以对各个CpG-二核苷酸的定量甲基化状态进行平均，以获得特别可靠的值。还可能的是，使用这种CpG-二核苷酸用于定量，为该核苷酸确定最高的甲基化值，因为这种CpG-二核苷酸然后在恶性疾病的基因组DNA中特别强烈地甲基化，因此为其量表示了可靠的标准。以这种方式，实现了该方法的特别高的鲁棒性和精度。
如果根据步骤B)中的突变分析确定基因组DNA内的恶性疾病的基因组DNA的比例，则突变分析优选包括确定至少一个频发突变。还可能的是，根据频发突变基因的至少一个突变确定基因组DNA内的恶性疾病DNA的比例。实施例11中列出了合适的和优选的频发突变和频发突变基因。
在优选的变化方案中，所述方法包括一种或多种以下组合：包括BRAF基因的至少一部分的突变分析和包含SHOX2基因的至少一部分的甲基化分析；包括至少部分BRCA1、BRCA2和/或PALB2基因的突变分析和包括至少部分BRCA1基因的甲基化分析；包括IDH1、IDH2和/或EGFR基因的至少一部分的突变分析和包括MGMT基因的至少一部分的甲基化分析；包括TP53基因的至少一部分的突变分析和包括PITX2基因的至少一部分的甲基化分析；包括AR、ESR1、BRCA1、BRCA2、PALB2和/或ERBB2(HER2)基因的至少一部分的突变分析和包括在所述PITX2基因的至少一部分的甲基化分析；包括至少FGFR3、TERT、PIK3CA、KRAS、TP53、NRAS和/或HRAS基因的至少一部分的突变分析和包括ONECUT2、OTX1、SHOX2、SEPT9和/或TWIST1基因的至少一部分的甲基化分析；包括TP53基因的至少一部分的突变分析和/或病毒DNA的插入，特别是一个或多个人类乳头状瘤病毒(HPV)DNA的至少一个或多个部分和包括SEPT9基因的至少一部分的甲基化分析。还可能的是，用至少部分其它基因的甲基化和/或突变分析来补充这些组合。就此而言，从前面的描述和实施例以及序列表，优选的基因和序列是显而易见的。
本发明的第二方面涉及根据第一方面的方法用于恶性疾病的诊断、预后、预测和/或随访的用途。
恶性疾病特别地可以包括癌、黑素瘤、肉瘤、神经胶质瘤、淋巴瘤和/或白血病。癌例如可以包括腺癌、鳞状细胞癌、小细胞癌、神经内分泌癌、肾细胞癌、泌尿上皮癌、肝细胞癌、肛门癌、肺癌、子宫内膜癌、胆管细胞癌、肝细胞癌、睾丸癌、结肠直肠癌、头颈部的癌、食道癌、胃癌、乳腺癌、肾癌、卵巢癌、胰腺癌、前列腺癌、甲状腺癌和/或子宫颈癌。肉瘤例如可以是血管肉瘤、软骨肉瘤、尤因肉瘤、纤维肉瘤、卡波西氏肉瘤、脂肪肉瘤、平滑肌肉瘤、恶性纤维组织细胞瘤、神经源性肉瘤、骨肉瘤或横纹肌肉瘤。白血病例如可以是急性骨髓性白血病(AML)、急性淋巴细胞性白血病(ALL)、慢性淋巴细胞性白血病(CLL)或慢性骨髓性白血病(CML)是。淋巴瘤可以是霍奇金淋巴瘤和非霍奇金淋巴瘤。非霍奇金淋巴瘤可以是B细胞淋巴瘤或T细胞淋巴瘤。
在优选的用途中，该方法包括步骤A)、B)和C)，因为通过本发明的突变分析和甲基化分析的协同相互作用实现了例如诊断的灵敏性和特异性的显著改善以及更有区别性和更可靠的预后、预测和随访。就此而言，也参考下面的实施例。
在预后方法的优选用途中，使用基因的甲基化分析用作预后生物标志物。优选地，用于此目的的甲基化分析包含PITX2基因的一个或多个CpG-二核苷酸。为此特别地将它设计为确定序列的一个或多个CpG-二核苷酸的甲基化状态，其在野生型、未转换的状态中与SEQ ID NO：90和/或SEQ ID NO：91具有至少95％的序列同一性。可选地或额外地，用于此目的的甲基化分析还可以包括选自CDO1、PLAU、POU4F3、TFF1和CXCL12及其组合的基因的一个或多个CpG-二核苷酸。以这种方式，例如，可以检测恶性疾病，并同时可以对疾病的侵袭性得出结论。
在用于预测和预后的方法的优选用途中，将基因的甲基化分析用作预后性生物标志物和将基因的突变分析用作预测性生物标志物。优选地，用于此目的的甲基化分析包括PITX2基因的一个或多个CpG-二核苷酸，优选序列的一个或多个CpG-二核苷酸，其在野生型、未转换状态下与SEQ ID NO：90和/或SEQ ID NO：91具有至少95％的序列同一性。优选地，用于此目的的突变分析包括基因BRAF、EGFR、KRAS、NRAS、BRCA1、BRCA2、AKT1、VGFR、IDH1、IDH2、CRLF2、TSC1、PDGFRA、NF1、GNAQ、GNA11、CTNNB1、ASXL1、BCOR、DNMT3A、ETV6、EZH2、SF3B1、SRSF2、STAG2、TET2、TP53、U2AF1、ZRSR2、HRAS、TERT(hTERT)、SMO、FLT3、JAK2、ESR1、BCR、SMAD4、DNMT3A、AR、ERBB2(HER2)、MAP2K1(MEK1)、PIK3CA、PTEN、PALB2、DDR2、NTRK1(TRKA)、RET、DEK-NUP214、MLL-MLLT3、CBFB-MYH11、RPN1-EVI1、RUNX1-RUNX1T1、PML-RARA、RBM15-MKL、KIT、ALK、FGFR1、MET、ERBB2(HER2)、FGFR1、FGFR2、BCR-ABL1、RET、MEK、mTOR、VEGFR、及这些基因的任意组合的一个或多个突变。特别优选地，用于此目的的突变分析包括AR、ERBB2(HER2)、BRCA2、BRCA1和/或ESR1。
在变化方案中，可以预测对采用雄激素受体和/或雌激素受体的抑制剂治疗、对采用PARP抑制剂和/或针对ERBB2(HER2)采用治疗性单克隆抗体的反应。在其它变化方案中，进行激素受体抑制剂例如抗雄激素和/或抗雌激素的作用的预测。在另一变化方案中，进行关于活性成分恩扎鲁胺、阿比特龙、比卡鲁胺、氟他胺、他莫昔芬和醋酸环丙孕酮的预测。还在另一变化方案中，进行PARP抑制剂作用的预测，例如，Talazoparib(BMN-673)、奥拉帕尼(AZD-2281)、Rucaparib(AG014699、PF-01367338)、Veliparib(ABT-888)、CEP 9722、MK4827、BGB-290和/或进行治疗性单克隆抗体活性的预测，例如曲妥珠单抗。还在另一变化方案中，进行AG-221、AGI-5198、AG-120、AG-881、威罗菲尼、西妥昔单抗、克里唑替尼、替莫唑胺、厄洛替尼(特罗凯)、吉非替尼(易瑞沙)、Afatinib(Gilotrif)、Dacomitinib、来那替尼、CO-1686(Rociletinib)、AZD9291和/或HM61713活性的预测。这些变化方案的任意组合也是可能的。
用于预测的方法的某些用途例如可以包括相同治疗相关基因的突变分析和甲基化分析。这可以是，例如，肿瘤抑制基因，如例如DNA修复基因，和/或原癌基因。例如，治疗相关基因的异常甲基化和/或突变(例如失活突变)可以表明患有恶性疾病的患者对某些治疗的反应，而治疗相关基因的野生型或标准值则表明病人对治疗无反应。相反的情况也是可能的，即这些构象(Konstellationen)表明患者对治疗没有反应。
在用于预测的方法的优选变化方案中，突变分析和/或甲基化分析包括BRCA1、BRCA2和/或PALB2基因的CpG-二核苷酸的至少一部分或多个部分或一个或更多个。对于这些基因的特别优选的序列，参考实施例8中提及的序列。
但也属于根据本发明方法的独特特征的是，可以检测各种治疗相关基因之间的相互作用，这相互影响了关于患者对治疗的反应。对此，可选地或额外地对于前述的变化方案，突变分析包括至少第一治疗相关基因的一部分或多部分和甲基化分析包括与第一相关基因不同的第二治疗相关基因的一个或多个CpG-二核苷酸。
这反映了本发明的发现，即第一治疗相关基因的甲基化状态和第二治疗相关基因的突变可能对特定疗法具有同时或相反的作用。因此，考虑本发明的认识，第一治疗相关基因的甲基化状态和第二治疗相关基因的突变可能对某一治疗具有同时或相反的作用。可以借助于本发明首次通过同时突变和甲基化分析将这些相互作用功能性相关连并解密。
在用于预测的方法的优选变化方案中，甲基化分析因此包括MGTM基因的一个或多个CpG-二核苷酸和突变分析包括基因IDH1，IDH2和/或EGFR的至少一部分或多个部分。对于这些基因内特别优选的序列，参考
实施例9。
在用于预测的方法的优选用途中，进行病人对用至少一种活性成分治疗的反应的预测，该活性成分选自下组：烷化化疗剂、细胞抑制剂、治疗性单克隆抗体和抑制剂，特别是酪氨酸激酶抑制剂。特别优选地进行关于选自替莫唑胺、西妥昔单抗、贝伐单抗、AG-221、AGI-5198、AG-120、AG-881或其组合的活性成分的预测。
在用于患者的恶性疾病的随访的方法的优选变化方案中设计了，步骤B)和C)在允许至少一个突变和/或至少一个CpG-二核苷酸的甲基化状态的定量确定的条件下进行。优选地，用于恶性疾病随访的方法的用途然后包括以下步骤：i)从第一时间点提供具有患者基因组DNA的第一样品和进行根据第一方面的方法，其中基因组中恶性疾病的DNA的比例根据步骤B)中的突变分析和/或如果存在的话根据步骤C)中的甲基化分析来确定，ii)从在第一时间点后存在的第二时间点提供具有患者基因组DNA的第二样品和用第二样品重复来自步骤i)的方法。恶性疾病的进展然后可以根据第二样品中基因组DNA中恶性疾病DNA相比于第一样品的比例的变化来控制。例如，第一时间点可以在治疗开始之前，第二时间点在治疗开始之后。然后，第二样品中恶性疾病DNA比例的增加可能表明，例如，患者对治疗有反应。这种情况可能出现在，例如，如果肿瘤死亡并且在死亡过程中恶性疾病的基因组DNA越来越多地进入血液时。还可能的是，第二样品中恶性疾病的DNA比例增加表明患者对治疗无反应。这种情况可能出现在，例如，尽管进行了治疗但如果肿瘤继续生长并且在生长过程中恶性疾病的基因组DNA越来越多地进入血液中时。还可能的是，第二样品中恶性疾病DNA的比例略有减少表明患者对治疗无反应。这种情况可能出现在，例如，如果只有肿瘤的一部分对治疗有反应并死亡，所以恶性疾病的基因组DNA进一步进入血液中时。
在用于随访的方法的变化方案中，在步骤i)中，第一时间点在治疗开始后2至12天，优选4至10天，特别优选6至8天，例如放射治疗。在步骤ii)中，第二时间点可以在治疗开始后10至31天，优选14至28天，更优选18至24天。在另一变化方案中，第一或第二时间点也可以在开始治疗或介入(例如手术)之后1至5天，优选2至4天。治疗开始或进行介入的那一天视为第0天。由于已经阐述的优点，通过根据本发明的方法实现对血液中肿瘤DNA的特别特异性的检测，从而例如可以高度可靠地得出手术后残余肿瘤的遗留和/或隐匿转移的存在。
可能的是，用根据本发明的方法在基因组的恶性疾病中没有起因的DNA中也检测此类突变。例如可能的是，确定在母亲血液中循环的胎儿DNA中的突变。例如，依据根据本发明对母亲血液中的胎儿DNA进行分析，可能检测到未出生婴儿的癫痫性脑病。为此优选地检查基因ALDH7A1，PNPO、SLC2A1、MECP2、FOXG1、ARX、CDKL5、STXBP1、SPTAN1、SCN1A、EIEE6、KCNQ2、EIEE7、ARHGEF9、EIEE8、PCDH19、PNKP、EIEE10、SCN2A、和/或EIEE11的突变。还可能的是，在母亲的血液中检测未出生婴儿的其它遗传疾病。优选地使用本发明的方法，可以根据FGFR3基因中的突变诊断软骨发育不全；根据SERPINA1基因中的突变诊断α-1-抗胰蛋白酶缺陷；根据CFTR基因中的突变诊断囊性纤维化；根据GBA基因中的突变诊断戈谢病；根据DMD基因中的突变诊断杜氏肌营养不良；根据MEFV基因中的突变诊断地中海热；根据FMR1基因中的突变诊断脆性X综合征；根据HFE基因中的突变诊断遗传性血色沉着病；根据HTT基因中的突变诊断亨廷顿病；根据FBN1基因中的突变诊断马凡综合征；根据CNPB和/或DMPK基因中的突变诊断肌强直性营养不良；根据F5基因中的突变诊断凝血因子V因子；根据基因F8和/或F9基因中的突变诊断血友病；根据PTPN11、SOS1、RAF1和/或KRAS基因中的突变诊断努南综合的突变征；根据PAH基因中的突变诊断苯丙酮尿症；根据IL2RG基因中的突变诊断X染色体重度联合免疫缺陷；根据HBB基因中的突变诊断镰状细胞性贫血和地中海贫血；根据SMN1和/或VAPB基因中的突变诊断脊髓性肌萎缩；根据NF1和NF2基因中的突变诊断神经纤维瘤病I型和II型；根据LDLR基因中的突变诊断高胆固醇血症；根据COL1A1和/或COL1A2基因中的突变诊断成骨不全；根据HEXA基因中的突变诊断Tay-Sachs病；根据COMT和/或TBX1基因中的突变诊断腭-心-面综合征；根据ATP7B基因中的突变诊断威尔逊氏病；根据FMO3基因中的突变诊断三甲基氨尿症。还可能的是，检测染色体突变如21三体、5号染色体中的缺失和/或15号染色体中的微缺失根据本发明用于诊断唐氏综合征、猫叫综合征和安格曼综合征。这些用途的任何组合也是可能的。
还可能的是，通过使用根据本发明的方法检测更多良性和/或非恶性疾病。优选的是在肾的产生皮质醇的腺瘤中和在遗传性高血压中的KCNJ5突变；在肾的产生皮质醇的腺瘤和增生中的PRKACA和/或KCNJ5；和在醛固酮腺瘤和原发性醛固酮增多症中的CACNA1D突变。此外这些用途的组合是可能的。
本发明的第三方面涉及用于实施根据第一方面的方法或其根据第二方面的用途的试剂盒。试剂盒包含：a)至少一个第一寡核苷酸对，其设计用于杂交在从步骤A)获得的基因组DNA上，以扩增基因组DNA的怀疑含有至少一个突变的至少第一分区。可能的是，第一分区额外含有至少一个待确定其甲基化状态的CpG-二核苷酸。
在更优选的变化方案中，试剂盒额外包括b)至少一个第二寡核苷酸对，其设计用于杂交在从步骤A)获得的基因组DNA上，以扩增转换的基因组DNA的包含待分析其甲基化状态的至少一个CpG-二核苷酸的至少第二分区。
可能的是，将第一和/或第二寡核苷酸如此设计，使得怀疑含有至少一个突变的分区的那个片段或怀疑含有至少一个CpG-二核苷酸那个分区与第一和第二寡核苷酸对中的一个寡核苷酸至少部分地反向互补。以这种方式，实现了各个待分析区域的特定特殊的扩增。然而还可能的是，怀疑其中含有突变的片段或含有CpG-二核苷酸的片段位于与寡核苷酸反向互补的序列之间。
试剂盒还可以含有其它第一和第二寡核苷酸对，以相应地扩增基因组DNA的其它第一和/或第二分区，该DNA怀疑含有突变，或该DNA包含待分析其甲基化状态的CpG-二核苷酸。
优选地，将第一和第二寡核苷酸对以及任选的其它寡核苷酸对设计用于双重PCR或多重PCR。优选地，寡核苷酸的GC含量在20至70％的范围内，特别优选30至60％。优选地，引物长度在17至35个核苷酸之间，特别优选在18至30个核苷酸之间。优选地，引物对的一个引物含有少于四个的胞嘧啶，并且引物对的另一个引物在DNA结合序列中含有少于四个的鸟嘌呤。特别优选的是，引物对的一个引物不含任何胞嘧啶，引物对的另一个引物在DNA结合序列中不含鸟嘌呤。
优选地，从A)获得的转换的基因组DNA中的寡核苷酸对的寡核苷酸的结合位点不含胞嘧啶且不含甲基胞嘧啶。优选地，从A)获得的转换的基因组DNA中寡核苷酸对的一个寡核苷酸的结合位点或寡核苷酸对的另一个寡核苷酸的反向互补结合位点不含CpG-二核苷酸。
优选地，从A)获得的转换的基因组DNA中的寡核苷酸对的寡核苷酸的结合位点不含胞嘧啶且不含甲基胞嘧啶。从A)获得的转换的基因组DNA中寡核苷酸对的一个寡核苷酸的结合位点或寡核苷酸对的另一个寡核苷酸的反向互补结合位点优选不含CpG-二核苷酸。
在某些变化方案中，将第一寡核苷酸对的寡核苷酸如此设计，使得它们各自至少部分与其中没有胞嘧啶转换，特别是不含胞嘧啶转换的转换的DNA序列互补。
在优选的变化方案中，第一分区包括BRAF的至少一个分区。在另一优选的变化方案中，第一分区包括EGFR的至少一个分区。在另一优选的变化方案中，第一分区至少包括KRAS的至少一个分区。在另一优选的变化方案中，第一分区至少包括BRCA1的区域。在另一变化方案中，第一分区至少包括BRCA2的至少一个分区。在又一优选的变化方案中，第一分区至少包括PALB2的至少一个分区。在另一优选的变化方案中，第一分区至少包括IDH1的至少一个分区。在另一优选变化方案中，第一分区包括IDH2的至少一部分。在另一优选的变化方案中，第一分区域包括TP53的至少一部分。另外，这些第一部分的任意组合都是可能的。
在优选的变化方案中，第二分区包括PITX2的至少一部分。在另一优选的变化方案中，第二分区包括CDO1、PLAU、POU4F3、TFF1和/或CXCL12的至少一部分。在另一优选的变化方案中，第二分区包括MGMT的至少一部分。在另一还优选的变化方案中，第二分区包括SHOX2的至少一部分。在另一还优选的变化方案中，第二分区包括SEPT9的至少一部分。同样包括这些第二分区的任意组合。
此外，一个或更多个第一分区和第二分区的任意组合都是可能的。例如，在优选的变化方案中，第一分区包含BRAF基因的至少以部分，第二分区包含SHOX2基因的至少一部分。在另一优选的变化方案中，第一分区包含BRCA1、BRCA2或PALB2基因的至少一部分，第二分区包含BRCA1基因的至少一部分，任选地第二部分。在另一优选的变化方案中，第一分区包含IDH1、IDH2和/或EGFR基因的至少一部分，第二分区包含MGMT基因的至少一部分。在另一优选的变化方案中，第一分区包含至少部分TP53基因的至少一部分，第二分区包含PITX2基因的至少一部分。
从前面的描述和实施例以及序列表，另一优选的分区和优选序列是显而易见的。
试剂盒优选包含用于实施根据第一方面的方法和/或使用根据第二方面的方法的说明手册。
具体实施方式
下面将借助于实施例和实验结果更详细地描述本发明。这些实施例用于说明而不限于特定的细节。
实施例1：确定未转换的基因组DNA(参照)中的点突变
点突变是那些只有单个核碱基受到变化影响的突变。点突变的可靠确定因此对分子诊断检测方法的特异性和灵敏性提出了高要求。
作为关于临床高度相关的点突变的实例，研究了BRAF基因内的点突变V600E。
待分析的基因组DNA可以来自各种来源。举例来说，这里使用固定的组织。将福尔马林固定和石蜡包埋的恶性黑色素瘤各10μm的三个薄切片以及一个与黑素瘤相邻的正常组织(皮肤)的组织块分别转移到单独的2ml反应容器中。随后，从组织切片中提取基因组DNA。例如根据制造商的说明使用QIAamp DNAFFPE组织试剂盒(Qiagen，Hilden，Germany)适合于此目的。
随后使用NanoDrop ND-1000分光光度计(Thermo Fisher Scientific,Waltham,MA,USA)将未转换的基因组DNA进行定量。
随后在未转换的基因组DNA中扩增BRAF基因的其中怀疑含有突变的基因座。为此，用正向引物SEQ ID NO：1和反向引物SEQ ID NO：2通过PCR扩增基因座，以将所得序列与未转换的野生型序列SEQ ID NO：3进行比对。PCR反应例如在20μl体积中在以下条件下进行：2μl PCR具有20mM MgCl2的反应缓冲液(10倍浓缩的，Roche，Penzberg，德国)，2U FastStartTaq DNA聚合酶(Roche)，0.4μM每种引物，0.25mM每种dNTP(dTTP、dATP、dGTP、dCTP)。例如，借助于DNAEngine Tetrad热循环仪(Biorad，USA)进行PCR。合适的温度曲线包括例如以下步骤：在95℃下进行10分钟，然后在54℃下40个循环每次45秒，在72℃下45秒，并且在95℃下15秒。然后通过Sanger测序对得到的PCR产物进行测序，其中使用正向引物SEQ ID NO：1作为测序引物。PCR产物的Sanger测序是本领域普通技术人员容易获得的方法，并且也被许多提供者作为服务提供。在本应用实施例中进行的Sanger测序由例如Beckman CoulterGenomics，Hope End，Takeley，Essex CM22 6TA，United Kingdom生成。
图1A示出了来自正常组织的未转换基因组DNA作为参照的分析结果。正常组织只有野生型序列CAC。因此在这一点上不存在点突变。图1B示出了用未转换的恶性组织的基因组DNA作为参照的分析结果。除了野生型序列CAC之外，在黑素瘤的基因组DNA序列中还发现具有碱基序列CTC的V600E突变。
实施例2：确定基因组DNA中的点突变
在来自实施例1的提取的DNA中，根据本发明在每种情况下基因组DNA的部分被转换。转换可以通过例如使基因组DNA与亚硫酸氢盐接触来完成。目前例如用innuCONVERT亚硫酸氢盐一体化试剂盒(Analytik Jena，Jena，德国)进行转换。为此目的，根据制造商的说明书将每种样品的2μg提取的DNA进行转换。随后使用NanoDrop ND-1000分光光度计(Thermo Fisher Scientific，Waltham，MA，USA)定量转换的DNA的量。
在正常状态下，DNA以双螺旋的形式组织，其由两条相互反向互补的单链组成。一条链称为正链或正向链，另一条链称为负链或反向链。在DNA转换之后，例如用亚硫酸氢盐，正链和负链是不再反向互补。正链的亚硫酸氢盐转换形成的链称为亚硫酸氢盐I链，用于本发明的描述。由负链亚硫酸氢盐转换形成的链称为亚硫酸氢盐-II链。
在根据本发明的方法实施范围内，突变分析可以与转换的基因组DNA的扩增相关联。在本实例中，使用定量实时PCR(qPCR)扩增黑素瘤和正常组织的转换基因组DNA，并同时定量，见下文。优选地，作为双重-或多重PCR进行PCR或qPCR，其中例如在同一反应中扩增怀疑含有突变的转换的基因组DNA的一个或多个第一部分，和含有需分析其甲基化状态的CpG-二核苷酸的转换的基因组DNA的一个或多个第二部分。
为了定量转换的基因组DNA的总量，用上述实施例1中所述的引物序列扩增qPCR中BRAF基因的基因座。例如，引物SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2被设计成，使其在不发生胞嘧啶转换的区域中在亚硫酸氢盐-II链上的靶序列中杂交。亚硫酸氢盐-II链的序列在不存在任何突变的情况下对应SEQ ID NO：4。通过选择这些引物，可以同时扩增和定量未转换的基因组DNA和转换的基因组DNA。
扩增子的序列特异性检测和定量可以以各种方式进行。例如，可以借助探针进行。例如目前用含有荧光团/猝灭剂系统Atto-647N/BHQ-2的SEQ ID NO：5的探针实现BRAF扩增子的检测。
根据本发明的甲基化分析例如可以包括甲基化特异性扩增反应。例如，可以使用寡核苷酸用于扩增，只有当待研究的CpG-二核苷酸已被甲基化时，所述寡核苷酸才在组合中导致扩增。例如在WO02/072880A2中描述了合适的方法，就此而言完全参考该文献。优选地，此种甲基化特异性扩增反应作为双重或多重PCR与上述突变分析的扩增组合进行。
例如，对于未转换的野生型状态对应于SEQ ID NO：6的SHOX2基因座的甲基化特异性扩增，使用正向引物SEQ ID NO：7、反向引物SEQ ID NO：8和阻断剂寡核苷酸SEQ ID NO：9。如WO02/072880A2中所述，阻断剂寡核苷酸在3′末端而不是OH基上携带磷酸，因此不能被聚合酶延伸，但是防止正向引物杂交在未甲基化的转换的基因组DNA上。因此，在该示例性实施方案中，在转换的基因组DNA中实现了SHOX2基因的亚硫酸氢盐-I链(SEQ ID NO：10)的甲基化特异性扩增。为了序列特异性检测扩增子，使用SEQ ID NO：11的6-FAM/BBQ-650双标记寡核苷酸。
可以进行校准以实现定量甲基化分析的特别高的准确性。例如，可以用在甲基化分析中与待检查的基因座具有相同序列的DNA进行校准，并且在转换之前按照一个或多个确定的比例将其甲基化，例如50％或100％，以下也称为标准DNA。在本实施例中，根据制造商的说明书使用CpG甲基转移酶M.SssI(New England Biolabs，Ipswich，MA，USA)完全甲基化人白细胞膜基因组DNA中的所有CpG-二核苷酸(Roche Applied Science，Penzberg，Germany)。在此特别是在序列SEQ ID NO：6内的所有CpG-二核苷酸被甲基化。随后，根据制造商的说明书使用innuCONVERT亚硫酸氢盐一体化试剂盒转换DNA。
随后对于定量甲基化分析在上述扩增反应中使用各5ng转换的标准DNA或各50ng转换的恶性黑色素瘤或正常组织的DNA。
在本实施例中，实时PCR定量在20μl PCR反应中分别进行三次独立测量，例如其中以下组合是合适的：35mM Tris-HCl缓冲液，pH8.4，6mM MgCl2，50mM KCl，4％甘油，0.25mM的每种dNTP(dTTP、dATP、dGTP、dCTP)，2U FastStart Taq DNA聚合酶(Roche AppliedScience，Penzberg，德国)，0.4μM每种引物，0.75μM阻断剂寡核苷酸，0.2μM每个检测探针。例如，使用AB7500Fast Real-Time PCR系统(Life Technologies Corporation，Carlsbad，CA)进行qPCR。例如，合适的温度曲线包括以下步骤：在95℃下进行20分钟，然后在56℃下45个循环每次45s，和在95℃下15s，。
通过DeltaDelta-CT法计算恶性黑色素瘤的转换DNA中或正常组织中的甲基化状态，并表示为相对于假定为100％的标准DNA的百分比。
在本实施例中使用的正向引物SEQ ID NO：7、反向引物SEQ ID NO：8、封闭剂寡核苷酸SEQ ID NO：9和双标记探针SEQ ID NO：11例如被如此设计，使得甲基化分析中总共包括9种不同的SHOX2基因座的CpG-二核苷酸。在此，根据DeltaDelta-CT方法计算的甲基化百分比值反映了DNA的相应混合物可能具有的值，该混合物以此百分比部分由在这九个CpG-二核苷酸处对应地甲基化或未甲基化的序列组成。例如，66％的测量的甲基化值对应于qPCR中的行为，所述行为可能包括序列的混合，在所分析的全部九个CpG-二核苷酸处66％的序列被甲基化，而34％的序列没有在这九个CpG-二核苷酸处甲基化。
使用qPCR的甲基化分析显示，来自黑素瘤组织切片的基因组DNA中的SHOX2基因座的甲基化状态为66％，而在相邻皮肤的组织块中仅测量到小于1％的甲基化。因此能够显示出，提取的黑色素瘤基因组DNA含有高比例的恶性疾病DNA。
随后，如实施例1中所述，通过Sanger测序对由qPCR产生的BRAF基因的扩增子进行测序。在此使用修饰的测序引物SEQ ID NO：12代替引物SEQ ID NO：1，其具有与SEQ ID NO：1相比稍微偏移的靶序列。以这种方式可以避免从qPCR测序非特异性扩增子。
在确定恶性疾病的基因组转换的DNA的同时，通过转换的DNA的qPCR产物的Sanger测序，无疑可以证实黑素瘤的基因组DNA中BRAF V600E突变的存在(图1D)，而相邻的正常组织没有突变(图1C)。
因此根据本发明的方法允许通过使用转换的基因组DNA可靠地确定点突变。因此，同时本发明的方法还允许同时测定至少一种CpG-二核苷酸的甲基化状态，例如作为基因组DNA样品中存在恶性疾病DNA和其突变的存在的证据。这种同时测定具有额外的效果，即通过突变分析和甲基化分析相关性可以有效地避免突变分析的假阴性结果。此种假阴性结果可以在常规分析方法中产生，例如，由于在具有基因组DNA的待分析样品中没有注意到不存在恶性疾病的DNA。
对于本领域的读者显而易见的是，可轻松调整该方法使之容易适用于确定额外的突变和其它恶性疾病。在此，突变可以分别进行分析，也可以同时彼此组合分析。其他甲基化生物标志物也可以单独分析或彼此组合分析。当使用基于实时PCR的技术时，几种DNA甲基化生物标志物和/或突变的组合仅受限于不同染料的可读性。借助其他方法还可以实现更高的多重复用性。此种方法的优选实例是多重基因座的多重PCR扩增，然后通过NGS分析PCR扩增子。
实施例3：确定游离循环基因组DNA中的突变
来自体液的游离循环基因组DNA的突变分析特别有吸引力，因为它不需要对患者进行手术干预。同时，由于恶性疾病的DNA量可能高度依赖于疾病的阶段，所以该方法具有增加产生假阴性结果的风险。正好在早期阶段，通常在体内仅循环非常少量的恶性疾病的基因组DNA，所述量在健康的DNA背景下尤其难以检测。
在本发明的范围内已经认识到这个问题，并且使用本发明的方法来解决，如在下面的实例中所示。
示例性地作为体液分析的四名选择的患有恶性黑素瘤的患者(A，B，C，D)的血浆。两名患者(C和D)处于疾病晚期，因此具有高的肿瘤负荷。因此，在这些患者中预期血液中游离循环肿瘤DNA的比例高。另外两名患者(A和B)患有黑色素瘤，处于疾病的早期阶段，具有非常低的肿瘤负荷。因此，在这些患者中不得不预期少量的游离循环肿瘤DNA。
首先，如实施例1中所述，用恶性组织的未转换的基因组DNA进行参照分析。一名晚期患者(D)和一名早期患者(B)在分析肿瘤组织后显示V600E BRAF突变，而另外两名患者(A和C)在肿瘤组织中没有这种突变。
为了实施根据本发明的方法，使用innuCONVERT亚硫酸氢盐体液试剂盒(AnalytikJena，Jena，德国)首先将来自每个3ml血浆的每名患者的基因组DNA按照制造商的说明书进行浓缩，然后进行转换。在该试剂盒中使用的用于浓缩来自血浆的游离循环DNA的方法基于根据聚合物辅助的富集。通过与亚硫酸氢盐接触，在试剂盒方案的范围内进行转换。转换的基因组DNA最终以60μl洗脱。在类似于实施例2进行的定量实时PCR中，将这些具有转换的基因组DNA的60μl用于6次各10μl的测定中。
随后，通过BRAF基因座关联SHOX2基因座的定量甲基化分析和游离的循环DNA的定量确定来确定游离循环DNA中恶性疾病的DNA的比例。
图2示出了黑素瘤患者血浆中组合的SHOX2甲基化分析和BRAF突变分析的结果。在左栏中的图表示出了定量实时PCR的结果：针对作为基因组DNA总量的分量的不依赖于甲基化状态和突变状态的BRAF DNA拷贝的比例，以及针对作为恶性疾病DNA在基因组DNA中的比例的分量的甲基化SHOX2DNA的数量。右栏表示在实时PCR产生的BRAF扩增子的测序结果(A：在原发性肿瘤中具有较低肿瘤负荷和根据参考分析BRAF野生型的患者。B：具有较低肿瘤负荷和BRAF V600E突变原发性肿瘤的患者。C：在原发性肿瘤中具有高肿瘤负荷和BRAF野生型的患者。D：具有高肿瘤负荷和BRAF V600E突变原发性肿瘤的患者)。
基于SHOX2基因座的甲基化分析与通过BRAF基因座测量的游离循环基因组DNA总量的根据本发明的相关性，发现患者A的血浆中恶性疾病的DNA为1.7％，患者B的血浆中恶性疾病的DNA为0.26％。这对应于相对较早的肿瘤阶段，其中发现血浆中通常只有少量的肿瘤DNA。
随后对生成的BRAF扩增子的Sanger测序中随后在患者A和B中仅检测到野生型DNA，尽管患者B是突变携带者(图2，右栏)。分开考虑游离循环基因组DNA中的突变分析因此会导致患者B的假阴性结果。然而，这一结果通过根据本发明的突变分析与甲基化分析的组合可能归因于血浆中恶性疾病的DNA量太少并且因此可靠地鉴定为假阴性。相反，常规的突变分析会导致假阴性诊断。
对于患者C和D情况是不同的。在这两种情况下，根据甲基化分析可以显示血液中存在大量恶性疾病的游离循环DNA(图2左栏：患者C：26％；患者D：41％)。尽管患者C的突变分析仅显示野生型序列，但是通过根据本发明的组合甲基化分析和突变分析可以排除这是假阴性的结果。患者C的恶性疾病因此不携带BRAF V600E突变。通过仅进行突变分析的常规方法，可能无法将这种真正的阴性诊断与假阴性结果区分。
以这种方式，根据本发明的方法提高了分子诊断突变分析的灵敏度，因为假阴性结果的数目减少，特别是基于游离循环的基因组DNA、外来体DNA或游离循环细胞。
实施例4：确定导致形成CpG的突变
表皮生长因子受体(EGFR)是通常由配体结合激活的酪氨酸激酶。通过突变导致组成型激活，从而提高细胞增殖。EGFR酪氨酸激酶抑制剂(TKI)与ATP竞争与受体的配体结合口袋中的结合，并以这种方式既抑制酪氨酸激酶活性又抑制EGFR信号传导途径。在EGFR激活突变的患者中，这些TKI被认为是一线治疗并且可以提高患者的无进展生存期和治疗反应率。因此，EGFR突变是对EGFR酪氨酸激酶抑制剂(TKI)的高效预测性标记，例如第一代TKI厄洛替尼(特罗凯)和吉非替尼(Iressa))和第二代TKI，例如阿法替尼(Gilotrif)、Dacomitinib和Neratinib。额外地如此设计第三代TKI例如CO-1686(rociletinib)、AZD9291和HM61713，使得他们比EGFR野生型更强烈地抑制突变的EGFR蛋白质。由于这些原因，确定EGFR的突变状态对个性化、靶向治疗特别重要。
在肺肿瘤中，EGFR突变在腺癌、女性和非吸烟者中特别常见。它们在EGFR基因的外显子18中是9％，在外显子19中是51％，在外显子20中是18％，以及在外显子21中是22％。大约5％的EGFR突变导致对EGFR-TKI的继发性治疗抗性。突变c.2369C>T(T790M)在此是EGFR-TKI治疗抵抗的最常见机制。
在这个应用实例中，研究了EGFR的c.2573T>G(L858R)突变。它位于EGFR基因的激酶结构域内的外显子21中，并发生在约43％的EGFR突变的肺肿瘤中。
将福尔马林固定的和石蜡包埋的肺肿瘤各10μm的三个薄切片和相邻正常肺组织的组织块分别转移到2ml反应容器中。根据Kithandbuch使用QIAamp DNA FFPE组织试剂盒(Qiagen，Hilden)从组织切片中提取基因组DNA。从提取的DNA中，使用innuCONVERT亚硫酸氢盐一体化试剂盒(Analytik Jena,Jena,德国)分别转换每个样品2μg。
提取的DNA的未转换部分用于参考分析。为此，使用两个引物(引物序SEQ ID NO：13和SEQ ID NO：14)扩增基因组未转换的DNA，该引物扩增怀疑突变的EGFR基因的外显子21中的基因座。随后在Sanger测序中对获得的扩增子进行测序，并与未转换的野生型序列SEQID NO：15进行比较，其中正向引物SEQ ID NO：13用作测序引物。如实施例1所述进行PCR扩增和Sanger测序。
图3A和3B总结了外显子21中EGFR基因座参考分析的结果。图3A示出了确定的与肿瘤相邻的健康组织的序列。图3B示出了确定的肿瘤组织的序列。已经发现在相邻正常组织的基因组DNA中未发现突变。相反，除了野生型序列(CTG)之外，在来自肿瘤的基因组DNA的序列中还发现L858R突变(CGG)。
对于根据本发明的突变分析，用序列SEQ ID NO：16和SEQ ID NO：17的引物扩增转换的基因组DNA，以确定与具有序列SEQ ID NO：18的亚硫酸氢盐I链的野生型序列的差别。具有序列SEQ ID NO：18的亚硫酸氢盐I链对应于由野生型基因组序列SEQ ID NO：15的正链转换产生的序列。然后使用正向引物SEQ ID NO：16作为测序引物对得到的PCR产物进行测序。如实施例1所述进行PCR扩增和Sanger测序。
图3C和3D示出了根据本发明的方法的结果。图3C示出了获得的健康组织的序列，图3D示出了获得的肿瘤组织的序列。可以发现由肿瘤组织中的点突变产生的CpG-二核苷酸存在甲基化。由于其甲基化，该CpG-二核苷酸中的胞嘧啶不被亚硫酸氢盐处理转换。由此，转换的野生型DNA的所获得的序列(图3C)有利地在额外的碱基中与转换的肿瘤DNA序列的所获得的序列不同(图3D)。相比之下，由于肿瘤的基因组未转换的DNA中只有一个碱基是不同的，所以借助根据本发明的方法可以比常规的突变分析明显更好地检测这种类型的突变。这使得即使在样本中恶性疾病的DNA比例低的情况下也出乎意料地提高根据本发明的突变分析的灵敏性和特异性。
实施例5：确定基因组DNA中的缺失
导致蛋白质中氨基酸缺失的缺失是EGFR基因中的其它常见突变。它们经常发生在编码部分激酶结构域的外显子19中。这些突变同样可以预测对EGFR靶向的TKIs的反应。在约48％的EGFR突变型肺肿瘤中，在外显子19中发现缺失。
在这项研究中显示转换的基因组DNA中的缺失可以可靠地确定。为此目的，将福尔马林固定和石蜡包埋的肺肿瘤的各10μm的三个薄切片和相邻的正常肺组织切片分别转移到2ml的反应容器中。根据Kithandbuch使用QIAamp DNA FFPE组织试剂盒(Qiagen，Hilden)从组织切片中提取基因组DNA。从提取的DNA中使用innuCONVERT亚硫酸氢盐一体化试剂盒(Analytik Jene，Jena，德国)分别转换每个样品2μg DNA。
部分提取的DNA未转换并用于参考分析。为此目的，使用引物SEQ ID NO：19和SEQID NO：20，对此将引物设计为扩增EGFR基因外显子21中的携带突变的基因座，以将获得的序列与未转换的野生型序列SEQ ID NO：21比较。随后在Sanger测序中对获得的扩增子进行测序，其中使用反向引物SEQ ID NO：20作为测序引物。如实施例1所述进行PCR扩增和Sanger测序。
参考分析的结果显示在图4中。图4A示出了在相邻正常组织的基因组未转换的DNA中未发现突变。与此相反，在来自肿瘤的未转换的DNA的序列中，发现野生型序列与缺失15个碱基的突变序列重叠(图4B)。通过这种缺失导致随后的与缺失相连的碱基与野生型序列缺失之后的碱基重叠。
对于根据本发明的方法，用引物SEQ ID NO：22和SEQ ID NO：23扩增转换的基因组DNA，以确定亚硫酸氢盐-I链的野生型序列与序列SEQ ID NO：24的差别。SEQ ID NO：24对应于由野生型基因组序列SEQ ID NO：21的正链转换产生的序列。随后使用反向引物SEQ IDNO：23对产生的扩增子进行测序。如实施例1所述进行PCR扩增和Sanger测序。
对于正常组织的未转换基因组DNA的测序结果在图4C中示出，并且对于肿瘤的未转换基因组DNA的测序结果在图4D中示出。可以看出，外显子19的等位基因中的缺失导致与基因组未转换的肿瘤DNA的测序可比的(vergleichbaren)重叠模式。因此，使用根据本发明的方法也可以可靠地确定缺失。
为了进一步确认转换的基因组DNA中根据本发明的缺失的确定，将携带突变的转换的DNA的PCR产物连接到质粒中。将质粒转染到大肠杆菌中并在琼脂平板上分离。这些单细胞在37℃生长过夜以克隆的方式进行克隆。将各个大肠杆菌克隆的细胞转移到PCR反应中随后测序。使用TOPO-TA克隆试剂盒(Life Technologies，Carlsbad，CA，USA)根据制造商的说明书进行PCR产物的克隆。如实施例1所述进行PCR扩增。为此，使用引物SEQ ID NO：22和SEQ ID NO：23。如实施例1所述进行测序。SEQ ID NO：23用作测序引物。
图5A示出了携带肿瘤DNA的样品中的一部转换的基因组DNA是野生型的，而在图5B所示的等位基因清楚地具有15个碱基的缺失。
实施例6：确定具有胞嘧啶-胸腺嘧啶转变的突变
迄今为止主流的观点是，转换的基因组DNA中的突变非常难或完全不可能检测到。这种流行的观点也是基于这样一个事实，即未甲基化的胞嘧啶转换为尿嘧啶，尿嘧啶在碱基配对性质中不能与胸腺嘧啶相区分。因此，在本领域中，通过C到T突变引入的胸腺嘧啶和通过胞嘧啶转换引入的胸腺嘧啶之间的区分被认为是不可解决的问题。
这种误解可以在本发明的范围内得到克服。通过本发明的理解，首先认识到，如果代替或额外地为了基因组样品的转换的正链以外，基因组DNA的转换的负链包括在本发明的突变分析中，则可以解决该问题。在负链上，C到T的转变对应于G到A转变的正链。因此在本实施例中，根据KRAS基因座的外显子4中的突变c.437C>T(A146V，COSM1360827)显示，在基因组DNA的转换后在负链上的G到A转变是良好可检测的并且因此可靠地确定仅基于C到T转变的点突变是可能的。
为此目的，将大肠的福尔马林固定和石蜡包埋的腺癌的各10μm的三个薄切片和相邻的正常肠组织的组织切片分别转移到2ml的反应容器中。使用QIAamp DNA FFPE组织试剂盒(Qiagen，Hilden，德国)根据Kithandbuch从组织切片中提取基因组DNA。从提取的DNA中，使用innuCONVERT亚硫酸氢盐一体化试剂盒(Analytik Jena，Jena，德国)转换每个样品2μgDNA。
提取的DNA的每个额外部分未被转换并用于参考分析。为此，在使用引物SEQ IDNO：25和SEQ ID NO：26的PCR中，扩增KRAS基因外显子4中潜在的携带突变的基因组基因座，以确定与未转换的野生型DNA序列SEQ ID NO：27的差别。随后在Sanger测序中对获得的PCR产物进行测序，其中使用正向引物SEQ ID NO：25作为测序引物。如实施例1所述进行PCR扩增和Sanger测序。
图6A和6B示出了参考分析的结果。图6A还原了正向链测序后与肿瘤相邻的健康组织的未转换基因组DNA序列。图6B示出正向链测序后未转换的肿瘤组织基因组DNA的序列。结果，在相邻的正常组织的未转换的基因组DNA中没有发现突变(图6A)。相反，在来自肿瘤的基因组DNA序列中，除了野生型序列之外，还出现具有C至T转变的突变序列(图6B)。
在根据本发明的方法的范围内，首先用具有序列SEQ ID NO：29和SEQ ID NO：30的引物进行KRAS基因外显子4中相应基因座的PCR扩增，以确定扩增子与序列SEQ ID NO：28。序列SEQ ID NO：28对应于具有序列SEQ ID NO：27的正链的转换的野生型序列。如实施例1所述进行PCR扩增。在图6C和6D中示出了根据实施例1的随后的Sanger测序经由正向引物SEQ ID NO：29的结果。图6C还原了亚硫酸氢盐-I链正向测序后健康组织的转换基因组DNA序列，图6D对应于亚硫酸氢盐-I链正向测序后肿瘤组织转换的基因组DNA序列。结果清楚表明由于在亚硫酸氢盐-I链中C到U的化学转换，C到T转变不再可检测。这基于，转换的基因组DNA中的U随后在PCR扩增的情况下又被T代替，使得最初突变的序列不能再与野生型序列区分。
随后，基于亚硫酸氢盐-II链对KRAS基因的外显子4中的相应基因座进行突变分析，以确定与转换的野生型序列SEQ ID NO：31的区别。对于基于亚硫酸氢盐-II链的PCR扩增，使用引物SEQ ID NO：32和SEQ ID NO：33。PCR产物的测序用反向引物SEQ ID NO：32进行。结果在图6E-H中示出。图6E和6F首先示出通过反向引物SEQ ID NO：26进行测序后的作为参照的野生型变体和在未转换的基因组DNA中的突变。图6F中根据部分出现的G到A的转变可看到突变。图6G和6H示出在前述的亚硫酸氢盐-II链的反向测序后，分别在健康组织(6G)或肿瘤组织(6H)的转换的基因组DNA中确定的序列。可以清楚地看出，与肿瘤组织中的健康组织相比，除了野生型序列之外，还出现了具有G到A转变的突变序列。G到A的转变对应于正向链上搜索到的C到T的转换。
因此，与本领域中的错误相反，根据本发明的方法通常允许可靠地确定包含C至T转变或由C至T转变组成的突变。
在根据本发明的方法的某些变化方案中，突变分析因此包括基于基因组DNA的转换的负链确定突变。
实施例7：从体液和组织中多重测定基因组DNA中的突变
在本发明的优选的应用中，设计进行组合的突变分析和甲基化分析，其包括来自基因组不同区域的多个基因，下文也称为全基因组突变分析和甲基化分析。
优选地，用来自体液的游离循环基因组DNA进行全基因组突变和甲基化分析。特别合适的是血浆、血清、尿液、腹水和胸腔积液。来自体液基因组DNA的转换例如可以用innuCONVERT亚硫酸氢盐体液试剂盒(Analytik Jene，Jena，德国)按照试剂盒手册进行。
随后，借助于合适的全基因组测序方法设计组合的突变分析和甲基化分析。在优选的变化方案中，使用高通量测序方法，例如下一代测序方法。特别优选地，使用全基因组鸟枪法亚硫酸氢盐测序(WGSBS)方法。以这种方式，可以同时确定大量的突变或CpG甲基化状态。如果确定在每种情况下进行定量，那么确定的量随后可以与任选转换的基因组DNA内相应的野生型序列或甲基化状态相关。以这种方式，例如，可以确定基因组DNA内携带突变的DNA和/或恶性疾病()DNA(根据甲基化状态)的相对比例。以这种方式也可以确定携带突变的那部分恶性疾病的DNA的比例。这可能是特别有利的，因为恶性疾病如肿瘤通常具有异质的基因组合物，或例如恶性疾病的基因组DNA中携带突变的DNA的相对比例可以由于例如治疗而改变，并且允许关于治疗过程和/或疾病发展情况的结论。
在另一实施方案中设计成，来自体液的转换的基因组DNA的突变分析或甲基化分析不是通过如上所述的全基因组测序方法直接进行。在这种情况下设计成，首先扩增转换的基因组DNA的待检测区域。在优选的用途中，这些区域借助PCR扩增。为此将引物对设计成各自从转换的基因组DNA产生扩增子，该扩增子包含一个或多个待分析的突变位点或CpG-二核苷酸。优选地，还将引物对设计成使其与多重PCR相容，其中多个引物对用于同时扩增转换的基因组DNA的待检测多个区域。随后，例如通过下一代测序进行多个PCR扩增的检测。
在另一优选的实施方案中，通过多重连接依赖性探针扩增(MLPA)进行分析。对此，用于MLPA的探针以这样的方式设计成使得它们结合待测定的突变位点或甲基化位点，并且例如在存在CpG-二核苷酸的突变或甲基化的情况下被连接。然后可以例如借助PCR扩增连接的探针，并任选测序。
在另一优选实施方案中，分析来自新鲜或固定的组织或游离循环的肿瘤细胞的DNA而不是游离循环DNA的DNA。
实施例8：在基因内通过组合的突变分析和甲基化分析进行预测
在本发明的范围内已经认识到，患有恶性疾病的患者对例如化疗等治疗的反应可能取决于例如恶性疾病组织中某些DNA修复酶是否有活性或无活性。由于例如甲基化状态或还由于恶性疾病的基因组DNA中编码修复酶的相应基因的失活突变，可能存在失活。因此，为了更有针对性的治疗，既研究关于同一基因的甲基化状态又研究突变的存在可能是有利的。
这种方法例如提供了与PARP抑制剂治疗有关的发明。PARP抑制剂是一组抑制多聚ADP-核糖聚合酶(PARP)的药理学物质。这种酶对修复DNA中单链断裂是重要的。如果这些单链断裂没有被有效地修复，那么这些单链断裂可能导致双链断裂，在同样缺乏修复的情况下这又会导致细胞死亡。例如，这在肿瘤的化疗和/或放疗中是如此期望的。优选进行关于PARP抑制剂，他拉西巴(BMN-673)、奥拉帕尼(AZD-2281)、鲁卡里巴(AG014699、PF-01367338)、veliparib(ABT-888)、CEP9722、MK4827和/或BGB-290的根据本发明的预测。
BRCA1，BRCA2和PALB2编码修复酶，其通过同源重组修复此类双链断裂。如果这些基因是有活性的和有功能的，则可以有效修复由于PARP抑制导致单链和双链断裂。肿瘤细胞可以幸存。在这种情况下，用PARP抑制剂治疗效果不佳。
然而，在一些肿瘤中，BRCA1，BRCA2和/或PALB2的功能是有限的，因为相应的基因携带例如生殖系突变或体细胞突变和/或通过甲基化基因是失活的。在这些情况下，由PARP抑制导致的DNA损伤不能被修复，并且肿瘤细胞死亡。其中BRCA1，BRCA2或PALB2通过突变和/或甲基化而失活的肿瘤细胞因此对用PARP抑制剂的治疗反应良好。
设计借助于根据本发明的方法来如下测试：由于DNA修复酶通过甲基化和/或相应基因的突变而失活，该肿瘤是否可能响应单一疗法或与PARP抑制剂的组合疗法。对于联合治疗，在此例如非排除性的，考虑用顺铂的化疗、放疗或其他治疗。
为了实施根据本发明的方法，例如，制备福尔马林固定的和石蜡包埋的肿瘤的苏木精-伊红切片(H&E切片)。同时，制备其它无色的约10微米的空白切片，并安装在载玻片上。由病理学家在H&E切片上标记组织的肿瘤区域。然后通过手术刀将拉起的(aufgezogenen)空白切片转移到2ml反应容器中。理想情况下，使用的面积总共约为1-3cm2，这个区域也可以从更多的空白切片获得。
随后可以将组织脱石蜡并且例如通过蛋白酶K裂解。裂解的组织可以在没有事先提取的情况下直接转换，例如在用于转换基因组DNA的亚硫酸氢盐转换反应中。可选地也可以在转换前从裂解的组织中提取基因组DNA。转换后进行转换的基因组DNA的纯化。例如二氧化硅膜柱适用于此目的。例如可以用innuConvert一体化试剂盒(Analytik Jena，Jena，德国)相应于试剂盒中包含的方案进行组织的裂解、DNA的亚硫酸氢盐转换和随后的纯化。
突变和甲基化状态的根据本发明的确定可随后通过各种方法变化方案进行。
例如可能的是，用引物对进行转换基因组DNA的多重PCR扩增，该引物对适于扩增怀疑含有突变的转换基因组DNA的至少第一分区，和包含待分析其甲基化状态的CpG-二核苷酸的第二分区。
对于BRCA1的甲基化分析，优选使用引物，但非排他性地，为此将其设计成在该序列转换后在SEQ ID NO：61的基因组序列中至少部分结合。例如，具有SEQ ID NO：86和SEQID NO：87的引物对或具有SEQ ID NO：88和SEQ ID NO：89的引物对可能是合适的。对于BRCA2的甲基化分析，优选使用引物，但非排他性地，为此将其设计成在该序列转换后在SEQID NO：39的基因组序列中至少部分结合。
对于BRCA1的突变分析，优选使用一对或多对引物对，其靶序列至少部分地位于转换的基因组DNA区域中，其在未转换的野生型状态中与选自SEQ ID NO：46至SEQ ID NO：63或其组合，特别包含SEQ ID NO：56中的序列具有至少95％的序列同一性。
对于BRCA2的突变分析，优选使用一对或多对引物对，其靶序列至少部分地位于转换的基因组DNA区域中，其在未转换的野生型状态中与选自SEQ ID NO：34至SEQ ID NO：45或其组合中的序列具有至少95％的序列同一性。此外，特别优选使用一对或多个引物对，其靶序列位于PALB2基因座的转换的基因组DNA区域中。
可能的是，随后例如通过NGS测序PCR扩增的产物，其中优选定量地进行确定甲基化状态或者存在或不存在突变。以这种方式，例如，甲基化和突变的等位基因的百分比可以通过定量的甲基化状态和/或具有和不具有突变的转换的基因组DNA的比率来确定。
类似于实施例7中的描述或者这些方法的合适变化方案，也可以通过MLPA或WGSBS进行突变分析和甲基化分析。
在另一个实施方案中，未宏观分离福尔马林固定的肿瘤。例如，可以将携带肿瘤的组织块的各10μm的切片直接转移到2ml的反应容器中。随后的裂解，转换和纯化可以如上所述进行。
这种方法的应用是特别适合其中BRCA1和BRCA2突变的存在发挥了重要作用的疾病，例如乳腺癌和卵巢癌和黑色素瘤和前列腺癌。
实施例9：通过组合不同基因的突变和甲基化分析进行预测
尽管在前面的实例中，特别是同一基因内的组合突变分析和甲基化分析允许预测对治疗的反应，但在本发明的范围内也已经认识到，在某些恶性疾病中，不同基因的突变或甲基化状态的组合确定可以确保特别有利的预测。
一个实例涉及替莫唑胺的治疗。替莫唑胺是一种烷化细胞抑制剂，用于结合放疗同时、辅助和姑息地治疗胶质母细胞瘤。替莫唑胺通过将DNA烷基化而引起DNA损伤。这些DNA损伤可能导致肿瘤细胞凋亡，从而杀死它们。
酶O6甲基鸟嘌呤DNA甲基转移酶(MGMT)参与烷基化DNA的修复。这种酶可以因此降低替莫唑胺的效果。MGMT通过基因的甲基化在一些胶质母细胞瘤中受到抑制。因此，肿瘤显示MGMT表达降低的患者对替莫唑胺的治疗反应良好。MGMT的甲基化状态因此是替莫唑胺治疗反应的预测性生物标志物。
现在已知，除了MGTM的甲基化之外，还有一些突变如IDH1和IDH2基因的突变以及EGFR的扩增可以预测对替莫唑胺治疗的反应。对此，使用特异性抑制IDH1和IDH2的突变体的药物是有希望的治疗方法。具有EGFR扩增的肿瘤可能对用针对EGFR的靶向治疗性单克隆抗体的治疗有反应。在IDH1或IDH2中具有突变的肿瘤对用抑制突变的活性成分的治疗反应良好。因此，组合的对MGMT的甲基化分析和对IDH1、IDH2和/或EGFR的突变分析在来自胶质母细胞瘤或其中存在IDH1、IDH2和/或EGFR突变的其他肿瘤的转换基因组DNA中是本发明的临床相关应用。特别地，根据本发明的方法包括对MGMT基因的甲基化分析，其优选包括在未转换的野生型状态中与SEQ ID NO：92具有至少95％序列同一性序列的至少一部分，和/或对IDH1和/或IDH2的突变分析。特别地，可以将突变分析设计为确定序列的至少一部分中的突变，其在未转换的野生型状态中与SEQ ID NO：84和/或SEQ ID NO：85具有至少95％序列同一性。
实施例10：用于预后和/或预测的方法的用途
预后性生物标记物的测定使得确定恶性疾病例如肿瘤的侵袭性成为可能。
属于本发明的独特特征的是，通过同时进行突变分析和甲基化分析，可以完成分子诊断的总图，其中预后性生物标志物如基因的甲基化状态和预测性生物标志物如治疗相关基因中的突变同时流入。以这种方式，首次在单个分析中可以建立此种预后性和预测性遗传倾向之间的功能关系，以便以更有针对性和任选地更动态的方式来治疗患者。
因此，在本发明的另一应用中，将作为预后性生物标志物的基因的甲基化分析和作为恶性疾病的预测性生物标志物的治疗相关基因的突变分析集中在一个分析中。
对于这种类型的分析，特别设计了甲基化分析包含预后性DNA甲基化生物标志物PITX2、CDO1、PLAU、POU4F3、TFF1、CXCL12、或其组合的至少一部分或多个部分，优选序列的至少一部分，该序列在未转换野生型状态中与SEQ ID NO：90和/或SEQ ID NO：91具有至少95％序列同一性。
实施例11：通过组合突变分析和甲基化分析确定基因组DNA中恶性疾病DNA的比例
在本发明中范围内，还认识到的问题是，一些恶性疾病在许多在恶性疾病中通常异常过甲基化的基因上具有总体低的甲基化。在这种情况下，通过单独的甲基化分析来确定基因组DNA样品中恶性疾病DNA的比例可能是有问题的，因为可能存在恶性疾病DNA，尽管检测到仅仅很少或没有DNA甲基化。以这种方式可能会导致假阴性诊断。
这一难题在本发明的另一实施方案中采用以下方式得以解决：突变分析包括确定至少一个频发突变或在频发突变基因中确定至少一个突变。特别地，可以根据至少一个频发突变或在频发突变基因中的至少一个突变确定基因组DNA中恶性疾病DNA的比例。对此优选地在允许定量确定至少一个频发突变或频发突变基因的至少一个突变的条件下进行步骤B)中的突变分析，以定量基因组DNA中恶性疾病DNA的比例。
如果例如在肠癌患者的血浆中进行根据本发明的EGFR或KRAS的突变分析，则额外地进行另一个在肠癌中非常频繁的突变的确定，以便单独或与甲基化分析一起使用来确定基因组DNA中的恶性疾病DNA的比例。在肠癌中，突变分析例如可以包括TP53和/或APC，以确定频发突变基因的突变。然后，基因组DNA中恶性疾病DNA的比例可以仅根据频发突变基因的突变或与甲基化分析结合来确定，以便以这种方式获得特别有力的结果。
确定频发突变或在频发突变基因中的突变可能特别取决于哪个器官或组织类型受到恶性疾病的影响。随后，将各种器官和组织类型与各基因一起示出，所述基因优选至少部分由突变分析涵盖用于确定频发突变或频发突变基因的突变。突变分析还可以包括这些基因的组合以确定一个或多个频发突变或频发突变基因的一个或多个突变。
外阴：TP53、CDKN2A。阴道：TP53。泌尿道：TERT、FGFR3、TP53、STAG2、KDM6A、PIK3CA、CDKN2A、ARID1A、RB1。上呼吸消化道：TP53、CDKN2A、NOTCH1。甲状腺：BRAF、RET、TSHR、TERT、NRAS。胸腺：ALK、TP53、KIT、MEN1、CDKN2A、RET。睾丸：CTNNB1、KIT、TP53、KRAS。胃：TP53、ARID1A、CDH1、APC、PIK3CA、KMT2C、TRRAP、CTNNB1。软组织：KIT、CTNNB1、MED12、NF2、SMARCB1、NF1、PDGFRA、TP53、TERT、CDKN2A、VHL。小肠：PDGFRA、KRAS、TP53、CTNNB1、APC、MEN1、SMAD4、GNAS。皮肤：BRAF、TP53、TERT、CDKN2A、GRIN2A、PTCH 1、NRAS、ROS1、FGFR3、KMT2C、HRAS。唾液腺：TP53、HRAS、PIK3CA、CDKN2A、CREBBP、KDM6A、CTNNB1。前列腺：TP53、PTEN、SPOP、KRAS。胸膜：DICER1、CDKN2A、BAP1、NF2、TERT、TP53。腹膜：GNAS、KRAS、TP53、EGFR、SMAD4。胰腺：KRAS、TP53、GNAS、SMAD4、CDKN2A。卵巢：TP53、FOXL2、KRAS、PIK3CA、ARID1A、BRAF。食道：TP53、CDKN2A、NOTCH1。神经系统：BRAF、TERT、NRAS、CDKN2A。肺：TP53、EGFR、KRAS。肝脏：TP53、CTNNB1、TERT。大肠：APC、TP53、KRAS、ATM、PIK3CA、SMAD4、BRAF。肾：VHL、PBRM1、BAP1、SETD2、CTNNB1、AMER1、TP53、WT1。白血病和淋巴瘤：JAK2、NPM1、FLT3、MYD88、KIT、CALR、ABL1、TET2、NOTCH1、DNMT3A、ASXL1。子宫内膜：PTEN、PIK3CA、CTNNB1、TP53、PIK3R1、ARID1A、KRAS。宫颈：PIK3CA、KMT2C、KMT2D、KRAS。中枢神经系统：IDH1、TERT、TP53、CDKN2A、PTEN、H3F3A。乳房：PIK3CA、TP53、CDH1。骨：IDH1、GNAS、TP53、H3F3B、COL2A1。胆汁：TP53、KRAS、CDKN2A、KMT2C、IDH1、ARID1A。肾上腺：KCNJ5、TP53、CTNNB1、NF1。
实施例12循环肿瘤细胞(CTC)的检测
循环肿瘤细胞(CTC)的分析对于改善恶性肿瘤患者的治疗具有很大的潜力。例如，血液中CTC的存在可以使确定肿瘤分期成为可能，因为它早已表明隐匿性远处转移。CTC的分子分析也可以提供关于这些细胞对某些治疗的潜在反应的信息。例如，如果BRAF突变V600E存在于黑色素瘤患者的CTC中，那么这些细胞可能对威罗菲尼的治疗有反应。
但是，对CTC的具体检测是有问题的。例如常规方法根据根据上皮表面标志物富集CTC。对此上皮细胞粘附分子EpCAM例如表明该细胞可以是肿瘤细胞，因为这种细胞具有大部分造血起源的其它循环细胞没有显示的上皮特征。借助于针对EpCAM的抗体，可以特异性标记这些细胞并例如通过磁性颗粒纯化，或者已在体内通过在表面上携带针对EpCAM的抗体的导管富集。这个方法有两个严重的问题。首先，并不是所有的肿瘤细胞都携带相应的蛋白质，如表面上的EpCAM，所以即使恰好在少量的CTC的情况下，该方法对于检测通常也是不够灵敏的。其次，存在分离的具有上皮细胞特征但不是肿瘤来源的循环细胞，因此该方法也缺乏特异性。
用于富集CTC的其它已知方法基于尺寸选择。CTC比大多数其它循环细胞大，并且因此可以通过合适大小的孔来富集。这里也存在特异性的问题，因为也可以富集非肿瘤来源的其它细胞。如果现在在假想的由常规方法得到的富集CTC中进行突变分析，则可能获得假阴性结果，因为至少部分地分析了非特异性富集的良性细胞而不是CTC。
根据本发明的方法例如通过在游离循环细胞的转换的基因组DNA中进行组合的突变分析和甲基化分析来解决这个问题。然后可以根据甲基化分析来检测分离细胞的恶性起源。以这种方式可以显著改善突变分析的特异性。
实施例13：归一化的甲基化分析
在前面的实施例中已经显示，借助于根据本发明的方法，通过将突变分析与甲基化分析相关联，可以对突变进行归一化检测。以这种方式，例如可以在具有基因组DNA的样品中通过甲基化分析确定恶性疾病DNA的比例，以避免在样品中没有恶性疾病DNA导致假阴性突变分析。由此根据本发明例如实现了突变确定的灵敏性的显著改善。
但也是相反的情况，即，根据突变分析的甲基化分析的归一化，特别地与根据本发明的优点相关联。
恶性疾病，例如肿瘤通常是异质的，即，可能有各种细胞亚型，其有时具有不同的性质。例如，如果对肿瘤进行治疗，例如化疗、靶向治疗或免疫治疗，则不是所有的细胞都会以相同的方式应答，并且通常肿瘤细胞群存活。这例如可以是某些亚型。
根据本发明的甲基化分析特别适合于鉴定此种亚型。甲基化生物标志物在所有肿瘤细胞中通常不被甲基化。因此，甲基化生物标志物的分析允许鉴定具有某个性质的细胞的亚型。例如，如前面的实施例所述，这可以包括对某种治疗的某种反应或某种侵袭性。
如果在根据本发明的方法的范围内对转换的基因组DNA进行关于此种预测性和预后性的甲基化生物标志物检查，则感兴趣的问题是样品中恶性疾病的DNA比例有多高。例如如果甲基化分析包括胶质母细胞瘤基因组DNA样品中的MGMT以预测例如对替莫唑胺的应答，那么在肿瘤细胞中MGMT甲基化有多少百分比可能是重要的。
例如，如果肿瘤携带促成肿瘤发生的突变，则其在所有肿瘤细胞中都克隆存在，并且根据本发明的方法允许根据突变分析确定肿瘤细胞的比例。例如，关于胶质母细胞瘤的实例，可以确定IDH1或IDH2的突变。随后，可以形成其中已经检测甲基化的基因组DNA的比例与其中已经检测突变的基因组DNA的比例的比值。该比值可以用作恶性疾病中寻求的细胞亚型比例的量度。例如，可以确定可能对治疗有反应的胶质母细胞瘤的MGMT-甲基化细胞的比例。
例如，对于乳腺癌、前列腺癌、肺癌和头颈部癌症PITX2是非常高效的预后性甲基化标志物。在此组织中PITX2甲基化的相对量是预后性的。在某些实施方案中，根据本发明方法的甲基化分析因此包括PITX2中一个或多个CpG-二核苷酸的甲基化状态。优选地，该实施方案中的突变分析包括确定例如实施例11中所述的至少一个频发突变或频发突变基因的突变。尤其优选地，突变分析包含TP53的至少一部分。
根据频发突变例如TP53的突变对PITX2甲基化进行标准化，可以根据本发明更精确地确定例如在整个肿瘤DNA上的甲基化肿瘤DNA的比例，并从而例如对恶性疾病进行更有区别性的诊断、预后和预测。
序列表
<110> Dietrich, Dimo
<120> 确定基因组DNA中突变的方法、该方法的用途以及实施该方法的试剂盒
<130> DD2015-01-PCT
<150> 2015年12月10日 009 187.5
<151> 2015-07-16
<160> 94
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial)
<220>
<223> 用于扩增未转换的(SEQ ID NO:3)和亚硫酸氢盐转换的(SEQ ID NO:4)BRAFV600E基因座的正向引物
<400> 1
tcaattctta ccatccacaa aat 23
<210> 2
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial)
<220>
<223> 用于扩增未转换的(SEQ ID NO:3)和亚硫酸氢盐转换的(SEQ ID NO:4)BRAFV600E基因座的反向引物
<400> 2
agtaaaaata ggtgattttg gt 22
<210> 3
<211> 105
<212> DNA
<213> 包含V600E突变位点的人BRAF基因座
<400> 3
tcaattctta ccatccacaa aatggatcca gacaactgtt caaactgatg ggacccactc 60
catcgagatt tcactgtagc tagaccaaaa tcacctattt ttact 105
<210> 4
<211> 105
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial)
<220>
<223> 包含V600E突变位点的亚硫酸氢盐转换的(亚硫酸氢盐链II)BRAF基因座
<400> 4
tcaattctta ccatccacaa aataaatcca aacaactatt caaactaata aaacccactc 60
catcgaaatt tcactataac taaaccaaaa tcacctattt ttact 105
<210> 5
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial)
<220>
<223> 靶向包含V600E突变位点的亚硫酸氢盐转换的BRAF基因座(SEQ ID NO:4)的qPCR检测探针
<400> 5
attcaaacta ataaaaccca ctcca 25
<210> 6
<211> 112
<212> DNA
<213> 在甲基化分析过程中被靶向的人SHOX2基因座
<400> 6
gtcccctgga cagccaggta atctccgtcc cgcctgcccg accggggtcg cacgagcaca 60
ggcgcccacg ccatgttggc tgcccaaagg gctcgccgcc caagccgggc ca 112
<210> 7
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial)
<220>
<223> 用于扩增亚硫酸氢盐转换的(SEQ ID NO:10)SHOX2基因座的正向引物
<400> 7
gttttttgga tagttaggta at 22
<210> 8
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial)
<220>
<223> 用于扩增亚硫酸氢盐转换的(SEQ ID NO:10)甲基化的SHOX2基因座的反向引物
<400> 8
taacccgact taaacgacga 20
<210> 9
<211> 37
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial)
<220>
<223> 阻止正向引物(SEQ ID NO:7)与亚硫酸氢盐转换的非甲基化SHOX2基因座位结合的阻断剂寡核苷酸
<400> 9
taatttttgt tttgtttgtt tgattggggt tgtatga 37
<210> 10
<211> 112
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial)
<220>
<223> 源自基因组序列SEQ ID NO:6的亚硫酸氢盐转换(亚硫酸氢盐链I)的SHOX2基因座
<400> 10
gttttttgga tagttaggta attttcgttt cgtttgttcg atcggggtcg tacgagtata 60
ggcgtttacg ttatgttggt tgtttaaagg gttcgtcgtt taagtcgggt ta 112
<210> 11
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial)
<220>
<223> 靶向亚硫酸氢盐转换的甲基化SHOX2基因座(SEQ ID NO:10)的qPCR检测探针
<400> 11
ctcgtacgac cccgatcg 18
<210> 12
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial)
<220>
<223> 用于对亚硫酸氢盐转换的BRAF基因座SEQ ID NO:4进行Sanger测序的测序引物
<400> 12
cttaccatcc acaaaataaa tcca 24
<210> 13
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial)
<220>
<223> 用于扩增包含L858R突变位点的未转换的EGFR外显子21基因座SEQ ID NO:15的正向引物
<400> 13
gtttcagggc atgaactact tgg 23
<210> 14
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial)
<220>
<223> 用于扩增包含L858R突变位点的未转换的EGFR外显子21基因座SEQ ID NO:15的反向引物
<400> 14
cctggtgtca ggaaaatgct gg 22
<210> 15
<211> 208
<212> DNA
<213> 包含L858R突变位点的未转换的人EGFR外显子21基因座
<400> 15
gtttcagggc atgaactact tggaggaccg tcgcttggtg caccgcgacc tggcagccag 60
gaacgtactg gtgaaaacac cgcagcatgt caagatcaca gattttgggc tggccaaact 120
gctgggtgcg gaagagaaag aataccatgc agaaggaggc aaagtaagga ggtggcttta 180
ggtcagccag cattttcctg acaccagg 208
<210> 16
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial)
<220>
<223> 用于扩增包含L858R突变位点的亚硫酸氢盐转换的EGFR外显子21基因座SEQ IDNO:18的正向引物
<400> 16
gttttagggt atgaattatt tgga 24
<210> 17
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial)
<220>
<223> 用于扩增包含L858R突变位点的亚硫酸氢盐转换的EGFR外显子21基因座SEQ IDNO:18的反向引物
<400> 17
ccctaatatc aaaaaaatac taacta 26
<210> 18
<211> 209
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial)
<220>
<223> 源于包含L858R突变位点的SEQ ID NO:15的亚硫酸氢盐转换的EGFR外显子21基因座(亚硫酸氢盐链I)
<400> 18
gttttagggt atgaattatt tggaggatcg tcgtttggtg tatcgcgatt tggtagttag 60
gaacgtattg gtgaaaatat cgtagtatgt taagattata gattttgggt tggttaaatt 120
gttgggtgcg gaagagaaag aatattatgt agaaggaggt aaagtaagga ggtggtttta 180
ggttagttag tatttttttg atattaggg 209
<210> 19
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial)
<220>
<223> 用于扩增未转换的EGFR外显子19基因座SEQ ID NO:21的正向引物
<400> 19
tctctgtcat agggactctg gatc 24
<210> 20
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial)
<220>
<223> 用于扩增未转换的EGFR外显子19基因座SEQ ID NO:21的反向引物
<400> 20
cctgaggttc agagccatgg a 21
<210> 21
<211> 159
<212> DNA
<213> 未转换的人EGFR外显子19基因座
<400> 21
tctctgtcat agggactctg gatcccagaa ggtgagaaag ttaaaattcc cgtcgctatc 60
aaggaattaa gagaagcaac atctccgaaa gccaacaagg aaatcctcga tgtgagtttc 120
tgctttgctg tgtgggggtc catggctctg aacctcagg 159
<210> 22
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial)
<220>
<223> 用于扩增亚硫酸氢盐转换的EGFR外显子9基因座SEQ ID NO:24的正向引物
<400> 22
ttttttgtta tagggatttt ggattt 26
<210> 23
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial)
<220>
<223> 用于扩增亚硫酸氢盐转换的EGFR外显子9基因座SEQ ID NO:24的反向引物
<400> 23
taaacctaaa attcaaaacc ataaacc 27
<210> 24
<211> 164
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial)
<220>
<223> 源自SEQ ID NO:21的亚硫酸氢盐转换的EGFR外显子19基因座(亚硫酸氢盐链I)
<400> 24
ttttttgtta tagggatttt ggattttaga aggtgagaaa gttaaaattt tcgtcgttat 60
taaggaatta agagaagtaa tattttcgaa agttaataag gaaattttcg atgtgagttt 120
ttgttttgtt gtgtgggggt ttatggtttt gaattttagg ttta 164
<210> 25
<211> 28
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial)
<220>
<223> 用于扩增未转换的KRAS外显子4基因座SEQ ID NO:27的正向引物
<400> 25
gagagaaaaa ctgatatatt aaatgaca 28
<210> 26
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial)
<220>
<223> 用于扩增未转换的KRAS外显子4基因座SEQ ID NO:27的反向引物
<400> 26
tttgccttct agaacagtag acaca 25
<210> 27
<211> 178
<212> DNA
<213> 未转换的人KRAS外显子4基因座
<400> 27
gagagaaaaa ctgatatatt aaatgacata acagttatga ttttgcagaa aacagatctg 60
tatttatttc agtgttactt acctgtcttg tctttgctga tgtttcaata aaaggaattc 120
cataacttct tgctaagtcc tgagcctgtt ttgtgtctac tgttctagaa ggcaaatc 178
<210> 28
<211> 176
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial)
<220>
<223> 源自SEQ ID NO:27的亚硫酸氢盐转换的KRAS外显子4基因座(亚硫酸氢盐链I)
<400> 28
gagagaaaaa ttgatatatt aaatgatata atagttatga ttttgtagaa aatagatttg 60
tatttatttt agtgttattt atttgttttg tttttgttga tgttttaata aaaggaattt 120
tataattttt tgttaagttt tgagtttgtt ttgtgtttat tgttttagaa ggtaaa 176
<210> 29
<211> 28
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial)
<220>
<223> 用于扩增亚硫酸氢盐转换的KRAS外显子4基因座SEQ ID NO:28的正向引物
<400> 29
gagagaaaaa ttgatatatt aaatgata 28
<210> 30
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial)
<220>
<223> 用于扩增亚硫酸氢盐转换的KRAS外显子4基因座SEQ ID NO:28的反向引物
<400> 30
tttaccttct aaaacaataa acaca 25
<210> 31
<211> 168
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial)
<220>
<223> 源自SEQ ID NO:27的亚硫酸氢盐转换的KRAS外显子4基因座(亚硫酸氢盐链II)
<400> 31
gatttgtttt ttagaatagt agatataaaa taggtttagg atttagtaag aagttatgga 60
atttttttta ttgaaatatt agtaaagata agataggtaa gtaatattga aataaatata 120
gatttgtttt ttgtaaaatt ataattgtta tgttatttaa tatattag 168
<210> 32
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial)
<220>
<223> 用于扩增亚硫酸氢盐转换的KRAS外显子4基因座SEQ ID NO:31的正向引物
<400> 32
gatttgtttt ttagaatagt agatat 26
<210> 33
<211> 29
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial)
<220>
<223> 用于扩增亚硫酸氢盐转换的KRAS外显子4基因座SEQ ID NO:31的反向引物
<400> 33
ctaatatatt aaataacata acaattata 29
<210> 34
<211> 477
<212> DNA
<213> 感兴趣的人BRCA2区域(ROI)1
<400> 34
tatgccttaa caaaagtaat ccatagtcaa gatcttaagc atttttttcc ttatgatctt 60
taactgttct gggtcacaaa tttgtctgtc actggttaaa actaaggtgg gatttttttt 120
ttaaatagat ttaggaccaa taagtcttaa ttggtttgaa gaactttctt cagaagctcc 180
accctataat tctgaacctg cagaagaatc tgaacataaa aacaacaatt acgaaccaaa 240
cctatttaaa actccacaaa ggaaaccatc ttataatcag ctggcttcaa ctccaataat 300
attcaaagag caagggctga ctctgccgct gtaccaatct cctgtaaaag aattagataa 360
attcaaatta gacttaggta agtaatgcaa tatggtagac tggggagaac tacaaactag 420
gaatttaggc aaacctgtgt taaaatctta gctcattcat taattgtgtc atgctgg 477
<210> 35
<211> 555
<212> DNA
<213> 感兴趣的人BRCA2区域(ROI) 2
<400> 35
tcttagaata ctagaaatgt taataaaaat aaaacttaac aattttcccc tttttttacc 60
cccagtggta tgtgggagtt tgtttcatac accaaagttt gtgaaggtaa atattctacc 120
tggtttattt ttatgactta gtaattgaga atttgacaat agcgttatac ctttgccctg 180
agatttacaa atctgtacct agcattctgc ctcatacagg caattcagta aacgttaagt 240
gaaataaaga gtgaatgaaa aaataatatc cttaatgatc agggcatttc tataaaaaat 300
aaactatttt ctttcctccc agggtcgtca gacaccaaaa catatttctg aaagtctagg 360
agctgaggtg gatcctgata tgtcttggtc aagttcttta gctacaccac ccacccttag 420
ttctactgtg ctcataggta ataatagcaa atgtgtattt acaagaaaga gcagatgagg 480
ttgataattg tcatctctaa tacttctgtt aaaaggaaat atgaaaagaa aatattagat 540
aatgtctttg ataag 555
<210> 36
<211> 212
<212> DNA
<213> 感兴趣的人BRCA2区域(ROI) 3
<400> 36
tgtctgacaa aaaataagtt tttgcattct agtgataata tacaatacac ataaattttt 60
atcttacagt cagaaatgaa gaagcatctg aaactgtatt tcctcatgat actactgctg 120
taagtaaata tgacattgat tagactgttg aaattgctaa caattttgga atgccttgtt 180
aaattattta tcttacattt ttaatttcct aa 212
<210> 37
<211> 216
<212> DNA
<213> 感兴趣的人BRCA2区域(ROI) 4
<400> 37
actataattt ttgcagaatg tgaaaagcta tttttccaat catgatgaaa gtctgaagaa 60
aaatgataga tttatcgctt ctgtgacaga cagtgaaaac acaaatcaaa gagaagctgc 120
aagtcatggt aagtcctctg tttagttgaa ctacaggttt ttttgttgtt gttgttttga 180
tttttttttt ttgaggtgga gtcttgctct gtcacc 216
<210> 38
<211> 1199
<212> DNA
<213> 感兴趣的人BRCA2区域(ROI) 5
<400> 38
gttgtgagaa taatataaat tatatggctt ataaaatatt aatgtgcttc tgttttatac 60
tttaacagga tttggaaaaa catcagggaa ttcatttaaa gtaaatagct gcaaagacca 120
cattggaaag tcaatgccaa atgtcctaga agatgaagta tatgaaacag ttgtagatac 180
ctctgaagaa gatagttttt cattatgttt ttctaaatgt agaacaaaaa atctacaaaa 240
agtaagaact agcaagacta ggaaaaaaat tttccatgaa gcaaacgctg atgaatgtga 300
aaaatctaaa aaccaagtga aagaaaaata ctcatttgta tctgaagtgg aaccaaatga 360
tactgatcca ttagattcaa atgtagcaaa tcagaagccc tttgagagtg gaagtgacaa 420
aatctccaag gaagttgtac cgtctttggc ctgtgaatgg tctcaactaa ccctttcagg 480
tctaaatgga gcccagatgg agaaaatacc cctattgcat atttcttcat gtgaccaaaa 540
tatttcagaa aaagacctat tagacacaga gaacaaaaga aagaaagatt ttcttacttc 600
agagaattct ttgccacgta tttctagcct accaaaatca gagaagccat taaatgagga 660
aacagtggta aataagagag atgaagagca gcatcttgaa tctcatacag actgcattct 720
tgcagtaaag caggcaatat ctggaacttc tccagtggct tcttcatttc agggtatcaa 780
aaagtctata ttcagaataa gagaatcacc taaagagact ttcaatgcaa gtttttcagg 840
tcatatgact gatccaaact ttaaaaaaga aactgaagcc tctgaaagtg gactggaaat 900
acatactgtt tgctcacaga aggaggactc cttatgtcca aatttaattg ataatggaag 960
ctggccagcc accaccacac agaattctgt agctttgaag aatgcaggtt taatatccac 1020
tttgaaaaag aaaacaaata agtttattta tgctatacat gatgaaacat cttataaagg 1080
aaaaaaaata ccgaaagacc aaaaatcaga actaattaac tgttcagccc agtttgaagc 1140
aaatgctttt gaagcaccac ttacatttgc aaatgctgat tcaggtacct ctgtctttt 1199
<210> 39
<211> 4944
<212> DNA
<213> 感兴趣的人BRCA2区域(ROI) 6，优选用于甲基化分析
<400> 39
ttttatgttt aggtttattg cattcttctg tgaaaagaag ctgttcacag aatgattctg 60
aagaaccaac tttgtcctta actagctctt ttgggacaat tctgaggaaa tgttctagaa 120
atgaaacatg ttctaataat acagtaatct ctcaggatct tgattataaa gaagcaaaat 180
gtaataagga aaaactacag ttatttatta ccccagaagc tgattctctg tcatgcctgc 240
aggaaggaca gtgtgaaaat gatccaaaaa gcaaaaaagt ttcagatata aaagaagagg 300
tcttggctgc agcatgtcac ccagtacaac attcaaaagt ggaatacagt gatactgact 360
ttcaatccca gaaaagtctt ttatatgatc atgaaaatgc cagcactctt attttaactc 420
ctacttccaa ggatgttctg tcaaacctag tcatgatttc tagaggcaaa gaatcataca 480
aaatgtcaga caagctcaaa ggtaacaatt atgaatctga tgttgaatta accaaaaata 540
ttcccatgga aaagaatcaa gatgtatgtg ctttaaatga aaattataaa aacgttgagc 600
tgttgccacc tgaaaaatac atgagagtag catcaccttc aagaaaggta caattcaacc 660
aaaacacaaa tctaagagta atccaaaaaa atcaagaaga aactacttca atttcaaaaa 720
taactgtcaa tccagactct gaagaacttt tctcagacaa tgagaataat tttgtcttcc 780
aagtagctaa tgaaaggaat aatcttgctt taggaaatac taaggaactt catgaaacag 840
acttgacttg tgtaaacgaa cccattttca agaactctac catggtttta tatggagaca 900
caggtgataa acaagcaacc caagtgtcaa ttaaaaaaga tttggtttat gttcttgcag 960
aggagaacaa aaatagtgta aagcagcata taaaaatgac tctaggtcaa gatttaaaat 1020
cggacatctc cttgaatata gataaaatac cagaaaaaaa taatgattac atgaacaaat 1080
gggcaggact cttaggtcca atttcaaatc acagttttgg aggtagcttc agaacagctt 1140
caaataagga aatcaagctc tctgaacata acattaagaa gagcaaaatg ttcttcaaag 1200
atattgaaga acaatatcct actagtttag cttgtgttga aattgtaaat accttggcat 1260
tagataatca aaagaaactg agcaagcctc agtcaattaa tactgtatct gcacatttac 1320
agagtagtgt agttgtttct gattgtaaaa atagtcatat aacccctcag atgttatttt 1380
ccaagcagga ttttaattca aaccataatt taacacctag ccaaaaggca gaaattacag 1440
aactttctac tatattagaa gaatcaggaa gtcagtttga atttactcag tttagaaaac 1500
caagctacat attgcagaag agtacatttg aagtgcctga aaaccagatg actatcttaa 1560
agaccacttc tgaggaatgc agagatgctg atcttcatgt cataatgaat gccccatcga 1620
ttggtcaggt agacagcagc aagcaatttg aaggtacagt tgaaattaaa cggaagtttg 1680
ctggcctgtt gaaaaatgac tgtaacaaaa gtgcttctgg ttatttaaca gatgaaaatg 1740
aagtggggtt taggggcttt tattctgctc atggcacaaa actgaatgtt tctactgaag 1800
ctctgcaaaa agctgtgaaa ctgtttagtg atattgagaa tattagtgag gaaacttctg 1860
cagaggtaca tccaataagt ttatcttcaa gtaaatgtca tgattctgtt gtttcaatgt 1920
ttaagataga aaatcataat gataaaactg taagtgaaaa aaataataaa tgccaactga 1980
tattacaaaa taatattgaa atgactactg gcacttttgt tgaagaaatt actgaaaatt 2040
acaagagaaa tactgaaaat gaagataaca aatatactgc tgccagtaga aattctcata 2100
acttagaatt tgatggcagt gattcaagta aaaatgatac tgtttgtatt cataaagatg 2160
aaacggactt gctatttact gatcagcaca acatatgtct taaattatct ggccagttta 2220
tgaaggaggg aaacactcag attaaagaag atttgtcaga tttaactttt ttggaagttg 2280
cgaaagctca agaagcatgt catggtaata cttcaaataa agaacagtta actgctacta 2340
aaacggagca aaatataaaa gattttgaga cttctgatac attttttcag actgcaagtg 2400
ggaaaaatat tagtgtcgcc aaagagtcat ttaataaaat tgtaaatttc tttgatcaga 2460
aaccagaaga attgcataac ttttccttaa attctgaatt acattctgac ataagaaaga 2520
acaaaatgga cattctaagt tatgaggaaa cagacatagt taaacacaaa atactgaaag 2580
aaagtgtccc agttggtact ggaaatcaac tagtgacctt ccagggacaa cccgaacgtg 2640
atgaaaagat caaagaacct actctattgg gttttcatac agctagcggg aaaaaagtta 2700
aaattgcaaa ggaatctttg gacaaagtga aaaacctttt tgatgaaaaa gagcaaggta 2760
ctagtgaaat caccagtttt agccatcaat gggcaaagac cctaaagtac agagaggcct 2820
gtaaagacct tgaattagca tgtgagacca ttgagatcac agctgcccca aagtgtaaag 2880
aaatgcagaa ttctctcaat aatgataaaa accttgtttc tattgagact gtggtgccac 2940
ctaagctctt aagtgataat ttatgtagac aaactgaaaa tctcaaaaca tcaaaaagta 3000
tctttttgaa agttaaagta catgaaaatg tagaaaaaga aacagcaaaa agtcctgcaa 3060
cttgttacac aaatcagtcc ccttattcag tcattgaaaa ttcagcctta gctttttaca 3120
caagttgtag tagaaaaact tctgtgagtc agacttcatt acttgaagca aaaaaatggc 3180
ttagagaagg aatatttgat ggtcaaccag aaagaataaa tactgcagat tatgtaggaa 3240
attatttgta tgaaaataat tcaaacagta ctatagctga aaatgacaaa aatcatctct 3300
ccgaaaaaca agatacttat ttaagtaaca gtagcatgtc taacagctat tcctaccatt 3360
ctgatgaggt atataatgat tcaggatatc tctcaaaaaa taaacttgat tctggtattg 3420
agccagtatt gaagaatgtt gaagatcaaa aaaacactag tttttccaaa gtaatatcca 3480
atgtaaaaga tgcaaatgca tacccacaaa ctgtaaatga agatatttgc gttgaggaac 3540
ttgtgactag ctcttcaccc tgcaaaaata aaaatgcagc cattaaattg tccatatcta 3600
atagtaataa ttttgaggta gggccacctg catttaggat agccagtggt aaaatcgttt 3660
gtgtttcaca tgaaacaatt aaaaaagtga aagacatatt tacagacagt ttcagtaaag 3720
taattaagga aaacaacgag aataaatcaa aaatttgcca aacgaaaatt atggcaggtt 3780
gttacgaggc attggatgat tcagaggata ttcttcataa ctctctagat aatgatgaat 3840
gtagcacgca ttcacataag gtttttgctg acattcagag tgaagaaatt ttacaacata 3900
accaaaatat gtctggattg gagaaagttt ctaaaatatc accttgtgat gttagtttgg 3960
aaacttcaga tatatgtaaa tgtagtatag ggaagcttca taagtcagtc tcatctgcaa 4020
atacttgtgg gatttttagc acagcaagtg gaaaatctgt ccaggtatca gatgcttcat 4080
tacaaaacgc aagacaagtg ttttctgaaa tagaagatag taccaagcaa gtcttttcca 4140
aagtattgtt taaaagtaac gaacattcag accagctcac aagagaagaa aatactgcta 4200
tacgtactcc agaacattta atatcccaaa aaggcttttc atataatgtg gtaaattcat 4260
ctgctttctc tggatttagt acagcaagtg gaaagcaagt ttccatttta gaaagttcct 4320
tacacaaagt taagggagtg ttagaggaat ttgatttaat cagaactgag catagtcttc 4380
actattcacc tacgtctaga caaaatgtat caaaaatact tcctcgtgtt gataagagaa 4440
acccagagca ctgtgtaaac tcagaaatgg aaaaaacctg cagtaaagaa tttaaattat 4500
caaataactt aaatgttgaa ggtggttctt cagaaaataa tcactctatt aaagtttctc 4560
catatctctc tcaatttcaa caagacaaac aacagttggt attaggaacc aaagtgtcac 4620
ttgttgagaa cattcatgtt ttgggaaaag aacaggcttc acctaaaaac gtaaaaatgg 4680
aaattggtaa aactgaaact ttttctgatg ttcctgtgaa aacaaatata gaagtttgtt 4740
ctacttactc caaagattca gaaaactact ttgaaacaga agcagtagaa attgctaaag 4800
cttttatgga agatgatgaa ctgacagatt ctaaactgcc aagtcatgcc acacattctc 4860
tttttacatg tcccgaaaat gaggaaatgg ttttgtcaaa ttcaagaatt ggaaaaagaa 4920
gaggagagcc ccttatctta gtgg 4944
<210> 40
<211> 498
<212> DNA
<213> 感兴趣的人BRCA2区域(ROI) 7
<400> 40
atttatatgt gtactagtca ataaacttat atattttctc cccattgcag cacaactaag 60
gaacgtcaag agatacagaa tccaaatttt accgcacctg gtcaagaatt tctgtctaaa 120
tctcatttgt atgaacatct gactttggaa aaatcttcaa gcaatttagc agtttcagga 180
catccatttt atcaagtttc tgctacaaga aatgaaaaaa tgagacactt gattactaca 240
ggcagaccaa ccaaagtctt tgttccacct tttaaaacta aatcacattt tcacagagtt 300
gaacagtgtg ttaggaatat taacttggag gaaaacagac aaaagcaaaa cattgatgga 360
catggctctg atgatagtaa aaataagatt aatgacaatg agattcatca gtttaacaaa 420
aacaactcca atcaagcagt agctgtaact ttcacaaagt gtgaagaaga acctttaggt 480
attgtatgac aatttgtg 498
<210> 41
<211> 271
<212> DNA
<213> 感兴趣的人BRCA2区域(ROI) 8
<400> 41
aaatatgcat ttttgttttc acttttagat atgatacgga aattgataga agcagaagat 60
cggctataaa aaagataatg gaaagggatg acacagctgc aaaaacactt gttctctgtg 120
tttctgacat aatttcattg agcgcaaata tatctgaaac ttctagcaat aaaactagta 180
gtgcagatac ccaaaaagtg gccattattg aacttacaga tgggtggtat gctgttaagg 240
cccagttaga tcctcccctc ttagctgtct t 271
<210> 42
<211> 444
<212> DNA
<213> 感兴趣的人BRCA2区域(ROI) 9
<400> 42
ccatggaatc tgctgaacaa aaggaacaag gtttatcaag ggatgtcaca accgtgtgga 60
agttgcgtat tgtaagctat tcaaaaaaag aaaaagattc aggtaagtat gtaaatgctt 120
tgtttttatc agttttatta acttaaaaaa tgaccttact aacaaaatga ttataaatcc 180
agataaagta taaagttagt ttatatcaga gaagcaaaat ccactactaa tgcccacaaa 240
gagataatat aaaagaggat ctgtatttat tttgaaacaa acatttaaat gataatcact 300
tcttccattg catctttctc atctttctcc aaacagttat actgagtatt tggcgtccat 360
catcagattt atattctctg ttaacagaag gaaagagata cagaatttat catcttgcaa 420
cttcaaaatc taaaagtaaa tctg 444
<210> 43
<211> 138
<212> DNA
<213> 感兴趣的人BRCA2区域(ROI) 10
<400> 43
catctaacac atctataata acattctttt cttttttttc cattctagga cttgcccctt 60
tcgtctattt gtcagacgaa tgttacaatt tactggcaat aaagttttgg atagacctta 120
atgaggacat tattaagc 138
<210> 44
<211> 252
<212> DNA
<213> 感兴趣的人BRCA2区域(ROI) 11
<400> 44
gtgggtttgc aatttataaa gcagcttttc cacttatttt cttagaatat tgacatactt 60
tgcaatgaag cagaaaacaa gcttatgcat atactgcatg caaatgatcc caagtggtcc 120
accccaacta aagactgtac ttcagggccg tacactgctc aaatcattcc tggtacagga 180
aacaagcttc tggtaagtta atgtaaactc aaggaatatt ataagaagta tatatggagg 240
ccatcgtata tt 252
<210> 45
<211> 366
<212> DNA
<213> 感兴趣的人BRCA2区域(ROI) 12
<400> 45
ttactacata attatgatag gctacgtttt cattttttta tcagatgtct tctcctaatt 60
gtgagatata ttatcaaagt cctttatcac tttgtatggc caaaaggaag tctgtttcca 120
cacctgtctc agcccagatg acttcaaagt cttgtaaagg ggagaaagag attgatgacc 180
aaaagaactg caaaaagaga agagccttgg atttcttgag tagactgcct ttacctccac 240
ctgttagtcc catttgtaca tttgtttctc cggctgcaca gaaggcattt cagccaccaa 300
ggagttgtgg caccaaatac gaaacaccca taaagaaaaa agaactgaat tctcctcaga 360
tgactc 366
<210> 46
<211> 337
<212> DNA
<213> 感兴趣的人BRCA1区域 (ROI) 1 (BRCA1 "感兴趣的区域" (ROI) 1)
<400> 46
aggagctccc agggcctgga aaggccactt tgtaagctca ttcttggggt cctgtggctc 60
tgtacctgtg gctggctgca gtcagtagtg gctgtggggg atctggggta tcaggtaggt 120
gtccagctcc tggcactggt agagtgctac actgtccaac acccactctc gggtcaccac 180
aggtgcctca cacatctgcc caattgctgg agacagagaa cacaagcaga gattagtgtc 240
aattcattct cctggactag gctctaatca atcgactcca gggtcctggt tgtatgagtt 300
cttaggatta atgaggtaga agctaatttt ttttttt 337
<210> 47
<211> 278
<212> DNA
<213> 感兴趣的人BRCA1区域 (ROI) 2 (BRCA1 "感兴趣的区域" (ROI) 2)
<400> 47
tgtgcagttc tcaaatcctt acccatccct tacagatgga gtcttttggc acaggtatgt 60
gggcagagaa gacttctgag gctacagtag gggcatccat agggactgac aggtgccagt 120
cttgctcaca ggagagaata ttgtgtcctc cctctctgac agggcaccca atacttactg 180
tgccaagggt gaatgatgaa agctccttca ccacagaagc accacacagc tgtaccatcc 240
attccagttg atctaaaatg gacatttaga tgtaaaat 278
<210> 48
<211> 150
<212> DNA
<213> 感兴趣的人BRCA1区域 (ROI) 3 (BRCA1 "感兴趣的区域" (ROI) 3)
<400> 48
tgcttataat actccactat gtaagacaaa ggctggtgct ggaactctgg ggttctccca 60
ggctcttacc tgtgggcatg ttggtgaagg gcccatagca acagatttct agccccctga 120
agatctggaa gaagagagga agagagaggg 150
<210> 49
<211> 128
<212> DNA
<213> 感兴趣的人BRCA1区域 (ROI) 4 (BRCA1 "感兴趣的区域" (ROI) 4)
<400> 49
aaggggagtg gaatacagag tggtggggtg agatttttgt caacttgagg gagggagctt 60
tacctttctg tcctgggatt ctcttgctcg ctttggacct tggtggtttc ttccattgac 120
cacatctc 128
<210> 50
<211> 704
<212> DNA
<213> 感兴趣的人BRCA1区域 (ROI) 5 (BRCA1 "感兴趣的区域" (ROI) 5)
<400> 50
atatgactga atgaatatct ctggttagtt tgtaacatca agtacttacc tcattcagca 60
tttttctttc tttaatagac tgggtcaccc ctaaagagat catagaaaag acaggttaca 120
tacagcagaa gaacgtgctc ttttcacgga gatagagagg tcagcgattc acaaaagagc 180
acaggaagaa tgacagagga gaggtccttc cctctaaagc cacagccctt taataaggct 240
tgtagcagca gtttccttct ggagacagag ttgatgttta atttaaacat tataagtttg 300
cctgctgcac atggattcct gccgactatt aaataaatcc ctagctcata tgctaacatt 360
gctaggagca gattaggtcc tattagttat aaaagagacc cattttccca gcatcaccag 420
cttatctgaa caaagtgata ttaaagataa aagtagttta gtattacaat taaagacctt 480
ttggtaactc agactcagca tcagcaaaaa ccttaggtgt taaacgttag gtgtaaaaat 540
gcaattctga ggtgttaaag ggaggagggg agaaatagta ttatacttac agaaatagct 600
aactacccat tttcctcccg caattcctag aaaatatttc agtgtccgtt cacacacaaa 660
ctcagcatct gcagaatgaa aaacactcaa aggattagaa gttg 704
<210> 51
<211> 243
<212> DNA
<213> 感兴趣的人BRCA1区域 (ROI) 6 (BRCA1 "感兴趣的区域" (ROI) 6)
<400> 51
tacaggcatg cgccaccgtg cctcgcctca tgtggtttta tgcagcagat gcaaggtatt 60
ctgtaaaggt tcttggtata cctgttttca taacaacatg agtagtctct tcagtaatta 120
gattagttaa agtgatgtgg tgttttctgg caaacttgta cacgagcatc tgaaattaaa 180
tcaaatattc cattatcatg agttacctct agcacacagc tcagaatact agttattcca 240
cca 243
<210> 52
<211> 306
<212> DNA
<213> 感兴趣的人BRCA1区域 (ROI) 7 (BRCA1 "感兴趣的区域" (ROI) 7)
<400> 52
acctacataa aactctttcc agaatgttgt taagtcttag tcattaggga gatacatatg 60
gatacactca caaattcttc tggggtcagg ccagacacca ccatggacat tcttttgttg 120
accctttctg ttgaagctgt caattctggc ttctccctgc tcacactttc ttccattgca 180
ttatacccag cagtatcagt agtatgagca gcagctggac tctgggcaga ttctgcaact 240
ttcaattggg gaactttcaa tgcagaggtt gaagatggta tgttgccaac acgagctgac 300
tctggg 306
<210> 53
<211> 346
<212> DNA
<213> 感兴趣的人BRCA1区域 (ROI) 8 (BRCA1 "感兴趣的区域" (ROI) 8)
<400> 53
ttaagtataa caaaagtgtc catgatagac tagtacatct aaaagttggt taaccagaat 60
atctttatgt aggattcaga gtaaaatcaa agtgtttgtt ccaatacagc agatgaaata 120
ttacctagat cttgccttgg caagtaagat gtttccgtca aatcgtgtgg cccagactct 180
tccagctgtt gctcctccac atcaacaacc ttaatgagct cctcttgaga tgggtagttt 240
ctattctgaa gactcccaga gcaactgtgc atgtaccacc tatcatctaa tgatgggcat 300
ttagaagggg atgacctaga aagataaatg gaaggagaaa accatc 346
<210> 54
<211> 386
<212> DNA
<213> 感兴趣的人BRCA1区域 (ROI) 9 (BRCA1 "感兴趣的区域" (ROI) 9)
<400> 54
tcatgttgta gcttatgtta taggttcaaa aaacctatat aggattaaac aaaagaagta 60
tcctagagca ataaaagtgt ataaatgcct gtatgcaaaa aactggagaa agtatggtga 120
aaaaaattaa caatcagagt tcaatataaa taaagatgtc agataccaca gcatctttac 180
attgatgttt cttacctttc cactcctggt tctttatttt tactggtaga actatctgca 240
gacacctcaa acttgtcagc agaaaggcct tctggattct ggcttatagg gtattcacta 300
cttttctgtg aagttaatac tgctttaaat ggaatgagaa aacaaatcta ctttactgct 360
ttgttctgat agtgataatt caggtt 386
<210> 55
<211> 262
<212> DNA
<213> 感兴趣的人BRCA1区域 (ROI) 10 (BRCA1 "感兴趣的区域" (ROI) 10)
<400> 55
taggtcctta ctcttcagaa ggagataaag gggaaggaaa gaattttgct taagatatca 60
gtgtttggcc aacaatacac acctttttct gatgtgcttt gttctggatt tcgcaggtcc 120
tcaagggcag aagagtcact tatgatggaa gggtagctgt tagaaggctg gctcccatgc 180
tgttctaaca cagcttctag ttcagccatt tcctgctgga gctttatcag gttatgttgc 240
atggtatccc tctgcttcaa aa 262
<210> 56
<211> 3899
<212> DNA
<213> 感兴趣的人BRCA1区域 (ROI) 11 ，优选用于突变分析
<400> 56
accacacaca cgcatgtgca cacacacaca cgctttttac ctgagtggtt aaaatgtcac 60
tctgagagga tagccctgag cagtcttcag agacgcttgt ttcactctca cacccagatg 120
ctgcttcacc ttaaataaca aaaacagagg ttcagatgta aaagcagact ataaacgctg 180
caacttgctg tgtctttttc ttctcattgg caggactgga tttactttca tgtcacacaa 240
aatgattaaa ttccttgctt tgggacacct ggatttgctt ttataaaatg aaaccagaag 300
taagtccacc agtaattagg atgttaaagc tcattcagtc aaagatgacg tcctagctgt 360
gtgaaggact tttttctatg aaaagcacct taggaggaac atgtttcaag tttaagaagc 420
agttccttta actatacttg gaaatttgta aaatgtgctc cccaaaagca taaacattta 480
gctcacttct ataaatagac tggggcaaac acaaaaacct ggttccaata cctaagtttg 540
aatccatgct ttgctcttct tgattatttt cttccaagcc cgttcctctt tcttcatcat 600
ctgaaaccaa ttccttgtca ctcagaccaa ctccctggct ttcagactga tgcctcattt 660
gtttggaaga accaatcaag aaaggatcct gggtgtttgt atttgcagtc aagtcttcca 720
attcactgca ctgtgaagaa aacaagctag cagaacattt tgtttcctca ctaaggtgat 780
gttcctgaga tgcctttgcc aatattacct ggttactgca gtcatttaag ctattcttca 840
atgataataa attctcctct gtgttcttag acagacactc ggtagcaacg gtgctatgcc 900
tagtagactg agaaggtata ttgtttactt taccaaataa caagtgttgg aagcagggaa 960
gctcttcatc ctcactagat aagttctctt ctgaggactc taatttcttg gcccctcttc 1020
ggtaaccctg agccaaatgt gtatgggtga aagggctagg actcctgcta agctctcctt 1080
tctggacgct tttgctaaaa acagcagaac tttccttaat gtcattttca gcaaaactag 1140
tatcttcctt tatttcacca tcatctaaca ggtcatcagg tgtctcagaa caaacctgag 1200
atgcatgact acttcccata ggctgttcta agttatctga aatcagatat ggagagaaat 1260
ctgtattaac agtctgaact acttcttcat attcttgctt ttttatttca ggatgcttac 1320
aattacttcc aggaagactt tgtttataga cctcaggttg caaaacccct aatctaagca 1380
tagcattcaa ttttggccct ctgtttctac ctagttctgc ttgaatgttt tcatcactgg 1440
aacctatttc attaatactg gagcccactt cattagtact ggaacctact tcattaatat 1500
tgcttgagct ggcttcttta aaaacatttt ctctaatgtt attacggcta attgtgctca 1560
ctgtacttgg aatgttctca tttcccattt ctctttcagg tgacattgaa tgttcctcaa 1620
agttttcctc tagcagattt ttcttacatt tagttttaac aaatgacttg atgggaaaaa 1680
gtggtggtat acgatatggg ttttgtaaaa gtccatgttt atttggagta atgagtccag 1740
tttcgttgcc tctgaactga gatgatagac aaaacctaga gcctcctttg atactacatt 1800
tggcattatc aactggctta tctttctgac caaccacagg aaagcctgca gtgatattaa 1860
ctgtctgtac aggcttgata ttagactcat tctttccttg attttcttcc ttttgttcac 1920
attcaaaagt gacttttgga ctttgtttct ttaaggaccc agagtgggca gagaatgttg 1980
cacattcctc ttctgcattt cctggatttg aaaacggagc aaatgactgg cgctttgaaa 2040
ccttgaatgt attctgcaaa tactgagcat caagttcact ttcttccatt tctatgcttg 2100
tttcccgact gtggttaact tcatgtccca atggatactt aaagccttct gtgtcatttc 2160
tattatcttt ggaacaacca tgaattagtc ccttggggtt ttcaaatgct gcacactgac 2220
tcacacattt atttggttct gtttttgcct tccctagagt gctaacttcc agtaacgaga 2280
tactttcctg agtgccataa tcagtaccag gtaccaatga aatactgcta ctctctacag 2340
atctttcagt ttgcaaaacc ctttctccac ttaacatgag atctttgggg tcttcagcat 2400
tattagacac tttaactgtt tctagtttct cttctttttc ttctcttgga aggctaggat 2460
tgacaaattc tttaagttca ctggtatttg aacacttagt aaaagaacca ggtgcatttg 2520
ttaacttcag ctctgggaaa gtatcgctgt catgtctttt acttgtctgt tcatttggct 2580
tgttactctt cttggctcca gttgcaggtt ctttaccttc catgagttgt aggtttctgc 2640
tgtgcctgac tggcatttgg ttgtactttt ttttctttat ctcttcactg ctagaacaac 2700
tatcaatttg caattcagta caattaggtg ggcttagatt tctactgact actagttcaa 2760
gcgcatgaat atgcctggta gaagacttcc tcctcagcct attcttttta ggtgcttttg 2820
aattgtggat atttaattcg agttccatat tgcttatact gctgcttata ggttcagctt 2880
tcgttttgaa agcagattct ttttcgagtg attctattgg gttaggattt ttctcattct 2940
gaatagaatc accttttgtt ttattctcat gaccactatt agtaatattc atcacttgac 3000
cattctgctc cgtttggtta gttccctgat ttatcatttc aggagtcttt tgaactgcca 3060
aatctgcttt cttgataaaa tcctcaggat gaaggcctga tgtaggtctc cttttacgct 3120
ttaatttatt tgtgagggga cgctcttgta ttatctgtgg ctcagtaaca aatgctccta 3180
taattagatt ttcagttaca tggcttaagt tggggaggct tgccttcttc cgataggttt 3240
tcccaaatat tttgtcttca atattactct ctactgattt ggagtgaact ctttcacttt 3300
tacatattaa agcctcatga ggatcactgg ccagtaagtc tattttctct gaagaaccag 3360
aatattcatc tacctcattt agaacgtcca atacatcagc tactttggca tttgattcag 3420
actccccatc atgtgagtca tcagaaccta acagttcatc acttctggaa aaccactcat 3480
taactttctg aatgctgcta tttagtgtta tccaaggaac atcttcagta tctctaggat 3540
tctctgagca tggcagtttc tgcttattcc attcttttct ctcacacagg ggatcagcat 3600
tcagatctac ctttttttct gtgctgggag tccgcctatc attacatgtt tccttacttc 3660
cagcccatct gttatgttgg ctccttgcta agccaggctg tttgctttta ttacagaatt 3720
cagccttttc tacattcatt ctgtctttag tgagtaataa actgctgttc tcatgctgta 3780
atgagctggc atgagtattt gtgccacatg gctccacatg caagtttgaa acagaactac 3840
cctgatactt ttctggatgc ctctcagctg cacgcttctc agtggtgttc aaatcatta 3899
<210> 57
<211> 1100
<212> DNA
<213> 感兴趣的人BRCA1区域 (ROI) 12 (BRCA1 "感兴趣的区域" (ROI) 12)
<400> 57
accccgtctc tactaaaaat acaaaaatta gcctggcatg gtggcgcgtg cctgtaatcc 60
cagctactaa gggggctaag gcaggaggac tgcttctagc ctgggccaca gagcaagact 120
ccatctcaaa aaaaaaaaag aaaaaaaaaa gaaaagaaga agaagaagaa gaagaaaaca 180
aatggtttta ccaaggaagg attttcgggt tcactctgta gaagtctttt ggcacggttt 240
ctgtagccca tactttggat gatagaaact tcatctttta gatgttcagg agagttattt 300
tccttttttg caaaattata gctgtttgca tctgtaaaat acaagggaaa acattatgtt 360
tgcagttaga gaaaaatgta tgaattataa tcaaagaaac caagagaaac cctatgtatg 420
ctctttgttg tgttaagaca atgcattaag gttacctgtg atttttttta aaaatcaaat 480
tttaaaaaat caactggaaa ttttactcct aggaaacaaa aacaaataca cagaccatca 540
aagttattta gagtccttgt tttctacctt aacactaaga aatttgccta tcaatactgt 600
atttcactaa agctaagaca ccaacaatgt aagttgcact attattttct gtatcactaa 660
gaaagaaagc acacaaatta aacaaatgac acaccctcaa tagtaaaatg ttcccaattt 720
cagagatgtt aagatgtgaa aaatgtgcac cttacgattg ataaaataag gtgtgagacc 780
agtgggagta attttttaaa aatagattac agatacagaa ctaaaattaa cctagactaa 840
aaggtcttat caccacgtca tagaaagtaa ttgtgcaaac ttcctgagtt ttcatggaca 900
gcacttgagt gtcattcttg ggatattcaa cacttacact ccaaacctgt gtcaagctga 960
aaagcacaaa tgattttcaa tagctcttca acaagttgac taaatctcgt actttcttgt 1020
aggctcctga aattaaattg tttgagaaac acactcagca agtgattatc aaccttttaa 1080
ggacactaaa ataagaaaag 1100
<210> 58
<211> 101
<212> DNA
<213> 感兴趣的人BRCA1区域 (ROI) 13 (BRCA1 "感兴趣的区域" (ROI) 13)
<400> 58
tcctactgtg gttgcttcca acctagcatc attaccaaat tatatacctt ttggttatat 60
cattcttaca taaaggacac tgtgaaggcc ctttcttctg g 101
<210> 59
<211> 1229
<212> DNA
<213> 感兴趣的人BRCA1区域 (ROI) 14 (BRCA1 "感兴趣的区域" (ROI) 14)
<400> 59
tgtaaaacac cataaaaatt aatcttaagg ccgggcgcgg tggctcacgc ctgtaatccc 60
agcactttgg gaggccgagg tgggcggatc acgaggtcag gaagtggaga ccatcctggc 120
taacacggtg aaaccccgtc tctactaaaa atacaaaaaa ttagccgggc gtggtggtgg 180
acgcctgtag tcccagctac ttggggggcc gaggcaggag aatggcgtga acccgggagg 240
cggagcttgc agtgagccga gatggcgcca ctgcactccg gcctgggtga aagagcgaga 300
ctccgtctca aaaacaaaac aaacaaaaat taatcttaag ccaggcgcag tggctcacgc 360
cagcactttg gaaggccgag gcgggtggat cacgagatca ggacttcaag accagcctga 420
ccaacgtgat gaaaccctat ctctactaaa aatacaaaat tagccggcca cggtggcgtg 480
cgcctataat cccagctact caggaggctg aggcaggaga agcgcttgaa cttgaacctg 540
gcaggcggag gttgcagtga gccaagatgg cgccactgca ctccagcctg ggcgacagag 600
ccagactcca accccccacc ccgaaaaaaa aaggtccagg ccgggcgcag tggctcagga 660
ctgtaatccc agcactttgg aaggctgagg cgggtggatc acaaggtcag gagatcgaga 720
ccatcttggc taacatggtg aaaccccgtc tctactaaaa atacaaaaaa ttagccgggc 780
atagtggtgg gcgcctgtag tcccagctac tcgggaggct gaggcaggag aatggcctga 840
acccgggagg cggagctggc agtgagccaa gatcgtgcca ctgcactcca gcctaggcag 900
cagagcgaga ccgtgtctca aaaaaacaaa acaaaacaaa acaaaaagtc tgggagcggt 960
ggctcacgcc tgtaatccca gcactttcgg aggccaaggc aggaggatca cctgaggtca 1020
ggagttcgag accaacctga ccaatatgga gaaaccctgt ctctactaaa aatacaaaat 1080
tagctggtgt gatggcacat gcctgcaatc ccaggtactc cggaggctga ggcagcagaa 1140
ttgcttgaac ccgggaggtg gaggttgtag tgagccgaga ttgtgccact gcactccagc 1200
ctgggcaaca agagccaaag tctgtctca 1229
<210> 60
<211> 1369
<212> DNA
<213> 感兴趣的人BRCA1区域 (ROI) 15 (BRCA1 "感兴趣的区域" (ROI) 15)
<400> 60
agcatggcca acatagcaaa accctatctc tacaacagaa aaatacaaga atggctggac 60
gcagtggctt atgcctgtaa tcctagcact ttgggaggcc caggcgggtg gatcacaagg 120
tcaggagatc aagactatcc tggctaacac ggtgaaatcc cgcctctact aaaaaagaaa 180
aaaaaataca aaaaattagc cgggcgtggt agtgggtgct tgtagtccca gctattcagg 240
aggctcaggc agaagaatgg catgaacccg ggaggcagag tttgcagtga gctgagatcg 300
cgccactgca ctccagcctg ggcaacagag caagactcca tctcaaaaaa agaaaaaaaa 360
atacaaaaat tagctgggca tggtggtgca cacctatcgt ccctgctact ctggaggctg 420
aggtgggagg attgcttgag cctgacgagg ttgaggctgc agtgagctgt gatagcacca 480
ctgcactcca gcctctcgac agagatccta tataaaaaaa aaacctctgc atttcattgt 540
atgtaaataa gtatgtaatt tcattgtatg tacagagcca gtttcaaaca aaggttcttc 600
caaataccta tcctctcaac gacaccgatc atccatgttt tttttttttt tttttttttt 660
ttgagatgga gtttagctct gtcgctggag ttcagtggtg ccatattggc tcacagcaac 720
atctgcctcc tggttcaagt gattctcctg cctcagcctc ctgagtagct gggattacag 780
gcacatgcca ctacgcccag ctaatttttg tatttttagt ggagaggggg tttcaccatg 840
ttggccagga tggtctcgat ctcctgacct cgtgatccta ccaccttggc ctcccaaagt 900
gctgggatta caggcataag ccaccgccct cggcctcatc catgatttta ttttgccatt 960
tcaagtgatg gagcttgttt tagagctgga agaaaagcca aaatgccagt taatctaaac 1020
tagattcctg ccccagtgca gaaccaatca agacagagtc cctgtctttc ccggaccaca 1080
ggatttgtgt tgaaaaggag aggagtggga gaggcagagt ggatggagaa caaggaatca 1140
ttttctatat ttttaaagtt cttcagttaa gaaaatcagc aattacaata gcctaatctt 1200
actagacatg tcttttcttc cctagtatgt aaggtcaatt ctgttcattt gcataggaga 1260
taatcatagg aatcccaaat taatacactc ttgtgctgac ttaccagatg ggacactcta 1320
agattttctg catagcatta atgacatttt gtacttcttc aacgcgaag 1369
<210> 61
<211> 1308
<212> DNA
<213> 感兴趣的人BRCA1区域 (ROI) 16，优选用于甲基化分析
<400> 61
aatcaacaac gaccaaacca acaccaatca aggcctcccc gcccctaacc tttcccagtg 60
acctgctctc atctctggat cctcctcaag cacatccctg ccggcagcat ctgttactac 120
tgacgctcct ctacttccct cttgcgcttt ctcaatggcg caaatggatc cagttcttaa 180
gttctccctc ccacaaaatc ctgtctcctc cccttcccag acatattcct ggcacctctt 240
cttccacaag gtcccatcct ctcatacata ccagccggtg ttttttgttt tgttttgttt 300
tgttttgttt tgagacagtc tcgctctgtc gcccaggctg gagtgcaatg gcgcgatctc 360
ggctcactgc aacctccgcc tcccgggttc tagcgattct cctgcctcag cctcctgagt 420
agctggagcg gcaccacgcc cggctaattt ttgtattttt agtagagacg gagtttcacc 480
acgttggtca ggctggtctg gaactcctga cctcatgacc agccgacgtt tttaaagaca 540
tagtgtcccc ctcaaggcat attccagttc ctatcacgag gattccccca cggacactca 600
gtgccccctt cctgatcctc agcgcttccc tcgcgaccta caaactgccc ccctccccag 660
ggttcacaac gccttacgcc tctcaggttc cgcccctacc ccccgtcaaa gaatacccat 720
ctgtcagctt cggaaatcca ctctcccacg ccagtacccc agagcatcac ttgggccccc 780
tgtccctttc ccgggactct actaccttta cccagagcag agggtgaagg cctcctgagc 840
gcaggggccc agttatctga gaaaccccac agcctgtccc ccgtccagga agtctcagcg 900
agctcacgcc gcgcagtcgc agttttaatt tatctgtaat tcccgcgctt ttccgttgcc 960
acggaaacca aggggctacc gctaagcagc agcctctcag aatacgaaat caaggtacaa 1020
tcagaggatg ggagggacag aaagagccaa gcgtctctcg gggctctgga ttggccaccc 1080
agtctgcccc cggatgacgt aaaaggaaag agacggaaga ggaagaattc tacctgagtt 1140
tgccataaag tgcctgccct ctagcctcta ctcttccagt tgcggcttat tgcatcacag 1200
taattgctgt acgaaggtca gaatcgctac ctattgtcca aagcagtcgt aagaagaggt 1260
cccaatcccc cactctttcc gccctaatgg aggtctccag tttcggta 1308
<210> 62
<211> 1411
<212> DNA
<213> 感兴趣的人BRCA1区域 (ROI) 17 (BRCA1 "感兴趣的区域" (ROI) 17)
<400> 62
atgcgttgcg gaatgaaagg tcttcgccac agtgttcctt agaaactgta gtcttatgga 60
gaggaacatc caataccaga gcgggcacaa ttctcacgga aatccagtgg atagattgga 120
gacctgtgcg cgcttgtact tgtcaacagt tatggactgg agtgttatgt tttcgtattt 180
tgaaagcaga aactaggcct taaaaagata cgtacaactc tttagggaga ctacaattcc 240
catccagccc caggagtctg gggcaagtag tcttgtaagg tcagtggcct gcggggacgc 300
agtgagcgcc gaatttgcct ggggcagggg aaatgcgctc tggcccatgt ctgcgcactc 360
gtagttccac ccctcagccc cagtgtttgt tatttttcgg gttcagcttg cttttgcccc 420
gtctccgtcg acgcaatcgc caccagtcaa tggggtggtc gttttgaggg acaagtggta 480
agagccaatc ttcttggcga aaacgcggag aaacgggact agttactgtc tttgtccgcc 540
atgttagatt caccccacag agatagcggc agagctggca gcggacggtc tttgcattgc 600
cgcctcccca gggggcggga agctggtaag gaagcagcct gggttagcta ggggtggggt 660
cacgtcacac taagagggtt tggagaagtt caagggagga atcctgcaaa gaagaggggc 720
gactttttcc gtgtctccgg acagctaatc gttttagtga caggatgaga gagcccttcg 780
tgttctgagg gaccgagtgg gcgaaaagcg ccggagagtt ggagagtctg tggttcagaa 840
tgcgaggtga caacgtgcta gcagccctcg ctcgctctcg gcgcctcctc ggccttggcg 900
tccattctgg ccgtgctgga ggagcccttc agcccgccac tgcgctgtgg gggcccctct 960
ctgggctggc cgaagccaga gccggctccc tctgcttgcg gggaagtgtg gagggagagg 1020
cgggtgtggg aactggggct gcgcgcagcg ctcgccagcc agcgcgagtt ccaggtgggc 1080
gcgggctcag cgggccccgc acccccggcc ccgggcagtc aggggcctag cacccgggcc 1140
agcagctgca gagggtgcgc cgggtccccc agcactgccg gcccgcctgc accccgcttg 1200
aattctcacc gggccccagc cgccctgcac agggcaaggc tcaggacctg cagcccgcca 1260
tgcccgagcc ccctcccaac ccctgtgagc tccagcgtgg cctgagcctc cccgacgggc 1320
accgccccct gctcctcagc gcccggtccc atcgactgcc caagggctga gaggagtgca 1380
ggcgcccggc acagccctgc gcaggatcca c 1411
<210> 63
<211> 2166
<212> DNA
<213> 感兴趣的人BRCA1区域 (ROI) 18 (BRCA1 "感兴趣的区域" (ROI) 18)
<400> 63
ggatcacgag gtcaagagat cgagaccatc ctggctaaca cagtgaaacc ccgactctac 60
taaaaagaca aaatattagc tgggtgcggt ggtgggtgcc tgtaatcccc tctactgggg 120
aggttgaggc aggagaatgg cgtgaacccg ggaggcggag cttgcagtga gcccagattg 180
caccactgca ttccagcctg ggtgacagag ggagactcca tctcaaaaaa aaaaaaaaaa 240
aaaaaaaaaa atgcaggctg cctgagccag cagcagcaac ccgctctggt ctccttccac 300
gctgtggaag ctttgttctt gtgctctttg caataaatct tgctgctgct cactctttgg 360
gtccgcatag catttatctg ctggtaacac cgaccgcaga ggtctgcagc ttcactcctg 420
aagccagcga gaccacgaac ccaccaggag gaatgaacaa ctccagacgg gaggaacgaa 480
caaactccag acatgccgcc ttaagagctg taacactcac cgcaaaggtc tgcagcttca 540
ctcctgaagc cagcgagacc acgaatccac cagaaggagg taactctgaa cacgtccgaa 600
catcagaagg aacaaactct ggacacatca tctttaagaa ctgtaccact caccgtgagg 660
gtccgcaact tcattcttga agtcagtgag accaagaacc caccaatttc ggacacaaga 720
acatccggct tctactgatg gaaggccacg actcctcagt agaaagaggg cccaggcaaa 780
gaaaatgaga gagagtcctt ggggtggtga cactatcttg ggaacatgga gtgctaggaa 840
acgataactg gaagactagg atgaaatctg caagttaaaa aatgacacta cccatatatc 900
cttctcatcc cattctcctt ttttcgagac cccgttaaag agatcttggt tagggacctt 960
tggttttgga aaggcactgt ttctcctttt tgtcaaacac tcaactttca ggccacactt 1020
tttttttttt tttcgagaca aagtctcgct ttctcaaaga ccagcccagg ctggtcttga 1080
actcctgagc tcaagcgatc ctcctgcctt ggcctcccaa agtgctggga ttacaggcat 1140
gagccaccac tcccggcctc agcttggata acttggcttg tacaggcctc tggtggagac 1200
agtaaccaaa gttcgggttg ccaggtttgt ttcattaaag ggattttgtt gaggctgaaa 1260
gaaaaaaaaa tcgatgtgga ggaaaagcta acttgtgcca agacaaggtg agtcagtcac 1320
atggacttaa caataatgtc aattatgaaa gctgaaggcc taggacccag ctatctgact 1380
ctactggctg tagacctaag gagcaggtag ggttaaccat agctttcgtg tttacacacg 1440
ttcaagatta atgctcttgc tgaaagaatt tttttacatg ccagccaaag agagttcctt 1500
atggagacct ggatatggtc cagctaagct agaatctccc acttcctgtt ttctcttagt 1560
tggcccacca gctggaggag ctccagaata tctaaattaa tttccaattg tgtaatttga 1620
gaaaaagaga cgaagattaa tttccctaac gagtagggaa gtgtgtttct tttttttctt 1680
ttttttttga gactgagtct cgctctgtcg cccagcctga agtgcagtgg cacgatcgcg 1740
gctagtgcac tgcgaactct gtctcccggg ttcacgccat tctcctgcct cagcctcccg 1800
agtagctggg actacaggca cccgccatca cgcccagcta attttttgtg tttttagtag 1860
agatgggggt ttcaccgcgt tagccaggat gacctcgatc tcctgacctc gtgatctgcc 1920
ttcctcggcc tcccaaagtg ctgggattat aggcgtgagc caccgcacct ggcaggaagt 1980
gtttcttaaa gttggaaagt ggtatttcag aatatccgct tttggcagac tgagtcagtc 2040
acttcatttt cctgattttt tgcctaaggt cctggtgaat tgacaaagat tctgcccaaa 2100
ttttaacgac cccagtaatt acatgtcata tgaatgaata cttgacgtca gcaggactgc 2160
gttttg 2166
<210> 64
<211> 99
<212> DNA
<213> 感兴趣的人EGFR区域 (ROI) 1, 外显子19 (EGFR "感兴趣的区域" (ROI) 1,外显子19)
<400> 64
ggactctgga tcccagaagg tgagaaagtt aaaattcccg tcgctatcaa ggaattaaga 60
gaagcaacat ctccgaaagc caacaaggaa atcctcgat 99
<210> 65
<211> 156
<212> DNA
<213> 感兴趣的人EGFR区域 (ROI) 2, 外显子21 (EGFR "感兴趣的区域" (ROI) 2,外显子21)
<400> 65
ggcatgaact acttggagga ccgtcgcttg gtgcaccgcg acctggcagc caggaacgta 60
ctggtgaaaa caccgcagca tgtcaagatc acagattttg ggctggccaa actgctgggt 120
gcggaagaga aagaatacca tgcagaagga ggcaaa 156
<210> 66
<211> 2728
<212> DNA
<213> 感兴趣的人EGFR区域 (ROI) 3, 外显子20 (EGFR "感兴趣的区域" (ROI) 3,外显子20)
<400> 66
ttgcatcggt actgaacata tacggacttt ttttcttgtc attattccct aaacaataca 60
gcataacaat tattcacata gcatttgcac tgtattaggt actataggta atcaggagat 120
gctgtagatg ggaggatgtc tgtaggttac acacaaatgc tgtgccactt tatatcaggg 180
gcttgagcat cctcacattt tgatatttaa gggaggtcct ggaaccaatt ccccagatac 240
tgagggtcca ctgtctgtgt cccctcgccc caccttgcct ttgtctcctg tctcctatct 300
ccaccctgcc tcccgccagc ctgttgctcc tgacctgccc gggcaccctg gagcagcacc 360
ctatctcaga gcctggctca gtgtgttcac ttctgcagag aaactaactt gcccaagtcc 420
acactcaaaa cataggcatt gctgagatgt gaaaagcagc tgtggatgct ttctgctaca 480
gtctgtgtgt tcttttccat atctgaataa aaggtcacca ccatttgtat tttaaagaga 540
aagagaattt atgggtggaa attggggatt ccctcattct cagtcagaca gaaaagaggg 600
ccccattgtg tgcctgattg caaataaatt tagcttcctc agcccaagaa tagcagaagg 660
gttaaaataa agtctgtatt tatggctctg tcaaaggaag gcccctgcct tggcagccag 720
ccggaattag cagggcagca gatgcctgac tcagtgcagc atggatttcc catagggagc 780
ctgggggcac agcacagaga gaccacttct ctttagaaat gggtcccggg cagccaggca 840
gcctttagtc actgtagatt gaatgctctg tccatttcaa aacctgggac tggtctattg 900
aaagagctta tccagctact ctttgcagag gtgctgtggg cagggtcccc agcccaaatg 960
cccacccatt tcccagagca cagtcagggc caagcctggc ctgtggggaa gggaggcctt 1020
tctccctgct ggctcggtgc tccccggatg ccttctccat cgcttgtcct ctgcagcacc 1080
cacagccagc gttcctgatg tgcagggtca gtcattaccc agggtgttcc ggaccccaca 1140
cagattccta caggccctca tgatatttta aaacacagca tcctcaacct tgaggcggag 1200
gtcttcataa caaagatact atcagttccc aaactcagag atcaggtgac tccgactcct 1260
cctttatcca atgtgctcct catggccact gttgcctggg cctctctgtc atggggaatc 1320
cccagatgca cccaggaggg gccctctccc actgcatctg tcacttcaca gccctgcgta 1380
aacgtccctg tgctaggtct tttgcaggca cagcttttcc tccatgagta cgtattttga 1440
aactcaagat cgcattcatg cgtcttcacc tggaaggggt ccatgtgccc ctccttctgg 1500
ccaccatgcg aagccacact gacgtgcctc tccctccctc caggaagcct acgtgatggc 1560
cagcgtggac aacccccacg tgtgccgcct gctgggcatc tgcctcacct ccaccgtgca 1620
gctcatcacg cagctcatgc ccttcggctg cctcctggac tatgtccggg aacacaaaga 1680
caatattggc tcccagtacc tgctcaactg gtgtgtgcag atcgcaaagg taatcaggga 1740
agggagatac ggggagggga gataaggagc caggatcctc acatgcggtc tgcgctcctg 1800
ggatagcaag agtttgccat ggggatatgt gtgtgcgtgc atgcagcaca cacacattcc 1860
tttattttgg attcaatcaa gttgatcttc ttgtgcacaa atcagtgcct gtcccatctg 1920
catgtggaaa ctctcatcaa tcagctacct ttgaagaatt ttctctttat tgagtgctca 1980
gtgtggtctg atgtctctgt tcttatttct ctggaattct ttgtgaatac tgtggtgatt 2040
tgtagtggag aaggaatatt gcttccccca ttcaggactt gataacaagg taagcaagcc 2100
aggccaaggc caggaggacc caggtgatag tggtggagtg gagcaggtgc cttgcaggag 2160
gcccagtgag gaggtgcaag gagctgacag agggcgcagc tgctgctgct atgtggctgg 2220
ggccttggct aagtgtcccc ctttccacag gctcgctcca gagccagggc ggggctgaga 2280
gagcagagtg gtcaggtagc cctgcctggg tgctggagac aggcacagaa caacaagcca 2340
ggtatttcac agctggtgcg gacccagaaa gacttctgct tttgccccaa acccctccca 2400
tctccatccc agtcttgcat cagttatttg cactcaactt gctaagtcct atttttttct 2460
aacaatgggt atacatttca tcccattgac tttaaaggat ttgcaggcag gccctgtctc 2520
tgagaatacg ccgttgcccg tcatctctct ccgacagcag ggcagggggt ccagagatgt 2580
gccagggacc agagggaggg agcagacacc cacccggcct gggcaggtcc tcctcattgc 2640
ttgcatccgc ctggttagca gtggcagtca gtcctgccga gtcattcgtg aggcgctcac 2700
ccaactccag gcagatgtaa aaggtgac 2728
<210> 67
<211> 123
<212> DNA
<213> 感兴趣的人EGFR区域 (ROI) 4, 外显子18 (EGFR "感兴趣的区域" (ROI) 4,外显子18)
<400> 67
cttgtggagc ctcttacacc cagtggagaa gctcccaacc aagctctctt gaggatcttg 60
aaggaaactg aattcaaaaa gatcaaagtg ctgggctccg gtgcgttcgg cacggtgtat 120
aag 123
<210> 68
<211> 122
<212> DNA
<213> 感兴趣的人 KRAS 区域 (ROI) 1, 外显子2 (KRAS "感兴趣的区域" (ROI) 1,外显子2)
<400> 68
ctctattgtt ggatcatatt cgtccacaaa atgattctga attagctgta tcgtcaaggc 60
actcttgcct acgccaccag ctccaactac cacaagttta tattcagtca ttttcagcag 120
gc 122
<210> 69
<211> 179
<212> DNA
<213> 感兴趣的人 KRAS 区域 (ROI) 2, 外显子3 (KRAS "感兴趣的区域" (ROI) 2,外显子3)
<400> 69
ctataatggt gaatatcttc aaatgattta gtattattta tggcaaatac acaaagaaag 60
ccctccccag tcctcatgta ctggtccctc attgcactgt actcctcttg acctgctgtg 120
tcgagaatat ccaagagaca ggtttctcca tcaattacta cttgcttcct gtaggaatc 179
<210> 70
<211> 671
<212> DNA
<213> 感兴趣的人 KRAS 区域 (ROI) 3, 外显子4 (KRAS "感兴趣的区域" (ROI) 3,外显子4)
<400> 70
tctgttggct ttctgggtat tgtctttctt taatgagacc tttctccaga aataaacaca 60
tcctcaaaaa aattctgcca aagtaaaatt cttcaaatac aacaacgttt aacctagaaa 120
catgacataa tggtttaaaa gtactaccga aatagaaaac gcaaaaattt gttgccctgt 180
tctttatata tatatatata tatatatata tatatatata tatatatata tatgtaacca 240
tgggaaaaaa aaatccccac ctcttgaatt ctaaatgtta acatgtgctc agaattgaag 300
agaaattttc aatgtagaaa gaaaccaaag ccaaaagcag taccatggac actggattaa 360
gaagcaatgc cctctcaaga gacaaaaaca tttactaaat attgttttat ttcctagtat 420
agcataattg agagaaaaac tgatatatta aatgacataa cagttatgat tttgcagaaa 480
acagatctgt atttatttca gtgttactta cctgtcttgt ctttgctgat gtttcaataa 540
aaggaattcc ataacttctt gctaagtcct gagcctgttt tgtgtctact gttctagaag 600
gcaaatcaca tttatttcct actaggacca taggtacatc ttcagagtcc ttaactcttt 660
taatttgttc t 671
<210> 71
<211> 119
<212> DNA
<213> 感兴趣的人 BRAF区域 (ROI) 1, 外显子15 (BRAF "感兴趣的区域" (ROI) 1,外显子15)
<400> 71
catccacaaa atggatccag acaactgttc aaactgatgg gacccactcc atcgagattt 60
cactgtagct agaccaaaat cacctatttt tactgtgagg tcttcatgaa gaaatatat 119
<210> 72
<211> 118
<212> DNA
<213> 感兴趣的人 BRAF区域 (ROI) 2, 外显子11 (BRAF "感兴趣的区域" (ROI) 2,外显子11)
<400> 72
catgccactt tcccttgtag actgttccaa atgatccaga tccaattctt tgtcccactg 60
taatctgccc atcaggaatc tcccaatcat cactcgagtc ccgtctacca agtgtttt 118
<210> 73
<211> 287
<212> DNA
<213> 感兴趣的人 AKT1区域 (ROI) (AKT1 "感兴趣的区域" (ROI))
<400> 73
gggatactta cgcgccacag agaagttgtt gaggggagcc tcacgttggt ccacatcctg 60
cggccgctcc ttgtagccaa tgaaggtgcc atcattcttg aggaggaagt agcgtggccg 120
ccaggtcttg atgtactccc ctacagacgt gcgggtggtg agagccacgc acactctacc 180
cgtcagaccc tcgccaggca gccaggcagg aactgggtgt gccaggacag atgtgcctgg 240
gatgcctgag tcccaggggg caggcgcggt acgggagctg tttctta 287
<210> 74
<211> 135
<212> DNA
<213> 感兴趣的人DDR2区域 (ROI) 1, 外显子19 (DDR2 "感兴趣的区域" (ROI) 1,外显子19)
<400> 74
acttacctcc ctcaaccagc catttgtcct gactctgtgt ataagctgat gctcagctgc 60
tggagaagag atacgaagaa ccgtccctca ttccaagaaa tccaccttct gctccttcaa 120
caaggcgacg agtga 135
<210> 75
<211> 150
<212> DNA
<213> 感兴趣的人DDR2 区域 (ROI) 2, 外显子18 (DDR2 "感兴趣的区域" (ROI) 2,外显子18)
<400> 75
ggcaagttca ctacagcaag tgatgtgtgg gcctttgggg ttactttgtg ggagactttc 60
accttttgtc aagaacagcc ctattcccag ctgtcagatg aacaggttat tgagaatact 120
ggagagttct tccgagacca agggaggcag 150
<210> 76
<211> 719
<212> DNA
<213> 感兴趣的人DDR2区域 (ROI) 3, 外显子16和17 (DDR2 "感兴趣的区域" (ROI)3, 外显子16和17)
<400> 76
gaatgatttt cttaaggaga taaagatcat gtctcggctc aaggacccaa acatcatcca 60
tctattagct gtgtgtatca ctgatgaccc tctctgtatg atcactgaat acatggagaa 120
tggagatctc aatcagtttc tttcccgcca cgagccccct aattcttcct ccagcgatgt 180
acgcactgtc aggtaaacaa gccaggtctt ccttctcctc cctgtggtca tgagagtaac 240
ctgggatctg aaaataggga gcagtgagcc ttaaagtgta tcaatgttct gggatggtgg 300
gggaagtcag tgtgcaggga ataatggagc agctgccctt tggggaaacg caagggattc 360
atcaagagta gagaaagaat gttgagcttt caaccctagt ttgttgatac cattttagaa 420
tgtgtacctt tcacatcttc ctgtttccat aggctacctt ctgtcttctt gtctatttcc 480
tcagttacac caatctgaag tttatggcta cccaaattgc ctctggcatg aagtaccttt 540
cctctcttaa ttttgttcac cgagatctgg ccacacgaaa ctgtttagtg ggtaagaact 600
acacaatcaa gatagctgac tttggaatga gcaggaacct gtacagtggt gactattacc 660
ggatccaggg ccgggcagtg ctccctatcc gctggatgtc ttgggagagt atcttgctg 719
<210> 77
<211> 186
<212> DNA
<213> 感兴趣的人ERBB2区域 (ROI) (ERBB2 "感兴趣的区域" (ROI))
<400> 77
gaagcatacg tgatggctgg tgtgggctcc ccatatgtct cccgccttct gggcatctgc 60
ctgacatcca cggtgcagct ggtgacacag cttatgccct atggctgcct cttagaccat 120
gtccgggaaa accgcggacg cctgggctcc caggacctgc tgaactggtg tatgcagatt 180
gccaag 186
<210> 78
<211> 211
<212> DNA
<213> 感兴趣的人MAP2K1(MEK1)区域 (ROI) (MAP2K1 (MEK1) "感兴趣的区域"(ROI))
<400> 78
gaccaacttg gaggccttgc agaagaagct ggaggagcta gagcttgatg agcagcagcg 60
aaagcgcctt gaggcctttc ttacccagaa gcagaaggtg ggagaactga aggatgacga 120
ctttgagaag atcagtgagc tgggggctgg caatggcggt gtggtgttca aggtctccca 180
caagccttct ggcctggtca tggccagaaa g 211
<210> 79
<211> 66
<212> DNA
<213> 感兴趣的人NRAS区域 (ROI) 1，密码子61
<400> 79
cctgtcctca tgtattggtc tctcatggca ctgtactctt cttgtccagc tgtatccagt 60
atgtcc 66
<210> 80
<211> 66
<212> DNA
<213> 感兴趣的人NRAS区域(ROI) 2，密码子12
<400> 80
tttgttttta tgtattggtt ttttatggta ttgtattttt tttgtttagt tgtatttagt 60
atgttt 66
<210> 81
<211> 303
<212> DNA
<213> 感兴趣的人PIK3CA 区域 (ROI) 1, 外显子9 (PIK3CA "感兴趣的区域" (ROI)1, 外显子9)
<400> 81
ataagatatt attttatttt acagagtaac agactagcta gagacaatga attaagggaa 60
aatgacaaag aacagctcaa agcaatttct acacgagatc ctctctctga aatcactgag 120
caggagaaag attttctatg gagtcacagg taagtgctaa aatggagatt ctctgtttct 180
ttttctttat tacagaaaaa ataactgaat ttggctgatc tcagcatgtt tttaccatac 240
ctattggaat aaataaagca gaatttacat gatttttaaa ctataaacat tgccttttta 300
aaa 303
<210> 82
<211> 455
<212> DNA
<213> 感兴趣的人PIK3CA区域 (ROI) 2, 外显子20 (PIK3CA "感兴趣的区域" (ROI)2, 外显子20)
<400> 82
gtctacgaaa gcctctctaa ttttgtgaca tttgagcaaa gacctgaagg tattaacatc 60
atttgctcca aactgaccaa actgttctta ttacttatag gtttcaggag atgtgttaca 120
aggcttatct agctattcga cagcatgcca atctcttcat aaatcttttc tcaatgatgc 180
ttggctctgg aatgccagaa ctacaatctt ttgatgacat tgcatacatt cgaaagaccc 240
tagccttaga taaaactgag caagaggctt tggagtattt catgaaacaa atgaatgatg 300
cacatcatgg tggctggaca acaaaaatgg attggatctt ccacacaatt aaacagcatg 360
cattgaactg aaaagataac tgagaaaatg aaagctcact ctggattcca cactgcactg 420
ttaataactc tcagcaggca aagaccgatt gcata 455
<210> 83
<211> 455
<212> DNA
<213> 感兴趣的人PTEN区域 (ROI), 外显子7 (PTEN "感兴趣的区域" (ROI), 外显子7)
<400> 83
tcaaactgga gaaaatctta cattgtttat atttttattt catttatttc agttgatttg 60
cttgagatca agattgcaga tacagaatcc atatttcgtg tatattgctg atattaatca 120
ttaaaatcgt ttttgacagt ttgacagtta aaggcatttc ctgtgaaata atactggtat 180
gtatttaacc atgcagatcc tcagtttgtg gtctgccagc taaaggtgaa gatatattcc 240
tccaattcag gacccacacg acgggaagac aagttcatgt actttgagtt ccctcagccg 300
ttacctgtgt gtggtgatat caaagtagag ttcttccaca aacagaacaa gatgctaaaa 360
aaggtttgta ctttactttc attgggagaa atatccaaaa taaggacaga ttaaaagcta 420
tattttattt tatgacatgt aaggaactat aattt 455
<210> 84
<211> 593
<212> DNA
<213> 感兴趣的人IDH1区域(ROI) (IDH1 "感兴趣的区域" (ROI))
<400> 84
tatggtataa ctgaataaaa ggataaagga aaaaaaacag catgtttgaa aaaaaatgtg 60
ttgagatgga cgcctatttg taagtttatt tgtatttgcc tttagctaaa tgtgtgtaaa 120
tatacagtta tacatatatg catttctcaa tttcatacct tgcttaatgg gtgtagatac 180
caaaagataa gaataaaaca catacaagtt ggaaatttct gggccatgaa aaaaaaaaca 240
tgcaaaatca cattattgcc aacatgactt acttgatccc cataagcatg acgacctatg 300
atgataggtt ttacccatcc actcacaagc cgggggatat ttttgcagat aatggcttct 360
ctgaagaccg tgccacccag aatatttcgt atggtgccat ttggtgattt ccacatttgt 420
ttcaacttga actcctcaac cctcttctca tcaggagtga tagtggcaca tttgacgcca 480
acattatgct tctttatagc ttctgcagca tccttggtga cttggtcgtt ggtggcatca 540
cgattctcta tgcctaaatc atagcttgaa agagaaaaat tagaagcaaa gtt 593
<210> 85
<211> 377
<212> DNA
<213> 感兴趣的人IDH2区域 (ROI) (IDH2 "感兴趣的区域" (ROI))
<400> 85
ggaagttgta cacttcccac tccttgacac cactgccatc ttttggggtg aagaccattt 60
tgaaagtgcc ggcccggtct gccacaaagt ctgtggcctt gtactgcaga gacaagagga 120
tggctaggcg aggagctcca gtcggggggt gcccaggtca gtggatcccc tctccaccct 180
ggcctacctg gtcgccatgg gcgtgcctgc caatggtgat gggcttggtc cagccaggga 240
ctaggcgtgg gatgtttttg cagatgatgg gctcccggaa gacagtcccc cccaggatgt 300
tccggatagt tccattggga cttttccaca tcttcttcag cttgaactct gtgaggacag 360
agataatagt ggtccca 377
<210> 86
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial)
<220>
<223> 适合于BRCA1甲基化分析的正向引物(F1)
<400> 86
ccaatacccc aaaacatcac tt 22
<210> 87
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial)
<220>
<223> 适合于BRCA1甲基化分析的反向引物(F1)
<400> 87
ggggtagatt gggtggttaa tt 22
<210> 88
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial)
<220>
<223> 适合于BRCA1甲基化分析的正向引物(F2)
<400> 88
ctaaacgcaa aaacccaatt atct 24
<210> 89
<211> 28
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial)
<220>
<223> 适用于BRCA1甲基化分析的反向引物(R2)
<400> 89
ggtttttttt gtttttttta ttttttga 28
<210> 90
<211> 1791
<212> DNA
<213> 感兴趣的人PITX2 区域 (ROI) 1 (启动子A)，优选用于甲基化分析
<400> 90
cttccagtag ctgaaacttt gtacccagcc ctttatcttg agaatgctaa tccttggccc 60
gaggatttgt tcctgcagtg ttggcaccga gatttaaggg aagatacctc gttttaaatg 120
ccagccacgg tctggcttcc ctctcgactt cagcaccctg tagattgtta gtgtctgtgg 180
cgggggacga aaggaacagg gctttgcaag gtctgtttgc cgactgcgtt accttgggcg 240
aaacttagcc ccaaaagcca caaatcacct acggtgaaga ttctccgaag tggaacaaat 300
ttccagactc gcattatctc acatccctgc gggatagatg gcctccactt accggctacc 360
gggagagagc tgctgtctcc gcgtcccact gcttcccggg gcgatttcca gcgagccgag 420
cctccggctg cacggcaagc gcccgaaagc cgggcctgag aggactgcag ggctcctgag 480
ggtgccaagt tccgaaggag tccacgggtg cactggggcc tccgaaatct agccgccact 540
ggcagtttct ttctgctcct ctccagcttt ctcgctcggt ctcgcactct ctctcctctc 600
cctccctctc atccctctct cttccctctg ctcctactcc gtgtggggag tgacgtgacg 660
tcagcagaga ttccaccaaa ctccactgca cagtggcgcg cgggcggccg gccgagcccg 720
gctgcgcggc tggcgatcca ggagcgagca cagcgcccgg gcgagcgccg gggggagcga 780
gcaggggcga cgagaaacga ggcaggggag ggaagcagat gccagcgggc cgaagagtcg 840
ggagccggag ccgggagagc gaaaggagag gggacctggc ggggcactta ggagccaacc 900
gaggagcagg agcacggact cccactgtgg aaaggaggac cagaagggag gatgggatgg 960
aagagaagaa aaagcaatct gcgccaaccc ggcagcccta ataaatcaaa gggggagcgc 1020
cagggcagcg gggagacaga aacgtacttt tggggagcaa atcaggacgg gctgggagga 1080
agcgacaggg aaagtggccc aagagacgga acaaaggaca atgttcatgg ggttgtttgg 1140
gacgaggcgt gtggagtgtg ggtgtgagcg tgcgtgtgtg accttctttc aggcctgcag 1200
agttgaggaa agaggtcaca gcaaagaggg actgcggagg gaggaaagtg agagaccggt 1260
agagggcggg agtggaggtg ggcgcggtgg ggatgggaga ggatgagtga agagaaatct 1320
agaagaatgg agtgagctag tgggagaggg tgggagggcc acagccggga gcgaacgagc 1380
taggcttgtc agctggggaa ggccgggacg ctgggcccag cttagctggg acaccgcgcc 1440
cgaggtcaag gcgggtggac caggcatgct gagagtgtcg gcgcacaggt gggcacggcc 1500
acgcactgac ccagtgttca cgaagggttt gcactggaca aggctcagac gctcatagag 1560
tctagaattt cctctgctgt acctacattc aacaagttca ccctgggtca cggatatctc 1620
attttttaaa atgacgaggt taaggttcct ggcgaggatg gtattaaatt gcacgggata 1680
gaagtggggg tgggggagag agtttccctc aagtccacat ttgctcctgc aaagcaaaga 1740
gtatgtgaaa ttacagggca tattctcact cgaaaagtgt gccttacttc t 1791
<210> 91
<211> 6265
<212> DNA
<213> 感兴趣的人PITX2 区域 (ROI) 2 (启动子C), 优选用于甲基化分析
<400> 91
tattactaac aactgctttt ataaaattaa tttgacattt cgatatatat acatcctttc 60
agtcatttaa atgttaacaa tgctaaactt aaaaaataac aagcttatag taatgttaaa 120
atgtcatatc cagtcaaaca tttgtttgtg tatgtgtcct tgcaactgtt agaaatactt 180
gtagtgaaag atgtcagaca ctgaggacat ccctttgaaa tcaaaggagc tctctctttg 240
attcagtggt ttccttttct ctatatagct tctctttctc tccctttctt tagtgcccac 300
gaccttctag cataattccc agtctttcaa gggcggagtt gccccatccg gcaaggtcct 360
aggatcccgg cgctgtgggt gcggctcaca cgggccggtc cactgcatac tggcaagcac 420
tcaggttgga ggccgggttc tgcacgctgg cgtagccgaa gctggagtgc tgctttgctt 480
tcagtctcag gctggccagg ctcgagttac acgtgtccct ataaacatac ggaggagtcg 540
gcggcgcgta aggacaggca ggcgtcggca ccgcggaatt cagcgacggg ctactcaggt 600
tgttcaagtt attcaggctg ttgagactgg agcccgggac gcctgtcact gctgagggca 660
ccatgctgga cgacatgctc atggacgaga tagagttggg tggggaaaac atgctctgtg 720
atgacagggg gttgacgttc atagagttga agaaggggaa gctcttggtg gatagggagg 780
cggatgtaag gcccttggcg gcccagttgt tgtaggaata gcctgggtac atgtcgtcgt 840
agggctgcat gagcccattg aactgcggcc cgaagccatt cttgcatagc tcggcctgct 900
ggttgcgctc cctctttctc catttggccc gacgattctt gaaccaaacc tgggggcggt 960
tggggcaagg gagcaaacag atgccacagt gcagattact aaaacttcca tcggaggcca 1020
acccccgcct tcccccgaca cacacgctag cgcactcaca caccctggcc tcgcttcact 1080
gcaccgccct gcacaccaag ataccagggc cagctttcag ttactggccc gggtctccac 1140
caagcgcagg agacctggtc tgctctggcc tgcgagctgg gactcggagc tacgccacaa 1200
acctcagccg aacgcatgga gacctgcgga cggtttgatc actcagccag gcgtttctcc 1260
aggtccaaaa acacttaatg taaaacaaac gcggggcagc aggcttttcc aacccttccc 1320
ggggcacctt gcaaacttgc ttccattcca aagccacaga cccacggatg aggagaaggg 1380
gctggaaggg cactagagga tcgctctttc tcccacgcaa ttcctccctt ccttccctga 1440
cctccactgt cgtcccccac cccctggtac gtgctccctt aacagggact aggccgccaa 1500
cactctttct cgcctagcaa aacaaccaaa taaagagcaa aagaccacct cttcgtcagc 1560
tcgttaactc caggagcttg gcatattaaa ctccgggaac ccggaaaggg tagttttgga 1620
gattccccct tctttcgctc tgcctcttct ttaccctaag cccaccacag gcctgtccgc 1680
gcgccaggcc cagccgggtc gtttggcttt gcaggcggcc acccaggccg gccggcttcc 1740
acccgtgtcc ggtggcccag ccgcaacccc gatcccaatc cacatcgggc ctccctgtcg 1800
ccccagacgg cggcttttgt gtattggaga gaggcctggc ctgagatatc cgagctgaca 1860
ccagtgatgt ttcacattac acatctccgc cgggcccagc cgtgtaatcc gctttttctc 1920
tttttccttt cattcttgat ttccttttta tcccccttcc tctttgcacc cgactgctat 1980
aaaaagcacg cctcactccc acttggctcg acaagcagcc gccctggaag gagaggcagc 2040
tgcaaggaga gcccagcgcc gcggctacaa agcactaggg tggagctgcg gaatagcggg 2100
cggggtggga gggcgttttc gaaggatccc agaaaaccca tagactctgt ctttaattac 2160
ttgccatttc taccctaggc catctaaact ttgctcaggc gagaagagta cgtgagaggc 2220
ccgttccctt gatgtgcaag agagctaatg aaagactgac cttgctcaaa accacgccgc 2280
ccaggaccca gctctggctc tggacagtta aactaaaacc attttcaact tcttcccggc 2340
cttttatcca ccagcatagc ctcatgcctt gcacaaatgc cacccagaga gtgtcttcat 2400
tccctctgat ttgggagagc attttggtct ttattctttt tatcgttgtt ttcttctttt 2460
tgtttgctct gctctaaccg ggggctttat tttttctacc cagagcactt aatttttttt 2520
ttttaacagc aaagcctctg gatgccgctt gatttgcttg attctgtttt ctgcttccag 2580
aatcctaaca aatttggaat cttccaccga ccagcataaa ccaggacgtt gctattgggt 2640
tatttatttg agctcatttt tgccaatcca taaagtacag atttgctaca aagttaaggt 2700
aagccctttt tacaaaacta tgattataat ttagaagagg gggtgtgagt ttcaatttcc 2760
agagttcaac tcctgagaga agataaataa accaagcaga aaagtctttc ttcttttttt 2820
ctttctcctt ctaagaggac tagtagttgt gtattaaaac tttgctcccg gagatcacaa 2880
aactaggaaa tagggtgtgt gggagagacc tgaatggccg aaacaaccgt aaagaaggtg 2940
taagaagcgc gagcccagga gggaaaaagc tgggccaggg ccgggacaaa ggtttcccag 3000
ggagggccaa ctcttccgtg tctctggcgg gttttccttg ttaaaggctc acaggttgga 3060
gcctgttcgc ggctcttggc ctggtaggga ttttattagc tctgctctgg caactgcaag 3120
ccaggaacac aatgtcctgt gcaggggatt gcccatgcag cccagctcgt gagatcgcgg 3180
gatggcgggg cagtgagccg gtgccgctct gggagcctga gccagggcgg cagtcctgtc 3240
ggcctcggag agggaactgt aatctcgcaa ccaggccgcc gcgaggcctt ctgcctttgc 3300
aaagctgcgc cccaccggcg ccctcccagg cggcgctgcc ttccacattc tctcctggtc 3360
tacttggcct gtacctccac aacatcctcc ccccatccct cccagactcc gtgctggctc 3420
ctacccggac tcgggcttcc gtaaggttgg tccacacagc gatttcttcg cgtgtggaca 3480
tgtccgggta gcggttcctc tggaaagtgg cctccagctc ctggagctgc tggctggtaa 3540
agtgagtccg ctgccgcctt tgccgcttct tcttagacgg gtcctcggcg cccacgtcct 3600
cattcttccc ctgctggctt ttatctttct ctgaaaacga aacacacaca ctttcccgtc 3660
agcatgccca cctgcaacgc ggacgccaac tggaccggcg gcagaagccg tggaagagct 3720
gggctgcctg gcgccggagg agggtgcgcg cggcggctcc gggccgcgag gagcgctgcg 3780
cctgtggggt gtgcaggcgc aagtgtgggt gtccgcgccc catttcctcc cctcccccag 3840
cgccgcacgt tttatttaca tgtttatctc actgcagcgg cacattcact tttatagcct 3900
gtgctttcaa gtatatttat acacctctgc gcagacacac caaatctcct gggacgcgca 3960
cacgcgcgtg gtttacagac ccccctcccc ctcgcagaaa gctcagattt ccatgcggtt 4020
tgggaaggct aggaaaagat gtggggattc ggttgggcac cgaagttcgc cggccctttc 4080
ccaaaaaaaa aaaaaaaatg cctcttcgcg aagggcattt ctgagtggtt tcaggcaatt 4140
tcctaacgag tggagctcct cgggagctga aagccgagag gaaaacaggg acagaggtcg 4200
gcggcctctg aaggtcctcg aatcaagatg ctgggatttt tgtgacccag gaaacagaag 4260
ggaggccagg gtacgaatag agagggcggc agaattgctc gcgcccttag cgccccagga 4320
gccgggccgg tcgagggaga actaaaggga tgcggggtag tcaaaattcc ggctcccgga 4380
agttctgcgg ggagccaggc gaacgaccac tcccaccacg cctccccccg gaggggctga 4440
cttccttggg gcgagaggga gcgggtggcg cagagcagct gagcgggaat gtctgcaggg 4500
cggcgcggcg ccttacctgc ggcctccggg ctggaggtgt cggagatggt gtgcacctcc 4560
agcctgtgct tggaggagtc cagcgaccgg ggctgaccgg gagccagaac cgaagccatg 4620
gctaacggct ggggatggtg acaggaagat gaggagacgg ccgacagctt ggtccccgct 4680
gctcggtgct ccaagtgaag cgggcctttc atgcagttca tggacgaggg agcgcgacgc 4740
tctactagtc cttggctact gccccgccga gcccccgtag ccgccgctgc ccgctccggg 4800
tcgcgctcta ggcgcggagt ttccccgctg cggggagagc caggggacgc aacccccgcc 4860
gagttctcaa gccaagctgc ccccgtctcc tccggaaggc tcaagcgaaa aagtccggag 4920
acggaaagtc agcgggcaaa cgaagacatg ggatgtgggc agaagggcac cactcagagc 4980
gtctttaggg agcaggcttc caagctccaa agcgaaacaa gagtgggcaa agaccccctt 5040
cttctctccc tccctccccc aagaacccct ccaataagga aagctaacgc cgaccgcgct 5100
ctgcccgccc cccccccacg cggcagccct gacagagaag tgtcaagagt gacagggaca 5160
ggtaggtgat attagatccc ctgcggcggc agcagccgct gcagccacga cgcggccctc 5220
tgagcgcacc ctccgcaacg cgcacacgca cacccctcgg gcggtcgaac aggagccggg 5280
ccttgccgca gctcagctcc aggcacccag gcgagcgacg gaccagatct gcggctccgc 5340
gcttccctgt tggcctaaca tcttaaaacc agaggcgggc ttcctggtgc cgagacgtca 5400
ctccgccgcg gccctcccca gccctctccg cctccgcctc ctcccagacc cttctccggg 5460
tgcgactgac gtggctccgc accaatcagg acgccccgag ccgcggtgga gggactgtcc 5520
tgcctgcacc tatcagcagt gcggggccgg gctactgcct cgccgtgcgc actgggtcta 5580
cacaggcaag ctcccgggaa ttcagctcct gcccagccca aggcgatccg gcttttagta 5640
cgaacccaaa ggtgaagaga tgaggctagg agtcgaaggc ttgggagaag agagtggaat 5700
ggtcaagaag agaaaggtac aaggatcaac aagacaccca ctctttgtgt ctcactacat 5760
ccatttccaa tcccccaccc catataaaaa ggagacacgt tacttaaaac tagaaaattt 5820
gaaaaacagc aacaaatcac ctctccgatc ttaaattttc caaacagcct gtcaagtgaa 5880
tgctgcgcta atctgaagaa gctttaattg caaagaagac agagccctga aaaggcaggc 5940
taataaatta gaaatcgaga agcaaatgga cccgtcaaaa gaaaattacc ttgactttaa 6000
acgaacaact gtttggtggt tcactctgga tttatacaag aataaaaagt cgcctcagat 6060
cacgttctct gtgatgctta ttagtcccca gacagaaaac acacaataga agagaaaccc 6120
taacccagcg ttttcaaaat gctgaaagct tatccattct acttaacgtt gattaagaca 6180
catatcctag atctttcaaa ttccttgtac actgtattaa gctcgtccta acccgagaga 6240
gccacgcttt aaattcgact ctctt 6265
<210> 92
<211> 2449
<212> DNA
<213> 感兴趣的人MGMT区域 (ROI) 1, 优选用于甲基化分析
<400> 92
ctccaacata gcttctctgg tggacacaat tcaactccta ataacgtcca cacaacccca 60
agcagggcct ggcaccctgt gtgctctctg gagagcggct gagtcaggct ctggcagtgt 120
ctaggccatc ggtgactgca gcccctggac ggcatcgccc accacaggcc ctggaggctg 180
cccccacggc cccctgacag ggtctctgct ggtctggggg tccctgacta ggggagcggc 240
accaggaggg gagagactcg cgctccgggc tcagcgtagc cgccccgagc aggaccggga 300
ttctcactaa gcgggcgccg tcctacgacc cccgcgcgct ttcaggacca ctcgggcacg 360
tggcaggtcg cttgcacgcc cgcggactat ccctgtgaca ggaaaaggta cgggccattt 420
ggcaaactaa ggcacagagc ctcaggcgga agctgggaag gcgccgcccg gcttgtaccg 480
gccgaagggc catccgggtc aggcgcacag ggcagcggcg ctgccggagg accagggccg 540
gcgtgccggc gtccagcgag gatgcgcaga ctgcctcagg cccggcgccg ccgcacaggg 600
catgcgccga cccggtcggg cgggaacacc ccgcccctcc cgggctccgc cccagctccg 660
cccccgcgcg ccccggcccc gcccccgcgc gctctcttgc ttttctcagg tcctcggctc 720
cgccccgctc tagaccccgc cccacgccgc catccccgtg cccctcggcc ccgcccccgc 780
gccccggata tgctgggaca gcccgcgccc ctagaacgct ttgcgtcccg acgcccgcag 840
gtcctcgcgg tgcgcaccgt ttgcgacttg gtgagtgtct gggtcgcctc gctcccggaa 900
gagtgcggag ctctccctcg ggacggtggc agcctcgagt ggtcctgcag gcgccctcac 960
ttcgccgtcg ggtgtggggc cgccctgacc cccacccatc ccgggcgagc tccaggtgcg 1020
ccccaagtgc ctcccaggtg ttgcccagcc tttccccggg cctggggttc ctggactagg 1080
ctgcgctgca gtgactgtgg actggcgtgt ggcgggggtc gtggcagccc ctgccttacc 1140
tctaggtgcc agccccaggc ccgggccccg ggttcttcct acccttccat gctgccagct 1200
ttccctccgc cagctgctcc aggaagcttc cagaagcccc tgcgcgggcc ttggcttgca 1260
gcaacccttt agcatactta ggcagagtcc catatttcct tcctgctgga ggccaagttc 1320
taggggcctt ctggttacta tggctggtgt ttgtgtacat cataccctaa ctgtattcat 1380
caacacttag agtaagcaag gctcgctgga gagccacaca cactgggcac cgtaatgtcg 1440
gttataacac cgcagaggag ttctgaacta tgtatttcgc actcctgggt tcatcatctc 1500
ctgaaatctc agggtggtgt ttgctctcag ttgcttcagc tgagtagctg gctttctgtc 1560
ctggaaagca gactttgtac atgtgtgtgc aacctatgcc tgctgagatc atcatcagac 1620
agggaagcgg cttggtccag agagctgttc tcagtagaat gttaagcaca gagagctgag 1680
aattagactg gttatttaca tagacatcca aatagaaacc tatagagtat ctgttaagtc 1740
aggctctccc gtcatctccc ccatccctgg gcaggtgtct aggagatggt tttgttattt 1800
tcagggccct ctcaatggct aaaacactct gggagatgaa caagatttta aaaacccaaa 1860
gcttagcgca cctggtgggt gggggtgtga aaactttgaa ggaaaccgcg tcaagagcct 1920
ggctgattgt taatatcacg ttaactcaga gggccaggat acttgcccag acccggagtc 1980
tgcctgcaag tagcagagga gagctggcct tgctctgccg cgtgtctttc ttcctgggcc 2040
ctctgtctcg ggttggaatt tgaatagtgg agtagtgtct gccacagtca ggggcctgga 2100
tgaagtagac caccagtacg gagctatact caggtacttt tcaatgtata tatcttcatt 2160
aaaaaaaaaa aatctgggcc aggcacagtg ggtcacgcct gtaatctcag cactttggga 2220
ggccgaggtg ggtggatcac ctgaagtcag gagtttgaga ccagcctggc caacatggtg 2280
aaacccagtt tctactaaaa acacaaaaat tatccaggcg tggtggtgca tgctggtaat 2340
cccagttact tgggagactg aggcaggaga attgcttgaa cctgggaggc ggaggttgca 2400
gtgagccgag attgcgccat tgcactccaa cctgggcgac gagagtgaa 2449
<210> 93
<211> 2928
<212> DNA
<213> 感兴趣的人SEPT9区域 (ROI) 1，优选用于甲基化分析
<400> 93
tttcagaggg ggtggggagg ggcaagtggg cagcgagcga cctcagaccc aggatgagct 60
gtcaggcgct ccccggccac acattcaagg gaccggagtg cagttgtagc gttgcggcct 120
gctgcttcgg gggtgggggt gttgttccat gctgtgaatt ctcacatggc ccctgactct 180
gggcagaggc cgagggtcta agggacgggg tgacagggag agcatgcagg agtgggtttc 240
tggctttcca gggcgagtgg aagaagcgcc tctctctctt gtaggtgaca gacctggggg 300
gcccttcttg aggatgagag cctgttgctt ctcaagttct gtgtctaacc caggtcccca 360
ggtctacccc agcccctcgg ccctgcctgc cttgtggatg atatagttta agggtagaga 420
ccgctggcct ggagggaagg ctaggcctca ggttagggcc cagaagggag ggagaagccc 480
ttggggcagc tccctttctg ctcactcact gcctagctcc ttccttcaca ccttccttcg 540
gaaacgtctg ctcctgacaa ggtctacttc ctgctctcag gaggccctta ttgtggagga 600
agggaggcgt cgcccgtccc tggcttctct gacagccgtg ttccatcccc gccctgtgcc 660
ccttctcccg gacagtgcct tctccagggc tcacccagga gggtgcagcg gtggcccccg 720
gggcggtggt cgtggtgggg gtgttagctg caggggtgcc ctcggtgggt gggagttggt 780
ggcctctcgc tggtgccatg ggactcgcat gttcgccctg cgcccctcgg ctcttgagcc 840
cacaggccgg gatcctgcct gccagccgcg tgcgctgccg tttaaccctt gcaggcgcag 900
agcgcgcggc ggcggtgaca gagaactttg tttggctgcc caaatacagc ctcctgcaga 960
aggaccctgc gcccggggaa ggggaggaat ctcttcccct ctgggcgccc gccctcctcg 1020
ccatggcccg gcctccacat ccgcccacat ctggccgcag cggggcgccc ggggggaggg 1080
gctgaggccg cgtctctcgc cgtcccctgg gcgcgggcca ggcggggagg aggggggcgc 1140
tccggtcgtg tgcccaggac tgtcccccag cggccactcg ggccccagcc ccccaggcct 1200
ggccttgaca ggcgggcgga gcagccagtg cgagacaggg aggccggtgc gggtgcggga 1260
acctgatccg cccgggaggc gggggcgggg cgggggcgca gcgcgcgggg aggggccggc 1320
gcccgccttc ctcccccatt cattcagctg agccaggggg cctaggggct cctccggcgg 1380
ctagctctgc actgcaggag cgcgggcgcg gcgccccagc cagcgcgcag ggcccgggcc 1440
ccgccggggg cgcttcctcg ccgctgccct ccgcgcgacc cgctgcccac cagccatcat 1500
gtcggacccc gcggtcaacg cgcagctgga tgggatcatt tcggacttcg aaggtgggtg 1560
ctgggctggc tgctgcggcc gcggacgtgc tggagaggac cctgcgggtg ggcctggcgc 1620
gggacggggg tgcgctgagg ggagacggga gtgcgctgag gggagacggg acccctaatc 1680
caggcgccct cccgctgaga gcgccgcgcg cccccggccc cgtgcccgcg ccgcctacgt 1740
gggggaccct gttaggggca cccgcgtaga ccctgcgcgc cctcacagga ccctgtgctc 1800
gttctgcgca ctgccgcctg ggtttccttc cttttattgt tgtttgtgtt tgccaagcga 1860
cagcgacctc ctcgagggct cgcgaggctg cctcggaact ctccaggacg cacagtttca 1920
ctctgggaaa tccatcggtc ccctcccttt ggctctcccc ggcggctctc gggccccgct 1980
tggacccggc aacgggatag ggaggtcgtt cctcacctcc gactgagtgg acagccgcgt 2040
cctgctcggg tggacagccc tcccctcccc cacgccagtt tcggggccgc caagttgtgc 2100
agcccgtggg ccgggagcac cgaacggaca cagcccaggt cgtggcaggg tctagagtgg 2160
gatgtcccat ggcccccatc caggcctggg gatatcctca tccgcctccc agaatcgggc 2220
cgtgggggac agaaggggcc tgcgtgcggg cagggagagt attttggctc tctcctgtct 2280
tcggggttta caaagtgtgt tgggacttgc ggggctgctc tgtccaagcc tgggtctggc 2340
gtccgcgtct ctgagcctgt gagtgcgtgc gctttcctgc gtcctcttga ctgccggtgc 2400
tggggctctg cgtcctgcgt ccgcgggagt aaatacagca ggcgaagggg aagctcacac 2460
aatggtctcc agcgctctgg ggcagggctt ctgaggggcg ggcctgcctc tgccgggacc 2520
tggagccccc gcccctcgga gaggctccta ggctgacttg ggcagagccc tctggtgggc 2580
cgggaggggg aaaggctgtg ttgaaatgag caaactgtcc aggtgtcagg ccaagctggg 2640
aggtgaccag cctgaggtcc tccccgctcc atggccagaa ccagggctga catctgggtg 2700
tcctgagccc agctgcccac acggcccacc tggggtcagc cctatctgag tgggggaggc 2760
ggggcctcct gggggaccag aactttggct ggacgccaag cagagtgcca gtggctgttc 2820
ttcagggctg ggcctgagga gggtgtgggg cggcgaaggg acgggagggg gttgtgatcc 2880
agtggccact ggcgctgtgc agagtgtgag ctggaaacat cgtagtta 2928
<210> 94
<211> 8485
<212> DNA
<213> 感兴趣的人TP53 区域 (ROI) (TP53 "感兴趣的区域" (ROI))
<400> 94
cccccagccc acactcattg cagactcagg tggctgcttc ccagcacctc ctcactcacc 60
cctgcacctg ctgaccccag tagcctgcac tggcgttcac ccctcagaca cacaggtggc 120
agcaaagttt tattgtaaaa taagagatcg atataaaaat gggatataaa aagggagaag 180
gaggggaagg gtggggtgaa aatgcagatg tgcttgcaga atgtaaaaga tgttgaccct 240
tccagctgga cgtggtggct cacaattgta atcccagcac tctgggaggc tgagacaggt 300
ggatcgcctg agcccaggag tttgagacca gcctgggcaa cactgtgaga ccccatctct 360
acaaaacatg caaaagttgg ctggccatgg tggcatgaac ctgtggtccc agctactccg 420
gaggctgagg caggactgct cgagccgggg aggcaaaggc tgcagtaagc caagatcacg 480
ccactccact ccagcctggg caacaaagcg agacccagtc tcaaagaaaa agaaaaaaaa 540
aaaaaaaaaa gaaaaaagaa attgaccctg agcataaaac aagtcttggt ggatccagat 600
catcatatac aagagatgaa atcctccagg gtgtgggatg gggtgagatt tccttttagg 660
tactaaggtt caccaagagg ttgtcagaca gggtttggct gggccagcag agacttgaca 720
actccctcta cctaaccagc tgcccaactg tagaaactac caacccaccg accaacaggg 780
agagggaaca agcaccctca agggggtcaa gttctagacc ccatgtaata aaaggtggtt 840
tcaaggccag atgtacatta tttcattaac cctcacaatg cactctgtga ggtaggtgca 900
aatgccagca tttcacagat atgggccttg aagttagaga aaattcaaca gtgagggaca 960
gcttccctgg ttagtacggt gaagtgggcc cctacctaga atgtggctga ttgtaaacta 1020
acccttaact gcaagaacat ttcttacatc tcccaaacat ccctcacagt aaaaacctta 1080
aaatctaagc tggtatgtcc tactccccat cctcctcccc acaacaaaac accagtgcag 1140
gccaacttgt tcagtggagc cccgggacaa agcaaatgga agtcctgggt gcttctgacg 1200
cacacctatt gcaagcaagg gttcaaagac ccaaaaccca aaatggcagg ggagggagag 1260
atgggggtgg gaggctgtca gtggggaaca agaagtggag aatgtcagtc tgagtcaggc 1320
ccttctgtct tgaacatgag ttttttatgg cgggaggtag actgaccctt tttggacttc 1380
aggtggctgt aggagacaga agcagggagg agagatgaca tcacatgagt gagagggtct 1440
gtgccccttt tccctgacca atgctttgaa gggcctaagg ctgggacaac gggaattcaa 1500
atcaagatgg tggccacacc ccatgcaaat atgtttactg agcacctcag agtattagtg 1560
tgtattagtc tcgtaatctt cccttacccc attttacttt atttatcttt tttgagacgg 1620
agtttcactc ttgttgccca ggctggagtg taatggtgag atctcagctc accgcaacct 1680
ctgcctcccg ggttcaagcg attctcctgc ctcagcctcc cgagtaggta gctgggatta 1740
caggcatgca tcaccacgcc cggctacttt tgtattttta gtagagatgg ggtttctcca 1800
tgttggtcag gctgggctca aactcccgac ctcaggtgat ccactcgcct tggcctccca 1860
gagtgtggga ttcgtgagcc actgcgcccg gcccccttac cccattttat atataaggaa 1920
actgagtttg acgggggtca cctaggacct gccggtgcat ggcagggctg agtatatgac 1980
ctgaaactct ggctgtattc agtattacac aattattagg cccctccttg agaccctcca 2040
gctctgggct gggagttgcg gagaatggca aagaagtatc cacactcgtc cctgggtttg 2100
gatgttctgt ggatacactg aggcaagaat gtggttatag gattcaaccg gaggaagact 2160
aaaaaaatgt ctgtgcaggg ctgggaccca atgagatggg gtcagctgcc tttgaccatg 2220
aaggcaggat gagaatggaa tcctatggct ttccaaccta ggaaggcagg ggagtagggc 2280
caggaagggg ctgaggtcac tcacctggag tgagccctgc tcccccctgg ctccttccca 2340
gcctgggcat ccttgagttc caaggcctca ttcagctctc ggaacatctc gaagcgctca 2400
cgcccacgga tctgcagcaa cagaggaggg ggagaagtaa gtatatacac agtacctgag 2460
ttaaaagatg gttcaagtta caattgtttg actttatgac ggtacaaaag caacatgcat 2520
ttagtagaaa ctgcacttca agtacctata cagctgactt ttaaaaatat ttatttattt 2580
attttgagat ggggtctcac tctgttgccc aggcgggagt gcaatggtgc aatcttggct 2640
gattgcaatc tccgcctctg gggttcaagt gattcttgtg cctcagcctc ccgagtagct 2700
gggactacag gcgtgtgcta ccacacctgg ctaatttttg tgtttttagt agagatgggg 2760
cttcaccatg ttagccaggc tggtttccaa ctcctgacgt caggtgatct acccacctcc 2820
acctcccaaa gtgctgggat tacaggtgtg agccactgtg cccggccctt ttttaaattt 2880
tagagatgat gtcttgctat gttgttcagg ctggactcaa actcttgggc tcaagagatc 2940
ctcctgcctt agcctctcaa gtaactggga ctacatgtgc atgcgactgt gcctcgtttc 3000
ttttcttttt tttctgagac ggagtctcac tctatcgccc aggctggagt gcagtggcgc 3060
catcttggct ccctgcaacc tccgcctcct ggttcaagcg attctcctgc ctcagcctcc 3120
caagtagctg ggattacagg cacctgccat cacgcccggt taatttttgt attttagtag 3180
agacggggtt tcaccatgtt ggctaggctg gtcttgaact cctgacctca ggtgatccac 3240
ccgcctcagc ctcccgaaat gctgggatta caggcgtgag ccagtgcgcc tggccttttc 3300
tttttttgag tctcgctctg cgcccaggct gtgcctggct cgactgtgcc tcctttcatg 3360
caaccatgct gtttctcact ttcagtaaca atattcaata aatcacatga gatatacaac 3420
attttattac tataaaaagg gctttgtgtt agatgacttt gcccaactgt agggtaactt 3480
aaatgctctg aacacgtttc aagtaggcta gggctgagtg tggtagctca tgcctgtaac 3540
cccaatactt ggggaggctg aggtggaagg attgattgag cccaggggtt tgataccagc 3600
atgggcaacg tagcaagacc ttgacttcac agaaaataaa aaattagctg ggtgtcgtgg 3660
catgtgcctg tagtcctagc tacttgggag ggtgaaatca ccggagccca gggaggtcaa 3720
ggctgcagtg agctgagatg gtgccactgc actctagcct gagtgacaga gtgagactct 3780
gtctttaaat aaataaataa aaattagccg ggcgtggtgg ctcacacctg taatcccagc 3840
actttgggag gccgaggcgg gcggatcaca tggtcagaag ttcgagacca gcctggccaa 3900
catggtgaaa ccctgtctct actaaaaata caaaaattag ctgggcgtgg tagcaggcgc 3960
ttgtagtcct agctattcgg gaggctgagg caggagaatc acttgaaccc aggaggcaga 4020
ggttgcagtg agccgagatc atgccactgc actccagcct gggcgacaga gtgagactga 4080
gtctcaaaaa aataaaataa aataaaataa aaataaataa ataaaaatta gccaggcatg 4140
gtggtgcagg cctgtagttg aagcaacttg ggaggctgag ctgggaggat ggatggagcc 4200
tgggaggtgg aggctgcagt gagctgtgac tgcactactg cactctatcc agcctgggtg 4260
acagagcaag accttgtctc aaaaaagtag gctagagacc agcctgggca acatagtgag 4320
actctatcta tctacaaaaa attttaaaaa ttagctgggt atggtggtgt atgcctgtgg 4380
tcctagctac tggggaggca gagttagggg gattgcttga gcccaggagg gtataatgag 4440
ctatgatcac atcactgtaa tccagcctgg gcaacagagc aagatgctgt ctccattaaa 4500
aataaaataa aagtaggcta ggcaggccgg gtgcggtggc tcacgcctgt aatcccagca 4560
ctttgggagg ccaaggcagg cagatcacaa ggtcaggagt tcgagactag cctggccaac 4620
atggtgaaac ctcatctcta ctaaaaaaaa aaataaataa ataacaaaaa attagctggg 4680
cgtcggggca ggtgcctgta atcccagcta ctcagtgggc tgaggcagga gaatcgcttg 4740
aacccagaag gcggaggttg cagtgagccg agatcccgcc actgcactcc agcctgggtg 4800
acagagtgag actctgtctc caaaaaaaaa aaaaaaaaaa gcaggctagg ctaagctatg 4860
atgttcctta gattaggtgt attaaatcca ttttcaactt acaatatttt caacttacga 4920
cgagtttatc aggaagtaac accatcgtaa gtcaagtagc atctgtatca ggcaaagtca 4980
tagaaccatt ttcatgctct ctttaacaat tttctttttg aaagctggtc tggtccttta 5040
aaatatatat tatggtataa gttggtgttc tgaagttagt tagctacaac caggagccat 5100
tgtctttgag gcatcactgc cccctgatgg caaatgcccc aattgcaggt aaaacagtca 5160
agaagaaaac ggcattttga gtgttagact ggaaactttc cacttgataa gaggtcccaa 5220
gacttagtac ctgaagggtg aaatattctc catccagtgg tttcttcttt ggctggggag 5280
aggagctggt gttgttgggc agtgctagga aagaggcaag gaaaggtgat aaaagtgaat 5340
ctgaggcata actgcaccct tggtctcctc caccgcttct tgtcctgctt gcttacctcg 5400
cttagtgctc cctgggggca gctcgtggtg aggctcccct ttcttgcgga gattctcttc 5460
ctctgtgcgc cggtctctcc caggacaggc acaaacacgc acctcaaagc tgttccgtcc 5520
cagtagatta ccactactca ggataggaaa agagaagcaa gaggcagtaa ggaaatcagg 5580
tcctacctgt cccatttaaa aaaccaggct ccatctactc ccaaccaccc ttgtcctttc 5640
tggagcctaa gctccagctc caggtaggtg gaggagaagc cacaggttaa gaggtcccaa 5700
agccagagaa aagaaaactg agtgggagca gtaaggagat tccccgccgg ggatgtgatg 5760
agaggtggat gggtagtagt atggaagaaa tcggtaagag gtgggcccag gggtcagagg 5820
caagcagagg ctggggcaca gcaggccagt gtgcagggtg gcaagtggct cctgacctgg 5880
agtcttccag tgtgatgatg gtgaggatgg gcctccggtt catgccgccc atgcaggaac 5940
tgttacacat gtagttgtag tggatggtgg tacagtcaga gccaacctag gagataacac 6000
aggcccaaga tgaggccagt gcgccttggg gagacctgtg gcaagcaggg gaggcctttt 6060
tttttttttt ttgagatgga atctcgctct gtcgcccagg ctggagtgca gtggcgtgat 6120
ctcagctcac tgcaagctcc accgcccagg ttcacgccat tctccttcct cagcctcccg 6180
agtagctggg actacaggtg cccagcacca cgcccggcta attttttttt gtatttttca 6240
gtagagacgg ggtttcaccg ttagccagga tggtctcgat ctcccaacct cgtgatccgc 6300
ctgccttggc ctcccaaagt gctgggatta caggcatgag ccactgcgcc cagccaagca 6360
ggggaggccc ttagcctctg taagcttcag ttttttcaac tgtgcaatag ttaaacccat 6420
ttactttgca catctcatgg ggttataggg aggtcaaata agcagcagga gaaagccccc 6480
ctactgctca cctggagggc cactgacaac cacccttaac ccctcctccc agagacccca 6540
gttgcaaacc agacctcagg cggctcatag ggcaccacca cactatgtcg aaaagtgttt 6600
ctgtcatcca aatactccac acgcaaattt ccttccactc ggataagatg ctgaggaggg 6660
gccagaccta agagcaatca gtgaggaatc agaggcctgg ggaccctggg caaccagccc 6720
tgtcgtctct ccagccccag ctgctcacca tcgctatctg agcagcgctc atggtggggg 6780
cagcgcctca caacctccgt catgtgctgt gactgcttgt agatggccat ggcgcggacg 6840
cgggtgccgg gcgggggtgt ggaatcaacc cacagctgca cagggcaggt cttggccagt 6900
tggcaaaaca tcttgttgag ggcaggggag tactgtagga agaggaagga gacagagttg 6960
aaagtcaggg cacaagtgaa cagataaagc aactggaaga cggcagcaaa gaaacaaaca 7020
tgcgtaagca cctcctgcaa cccactagcg agctagagag agttggcgtc tacacctcag 7080
gagcttttct tttttttttt tttttttgag atagggtctt gctctgtcac tcaggctgga 7140
gcacagtggt gtgatcacag ctcactgcag cctccatctc ctggcctcaa gtgatcttcc 7200
cacctcagcc tcctaagtgg ctgggactat aggtgtgcac caccatgcct ggctaatttt 7260
ttgtattttt ttgtagagac gaggtttcat catgttaccc aggctggtct tgaactcctg 7320
ggctcaggtg atctgcctgc cttggcctct ttgagagtgc tgggattgca ggtgtgagcc 7380
accaagcctg gtcaggagct tattttcaaa agccaaggaa tacacgtgga tgaagaaaaa 7440
gaaaagttct gcatccccag gagagatgct gagggtgtga tgggatggat aaaagcccaa 7500
attcaagggg ggaatattca actttgggac aggagtcaga gatcacacat taagtgggta 7560
aactataaaa aaacactgac aggaagccaa agggtgaaga ggaatcccaa agttccaaac 7620
aaaagaaatg cagggggata cggccaggca ttgaagtctc atggaagcca gcccctcagg 7680
gcaactgacc gtgcaagtca cagacttggc tgtcccagaa tgcaagaagc ccagacggaa 7740
accgtagctg ccctggtagg ttttctggga agggacagaa gatgacaggg gccaggaggg 7800
ggctggtgca ggggccgccg gtgtaggagc tgctggtgca ggggccacgg ggggagcagc 7860
ctctggcatt ctgggagctt catctggacc tgggtcttca gtgaaccatt gttcaatatc 7920
gtccggggac agcatcaaat catccattgc ttgggacggc aagggggact gtagatgggt 7980
gaaaagagca gtcagaggac caggtcctca gccccccagc cccccagccc tccaggtccc 8040
cagccctcca ggtccccagc ccaacccttg tccttaccag aacgttgttt tcaggaagtc 8100
tgaaagacaa gagcagaaag tcagtcccat ggaattttcg cttcccacag gtctctgcta 8160
gggggctggg gttggggtgg gggtggtggg cctgcccttc caatggatcc actcacagtt 8220
tccataggtc tgaaaatgtt tcctgactca gagggggctc gacgctagga tctgactgcg 8280
gctcctccat ggcagtgacc cggaaggcag tctggctgct gcaagaggaa aagtggggat 8340
ccagcatgag acacttccaa ccctgggtca cctgggcctg cagagaagga accccctccc 8400
ccaacaccat gccagtgtct gagacagctc ggcttcctgt ggagcaggaa aagaatggct 8460
gcttcacatt ctctcttcca atgtt 8485

Claims (22)

1.用于确定基因组DNA中至少一个突变的方法，包括：
A)将所述基因组DNA中包含的至少一部分胞嘧啶转换为尿嘧啶或另一种具有与所述胞嘧啶可区分的碱基配对行为和/或分子量的碱基，
B)用从步骤A)获得的基因组DNA进行突变分析，以确定所述至少一个突变。
2.根据权利要求1所述的方法，其中所述至少一个突变包括体细胞突变。
3.根据权利要求1或2所述的方法，其中所述至少一个突变包括病毒DNA的插入。
4.根据权利要求1至3中任一项所述的方法，其中所述突变分析包括所述基因组DNA中包含的两个或更多个基因的至少一部分。
5.根据权利要求1至4中任一项所述的方法，其中所述突变分析包括基因的至少一部分，所述基因选自下组：BRAF、EGFR、KRAS、NRAS、BRCA1、BRCA2、TP53及其任意组合。
6.根据权利要求1至5中任一项所述的方法，其中所述基因组DNA包括游离循环的DNA和/或来自体液的游离循环细胞的DNA。
7.根据权利要求6所述的方法，其中从血液富集所述游离循环细胞，特别借助于抗体，其抗原位于所述游离循环细胞的表面上。
8.根据权利要求1至7中任一项所述的方法，还包括：
C)用从步骤A)获得的基因组DNA进行甲基化分析，以确定所述基因组DNA中包含至少一个的CpG-二核苷酸的甲基化状态。
9.根据权利要求8所述的方法，其中所述甲基化分析包括确定所述基因组DNA中包含的基因内的两个或更多个CpG-二核苷酸和/或所述基因组DNA中包含的两个或更多个基因中的至少一个CpG-二核苷酸的甲基化状态。
10.根据权利要求8或9所述的方法，其中所述甲基化分析包括基因的至少一部分，所述基因选自下组：SHOX2、SEPT9、BRCA1、LIMK1、APC、VIM、RASSF2、RASSF1、GSTP1、FOXL2、RARB及其任意组合。
11.根据权利要求1至10中任一项所述的方法，其中步骤B)中所述的突变分析和/或步骤C)中所述的甲基化分析在允许定量确定所述至少一个CpG-二核苷酸的所述至少一个突变和/或甲基化状态的条件下进行。
12.根据权利要求1至11中任一项所述的方法，其中所述基因组DNA包括恶性疾病DNA的至少一部分，其中所述恶性疾病的所述DNA至少部分具有所述至少一个如果存在的突变和/或所述至少一个CpG-二核苷酸。
13.根据权利要求12所述的方法，其中所述恶性疾病的所述DNA的所述一部分根据步骤B)中所述的突变分析和/或步骤C)中所述的甲基化分析来确定。
14.根据权利要求8或9所述的方法，其中所述突变分析包括BRAF基因的至少一部分并且所述甲基化分析包括SHOX2基因的至少一部分。
15.根据权利要求8或9所述的方法，其中所述突变分析包括FGFR3、TERT、PIK3CA、KRAS、TP53、NRAS和/或HRAS基因的至少一部分并且所述甲基化分析包括ONECUT2、OTX1、SHOX2、SEPT9和/或TWIST1基因的至少一部分。
16.根据权利要求8或9所述的方法，其中所述突变分析包括TP53基因的至少一部分和/或病毒DNA的插入、特别是一个或多个人乳头瘤病毒(HPV)的DNA的至少一部分或多个部分并且所述甲基化分析包括SEPT9基因的至少一部分。
17.根据权利要求8或9所述的方法，其中所述突变分析包括BRCA1、BRCA2和/或PALB2基因的至少一部分并且所述甲基化分析包括BRCA1基因的至少一部分。
18.根据权利要求8或9所述的方法，其中所述突变分析包括IDH1、IDH2和/或EGFR基因的至少一部分并且所述甲基化分析包括MGMT基因的至少一部分。
19.根据权利要求8或9所述的方法，其中所述突变分析包括TP53基因的至少一部分并且所述甲基化分析包括PITX2基因的至少一部分。
20.权利要求1至19中任一项所述的方法用于恶性疾病的诊断、预后、预测和/或随访的用途。
21.一种用于实施根据权利要求1-19中任一项所述的方法或根据权利要求20所述的用途的试剂盒，包括
a)至少一个第一寡核苷酸对，其被设计成用于杂交在从步骤A)获得的基因组DNA上，以扩增转换的基因组DNA的、怀疑含有所述至少一个突变的至少第一分区。
22.根据权利要求21所述的试剂盒，还包括
b)至少一个第二寡核苷酸对，其被设计成用于杂交在从步骤A)获得的基因组DNA上，以扩增转换的基因组DNA的包含待分析其甲基化状态的所述至少一个CpG-二核苷酸的至少第二分区。
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