ES2829616T3 - Procedimiento para la determinación de una mutación en ADN genómico, uso del procedimiento y kit para la realización del procedimiento - Google Patents

Abstract

Un procedimiento para el diagnóstico, pronóstico, predicción y/o control de desarrollo de una enfermedad maligna, que comprende una determinación al menos de una mutación en ADN genómico, con las etapas de A) convertir al menos una parte de las citosinas contenidas en el ADN genómico en uracilo u otra base con un comportamiento de apareamiento de bases y/o peso molecular que puede diferenciarse de citosina, B) realizar un análisis de mutación con el ADN genómico obtenido de la etapa A), para determinar la al menos una mutación, C) realizar un análisis de metilación con el ADN genómico obtenido de la etapa A), para determinar un estado de metilación al menos de un dinucléotido de CpG contenido en el ADN genómico, D) correlacionar la presencia o ausencia de la mutación con el estado de metilación del dinucleótido de CpG, para determinar el diagnóstico, pronóstico, predicción y/o el desarrollo de la enfermedad maligna, en el que el análisis de mutación comprende al menos una parte del gen BRAF y el análisis de metilación comprende al menos una parte del gen SHOX2; o en el que el análisis de mutación comprende al menos una parte del gen FGFR3, TERT, PIK3CA, KRAS, TP53, NRAS y/o HRAS y el análisis de metilación comprende al menos una parte del gen ONECUT2, OTX1, SHOX2, SEPT9 y/oTWIST1; o en el que el análisis de mutación comprende al menos una parte del gen TP53 y/o una inserción de ADN viral, en particular al menos una parte o varias partes del ADN de uno o varios virus del papiloma humano (VPH) y el análisis de metilación comprende al menos una parte del gen SEPT9; o en el que el análisis de mutación comprende al menos una parte del gen BRCA1, BRCA2 y/o PALB2 y el análisis de metilación comprende al menos una parte del gen BRCA1; o en el que el análisis de mutación comprende al menos una parte del gen IDH1, IDH2 y/o EGFR y el análisis de metilación comprende al menos una parte del gen MGMT; o en el que el análisis de mutación comprende al menos una parte del gen TP53 y el análisis de metilación comprende al menos una parte del gen PITX2; o en el que el análisis de mutación comprende al menos una parte del gen AR, ESR1, BRCA1, BRCA2, PALB2 y/o ERBB2 y el análisis de metilación comprende al menos una parte del gen PITX2.

Description

DESCRIPCIÓN

Procedimiento para la determinación de una mutación en ADN genómico, uso del procedimiento y kit para la realización del procedimiento

Referencia a la solicitud anterior

Esta solicitud de patente reivindica la prioridad de la solicitud de patente alemana con el número de expediente 10 2015 009 187.5, cuyo contenido de divulgación se recoge como referencia por el presente documento.

Listado de secuencias

La solicitud incluye un listado de secuencias electrónico en el formato txt según el estándar WIPO ST.25 con 94 secuencias como parte de la descripción.

Campo de la invención

La invención se refiere a procedimientos de diagnóstico molecular en el campo de la oncología para la determinación de mutaciones en ADN genómico. La invención se refiere además al uso de tales procedimientos de diagnóstico molecular en relación con el diagnóstico, pronóstico, predicción y control de desarrollo de enfermedades malignas. Además, la invención se refiere a un kit para la realización de los procedimientos indicados o bien para los usos indicados. En particular, en el caso de los procedimientos de acuerdo con la invención se trata de procedimientos in vitro.

Antecedentes de la invención

En la era de la medicina personalizada, las terapias dirigidas desempeñan un papel más relevante. En el campo de la oncología se administran ya de manera exitosa algunos medicamentos que inhiben de manera dirigida las proteínas que están mutadas en tumores. Un ejemplo de esto es el medicamento Vemurafenib (nombre común: Zelboraf), que inhibe de manera selectiva el oncogén BRAF. En aproximadamente el 70 % de los tumores de melanoma malignos está mutado este gen. El producto génico resultante tiene mediante esta mutación una elevada actividad. Los pacientes, cuyos tumores presentan una mutación de este tipo, responden, por tanto, bien a una terapia con el inhibidor de BRAF Vemurafenib. La mutación de BRAF es, por consiguiente, un biomarcador predictivo para la respuesta a un tratamiento con Vemurafenib. Por tanto se ha establecido actualmente la determinación de una mutación de BRAF como diagnóstico de rutina para identificar pacientes en los que pueda administrarse Vemurafenib.

Otro ejemplo de una terapia dirigida de este tipo, en la que es relevante el estado de la mutación de un gen, es el medicamento Cetuximab (nombre común: Erbitux). Cetuximab inhibe de manera selectiva el receptor de factor de crecimiento epidérmico (EGFR) y se usa por ejemplo para el tratamiento de cáncer intestinal metastatizado. Sin embargo, este medicamento no actúa cuando otro gen (KRAS) presenta una mutación en la ruta de señalización. Por tanto, la determinación de la mutación de KRAS es predictiva para la no respuesta del paciente a un tratamiento con Cetuximab.

La determinación de una mutación de los correspondientes genes desempeña según esto un papel decisivo. Esto se realiza por regla general mediante secuenciación del ADN. Habitualmente, para este fin, un tumor eliminado quirúrgicamente o una biopsia del tumor se evalúa patológicamente en primer lugar y se marca el tejido tumoral contenido en la muestra de tejido. Si en el material tumoral identificado por el patólogo a continuación es negativa la secuenciación, entonces se muestra que la mutación no existe. Si la secuenciación da un resultado positivo, entones se prueba la existencia de la mutación.

Es problemático que en cualquier estadio de esta cadena de diagnóstico puede identificarse, tratarse o analizarse de manera errónea el material de muestra y puede conducir de esta manera a resultados de falsos negativos. Es posible, por ejemplo, que el histopatólogo identifique tejido normal sano como material tumoral o que mucho tejido normal sano se arrastre hacia el posterior ciclo de trabajo analítico. En tales condiciones previas, una mutación en el plano molecular por regla general puede distinguirse tan sólo con dificultad o ya no puede distinguirse en absoluto. Eventualmente puede poner remedio la evaluación del material de muestra mediante varios patólogos. Esto conduce sin embargo a un tiempo de procesamiento elevado y esfuerzo personal elevado y en consecuencia un aumento de costes. Con ello tampoco se ha eliminado el riesgo adicional de que el tumor contenga sólo una baja proporción de células neoplásicas o las células tumorales se encuentren muy dispersadas en el tejido normal y por consiguiente el análisis molecular puede producir resultados falsos negativos a pesar de la evaluación cuidadosa.

El documento DE 19951189 A1 divulga un procedimiento para la diferenciación de mutaciones de citosina en timina y para la detección de polimorfismo de nucleótido único, single nucleotide polymorphisms (SNP) o mutaciones puntuales en ADN genómico.

En los documentos US 2005/064401 A1, US 2013/338032 A1 y US 2008/0050738 A1 se determinan parámetros genéticos o bien epigenéticos por medio del estado de mutilación de citosina en ADN convertido químicamente. El documento WO 2013/084075 A2 divulga otro procedimiento para la determinación de mutaciones y modificaciones epigenéticas en muestras de ácido nucleico químicamente modificado.

Yaping et al. (Genome Biology 13, 2012, R61) describen un procedimiento para la detección de SNP en ADN convertido con bisulfito.

En Laskar et al. (Tumor Biology 36, 2015, 4661-4670) se somete a estudio la asociación de VPH con modificaciones genéticas y epigenéticas en el cáncer intestinal.

En el documento WO 2013/082043 A1 se somete a estudio la metilación de promotor de RBP1 como biomarcador molecular para la predicción de la supervivencia y respuesta al tratamiento en gliomas.

Los resultados de diagnóstico molecular falsos pueden tener consecuencias fatales. En el peor de los casos, los pacientes que pueden tratarse o bien que requieren terapia no reciben ninguna terapia o no la terapia adecuada. Por otro lado es posible, sin embargo, también que los pacientes reciban terapias innecesarias o reciban la terapia en un momento erróneo.

Por tanto, un objetivo de esta invención es facilitar procedimientos y sus usos así como kits que permitan un diagnóstico molecular robusto, en particular más sensible y/o más específico y económico de mutaciones o bien enfermedades malignas y fomenten una decisión clínica diferenciada y de esta manera reduzcan o solucionen los problemas mencionados anteriormente al menos parcialmente.

Este objetivo se soluciona mediante los objetos de las reivindicaciones independientes 1 y 5 a 8.

Variantes preferentes de la invención resultan de la descripción y las reivindicaciones dependientes.

Definiciones y explicaciones generales

En esta descripción se mencionan distintos documentos para facilitar un antecedente técnico general en relación a la presente invención. Como complemento, la siguiente descripción hace referencia en su totalidad a la divulgación y enseñanza de estos documentos, para evitar repeticiones.

Las siguientes definiciones y explicaciones generales darán instrucciones y ayudarán al lector experto en la comprensión, en la interpretación y en el ejercicio de la presente invención. Salvo otras indicaciones deben tener todos los términos técnicos y científicos aquel significado que corresponda a la comprensión del término habitual de un experto medio en el campo de la presente invención.

Los distintos aspectos y variantes de la invención implican técnicas y métodos de la práctica rutinaria de biología molecular. Los manuales de laboratorio convenientes para estas técnicas y métodos están a disposición para el experto sin más, por ejemplo "Molecular Cloning, A Laboratory Manual" de M.R. Green y J. Sambrook, 4a edición, 2012, Cold Spring Harbor Laboratory Press; "Next-Generation Sequencing: Current Technologies and Applications" de Jianping Xu, 2014, Caister Academic Press; "Next-Generation DNA Sequencing Informatics" de Stuart M. Brown, 2a edición, 2015, Cold Spring Harbor Laboratory Press.

El diseño de cebadores y sondas de oligonucleótido pertenece al conocimiento técnico de un genetista o biólogo molecular. Un algoritmo adecuado, que permite el diseño de cebadores y sondas para ADN convertido (convertido con bisulfito), es MethPrimer (Li, L.C. and Dahiya, R., Bioinformatics, 2002, 18, 1427-31). BiSearch (Tusnady G.E. et al., Nucleic Acids Research, 2005, 33, e9) es otro algoritmo de diseño de cebadores adecuado, que es adecuado tanto para ADN convertido (convertido con bisulfito) como también para ADN genómico, no convertido.

MethBlast (Pattyn, F. et al., BMC Bioinformatics, 2006, 7, 496) es un programa de búsqueda para el análisis de ADN convertido in silico (convertido con bisulfito), tanto en el estado metilado como también en el estado no metilado. Este programa se ha desarrollado sobre todo para encontrar sitios de unión a cebadores y con ello la optimización de la especificidad de amplificaciones por PCR.

Así, tal como se usan en el presente documento, los artículos indeterminados tal como "uno" o "una" incluyen de manera conjunta la posibilidad de que puedan estar presentes también dos o varias de estas características.

Como "gen" se designa en el presente documento un fragmento en el ADN, que comprende regiones de secuencia reguladoras, transcritas y/o funcionales y por consiguiente contiene las informaciones básicas para la preparación de un ARN biológicamente activo.

La nomenclatura para la designación de genes y sus nucleótidos se realiza de manera correspondiente a la recomendación del "Human Genome Organisation Gene Nomenclature Committee" (HGNC) actualizada el 30 de junio de 2015. Una cepa de gen se designa por ejemplo con letras mayúsculas latinas cursivas (por ejemplo EGFR, BRAF). Dado el caso, al símbolo de cepa le siguen uno o varios números arábigos o una combinación de números arábigos y letras latinas para la designación de un miembro de la familia de la cepa de gen (por ejemplo BRCA1, BRCA2, SHOX2).

La descripción de genes en el plano de ADN, o sea por ejemplo la denominación de nucleótidos, variaciones de secuencia y mutaciones, sigue las recomendaciones de "Human Genome Variation Society" (HGVS) para la descripción de variantes de secuencia actualizada el 30 de junio de 2015 (den Dünnen, J.T. and Antonarakis, S.E., Human Mutation, 2000, 15, 7-12).

Los genes descritos en el presente documento están disponibles al público por medio del "GenBank" del National Institute of Health, EE.UU., actualizado el 30 de junio de 2015 (Benson D.A. et al., Nucleic Acids Research, 2013, 41, D36-42).

Cuando a continuación se hace referencia a "identidad de secuencia de al menos el 95 %", esto incluye de manera conjunta identidades de secuencia más altas, tal como por ejemplo identidad de secuencia de al menos el 96 %, al menos el 97 %, al menos el 98 %, al menos el 99 % o del 100 %. La identidad de secuencia de dos secuencias de ácido nucleico puede determinarse por ejemplo con el algoritmo ClustalW (Thompson et al., Nucleic Acids Research, 1994, 22, 4673-4680).

Como "ADN genómico" en el sentido de la invención ha de entenderse cualquier parte de aquel ADN que forma o ha formado al menos parcialmente el genoma de una o varias células. En particular, ADN genómico puede encontrarse también como ADN libre de células, por ejemplo ADN circulante, que se ha liberado de una o varias células de un tumor. De manera correspondiente, "ADN genómico" incluye de manera conjunta también ADN aislado de células y dado el caso purificado.

Una "mutación" comprende una modificación permanente en el material genético, cuyo origen se encuentra en una célula individual y que a continuación se transmite a las células hijas. En distintas variantes de la invención, "mutación" comprende una mutación génica, por ejemplo una mutación puntual, delección, inserción, duplicación, amplificación, translocación, fusión o inversión. En ciertas variantes de la invención puede estar caracterizada una mutación por una frecuencia de alelos inferior al 1 % en la población mundial y por consiguiente puede separarse de un polimorfismo, que presenta de acuerdo con la definición más del 1 % de frecuencia de alelos en la población mundial.

Así, tal como se usa el término en el presente documento, una mutación comprende también la integración de ADN de origen viral en el ADN genómico en el sentido de una mutación por inserción. Ejemplos no limitativos de tales virus que tienen la capacidad de integrarse en el genoma de la célula infectada y de originar mutaciones por inserción son el virus de Epstein-Barr (VEB), el virus de la hepatitis B (VHB), virus de papiloma humanos (VPH), el virus linfotrópico humano de células T tipo 1 (HTLV-1), y el poliomavirus de células de Merkel (MCPyV).

De manera correspondiente comprende "análisis de mutación" un estudio de si existe y dado el caso en qué forma o bien en qué medida una modificación de este tipo en el material genético. En variantes distintas de la invención puede detectarse esto, por ejemplo, por medio de una desviación de la secuencia de bases, del peso molecular, de la intensidad de hibridación o de otra propiedad adecuada de un fragmento del ADN genómico que va a analizarse de un valor normalizado. Como valor normalizado es adecuado, por ejemplo, la correspondiente propiedad, en particular la secuencia de bases, de un correspondiente fragmento de un ADN genómico, que no presenta la modificación, a continuación designado también como tipo natural, estado de tipo natural o también ADN de referencia. Como tipo natural es adecuado, por ejemplo, ADN genómico de tejido normal, en particular tejido sano, del mismo individuo. Esto puede ser, por ejemplo, el tipo natural preferente en relación a la determinación de una mutación somática. Como tipo natural puede usarse también un genoma de referencia. Un genoma de referencia adecuado comprende la versión de genoma humano del Genome Reference Consortium Genome Reference Consortium Human Build 38 patch release 2 (GRCh38.p2) actualizado el 16 de julio de 2015. Un genoma de referencia puede ser, por ejemplo, el tipo natural preferente en relación a la determinación de una mutación de línea germinal y/o mutación somática. En determinadas variantes se entiende por "análisis de mutación" la determinación de si el ADN genómico que va a analizarse presenta una desviación en la secuencia de bases de un ADN de tipo natural, en particular de un gen determinado o de una secuencia determinada del ADN de tipo natural. Estas variantes incluyen de manera conjunta expresamente que también sólo una desviación en una parte del gen o de la secuencia determinada del ADN de tipo natural está comprendida por el análisis de mutación para determinar la mutación.

Por un "polimorfismo" se entiende la aparición de varias variantes génicas que resultan de variaciones de secuencia dentro de una población. Un polimorfismo se refiere a la línea germinal, puede transmitirse de un individuo a otro y aparece igualmente en todas las células de un organismo. La variante génica más rara dentro de una población debe tener a diferencia de una variación de secuencia o una mutación de la línea germinal de acuerdo con la definición una frecuencia de aparición (frecuencia de alelos) superior al uno por ciento.

Por la "línea germinal" se entiende aquella sucesión celular (genealogía), de la que resultan las células germinales (células generativas, gametos). Las líneas celulares somáticas que se desvían de la línea germinal forman el cuerpo (la soma). Por una "mutación de línea germinal" se entiende según esto una mutación que se produce en las células de la línea germinal de un organismo, afecta igualmente a todas las células del organismo y puede transmitirse de un individuo a otro. Por el contrario se entiende por una "mutación somática" una mutación que se produce fuera de la línea germinal, es decir en células somáticas (células de la soma). Esta mutación afecta sólo a una parte de las células de un organismo, por ejemplo células tumorales. Esta mutación no puede transmitirse de un individuo a otro.

Por una "mutación recurrente" se entiende una mutación, que se produce muy frecuentemente en una determinada enfermedad maligna. En particular existe una mutación recurrente cuando ésta se produce en al menos el 1 %, al menos el 3 % o al menos el 10 % de los casos de esta determinada enfermedad maligna. Por un ''gen mutado de manera recurrente" se entiende un gen, que presenta muy frecuentemente en una determinada enfermedad maligna al menos una mutación. En particular existe un gen mutado de manera recurrente cuando éste presenta en al menos el 5 %, al menos el 10 % o al menos el 20 % de los casos de esta determinada enfermedad maligna al menos una mutación.

Un "dinucleótido de CpG" es un motivo de ADN, que presenta en dirección de lectura generalmente válida de 5' a 3' la secuencia de nucleósidos citidina-fosfato-guanosina. Guanosina está constituida por la base nitrogenada guanina y el azúcar 13-D-ribosa. Citidina está constituida por la base nitrogenada citosina y el azúcar 13-D-ribosa.

Un "análisis de metilación" en el sentido de la presente invención comprende la determinación del estado de metilación de un dinucleótido de CpG o de varios dinucleótidos de CpG a partir de un contexto de secuencia determinado. En distintas variantes de la invención se entiende por "análisis de metilación" la determinación de si la citosina se encuentra metilada en el o los dinucleótidos de CpG. El análisis de metilación puede comprender una copia individual del dinucleótido de CpG. El análisis de metilación puede comprender también una pluralidad de copias del dinucleótido de CpG, por ejemplo cuando el ADN de una pluralidad de células está contenido en el ADN genómico. En este caso puede proporcionar el análisis de metilación un estado de metilación o bien un valor de metilación del dinucleótido de CpG, es decir un valor transversal, que comprende el estado de metilación de la pluralidad de copias del dinucleótido de CpG.

Un dinucleótido de CpG puede estar "metilado de manera aberrante" en un tejido o un tipo celular o bien puede tener un "estado de metilación aberrante", con lo que se quiere decir en este caso un dinucleótido de CpG que se encuentra hipermetilado o hipometilado en el ADN genómico en comparación con un valor normalizado. Como valor normalizado puede servir, por ejemplo, el estado de metilación del correspondiente dinucleótido de CpG en el ADN genómico del mismo tipo de tejido o celular, diferenciándose este mismo tipo de tejido o celular en una propiedad, con respecto a la cual el dinucleótido de CpG está "metilado de manera aberrante". "Metilados de manera aberrante" están por ejemplo los genes que presentan en células tumorales una metilación más alta o más baja que en el tejido del cual se ha producido el tumor. El "estado de metilación aberrante" se conserva cuando el ADN genómico se libera del tumor o de la célula, por ejemplo en forma de ADN circulante en la sangre. Los valores normalizados adecuados pueden determinarse según esto por ejemplo de manera experimental, realizándose un análisis de metilación del mismo tipo celular o del mismo tipo de tejido, que sin embargo no lleva la propiedad, con respecto a la que el al menos un dinucleótido de CpG deba determinarse como "metilado de manera aberrante". Hipermetilado e hipometilado pueden designar según esto una metilación más alta o bien más baja con respecto al valor normalizado. Los dinucleótidos de CpG hipermetilados muestran un valor de metilación, que es más alto que el valor normalizado, en particular que se encuentra al menos un 25 % por encima del valor normalizado. Los dinucleótidos de CpG hipometilados muestran un valor de metilación, que es más bajo que el valor normalizado, en particular que se encuentra al menos un 25 % por debajo del valor normalizado. Si el valor normalizado de un dinucleótido de CpG determinado es cero, entonces el dinucleótido de CpG determinado no está hipometilado.

Las enfermedades malignas o "perniciosas" comprenden enfermedades que están caracterizadas por un desarrollo de la enfermedad que es progresivamente destructora y posiblemente puede conducir también a la muerte del paciente. Las enfermedades malignas comprenden nuevas formaciones tisulares malignas, por ejemplo neoplasias o tumores, pudiéndose caracterizar la malignidad por crecimiento no controlado, que requiere espacio, que desplaza, infiltrativo y/o invasivo. Los tumores malignos pueden formar por regla general tumores secundarios (metástasis). Los tumores malignos son, por ejemplo, carcinomas, sarcomas, melanomas, blastomas y teratomas. Las enfermedades malignas comprenden también enfermedades malignas hematológicas, es decir enfermedades perniciosas que afectan al sistema sanguíneo o al sistema hematopoyético, por ejemplo leucemias, linfomas, enfermedades mieloproliferativas y síndromes mielodisplásicos. Las leucemias comprenden un grupo de enfermedades malignas en las que se han modificado de manera perniciosa células hematopoyéticas inmaduras, se reproducen de manera excesivamente fuerte y conducen a una acumulación de células en la sangre periférica. Los linfomas comprenden enfermedades en las que las células del sistema linfático se han degenerado. Las enfermedades mieloproliferativas comprenden un grupo de enfermedades, en las que se producen cada vez mucho más una o varias series de células hematopoyéticas. Los síndromes mielodisplásicos comprenden una expansión clonal de células precursoras de todas las series de células hematopoyéticas, basándose en una alteración de la diferenciación que discurre de manera crónica de las células madre hematopoyéticas.

Los biomarcadores son indicadores característicos o/y características biológicas, que pueden medirse de manera objetiva y permiten la deducción del estado de un proceso biológico normal o de un proceso patológico en un organismo, o bien la respuesta de un proceso normal o patológico a una intervención, por ejemplo una operación, una irradiación o un tratamiento medicamentoso. Los biomarcadores son con frecuencia sustancias (bio)químicas, tal como, por ejemplo, proteínas, hormonas, metabolitos, azúcares y ácidos nucleicos, así como modificaciones de los mismos.

Así, tal como se usan los términos en el presente documento, incluye "diagnóstico" una constatación o bien determinación de una enfermedad maligna, "pronóstico" una declaración sobre un desarrollo de una enfermedad maligna en el futuro, en particular en ausencia de una medida terapéutica, "predicción" una previsión de un comportamiento de respuesta de una enfermedad maligna a una determinada terapia y "control de desarrollo" una determinación de un estado de una enfermedad maligna en distintos momentos, por ejemplo antes, durante y tras una terapia. En particular designan estos términos etapas deductivas en relación con un procedimiento in vitro anterior, de modo que no tenga lugar ninguna etapa técnica esencial de la invención en el cuerpo humano o animal.

Tanto la descripción general anterior como también la descripción detallada siguiente han de interpretarse como ejemplo y deben servir para la explicación de la invención reivindicada. Otras ventajas y características de la invención son evidentes a partir de la descripción posterior, los dibujos y las reivindicaciones. Aunque la invención se explica por medio de sus formas de realización preferentes, pueden realizarse muchas otras variaciones, sin salirse del alcance de la presente invención. Por tanto está previsto que las reivindicaciones adjuntas cubran variaciones y combinaciones de características que están contenidas en el alcance real de la invención, Aunque éstas no estén representadas de manera expresa en las reivindicaciones.

Breve descripción de las figuras

La figura 1 muestra el resultado de un análisis de referencia de una secuencia del gen BRAF con ADN genómico no convertido de tejido normal (A) y de tejido maligno (B) así como el resultado del análisis de acuerdo con la invención de la secuencia del gen BRAF con ADN genómico convertido de tejido normal (C) y de tejido maligno (D).

La figura 2 muestra los resultados de una combinación de análisis de metilación de SHOX2 y análisis de mutación de BRAF en el plasma de pacientes con melanoma. Izquierda: resultados de PCR a tiempo real para el número de copias total de secuencias de ADN de BRAF (líneas continuas) y el número de copias de secuencias de ADN de SHOX2 metilado (líneas discontinuas). Derecha: secuenciación del amplificado por PCR de BRAF generado durante la cuantificación por PCR a tiempo real. A: paciente con baja carga tumoral y BRAF de tipo natural en el tumor primario. B: paciente con baja carga tumoral y mutación de BRAF V600E de tumor primario. C: paciente con alta carga tumoral y BRAF de tipo natural en el tumor primario. D: paciente con alta carga tumoral y mutación de BRAF V600E de tumor primario.

La figura 3 muestra los resultados de la secuenciación del locus EGFR (exón 21) con mutación L858R. A: análisis de referencia de ADN genómico no convertido del tejido sano, que limita con el tumor. B: análisis de referencia de ADN genómico no convertido del tejido tumoral. C: análisis de acuerdo con la invención de ADN genómico convertido del tejido sano. D: análisis de acuerdo con la invención de ADN genómico convertido del tejido tumoral. La figura 4 muestra los resultados de la secuenciación del locus génico EGFR (exón 19) con una delección. A: análisis de referencia de ADN genómico no convertido del tejido sano, que limita con el tumor. B: análisis de referencia de ADN genómico no convertido del tejido tumoral. C: análisis de acuerdo con la invención de ADN genómico convertido del tejido sano. D: análisis de acuerdo con la invención de ADN genómico convertido del tejido tumoral.

La figura 5 muestra el resultado de una secuenciación de clones de los dos alelos de los productos de PCR de la figura 4D. A: alelo de tipo natural del ADN genómico convertido del tumor que lleva la mutación. B: alelo mutado del ADN genómico convertido del tumor que lleva la mutación con una delección de 15 bases.

La figura 6 muestra los resultados de la secuenciación del locus KRAS (exón 4). A: análisis de referencia de ADN genómico no convertido del tejido sano, que limita con el tumor. Secuenciación de la cadena directa. B: análisis de referencia de ADN genómico no convertido del tejido tumoral. Secuenciación de la cadena directa. C: análisis de acuerdo con la invención de ADN genómico convertido del tejido sano. Secuenciación directa de la cadena con bisulfito-I. D: análisis de acuerdo con la invención de ADN genómico convertido del tejido tumoral. Secuenciación directa de la cadena con bisulfito-I. E: Como A, sin embargo secuenciación de la cadena inversa. F: Como B, sin embargo secuenciación de la cadena inversa. G: análisis de acuerdo con la invención de ADN genómico convertido del tejido sano. Secuenciación inversa de la cadena con bisulfito-II. H: análisis de acuerdo con la invención de ADN genómico convertido del tejido tumoral. Secuenciación inversa de la cadena con bisulfito-II.

Breve descripción de las secuencias

SEQ ID NO:1 cebador directo usado para la amplificación del locus de BRAF V600E no convertido (SEQ ID NO:3) y del convertido (SEQ ID NO:4).

SEQ ID NO:2 cebador inverso usado para la amplificación del locus de BRAF V600E no convertido (SEQ ID NO:3) y del convertido (SEQ ID NO:4).

SEQ ID NO:3 locus de gen BRAF, que comprende la posición de la mutación V600E.

SEQ ID NO:4 locus de gen BRAF convertido (cadena con bisulfito-II), que comprende la posición de la mutación V600E.

SEQ ID NO:5 sonda de detección de qPCR, que se dirige al locus de gen BRAF convertido con bisulfito (SEQ ID NO:4), que comprende la mutación V600E.

SEQ ID NO:6 locus de gen SHOX2, que se sometió a estudio en el contexto de análisis de metilación.

SEQ ID NO:7 cebador directo usado para la amplificación del locus de gen SHOX2 convertido (SEQ ID NO:10). SEQ ID NO:8 cebador inverso usado para la amplificación del locus de gen SHOX2 convertido (SEQ ID NO:10). SEQ ID NO:9 oligonucleótido bloqueador usado para impedir al cebador directo (SEQ ID NO:7) la unión al locus de gen SHOX2 convertido (SEQ iD NO:10), Cuando éste no está metilado.

SEQ ID NO:10 locus de gen SHOX2 convertido (cadena con bisulfito-I) derivado de la secuencia genómica SEQ ID NO:6.

SEQ ID NO:11 sonda de detección de qPCR, que se dirige al locus de gen SHOX2 metilado convertido (SEQ ID NO:10).

SEQ ID NO:12 cebador secuenciador usado para la secuenciación de Sanger del locus de gen BRAF convertido (SEQ ID NO:4).

SEQ ID NO:13 cebador directo usado para amplificar el locus de gen EGFR exón 21 no convertido (SEQ ID NO:15), que comprende la mutación L858R.

SEQ ID NO:14 cebador inverso usado, para amplificar el locus de gen EGFR exón 21 no convertido (SEQ ID NO:15), que comprende la mutación L858R.

SEQ ID NO:15 locus de gen EGFR exón 21 no convertido, que comprende la mutación L858R.

SEQ ID NO:16 cebador directo usado para amplificar el locus de gen EGFR exón 21 convertido (SEQ ID NO:18), que comprende la mutación L858R.

SEQ ID NO:17 cebador inverso usado, para amplificar el locus de gen EGFR exón 21 convertido (SEQ ID NO:18), que comprende la mutación L858R.

SEQ ID NO:18 locus de gen EGFR exón 21 convertido (cadena con bisulfito-I) derivado de SEQ ID NO:15, que comprende la mutación L858R.

SEQ ID NO:19 cebador directo usado para amplificar el locus de gen EGFR exón 19 no convertido (SEQ ID NO:21). SEQ ID NO:20 cebador inverso usado, para amplificar el locus de gen EGFR exón 19 no convertido (SEQ ID NO:21).

SEQ ID NO:21 locus de gen EGFR exón 19 no convertido.

SEQ ID NO:22 cebador directo usado para amplificar el locus de gen EGFR exón 19 convertido (SEQ ID NO:24). SEQ ID NO:23 cebador inverso usado, para amplificar el locus de gen EGFR exón 19 convertido (SEQ ID NO:24). SEQ ID NO:24 locus de gen EGFR exón 19 convertido (cadena con bisulfito-I) derivado de SEQ ID NO:21. SEQ ID NO:25 cebador directo usado para amplificar el locus de gen KRAS exón 4 no convertido (SEQ ID NO:27). SEQ ID NO:26 cebador inverso usado, para amplificar el locus de gen KRAS exón 4 no convertido (SEQ ID NO:27). SEQ ID NO:27 locus de gen KRAS exón 4 no convertido.

SEQ ID NO:28 locus de gen KRAS exón 4 convertido (cadena con bisulfito-I) derivado de SEQ ID NO:27.

SEQ ID NO:29 cebador directo usado para amplificar el locus de gen KRAS exón 4 convertido (SEQ ID NO:28). SEQ ID NO:30 cebador inverso usado, para amplificar el locus de gen KRAS exón 4 convertido (SEQ ID NO:28). SEQ ID NO:31 locus de gen KRAS exón 4 convertido (cadena con bisulfito-II) derivado de SEQ ID NO:27. SEQ ID NO:32 cebador directo usado para amplificar el locus de gen KRAS exón 4 convertido (SEQ ID NO:31). SEQ ID NO:33 cebador inverso usado, para amplificar el locus de gen KRAS exón 4 convertido (SEQ ID NO:31). SEQ ID NO:34 BRCA2, "región de interés" (ROI) 1.

SEQ ID NO:35 BRCA2, ROI 2.

SEQ ID NO:36 BRCA2, ROI 3.

SEQ ID NO:37 BRCA2, ROI 4.

SEQ ID NO:38 BRCA2, ROI 5

SEQ ID NO:39 BRCA2, ROI 6, preferido para análisis de metilación.

SEQ ID NO:40 BRCA2, ROI 7.

SEQ ID NO:41 BRCA2, ROI 8.

SEQ ID NO:42 BRCA2, ROI 9.

SEQ ID NO:43 BRCA2, ROI 10.

SEQ ID NO:44 BRCA2, ROI 11.

SEQ ID NO:45 BRCA2, ROI 12.

SEQ ID NO:46 BRCA1, "región de interés" (ROI) 1.

SEQ ID NO:47 BRCA1, ROI 2.

SEQ ID NO:48 BRCA1, ROI 3.

SEQ ID NO:49 BRCA1, ROI 4.

SEQ ID NO:50 BRCA1, ROI 5.

SEQ ID NO:51 BRCA1, ROI 6.

SEQ ID NO:52 BRCA1, ROI 7.

SEQ ID NO:53 BRCA1, ROI 8.

SEQ ID NO:54 BRCA1, ROI 9.

SEQ ID NO:55 BRCA1, ROI 10.

SEQ ID NO:56 BRCA1, ROI 11, preferido para análisis de mutación.

SEQ ID NO:57 BRCA1, ROI 12.

SEQ ID NO:58 BRCA1, ROI 13.

SEQ ID NO:59 BRCA1, ROI 14.

SEQ ID NO:60 BRCA1, ROI 15.

SEQ ID NO:61 BRCA1, ROI 16, preferido para análisis de metilación.

SEQ ID NO:62 BRCA1, ROI 17.

SEQ ID NO:63 BRCA1, ROI 18.

SEQ ID NO:64 EGFR, "región de interés" (ROI) 1, exón 19.

SEQ ID NO:65 EGFR, ROI 2, exón 21.

SEQ ID NO:66 EGFR, ROI 3, exón 20.

SEQ ID NO:67 EGFR, ROI 4, exón 18.

SEQ ID NO:68 KRAS, "región de interés" (ROI) 1, exón 2.

SEQ ID NO:69 KRAS, ROI 2, exón 3.

SEQ ID NO:70 KRAS, ROI 3, exón 4.

SEQ ID NO:71 BRAF, "región de interés" (ROI) 1, exón 15.

SEQ ID NO:72 BRAF, ROI 2, exón 11.

SEQ ID NO:73 AKT1, "región de interés" (ROI) 1.

SEQ ID NO:74 DDR2, "región de interés" (ROI) 1, exón 19.

SEQ ID NO:75 DDR2, ROI 2, exón 18.

SEQ ID NO:76 DDR2, ROI 3, exones 16 y 17.

SEQ ID NO:77 ERBB2 (HER2), "región de interés" (ROI) 1.

SEQ ID NO:78 MAP2K1 (MEK1), "región de interés" (ROI) 1.

SEQ ID NO:79 NRAS, "región de interés" (ROI) 1, codón 61.

SEQ ID NO:80 NRAS, ROI 2, codón 12.

SEQ ID NO:81 PIK3CA, "región de interés" (ROI) 1, exón 9.

SEQ ID NO:82 PIK3CA, ROI 2, exón 20.

SEQ ID NO:83 PTEN, "región de interés" (ROI) 1, exón 7.

SEQ ID NO:84 IDH1, "región de interés" (ROI) 1.

SEQ ID NO:85 IDH2, "región de interés" (ROI) 1.

SEQ ID NO:86 cebador directo (F1) adecuado para análisis de metilación de BRCA1.

SEQ ID NO:87 cebador inverso (R1) adecuado para análisis de metilación de BRCA1.

SEQ ID NO:88 cebador directo (F2) adecuado para análisis de metilación de BRCA1.

SEQ ID NO:89 cebador inverso (R2) adecuado para análisis de metilación de BRCA1.

SEQ ID NO:90 PITX2, "región de interés" (ROI) 1, promotor A, preferido para análisis de metilación. SEQ ID NO:91 PITX2, ROI 2, promotor C, preferido para análisis de metilación.

SEQ ID NO:92 MGMT, "región de interés" (ROI) 1, preferido para análisis de metilación.

SEQ ID NO:93 SEPT9, "región de interés" (ROI) 1, preferido para análisis de metilación.

SEQ ID NO:94 TP53"región de interés" (ROI) 1.

Descripción de la invención

El primer aspecto de la presente invención se refiere a un procedimiento para el diagnóstico, pronóstico, predicción y/o control de desarrollo de una enfermedad maligna, que comprende una determinación al menos de una mutación en ADN genómico. El procedimiento comprende las siguientes etapas: A) convertir al menos una parte de las citosinas contenidas en el ADN genómico en uracilo u otra base con un comportamiento de apareamiento de bases y/o peso molecular que puede diferenciarse de citosina, B) realizar un análisis de mutación con el ADN genómico obtenido de la etapa A), para determinar la al menos una mutación. El ADN genómico obtenido de la etapa A) se designa a continuación también como "ADN modificado" o "ADN convertido". Como consecuencia de esto designa "ADN no convertido" aquel ADN genómico que no ha recorrido la etapa A).

La presente invención se basa entre otras cosas en el conocimiento de la parte inventora de que muchas muestras clínicamente relevantes, tal como por ejemplo biopsias, materiales aspirados con aguja fina, células microdiseccionadas con láser, plasma sanguíneo o células tumorales de libre circulación contienen sólo muy bajas cantidades de ADN genómico, sin embargo al mismo tiempo en la rutina clínica se requieren cada vez más cantidad de parámetros genéticos para un tratamiento personalizado y optimizado del paciente. En el plasma sanguíneo están contenidas por ejemplo con frecuencia sólo de algunos cientos a algunos miles de copias de ADN de ADN de libre circulación por mililitro de plasma. Las células tumorales circulantes se producen incluso sólo en un orden de magnitud de algunas células individuales a algunas docenas de células tumorales por 10 mililitros de sangre completa. En células microdiseccionadas con láser, la cantidad del ADN depende del número de las células microdiseccionadas y puede alcanzar por una célula individual con dos copias de ADN hasta más de 1000 células. Con frecuencia se realiza la microdisección con láser con muestras fijadas en formalina e incrustadas en parafina, en las que se ha degradado la parte predominante del ADN y por tanto no está a disposición para procedimientos de diagnóstico molecular. Es problemático a este respecto que el ADN genómico, tras recorrer un procedimiento de diagnóstico molecular convencional, no puede recuperarse por regla general de manera inalterada o bien no puede recuperarse en absoluto. Por consiguiente no son posibles otros procedimientos de diagnóstico molecular o repeticiones de procedimientos de diagnóstico molecular.

Un ejemplo de otro procedimiento de diagnóstico molecular es un análisis de metilación, en el que el ADN genómico debe convertirse en primer lugar, por ejemplo mediante tratamiento con bisulfito. A este respecto se convierte citosina no metilada, por ejemplo, en uracilo, mientras que la citosina metilada (metilcitosina, meC) permanece inalterada. Uracilo tiene las mismas propiedades de apareamiento de bases que timina. Por tanto ya no pueden diferenciarse ambos uno de otro en el contexto de una amplificación posterior del ADN genómico convertido. Por tanto tiene lugar una conversión de C en U, que, debido al mismo comportamiento de apareamiento de bases de T y U, se comporta como una conversión de C en T. En consecuencia, la conversión de la citosina reduce mucho la complejidad de secuencia del ADN y conduce con ello por regla general a una pérdida considerable de información genética. Por este motivo, un médico molecular se ha visto obligado hasta ahora justamente en caso de muestras pequeñas y muy pequeñas a decidir qué análisis se realiza, por ejemplo un análisis de mutación o un análisis de metilación.

El análisis de mutación descrito en ADN convertido soluciona este problema. Aunque la conversión de ADN genómico para el fin de un análisis de metilación se conoce desde aproximadamente un cuarto de siglo (Frommer, M. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1992, 89, 1827-1831), no se ha podido mostrar en este largo tiempo por el mundo científico que sea posible un análisis de mutaciones también en ADN convertido. Más bien supuso la doctrina imperante que la pérdida de información genética mediante la conversión del ADN genómico hace de difícil a imposible la determinación de una mutación, en particular cuando estén afectadas citosinas por mutaciones.

Esta opinión ampliamente extendida entre los especialistas se superó en el contexto de la presente invención. Pudo mostrarse que es posible el análisis de mutaciones en ADN convertido. Este reconocimiento inventivo da como resultado distintas ventajas inesperadas. Por ejemplo, el análisis de mutación de acuerdo con la invención en ADN convertido permite por primera vez una combinación directa del análisis de mutación con otros análisis, tal como por ejemplo el análisis de metilación dentro de la misma muestra. De esta manera pueden multiplexarse y analizarse de manera paralela distintos parámetros genéticos y epigenéticos clínicamente relevantes en alta medida. Esto conduce no solo a un diagnóstico molecular económico de enfermedades, sino que permite también una decisión clínica diferenciada con tiempos de análisis simultáneamente más cortos. Sorprendentemente pudo determinarse también que pueden analizarse determinadas mutaciones incluso mejor que con un análisis de mutación convencional con ADN genómico no convertido. Con respecto a esto se remite también a los ejemplos de realización que siguen a continuación.

El ADN genómico puede proceder de distintas fuentes, por ejemplo de células de tejido tomado quirúrgicamente o por biopsia. Las células pueden proceder también de frotis y de materiales aspirados tal como por ejemplo líquidos de lavado, materiales aspirados con aguja fina o esputo. El ADN genómico puede proceder también de sangre, suero sanguíneo y plasma sanguíneo, por ejemplo en forma de ADN de libre circulación, ADN exosomal, o en forma de células de libre circulación, de las que se obtiene el ADN genómico. El ADN genómico puede proceder también de otros líquidos corporales tal como por ejemplo orina, derrames pleurales o ascitis, por ejemplo en forma de ADN libre o en forma de células, de las que se obtiene el ADN genómico. El ADN puede obtenerse de células, tejidos y líquidos corporales no conservados (frescos), así como de células, tejidos y líquidos corporales fijados. La fijación de las células, tejidos y líquidos corporales puede conseguirse mediante fijador de precipitación, tal como por ejemplo etanol y otros alcoholes o mediante fijador de reticulación transversal tal como por ejemplo formaldehído. El ADN genómico puede proceder también de combinaciones discrecionales de estas fuentes. Puede tratarse también de ADN extraído de las fuentes mencionadas anteriormente. También es posible enriquecer el ADN genómico, por ejemplo mediante precipitación o extracción. Esto puede ofrecerse por ejemplo en el caso de ADN genómico de libre circulación a partir de los líquidos corporales mencionados. También es posible enriquecer las células, por ejemplo mediante filtración por tamaño o a través de anticuerpos unidos en superficie (por ejemplo en partículas magnéticas, membranas o polímeros), cuyos antígenos se encuentran en la superficie de las células que van a enriquecerse, tal como por ejemplo un anticuerpo anti-EpCAM. Esto puede ofrecerse por ejemplo en el caso de células de libre circulación a partir de los líquidos corporales mencionados. Un dispositivo adecuado para el enriquecimiento de células de libre circulación del sistema circulatorio de un paciente se ha descrito por ejemplo en el documento WO 2010/145824 A1, al que se hace referencia en su totalidad para completar el antecedente técnico de esta invención. Los correspondiente dispositivos que pueden obtenerse comercialmente son por ejemplo el Cell-Collector Detektor CANCER01 (DC01) y Detektor CANCER02 (DC02) (ambos de GILUPI GmbH, Potsdam, Alemania). Otras fuentes adecuadas de A d N genómico son lisados u homogeneizados de tejidos frescos y lisados de tejidos fijados.

La conversión del ADN genómico en la etapa A) puede realizarse en principio con todos los métodos conocidos y adecuados en el estado de la técnica para este fin. Normalmente se trata de una conversión química o enzimática, por ejemplo mediante contacto del ADN genómico con bisulfito, por ejemplo bisulfito de sodio o bisulfito de amonio, o con citidina-desaminasas.

En caso necesario puede realizarse tras la conversión en la etapa A) y antes del análisis de mutación en la etapa B) una purificación del ADN genómico obtenido de la etapa A). Los métodos de purificación y protocolos adecuados los conoce el experto y pueden comprender por ejemplo una extracción de ADN, una precipitación o un enriquecimiento soportado por polímero (polymer-mediated enrichment).

El tipo de análisis de mutación en la etapa B) no está sujeto a ninguna limitación especial. Un experto puede determinar métodos adecuados fácilmente basándose en esta divulgación. Con respecto a esto se remite también a los manuales de laboratorio mencionados anteriormente. En una variante preferente se realiza en primer lugar una reacción en cadena de la polimerasa (PCR) con oligonucleótidos, los denominados cebadores, que está diseñada para amplificar un fragmento del ADN genómico convertido, del que se sospecha que contiene la mutación. A continuación se realiza preferentemente una secuenciación al menos de una parte del amplificado, por ejemplo una secuenciación de Sanger, pirosecuenciación, secuenciación por espectrometría de masas o una secuenciación de la segunda o tercera generación, que se designa también como "Massive Parallel Sequencing", "Next Generation Sequencing" (NGS) o como secuenciación de nanoporos. También es posible realizar a continuación de la PCR una hibridación con oligonucleótidos específicos de mutación (sondas), por ejemplo en forma de una micromatriz de ADN. La mutación puede determinarse también mediante PCR en tiempo real cuantitativa (quantitative real-time PCR, qPCR), dado el caso seguida de un análisis de curvas de fusión. La mutación puede determinarse también mediante procedimientos a base de PCR modificados, tal como por ejemplo ARMES (Amplification Refractory Mutation System).

En otras variantes a su vez preferentes puede no tener lugar una PCR, por ejemplo en una "Whole Genome Shotgun Bisulfite Sequencing" (WGSBS) o una secuenciación de nanoporos directa. En el caso de WGSBS se fragmenta el ADN, a continuación se ligan adaptadores a los fragmentos de ADN. A través de los adaptadores es posible a continuación una amplificación y secuenciación. Es también posible en el caso de WGSBS suprimir la etapa de la fragmentación, dado que el ADN puede encontrarse ya fragmentado por ejemplo mediante la conversión mediante tratamiento con bisulfito. Los protocolos para la realización de una WGSBS son fácilmente accesibles por el experto (Johnson, M. D. et al., Curr. Protoc. Mol. Biol., 2012, 99, 21.23.1-21.23.28; Lister, R. et al., Nature, 2009, 462, 315­ 322; Berman, B. P. et al., Nat. Genet., 2011, 44, 40-46).

En el caso de la secuenciación de nanoporos se hace pasar una molécula de ADN por un poro. Los nucléotidos provocan con el paso una señal eléctrica medible, que es característica para los nucleótidos que se encuentran en el nanoporo y puede asignarse así a éstos.

En otra variante preferente puede realizarse antes de la amplificación por PCR una hibridación con oligonucleótidos específicos (sondas), que se ligan en el caso de unión y a continuación se amplifican por medio de PCR. Métodos y protocolos adecuados, tal como por ejemplo una "multiplex ligation dependent probe amplification" (MLPA) están a disposición sin problemas para el experto, por ejemplo "PCR Mutation Detection Protocols" de B. D. M. Theophilus y R. Rapley, 2a edición, 2011, Springer.

En otra variante preferente se realiza el análisis de mutación por medio de PCR en tiempo real cuantitativa.

La mutación puede determinarse a continuación mediante comparación de la propiedad determinada del ADN genómico tratado, o sea por ejemplo de la secuencia de nucleótidos, del peso molecular o de la fuerza de hibridación, con un valor normalizado. Como valor normalizado es adecuada, por ejemplo, la correspondiente propiedad del ADN de tipo natural. Dado el caso puede considerarse a este respecto también una correspondiente conversión del ADN de tipo natural como en la etapa A), por ejemplo mediante correspondientes métodos bioinformáticos o recorriendo el ADN de tipo natural igualmente el procedimiento de acuerdo con la invención, por ejemplo como muestra de referencia. La mutación puede comprender básicamente una mutación de línea de germen o una mutación somática o también combinaciones de las mismas. En una variante preferente del procedimiento comprende la mutación una mutación somática. Mientras que las mutaciones de línea de germen pueden detectarse esencialmente en todas las células de un organismo, las mutaciones somáticas pueden detectarse por regla general sólo en células de un determinado tejido, por ejemplo células neoplásicas de un tumor. Una ventaja sorprendente de la presente invención es que pueden detectarse también aquellas mutaciones con baja abundancia en el organismo con ayuda del procedimiento de acuerdo con la invención con alta especificidad y sensibilidad.

En una variante preferente comprende el análisis de mutación al menos una parte o varias partes de un gen contenido en el ADN genómico. Como alternativa o adicionalmente puede comprender el análisis de mutación también al menos una parte o varias partes de en cada caso dos o más genes contenidos en el ADN genómico.

En variantes preferentes comprende el análisis de mutación al menos una parte o varias partes de un gen que se ha seleccionado del grupo de BRAF, EGFR, KRAS, NRAS, BRCA1, BRCA2, AKT1, VGFR, IDH1, IDH2, CRLF2, TSC1, PDGFRA, NF1, GNAQ, GNA11, CTNNB1, ASXL1, BCOR, DNMT3A, ETV6, EZH2, SF3B1, SRSF2, STAG2, TET2, TP53, U2AF1, ZRSR2, HRAS, TERT(hTERT), SMO, FLT3, JAK2, ESR1, BCR, SMAD4, DNMT3A, AR, ERBB2 (HER2), MAP2K1 (MEK1), PIK3CA, PTEN, PALB2, DDR2 y combinaciones discrecionales de los mismos.

En otras variantes preferentes está diseñado el análisis de mutación para determinar una fusión, translocación y/o inversión de al menos una parte o varias partes de un gen que se ha seleccionado del grupo de NTRK1 (TRKA), RET, DEK-NUP214, MLL-MLLT3, CBFB-MYH11, RPN1-EVI1, RUNX1-RUNX1T1, PML-RARA, RBM15-MKL, KIT, ALK, ROS1 y combinaciones discrecionales de los mismos.

En otras variantes preferentes está diseñado el análisis de mutación para determinar una amplificación de al menos una parte o varias partes de un gen que se ha seleccionado del grupo de los genes FGFR1, MET, ERBB2 (HER2), FGFR1, FGFR2, BCR-ABL1, RET, m Ek , mTOR y VEGFR y combinaciones discrecionales de los mismos.

En una variante preferente comprende el análisis de mutación al menos una parte o varias partes del gen BRAF. En particular puede estar diseñado el análisis de mutación para determinar una mutación en al menos una parte de una secuencia que en el estado de tipo natural presenta identidad de secuencia de al menos el 95 % con s Eq ID NO:71 y/o SEQ ID NO:72. En una variante especialmente preferente comprende el análisis de mutación la mutación de BRAF c.1799T>A (V600E). Por ejemplo, los tumores que tienen la mutación puntual V600E dentro del gen BRAF responden especialmente bien a un tratamiento con Vemurafenib. El análisis de mutación puede comprender también combinaciones discrecionales de estas variantes.

En otra variante preferente comprende el análisis de mutación al menos una parte o varias partes del gen EGFR. En particular puede estar diseñado el análisis de mutación para determinar una mutación en al menos una parte de una secuencia que en el estado de tipo natural presenta identidad de secuencia de al menos el 95 % con SEQ ID NO:64, SEQ ID NO:65, SEQ ID NO:66 o SEQ ID NO:67, así como combinaciones de los mismos.

En otra variante preferente comprende el análisis de mutación al menos una parte o varias partes del gen KRAS. En particular puede estar diseñado el análisis de mutación para determinar una mutación en al menos una parte de una secuencia que en el estado de tipo natural presenta identidad de secuencia de al menos el 95 % con SEQ ID NO:68, SEQ ID NO:69 o SEQ ID NO:70, así como combinaciones de los mismos.

En otra variante preferente comprende el análisis de mutación al menos una parte o varias partes del gen NRAS. En particular puede estar diseñado el análisis de mutación para determinar una mutación en al menos una parte de una secuencia que en el estado de tipo natural presenta identidad de secuencia de al menos el 95 % con SEQ ID NO:79 y/o SEQ ID NO:80, así como combinaciones de los mismos.

El análisis de mutación de ERBB2 (HER2) está diseñado preferentemente para determinar una mutación en al menos una parte de una secuencia, que en el estado de tipo natural presenta identidad de secuencia de al menos el 95 % con SEQ ID NO:77. El análisis de mutación de MAP2K1 (MEK1) está diseñado preferentemente para determinar una mutación en al menos una parte de una secuencia, que en el estado de tipo natural presenta identidad de secuencia de al menos el 95 % con SEQ ID NO:78. El análisis de mutación de PIK3CA está diseñado preferentemente para determinar una mutación en al menos una parte de una secuencia, que en el estado de tipo natural presenta identidad de secuencia de al menos el 95 % con SEQ ID NO:81 y/o SEQ ID NO:82, o combinaciones de las mismas. El análisis de mutación de PTEN está diseñado preferentemente para determinar una mutación en al menos una parte de una secuencia, que en el estado de tipo natural presenta identidad de secuencia de al menos el 95 % con SEQ ID NO:83. El análisis de mutación de DDR2 está diseñado preferentemente para determinar una mutación en al menos una parte de una secuencia, que en el estado de tipo natural presenta identidad de secuencia de al menos el 95 % con SEQ ID NO:74, SEQ ID NO:75 o SEQ ID NO:76, o combinaciones de las mismas. El análisis de mutación de AKT1 está diseñado preferentemente para determinar una mutación en al menos una parte de una secuencia, que en el estado de tipo natural presenta identidad de secuencia de al menos el 95 % con SEQ ID NO:73.

En otra variante está diseñado el análisis de mutación para determinar ADN viral integrado en el ADN genómico, en particular al menos una parte o varias partes del ADN de uno o varios virus del papiloma humano (VPH). De manera especialmente preferente está diseñado el análisis de mutación para determinar al menos una parte o varias partes del ADN de uno o varios virus de papiloma humano de los subgrupos HPV 16, 18, 31, 33, 35, 39, 45, 51, 52, 56, 58, 59, 68, 73 y/o 82 en el ADN genómico.

En otra variante está diseñado el análisis de mutación para determinar amplificaciones y/o delecciones que afectan a secuencias de ADN repetitivas. En particular es posible determinar la amplificación y delección de repeticiones cortas en tándem (Short Tandem Repeats, STR). En particular, esto permite la determinación de una inestabilidad de microsatélites (MSI). Una inestabilidad de microsatélites es indicativa de un sistema de reparación de ADN defectuoso en la célula y por tanto predictiva de la respuesta a quimioterapias que dañan el ADN.

En una variante preferente comprende el ADN genómico ADN de libre circulación, ADN de exosomas y/o ADN de células de libre circulación de un líquido corporal, las denominadas biopsias líquidas o "liquid biopsies". Las biopsias líquidas representan en la actualidad un campo central de la investigación oncológica. A este respecto se analiza no el propio tejido sospechoso, o sea por ejemplo un tejido tumoral, sino también una muestra de un líquido corporal, por ejemplo una muestra de sangre. En esta muestra pueden someterse a estudio distintas sustancias que proceden del tumor, dado que el ADN genómico de libre circulación, ADN exosomal, o bien células de libre circulación se liberan por el tumor al torrente sanguíneo. Ventajosamente se usa el procedimiento de acuerdo con la invención para el análisis de biopsias líquidas cuando el tumor o una metástasis no puede biopsiarse o bien cuando una biopsia representaría para el paciente en estadio de tumor tardío un riesgo demasiado grande.

Es posible analizar con el procedimiento de acuerdo con la invención mutaciones en ADN genómico de libre circulación o bien en células de libre circulación. En particular pueden detectarse también pocas moléculas de ADN que llevan mutación en el contexto de ADN genómico de libre circulación de origen sano. Es posible, por ejemplo, que el ADN genómico, en particular el ADN genómico convertido, comprenda una proporción mayor de ADN de origen sano (ADN de tipo natural) y una proporción menor de ADN genómico que contiene la al menos una mutación. En el contexto de la presente invención se ha reconocido sin embargo que esto puede conducir a problemas con respecto a la sensibilidad en la determinación de una mutación, cuando se usa un procedimiento convencional. Si, por ejemplo, en un paciente con una enfermedad maligna se ha realizado un análisis de mutación convencional con una muestra de ADN de libre circulación y es negativa la detección de la mutación en el ADN de libre circulación, entonces esto puede tener dos causas. O bien la enfermedad maligna realmente no lleva esta mutación o se encuentra muy poco o incluso nada de ADN de la enfermedad maligna en el torrente sanguíneo del paciente o bien en la muestra. En el último caso, la detección es en consecuencia falso negativo.

Otro objeto de la invención consistía por tanto en la mejora de la sensibilidad del análisis de mutación, reduciéndose el número de resultados falsos negativos. Este objetivo se soluciona de acuerdo con la invención, comprendiendo el procedimiento adicionalmente C) realizar un análisis de metilación con el ADN genómico obtenido de la etapa A), para determinar un estado de metilación al menos de un dinucléotido de CpG contenido en el ADN genómico.

La metilación de ADN es un proceso importante de la aparición y progresión de enfermedades malignas, por ejemplo de tumores. Esta metilación tiene lugar predominantemente en las citosinas en el contexto de secuencia de dinucleótido de CpG. Muchos genes están hipermetilados en enfermedades malignas, por ejemplo tumores, es decir que estos genes contienen dinucleótidos de CpG que están metilados con más frecuencia en comparación con el correspondiente tejido normal, del que se ha producido el tumor. El estado de metilación de un dinucleótido de CpG es por tanto muy adecuado para determinar ADN de una enfermedad maligna DNA que está contenido en ADN genómico. Mediante esto puede diferenciarse, por medio del estado de metilación de dinucleótidos de CpG, el ADN de la enfermedad maligna del ADN genómico de origen sano.

De esta manera, con el procedimiento de acuerdo con la invención puede establecerse por primera vez dentro de un único análisis una relación funcional entre un análisis de mutación y un análisis de metilación, por ejemplo en forma de una normalización o también estandarización interna. Es posible, por ejemplo, determinar la presencia o ausencia de ADN de una enfermedad maligna en ADN genómico por medio del estado de metilación del dinucleótido de CpG y correlacionarla con la presencia o ausencia de la mutación. Si puede mostrarse por ejemplo mediante la detección de un dinucleótido de CpG metilado de manera aberrante que el ADN de una enfermedad maligna está contenido en el ADN genómico y si puede mostrarse al mismo tiempo que no existe ninguna mutación, entones se establece que la enfermedad maligna no lleva la mutación y puede iniciarse un tratamiento adecuado. Si el análisis de metilación muestra por otro lado que no se encuentra ADN de una enfermedad maligna, entonces no puede detectarse de manera correspondiente tampoco la mutación. En consecuencia no se descarta que el tumor lleve sin embargo la mutación. Los análisis complementarios son necesarios para encontrar el tratamiento más adecuado.

Mediante esta interacción sinérgica del análisis de mutación y análisis de metilación se consigue una mejora significativa en comparación con los análisis de mutación convencionales. La realización de acuerdo con la invención del análisis de mutación y del análisis de metilación en una reacción conduce, por ejemplo, a una mejora significativa de la precisión de medición y con ello a una mejora significativa de la capacidad de potencia analítica del procedimiento por ejemplo en comparación con análisis de mutación convencionales. La precisión de medición de un método de prueba de diagnóstico molecular puede depender de muchos parámetros. Las características de calidad de un método de prueba diagnóstico son, por ejemplo, la precisión en condiciones intermedias y la robustez. La precisión en condiciones intermedias comprende la variabilidad que se produce durante la aplicación de un método de prueba en distintos momentos, con distintos instrumentos de prueba y distintas cargas de reactivo mediante distintos usuarios, sin embargo en el mismo laboratorio con la aplicación de la misma muestra y del mismo procedimiento de medición. La robustez de un procedimiento de análisis expresa en qué medida permanece insensible un procedimiento de análisis frente a pequeñas modificaciones intencionadas de los parámetros del procedimiento e indica cómo de fiable es éste en condiciones de uso normales. Mediante la realización de acuerdo con la invención del análisis de mutación y del análisis de metilación en una reacción se mejora significativamente la precisión en condiciones intermedias y la robustez, dado que se recogen varianzas y modificaciones dentro del procedimiento de medición mediante la correlación interna de ambos análisis y se normalizan o bien se estandarizan. Por ejemplo pueden evitarse de manera eficaz diagnósticos falsos negativos, lo que conduce en definitiva a un aumento de la sensibilidad y a un uso mejor y más eficaz de posibilidades de terapia para bien del paciente. Estas ventajas conciernen naturalmente no sólo a biopsias líquidas, sino también a otras fuentes de ADN genómico. Por ejemplo se reduce drásticamente el riesgo de un diagnóstico erróneo debido a una alta proporción de tejido normal sano en el desarrollo de trabajo analítico, debido a una baja proporción de células neoplásicas en la enfermedad maligna o debido a una fuerte dispersión de las células en el tejido normal.

En una variante adicionalmente preferente comprende el análisis de metilación la determinación del estado de metilación de dos o varios dinucleótidos de CpG dentro de un gen contenido en el ADN genómico. Como alternativa o adicionalmente puede comprender el análisis de metilación también al menos en cada caso un dinucleótido de CpG en dos o varios genes contenidos en el ADN genómico. De esta manera, la invención soluciona el problema de que los dinucleótidos de CpG en el ADN de una enfermedad maligna pueden encontrarse a veces metilados de manera heterogénea, de modo que se consigue una detección especialmente robusta de ADN de la enfermedad maligna. Los diagnósticos falsos negativos y falsos positivos se evitan en consecuencia y la especificidad y sensibilidad del procedimiento diagnóstico se mejoran adicionalmente.

El análisis de metilación puede comprender al menos una parte de un gen que se ha seleccionado del grupo de SHOX2, SEPT9, BRCA1, LIMK1, APC, VIM, RASSF2, RASSF1, GSTP1, FOXL2, CDKN2A (p16), RARB y combinaciones discrecionales de los mismos. El estado de metilación de dinucleótidos de CpG dentro de estos genes se reconoce como especialmente eficaz para detectar la presencia o ausencia de ADN de una enfermedad maligna dentro del ADN genómico. En una variante preferente comprende el análisis de metilación al menos una parte de SEPT9. En particular puede estar diseñado el análisis de metilación para determinar el estado de metilación de uno o varios dinucleótidos de CpG de una secuencia que en el estado de tipo natural, no convertido presenta identidad de secuencia de al menos el 95 % con SEQ ID NO:93. En otra variante preferente comprende el análisis de metilación al menos una parte de SHOX2. En particular puede estar diseñado el análisis de metilación para determinar el estado de metilación de uno o varios dinucleótidos de CpG de una secuencia que en el estado de tipo natural presenta identidad de secuencia de al menos el 95 % con SEQ ID NO:6.

El análisis de metilación puede comprender además al menos una parte de un gen que se ha descrito para este fin en el documento WO 2009/036922 A2 y/o US 2012/0101023 A1. El análisis de mutación puede comprender también al menos una parte de un gen que se ha divulgado en el documento US 2014/0303001 A1. De manera especialmente preferente comprende el análisis de metilación al menos una parte al menos de un gen del grupo de TWIST1, ONECUT2 y OTX1 y/o el análisis de mutación comprende al menos una parte al menos de un gen del grupo de FGFR3, TERT, KRAS, NRAS y PIK3CA. En esta combinación está previsto el procedimiento por ejemplo para la detección de la existencia y/o de la recurrencia de una enfermedad de cáncer de vejiga de acuerdo con el segundo aspecto de la invención siguiente. Ventajosamente se realiza la detección del cáncer de vejiga con ADN genómico, que comprende ADN de libre circulación de orina y/o ADN genómico de células del sedimento de orina.

En otra configuración comprende el análisis de metilación al menos una parte del gen SEPT9 y el análisis de mutación al menos una parte del gen TP53. SEPT9 está metilado de manera aberrante en especialmente muchas enfermedades malignas y además no está metilado generalmente en ADN de libre circulación en el plasma de pacientes sanos. Por tanto es adecuado el análisis de metilación de este gen especialmente para la detección de una enfermedad maligna en la sangre. TP53 está mutado de manera recurrente en distintas enfermedades malignas. La proteína codificada por TP53 es comparativamente pequeña con 393 aminoácidos. Los 393 aminoácidos se codifican por 1179 bases, dentro de las cuales se encuentran las mutaciones preferentemente analizadas. El 86 % de las mutaciones se encuentran dentro de los aminoácidos 125 y 300. El análisis de mutación de TP53 está diseñado por tanto en particular para determinar una mutación en al menos una parte de una secuencia, que en el estado de tipo natural, no convertido presenta identidad de secuencia de al menos el 95 % con SEQ ID NO:94. En particular, en relación al segundo aspecto de la invención siguiente está previsto el análisis de mutación de TP53 y el análisis de metilación de SEPT9 para el diagnóstico de cáncer intestinal, tumores de cabeza y de garganta, cáncer de pulmón, melanomas así como cáncer de ovario y de esófago.

En otra variante comprende el análisis de mutación al menos una parte del gen TP53 así como la determinación de una inserción de ADN viral, en particular al menos una parte o varias partes del ADN de uno o varios virus del papiloma humano (VPH), en particular en combinación de un análisis de metilación al menos de una parte de SEPT9. Por ejemplo, las causas más frecuentes para los tumores de cabeza y de garganta son fumar y una inserción del virus VPH. Los tumores de cabeza y de garganta que se han inducido mediante una inserción de VPH, por regla general no llevan ninguna mutación de TP53. Por tanto se realiza. en una variante preferente del procedimiento. el análisis de mutación de TP53 con un análisis de la inserción de VPH, dado que la parte inventora ha reconocido que mediante la existencia o bien de una o de la otra mutación se registra la mayor parte de los tumores. SEPT9 está metilado especialmente con frecuencia de manera aberrante en tumores de cabeza y de garganta. De manera especialmente preferente se realiza, por tanto, una combinación de un análisis de metilación de SEPT9 con un análisis de mutación de TP53 y/o un análisis de mutación de una inserción de VPH, dado que pueden detectarse estas enfermedades de esta manera con precisión especialmente alta.

En variantes preferentes del procedimiento se realiza el análisis de mutación en la etapa B) en condiciones que permiten una determinación cuantitativa de la al menos una mutación. Como alternativa o adicionalmente puede realizarse también el análisis de metilación en la etapa C) en condiciones que permiten una determinación cuantitativa del estado de metilación del al menos un dinucleótido de CpG.

Es posible, por ejemplo, que el ADN genómico comprenda al menos en una proporción ADN de una enfermedad maligna, presentando el a Dn de la enfermedad maligna el al menos un dinucleótido de CpG dado el caso metilado de manera aberrante y/o, en tanto que ésta esté presente, al menos parcialmente la al menos una mutación. Entonces puede determinarse la proporción del ADN de la enfermedad maligna dentro del ADN genómico por medio del análisis de mutación en la etapa B) y/o del análisis de metilación en la etapa C).

También es posible relacionar la determinación cuantitativa de la mutación en la etapa B) con la determinación cuantitativa del estado de metilación en la etapa C). De esta manera puede determinarse, por ejemplo, la proporción de ADN genómico que lleva la mutación dentro del ADN genómico de la enfermedad maligna. Esto es especialmente ventajoso, dado que las enfermedades malignas son con frecuencia heterogéneas y por ejemplo no todas las células de la enfermedad llevan también la mutación. De esta manera pueden obtenerse además del aspecto diagnóstico también conocimientos ventajosos en relación con el pronóstico, predicción o control de desarrollo de una enfermedad maligna. Esta interacción funcional del análisis de mutación y el análisis de metilación pertenece a las características distintivas de la invención. Además surten efecto también en este caso las ventajas determinadas ya anteriormente en relación a la robustez y precisión del procedimiento así como la capacidad de análisis de las cantidades más pequeñas de ADN genómico.

En otra variante comprende la determinación cuantitativa varias mutaciones distribuidas en uno o varios genes y/o el estado de metilación de varios dinucleótidos de CpG en uno o varios genes. A continuación puede realizarse un promedio de las cantidades obtenidas. Para la cuantificación relativa del ADN genómico de la enfermedad maligna dentro del ADN genómico pueden promediarse por ejemplo los estados de metilación cuantificados de los dinucleótidos de CpG individuales, para obtener un valor especialmente robusto. También es posible usar aquel dinucleótido de CpG para la cuantificación, para el que se determinó el valor de metilación más alto, dado que este dinucleótido de CpG se encuentra entonces metilado de manera especialmente fuerte en el ADN genómico de la enfermedad maligna y por consiguiente representa una escala fiable para su cantidad. De esta manera se consigue una robustez y precisión del procedimiento especialmente altas.

Cuando debe determinarse la proporción del ADN genómico de la enfermedad maligna dentro del ADN genómico por medio del análisis de mutación en la etapa B), comprende el análisis de mutación preferentemente la determinación al menos de una mutación recurrente. También es posible determinar la proporción del ADN de la enfermedad maligna dentro del ADN genómico por medio al menos de una mutación de un gen mutado de manera recurrente. Las mutaciones recurrentes adecuadas y preferentes y los genes mutados de manera recurrente están mencionados en el ejemplo 11.

En variantes preferentes comprende el procedimiento una o varias de las siguientes combinaciones: un análisis de mutación que comprende al menos una parte del gen BRAF y un análisis de metilación que comprende al menos una parte del gen SHOX2; un análisis de mutación que comprende al menos una parte del gen BRCA1, BRCA2 y/o PALB2 y un análisis de metilación que comprende al menos una parte del gen BRCA1; un análisis de mutación que comprende al menos una parte del gen IDH1, IDH2 y/o EGFR y un análisis de metilación que comprende al menos una parte del gen MGMT; un análisis de mutación que comprende al menos una parte del gen TP53 y un análisis de metilación que comprende al menos una parte del gen PITX2; un análisis de mutación que comprende al menos una parte del gen AR, ESR1, BRCA1, BRCA2, PALB2 y/o ERBB2 (HER2) y un análisis de metilación que comprende al menos una parte del gen PITX2; un análisis de mutación que comprende al menos una parte del gen FGFR3, TERT, PIK3CA, KRAS, TP53, NRAS y/o HRAS y un análisis de metilación que comprende al menos una parte del gen ONECUT2, OTX1, SHOX2, SEPT9 y/o TWIST1; un análisis de mutación que comprende al menos una parte del gen TP53 y/o una inserción de ADN viral, en particular al menos una parte o varias partes del ADN de uno o varios virus del papiloma humano (VPH) y un análisis de metilación que comprende al menos una parte del gen SEPT9. También es posible complementar estas combinaciones con análisis de metilación y/o mutación de al menos partes de otros genes. Los genes y secuencias preferentes con respecto a esto son evidentes a partir de la descripción anterior y los ejemplos de realización así como el listado de secuencias.

La enfermedad maligna puede comprender en particular un carcinoma, un melanoma, un sarcoma, un glioma, un linfoma y/o una leucemia. El carcinoma puede comprender, por ejemplo, un adenocarcinoma, un carcinoma de células escamosas, un carcinoma de células pequeñas, un carcinoma neuroendocrino, un carcinoma de células renales, un carcinoma urotelial, un carcinoma hepatocelular, un carcinoma anal, un carcinoma bronquial, un carcinoma de endometrio, un carcinoma colangiocelular, un carcinoma hepatocelular, un carcinoma de testículo, un carcinoma colorrectal, un carcinoma de la zona de cabeza y garganta, un carcinoma del esófago, un carcinoma de estómago, un carcinoma de mama, un carcinoma de riñón, un carcinoma de ovario, un carcinoma de páncreas, un carcinoma de próstata, un carcinoma de tiroides y/o un carcinoma de cuello de útero. Un sarcoma puede ser por ejemplo un angiosarcoma, un condrosarcoma, un sarcoma de Ewing, un fibrosarcoma, un sarcoma de Kaposi, un liposarcoma, un leiomiosarcoma, un histiocitoma fibroso maligno, un sarcoma neurogénico, un osteosarcoma o un rabdomiosarcoma. Una leucemia puede ser por ejemplo una leucemia mieloide aguda (AML), una leucemia linfática aguda (ALL), una leucemia linfática crónica (CLL), o una leucemia mieloide crónica (CML). Un linfoma puede ser un linfoma de Hodgkin o linfoma de no Hodgkin. Un linfoma de no Hodgkin puede ser un linfoma de células B o un linfoma de células T.

El procedimiento comprende las etapas A), B) y C), dado que mediante la interacción sinérgica de acuerdo con la invención del análisis de mutación y el análisis de metilación se consigue, por ejemplo, una mejora significativa de la sensibilidad y especificidad del diagnóstico y un pronóstico, predicción y control de desarrollo más diferenciados y más eficaces. Con respecto a esto se remite también a los ejemplos de realización siguientes.

En un uso preferente del procedimiento para el pronóstico se usa el análisis de metilación de un gen como biomarcador de pronóstico. Preferentemente comprende el análisis de metilación para este fin uno o varios dinucleótidos de CpG del gen PITX2. En particular puede estar éste diseñado para determinar el estado de metilación de uno o varios dinucleótidos de CpG de una secuencia que en el estado de tipo natural, no convertido presenta identidad de secuencia de al menos el 95 % con SEQ ID NO:90 y/o SEQ ID NO:91. Como alternativa o adicionalmente puede comprender el análisis de metilación para este fin también uno o varios dinucleótidos de CpG de un gen seleccionado del grupo de CDO1, PLAU, POU4F3, TFF1 y CXCL12, así como combinaciones de los mismos. De esta manera puede detectarse por ejemplo la enfermedad maligna y al mismo tiempo puede encontrarse una declaración sobre la agresividad de la enfermedad.

En un uso preferente del procedimiento para la predicción y el pronóstico se usa el análisis de metilación de un gen como biomarcador de pronóstico y el análisis de mutación de un gen como biomarcador predictivo. Preferentemente comprende el análisis de metilación para este fin uno o varios dinucleótidos de CpG del gen PITX2, preferentemente uno o varios dinucleótidos de CpG de una secuencia que en el estado de tipo natural, no convertido presenta identidad de secuencia de al menos el 95 % con SEQ ID NO:90 y/o SEQ ID NO:91. Preferentemente comprende el análisis de mutación para este fin una o varias mutaciones de los genes BRAF, EGFR, KRAS, NRAS, BRCA1, BRCA2, AKT1, VGFR, IDH1, IDH2, CRLF2, TSC1, PDGFRA, NF1, GNAQ, GNA11, CTNNB1, ASXL1, BCOR, DNMT3A, ETV6, EZH2, SF3B1, SRSF2, STAG2, TET2, TP53, U2AF1, ZRSR2, HRAS, TERT(hTERT), SMO, FLT3, JAK2, ESR1, BCR, SMAD4, DNMT3A, AR, ERBB2 (HER2), MAP2K1 (MEK1), PIK3CA, PTEN, PALB2, DDR2, NTRK1 (TRKA), RET, DEK-NUP214, MLL-MLLT3, CBFB-MYH11, RPN1-EVI1, RUNX1-RUNX1T1, PML-RARA, RBM15-MKL, KIT, ALK, FGFR1, MET, ERBB2 (HER2), FGFR1, FGFR2, BCR-ABL1, RET, MEK, mTOR, VEGFR y combinaciones discrecionales de estos genes. De manera especialmente preferente comprende el análisis de mutación para este fin AR, ERBB2 (HER2), BRCA2, BRCA1 y/o ESR1.

En una variante puede predecirse la respuesta a una terapia con inhibidores del receptor de andrógenos y/o del receptor de estrógenos, a una terapia con inhibidores de PARP y/o con anticuerpos monoclonales terapéuticos dirigidos contra ERBB2 (HER2). En otra variante se realiza la predicción de la acción de inhibidores de los receptores hormonales tal como por ejemplo antiandrógenos y/o antiestrógenos. En otra variante se realiza la predicción en relación a los principios activos enzalutamida, abiraterona, bicalutamida, flutamida, tamoxifeno y acetato de ciproterona. En aún otra variante se realiza la predicción de la acción de inhibidores de PARP tal como por ejemplo talazoparib (BMN-673), olaparib (AZD-2281), rucaparib (AG014699, PF-01367338), veliparib (ABT-888), CEP 9722, MK 4827, BGB-290 y/o de la acción de anticuerpos monoclonales terapéuticos tal como por ejemplo trastuzumab. En aún otra variante se realiza la predicción de la acción de AG-221, AGI-5198, AG-120, AG-881, vemurafenib, cetuximab, crizotinib, temozolomid, erlotinib (Tarceva), gefitinib (Iressa), afatinib (Gilotrif), dacomitinib, neratinib, CO-1686 (rociletinib), AZD9291 y/o HM61713. Son también posibles combinaciones discrecionales de estas variantes.

Determinados usos del procedimiento para la predicción pueden comprender por ejemplo un análisis de mutación y análisis de metilación des mismo gen terapéuticamente relevante. A este respecto puede tratarse por ejemplo de un gen supresor de tumor, tal como por ejemplo un gen de reparación de ADN, y/o un protooncogen. Por ejemplo, una metilación aberrante del gen terapéuticamente relevante y/o una mutación, por ejemplo una mutación de inactivación, puede indicar la respuesta de un paciente con una enfermedad maligna a una determinada terapia, mientras que el tipo natural o bien el valor normal del gen terapéuticamente relevante indica que el paciente no responderá a la terapia. También el caso inverso es posible, o sea que estas constelaciones indican la no respuesta del paciente a una terapia.

En variantes preferentes del procedimiento para la predicción comprende el análisis de mutación y/o análisis de mutilación al menos una parte o varias partes o bien uno o varios dinucleótidos de CpG el gen BRCA1, BRCA2 y/o PALB2. Para secuencias especialmente preferentes de estos genes se hace referencia a las secuencias mencionadas en el ejemplo 8.

Pertenece sin embargo también a las características distintivas del procedimiento de acuerdo con la invención que puede considerarse la interacción entre distintos genes terapéuticamente relevantes, que se influyen mutuamente en relación a la respuesta de un paciente a una terapia. Para ello puede comprender, como alternativa o adicionalmente a la variante anterior, por ejemplo el análisis de mutación al menos una parte o varias partes de un primer gen terapéuticamente relevante y el análisis de metilación uno o varios dinucleótidos de CpG de un segundo gen terapéuticamente relevante distinto del primero. Con ello se considera el reconocimiento inventivo de que un estado de metilación de un primer gen terapéuticamente relevante y una mutación de un segundo gen terapéuticamente relevante pueden tener acciones paralelas u opuestas sobre una determinada terapia. Estas interacciones pueden relacionarse funcionalmente y descodificarse con ayuda de la presente invención por primera vez mediante el análisis de mutación y de metilación simultáneo.

En variantes preferentes del procedimiento para la predicción comprende el análisis de metilación por tanto uno o varios dinucleótidos de CpG del gen MGMT y comprende el análisis de mutación al menos una parte o varias partes de los genes IDH1, IDH2 y/o EGFR. Para secuencias especialmente preferentes dentro de estos genes se hace referencia al ejemplo 9.

En un uso preferente del procedimiento para la predicción se realiza el pronóstico de respuesta de un paciente a una terapia con al menos un principio activo seleccionado de los grupos agentes antineoplásicos alquilantes, agentes citostáticos, anticuerpos monoclonales terapéuticos e inhibidores, en particular inhibidores de tirosina-cinasa. De manera especialmente preferente se realiza la predicción en relación a un principio activo seleccionado del temozolomida, cetuximab, bevacizumab, AG-221, AGI-5198, AG-120, AG-881, o combinaciones de las mismas.

En una variante preferente del procedimiento para el control de desarrollo de una enfermedad maligna de un paciente está previsto que las etapas B) y C) se realicen en condiciones que permiten una determinación cuantitativa de la al menos una mutación y/o del estado de metilación del al menos un dinucleótido de CpG. Preferentemente comprende el uso del procedimiento para el control de desarrollo de una enfermedad maligna entonces las siguientes etapas: i) facilitar una primera muestra con ADN genómico del paciente desde un primer momento y realizar u procedimiento de acuerdo con el primer aspecto, debiéndose determinar la proporción del ADN de la enfermedad maligna en el ADN genómico por medio del análisis de mutación en la etapa B) y/o, en caso de estar presente, por medio del análisis de metilación en la etapa C), ii) facilitar una segunda muestra con ADN genómico del paciente desde un segundo momento que se encuentra tras el primer momento y repetir el procedimiento de la etapa i) con la segunda muestra. El desarrollo de la enfermedad maligna puede controlarse entonces por medio de una modificación de la proporción del ADN de la enfermedad maligna en el ADN genómico en la segunda muestra en comparación con la primera muestra. Por ejemplo puede encontrarse el primer momento antes del inicio de la terapia y el segundo momento tras el inicio de la terapia. Un aumento de la proporción del ADN de la enfermedad maligna en la segunda muestra puede indica entonces por ejemplo una respuesta del paciente a la terapia. Esto es posible, por ejemplo, cuando el tumor se necrosa y en el proceso de necrosis emite cada vez más ADN genómico de la enfermedad maligna en la sangre. Es también posible que un aumento de la proporción del ADN de la enfermedad maligna en la segunda muestra indique una no respuesta del paciente a la terapia. Esto es posible, por ejemplo, cuando el tumor crece a pesar de la terapia y en el proceso de crecimiento emite cada vez más ADN genómico de la enfermedad maligna en la sangre. Es también posible que una baja reducción de la proporción del ADN de la enfermedad maligna en la segunda muestra indique una no respuesta del paciente a la terapia. Esto es posible, por ejemplo, cuando sólo una parte del tumor responde a la terapia y necrotiza, de modo que más ADN genómico de la enfermedad maligna llega a la sangre.

En una variante del procedimiento para el control del desarrollo se encuentra en la etapa i) el primer momento de 2 a 12 días, preferentemente de 4 a 10 días, de manera especialmente preferente de 6 a 8 días tras el inicio de una terapia, por ejemplo una radioterapia. En la etapa ii) puede encontrarse el segundo momento de 10 a 31 días, preferentemente de 14 a 28 días, de manera especialmente preferente de 18 a 24 días tras el inicio de una terapia. En otra variante puede encontrarse el primer o segundo momento también de 1 a 5 días, preferentemente de 2 a 4 días tras el inicio de una terapia o una intervención, por ejemplo una operación. Aquel día en el que se inició la terapia o en el que se realizó la intervención, se considera como día 0. Debido a las ventajas ya expuestas se consigue mediante el procedimiento de acuerdo con la invención una detección especialmente específica del ADN de tumor en la sangre, de modo que por ejemplo puede concluirse con alta fiabilidad la permanencia de un tumor residual y/o la existencia de metástasis oculta tras la operación.

Es posible medir con el procedimiento de acuerdo con la invención también aquellas mutaciones en ADN genómico, que no tienen ningún origen en una enfermedad maligna. Por ejemplo es posible determinar mutaciones en ADN fetal que circula en la sangre de la madre. La detección de encefalopatías epilépticas del niño no nacido es posible, por ejemplo, por medio del análisis de acuerdo con la invención de ADN fetal en la sangre de la madre. Preferentemente se someten a estudio para ello mutaciones de los genes ALDH7A1, PNPO, SLC2A1, MECP2, FOXG1, ARX, CDKL5, STXBP1, SPTAN1, SCN1A, EIEE6, KCNQ2, EIEE7, ARHGEF9, EIEE8, PCDH19, PNKP, EIEE10, SCN2A, y/o EIEE11. También es posible detectar tras enfermedades genéticas del niño no nacido en la sangre de la madre. Preferentemente, el uso del procedimiento de acuerdo con la invención permite el diagnóstico de acondroplasia por medio de mutaciones en el gen FGFR3; deficiencia de alfa-1-antitripsina por medio de mutaciones en el gen SERPINA1; fibrosis quistica por medio de mutaciones en el gen CFTR; enfermedad de Gaucher por medio de mutaciones en el gen GBA; distrofia muscular de Duchenne por medio de mutaciones en el gen DMD; fiebre mediterránea por medio de mutaciones en el gen MEFV; síndrome X frágil por medio de mutaciones en el gen FMR1; hemocromatosis hereditaria por medio de mutaciones en el gen HFE; enfermedad de Huntington por medio de mutaciones en el gen HTT; síndrome de Marfan por medio de mutaciones en el gen FBN1; distrofia miotónica por medio de mutaciones en los genes CNPB y/o DMPK; trombofilia de factor V Leiden por medio de mutaciones en el gen F5; hemofilia por medio de mutaciones en los genes F8 y/o F9; síndrome de Noonan por medio de mutaciones en los genes P TP N ll, SOS1, RAF1 y/o KRAS; fenilcetonuria por medio de mutaciones en el gen PAH; inmunodeficiencia combinada grave ligada a cromosoma X por medio de mutaciones en el gen IL2RG; anemia falciforme y talasemia por medio de mutaciones en el gen HBB; atrofia muscular espinal por medio de mutaciones en los genes SMN1 y/o VAPB; neurofibromatosis tipo I y II por medio de mutaciones en los genes NF1 y NF2; hipercolesterolemia por medio de mutaciones en el gen LDLR; osteogénesis imperfecta por medio de mutaciones en los genes COL1A1 y/o COL1A2; enfermedad de Tay-Sachs por medio de mutaciones en el gen HEXA; síndrome de velocardiofacial por medio de mutaciones en los genes COMT y/o TBX1; enfermedad de Wilson por medio de mutaciones en el gen ATP7B; trimetilaminuria por medio de mutaciones en el gen FMO3. También es posible detectar mutaciones cromosómicas tal como trisomia 21, delección en el cromosoma 5 y/o microdelecciones en el cromosoma 15 de acuerdo con la invención para el diagnóstico del síndrome de Down, síndrome de Katzenschrei y síndrome de Angelman. Son también posibles combinaciones discrecionales de estos usos.

También es posible detectar otras enfermedades benignas y/o no malignas mediante el uso del procedimiento de acuerdo con la invención. Preferentemente son mutaciones de KCNJ5 en caso de adenomas que producen cortisol de la glándula suprarrenal y en caso de la hipertensión hereditaria; mutaciones de PRKACA y/o KCNJ5 en caso adenomas que producen cortisol e hiperplasias de la glándula suprarrenal; y mutaciones de CACNA1D en caso de adenomas que producen aldosterona y aldosteronismo primario. Además son posibles combinaciones de estos usos.

El segundo aspecto de la invención se refiere a un uso de un kit para la realización del procedimiento según el primer aspecto. El kit comprende a) al menos un primer par de oligonucleótidos diseñado para la hibridación en el ADN genómico obtenido a partir de la etapa A), para amplificar al menos una primera zona parcial del ADN genómico, del que se sospecha que contiene la al menos una mutación. Es posible también que la primera zona parcial incluya adicionalmente el al menos un dinucleótido de CpG, cuyo estado de metilación va a determinarse.

Adicionalmente comprende el kit b) al menos un segundo par de oligonucleótidos diseñado para la hibridación en el ADN genómico obtenido a partir de la etapa A), para amplificar al menos una segunda zona parcial del ADN genómico, que incluye el al menos un dinucleótido de CpG, cuyo estado de metilación va a analizarse.

Es posible que el primer y/o segundo par de oligonucleótidos esté diseñado de manera que aquel fragmento de la zona parcial, del que se sospecha que contiene la al menos una mutación, o bien aquella zona parcial que incluye el al menos un dinucleótido de CpG, sea al menos parcialmente complementario inverso a uno de los oligonucleótidos del primer o bien segundo par de oligonucleótidos. De esta manera se consigue una amplificación especialmente específica de la respectiva zona que va a analizarse. Sin embargo es también posible que el fragmento, en el que se sospecha la mutación o bien el fragmento que incluye el dinucleótido de CpG, se encuentra entre las secuencias complementarias inversas a los oligonucleótidos.

El kit puede contener también otros primeros y segundos pares de oligonucleótidos, para amplificar de manera correspondiente otras primeras y/o segundas zonas parciales del ADN genómico convertido, del que se sospecha que contiene una mutación o que incluye un dinucleótido de CpG, cuyo estado de metilación va a analizarse.

Preferentemente, el primer y el segundo par de oligonucleótidos así como dado el caso otro par de oligonucleótidos están diseñados para una PCR doble o bien PCR múltiple. Preferentemente se encuentra el contenido en GC de los oligonucleótidos en el intervalo del 20 al 70 %, de manera especialmente preferente en del 30 al 60 %. Preferentemente se encuentra la longitud de cebador entre 17 y 35 nucleótidos, de manera especialmente preferente entre 18 y 30 nucleótidos. Preferentemente contiene un cebador de un par de cebadores menos de cuatro citosinas y el otro cebador del par de cebadores menos de cuatro guaninas en la secuencia de unión a ADN. De manera especialmente preferente, un cebador de un par de cebadores no contiene citosina y el otro cebador del par de cebadores no contiene guanina en la secuencia de unión a ADN.

Preferentemente, el sitio de unión de un oligonucleótido de un par de oligonucleótidos en el ADN genómico convertido obtenido a partir de A) no contiene citosinas y no contiene metilcitosinas. Preferentemente, el sitio de unión de un oligonucleótido de un par de oligonucleótidos o bien el sitio de unión complementario inverso del otro oligonucleótido del par de oligonucleótido en el ADN genómico convertido obtenido a partir de A) no contiene dinucleótido de CpG.

En determinadas variantes, los oligonucleótidos del primer par de oligonucleótidos están diseñados de manera que éstos sean al menos parcialmente complementarios en cada caso a una secuencia del ADN convertido, en la que no tiene lugar ninguna conversión de citosina, en particular que no contiene citosina.

En una variante preferente comprende la primera zona parcial al menos una zona parcial de BRAF. En otra variante preferente comprende la primera zona parcial al menos una zona parcial de EGFR. En otra variante preferente comprende la primera zona parcial al menos una zona parcial de k Ra S. En otra variante preferente comprende la primera zona parcial al menos una zona parcial de BRCA1. En otra variante comprende la primera zona parcial al menos una zona parcial de BRCA2. En de nuevo una variante preferente comprende la primera zona parcial al menos una zona parcial de PALB2. En otra variante preferente comprende la primera zona parcial al menos una zona parcial de IDH1. En aún otra variante preferente comprende la primera zona parcial al menos una parte de IDH2. En otra variante preferente comprende la primera zona parcial al menos una parte de TP53. Además son posibles combinaciones discrecionales de estas primeras zonas parciales.

En una variante preferente comprende la segunda zona parcial al menos una parte de PITX2. En otra variante preferente comprende la segunda zona parcial al menos una parte de CDO1, PLAU, POU4F3, TFF1 y/o CXCL12. En otra variante preferente comprende la segunda zona parcial al menos una parte de MGMT. En aún una variante preferente comprende la segunda zona parcial al menos una parte de SHOX2. En aún una variante preferente comprende la segunda zona parcial al menos una parte de SEPT9. Están comprendidas igualmente combinaciones discrecionales de estas segundas zonas parciales.

Además son posibles combinaciones discrecionales de una o varias primeras y segundas zonas parciales. En una variante preferente comprende la primera zona parcial por ejemplo al menos una parte del gen BRAF y la segunda zona parcial al menos una parte del gen SHOX2. En otra variante preferente comprende la primera zona parcial al menos una parte del gen BRCA1, BRCA2 o PALB2 y la segunda zona parcial al menos una, dado el caso segunda, parte del gen BRCA1. En otra variante preferente comprende la primera zona parcial al menos una parte del gen IDH1, IDH2 y/o EGFR y la segunda zona parcial al menos una parte del gen MGMT. En otra variante preferente comprende la primera zona parcial al menos una parte del gen TP53 y la segunda zona parcial al menos una parte del gen PITX2. Otras zonas parciales preferentes y secuencias preferentes son evidentes a partir de las descripciones anteriores y los ejemplos de realización así como el listado de secuencias.

El kit comprende preferentemente unas instrucciones de uso para la realización del procedimiento según el primer aspecto.

Descripción detallada de ejemplos de realización

A continuación se describe en más detalle la invención por medio de ejemplos de realización y resultados experimentales. Estos ejemplos de realización sirven para la explicación y no para la limitación a detalles específicos. Ejemplo 1: Determinación de una mutación puntual en ADN genómico no convertido (referencia)

Las mutaciones puntuales son aquellas mutaciones, en las que se ve afectada sólo una base nitrogenada individual por la modificación. La determinación eficaz de mutaciones puntuales exige por consiguiente altos requerimientos a la especificidad y sensibilidad de un procedimiento de detección de diagnóstico molecular.

Como ejemplo de una mutación puntual clínicamente altamente relevante se sometió a estudio la mutación puntual V600E dentro del gen BRAF.

El ADN genómico que va a analizarse puede proceder de distintas fuentes. A modo de ejemplo se usó en este caso tejido fijado. En cada caso tres secciones delgadas de en cada caso 10 ym de un melanoma maligno fijado en formalina e incrustado en parafina así como un trozo de tejido del tejido normal (piel) que limita con el melanoma se transfirieron a recipientes de reacción de 2 ml separados. A continuación se extrajo el ADN genómico de las secciones de tejido. Es adecuado para ello por ejemplo el uso del QIAamp DNA FFPE Tissue Kit (Qiagen, Hilden, Alemania) según las indicaciones del fabricante.

El ADN genómico no convertido se cuantificó a continuación con ayuda de un espectrofotómetro NanoDrop ND-1000 (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, EE.UU.).

En el ADN genómico no convertido se amplificó a continuación el locus del gen BRAF, en el que se sospechaba la mutación. Para ello se amplificó el locus con ayuda de una PCR con el cebador directo SEQ Id NO:1 y el cebador inverso SEQ ID NO:2, para comparar la secuencia resultante con la secuencia de tipo natural no convertida SEQ ID NO:3. Las reacciones de PCR se realizaron por ejemplo en volúmenes de 20 yl en las siguientes condiciones: 2 yl de tampón de reacción de PCR con 20 mM de MgCh (concentrado 10 veces, Roche, Penzberg, Alemania), 2 U de Taq ADN-polimerasa FastStart (Roche), 0,4 yM de cada cebador, 0,25 mM de cada dNTP (dTTP, dATP, dGTP, dCTP). La PCR se realizó por ejemplo por medio de un termociclador DNA Engine Tetrad (Biorad, EE.UU.). Un perfil de temperatura adecuado comprendía por ejemplo las siguientes etapas: 10 min a 95 °C seguido de 40 ciclos en cada caso de 45 s a 54 °C, 45 s a 72 °C y 15 s a 95 °C. El producto de PCR resultante se secuenció a continuación por secuenciación de Sanger, usándose el cebador directo SEQ ID NO:1 como cebador secuenciador. La secuenciación de Sanger de productos de PCR es un método fácilmente accesible para el experto medio y se ofrece además por muchos proveedores como prestación de servicio. Las secuenciaciones de Sanger realizadas en este ejemplo de aplicación se generaron por ejemplo mediante Beckman Coulter Genomics, Hope End, Takeley, Essex CM22 6TA, Gran Bretaña.

La figura 1A muestra el resultado del análisis que sirve como referencia del ADN genómico no convertido del tejido normal. El tejido normal presenta exclusivamente la secuencia de tipo natural CAC. Según esto no está presente en este sitio ninguna mutación puntual. La figura 1B muestra el resultado del análisis que sirve como referencia con el ADN genómico no convertido del tejido maligno. En la secuencia del ADN genómico del melanoma puede encontrarse además de la secuencia de tipo natural CAC también la mutación V600E con la secuencia de bases CTC.

Ejemplo 2: Determinación de una mutación puntual en ADN genómico

Del ADN extraído del ejemplo 1 se convirtió en cada caso una porción parcial del ADN genómico de acuerdo con la invención. La conversión puede realizarse por ejemplo mediante contacto del ADN genómico con bisulfito. En cuestión se realizó la conversión por ejemplo con el kit innuCONVERT Bisulfit All-In-One (Analytik Jena, Jena, Alemania). Para este fin se convirtieron 2 yg del ADN extraído de cada muestra según las indicaciones del fabricante. A continuación se cuantificó la cantidad de ADN convertido con ayuda de un espectrofotómetro NanoDrop ND-1000 (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, EE.UU.).

En el estado normal está organizado el ADN en forma de una doble hélice, que está constituida por dos cadenas individuales complementarias inversas una con respecto a otra. Una cadena se designa como cadena plus o directa y la otra cadena como cadena minus o inversa. Tras la conversión del ADN, por ejemplo, con bisulfito ya no son la cadena plus y la cadena minus complementarias inversas. La cadena que se produce mediante la conversión con bisulfito de la cadena plus se designa para la descripción de la invención como cadena de bisulfito-I. La cadena que se produce mediante la conversión con bisulfito de la cadena minus se designa como cadena de bisulfito-II.

En el contexto de la realización del procedimiento de acuerdo con la invención puede estar unido el análisis de mutación con una amplificación de ADN genómico convertido. En el presente ejemplo se amplificó el ADN genómico convertido del melanoma y del tejido normal con ayuda de una PCR en tiempo real cuantitativa (qPCR) y se cuantificó al mismo tiempo, véase a continuación. Preferentemente se realiza una PCR o bien qPCR como PCR doble o múltiple, en la que se amplifican dentro de la misma reacción por ejemplo una o varias primeras zonas parciales del ADN genómico convertido, de las que se sospecha que contienen una mutación, y una o varias segundas zonas parciales del ADN genómico convertido, que incluyen el dinucleótido de CpG, cuyo estado de metilación va a analizarse.

Para la cuantificación de la cantidad total de ADN genómico convertido se amplificó el locus del gen BRAF en la qPCR con las secuencias de cebadores descritas anteriormente en el ejemplo 1. Los cebadores SEQ ID NO:1 y SEQ ID NO:2 se diseñaron, por ejemplo, de modo que se hibridaron en la secuencia diana en la cadena de bisulfito-II en zonas en las que no tiene lugar ninguna conversión de citosina, Esta secuencia de la cadena de bisulfito-II corresponde en el caso de ausencia de una mutación a la secuencia SEQ ID NO:4. Mediante la elección de estos cebadores puede amplificarse y cuantificarse al mismo tiempo tanto ADN genómico no convertido como también ADN genómico convertido.

La detección y cuantificación específicas de secuencia de un amplificado puede realizarse de distintos modos. Por ejemplo puede tener lugar ésta con ayuda de una sonda. Por ejemplo se realizó en cuestión la detección del amplificado de BRAF con una sonda de la SEQ ID NO:5, que contenía un sistema de fluoróforo/desactivador de fluorescencia Atto-647N/BHQ-2.

El análisis de metilación de acuerdo con la invención puede comprender por ejemplo una reacción de amplificación específica de metilación. Por ejemplo pueden usarse para la amplificación oligonucleótidos que en combinación conducen a un amplificado sólo cuando el o los dinucleótidos de CpG que van a someterse a estudio se encuentran metilados. Un método adecuado se ha descrito, por ejemplo, en el documento WO 02/072880 A2, al que se hace referencia en su totalidad con respecto a esto. Preferentemente se realiza una reacción de amplificación específica de metilación de este tipo como PCR doble o múltiple en combinación con la amplificación mencionada anteriormente del análisis de mutación.

Por ejemplo se usó para la amplificación específica de metilación del locus de gen SHOX2, cuyo estado de tipo natural no convertido corresponde a la SEQ ID NO:6, el cebador directo SEQ ID NO:7, el cebador inverso SEQ ID NO:8 y un oligonucleótido bloqueador SEQ ID NO:9. El oligonucleótido bloqueador lleva, tal como se describe en el documento WO 02/072880 A2, en el extremo 3' en lugar del grupo OH un fosfato y debido a ello no puede alargarse mediante la polimerasa, sin embargo impide la hibridación del cebador directo en el ADN genómico convertido, cuando éste no se encontraba metilado. En esta configuración a modo de ejemplo se consiguió por consiguiente una amplificación específica de metilación de la cadena con bisulfito-I (SEQ ID n O:10) del gen SHOX2 en el ADN genómico convertido. Para la detección específica de secuencia del amplificado se usó el oligonucleótido marcado doblemente 6-FAM/BBQ-650 de la SEQ ID NO:11.

Es posible realizar una calibración para obtener una precisión especialmente alta del análisis de mutilación cuantitativo. Por ejemplo puede realizarse una calibración con un ADN, que presenta la misma secuencia que el locus de gen que va a someterse a estudio en el análisis de metilación y se metiló antes de la conversión para dar una o varias proporciones definidas, por ejemplo en el 50 % o el 100 %, a continuación designado también como ADN patrón. En este ejemplo se usó la CpG metiltransferasa M.SssI (New England Biolabs, Ipswich, MA, EE.UU.) de manera correspondiente a las indicaciones del fabricante, para metilar completamente todos los dinucleótidos de CpG en ADN genómico humano de película de leucocitos (Roche Applied Science, Penzberg, Alemania). En particular se metilaron a este respecto todos los dinucleótidos de CpG dentro de la secuencia SEQ ID NO:6. A continuación se convirtió el ADN por medio del kit de bisulfito innuCONVERT All-In-One de manera correspondiente a las instrucciones del fabricante.

Para el análisis de metilación cuantitativo se usaron a continuación en cada caso 5 ng del ADN patrón convertido o bien en cada caso 50 ng del ADN convertido del melanoma maligno o del tejido normal en la reacción de amplificación descrita anteriormente.

En el presente ejemplo, la cuantificación por PCR en tiempo real se realizó en reacciones de PCR de 20 y l en cada caso en tres mediciones independientes, siendo adecuada por ejemplo la siguiente composición: 35 mM de Tris-HCl, pH 8,4, 6 mM de MgCh, 50 mM de KCl, 4 % de glicerol, 0,25 mM de cada dNTP (dTTP, dATP, dGTP, dCTP), 2 U de Taq ADN-polimerasa FastStart (Roche Applied Science, Penzberg, Alemania), 0,4 yM de cada cebador, 0,75 yM de oligonucleótido bloqueador, 0,2 yM de cada sonda de detección. La qPCR se realizó por ejemplo por medio de un AB 7500 Fast Real-Time PCR System (Life Technologies Corporation, Carlsbad, CA, e E.UU.). Un perfil de temperatura adecuado comprendía por ejemplo las siguientes etapas: 20 min a 95 °C seguido de 45 ciclos en cada caso de 45 s a 56 °C y 15 s a 95 °C.

El estado de metilación en el ADN convertido del melanoma maligno o bien en el tejido normal se calculó por medio del método DeltaDelta-CT y se expresó porcentualmente en comparación con el ADN patrón, que se supuso para ello como el 100 %. El cebador directo SEQ ID NO:7, el cebador inverso SEQ ID NO:8, el oligonucleótido bloqueador SEQ ID NO:9 y la sonda doblemente marcada SEQ ID NO:11 usados en este ejemplo están diseñados por ejemplo de modo que en total están comprendidos nueve dinucleótidos de CpG distintos del locus de gen SHOX2 por el análisis de metilación. El valor de metilación porcentual calculado según el método DeltaDelta-CT reproduce a este respecto aquel valor que tendría una correspondiente mezcla de ADN, que está constituida en estas partes porcentuales por secuencias que están metiladas o bien no metiladas en estos nueves dinucleótidos de CpG de manera correspondiente. Por ejemplo, un valor de metilación medido del 66 % corresponde al comportamiento en la qPCR que tendría una mezcla de secuencias, de las que el 66 % de todos los nueve dinucleótidos de CpG analizados están metilados, mientras que el 34 % de las secuencias no presentan metilación en los nueve dinucleótidos de CpG.

El análisis de metilación con ayuda de la qPCR mostró que el estado de metilación del locus de gen SHOX2 en el ADN genómico de la sección de tejido del melanoma se encontraba en el 66 %, mientras que en el trozo de tejido de la piel adyacente se midió sólo una metilación inferior al 1 %. Por consiguiente pudo mostrarse que el ADN genómico extraído del melanoma contenía una alta proporción de ADN de la enfermedad maligna.

A continuación se secuenció el amplificado que resulta de la qPCR del gen BRAF por secuenciación de Sanger tal como se describe en el ejemplo 1. En este sentido se usó en lugar del cebador SEQ ID NO:1 un cebador secuenciador modificado SEQ ID NO:12, que tenía en comparación con SEQ ID NO:1 una secuencia diana ligeramente desplazada. De esta manera puede evitarse que se secuencien amplificados inespecíficos de la qPCR.

Al mismo tiempo con la determinación del ADN convertido genómico de la enfermedad maligna pudo confirmarse indudablemente, mediante la secuenciación de Sanger del producto de qPCR del ADN convertido, la existencia de la mutación de BRAF V600E en el ADN genómico del melanoma (figura 1D), mientras que el tejido normal adyacente no presenta ninguna mutación (figura 1C).

El procedimiento de acuerdo con la invención permite, por consiguiente, una determinación eficaz de mutaciones puntuales usando ADN genómico convertido. Al mismo tiempo, el procedimiento de acuerdo con la invención permite, por consiguiente, también una determinación simultánea del estado de metilación al menos de un dinucleótido de CpG, por ejemplo como detección de la existencia de ADN de una enfermedad maligna en una muestra de ADN genómico, y de la existencia de una mutación. Esta determinación simultánea tiene la acción adicional de que a través de la correlación del análisis de mutación y del análisis de metilación pueden evitarse de manera eficaz resultados falsos negativos de un análisis de mutación. Tales resultados falsos negativos pueden producirse en procedimientos de análisis convencionales, por ejemplo, mediante la ausencia desapercibida de ADN de una enfermedad maligna en una muestra que va a analizarse con ADN genómico.

Para el lector experto es evidente que puede adaptarse este método fácilmente para la determinación de otra mutación y otras enfermedades malignas. Las mutaciones pueden analizarse simultáneamente a este respecto de manera individual o en combinación entre sí. Pueden analizarse también otros biomarcadores de metilación de manera individual o en combinación entre sí. A la combinación de varios biomarcadores de metilación de ADN y/o mutaciones se han puesto límites en el caso de uso de una tecnología basada en PCR en tiempo real únicamente mediante la capacidad de lectura de distintos colorantes. Una capacidad de multiplexación aún más alta puede conseguirse mediante otros métodos. Un ejemplo preferente de un método de este tipo es la amplificación por PCR multiplexada de varios loci con análisis posterior de los amplificados de PCR por medio de NGS.

Ejemplo 3: Determinación de una mutación en ADN genómico de libre circulación

El análisis de mutación en ADN genómico de libre circulación de líquidos corporales es especialmente atractivo, dado que no se requiere ninguna intervención quirúrgica en el paciente. Al mismo tiempo esconde este método un elevado riesgo de producir resultados falsos negativos, dado que la cantidad de ADN de una enfermedad maligna puede depender fuertemente del estadio de la enfermedad. Precisamente en el estadio temprano circulan con frecuencia sólo cantidades muy bajas de ADN genómico de una enfermedad maligna en el cuerpo, que pueden detectarse difícilmente con respecto a ADN sano.

Este problema se reconoció en el contexto de la invención y se ha solucionado con ayuda del procedimiento de acuerdo con la invención, tal como se muestra en el siguiente ejemplo.

A modo de ejemplo se analizó como líquido corporal el plasma sanguíneo de cuatro pacientes seleccionados (A, B, C, D) con un melanoma maligno. Dos de los pacientes (C y D) se encontraban en un estadio avanzado de la enfermedad y tenían por consiguiente una carga tumoral alta. Por tanto era de esperar en estos pacientes una alta proporción de ADN de tumor de libre circulación en la sangre. Los dos otros pacientes (A y B) padecían un melanoma maligno en un estadio temprano con muy baja carga tumoral. Por consiguiente debía partirse en el caso de estos pacientes de una cantidad baja de ADN de tumor de libre circulación.

En primer lugar se realizaron análisis de referencia con el ADN genómico no convertido del tejido maligno, tal como se ha descrito en el ejemplo 1. Uno de los pacientes (D) en el estadio avanzado y un paciente en el estadio temprano (B) mostraron tras el análisis del tejido tumoral una mutación V600E BRAF, mientras que los otros dos pacientes (A y C) no presentaban esta mutación en el tejido tumoral.

Para la realización del procedimiento de acuerdo con la invención se concentró en primer lugar de cada paciente ADN genómico de en cada caso 3 ml de plasma sanguíneo con ayuda del kit innuCONVERT Bisulfit Body Fluids (Analytik Jena, Jena, Alemania) según las indicaciones del fabricante y a continuación se convirtió. El método usado en este kit para la concentración del ADN de libre circulación de plasma se basaba, por ejemplo, en un enriquecimiento soportado por polímero. La conversión se realizó en el contexto del protocolo del kit mediante contacto con bisulfito. El ADN genómico convertido se eluyó al final en 60 yl. Estos 60 y l con ADN genómico convertido se usaron en seis mezclas básicas en cada caso en 10 y l en una PCR en tiempo real cuantitativa, que se realizó de manera análoga al ejemplo 2.

Mediante correlación del análisis de metilación cuantitativo del locus de gen SHOX2 y de la determinación cuantitativa del ADN de libre circulación por medio del locus de gen BRAF se determinó a continuación la proporción del ADN de la enfermedad maligna en el ADN circulante.

La figura 2 muestra los resultados del análisis de metilación combinado de SHOX2 y análisis de mutación de BRAF en el plasma de los pacientes con melanoma. Los diagramas en la columna izquierda muestran los resultados de la PCR en tiempo real cuantitativa para la proporción de copias de ADN de BRAF independientemente del estado de metilación y mutación como medida de la cantidad total de ADN genómico y para el número de copias de ADN de SHOX2 metilado como medida de la proporción del ADN de la enfermedad maligna en el ADN genómico. La columna derecha muestra los resultados de la secuenciación del amplificado de BRAF generado en la PCR en tiempo real (A: paciente con baja carga tumoral y de acuerdo con el análisis de referencia con tipo natural de BRAF en el tumor primario; B: paciente con baja carga tumoral y mutación BRAF V600E de tumor primario; C: paciente con alta carga tumoral y BRAF de tipo natural en el tumor primario; D: paciente con alta carga tumoral y mutación de BRAF V600E de tumor primario).

Por medio de la correlación de acuerdo con la invención de los análisis de metilación del locus de gen SHOX2 con la cantidad total de ADN genómico de libre circulación medida por medio del locus de gen BRAF se determinó que en el paciente A se encontraba el 1,7 % de ADN de la enfermedad maligna y en el paciente B el 0,26 % de a Dn de la enfermedad maligna en el plasma. Esto corresponde a un estado del tumor relativamente temprano, en el que en general ha de encontrarse sólo una baja cantidad de ADN de tumor en el plasma sanguíneo.

En la secuenciación de Sanger posterior de los amplificados de BRAF generados pudo detectarse a continuación en los pacientes A y B sólo ADN de tipo natural, aunque el paciente B es portador de la mutación (figura 2, columna derecha). Considerado de manera aislada, el análisis de mutación en el ADN genómico de libre circulación conduciría en consecuencia para el paciente B a un resultado falso negativo. Este resultado pudo atribuirse sin embargo mediante la combinación de acuerdo con la invención del análisis de mutación con el análisis de metilación a la cantidad demasiado baja de ADN de la enfermedad maligna en el plasma y por consiguiente pudo identificarse de manera eficaz como falso negativo. Un análisis de mutación convencional habría conducido por el contrario a un diagnóstico falso negativo.

Es distinta la situación en los pacientes C y D. En ambos casos pudo mostrarse por medio del análisis de mutilación que estaba presente una alta cantidad de ADN de libre circulación de la enfermedad maligna en la sangre (figura 2, columna izquierda: paciente C: 26 %; paciente D: 41 %). Aunque el análisis de mutación del paciente C mostró sólo la secuencia de tipo natural, pudo descartarse con ayuda del análisis de metilación y de mutación combinado de acuerdo con la invención que se trata de un resultado falso negativo. La enfermedad maligna del paciente C no lleva según esto la mutación BRAF V600E. Este diagnóstico correcto negativo no se habría distinguido con un procedimiento convencional sólo a través del análisis de mutación de un resultado falso negativo.

De esta manera, el procedimiento de acuerdo con la invención eleva la sensibilidad de los análisis de mutación de diagnóstico molecular, dado que se reduce el número de resultados falsos negativos, en particular basándose en ADN genómico de libre circulación, de ADN exosómico o células de libre circulación.

Ejemplo 4: Determinación de una mutación, que conduce a la formación de un CpG

El receptor de factor de crecimiento epidérmico (EGFR) es una tirosinacinasa, que normalmente se activa mediante la unión de un ligando. Mediante mutaciones se llega a una activación constitutiva y por consiguiente a una proliferación celular elevada. Los inhibidores de tirosinacinasa EGFR (TKI) concurren con ATP para la unión en el sitio de unión a ligando del receptor e inhiben de esta manera tanto la actividad tirosinacinasa como también la ruta de señalización de EGFR. En pacientes con mutaciones activadoras en EGFR se consideran estos TKI como terapia de primera línea y pueden mejorar la supervivencia libre de progresión de los pacientes así como las tasas de respuesta a una terapia. Las mutaciones de EGFR son por tanto marcadores fuertemente predictivos para la respuesta a inhibidores de tirosina-cinasa EGFR (TKI), tal como por ejemplo los TKI de primera generación erlotinib (Tarceva) y gefitinib (Iressa) y TKI de segundo generación tal como por ejemplo afatinib (Gilotrif), dacomitinib y neratinib. Los TKI de tercera generación tal como por ejemplo CO-1686 (rociletinib), AZD9291 y HM61713 están diseñados adicionalmente de modo que éstos inhiben la proteína EGFR mutada más fuertemente que el tipo natural de EGFR. Por estos motivos es la determinación del estado de mutación de EGFR de especial importancia para una terapia personalizada, dirigida.

En tumores de pulmón han de esperarse mutaciones de EGFR con especialmente frecuencia en adenocarcinomas, mujeres y no fumadores. Éstas se encuentran en el 9 % en exón 18, el 51 % en exón 19, el 18 % en exón 20 y el 22 % en exón 21 del gen EGFR. Aproximadamente el 5 % de las mutaciones de EGFR conducen a una resistencia de terapia secundaria a EGFR-TKI. A este respecto es la mutación c.2369C>T (T790M) el mecanismo más frecuente para una resistencia de terapia a EGFR-TKI.

En este ejemplo de aplicación se sometió a estudio la mutación c.2573T>G (L858R) de EGFR. Ésta se encuentra en el exón 21 dentro del dominio de cinasa del gen EGFR y aparece en aproximadamente el 43 % de los tumores de pulmón con mutación de EGFR.

En cada caso tres secciones delgadas de en cada caso 10 ym de un tumor de pulmón fijado en formalina e incrustado en parafina así como un trozo de tejido del tejido de pulmón normal adyacente se transfirieron a un recipiente de reacción de 2 ml. Por medio del QIAamp DNA FFPE Tissue Kit (Qiagen, Hilden) se extrajo de manera correspondiente al manual del kit ADN genómico de las secciones de tejido. Del ADN extraído se convirtieron por muestra en cada caso 2 yg por medio del kit innuCONVERT Bisulfit All-In-One (Analytik Jena, Jena, Alemania).

La parte no convertida del ADN extraído se usó para el análisis de referencia. Para ello se amplificó el ADN no convertido genómico con ayuda de dos cebadores (secuencias de cebador SEQ ID NO: 13 y SEQ ID NO:14), que amplifican el locus genómico en el exón 21 del gen EGFR, en el que se sospechaba la mutación. El amplificado resultante se secuenció a continuación en una secuenciación de Sanger y se comparó con la secuencia de tipo natural no convertida SEQ ID NO:15, usándose el cebador directo SEQ ID NO:13 como cebador secuenciador. La amplificación por PCR y la secuenciación de Sanger se realizó tal como se ha descrito en el ejemplo 1.

El resultado del análisis de referencia del locus de EGFR en el exón 21 está resumido en la figura 3A y 3B. La figura 3A muestra la secuencia determinada del tejido sano, que limita con el tumor. La figura 3B muestra la secuencia determinada del tejido tumoral. Se determinó que en el ADN genómico del tejido normal adyacente no ha de encontrarse ninguna mutación. Por el contrario ha de encontrarse en la secuencia del ADN genómico del tumor además de la secuencia de tipo natural (CTG) también la mutación L858R (CGG).

Para el análisis de mutación de acuerdo con la invención se amplificó el ADN genómico convertido con los cebadores de las secuencias SEQ ID NO:16 y SEQ ID NO:17, para determinar una desviación de la secuencia de tipo natural de la cadena con bisulfito-I con la secuencia SEQ ID n O:18. La cadena con bisulfito-I con la secuencia SEQ ID NO:18 se corresponde con la secuencia que resulta de una conversión de la cadena plus de la secuencia genómica de tipo natural SEQ ID NO:15. Los productos de PCR producidos se secuenciaron a continuación con ayuda del cebador directo SEQ ID NO:16 como cebador secuenciador. La amplificación por PCR y la secuenciación de Sanger se realizaron tal como se ha descrito en el ejemplo 1.

El resultado del procedimiento de acuerdo con la invención está mostrado en la figura 3C y 3D. La figura 3C muestra la secuencia determinada del tejido sano, la figura 3D muestra la secuencia determinada del tejido tumoral. Pudo determinarse que el dinucleótido de CpG que resulta de la mutación puntual se encuentra metilado en el tejido tumoral. Debido a su metilación no se convierte la citosina en este dinucleótido de CpG mediante el tratamiento con bisulfito. Debido a ello se diferencia la secuencia determinada del ADN de tipo natural convertido (figura 3C) ventajosamente en una base adicional de la secuencia determinada del ADN de tumor convertido (figura 3D). Dado que en el ADN no convertido genómico del tumor, por el contrario, es diferente sólo una base, puede detectarse este tipo de mutación con ayuda del procedimiento de acuerdo con la invención claramente mejor que en el análisis de mutación convencional. Esto conduce a una mejora sorprendente de la sensibilidad y especificidad del análisis de mutación de acuerdo con la invención también en caso de baja proporción de ADN de la enfermedad maligna en la muestra.

Ejemplo 5: Determinación de una delección de ADN genómico

Las delecciones que conducen a una pérdida de aminoácidos en la proteína son otras mutaciones que pueden encontrarse con frecuencia en el gen EGFR. Éstas tienen lugar con frecuencia en el exón 19, que codifica una parte del dominio de cinasa. Estas mutaciones son igualmente predictivas de la respuesta de terapia en el caso de administración de TKI dirigidos a EGFR. En aproximadamente el 48 % de los tumores de pulmón con EGFR mutado puede encontrarse una delección en el exón 19.

En este estudio pudo mostrarse que pueden determinarse delecciones en ADN genómico convertido de manera eficaz. Para este fin, en cada caso tres secciones delgadas de en cada caso 10 ym de un tumor de pulmón fijado en formalina e incrustado en parafina así como un trozo de tejido del tejido de pulmón normal adyacente se transfirieron a un recipiente de reacción de 2 ml. Por medio del QIAamp DNA FFPE Tissue Kit (Qiagen, Hilden) se extrajo de manera correspondiente al manual del kit ADN genómico de las secciones de tejido. Del ADN extraído se convirtieron por muestra en cada caso 2 yg de ADN por medio del kit innuCONVERT Bisulfit All-In-One (Analytik Jene, Jena, Alemania).

Del ADN extraído no se convirtió una parte y se usó para el análisis de referencia. Para este fin se usaron los cebadores SEQ ID NO:19 y SEQ ID NO:20 que están diseñados para amplificar el locus genómico que lleva la mutación en el exón 21 del gen EGFR, para comparar la secuencia resultante con la secuencia de tipo natural no convertida SEQ ID NO:21. El amplificado resultante se secuenció a continuación en una secuenciación de Sanger, usándose el cebador inverso SEQ ID NO:20 como cebador secuenciador. La amplificación por PCR y la secuenciación de Sanger se realizó tal como se ha descrito en el ejemplo 1.

El resultado del análisis de referencia está representado en la figura 4. La figura 4A muestra que en el ADN no convertido genómico del tejido normal adyacente no ha de encontrarse ninguna mutación. Por el contrario ha de encontrarse en la secuencia del ADN no convertido del tumor un solapamiento de la secuencia de tipo natural con una secuencia mutada, en la que se han deleccionado 15 bases, (figura 4B). Mediante esta delección se llega a un solapamiento de las siguientes bases, que siguen a la delección, con la secuencia de tipo natural.

Para el procedimiento de acuerdo con la invención se amplificó el ADN genómico convertido con los cebadores SEQ ID NO:22 y SEQ ID NO:23, para determinar una desviación de la secuencia de tipo natural de la cadena con bisulfito-I con la secuencia SEQ ID NO:24. La SEQ ID NO:24 se corresponde con la secuencia, que resulta de una conversión de la cadena plus de la secuencia genómica de tipo natural SEQ ID NO:21. Los amplificados producidos se secuenciaron a continuación por medio del cebador inverso SEQ ID NO:23. La amplificación por PCR y la secuenciación de Sanger se realizó tal como se ha descrito en el ejemplo 1.

Los resultados de la secuenciación están mostrados en la figura 4C para el ADN genómico convertido del tejido normal y en la figura 4D para el ADN genómico convertido del tumor. Puede distinguirse que la delección en un alelo del exón 19 conduce a un patrón de solapamiento comparable como en la secuenciación del ADN de tumor no convertido genómico. A continuación pueden determinarse también delecciones de manera eficaz con el procedimiento de acuerdo con la invención.

Para confirmar adicionalmente la determinación de acuerdo con la invención de la delección en ADN genómico convertido, se ligó el producto de PCR del ADN convertido que lleva la mutación en un plásmido. Los plásmidos se transfectaron en E. coli y se aislaron en una placa de agar. Se recurrieron a estas células individuales durante la noche a 37 °C para dar colonias clonales. Las células de clones de E. coli individuales se transfirieron a reacciones de PCR y a continuación se secuenciaron. La clonación del producto de PCR se realizó por medio del kit de clonación TOPO-TA (Life Technologies, Carlsbad, CA, EE.UU.) de manera correspondiente a las indicaciones del fabricante. La amplificación por PCR se realizó tal como se ha descrito en el ejemplo 1. Para ello se usaron los cebadores SEQ ID NO:22 y SEQ ID NO:23. La secuenciación se realizó tal como se ha descrito en el ejemplo 1. Como cebador secuenciador sirvió SEQ ID NO:23. La figura 5A muestra que una parte del ADN genómico convertido en la muestra que lleva ADN de tumor es de tipo natural, mientras que el alelo mostrado en la figura 5B presenta de manera unívoca la delección de 15 bases.

Ejemplo 6: Determinación de una mutación con transición citosina-timina

En la teoría imperante se partía hasta ahora de que las mutaciones en ADN genómico convertido pueden detectarse con mucha dificultad o no pueden detectarse en absoluto. Esta opinión extendida se basaba también en el hecho de que la citosina no metilada se convierte por ejemplo en uracilo y no se diferencia uracilo en las propiedades de apareamiento de bases de timina. En el mundo científico se consideró por tanto como un problema no solucionable diferenciar entre una timina introducida mediante mutación de C a T y una timina que se introduce mediante conversión de citosina.

Esta falsa idea pudo superarse en el contexto de la presente invención. Mediante comprensión inventiva se reconoció por primera vez que este problema puede solucionarse cuando en lugar o adicionalmente a la cadena plus convertida de la muestra genómica está comprendida también la cadena minus convertida del ADN genómico por el análisis de mutación de acuerdo con la invención. En la cadena minus se corresponde una transición de C a T de la cadena plus con una transición de G a A. En el presente ejemplo pudo mostrarse, por tanto, por medio de la mutación c.437C>T (A146V, COSM1360827) en el exón 4 del locus de KRAS que puede detectarse bien la transición de G a A en la cadena minus tras una conversión del ADN genómico y por consiguiente es posible una determinación eficaz de una mutación puntual que se basa únicamente en una transición de C a T.

Para este fin, en cada caso tres secciones delgadas de en cada caso 10 ym de un adenocarcinoma del intestino grueso fijado en formalina e incrustado en parafina así como un trozo de tejido del tejido de intestino normal adyacente se transfirieron a un recipiente de reacción de 2 ml. Por medio del QIAamp DNA FFPE Tissue Kit (Qiagen, Hilden, Alemania) se extrajo de manera correspondiente al manual del kit ADN genómico de las secciones de tejido. Del ADN extraído se convirtieron por muestra en cada caso 2 yg de ADN por medio del kit innuCONVERT Bisulfit All-In-One (Analytik Jena, Jena, Alemania).

En cada caso otra parte del ADN extraído no se convirtió y se usó para el análisis de referencia. Para ello se amplificó en una PCR con ayuda de los cebadores SEQ ID NO:25 y SEQ ID NO:26 el locus genómico que lleva potencialmente la mutación en el exón 4 del gen KRAS, para determinar desviaciones de la secuencia de ADN de tipo natural no convertido SEQ ID NO:27. El producto de PCR resultante se secuenció a continuación en una secuenciación de Sanger, usándose el cebador directo SEQ ID NO:25 como cebador secuenciador. La amplificación por PCR y la secuenciación de Sanger se realizó tal como se ha descrito en el ejemplo 1.

La figura 6A y 6B muestran el resultado del análisis de referencia. La figura 6A reproduce la secuencia del ADN genómico no convertido del tejido sano, que limita con el tumor tras la secuenciación de la cadena directa. La figura 6B muestra la secuencia del a Dn genómico no convertido del tejido tumoral tras la secuenciación de la cadena directa. Por consiguiente no puede encontrarse ninguna mutación en el ADN genómico no convertido del tejido normal adyacente (6A). Por el contrario aparece en la secuencia del ADN genómico del tumor además de la secuencia de tipo natural también una secuencia mutada con una transición de C a T (6B).

En el contexto de la realización del procedimiento de acuerdo con la invención se realizó en primer lugar una amplificación por PCR del locus de gen correspondiente en el exón 4 del gen KRAS con los cebadores con las secuencias s Eq ID NO:29 y SEQ ID NO:30, para determinar una desviación del amplificado de la secuencia SEQ ID NO:28. La secuencia SEQ ID NO:28 se corresponde con la secuencia de tipo natural convertida de la cadena plus con la secuencia SEQ ID NO:27. La amplificación por PCR se realizó tal como se ha descrito en el ejemplo 1. El resultado de la secuenciación de Sanger realizada a continuación de manera correspondiente según el ejemplo 1 por medio del cebador directo SEQ ID NO:29 está mostrado en la figura 6C y 6D. La figura 6C reproduce la secuencia del ADN genómico convertido del tejido sano tras la secuenciación directa de la cadena con bisulfito-I, La figura 6D reproduce de manera correspondiente la secuencia del ADN genómico convertido del tejido tumoral tras la secuenciación directa de la cadena con bisulfito-I. El resultado explica que la transición de C a T debido a la conversión química de C en U ya no puede detectarse en la cadena con bisulfito-I. Esto se basa en que un U en el ADN genómico convertido se sustituye a continuación en el contexto de la amplificación por PCR de nuevo por una T, de modo que ya no puede diferenciarse la secuencia mutada originariamente de la secuencia de tipo natural.

A continuación se realizó el análisis de mutación del correspondiente locus de gen en el exón 4 del gen KRAS basándose en la cadena con bisulfito-II, para determinar una desviación de la secuencia de tipo natural convertida SEQ ID NO:31. Para la amplificación por PCR en base a la cadena con bisulfito-II se usaron los cebadores SEQ ID NO:32 y SEQ ID NO:33. La secuenciación del producto de PCR se realizó con el cebador inverso SEQ ID NO:32. Los resultados están mostrados en la figura 6E-H. Las figuras 6E y 6F muestran en primer lugar como referencia la variante de tipo natural y la mutación en el ADN genómico no convertido tras la secuenciación por medio del cebador inverso SEQ ID NO:26. La mutación puede distinguirse en la figura 6F por medio de la aparición de una transición parcial de G a A. Las figuras 6G y 6H muestran las secuencias determinadas en el ADN genómico convertido del tejido sano (6G) o bien del tejido tumoral (6H) en cada caso tras la secuenciación inversa descrita anteriormente de la cadena con bisulfito-II. Puede distinguirse claramente que a diferencia del tejido sano en el tejido tumoral aparece además de la secuencia de tipo natural también la secuencia mutada con la transición de G a A. Esta transición de G a A se corresponde con la transición de C a T buscada en la cadena directa.

Por consiguiente, el procedimiento de acuerdo con la invención permite, en contra de las ideas falsas entre los expertos, generalmente una determinación eficaz de mutaciones, que comprenden una transición de C a T o están constituidas por ésta.

En determinadas variantes del procedimiento de acuerdo con la invención comprende el análisis de mutación por tanto una determinación de la mutación basándose en la cadena minus convertida del ADN genómico.

Ejemplo 7: Determinación multiplexada de mutaciones en ADN genómico de líquidos corporales y tejidos

En una aplicación preferente de la invención está previsto realizar un análisis de mutación y de metilación combinado, que comprende varios genes de distintas regiones del genoma, a continuación designado también como análisis de mutación y de metilación del genoma completo.

Preferentemente se realiza el análisis de mutación y de metilación del genoma completo con ADN genómico de libre circulación de líquidos corporales. Especialmente se ofrecen plasma sanguíneo, suero sanguíneo, orina, ascitis y derrames pleurales. La conversión del ADN genómico de líquidos corporales puede realizarse por ejemplo por medio del kit innuCONVERT Bisulfit Body Fluids (Analytik Jene, Jena, Alemania) de manera correspondiente al manual del kit.

A continuación está previsto un análisis de mutación y análisis de metilación combinado con ayuda de un método de secuenciación del genoma completo adecuado. En variantes preferentes se usa un método de secuenciación de alto rendimiento tal como por ejemplo un método de secuenciación de nueva generación. De manera especialmente preferente se usa el método de Whole Genome Shotgun Bisulfite Sequencing (WGSBS). De esta manera pueden determinarse sucesivamente una pluralidad de mutaciones o bien estados de metilación de CpG. Siempre que se realice la determinación en cada caso de manera cuantitativa, las cantidades determinadas pueden relacionarse a continuación con las correspondientes secuencias de tipo natural o bien estados de metilación dentro del ADN genómico, dado el caso convertido. De esta manera puede determinarse, por ejemplo, la proporción relativa de ADN que lleva la mutación y/o ADN de una enfermedad maligna (por medio del estado de metilación) dentro del ADN genómico. De esta manera es también posible determinar aquella proporción del ADN de una enfermedad maligna que lleva una mutación. Esto puede ser especialmente ventajoso, dado que las enfermedades malignas, tal como por ejemplo tumores, presentan con frecuencia una composición genética heterogénea o puede modificarse por ejemplo la proporción relativa de ADN que lleva mutación en el ADN genómico de una enfermedad maligna mediante por ejemplo una terapia y permite sacar conclusiones sobre el desarrollo de la terapia y/o de la enfermedad.

En otra configuración está previsto que el análisis de mutación o bien el análisis de metilación del ADN genómico convertido de líquidos corporales no se realicen directamente por medio de un método de secuenciación del genoma completo tal como se ha descrito anteriormente. En este caso está previsto amplificar en primer lugar las regiones que van a someterse a estudio del ADN genómico convertido. En una aplicación preferente se amplifican estas regiones con ayuda de una PCR. Los pares de cebadores se diseñan para ello de manera que éstos generan en cada caso un amplificado del ADN genómico convertido, que comprende uno o varios sitios de mutación que van a analizarse o dinucleótidos de CpG. Preferentemente, los pares de cebadores se diseñan también de manera que sean compatibles con una PCR múltiple, en la que se usan una pluralidad de pares de cebadores para la amplificación simultánea de una pluralidad de regiones que van a someterse a estudio del ADN genómico convertido. A continuación se realiza el estudio de la pluralidad de amplificados de por ejemplo por medio de secuenciación de nueva generación.

En otra configuración preferente se realiza el análisis a través de una amplificación de sondas multiplexada, dependiente de la ligación (MLPA). Las sondas usadas para la MLPA se diseñan para ello de manera que éstas se unan a los sitios de mutación o bien sitios de metilación que van a determinarse y por ejemplo se liguen en caso de existencia de una mutación o de una metilación de un dinucleótido de CpG. A continuación, las sondas ligadas pueden amplificarse, por ejemplo con ayuda de una PCR, y dado el caso secuenciarse.

En otra forma de realización preferente se analiza ADN de tejidos frescos o fijados o células tumorales de libre circulación en lugar de ADN de libre circulación.

Ejemplo 8: Predicción mediante análisis de mutación y de metilación combinado dentro de un gen

En el contexto de la presente invención se distinguió que una respuesta de un paciente con una enfermedad maligna a una terapia, tal como por ejemplo una quimioterapia puede depender de si por ejemplo determinadas enzimas de reparación de ADN están activas o inactivas en el tejido de la enfermedad maligna. Una inactivación puede encontrarse por ejemplo debido al estado de metilación o también a una mutación inactivadora del correspondiente gen que codifica la enzima de reparación en el ADN genómico de la enfermedad maligna. Con respecto a una terapia dirigida puede ser ventajoso por tanto someter a estudio el mismo gen tanto en relación a su estado de metilación como también con respecto a la existencia de una mutación.

Un modo de procedimiento de este tipo prevé la invención por ejemplo en relación a la terapia con inhibidores de PARP. Los inhibidores de PARP son un grupo de sustancias farmacológicas que inhiben la enzima poli-ADP-ribosapolimerasa (PARP). Esta enzima es importante para la reparación de rupturas de cadena sencilla en el ADN. Si estas rupturas de cadena sencilla no se reparan de manera eficaz, entonces pueden conducir éstas a rupturas de cadena doble, que a su vez en el caso de faltar igualmente la reparación pueden conducir a la muerte celular. Esto se pretende así por ejemplo en el caso de una quimioterapia y/o radioterapia de tumores. Preferentemente se realiza la predicción de acuerdo con la invención en relación a los inhibidores de PARP, talazoparib (BMN-673), olaparib (AZD-2281), rucaparib (AG014699, PF-01367338), veliparib (ABT-888), CEP 9722, MK 4827 y/o BGB-290.

BRCA1, BRCA2 y PALB2 codifican enzimas de reparación, que reparan tales rupturas de cadena doble resultantes mediante recombinación homóloga. Cuando estos genes están activos y funcionales, entonces pueden repararse de manera eficaz las rupturas de cadena sencilla y doble que resultan mediante una inhibición de PARP. Las células tumorales pueden sobrevivir. La terapia con inhibidores de PARP actúa mal en este caso.

En algunos tumores está limitada sin embargo la función de BRCA1, BRCA2 y/o PALB2, dado que los correspondientes genes llevan, por ejemplo, una mutación de la línea germinal o una mutación somática o/y los genes están inactivados mediante metilación. En estos casos no pueden repararse los daños del ADN que resulta de la inhibición de PARP y la célula tumoral muere. Las células tumorales, en las que BRCA1, BRCA2 o PALB2 están inactivados mediante mutación y/o metilación, responden, por tanto, bien al tratamiento con inhibidores de PARP.

Está previsto someter a ensayo con ayuda del procedimiento de acuerdo con la invención tumores en el sentido de si éstos, debido a una inactivación de enzimas de reparación del ADN mediante metilación y/o mutación del correspondiente gen, responden previsiblemente a una monoterapia o terapia de combinación con inhibidores de PARP. Para una terapia de combinación se tienen en cuenta a este respecto por ejemplo, sin embargo no exclusivamente, una quimioterapia con cisplatino, una radiación u otras terapias.

Para la realización del procedimiento de acuerdo con la invención se prepara por ejemplo una sección de hematoxilinaeosina (sección H&E) del tumor fijado en formalina e incrustado en parafina. Al mismo tiempo se preparan otras secciones histológicas no teñidas de aproximadamente 10 ym y se colocan en portaobjetos de vidrio. Mediante un patólogo se marca la región del tejido que lleva el tumor en la sección de H&E. El área correspondiente de las secciones histológicas no teñidas colocadas se transfiere entonces por medio de un escalpelo a un recipiente de reacción de 2 ml. Idealmente se usa un área que mide en total aproximadamente de 1 a 3 cm2 Este área puede obtenerse también de varias secciones histológicas no teñidas.

El tejido puede desparafinarse a continuación y puede lisarse por ejemplo por medio de proteinasa K. El tejido lisado puede transferirse directamente sin extracción anterior por ejemplo a una reacción de conversión con bisulfito para la conversión del ADN genómico. Como alternativa puede extraerse el ADN genómico también antes de la conversión del tejido lisado. Tras la conversión se realiza una purificación del ADN genómico convertido. Para ello son adecuadas por ejemplo columnas de membrana de sílice. El lisado del tejido, la conversión con bisulfito del ADN y la purificación posterior puede realizarse por ejemplo con el kit innuConvert All-In-One (Analytik Jena, Jena, Alemania) de manera correspondiente al protocolo contenido en el kit.

La determinación de acuerdo con la invención de la mutación y del estado de metilación puede realizarse a continuación a través de distintas variantes de procedimiento.

Es posible, por ejemplo, realizar una amplificación por PCR múltiple del ADN genómico convertido con pares de cebadores, que son adecuados para amplificar al menos una primera zona parcial del ADN genómico convertido, del que se sospecha que contiene una mutación, y una segunda zona parcial, que incluye un dinucleótido de CpG, cuyo estado de metilación va a analizarse.

Para el análisis de metilación de BRCA1 se usaron cebadores que preferentemente, sin embargo no exclusivamente, están diseñados para unirse al menos parcialmente en la secuencia genómica SEQ ID NO:61, después de que se convirtiera esta secuencia. Por ejemplo puede ser adecuado el par de cebadores con SEQ ID NO:86 y SEQ ID NO:87 o bien el par de cebadores con SEQ ID NO:88 y SEQ ID NO:89.

Para el análisis de metilación de BRCA2 se usaron cebadores que preferentemente, sin embargo no exclusivamente, están diseñados para unirse al menos parcialmente en la secuencia genómica SEQ ID NO:39, después de que se convirtiera esta secuencia.

Para el análisis de mutación de BRCA1 se usan preferentemente uno o varios pares de cebadores, cuyas secuencias diana se encuentran al menos parcialmente en regiones del ADN genómico convertido, que tenían en el estado de tipo natural no convertido una identidad de secuencia de al menos el 95 % con una de las secuencias seleccionadas de SEQ ID NO:46 a SEQ ID NO:63 o combinaciones de las mismas, en particular que comprende SEQ ID NO:56.

Para el análisis de mutación de BRCA2 se usan preferentemente uno o varios pares de cebadores, cuyas secuencias diana se encuentran al menos parcialmente en regiones del ADN genómico convertido, que tenían en el estado de tipo natural no convertido una identidad de secuencia de al menos el 95 % con una de las secuencias seleccionadas de SEQ ID NO:34 a SEQ ID NO:45 o combinaciones de las mismas. Además se usan de manera especialmente preferente uno o varios pares de cebadores, cuyas secuencias diana se encuentran en regiones del ADN genómico convertido del locus de gen PALB2.

Es posible secuenciar los productos de la amplificación por PCR a continuación por ejemplo a través de NGS, realizándose la determinación del estado de metilación o bien de la presencia o ausencia de la mutación preferentemente de manera cuantitativa. De esta manera puede determinarse por ejemplo a través del estado de metilación cuantificado y/o la relación de ADN genómico convertido con y sin mutación la proporción porcentual de alelos metilados y mutados.

El análisis de mutación y de metilación puede realizarse también a través de MLPA o WGSBS de manera análoga a la descripción en el ejemplo 7 o variaciones adecuadas de estos procedimientos.

En otra configuración no se macrodisecciona el tumor fijado en formalina. Por ejemplo pueden transferirse las secciones de en cada caso 10 ym de un bloque de tejido que lleva tumor directamente a un recipiente de reacción de 2 ml. El siguiente lisado, conversión y purificación puede realizarse tal como se ha descrito anteriormente.

La aplicación de este procedimiento se ofrece especialmente para enfermedades, en las que la existencia de mutaciones BRCA1 y BRCA2 desempeñan un importante papel, tal como por ejemplo cáncer de mama y de ovario, así como melanomas y cáncer de próstata.

Ejemplo 9: Predicción mediante análisis de mutación y metilación combinado de distintos genes

Mientras que en el ejemplo anterior, en particular un análisis de mutación y de metilación combinado dentro del mismo gen permite una predicción con respecto a la respuesta a una terapia, se ha distinguido en el contexto de la invención también que en determinadas enfermedades malignas, una determinación combinada de una mutación o bien de un estado de metilación de distintos genes puede garantizar una predicción especialmente ventajosa.

Un ejemplo se refiere al tratamiento con temozolomida. Temozolomida es un agente citostático alquilante, que se usa para la terapia simultánea, adyuvante y paliativa de glioblastomas en combinación con radioterapia. Temozolomida conduce a un daño del ADN, alquilándose el ADN. Estos daños del ADN pueden inducir las células tumorales a la apoptosis y pueden así destruir éstas.

La enzima O6-metilguanina-ADN-metiltransferasa (MGMT) participa en la reparación de ADN alquilado. Esta enzima puede reducir en consecuencia la acción de temozolomida. MGMT se reprime en algunos glioblastomas mediante la metilación del gen. Los pacientes, cuyos tumores presentan una expresión reducida de MGMT, responden, por tanto, bien a un tratamiento con temozolomida. El estado de metilación de MGMT es por tanto un biomarcador predictivo de la respuesta a un tratamiento con temozolomida.

Mientras tanto se conoce que además de la metilación de MGMT también algunas mutaciones, por ejemplo mutaciones de los genes IDH1 y IDH2 así como amplificación de EGFR, pueden predecir la respuesta a un tratamiento con temozolomida. Para ello es la aplicación de medicamentos, que inhiben específicamente la variante mutada de IDH1 y IDH2, un planteamiento de terapia muy prometedor. Los tumores que presentan una amplificación de EGFR pueden responder a un tratamiento con anticuerpos monoclonales terapéuticos dirigidos contra EGFR. Los tumores que presentan mutaciones en IDH1 o IDH2 responden bien a una terapia con principios activos que inhiben las variantes mutadas. El análisis de metilación de MGMt y análisis de mutación de IDH1, lDH2 y/o EGFR combinado en el ADN genómico convertido de glioblastomas u otros tumores, en los que se encuentran las mutaciones IDH1, IDH2 y/o EGFR, es por tanto una aplicación clínicamente relevante de la presente invención. En particular comprende el procedimiento de acuerdo con la invención un análisis de metilación del gen MGMT, preferentemente que comprende al menos una parte de una secuencia que en el estado de tipo natural, no convertido presenta identidad de secuencia de al menos el 95 % con SEQ ID NO:92, y/o un análisis de mutación de IDH1 y/o IDH2. En particular puede estar diseñado el análisis de mutación para determinar una mutación en al menos una parte de una secuencia que en el estado de tipo natural, no convertido presenta identidad de secuencia de al menos el 95 % con SEQ ID NO:84 y/o SEQ ID NO:85.

Ejemplo 10: Uso del procedimiento para el pronóstico y/o la predicción

La medición de biomarcadores de pronóstico permite la determinación de la agresividad de una enfermedad maligna, por ejemplo de un tumor.

Pertenece a las características distintivas de la presente invención que mediante el análisis de mutación y de metilación simultáneo puede crearse una idea general de diagnóstico molecular, en la que se incorporan igualmente biomarcadores de pronóstico tal como por ejemplo del estado de metilación de un gen y biomarcadores predictivos tal como por ejemplo una mutación en un gen terapéuticamente relevante. De esta manera puede establecerse por primera vez dentro de un único análisis una relación funcional entre tales disposiciones genéticas de pronóstico y predictivas, de esta manera para tratar pacientes de manera dirigida y dado el caso de manera dinámica.

En otra aplicación de esta invención se reúnen por tanto el análisis de metilación de un gen como biomarcador de pronóstico y el análisis de mutación de un gen terapeúticamente relevante como biomarcador predictivo de una enfermedad maligna en un análisis.

Para este tipo de análisis está previsto en particular que el análisis de metilación comprenda al menos una parte o varias partes del biomarcador de metilación de ADN de pronóstico PITX2, preferentemente al menos una parte de una secuencia que en el estado de tipo natural, no convertido presenta identidad de secuencia de al menos el 95 % con SEQ ID NO:90 y/o SEQ ID NO:91, CDO1, PLAU, POU4F3, TFF1, CXCL12 o combinaciones de los mismos.

Ejemplo 11: Determinación de la proporción de ADN de una enfermedad maligna en ADN genómico mediante análisis de mutación y análisis de metilación combinado

En el contexto de la presente invención se distinguió también el problema de que algunas enfermedades malignas presentan una metilación en total baja en muchos genes, que habitualmente están hipermetilados de manera aberrante en enfermedades malignas. En tales casos puede ser problemático determinar la proporción del ADN de la enfermedad maligna en una muestra de ADN genómico sólo por medio de los análisis de metilación, ya que puede existir ADN de la enfermedad maligna, a pesar de que se detecta sólo poca o ninguna metilación de a Dn . De esta manera pueden resultar diagnósticos falsos negativos.

Esta problemática se soluciona en otra configuración de la invención, comprendiendo el análisis de mutación una determinación de al menos una mutación recurrente o de al menos una mutación en un gen mutado de manera recurrente. En particular puede determinarse la proporción del ADN de la enfermedad maligna en el ADN genómico por medio de la al menos una mutación recurrente o al menos una mutación en un gen mutado de manera recurrente. Preferentemente se realiza para ello el análisis de mutación en la etapa B) en condiciones que permiten una determinación cuantitativa de la al menos una mutación recurrente o de la al menos una mutación del gen mutado de manera recurrente, para cuantificar la proporción de ADN de la enfermedad maligna en el ADN genómico.

Si, por ejemplo, en el plasma de un paciente con cáncer intestinal debe realizarse un análisis de mutación de acuerdo con la invención de EGFR o KRAS, entonces se ofrece adicionalmente una determinación de otras mutaciones que son muy frecuentes en cáncer intestinal para usar ésta sola o junto con el análisis de metilación para la determinación de la proporción del ADN de la enfermedad maligna en el ADN genómico. En el caso de cáncer intestinal puede comprender el análisis de mutación por ejemplo TP53 y/o APC para determinar una mutación de un gen mutado de manera recurrente. La proporción de a Dn de la enfermedad maligna en el ADN genómico puede determinarse entonces únicamente por medio de la mutación del gen mutado de manera recurrente o en combinación con el análisis de metilación, para obtener de esta manera un resultado especialmente robusto.

La determinación de la mutación recurrente o de la mutación en el gen mutado de manera recurrente puede realizarse en particular dependiendo de qué órgano o bien qué tipo de tejido se ve afectado por la enfermedad maligna. A continuación se mencionan distintos tipos de órganos y tejidos junto con los respectivos genes, que están comprendidos preferentemente al menos parcialmente por el análisis de mutación para la determinación de una mutación recurrente o una mutación de un gen mutado de manera recurrente. El análisis de mutación puede comprender también combinaciones de estos genes para determinar una o varias mutaciones recurrentes o una o varias mutaciones de genes mutados de manera recurrente.

Vulva: TP53, CDKN2A. Vagina: TP53. Vías urinarias: TERT, FGFR3, TP53, STAG2, KDM6A, PIK3CA, CDKN2A, ARID1A, RB1. Tracto aerodigestivo superior: TP53, CDKN2A, NOTCH1. Tiroides: BRAF, RET, TSHR, TERT, NRAS. Timo: ALK, TP53, KIT, MEN1, CDKN2A, RET. Testículo: CTNNB1, KIT, TP53, KRAS. Estómago: TP53, ARID1A, CDH1, APC, PIK3CA, KMT2C, TRRAP, CTNNB1. Partes blandas: KIT, CTNNB1, MED12, NF2, SMARCB1, NF1, PDGFRA, TP53, TERT, CDKN2A, VHL Intestino delgado: PDGFRA, KRAS, TP53, CTNNB1, APC, MEN1, SMAD4, GNAS. Piel: BRAF, TP53, TERT, CDKN2A, GRIN2A, PTCH1, NRAS, ROS1, FGFR3, KMT2C, HRAS. Glándulas salivales: TP53, HRAS, PIK3CA, CDKN2A, CREBBP, KDM6A, CTNNB1. Próstata: TP53, PTEN, SPOP, KRAS. Pleura: DICER1, CDKN2A, BAP1, NF2, TERT, TP53. Peritoneo: GNAS, KRAS, TP53, EGFR, SMAD4. Páncreas: KRAS, TP53, GNAS, SMAD4, CDKN2A. Ovario: TP53, FOXL2, KRAS, PIK3CA, ARID1A, BRAF. Esófago: TP53, CDKN2A, NOTCH1. Sistema nervioso: BRAF, TERT, NRAS, CDKN2A. Pulmón: TP53, EGFR, KRAS. Hígado: TP53, CTNNB1, TERT. Intestino grueso: APC, TP53, KRAS, ATM, PIK3CA, SMAD4, BRAF. Riñón: VHL, PBRM1, BAP1, SETD2, CTNNB1, AMER1, TP53, WT1. Leucemias y linfomas: JAK2, NPM1, FLT3, MYD88, KIT, CALR, ABL1, TET2, NOTCH1, DNMT3A, ASXL1. Endometrio: PTEN, PIK3CA, CTNNB1, TP53, PIK3R1, ARID1A, KRAS. Cuello uterino: PIK3CA, KMT2C, KMT2D, KRAS. Sistema nervioso central: IDH1, TERT, TP53, CDKN2A, PTEN, H3F3A. Mama: PIK3CA, TP53, CDH1. Hueso: IDH1, GNAS, TP53, H3F3B, COL2A1. Vesícula biliar: TP53, KRAS, CDKN2A, KMT2C, IDH1, ARID1A. Glándula suprarrenal: KCNJ5, TP53, CTNNB1, NF1.

Ejemplo 12: Detección de células tumorales circulantes (CTC)

El análisis de células tumorales circulantes (CTC) incluye un gran potencial para la mejora del tratamiento de pacientes con enfermedades malignas. Por ejemplo, la existencia de CTC en la sangre puede permitir la determinación del estadio del tumor, dado que indica ya de manera temprana una metástasis remota oculta. Un análisis molecular de CTC puede permitir también una declaración sobre la posible respuesta de estas células a determinadas terapias. Si por ejemplo en las CTC de pacientes con melanoma se encuentra la mutación de BRAF V600E, entonces es probable una respuesta de estas células a un tratamiento con vermurafenib.

La detección específica de CTC es sin embargo problemático. Los procedimientos convencionales se basan por ejemplo en el enriquecimiento de CTC por medio de marcadores de superficie epiteliales. La molécula de adhesión celular epitelial EpCAM por ejemplo indica que la célula podría ser una célula tumoral, dado que esta célula presenta características epiteliales, que no se muestran por otras células circulantes que en la mayoría de los casos son de origen hematopoyético. Con ayuda de anticuerpos contra EpCAM pueden marcarse estas células de manera específica y pueden purificarse por ejemplo a través de partículas magnéticas o pueden enriquecerse ya en el cuerpo con un catéter que lleva sobre la superficie anticuerpos contra EpCAM. Este procedimiento presenta dos graves problemas. En primer lugar no todas las células tumorales llevan las correspondientes proteínas, tal como por ejemplo EpCAM, sobre la superficie, de modo que el método precisamente con bajas cantidades de CTC no es con frecuencia suficientemente sensible para la detección. En segundo lugar se encuentran células circulantes aisladas, que llevan características de células epiteliales, sin embargo a este respecto no son de origen tumoral, de modo que el método carece también de especificidad.

Otros métodos conocidos para el enriquecimiento de CTC se basan en una selección de tamaño. Las CTC son más grandes que la mayoría de otras células circulantes y pueden enriquecerse así a través de poros de un tamaño adecuado. También en este caso existe el problema de la especificidad, dado que pueden enriquecerse también otras células de origen no tumoral.

Si se realiza ahora en las CTC supuestamente enriquecidas del procedimiento convencional un análisis de mutación, entonces pueden producirse resultados falsos negativos, dado que en lugar de las CTC se analizan al menos parcialmente también células benignas enriquecidas de manera inespecífica.

El procedimiento de acuerdo con la invención soluciona este problema, por ejemplo, mediante un análisis de mutación y de metilación combinado en ADN genómico convertido de células de libre circulación. Es entonces posible detectar un origen maligno de las células aisladas por medio del análisis de metilación. De esta manera puede mejorarse la especificidad del análisis de mutación de manera significativa.

Ejemplo 13: Análisis de metilación normalizado

En los ejemplos anteriores se mostró ya que con ayuda del procedimiento de acuerdo con la invención es posible una detección normalizada de mutaciones mediante correlación del análisis de mutación con el análisis de metilación. De esta manera puede determinarse, por ejemplo, la proporción de ADN de una enfermedad maligna en una muestra con ADN genómico a través del análisis de metilación, para evitar que la ausencia de ADN de la enfermedad maligna en la muestra conduzca a un análisis de mutación falso negativo. Debido a ello se consigue de acuerdo con la invención, por ejemplo, una mejora considerable de la sensibilidad de la determinación de mutaciones.

Sin embargo también el caso inverso, es decir una normalización del análisis de metilación por medio del análisis de mutación, está unida con ventajas especiales de acuerdo con la invención.

Una enfermedad maligna, por ejemplo un tumor, es por regla general heterogénea, es decir pueden estar presentes distintos subtipos de células, que en ocasiones tienen propiedades distintas. Si actúa por ejemplo sobre el tumor una terapia, por ejemplo una quimioterapia, una terapia dirigida o una inmunoterapia, entonces no todas las células responden de la misma manera y con frecuencia sobrevive una población de células tumorales. Esto puede ser por ejemplo un subtipo determinado.

El análisis de metilación de acuerdo con la invención es especialmente adecuado para identificar tales subtipos. Los biomarcadores de metilación con frecuencia no están metilados en todas las células tumorales. Por tanto, el análisis de biomarcadores de metilación permite la identificación de subtipos de células, que tienen una determinada propiedad. Esto puede comprender, tal como se ha mencionado ya en los ejemplos anteriores, por ejemplo una determinada respuesta a una determinada terapia o una determinada agresividad.

Si se somete a estudio en el contexto del procedimiento de acuerdo con la invención el ADN genómico convertido en cuanto a tales biomarcadores de metilación predictivos y de pronóstico, entonces es interesante la cuestión de cómo de alta es la proporción del ADN de la enfermedad maligna en la muestra. Si, por ejemplo, el análisis de metilación comprende MGMt en una muestra con ADN genómico de un glioblastoma para predecir por ejemplo una respuesta a temozolomida, entonces puede ser importante en qué porcentaje de las células tumorales existe una metilación de MGMT.

Si un tumor lleva, por ejemplo, una mutación que ha conducido a la producción de tumor, entonces ésta está contenida de manera clonal en todas las células tumorales y el procedimiento de acuerdo con la invención permite la determinación de la proporción de células tumorales por medio del análisis de mutación. En relación al ejemplo del glioblastoma puede determinarse por ejemplo una mutación de IDH1 o IDH2. A continuación puede formarse una relación de la proporción del ADN genómico, en el que se detectó la metilación, y la proporción del ADN genómico, en el que se detectó la mutación. Esta relación puede servir como medida de la proporción del subtipo de células buscado

Claims (8)

REIVINDICACIONES

1. Un procedimiento para el diagnóstico, pronóstico, predicción y/o control de desarrollo de una enfermedad maligna, que comprende una determinación al menos de una mutación en ADN genómico,

con las etapas de

A) convertir al menos una parte de las citosinas contenidas en el ADN genómico en uracilo u otra base con un comportamiento de apareamiento de bases y/o peso molecular que puede diferenciarse de citosina,

B) realizar un análisis de mutación con el ADN genómico obtenido de la etapa A), para determinar la al menos una mutación,

C) realizar un análisis de metilación con el ADN genómico obtenido de la etapa A), para determinar un estado de metilación al menos de un dinucléotido de CpG contenido en el ADN genómico,

D) correlacionar la presencia o ausencia de la mutación con el estado de metilación del dinucleótido de CpG, para determinar el diagnóstico, pronóstico, predicción y/o el desarrollo de la enfermedad maligna,

en el que el análisis de mutación comprende al menos una parte del gen BRAF y el análisis de metilación comprende al menos una parte del gen SHOX2; o

en el que el análisis de mutación comprende al menos una parte del gen FGFR3, TERT, PIK3CA, KRAS, TP53, NRAS y/o HRAS y el análisis de metilación comprende al menos una parte del gen ONECUT2, OTX1, SHOX2, SEPT9 y/oTWIST1; o

en el que el análisis de mutación comprende al menos una parte del gen TP53 y/o una inserción de ADN viral, en particular al menos una parte o varias partes del ADN de uno o varios virus del papiloma humano (VPH) y el análisis de metilación comprende al menos una parte del gen SEPT9; o

en el que el análisis de mutación comprende al menos una parte del gen BRCA1, BRCA2 y/o PALB2 y el análisis de metilación comprende al menos una parte del gen BRCA1; o

en el que el análisis de mutación comprende al menos una parte del gen IDH1, IDH2 y/o EGFR y el análisis de metilación comprende al menos una parte del gen MGMT; o en el que el análisis de mutación comprende al menos una parte del gen TP53 y el análisis de metilación comprende al menos una parte del gen PITX2; o

en el que el análisis de mutación comprende al menos una parte del gen AR, ESR1, BRCA1, BRCA2, PALB2 y/o ERBB2 y el análisis de metilación comprende al menos una parte del gen PITX2.

2. El procedimiento según la reivindicación 1, en el que la al menos una mutación comprende una mutación somática.

3. El procedimiento según una de las reivindicaciones 1 o 2, en el que la al menos una mutación comprende una inserción de ADN viral.

4. El procedimiento según una de las reivindicaciones 1 a 3, en el que el ADN genómico comprende ADN de libre circulación y/o ADN de células de libre circulación de un líquido corporal.

5. Un procedimiento para el pronóstico de una enfermedad maligna y/o para la predicción de un comportamiento de respuesta de una enfermedad maligna a una terapia, que comprende una determinación al menos de una mutación en ADN genómico, con las etapas de

A) convertir al menos una parte de las citosinas contenidas en el ADN genómico en uracilo u otra base con un comportamiento de apareamiento de bases y/o peso molecular que puede diferenciarse de citosina,

B) realizar un análisis de mutación con el ADN genómico obtenido de la etapa A), para determinar la al menos una mutación,

C) realizar un análisis de metilación con el ADN genómico obtenido de la etapa A), para determinar un estado de metilación al menos de un dinucléotido de CpG contenido en el ADN genómico,

D) correlacionar la presencia o ausencia de la mutación con el estado de metilación del dinucleótido de CpG, para determinar el pronóstico y/o el comportamiento de respuesta de la enfermedad maligna a la terapia, en el que el análisis de mutación comprende una mutación de un gen seleccionado de BRAF, EGFR, KRAS, NRAS, AKT1, IDH1, IDH2, TSC1, NF1, DNMT3A, EZH2, TERT, SMO, FLT3, JAK2, BCR, SMAD4, MAP2K1, PIK3CA, PTEN, DDR2, NTRK1, RET, KIT, ALK, FGFR1, MET, FGFR1, FGFR2, BCR-ABL1, RET, MEK, mTOR, VEGFR y combinaciones discrecionales de estos genes y el análisis de metilación comprende uno o varios dinucleótidos de CpG del gen PITX2.

6. Un procedimiento para la determinación al menos de una mutación en ADN genómico, que comprende

A) convertir al menos una parte de las citosinas contenidas en el ADN genómico en uracilo u otra base con un comportamiento de apareamiento de bases y/o peso molecular que puede diferenciarse de citosina,

B) realizar un análisis de mutación con el a Dn genómico obtenido de la etapa A), para determinar la presencia o ausencia de la al menos una mutación,

C) realizar un análisis de metilación con el ADN genómico obtenido de la etapa A), para determinar un estado de metilación al menos de un dinucléotido de CpG contenido en el ADN genómico y por medio del estado de metilación del dinucleótido de CpG determinar la presencia o ausencia de ADN de una enfermedad maligna en el ADN genómico,

D) correlacionar la presencia o ausencia de ADN de la enfermedad maligna determinada en la etapa C) con la presencia o ausencia de la mutación determinada en la etapa B).

7. Un procedimiento para la normalización y/o estandarización interna de un análisis de mutación y/o análisis de metilación, que comprende una determinación al menos de una mutación en ADN genómico, que comprende además A) convertir al menos una parte de las citosinas contenidas en el ADN genómico en uracilo u otra base con un comportamiento de apareamiento de bases y/o peso molecular que puede diferenciarse de citosina,

B) realizar un análisis de mutación con el ADN genómico obtenido de la etapa A) en condiciones que permiten una determinación cuantitativa de la al menos una mutación, y determinar una proporción del ADN genómico, que contiene la mutación,

C) realizar un análisis de metilación con el ADN genómico obtenido de la etapa A) en condiciones que permiten una determinación cuantitativa de un estado de metilación al menos de un dinucleótido de CpG contenido en el ADN genómico, y determinar una proporción del ADN genómico, en la que el dinucleótido de CpG se encuentra metilado,

D) correlacionar la proporción del ADN genómico, que contiene la mutación, con la proporción del ADN genómico, en la que el dinucleótido de CpG se encuentra metilado.

8. Un uso de un kit para la realización del procedimiento según una de las reivindicaciones 1 a 7, en el que el kit comprende

a) al menos un primer par de oligonucleótidos diseñado para la hibridación en el ADN genómico obtenido a partir de la etapa A), para amplificar al menos una primera zona parcial del ADN genómico convertido, del que se sospecha que contiene la al menos una mutación

b) al menos un segundo par de oligonucleótidos diseñado para la hibridación en el ADN genómico obtenido a partir de la etapa A), para amplificar al menos una segunda zona parcial del ADN genómico convertido, que incluye el al menos un dinucleótido de CpG, cuyo estado de metilación va a analizarse.