KR102585973B1 - 타우 발현을 조절하기 위한 올리고뉴클레오티드 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 표적 세포에서 타우 발현을 조절할 수 있는 안티센스 올리고뉴클레오티드에 관한 것이다. 이러한 올리고뉴클레오티드는 MAPT mRNA에 혼성화한다. 본 발명은 또한 올리고뉴클레오티드의 접합체 및 약학 조성물, 및 타우병증, 알츠하이머병, 전두-측두엽 치매(FTD), FTDP-17, 진행성 핵상 마비(PSP), 만성 외상성 뇌병증(CTE), 피질기저핵 신경절 변성(CBD), 간질, 드라벳(Dravet) 증후군, 우울증, 발작 장애 및 운동 장애의 치료 방법에 관한 것이다.

Description

타우 발현을 조절하기 위한 올리고뉴클레오티드
본 발명은 타우(Tau)의 발현을 감소시키는 미세소관-관련 단백질 Tau (MAPT) 전사체에 상보적인 올리고뉴클레오티드 (올리고머)에 관한 것이다. MAPT 전사체 및/또는 Tau 단백질 발현의 감소는 일정 범위의 의학적 장애, 예컨대, Tau 병증, 알츠하이머 병, 전두-측두엽 치매 (FTD), FTDP-17, 진행성 핵상 마비 (PSP), 만성 외상성 뇌병증 (CTE), 피질기저핵 신경절 변성 (CBD), 간질, 드라벳 (Dravet) 증후군, 우울증, 발작 장애 및 운동 장애에 유익하다.
Tau는 튜불린과 상호작용하고 미세소관 조립 및 안정화에 관여하는 미세소관-관련 단백질 (MAP)이다. 미세소관은 세포상 세포골격의 중요한 구조적 구성요소이고, 유사 분열, 세포질 분열 및 소포 수송을 포함한 다양한 세포 과정에 관여한다. Tau 단백질은 여러 세포 및 조직 유형에 존재하지만, 특히 축삭 수송 및 기능을 조절하는데 중요한 역할을 하는 뉴런에 풍부하다.
Tau 발현 수준 및/또는 기능의 변화는 다양한 신경퇴행성 장애의 병태생리학에 기여한다. 예를 들어, 미스폴딩되고 과인산화된 Tau의 응집체는 알츠하이머 병 (AD) 및 관련 타우병증, 예컨대, 진행성 핵상 마비 (PSP), 피질기저핵 신경절 변성 (CBD), 만성 외상성 뇌병증 (CTE), 전두-측두엽 치매 (FTD) 및 염색체 17 (FTDP-17)에 연관된 파킨슨증이 있는 FTD, 피크병 (PiD), 은친화입자병 (AGD), 매듭-우세 노인성 치매 (TPSD), 원발성 노화-관련 타우병증 (PART), 다운 증후군 및 라이티코-보딕 (lytico-bodig) 병과 관련된 신경원섬유 봉입체에서 발견된다. 병리학적 Tau의 상향조절은 일측성 거대뇌증 (HME), 결절성 경화증 복합체, 국소 피질 형성이상 2b형; 및 신경절교종을 비롯한 영아 타우병증과 관련되어 있다. 또한, 비정상적인 Tau 발현 및/또는 기능은 또한 뇌철 축적 1형 (NBIA1), 신경절 세포종 및 아급성 경화성 범뇌염을 동반한 신경퇴행으로도 알려진 할러포르덴-스파츠 증후군과 같은 다른 질환과 관련될 수 있다. Tau는 또한 발작 장애 (예컨대, 간질), 네트워크 기능장애 (예컨대, 우울증) 및 운동 장애 (예컨대, 파킨슨 병)에서 역할을 할 수 있다.
MAPT 전구-mRNA 또는 mRNA 전사체를 표적화함으로써 Tau 단백질 수준을 감소시킬 수 있는 안티센스 분자, 뿐만 아니라 siRNA 분자가 설명된 바 있는데, 예를 들어, De Vos 외 2013 Journal of Neuroscience Vol 33 pp 12887, WO2013/148260, WO2014/153236, WO2015/010135, WO2016/126995, WO2016/151523, WO2017/09679 및 WO2018/064593을 참고하라. MAPT 전사체의 스플라이스 조절을 유도할 수 있는 안티센스 올리고뉴클레오티드는 Sud 외, 2014 Mol Ther Nucl Acid 3 e180 및 WO2016/019063에도 설명된 바 있다.
AD와 같은 Tau-관련 장애는 노인 치매의 가장 흔한 원인이고, AD 및 타우병증, 발작 장애, 및 운동 장애를 비롯한 관련 신경퇴행성 질환의 치료를 위한 강력하고 효과적인 제제가 매우 필요하다.
발명의 목적
본 발명은 생체내 및 시험관내 모두에서 Tau를 감소시키는 안티센스 올리고뉴클레오티드를 제공한다. 본 발명은 안티센스 올리고뉴클레오티드에 의해 표적화되어 효과적인 Tau 억제를 제공할 수 있는 인간 MAPT 전구-mRNA의 인트론 1 또는 2에 위치한 MAPT 전구-mRNA 내 3개 특이적 표적 영역을 확인하였다. 특히 서열식별번호: 1의 위치 12051 내지 12111, 39562 내지 39593 및 또는 72837 내지 72940을 표적하는 것이 Tau 감소 양상에서 유리하다. 본 발명은 또한 Tau를 감소시킬 수 있는 효과적인 안티센스 올리고뉴클레오티드 서열 및 화합물, 및 타우병증, 알츠하이머 병, FTDP-17, 발작 장애 및 운동 장애를 비롯한 신경퇴행성 질환과 같은 질환 또는 장애의 치료에 있어 이들의 사용을 제공한다.
발명의 요약
본 발명은 Tau의 발현을 조절할 수 있는 Tau 인코딩 핵산을 표적하는 올리고뉴클레오티드 및 Tau의 기능과 관련된 질환을 치료 또는 예방하기 위한 올리고뉴클레오티드의 사용에 관한 것이다.
따라서, 본 발명의 제 1 양상에서 본 발명은 서열식별번호: 3, 4 및 5로 나타내어지는 MAPT의 특이적 영역에 대해 적어도 90% 상보성을 가지는 10개 이상 뉴클레오티드 길이의 인접 뉴클레오티드 서열을 포함하는, 10 내지 30개의 뉴클레오티드 길이의 올리고뉴클레오티드를 제공한다.
이러한 올리고뉴클레오티드는 안티센스 올리고뉴클레오티드일 수 있으며, 바람직하게는 갭머 디자인이다. 바람직하게는, 이러한 올리고뉴클레오티드는 표적 핵산의 절단에 의해 Tau 발현을 억제할 수 있다. 이러한 절단은 바람직하게는 뉴클레아제 동원에 의해 이루어진다.
또 다른 양상에서, 본 발명은 본 발명의 올리고뉴클레오티드 및 약학상 허용되는 희석제, 담체, 염 및/또는 보조제를 포함하는 약학 조성물을 제공한다.
또 다른 양상에서, 본 발명은 본 발명의 올리고뉴클레오티드 또는 조성물의 유효량을 Tau를 발현하는 표적 세포에 투여함으로써 상기 세포에서 Tau 발현을 조절하는 생체내 또는 시험관내 방법을 제공한다.
또 다른 양상에서, 본 발명은 본 발명의 올리고뉴클레오티드의 치료적 또는 예방적 유효량을 Tau의 생체내 활성과 관련된 질환, 장애 또는 기능 장애를 앓고 있거나 이에 걸리기 쉬운 대상자에게 투여하는 것을 포함하는, 상기 질환, 장애 또는 기능 장애를 치료 또는 예방하는 방법을 제공한다.
또 다른 양상에서 본 발명의 올리고뉴클레오티드 또는 조성물은 알츠하이머 병 (AD), 진행성 핵상 마비 (PSP), 전두-측두엽 치매 (FTD) 또는 FTDP-17의 치료 또는 예방에 사용된다.
도 1: MAPT 상의 모든 인트론 영역들을 커버하는 올리고뉴클레오티드 라이브러리로부터 얻은 스크리닝 결과 (실시예 1). 각 점은 올리고뉴클레오티드 화합물을 나타내며, x-축은 MAPT 전사체에서의 위치를 나타내고 y-축은 대조군과 비교할 때 MAPT mRNA 잔부의 양을 보여준다 (낮은 숫자는 MAPT의 큰 감소에 해당). A, B 및 C는 추가 올리고뉴클레오티드 화합물에 대한 표적 영역으로 선택된 MAPT 전사체의 3개 영역을 나타낸다.
도 2: 화합물 9_103 (핵염기들의 서열은 서열식별번호: 9에 제시됨).
도 3: 화합물 9_104 (핵염기들의 서열은 서열식별번호: 9에 제시됨).
도 4: 화합물 11_1 (핵염기들의 서열은 서열식별번호: 11에 제시됨).
도 5: 화합물 49_38 (핵염기들의 서열은 서열식별번호: 49에 제시됨).
도 6: 화합물 49_189 (핵염기들의 서열은 서열식별번호: 49에 제시됨).
도 2, 3, 4, 5 및 6에 도시된 화합물들은 양성자화된 형태로 도시되어 있고(포스포로티오에이트 연결 상의 S 원자가 양성자화됨), 양성자의 존재는 분자 환경의 산성도, 그리고 대체 양이온의 존재 (예컨대, 올리고뉴클레오티드가 염 형태로 존재하는 경우)에 따라 달라질 것임을 이해할 수 있을 것이다. 양성자화된 포스포로티오에이트는 호변이성질체 형태로 존재한다.
정의
올리고뉴클레오티드
본원에서 사용된 용어 "올리고뉴클레오티드"는 일반적으로 2개 이상의 공유 결합된 뉴클레오시드를 포함하는 분자로서 통상의 기술자가 이해하는 바와 같이 정의된다. 이러한 공유 결합된 뉴클레오시드는 또한 핵산 분자 또는 올리고머로 지칭될 수 있다. 올리고뉴클레오티드는 일반적으로 고체상 화학 합성 후, 정제 및 분리에 의해 실험실에서 만들어진다. 올리고뉴클레오티드의 서열을 언급할 때, 공유 결합된 뉴클레오티드 또는 뉴클레오시드의 핵염기 모이어티의 서열 또는 순서, 또는 이의 변형이 언급된다. 본 발명의 올리고뉴클레오티드는 인공이고 화학적으로 합성되며 통상적으로 정제되거나 분리된다. 본 발명의 올리고뉴클레오티드는 2' 당 변형된 뉴클레오시드와 같은 하나 이상의 변형된 뉴클레오시드 또는 뉴클레오티드를 포함할 수 있다.
안티센스 올리고뉴클레오티드
본원에서 사용된 용어 "안티센스 올리고뉴클레오티드"는 표적 핵산, 특히, 표적 핵산 상의 인접 서열에 혼성화함으로써 표적 유전자의 발현을 조절할 수 있는 올리고뉴클레오티드로 정의된다. 안티센스 올리고뉴클레오티드는 본질적으로 이중 가닥이 아니므로 siRNA 또는 shRNA가 아니다. 바람직하게는, 본 발명의 안티센스 올리고뉴클레오티드는 단일 가닥이다. 사슬내 또는 사슬간 자기-상보성 정도가 전장 올리고뉴클레오티드의 50% 미만인 한, 본 발명의 단일 가닥 올리고뉴클레오티드는 헤어핀 또는 분자간 이중나선 구조 (동일한 올리고뉴클레오티드의 2개 분자들 사이의 이중나선)를 형성할 수 있는 것으로 이해된다.
유리하게는, 본 발명의 단일 가닥 안티센스 올리고뉴클레오티드는 RNA 뉴클레오시드를 함유하지 않는데, 이는 이것이 뉴클레아제 내성을 감소시킬 것이기 때문이다.
유리하게는, 본 발명의 안티센스 올리고뉴클레오티드는 하나 이상의 변형된 뉴클레오시드 또는 뉴클레오티드, 예컨대, 2' 당 변형된 뉴클레오시드를 포함한다. 또한, 변형되지 않은 뉴클레오시드가 DNA 뉴클레오시드인 것이 유리하다.
인접 뉴클레오티드 서열
용어 "인접 뉴클레오티드 서열"은 표적 핵산 또는 표적 서열에 상보적인 올리고뉴클레오티드의 영역을 지칭한다. 이 용어는 본원에서 용어 "인접 핵염기 서열" 및 용어 "올리고뉴클레오티드 모티프 서열"과 상호교환적으로 사용된다. 일부 구체예에서 올리고뉴클레오티드의 모든 뉴클레오티드는 인접 뉴클레오티드 서열을 구성한다. 일부 구체예에서 올리고뉴클레오티드는 F-G-F' 갭머 영역과 같은 인접 뉴클레오티드 서열을 포함하고, 선택적으로 추가 뉴클레오티드(들), 예를 들어 인접 뉴클레오티드 서열에 작용기를 부착하는데 사용될 수 있는 뉴클레오티드 연결기 영역을 포함할 수 있다. 뉴클레오티드 연결기 영역은 표적 핵산에 상보적이거나 상보적이지 않을 수 있다. 올리고뉴클레오티드의 인접 뉴클레오티드 서열은 그 자체로 올리고뉴클레오티드보다 길 수 없고, 올리고뉴클레오티드는 인접 뉴클레오티드 서열보다 짧을 수 없는 것으로 이해된다.
뉴클레오티드
뉴클레오티드는 올리고뉴클레오티드 및 폴리뉴클레오티드의 빌딩 블록이고, 본 발명의 목적상 자연발생 및 비자연발생 뉴클레오티드 모두를 포함한다. 자연적으로, DNA 및 RNA 뉴클레오티드와 같은 뉴클레오티드는 리보스 당 모이어티, 핵염기 모이어티 및 하나 이상의 포스페이트 기 (뉴클레오시드에 없음)를 포함한다. 뉴클레오시드 및 뉴클레오티드는 또한 "단위" 또는 "단량체"로 상호교환적으로 지칭될 수 있다.
변형된 뉴클레오시드
본원에서 사용되는 용어 "변형된 뉴클레오시드" 또는 "뉴클레오시드 변형"은 당 모이어티 또는 (핵)염기 모이어티의 하나 이상의 변형의 도입에 의해 등가 DNA 또는 RNA 뉴클레오시드와 비교하여 변형된 뉴클레오시드를 지칭한다. 바람직한 구체예에서 변형된 뉴클레오시드는 변형된 당 모이어티를 포함한다. 용어 변형된 뉴클레오시드는 또한 용어 "뉴클레오시드 유사체" 또는 변형된 "단위" 또는 변형된 "단량체"와 상호교환적으로 사용될 수 있다. 변형되지 않은 DNA 또는 RNA 당 모이어티를 갖는 뉴클레오시드는 본원에서 DNA 또는 RNA 뉴클레오시드로 명명된다. DNA 또는 RNA 뉴클레오시드의 염기 영역에서 변형된 뉴클레오시드는 왓슨 크릭 염기 쌍을 허용하는 경우 일반적으로 일반적으로 DNA 또는 RNA라 명명된다.
변형된 뉴클레오시드간 연결
용어 "변형된 뉴클레오시드간 연결"은 통상의 기술자가 일반적으로 2 개의 뉴클레오시드를 함께 공유 결합하는 포스포디에스테르 (PO) 연결 이외의 연결로서 이해하는 바와 같이 정의된다. 따라서 본 발명의 올리고뉴클레오티드는 변형된 뉴클레오시드간 연결을 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 변형된 뉴클레오시드간 연결은 포스포디에스테르 연결과 비교하여 올리고뉴클레오티드의 뉴클레아제 내성을 증가시킨다. 자연 발생 올리고뉴클레오티드의 경우, 뉴클레오시드간 연결은 인접한 뉴클레오시드 사이에 포스포디에스테르 결합을 생성하는 포스페이트 기를 포함한다. 변형된 뉴클레오시드간 연결은 생체내 사용을 위한 올리고뉴클레오티드를 안정화시키는데 특히 유용하고, 본 발명의 올리고뉴클레오티드 내 DNA 또는 RNA 뉴클레오시드의 영역, 예를 들어, 갭머 올리고뉴클레오티드의 갭 영역 G 내에서, 뿐만 아니라 영역 F 및 F'와 같은 변형된 뉴클레오시드 영역에서의 뉴클레아제 절단에 대한 보호 기능을 할 수 있다.
구체예에서, 올리고뉴클레오티드는 천연 포스포디에스테르로부터 변형된 하나 이상의 뉴클레오시드간 연결, 예컨대, 뉴클레아제 공격에 보다 내성인 하나 이상의 변형된 뉴클레오시드간 연결을 포함한다. 뉴클레아제 내성은 혈청에서 올리고뉴클레오티드를 배양하거나 뉴클레아제 내성 검정 (예컨대, 뱀독 포스포디에스테라제 (SVPD))을 사용하여 결정될 수 있으며, 두 방법 모두 해당 기술분야에 잘 알려져 있다. 올리고뉴클레오티드의 뉴클레아제 내성을 향상시킬 수 있는 뉴클레오시드간 연결은 뉴클레아제 내성 뉴클레오시드간 연결로 지칭된다. 일부 구체예에서, 올리고뉴클레오티드, 또는 이의 인접 뉴클레오티드 서열에서 뉴클레오시드간 연결의 적어도 50%는 변형된다. 예컨대, 올리고뉴클레오티드, 또는 이의 인접 뉴클레오티드 서열에서 뉴클레오시드간 연결의 적어도 60%, 예컨대, 적어도 70%, 예컨대, 적어도 75%, 예컨대, 적어도 80%, 또는 예컨대, 적어도 90%가 변형된다. 일부 구체예에서 올리고뉴클레오티드, 또는 이의 인접 뉴클레오티드 서열의 뉴클레오시드간 연결 모두가 변형된다. 일부 구체예에서, 본 발명의 올리고뉴클레오티드를 접합체와 같은 비-뉴클레오티드 작용기에 연결하는 뉴클레오시드는 포스포디에스테르일 수 있음이 인정될 것이다. 일부 구체예에서 올리고뉴클레오티드, 또는 이의 인접 뉴클레오티드 서열의 뉴클레오시드간 연결 모두는 뉴클레아제 내성 뉴클레오시드간 연결이다.
변형된 뉴클레오시드간 연결은 포스포로티오에이트, 디포스포로티오에이트 및 보라노포스페이트를 포함하는 군에서 선택될 수 있다. 일부 구체예에서, 변형된 뉴클레오시드간 연결, 예를 들어 포스포로티오에이트, 디포스포로티오에이트 또는 보라노포스페이트는 본 발명의 올리고뉴클레오티드의 RNase H 동원과 양립할 수 있다.
일부 구체예에서 뉴클레오시드간 연결, 예컨대, 포스포로티오에이트 뉴클레오시드간 연결은 황 (S)을 포함한다.
본 발명의 올리고뉴클레오티드에 있어서 포스포로티오에이트 뉴클레오시드간 연결을 사용하는 것이 유리하다.
포스포로티오에이트 뉴클레오시드간 연결은 뉴클레아제 내성, 유익한 약동학 및 제조 용이성으로 인해 특히 유용하다. 일부 구체예에서, 올리고뉴클레오티드, 또는 이의 인접 뉴클레오티드 서열에서 뉴클레오시드간 연결의 적어도 50%는 포스포로티오에이트이다. 예컨대, 올리고뉴클레오티드, 또는 이의 인접 뉴클레오티드 서열에서 뉴클레오시드간 연결의 적어도 60%, 예컨대, 적어도 70%, 예컨대, 적어도 75%, 예컨대, 적어도 80%, 또는 예컨대, 적어도 90%가 포스포로티오에이트이다. 일부 구체예에서 올리고뉴클레오티드, 또는 이의 인접 뉴클레오티드 서열의 뉴클레오시드간 연결 모두가 포스포로티오에이트이다.
일부 구체예에서, 본 발명의 올리고뉴클레오티드는 포스 포로 디티 오 에이트 연결(들) 이외에도 포스포로티오에이트 뉴클레오시드간 연결 및 적어도 하나의 포스포디에스테르 연결, 예컨대, 2, 3 또는 4 개의 포스포디에스테르 연결을 포함한다. 갭머 올리고뉴클레오티드에서, 포스포디에스테르 연결이 존재하는 경우, 이는 갭 영역 G에서 인접 DNA 뉴클레오시드들 사이에 적절하게 위치하지 않는다.
일부 구체예에서, 올리고뉴클레오티드는 하나 이상의 중성 뉴클레오시드간 연결, 특히 포스포트리에스테르, 메틸포스포네이트, MMI, 아미드-3, 포름아세탈 또는 티오포름아세탈로부터 선택된 뉴클레오시드간 연결을 포함한다.
추가의 뉴클레오시드간 연결은 WO2009/124238 (본원에 참고로 포함됨)에 개시되어 있다. 한 구체예에서 뉴클레오시드간 연결은 WO2007/031091 (본원에 참고로 포함됨)에 개시된 연결기로부터 선택된다. 특히, 뉴클레오시드간 연결은 -O-P(O)2-O-, -O-P(O,S)-O-, -O-P(S)2-O-, -S-P(O)2-O-, -S-P(O,S)-O-, -S-P(S)2-O-, -O-P(O)2-S-, -O-P(O,S)-S-, -S-P(O)2-S-, -O-PO(RH)-O-, 0-PO(OCH3)-0-, -O-PO(NRH)-O-, -O-PO(OCH2CH2S-R)-O-, -O-PO(BH3)-O-, -O-PO(NHRH)-O-, -O-P(O)2-NRH-, -NRH-P(O)2-O-, -NRH-CO-O-, -NRH-CO-NRH-에서 선택될 수 있고, 및/또는 특히, 뉴클레오시드간 연결기는 다음으로 구성된 군에서 선택될 수 있다: -O-CO-O-, -O-CO-NRH-, -NRH-CO-CH2-, -O-CH2-CO-NRH-, -O-CH2-CH2-NRH-, -CO-NRH-CH2-, -CH2-NRHCO-, -O-CH2-CH2-S-, -S-CH2-CH2-O-, -S-CH2-CH2-S-, -CH2-SO2-CH2-, -CH2-CO-NRH-, -O-CH2-CH2-NRH-CO-, -CH2-NCH3-O-CH2-, 이 때, RH는 수소 및 C1-4-알킬에서 선택된다.
뉴클레아제 내성 연결, 예컨대, 포스포티오에이트 연결은 갭머에 대한 영역 G와 같은 표적 핵산과 이중나선을 형성할 때 뉴클레아제를 동원할 수 있는 올리고뉴클레오티드 영역에서 특히 유용하다. 그러나, 포스포로티오에이트 연결은 또한 비-뉴클레아제 동원 영역 및/또는 친화력 향상 영역, 예컨대, 갭머의 경우 영역 F 및 F'에서 유용할 수 있다. 일부 구체예들에서, 갭머 올리고뉴클레오티드는, 영역 F 또는 F', 또는 영역 F 및 F' 모두에서 하나 이상의 포스포디에스테르 연결을 포함하며, 이 때, 영역 G 내 뉴클레오시드간 연결은 모두 포스포로티오에이트일 수 있다.
유리하게는, 올리고뉴클레오티드의 인접 뉴클레오티드 서열의 모든 뉴클레오시드간 연결은 포스포로티오에이트이거나, 올리고뉴클레오티드의 모든 뉴클레오시드간 연결은 포스포로티오에이트 연결이다.
핵염기
용어 핵염기는 핵산 혼성화에서 수소 결합을 형성하는 뉴클레오시드 및 뉴클레오티드에 존재하는 퓨린 (예컨대, 아데닌 및 구아닌) 및 피리미딘 (예컨대, 우라실, 티민 및 시토신) 모이어티를 포함한다. 본 발명의 내용에서 용어 핵염기는 또한 자연 발생 핵염기와 다를 수 있지만 핵산 혼성화 동안 기능하는 변형된 핵염기를 포함한다. 이러한 내용에서 "핵염기"는 아데닌, 구아닌, 시토신, 티미 딘, 우라실, 크 산틴 및 하이포크 산틴과 같은 자연 발생 핵염기뿐만 아니라 비 자연 발생 변이체를 모두 지칭한다. 이러한 변이체들은 예를 들어, Hirao 외 (2012) Accounts of Chemical Research vol 45 2055 페이지 및 Bergstrom (2009) Current Protocols in Nucleic Acid Chemistry Suppl. 37 1.4.1에 기재되어 있다.
일부 구체예에서 핵염기 모이어티는 퓨린 또는 피리미딘을 변형된 퓨린 또는 피리미딘, 예컨대, 치환된 퓨린 또는 치환된 피리미딘, 예컨대, 이소시토신, 슈도이소시토신, 5-메틸 시토신, 5-티오졸로-시토신, 5-프로핀일-시토신, 5-프로핀일-우라실, 5-브로모우라실 5-티아졸로-우라실, 2-티오-우라실, 2'티오-티민, 이노신, 디아미노퓨린, 6-아미노퓨린, 2-아미노퓨린, 2,6-디아미노퓨린 및 2-클로로-6-아미노퓨린으로부터 선택된 핵염기로 변화시킴으로써 변형된다.
핵염기 모이어티는 각각의 상응하는 핵염기에 대한 문자 코드, 예컨대, A, T, G, C 또는 U로 표시될 수 있으며, 이 때, 각 문자는 선택적으로 동등한 기능의 변형된 핵염기를 포함할 수 있다. 예를 들면, 예시된 올리고뉴클레오티드에서, 핵염기 모이어티는 A, T, G, C 및 5-메틸 시토신으로부터 선택된다. 선택적으로, LNA 갭머의 경우 5-메틸 시토신 LNA 뉴클레오시드를 사용할 수 있다.
변형된 올리고뉴클레오티드
용어 변형된 올리고뉴클레오티드는 하나 이상의 당-변형된 뉴클레오시드 및/또는 변형된 뉴클레오시드간 연결을 포함하는 올리고뉴클레오티드를 설명한다. 용어 키메라" 올리고뉴클레오티드는 변형된 뉴클레오시드를 갖는 올리고뉴클레오티드를 설명하기 위해 문헌에서 사용된 용어이다.
상보성
용어 "상보성"은 뉴클레오시드/뉴클레오티드의 왓슨-크릭 염기-페어링 능력을 설명한다. 왓슨-크릭 염기쌍은 구아닌 (G)-시토신 (C) 및 아데닌 (A)-티민 (T)/우라실 (U)이다. 올리고뉴클레오티드는 변형된 핵염기를 가진 뉴클레오시드를 포함할 수 있다. 예를 들면, 5-메틸 시토신은 종종 시토신 대신 사용되며, 이와 같이 이러한 상보성이라는 용어는 비-변형된 핵염기와 변형된 핵염기 사이의 왓슨 크릭 염기-쌍을 포함하는 것으로 이해될 것이다 (예를 들면 Hirao 외 (2012) Accounts of Chemical Research vol 45 page 2055 and Bergstrom (2009) Current Protocols in Nucleic Acid Chemistry Suppl. 37 1.4.1 참고).
본원에서 사용된 용어 "% 상보적"은, 인접 뉴클레오티드 서열 전반에 걸쳐, 핵산 분자 (예컨대, 올리고뉴클레오티드) 내 인접 뉴클레오티드 서열 중 참조 서열 (예컨대, 표적 서열 또는 서열 모티프)에 상보적인, 뉴클레오티드의 비율 (%)을 지칭한다. 그러므로 상보성 백분율은 (표적 서열 5'-3' 및 3'-5'의 올리고뉴클레오티드 서열과 함께 정렬될 때) 2개 서열들 사이에 (왓슨 크릭 염기 쌍으로부터) 상보적인 정렬된 핵염기들의 수를 계수하고, 이 수를 올리고뉴클레오티드의 총 뉴클레오티드 수로 나누고 100을 곱하여 계산된다. 이러한 비교에서 정렬되지 않는 (염기쌍을 형성하는) 핵염기/뉴클레오티드를 미스매치라 명명한다. 인접 뉴클레오티드 서열의 상보성 % 계산에서 삽입 및 결실은 허용되지 않는다. 상보성을 결정할 때 핵염기의 화학적 변형은 왓슨 크릭 염기쌍을 형성하는 핵염기의 기능적 능력이 유지되는 한 무시됨을 이해할 수 있을 것이다 (예컨대, 5'-메틸 시토신은 % 동일성 계산을 위해 시토신과 동일한 것으로 간주된다).
용어 "완전히 상보적"은 100% 상보성을 지칭한다.
다음은 표적 핵산에 완전히 상보적인 올리고뉴클레오티드의 예이다.
다음은 표적 핵산 (서열식별번호: 4)에 완전히 상보적인 올리고뉴클레오티드 (서열식별번호: 49)의 예이다.
동일성
본원에서 사용된 용어 "% 동일성"은, 인접 뉴클레오티드 서열 전반에 걸쳐, 핵산 분자 (예컨대, 올리고뉴클레오티드) 내 인접 뉴클레오티드 서열 중 참조 서열 (예컨대, 서열 모티프)에 동일한, 뉴클레오티드의 비율 (%로 표현)을 지칭한다. 그러므로 동일성 백분율은 2개 서열들 (본 발명의 화합물의 인접 뉴클레오티드 서열과 참조 서열) 사이에 동일한 (매치) 정렬된 핵염기의 수를 계수하고, 이 수를 올리고뉴클레오티드 내 뉴클레오티드의 총 수로 나누고 100을 곱하여 계산된다. 그러므로, 동일성 백분율 = (매치 x 100)/정렬된 영역의 길이 (예컨대, 인접 뉴클레오티드 서열). 인접 뉴클레오티드 서열의 동일성 백분율 계산에서 삽입 및 결실은 허용되지 않는다. 동일성을 결정할 때 핵염기의 화학적 변형은 왓슨 크릭 염기쌍을 형성하는 핵염기의 기능적 능력이 유지되는 한 무시됨을 이해할 수 있을 것이다 (예컨대, 5-메틸 시토신은 % 동일성 계산을 위해 시토신과 동일한 것으로 간주된다).
혼성화
본원에서 사용된 용어 "혼성화" 또는 "혼성화하다"는 2개의 핵산 가닥 (예컨대, 올리고뉴클레오티드 및 표적 핵산)이 반대 가닥의 염기 쌍들 사이에 수소 결합을 형성하여 이중나선을 형성하는 것으로 이해되어야 한다. 두 핵산 가닥 사이의 결합 친화력은 혼성화의 강도이다. 이것은 종종 올리고뉴클레오티드의 절반이 표적 핵산과 이중나선을 형성하는 온도로 정의되는 용융 온도 (Tm)로 설명된다. 생리적 조건에서 Tm은 친화성에 엄격하게 비례하지 않는다 (Mergny and Lacroix, 2003, Oligonucleotides 13: 515-537). 표준 상태 깁스 자유 에너지 △G°는 결합 친화도의 보다 정확한 표현이고 △G°=-RTln(Kd)에 의한 반응의 해리 상수 (Kd)와 관련되며, 이 때, R은 기체 상수이고 T는 절대 온도이다. 그러므로, 올리고뉴클레오티드와 표적 핵산 사이 반응의 매우 낮은 △G°는 올리고뉴클레오티드와 표적 핵산 사이의 강한 혼성화를 반영한다. △G°는 수성 농도가 1M이고, pH가 7이고, 온도가 37℃인 반응과 관련된 에너지이다. 표적 핵산에 대한 올리고뉴클레오티드의 혼성화는 자발적인 반응이고 자발적인 반응의 경우 △G°는 0보다 작다. △G°는, 예를 들면, Hansen 외, 1965, Chem. Comm. 36-38 및 Holdgate 외, 2005, Drug Discov Today에 기재된 등온 적정 열량계 (ITC) 방법을 사용하여 실험적으로 측정될 수 있다. 통상의 기술자는 △G° 측정에 시판 장비들을 이용가능함을 알고 있을 것이다. △G°는 Sugimoto 외의, 1995, Biochemistry 34:11211-11216 및 McTigue 외, 2004, Biochemistry 43:5388-5405에 기재된 적절히 유도된 열역학적 매개변수들을 사용하여 SantaLucia, 1998, Proc Natl Acad Sci USA. 95: 1460-1465에 기재된 가장 근접한 이웃 모델을 사용하여 수치적으로 추정될 수도 있다. 그 의도한 핵산 표적을 혼성화로 조절할 가능성을 갖도록 하기 위해, 본 발명의 올리고뉴클레오티드는 10-30개의 뉴클레오티드 길이인 올리고뉴클레오티드에 대해 -10 kcal 미만의 추정 △G° 값으로 표적 핵산에 혼성화한다. 일부 구체예에서 혼성화 정도 또는 강도는 표준 상태 깁스 자유 에너지 △G°에 의해 측정된다. 올리고뉴클레오티드는, 8-30개의 뉴클레오티드 길이인 올리고뉴클레오티드의 경우, -10 kcal 범위 미만, 예컨대, -15 kcal 미만, 예컨대, -20 kcal 미만, 그리고 예컨대, -25 kcal 미만의 추정 △G° 값으로 표적 핵산에 혼성화할 수 있다. 일부 구체예에서, 올리고뉴클레오티드는 -10 내지 -60 kcal, 예컨대, -12 내지 -40, 예컨대, -15 내지 -30 kcal 또는 -16 내지 -27 kcal, 예컨대, -18 내지 -25 kcal의 추정△G° 값으로 표적 핵산에 혼성화한다.
표적 핵산
본 발명에 따르면, 표적 핵산은 포유동물 Tau를 인코드하는 핵산이고, 예를 들어, 유전자, RNA, mRNA 및 전구-mRNA, 성숙 mRNA 또는 cDNA 서열일 수 있다. 따라서 표적은 Tau 표적 핵산 또는 MAPT 표적 핵산으로 지칭될 수 있으며, 이러한 용어는 상호교환적으로 사용될 수 있다. 본 발명의 올리고뉴클레오티드는 예를 들어 포유동물 MAPT의 엑손 영역을 표적할 수 있고, 또는, 예를 들어, MAPT 전구-mRNA의 인트론 영역을 표적할 수 있다 (표 1 참조).
[표 1]
인간 MAPT 엑손 및 인트론
적합하게는, 표적 핵산은 Tau 단백질, 특히, 포유동물 Tau, 예컨대, 인간에 대한 전구-mRNA 서열들을 제공하는 인간 Tau (예를 들면, 표 2 및 3 참고), 및 원숭이 Tau)를 인코드한다.
일부 구체예에서, 표적 핵산은 서열식별번호: 1 및 2 또는 이의 자연 발생 변이체 (예컨대, 포유동물 Tau 단백질을 인코드하는 서열들)로 구성된 군에서 선택된다. 연구 또는 진단에 본 발명의 올리고뉴클레오티드를 사용하는 경우 표적 핵산은 cDNA 또는 DNA 또는 RNA로부터 유래된 합성 핵산일 수 있다.
생체내 또는 시험관내 응용의 경우, 본 발명의 올리고뉴클레오티드는 전형적으로 MAPT 표적 핵산을 발현하는 세포에서 Tau 단백질의 발현을 억제할 수 있다. 본 발명의 올리고뉴클레오티드의 핵염기의 인접 서열은, 올리고뉴클레오티드 길이에 걸쳐 측정시, 선택적으로 1 또는 2개의 미스매치를 제외하고, 선택적으로 올리고뉴클레오티드를 선택적 작용기, 예컨대, 접합체에 연결할 수 있는 뉴클레오티드 기반 연결기 영역들, 또는 다른 비-상보적 말단 뉴클레오티드 (예컨대, 영역 D' 또는 D")를 제외하고 일반적으로 MAPT 표적 핵산에 상보적이다. 일부 구체예들에서, 표적 핵산은, RNA 또는 DNA, 예컨대, 전령 RNA, 예컨대, 성숙 mRNA 또는 전구-mRNA일 수 있다.
일부 구체예에서 표적 핵산은 포유동물 Tau 단백질, 예컨대, 인간 Tau, 예컨대, 인간 MAPT 전구-mRNA 서열, 예컨대, 서열식별번호: 1로 개시된 서열을 인코드하는 RNA 또는 DNA이다. 예시적인 표적 핵산에 대한 추가 정보는 표 2 및 3에 제공된다.
[표 2]
종들간 Tau에 대한 게놈 및 어셈블리 정보
Fwd = 정방향 가닥. 게놈 좌표는 전구-mRNA 서열 (게놈 서열)을 제공한다. NCBI 참조는 mRNA 서열 (cDNA 서열)을 제공한다.
* 국가 생명공학 정보 센터 (National Center for Biotechnology Information) 참조 서열 데이터베이스는 게놈, 전사체 및 단백질을 포함하는 포괄적이고, 통합된, 비-중복의, 주석처리가 잘 되어 있는 참조 서열 세트이다. 이는 www.ncbi.nlm.nih.gov/refseq에 호스팅되어 있다.
[표 3]
종들 간 Tau/ MAPT에 관한 서열 세부사항
표적 서열
본원에서 사용된 용어 "표적 서열"은 본 발명의 올리고뉴클레오티드에 상보적인 핵염기 서열을 포함하는 표적 핵산에 존재하는 뉴클레오티드의 서열을 지칭한다. 일부 구체예에서, 표적 서열은 본 발명의 올리고뉴클레오티드의 인접 뉴클레오티드 서열에 상보적인 핵염기 서열을 갖는 표적 핵산상의 영역으로 구성된다. 표적 핵산의 이 영역은 표적 뉴클레오티드 서열, 표적 서열 또는 표적 영역으로 상호교환적으로 지칭될 수 있다. 일부 구체예에서 표적 서열은 단일 올리고뉴클레오티드의 상보적 서열보다 길고, 예를 들어, 본 발명의 여러 올리고뉴클레오티드에 의해 표적화될 수 있는 표적 핵산의 바람직한 영역을 나타낼 수 있다.
일부 구체예에서 표적 서열은 표 4의 임의의 영역 (R_1-R_2254)으로부터 선택된 서열이다. 특히, 표적 서열은 R_223, R_738 또는 R_1298로 구성된 영역들의 군에 속하는 영역 중 하나에서 선택될 수 있다.
[표 4]
본 발명의 올리고뉴클레오티드를 사용하여 표적화될 수 있는 서열식별번호: 1 상의 영역 (reg.)
일부 구체예에서 표적 서열은 인간 MAPT mRNA 인트론, 예컨대, Tau 인간 mRNA 인트론 1 또는 2로부터 선택된 서열이다 (상기 표 1 참조).
본 발명의 올리고뉴클레오티드는 표적 핵산, 예컨대, 본원에 기재된 표적 서열에 상보적이거나 이에 혼성화하는 인접 뉴클레오티드 서열을 포함한다.
올리고뉴클레오티드가 상보적이거나 혼성화되는 표적 서열은 일반적으로 10개 이상의 뉴클레오티드의 인접 핵염기 서열을 포함한다. 인접 뉴클레오티드 서열은 10 내지 100개의 뉴클레오티드, 예컨대, 12 내지 60, 예컨대, 13 내지 50, 예컨대, 14 내지 30, 예컨대, 15 내지 25, 예컨대, 16 내지 20 개의 인접 뉴클레오티드이다.
본 발명의 한 구체예에서 표적 서열은 서열식별번호: 3이고, 이는 영역 A에 해당한다. 특정 구체예에서, 표적 서열은 서열식별번호: 1의 위치 12051-12111, 예컨대, 서열식별번호: 1의 위치 12051-12079, 위치 12085-12111 또는 위치 12060-12078에서 선택된다.
본 발명의 또 다른 구체예에서 표적 서열은 서열식별번호: 4이고, 이는 영역 B에 해당한다. 특정 구체예에서, 표적 서열은 서열식별번호: 1의 위치 39562-39593, 예컨대, 서열식별번호: 1의 위치 39573-39592로부터 선택된다.
본 발명의 또 다른 구체예에서 표적 서열은 서열식별번호: 5이고, 이는 영역 C에 해당한다. 특정 구체예에서, 표적 서열은 서열식별번호: 1의 위치 72837-72940, 예컨대, 서열식별번호: 1의 위치 72861-72891 또는 위치 72862-72890으로부터 선택된다.
표적 세포
본원에서 사용되는 용어 "표적 세포"는 표적 핵산을 발현하는 세포를 지칭한다. 일부 구체예에서 표적 세포는 생체내 또는 시험관내 존재할 수 있다. 일부 구체예에서 표적 세포는 포유동물 세포, 예컨대, 마우스 세포 또는 래트 세포와 같은 설치류 세포 또는 영장류 세포, 예컨대, 원숭이 세포 또는 인간 세포이다.
바람직한 구체예에서 표적 세포는 Tau mRNA, 예컨대, Tau 전구-mRNA 또는 Tau 성숙 mRNA를 발현한다. Tau mRNA의 폴리 A 꼬리는 일반적으로 안티센스 올리고뉴클레오티드 표적화에 있어 무시된다.
자연 발생 변이체
용어 "자연 발생 변이체"는 표적 핵산과 동일한 유전자 좌위로부터 유래하지만, 예를 들면, 동일한 아미노산을 인코딩하는 다수의 코돈을 유발하는 유전자 코드의 축퇴성에 의해, 또는 전구-mRNA의 대체 스플라이싱, 또는 다형성, 예컨대, 단일 뉴클레오티드 다형성 (SNPs), 및 대립유전자 변이체들의 존재로 인해 상이할 수 있는 MAPT 유전자 또는 전사체의 변이체들을 지칭한다. 그러므로, 올리고뉴클레오티드에 충분히 상보적인 서열의 존재에 기초하여, 본 발명의 올리고뉴클레오티드는 표적 핵산 및 이의 자연 발생 변이체를 표적화할 수 있다.
일부 구체예에서, 자연 발생 변이체는 포유동물 MAPT 표적 핵산, 예컨대 서열식별번호: 1 및 2로 구성된 군에서 선택된 표적 핵산에 대해 적어도 95%, 예컨대, 적어도 98% 또는 적어도 99%의 상동성을 갖는다. 일부 구체예에서 자연 발생 변이체는 서열식별번호: 1의 인간 MAPT 표적 핵산에 대해 적어도 99%의 상동성을 갖는다.
발현 조절
본원에서 사용된 용어 "발현 조절"은 올리고뉴클레오티드의 투여 전 Tau의 양과 비교할 때 Tau의 양을 변경시키는 올리고뉴클레오티드의 능력에 대한 전체적인 용어로 이해되어야 한다. 대안적으로, 발현 조절은 대조군 실험을 참조하여 결정될 수 있다. 일반적으로 대조군은 식염수 조성물로 처리된 개체 또는 표적 세포 또는 비-표적화 올리고뉴클레오티드 (모의)로 처리된 개체 또는 표적 세포인 것으로 이해된다.
한 가지 유형의 조절은, 예를 들어, mRNA의 분해 또는 전사의 차단에 의해 Tau의 발현을 억제, 하향조절, 감소, 저해, 제거, 중지, 차단, 예방, 감소, 저하, 회피 또는 종결하는 올리고뉴클레오티드의 능력이다. 또 다른 유형의 조절은 예를 들어, 스플라이싱 부위의 복구 또는 스플라이싱 방지 또는 마이크로RNA 억제와 같은 억제 메커니즘의 제거 또는 차단에 의해 Tau의 발현을 복구, 증가 또는 향상시키는 올리고뉴클레오티드의 능력이다.
고 친화성 변형된 뉴클레오시드
고 친화성 변형된 뉴클레오시드는, 예를 들어, 용융 온도 (Tm)로 측정시, 올리고뉴클레오티드에 통합될 때 올리고뉴클레오티드의 그 상보적 표적에 대한 친화성을 향상시키는 변형된 뉴클레오티드이다. 본 발명의 고 친화성 변형된 뉴클레오시드는 용융 온도를 바람직하게는 변형된 뉴클레오시드 당 +0.5 내지 +12℃, 더욱 바람직하게는 +1.5 내지 +10℃, 가장 바람직하게는 +3 내지 +8℃ 증가시킨다. 다수의 고 친화성 변형된 뉴클레오시드가 해당 기술분야에 공지되어 있으며, 예를 들어, 많은 2' 치환된 뉴클레오시드 및 잠금 핵산 (LNA)을 포함한다 (예컨대, Freier & Altmann; Nucl. Acid Res., 1997, 25, 4429-4443 및 Uhlmann; Curr. Opinion in Drug Development, 2000, 3 (2), 293-213 참고).
당 변형
본 발명의 올리고머는 변형된 당 모이어티, 즉 DNA 및 RNA에서 발견되는 리보스 당 모이어티와 비교할 때 당 모이어티의 변형을 갖는 하나 이상의 뉴클레오시드를 포함할 수 있다.
주로 친화성 및/또는 뉴클레아제 내성과 같은 올리고뉴클레오티드의 특정한 특성을 개선하기 위한 목적으로 리보스 당 모이어티가 변형된 수많은 뉴클레오시드가 만들어졌다.
이러한 변형에는, 리보스 고리 구조가, 예를 들어, 헥소스 고리 (HNA), 또는, 일반적으로 리보스 고리 (LNA)의 C2와 C4 탄소 사이에 바이라디칼 가교를 갖는 바이사이클릭 고리, 또는 일반적으로 C2와 C3 탄소 사이에 결합이 없는 연결되지 않은 리보스 고리 (예컨대, UNA)로의 교체에 의해 변형되는 경우가 포함된다. 다른 당 변형된 뉴클레오시드는, 예를 들어, 바이사이클로헥소스 핵산 (WO2011/017521) 또는 트리사이클릭 핵산 (WO2013/154798)을 포함한다. 변형된 뉴클레오시드는 또한 예를 들어, 펩티드 핵산 (PNA) 또는 모르폴리노 핵산의 경우에 당 모이어티가 비-당 모이어티로 교체된 뉴클레오시드를 포함한다.
당 변형은 또한 리보스 고리의 치환기를 수소 이외의 기로 변경하거나 DNA 및 RNA 뉴클레오시드에서 자연적으로 발견되는 2'-OH 기로 변경하여 이루어진 변형을 포함한다. 예를 들어, 치환기는 2', 3', 4' 또는 5' 위치에 도입될 수 있다.
2' 당 변형된 뉴클레오시드
2' 당 변형된 뉴클레오시드는 2' 위치에 H 또는 -OH 이외의 치환기를 갖는 뉴클레오시드 (2' 치환된 뉴클레오시드) 또는 리보스 고리의 2' 탄소와 제 2 탄소 사이에 가교를 형성할 수 있는 2' 연결된 바이라디칼을 포함하는 뉴클레오시드, 예컨대, LNA (2'-4' 바이라디칼 가교된) 뉴클레오시드이다.
실제로, 2' 당 치환된 뉴클레오시드를 개발하는데 많은 노력을 해왔으며, 많은 2' 치환된 뉴클레오시드는 올리고뉴클레오티드에 통합될 때 유익한 특성을 갖는 것으로 밝혀졌다. 예를 들어, 2' 변형된 당은 올리고뉴클레오티드에 대한 향상된 결합 친화성 및/또는 증가된 뉴클레아제 내성을 제공할 수 있다. 2' 치환된 변형된 뉴클레오시드의 예는 2'-O-알킬-RNA, 2'-O-메틸-RNA, 2'-알콕시-RNA, 2'-O-메톡시에틸-RNA (MOE), 2'-아미노-DNA, 2'-플루오로-RNA, 및 2'-F-ANA 뉴클레오시드이다. 추가 예로서, 예컨대, Freier & Altmann; Nucl. Acid Res., 1997, 25, 4429-4443 and Uhlmann; Curr. Opinion in Drug Development, 2000, 3(2), 293-213, 및 Deleavey and Damha, Chemistry and Biology 2012, 19, 937을 참고하라. 아래에 일부 2' 치환된 변형된 뉴클레오시드를 예시한다.
본 발명과 관련하여 2' 치환된 당 변형된 뉴클레오시드는 LNA와 같은 2' 가교 뉴클레오시드를 포함하지 않는다.
잠금 핵산 뉴클레오시드 (LNA 뉴클레오시드)
"LNA 뉴클레오시드"는 상기 뉴클레오시드의 리보스 당 고리의 C2'와 C4'를 연결하는 바이라디칼 ("2'- 4' 가교"로도 지칭됨)을 포함하는 2'-당 변형된 뉴클레오시드로서, 리보스 고리의 입체형태를 제한 또는 잠금한다. 이러한 뉴클레오시드는 문헌에서 가교 핵산 또는 바이사이클릭 핵산 (BNA)으로도 명명된다. 리보스 입체형태의 잠금은 LNA가 상보적 RNA 또는 DNA 분자에 대한 올리고뉴클레오티드에 통합될 때 향상된 혼성화 (이중나선 안정화) 친화성과 연관된다. 이는 올리고뉴클레오티드/보체 이중나선의 용융 온도를 측정하여 관례적으로 결정될 수 있다.
비 제한적인 예시적 LNA 뉴클레오시드가 WO 99/014226, WO 00/66604, WO 98/039352, WO 2004/046160, WO 00/047599, WO 2007/134181, WO 2010/077578, WO 2010/036698, WO 2007/090071, WO 2009/006478, WO 2011/156202, WO 2008/154401, WO 2009/067647, WO 2008/150729, Morita 외, Bioorganic & Med.Chem. Lett. 12, 73-76, Seth 외, J. Org. Chem. 2010, Vol 75(5) pp. 1569-81, Mitsuoka 외, Nucleic Acids Research 2009, 37(4), 1225-1238, 및 Wan and Seth, J. Medical Chemistry 2016, 59, 96459667에 개시되어 있다.
2'-4' 가교는 2 내지 4개 가교 원자들을 포함하고, 특히 식 -X-Y-이고, 이 때
X는 산소, 황, -CRaRb-, -C(Ra)=C(Rb)-, -C(=CRaRb)-, -C(Ra)=N-, -Si(Ra)2-, -SO2-, -NRa-, -O-NRa-, -NRa-O-, -C(=J)-, Se, -O-NRa-, -NRa-CRaRb-, -N(Ra)-O- 또는 -O-CRaRb-이고;
Y는 산소, 황, -(CRaRb)n-, -CRaRb-O-CRaRb-, -C(Ra)=C(Rb)-, -C(Ra)=N-, -Si(Ra)2-, -SO2-, -NRa-, -C(=J)-, Se, -O-NRa-, -NRa-CRaRb-, -N(Ra)-O- 또는 -O-CRaRb-이고;
단, -X-Y-는 -O-O-, Si(Ra)2-Si(Ra)2-, -SO2-SO2-, -C(Ra)=C(Rb)-C(Ra)=C(Rb), -C(Ra)=N-C(Ra)=N-, -C(Ra)=N-C(Ra)=C(Rb), -C(Ra)=C(Rb)-C(Ra)=N- 또는 -Se-Se-가 아니며;
J는 산소, 황, =CH2 또는 =N(Ra)이고;
Ra 및 Rb는 수소, 할로겐, 하이드록실, 시아노, 티오하이드록실, 알킬, 치환된 알킬, 알켄일, 치환된 알켄일, 알킨일, 치환된 알킨일, 알콕시, 치환된 알콕시, 알콕시알킬, 알켄일옥시, 카르복실, 알콕시카르보닐, 알킬카르보닐, 포름일, 아릴, 헤테로사이클릴, 아미노, 알킬아미노, 카르바모일, 알킬아미노카르보닐, 아미노알킬아미노카르보닐, 알킬아미노알킬아미노카르보닐, 알킬카르보닐아미노, 카르바미도, 알카노일옥시, 설폰일, 알킬설폰일옥시, 니트로, 아지도, 티오하이드록실설파이드알킬설파닐, 아릴옥시카르보닐, 아릴옥시, 아릴카르보닐, 헤테로아릴, 헤테로아릴옥시카르보닐, 헤테로아릴옥시, 헤테로아릴카르보닐, -OC(=Xa)Rc, -OC(=Xa)NRcRd 및 -NReC(=Xa)NRcRd에서 독립적으로 선택되거나;
2개의 같은 자리 Ra 및 Rb는 함께 선택적으로 치환된 메틸렌을 형성하거나;
2개의 같은 자리 Ra 및 Rb는, 이들이 부착되는 탄소와 함께, -X-Y-의 오직 하나의 탄소 원자와 사이클로알킬 또는 할로사이클로알킬을 형성하고;
이 때, 치환된 알킬, 치환된 알켄일, 치환된 알킨일, 치환된 알콕시 및 치환된 메틸렌은 할로겐, 하이드록실, 알킬, 알켄일, 알킨일, 알콕시, 알콕시알킬, 알켄일옥시, 카르복실, 알콕시카르보닐, 알킬카르보닐, 포름일, 헤테로사이클릴, 아릴 및 헤테로아릴에서 독립적으로 선택된 1 내지 3개 치환기로 치환된 알킬, 알켄일, 알킨일 및 메틸렌이고;
Xa는 산소, 황 또는 -NRc이고;
Rc, Rd 및 Re는 수소 및 알킬에서 독립적으로 선택되고;
n은 1, 2 또는 3이다.
본 발명의 추가 특정 구체예에서, X는 산소, 황, -NRa-, -CRaRb- 또는 -C(=CRaRb)-, 특히, 산소, 황, -NH-, -CH2- 또는 -C(=CH2)-, 더욱 특히 산소이다.
본 발명의 또 다른 특정 구체예에서, Y는 -CRaRb-, -CRaRb-CRaRb- 또는 -CRaRb-CRaRb-CRaRb-, 특히 -CH2-CHCH3-, -CHCH3-CH2-, -CH2-CH2- 또는 -CH2-CH2-CH2-이다.
본 발명의 특정 구체예에서, -X-Y-는 -O-(CRaRb)n-, -S-CRaRb-, -N(Ra)CRaRb-, -CRaRb-CRaRb-, -O-CRaRb-O-CRaRb-, -CRaRb-O-CRaRb-, -C(=CRaRb)-CRaRb-, -N(Ra)CRaRb-, -O-N(Ra)-CRaRb- 또는 -N(Ra)-O-CRaRb-이다.
본 발명의 특정 구체예에서, Ra 및 Rb는 수소, 할로겐, 하이드록실, 알킬 및 알콕시알킬, 특히, 수소, 할로겐, 알킬 및 알콕시알킬로 구성된 군에서 독립적으로 선택된다.
본 발명의 또 다른 구체예에서, Ra 및 Rb는 수소, 플루오로, 하이드록실, 메틸 및 -CH2-O-CH3, 특히, 수소, 플루오로, 메틸 및 -CH2-O-CH3으로 구성된 군에서 독립적으로 선택된다.
유리하게는, -X-Y-의 Ra 및 Rb 중 하나는 상기 정의된 바와 같고 다른 하나는 모두 동시에 수소이다.
본 발명의 추가 특정 구체예에서, Ra는 수소 또는 알킬, 특히, 수소 또는 메틸이다.
본 발명의 또 다른 특정 구체예에서, Rb는 수소 또는 알킬, 특히, 수소 또는 메틸이다.
본 발명의 특정 구체예에서, Ra 및 Rb 중 하나 또는 둘 모두는 수소이다.
본 발명의 특정 구체예에서, Ra 및 Rb 중 단 하나만 수소이다.
본 발명의 한 특정 구체예에서, Ra 및 Rb 중 하나는 메틸이고 다른 하나는 수소이다.
본 발명의 특정 구체예에서, Ra 및 Rb는 모두 동시에 메틸이다.
본 발명의 특정 구체예에서, -X-Y-는 -O-CH2-, -S-CH2-, -S-CH(CH3)-, -NH-CH2-, -O-CH2CH2-, -O-CH(CH2-O-CH3)-, -O-CH(CH2CH3)-, -O-CH(CH3)-, -O-CH2-O-CH2-, -O-CH2-O-CH2-, -CH2-O-CH2-, -C(=CH2)CH2-, -C(=CH2)CH(CH3)-, -N(OCH3)CH2- 또는 -N(CH3)CH2-이다.
본 발명의 특정 구체예에서, -X-Y-는 -O-CRaRb-이고, 이 때, Ra 및 Rb는 수소, 알킬 및 알콕시알킬, 특히, 수소, 메틸 및 -CH2-O-CH3으로 구성된 군에서 독립적으로 선택된다.
특정 구체예에서, -X-Y-는 -O-CH2- 또는 -O-CH(CH3)-, 특히 -O-CH2-이다.
2'- 4' 가교는, 각각 구조식 (A) 및 구조식 (B)에 도시된 바와 같이, 리보스 고리의 평면 아래 (베타-D-입체형태), 또는 이러한 고리의 평면 위에 (알파-L-입체형태) 위치할 수 있다.
본 발명에 따른 LNA 뉴클레오시드는, 특히, 구조식 (A) 또는 (B)이고
(A); (B);
이 때
W는 산소, 황, -N(Ra)- 또는 -CRaRb-, 특히, 산소이고;
B는 핵염기 또는 변형된 핵염기이고;
Z는 인접 뉴클레오시드 또는 5'-말단 기에 대한 뉴클레오시드간 연결이고;
Z*는 인접 뉴클레오시드 또는 3'-말단 기에 대한 뉴클레오시드간 연결이고;
R1, R2, R3, R5 및 R5*는 수소, 할로겐, 알킬, 할로알킬, 알켄일, 알킨일, 하이드록시, 알콕시, 알콕시알킬, 아지도, 알켄일옥시, 카르복실, 알콕시카르보닐, 알킬카르보닐, 포름일 및 아릴에서 독립적으로 선택되고;
X, Y, Ra 및 Rb는 상기 정의된 바와 같다.
특정 구체예에서, -X-Y-의 정의에서, Ra는 수소 또는 알킬, 특히, 수소 또는 메틸이다. 또 다른 특정 구체예에서, -X-Y-의 정의에서, Rb는 수소 또는 알킬, 특히, 수소 또는 메틸이다. 추가 특정 구체예에서, -X-Y-의 정의에서, Ra 및 Rb 중 하나 또는 둘 모두는 수소이다. 특정 구체예에서, -X-Y-의 정의에서, Ra 및 Rb 중 단 하나만 수소이다. 한 특정 구체예에서, -X-Y-의 정의에서, Ra 및 Rb 중 하나는 메틸이고 다른 하나는 수소이다. 특정 구체예에서, -X-Y-의 정의에서, Ra 및 Rb는 모두 동시에 메틸이다.
추가 특정 구체예에서, X의 정의에서, Ra는 수소 또는 알킬, 특히, 수소 또는 메틸이다. 또 다른 특정 구체예에서, X의 정의에서, Rb는 수소 또는 알킬, 특히, 수소 또는 메틸이다. 특정 구체예에서, X의 정의에서, Ra 및 Rb 중 하나 또는 모두는 수소이다. 특정 구체예에서, X의 정의에서, Ra 및 Rb 중 단 하나만 수소이다. 한 특정 구체예에서, X의 정의에서, Ra 및 Rb 중 하나는 메틸이고 다른 하나는 수소이다. 특정 구체예에서, X의 정의에서, Ra 및 Rb는 모두 동시에 메틸이다.
추가 특정 구체예에서, Y의 정의에서, Ra는 수소 또는 알킬, 특히, 수소 또는 메틸이다. 또 다른 특정 구체예에서, Y의 정의에서, Rb는 수소 또는 알킬, 특히, 수소 또는 메틸이다. 특정 구체예에서, Y의 정의에서, Ra 및 Rb 중 하나 또는 모두는 수소이다. 특정 구체예에서, Y의 정의에서, Ra 및 Rb 중 단 하나만 수소이다. 한 특정 구체예에서, Y의 정의에서, Ra 및 Rb 중 하나는 메틸이고 다른 하나는 수소이다. 특정 구체예에서, Y의 정의에서, Ra 및 Rb는 모두 동시에 메틸이다.
본 발명의 특정 구체예에서, R1, R2, R3, R5 및 R5*는 수소 및 알킬, 특히, 수소 및 메틸에서 독립적으로 선택된다.
본 발명의 추가의 특정 유리한 구체예에서, R1, R2, R3, R5 및 R5*는 모두 동시에 수소이다.
본 발명의 또 다른 특정 구체예에서, R1, R2, R3은 모두 동시에 수소이고, R5 및 R5* 중 하나는 수소이고 다른 하나는 상기 정의된 바와 같고, 특히, 알킬, 더욱 특히 메틸이다.
본 발명의 특정 구체예에서, R5 및 R5*는 수소, 할로겐, 알킬, 알콕시알킬 및 아지도, 특히, 수소, 플루오로, 메틸, 메톡시에틸 및 아지도에서 독립적으로 선택된다. 본 발명의 유리한 특정 구체예에서, R5 및 R5* 중 하나는 수소이고 다른 하나는 알킬, 특히, 메틸, 할로겐, 특히, 플루오로, 알콕시알킬, 특히, 메톡시에틸 또는 아지도이거나; R5 및 R5*는 모두 동시에 수소 또는 할로겐이고, 특히, 모두 동시에 수소 또는 플루오로이다. 이러한 특정 구체예에서, W는 유리하게는 산소, 및 -X-Y-, 유리하게는 -O-CH2-일 수 있다.
본 발명의 특정 구체예에서, -X-Y-는 -O-CH2-이고, W는 산소이고 R1, R2, R3, R5 및 R5*는 모두 동시에 수소이다. 이러한 LNA 뉴클레오시드는 본원에 참고문헌으로 포함되는 WO 99/014226, WO 00/66604, WO 98/039352 및 WO 2004/046160에 개시되어 있으며, 베타-D-옥시 LNA 및 알파-L-옥시 LNA 뉴클레오시드로 해당 기술분야에 통상적으로 공지되어 있는 것들을 포함한다.
본 발명의 또 다른 특정 구체예에서, -X-Y-는 -S-CH2-이고, W는 산소이고 R1, R2, R3, R5 및 R5*는 모두 동시에 수소이다. 이러한 티오 LNA 뉴클레오시드는 WO 99/014226 및 WO 2004/046160에 개시되어 있으며 이는 본원에 참고문헌으로 포함된다.
본 발명의 또 다른 특정 구체예에서, -X-Y-는 -NH-CH2-이고, W는 산소이고 R1, R2, R3, R5 및 R5*는 모두 동시에 수소이다. 이러한 아미노 LNA 뉴클레오시드는 WO 99/014226 및 WO 2004/046160에 개시되어 있으며 이는 본원에 참고문헌으로 포함된다.
본 발명의 또 다른 특정 구체예에서, -X-Y-는 -O-CH2CH2- 또는 -OCH2CH2CH2-이고, W는 산소이고, 및 R1, R2, R3, R5 및 R5*는 모두 동시에 수소이다. 이러한 LNA 뉴클레오시드는 본원에 참고문헌으로 포함되는 WO 00/047599 및 Morita 외, Bioorganic & Med.Chem. Lett. 12, 73-76에 개시되어 있으며, 해당 기술분야에 일반적으로 2'-O-4'C-에틸렌 가교 핵산 (ENA)으로 공지된 것을 포함한다.
본 발명의 또 다른 특정 구체예에서, -X-Y-는 -O-CH2-이고, W는 산소이고, R1, R2, R3은 모두 동시에 수소이고, R5 및 R5* 중 하나는 수소이고 다른 하나는 수소가 아니다. 예컨대, 알킬, 예를 들면 메틸이다. 이러한 5' 치환된 LNA 뉴클레오시드는 본원에 참고로 포함되는 WO 2007/134181에 개시되어 있다.
본 발명의 또 다른 특정 구체예에서, -X-Y-는 -O-CRaRb-이고, 이 때, Ra 및 Rb 중 하나 또는 둘 모두는 수소가 아니고, 특히, 알킬, 예컨대, 메틸이고, W는 산소이고, R1, R2, R3은 모두 동시에 수소이고, R5 및 R5* 중 하나는 수소이고 다른 하나는 수소가 아니다. 특히, 알킬, 예를 들면 메틸이다. 이러한 비스 변형된 LNA 뉴클레오시드는 본원에 참고문헌으로 포함되는 WO 2010/077578에 개시되어 있다.
본 발명의 또 다른 특정 구체예에서, -X-Y-는 -O-CHRa-이고, W는 산소이고 R1, R2, R3, R5 및 R5*는 모두 동시에 수소이다. 이러한 6'-치환된 LNA 뉴클레오시드는 WO 2010/036698 및 WO 2007/090071에 개시되어 있으며, 이는 모두 본원에 참고문헌으로 포함된다. 이러한 6'-치환된 LNA 뉴클레오시드에서, Ra는 특히, C1-C6 알킬, 예컨대, 메틸이다.
본 발명의 또 다른 특정 구체예에서, -X-Y-는 -O-CH(CH2-O-CH3)-이다 ("2' O-메톡시에틸 바이사이클릭 핵산", Seth 외, J. Org. Chem. 2010, Vol 75(5) pp. 1569-81).
본 발명의 또 다른 특정 구체예에서, -X-Y-는 -O-CH(CH2CH3)-이다 ("2'O-에틸 바이사이클릭 핵산", Seth 외, J. Org. Chem. 2010, Vol 75(5) pp. 1569-81).
본 발명의 또 다른 특정 구체예에서, -X-Y-는 -O-CH(CH2-O-CH3)-이고, W는 산소이고 R1, R2, R3, R5 및 R5*는 모두 동시에 수소이다. 이러한 LNA 뉴클레오시드는 또한 사이클릭 MOE (cMOE)로서 해당 기술분야에 공지되어 있으며 WO 2007/090071에 개시되어 있다.
본 발명의 또 다른 특정 구체예에서, -X-Y-는 -O-CH(CH3)-이다.
본 발명의 또 다른 특정 구체예에서, -X-Y-는 -O-CH2-O-CH2-이다 (Seth 외, J. Org. Chem 2010 op. cit.).
본 발명의 또 다른 특정 구체예에서, -X-Y-는 -O-CH(CH3)-이고, W는 산소이고 R1, R2, R3, R5 및 R5*는 모두 동시에 수소이다. 이러한 6'-메틸 LNA 뉴클레오시드는 또한 해당 기술분야에 cET 뉴클레오시드로 공지되어 있고, WO 2007/090071 (베타-D) 및 WO 2010/036698 (알파-L)에 개시된 바와 같이 (S)-cET 또는 (R)-cET 부분입체이성질체일 수 있으며, 이들 문헌은 모두 본원에 참고문헌으로 포함된다.
본 발명의 또 다른 특정 구체예에서, -X-Y-는 -O-CRaRb-이고, 이 때, Ra도 Rb도 수소가 아니며, W는 산소이고 R1, R2, R3, R5 및 R5*는 모두 동시에 수소이다. 특정 구체예에서, Ra 및 Rb는 모두 동시에 알킬이고, 특히, 모두 동시에 메틸이다. 이러한 6'-이-치환된 LNA 뉴클레오시드는 본원에 참고로 포함되는 WO 2009/006478에 개시되어 있다.
본 발명의 또 다른 특정 구체예에서, -X-Y-는 -S-CHRa-이고, W는 산소이고 R1, R2, R3, R5 및 R5*는 모두 동시에 수소이다. 이러한 6'-치환된 티오 LNA 뉴클레오시드는 본원에 참고로 포함되는 WO 2011/156202에 개시되어 있다. 이러한 6'-치환된 티오 LNA의 특정 구체예에서, Ra는 알킬, 특히 메틸이다.
본 발명의 특정 구체예에서, -X-Y-는 -C(=CH2)C(RaRb)-, -C(=CHF)C(RaRb)- 또는 -C(=CF2)C(RaRb)-이고, W는 산소이고 R1, R2, R3, R5 및 R5*는 모두 동시에 수소이다. Ra 및 Rb는 수소, 할로겐, 알킬 및 알콕시알킬, 특히, 수소, 메틸, 플루오로 및 메톡시메틸에서 유리하게 독립적으로 선택된다. Ra 및 Rb는 특히, 모두 동시에 수소 또는 메틸이거나, Ra 및 Rb 중 하나는 수소이고 다른 하나는 메틸이다. 이러한 비닐 카르보 LNA 뉴클레오시드는 WO 2008/154401 및 WO 2009/067647에 개시되어 있으며, 이는 모두 본원에 참고문헌으로 포함된다.
본 발명의 특정 구체예에서, -X-Y-는 -N(ORa)-CH2-이고, W는 산소이고 R1, R2, R3, R5 및 R5*는 모두 동시에 수소이다. 특정 구체예에서, Ra는 알킬, 예컨대, 메틸이다. 이러한 LNA 뉴클레오시드는 또한 N 치환된 LNA로 공지되어 있으며 본원에 참고로 포함되는 WO 2008/150729에 개시되어 있다.
본 발명의 특정 구체예에서, -X-Y-는 -O-N(Ra)-, -N(Ra)-O-, -NRa-CRaRb-CRaRb- 또는 -NRa-CRaRb-이고, W는 산소이고 R1, R2, R3, R5 및 R5*는 모두 동시에 수소이다. Ra 및 Rb는 수소, 할로겐, 알킬 및 알콕시알킬, 특히, 수소, 메틸, 플루오로 및 메톡시메틸에서 유리하게 독립적으로 선택된다. 특정 구체예에서, Ra는 알킬, 예컨대, 메틸이고, Rb는 수소 또는 메틸, 특히, 수소이다 (Seth 외, J. Org. Chem 2010 op. cit.).
본 발명의 특정 구체예에서, -X-Y-는 -O-N(CH3)- 이다 (Seth 외, J. Org. Chem 2010 op. cit.).
본 발명의 특정 구체예에서, R5 및 R5*는 모두 동시에 수소이다. 본 발명의 또 다른 특정 구체예에서, R5 및 R5* 중 하나는 수소이고 다른 하나는 알킬, 예컨대, 메틸이다. 이러한 구체예들에서, R1, R2 및 R3은 특히, 수소일 수 있고 -X-Y-는 특히, -O-CH2- 또는 -O-CHC(Ra)3-, 예컨대, -O-CH(CH3)-일 수 있다.
본 발명의 특정 구체예에서, -X-Y-는 -CRaRb-O-CRaRb-, 예컨대, -CH2-O-CH2-이고, W는 산소이고 R1, R2, R3, R5 및 R5*는 모두 동시에 수소이다. 이러한 특정 구체예들에서, Ra는 특히, 알킬, 예컨대, 메틸일 수 있고, Rb는 수소 또는 메틸, 특히, 수소일 수 있다. 이러한 LNA 뉴클레오시드는 또한 입체형태적으로 제한된 뉴클레오티드 (CRNs)로 공지되어 있고 본원에 참고문헌으로 포함되는 WO 2013/036868에 개시되어 있다.
본 발명의 특정 구체예에서, -X-Y-는 -O-CRaRb-O-CRaRb-, 예컨대, -O-CH2-O-CH2-이고, W는 산소이고 R1, R2, R3, R5 및 R5*는 모두 동시에 수소이다. Ra 및 Rb는 수소, 할로겐, 알킬 및 알콕시알킬, 특히, 수소, 메틸, 플루오로 및 메톡시메틸에서 유리하게 독립적으로 선택된다. 이러한 특정 구체예에서, Ra는 특히, 알킬, 예컨대, 메틸일 수 있고, Rb는 수소 또는 메틸, 특히, 수소일 수 있다. 이러한 LNA 뉴클레오시드는 COC 뉴클레오티드로도 공지되어 있으며 Mitsuoka 외, Nucleic Acids Research 2009, 37 (4), 1225-1238에 개시되어 있으며, 이는 본원에 참조로 포함된다.
명시되지 않는 한 LNA 뉴클레오시드는 베타-D 또는 알파-L 입체아이소형일 수 있는 것으로 인정될 것이다.
본 발명의 LNA 뉴클레오시드의 특정 예는 도식 1에 제시되어 있다 (이 때, B는 상기 정의된 바와 같다).
도식 1
특정 LNA 뉴클레오시드는 베타-D-옥시-LNA, 6'-메틸-베타-D-옥시 LNA, 예컨대, (S)-6'-메틸-베타-D-옥시-LNA (ScET) 및 ENA이다.
본 발명의 출발 물질 또는 화합물 중 하나가 하나 이상의 반응 단계의 반응 조건들하에서 안정하지 않거나 반응성인 하나 이상의 작용기를 함유하는 경우, 해당 기술분야에 잘 공지되어 있는 방법을 적용하는 중요한 단계 이전에 적절한 보호기 (예컨대, "Protective Groups in Organic Chemistry" by TW Greene and PGM Wuts, 3rd Ed., 1999, Wiley, New York에 기재)가 도입될 수 있다. 이러한 보호기는 문헌에 기재된 표준 방법을 사용하여 합성의 후반 단계에서 제거될 수 있다. 보호기의 예는 tert-뷰톡시카르보닐 (Boc), 9-플루오렌일메틸카르바메이트 (Fmoc), 2-트리메틸실릴에틸 카르바메이트 (Teoc), 카르보벤질옥시 (Cbz) 및 p-메톡시벤질옥시카르보닐 (Moz)이다.
본원에 기재된 화합물은 여러 비대칭 중심을 함유할 수 있으며 광학적으로 순수한 거울상 이성질체, 거울상 이성질체의 혼합물, 예를 들어, 라세미체, 부분입체이성질체의 혼합물, 부분입체이성질체 라세미체 또는 부분입체이성질체 라세미체의 혼합물의 형태로 존재할 수 있다.
용어 "비대칭 탄소 원자"는 4개의 다른 치환기를 갖는 탄소 원자를 의미한다. Cahn-Ingold-Prelog 협약에 따르면 비대칭 탄소 원자는 "R" 또는 "S" 구조일 수 있다.
화학적 기 정의
본 명세서에서 용어 "알킬"은 단독으로 또는 조합으로 1 내지 8 개의 탄소 원자를 갖는 직쇄 또는 분지쇄 알킬기, 특히 1 내지 6 개 이상의 탄소 원자를 갖는 직쇄 또는 분지쇄 알킬기, 더욱 특히 1 내지 4 개의 탄소 원자를 갖는 직쇄 또는 분지쇄 알킬기를 의미한다. 직쇄 및 분지쇄 C1-C8 알킬기의 예로는 메틸, 에틸, 프로필, 이소프로필, 부틸, 이소부틸, tert-뷰틸, 이성체 펜틸, 이성체 헥실, 이성체 헵틸 및 이성체 옥틸, 특히, 메틸, 에틸, 프로필, 뷰틸 및 펜틸이 있다. 알킬의 특정 예는 메틸, 에틸 및 프로필이다.
용어 "사이클로알킬"은 단독으로 또는 조합으로 3 내지 8 개의 탄소 원자를 갖는 사이클로알킬 고리, 특히, 3 내지 6 개의 탄소 원자를 갖는 사이클로알킬 고리를 의미한다. 사이클로알킬의 예는 사이클로프로필, 사이클로뷰틸, 사이클로펜틸, 사이클로헥실, 사이클로헵틸 및 사이클로옥틸, 더욱 특히 사이클로프로필 및 사이클로뷰틸이다. "사이클로알킬"의 특정 예는 사이클로프로필이다.
용어 "알콕시"는 단독으로 또는 조합으로, 용어 "알킬"이 상기 주어진 의미를 가지는 식 알킬-O- 기, 예컨대, 메톡시, 에톡시, n-프로폭시, 이소프로폭시, n-뷰톡시, 이소뷰톡시, sec-뷰톡시 및 tert-뷰톡시를 의미한다. 특히 "알콕시"는 메톡시 및 에톡시이다. 메톡시에톡시는 "알콕시알콕시"의 특정한 예이다.
용어 "옥시"는 단독으로 또는 조합으로 -O- 기를 의미한다.
용어 "알켄일"은 단독으로 또는 조합으로 올레핀 결합 및 최대 8 개, 바람직하게는 최대 6 개, 특히 바람직하게는 최대 4 개의 탄소 원자를 포함하는 직쇄 또는 분지형 탄화수소 잔기를 의미한다. 알켄일 기의 예들은 에텐일, 1-프로펜일, 2-프로펜일, 이소프로펜일, 1-뷰텐일, 2-뷰텐일, 3-뷰텐일 및 이소뷰텐일이다.
용어 "알킨일"은 단독으로 또는 조합으로 삼중 결합 및 최대 8 개, 바람직하게는 최대 6 개, 특히 바람직하게는 최대 4 개의 탄소 원자를 포함하는 직쇄 또는 분지형 탄화수소 잔기를 의미한다.
용어 "할로겐" 또는 "할로"는 단독으로 또는 조합으로 불소, 염소, 브롬 또는 요오드, 특히, 불소, 염소 또는 브롬, 더욱 특히, 불소를 의미한다. 또 다른 기와 조합된 용어 "할로"는, 하나 이상의 할로겐, 특히 1 내지 5개의 할로겐, 특히 1 내지 4 개의 할로겐, 즉, 1, 2, 3 또는 4개의 할로겐으로 치환된, 하나 이상의 할로겐으로 상기 기가 치환되는 것을 나타낸다.
용어 "할로알킬"은 단독으로 또는 조합으로, 하나 이상의 할로겐, 특히, 1 내지 5 개의 할로겐, 특히, 1 내지 3 개의 할로겐으로 치환된 알킬 기를 나타낸다. 할로알킬의 예는 모노플루오로-, 다이플루오로- 또는 트라이플루오로-메틸, -에틸 또는 -프로필, 예를 들면, 3,3,3-트라이플루오로프로필, 2-플루오로에틸, 2,2,2-트라이플루오로에틸, 플루오로메틸 또는 트라이플루오로메틸을 포함한다. 플루오로메틸, 다이플루오로메틸 및 트라이플루오로메틸은 특정한 "할로알킬"이다.
용어 "할로사이클로알킬"은 단독으로 또는 조합으로, 하나 이상의 할로겐, 특히, 1 내지 5 개의 할로겐, 특히, 1 내지 3 개의 할로겐으로 치환된 상기 정의된 바와 같은 사이클로알킬 기를 나타낸다. "할로사이클로알킬"의 특정한 예는 할로사이클로프로필, 특히, 플루오로사이클로프로필, 다이플루오로사이클로프로필 및 트라이플루오로사이클로프로필이다.
용어 "하이드록실" 및 "하이드록시"는 단독으로 또는 조합으로 -OH 기를 의미한다.
용어 "티오하이드록실" 및 "티오하이드록시"는, 단독으로 또는 조합으로, -SH 기를 의미한다.
용어 "카르보닐"은, 단독으로 또는 조합으로, -C(O)- 기를 의미한다.
용어 "카르복시" 또는 "카르복실"은, 단독으로 또는 조합으로, -COOH 기를 의미한다.
용어 "아미노"는, 단독으로 또는 조합으로, 1차 아미노 기 (-NH2), 2차 아미노 기 (-NH-), 또는 3차 아미노 기 (-N-)를 의미한다.
용어 "알킬아미노"는, 단독으로 또는 조합으로, 상기 정의된 1 또는 2개 알킬 기로 치환된 상기 정의된 아미노 기를 의미한다.
용어 "설폰일"은, 단독으로 또는 조합으로, -SO2 기를 의미한다.
용어 "설핀일"은, 단독으로 또는 조합으로, -SO- 기를 의미한다.
용어 "설판일"은, 단독으로 또는 조합으로, -S- 기를 의미한다.
용어 "시아노"는, 단독으로 또는 조합으로, -CN 기를 의미한다.
용어 "아지도"는, 단독으로 또는 조합으로, -N3 기를 의미한다.
용어 "니트로"는, 단독으로 또는 조합으로, NO2 기를 의미한다.
용어 "포름일"은, 단독으로 또는 조합으로, -C(O)H 기를 의미한다.
용어 "카르바모일"은, 단독으로 또는 조합으로, -C(O)NH2 기를 의미한다.
용어 "카바미도"는, 단독으로 또는 조합으로, -NH-C(O)-NH2 기를 의미한다.
용어 "아릴"은, 단독으로 또는 조합으로, 할로겐, 하이드록실, 알킬, 알켄일, 알킨일, 알콕시, 알콕시알킬, 알켄일옥시, 카르복실, 알콕시카르보닐, 알킬카르보닐 및 포름일에서 독립적으로 선택된 1 내지 3개 치환기로 선택적으로 치환된, 6 내지 10개 탄소 고리 원자들을 포함하는 1가 방향족 카르보사이클릭 모노- 또는 바이사이클릭 고리 시스템을 나타낸다. 아릴의 예는 페닐 및 나프틸, 특히, 페닐을 포함한다.
용어 "헤테로아릴"은, 단독으로 또는 조합으로, N, O 및 S에서 선택된 1, 2, 3 또는 4개 헤테로원자들을 포함하고, 잔부 고리 원자들은 탄소이고, 할로겐, 하이드록실, 알킬, 알켄일, 알킨일, 알콕시, 알콕시알킬, 알켄일옥시, 카르복실, 알콕시카르보닐, 알킬카르보닐 및 포름일에서 독립적으로 선택된 1 내지 3개 치환기들로 선택적으로 치환된, 5 내지 12개 고리 원자들의 1가 방향족 헤테로사이클릭 모노- 또는 바이사이클릭 고리 시스템을 나타낸다. 헤테로아릴의 예들에는 피롤릴, 퓨란일, 티엔일, 이미다졸릴, 옥사졸릴, 티아졸릴, 트리아졸릴, 옥사디아졸릴, 티아디아졸릴, 테트라졸릴, 피리딘일, 피라진일, 피라졸릴, 피리다진일, 피리미딘일, 트리아진일, 아제핀일, 디아제핀일, 이속사졸릴, 벤조퓨란일, 이소티아졸릴, 벤조티엔일, 인돌릴, 이소인돌릴, 이소벤조퓨란일, 벤즈이미다졸릴, 벤즈옥사졸릴, 벤조이속사졸릴, 벤조티아졸릴, 벤조이소티아졸릴, 벤조옥사디아졸릴, 벤조티아디아졸릴, 벤조트리아졸릴, 퓨린일, 퀴놀린일, 이소퀴놀린일, 퀴나졸린일, 퀴녹살린일, 카르바졸릴 또는 아크리딘일이 포함된다.
용어 "헤테로사이클릴"은, 단독으로 또는 조합으로, N, O 및 S에서 선택된 1, 2, 3 또는 4개 고리 헤테로원자들을 포함하고, 잔부 고리 원자들은 탄소이고, 할로겐, 하이드록실, 알킬, 알켄일, 알킨일, 알콕시, 알콕시알킬, 알켄일옥시, 카르복실, 알콕시카르보닐, 알킬카르보닐 및 포름일에서 독립적으로 선택된 1 내지 3개 치환기들로 선택적으로 치환된, 4 내지 12개, 특히 4 내지 9개 고리 원자들의 1가 포화 또는 부분 불포화 모노- 또는 바이사이클릭 고리 시스템을 의미한다. 모노사이클릭 포화 헤테로사이클릴의 예들은 아제티딘일, 피롤리딘일, 테트라하이드로퓨란일, 테트라하이드로-티엔일, 피라졸리딘일, 이미다졸리딘일, 옥사졸리딘일, 이속사졸리딘일, 티아졸리딘일, 피페리딘일, 테트라하이드로피란일, 테트라하이드로티오피란일, 피페라진일, 모르폴린일, 티오모르폴린일, 1,1-디옥소-티오모르폴린-4-일, 아제판일, 디아제판일, 호모피페라진일, 또는 옥사제판일이다. 바이사이클릭 포화 헤테로사이클로알킬의 예들은 8-아자-바이사이클로[3.2.1]옥틸, 퀴누클리딘일, 8-옥사-3-아자-바이사이클로[3.2.1]옥틸, 9-아자-바이사이클로[3.3.1]논일, 3-옥사-9-아자-바이사이클로[3.3.1]논일, 또는 3-티아-9-아자-바이사이클로[3.3.1]논일이다. 부분 포화 헤테로사이클로알킬의 예들은 디하이드로퓨릴, 이미다졸린일, 디하이드로-옥사졸릴, 테트라하이드로-피리딘일 또는 디하이드로피란일이다.
약학적으로 허용되는 염
용어 "약학적으로 허용되는 염"은, 생물학적으로 또는 달리 바람직하지 않은 것은 아닌, 유리 염기 또는 유리 산의 생물학적 유효성 및 성질들을 보유하는 염들을 지칭한다. 이러한 염들은 무기산, 예컨대, 염화수소산, 브롬화수소산, 황산, 질산, 인산, 특히, 염화수소산, 및 유기산, 예컨대, 아세트산, 프로피온산, 글리콜산, 피루브산, 옥살산, 말레산, 말론산, 숙신산, 푸마르산, 타르타르산, 시트르산, 벤조산, 신남산, 만델산, 메탄설폰산, 에탄설폰산, p-톨루엔설폰산, 살리실산, N-아세틸시스테인을 사용하여 형성된다. 또한 이들 염은 무기 염기 또는 유기 염기를 유리 산에 부가하여 제조될 수 있다. 무기 염기로부터 유도된 염들에는, 나트륨, 칼륨, 리튬, 암모늄, 칼슘, 마그네슘 염 등이 포함되나 이에 제한되는 것은 아니다. 유기 염기로부터 유도된 염들에는, 자연 발생 치환된 아민, 사이클릭 아민 및 염기성 이온 교환 수지, 예컨대, 아이소프로필아민, 트라이메틸아민, 다이에틸아민, 트라이에틸아민, 트라이프로필아민, 에탄올아민, 리신, 아르기닌, N-에틸피페리딘, 피페리딘, 폴리아민 수지를 비롯한 1차, 2차, 및 3차 아민, 치환된 아민의 염이 포함되나 이에 제한되는 것은 아니다. 화학식 (I)의 화합물 또한 양쪽성 이온의 형태로 존재할 수 있다. 화학식 (I)의 화합물의 특히 바람직한 약학적으로 허용되는 염은 염화수소산, 브롬화수소산, 황산, 인산 및 메탄설폰산의 염이다.
보호기
용어 "보호기"는, 단독으로 또는 조합으로, 다작용기 화합물에서 반응성 부위를 선택적으로 차단하여, 화학 반응이 다른 보호되지 않은 반응성 부위에서 선택적으로 수행될 수 있게 하는 기를 의미한다. 보호기들은 제거될 수 있다. 예시적인 보호기들은 아미노-보호기, 카르복시-보호기 또는 하이드록시-보호기이다.
뉴클레아제 매개 분해
뉴클레아제 매개 분해는 이러한 서열로 이중나선을 형성할 때 상보적 뉴클레오티드 서열의 분해를 매개할 수 있는 올리고뉴클레오티드를 의미한다.
일부 구체예에서, 올리고뉴클레오티드는 표적 핵산의 뉴클레아제 매개 분해를 통해 기능할 수 있으며, 이 때, 본 발명의 올리고뉴클레오티드는 뉴클레아제, 특히 엔도뉴클레아제, 바람직하게는 RNase H와 같은 엔도리보뉴클레아제 (RNase)를 동원할 수 있다. 뉴클레아제 매개 메카니즘을 통해 작동하는 올리고뉴클레오티드 디자인의 예는 전형적으로 5 개 또는 6 개 이상의 인접 DNA 뉴클레오시드의 영역을 포함하고 친화력 향상 뉴클레오시드, 예를 들어, 갭머, 헤드머 및 테일머가 한쪽 또는 양쪽에서 연접하는 올리고뉴클레오티드이다.
RNase H 활성 및 동원
안티센스 올리고뉴클레오티드의 RNase H 활성은 상보적 RNA 분자와 함께 이중나선으로 존재할 때 RNase H를 동원하는 능력을 나타낸다. WO01/23613은 RNase H 활성을 결정하는 시험관내 방법을 제공하며, 이는 RNase H를 동원하는 능력을 결정하는데 사용될 수 있다. 전형적으로 올리고뉴클레오티드는, 상보적 표적 핵산 서열과 함께 제공될 때, pmol/l/분으로 측정하여, 테스트되는 변형된 올리고뉴클레오티드와 동일한 염기 서열을 가지지만 올리고뉴클레오티드 내 모든 단량체들 사이에 포스포로티오에이트 연결을 가지는 DNA 단량체들 만을 내포하는 올리고뉴클레오티드를 사용하고, WO01/23613 (본원에 참고문헌으로 포함됨)의 실시예 91-95에 제공된 방법들을 사용하여 결정한 초기 속도의 적어도 5%, 예컨대, 적어도 10% 또는 20% 초과인 초기 속도를 가지는 경우, RNase H를 동원할 수 있는 것으로 간주된다. RHase H 활성을 결정함에 사용하기 위해, 재조합 인간 RNase H1은 스위스, 루체른의 Lubio Science GmbH사로부터 구입가능하다.
갭머
본 발명의 안티센스 올리고뉴클레오티드, 또는 이의 인접 뉴클레오티드 서열은, 갭머 올리고뉴클레오티드 또는 갭머 디자인으로도 명명되는 갭머일 수 있다. 안티센스 갭머들은 RNase H 매개 분해를 통해 표적 핵산을 억제하는데 통상적으로 사용된다. 갭머 올리고뉴클레오티드는 '5-> 3' 방향으로 3개 이상의 별개의 구조 영역들인 5'-플랭크, 갭 및 3'-플랭크, F-G-F'를 포함한다. "갭" 영역 (G)은 올리고뉴클레오티드가 RNase H를 동원할 수 있게 하는 인접 DNA 뉴클레오티드의 스트레치를 포함한다. 갭 영역에는 하나 이상의 당 변형된 뉴클레오시드, 유리하게는 고 친화성 당 변형된 뉴클레오시드를 포함하는 5' 연접 영역 (F), 그리고 하나 이상의 당 변형된 뉴클레오시드, 유리하게는 고 친화성 당 변형된 뉴클레오시드를 포함하는 3' 연접 영역 (F')이 연접된다. 영역 F 및 F' 에서 하나 이상의 당 변형된 뉴클레오시드는 표적 핵산에 대한 올리고뉴클레오티드의 친화성을 향상시킨다 (즉, 친화도 향상 당 변형된 뉴클레오시드임). 일부 구체예에서, 영역 F 및 F'에서 하나 이상의 당 변형된 뉴클레오시드는 LNA 및 2'-MOE로부터 독립적으로 선택된 것과 같은 고 친화성 2' 당 변형과 같은 2' 당 변형된 뉴클레오시드이다.
갭머 디자인에서, 갭 영역의 5' 및 3'에 가장 가까운 뉴클레오시드는 DNA 뉴클레오시드이고, 각각 5' (F) 또는 3' (F') 영역의 당 변형된 뉴클레오시드에 인접하여 위치한다. 플랭크는 갭 영역으로부터 가장 원위의 말단, 즉, 5' 플랭크의 5' 말단 및 3' 플랭크의 3' 말단에 하나 이상의 당 변형된 뉴클레오시드를 가지는 것으로 추가로 정의될 수 있다.
영역 F-G-F'는 인접 뉴클레오티드 서열을 형성한다. 본 발명의 안티센스 올리고뉴클레오티드, 또는 이의 인접 뉴클레오티드 서열은, 식 F-G-F'의 갭머 영역을 포함할 수 있다.
갭머 디자인 F-G-F'의 전장은, 예를 들면, 12 내지 32개의 뉴클레오시드, 예컨대, 13 내지 24개, 예컨대, 14 내지 22개의 뉴클레오시드, 예컨대, 14 내지 17개, 예컨대, 16 내지 18개의 뉴클레오시드, 예컨대, 16 내지 20개 뉴클레오티드일 수 있다.
예를 들어, 본 발명의 갭머 올리고뉴클레오티드는 다음 식으로 표시될 수 있다:
F1-8-G6-16-F'2-8, 예컨대,
F2-8-G6-14-F'2-8, 예컨대,
F3-8-G6-14-F'2-8
단, 갭머 영역 F-G-F'의 전장은 10개 이상, 예컨대, 12개 이상, 예컨대, 14개 이상의 뉴클레오티드 길이이다.
본 발명의 한 양상에서 안티센스 올리고뉴클레오티드, 또는 이의 인접 뉴클레오티드 서열은, 식 5'-F-G-F'-3'의 갭머로 구성되거나 이를 포함하고, 이 때, 영역 F 및 F'는 독립적으로 1-8개의 뉴클레오시드를 포함하거나 이들로 구성되고, 이들 중 2-4개는 2' 당 변형되고 F 및 F' 영역의 5' 및 3' 말단을 정의하고, G는 RNase H를 동원할 수 있는 6 내지 16개의 뉴클레오시드의 영역이다.
영역 F, G 및 F '는 아래에서 추가로 정의되며 F-G-F' 식에 통합될 수 있다.
갭머-영역 G
갭머의 영역 G (갭 영역)는 올리고뉴클레오티드가 RNase H, 예컨대, 인간 RNase H 1, 전형적으로 DNA 뉴클레오시드를 동원할 수 있게 하는 뉴클레오시드의 영역이다. RNase H는 DNA와 RNA 사이의 이중나선을 인식하여 RNA 분자를 효소적으로 절단하는 세포 효소이다. 적합하게는 갭머는 5 또는 6개 이상의 인접 DNA 뉴클레오시드, 예컨대, 5-16개 인접 DNA 뉴클레오시드, 예컨대, 6-15개 인접 DNA 뉴클레오시드, 예컨대, 7-14개 인접 DNA 뉴클레오시드, 예컨대, 8-12개 인접 DNA 뉴클레오티드, 예컨대, 8-12개 인접 DNA 뉴클레오티드 길이의 갭 영역 (G)을 가질 수 있다. 갭 영역 G는 일부 구체예에서 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15 또는 16 개의 인접 DNA 뉴클레오시드로 구성될 수 있다. 갭 영역의 시토신 (C) DNA는 경우에 따라 메틸화될 수 있으며, 이러한 잔기는 5'-메틸-시토신으로 주석처리된다 (meC 또는 c 대신 e로). 잠재적인 독성을 감소시키기 위해 cg 디뉴클레오티드가 갭에 존재하는 경우, 갭 내 시토신 DNA의 메틸화가 유리하며, 변형은 올리고뉴클레오티드의 효능에 큰 영향을 미치지 않는다. DNA 갭 영역에서의 사용을 위해 5' 치환된 DNA 뉴클레오시드, 예컨대, 5' 메틸 DNA 뉴클레오시드가 보고된 바 있다 (EP 2 742 136).
일부 구체예들에서 갭 영역 G는 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15 또는 16개의 인접 포스포로티오에이트 연결된 DNA 뉴클레오시드로 구성될 수 있다. 일부 구체예들에서, 갭 내 모든 뉴클레오시드간 연결은 포스포로티오에이트 연결이다.
전통적인 갭머는 DNA 갭 영역을 가지고 있지만 갭 영역 내에서 사용될 때 RNase H 동원을 가능하게 하는 변형된 뉴클레오시드의 수많은 예가 존재한다. 갭 영역 내에 포함될 때 RNase H를 동원할 수 있는 것으로 보고된 변형된 뉴클레오시드는, 예를 들면, 알파-L-LNA, C4' 알킬화 DNA (PCT/EP2009/050349 및 Vester 외, Bioorg. Med. Chem. Lett. 18 (2008) 2296-2300에 기재, 두 문헌 모두 본원에 참고문헌으로 포함됨), ANA 및 2'F-ANA와 같은 아라비노스 유래 뉴클레오시드 (Mangos 외, 2003 J. AM. CHEM. SOC. 125, 654-661), UNA (비잠금 핵산) (본원에 참고문헌으로 포함된 Fluiter 외, Mol. Biosyst., 2009, 10, 1039에 기재)를 포함한다. UNA는 비잠금 핵산으로, 일반적으로 리보스의 C2와 C3 사이의 결합이 제거되어 비잠금 "당" 잔기를 형성한다. 이러한 갭머에 사용되는 변형된 뉴클레오시드는 갭 영역에 도입될 때 2' 엔도 (DNA 유사) 구조를 채택하는 뉴클레오시드, 즉, RNase H 동원을 가능하게 하는 변형일 수 있다. 일부 구체예에서, 본원에 기재된 DNA 갭 영역 (G)은 갭 영역으로 도입될 때 2' 엔도 (DNA 유사) 구조를 채택하는 1 내지 3 개의 당 변형된 뉴클레오시드를 선택적으로 함유할 수 있다.
영역 G-" 갭 -브레이커"
대안적으로, 일부 RNase H 활성을 유지하면서 갭머의 갭 영역에 3' 엔도 입체형태를 부여하는 변형된 뉴클레오시드의 삽입에 대한 수많은 보고가 있다. 하나 이상의 3' 엔도 변형된 뉴클레오시드를 포함하는 갭 영역을 갖는 이러한 갭머는 "갭-브레이커" 또는 "갭-파괴된" 갭머로 지칭되며, 예를 들어 WO2013/022984를 참고하라. 갭-브레이커 올리고뉴클레오티드는 갭 영역 내부에 RNase H 동원을 가능하게 하기에 충분한 DNA 뉴클레오시드 영역을 보유한다. RNase H를 동원하는 갭브레이커 올리고뉴클레오티드 디자인의 능력은 통상적으로 서열 또는 심지어 화합물 특이적이다 (Rukov 외, 2015 Nucl. Acids Res. Vol. 43 pp. 8476-8487 참고, 이는 일부 경우에 표적 RNA의 보다 특이적인 절단을 제공하는 RNase H를 동원하는 "갭브레이커" 올리고뉴클레오티드를 개시한다). 갭-브레이커 올리고뉴클레오티드의 갭 영역 내에서 사용되는 변형된 뉴클레오시드는, 예를 들면, 3' 엔도 입체형태를 부여하는 변형된 뉴클레오시드, 예컨대, 2'-O-메틸 (OMe) 또는 2'-O-MOE (MOE) 뉴클레오시드, 또는 베타-D LNA 뉴클레오시드 (뉴클레오시드의 리보스 당 고리의 C2'와 C4' 사이의 가교는 베타 입체형태로 존재함), 예컨대, 베타-D-옥시 LNA 또는 ScET 뉴클레오시드일 수 있다.
위에서 설명한 영역 G를 포함하는 갭머와 마찬가지로, 갭-브레이커 또는 갭-파괴된 갭머의 갭 영역은, (영역 F의 3' 뉴클레오시드에 인접한) 갭의 5' 말단에서 DNA 뉴클레오시드, 및 (영역 F의 5' 뉴클레오시드에 인접한) 갭의 3' 말단에서 DNA 뉴클레오시드를 가진다. 파괴된 갭을 포함하는 갭머는 전형적으로 갭 영역의 5' 말단 또는 3' 말단에서 3 또는 4개 이상의 인접 DNA 뉴클레오사이드 영역을 보유한다.
갭-브레이커 올리고뉴클레오티드에 대한 예시적인 디자인은 다음을 포함한다:
F1-8-[D3-4-E1-D3-4]-F'1-8
F1-8-[D1-4-E1-D3-4]-F'1-8
F1-8-[D3-4-E1-D1-4]-F'1-8
이 때, 영역 G는 꺾쇠 [Dn-Er- Dm] 내부에 존재하고, D는 DNA 뉴클레오시드의 인접 서열이고, E는 변형된 뉴클레오시드 (갭-브레이커 또는 갭-파괴 뉴클레오시드)이고, F 및 F'는 본원에 정의된 연접 영역들이고, 단 갬머 영역들 F-G-F'의 전장은 12개 이상, 예컨대, 14개 이상 뉴클레오티드 길이이다.
일부 구체예들에서, 갭 파괴된 갭머의 영역 G는 6개 이상의 DNA 뉴클레오시드, 예컨대, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15 또는 16개 이상의 DNA 뉴클레오시드를 포함한다. 전술한 바와 같이, DNA 뉴클레오시드는 인접할 수 있거나 선택적으로 하나 이상의 변형된 뉴클레오시드가 산재될 수 있으며, 단 갭 영역 G는 RNase H 동원을 매개할 수 있다.
갭머-연접 영역들, F 및 F'
영역 F는 영역 G의 5' DNA 뉴클레오시드에 바로 인접하여 위치한다. 영역 F의 3'에 가장 가까운 뉴클레오시드는, 당 변형된 뉴클레오시드, 예컨대, 고 친화성 당 변형된 뉴클레오시드, 예를 들면, 2' 치환된 뉴클레오시드, 예컨대, MOE 뉴클레오시드, 또는 LNA 뉴클레오시드이다.
영역 F는 영역 G의 3' DNA 뉴클레오시드에 바로 인접하여 위치한다. 영역 F의 5'에 가장 가까운 뉴클레오시드는, 당 변형된 뉴클레오시드, 예컨대, 고 친화성 당 변형된 뉴클레오시드, 예를 들면, 2' 치환된 뉴클레오시드, 예컨대, MOE 뉴클레오시드, 또는 LNA 뉴클레오시드이다.
영역 F는 1-8개 인접 뉴클레오티드 길이, 예컨대, 2-6개, 예컨대, 3-4개 인접 뉴클레오티드 길이이다. 유리하게는 영역 F의 5'에 가장 가까운 뉴클레오시드는 당 변형된 뉴클레오시드이다. 일부 구체예들에서 영역 F의 5'에 가장 가까운 2개의 뉴클레오시드는 당 변형된 뉴클레오시드이다. 일부 구체예들에서 영역 F의 5'에 가장 가까운 뉴클레오시드는 LNA 뉴클레오시드이다. 일부 구체예들에서 영역 F의 5'에 가장 가까운 2개의 뉴클레오시드는 LNA 뉴클레오시드이다. 일부 구체예들에서 영역 F의 5'에 가장 가까운 2개의 뉴클레오시드는 2' 치환된 뉴클레오시드 뉴클레오시드, 예컨대, 2개의 3' MOE 뉴클레오시드이다. 일부 구체예들에서 영역 F의 5'에 가장 가까운 뉴클레오시드는 2' 치환된 뉴클레오시드, 예컨대, MOE 뉴클레오시드이다.
영역 F'는 2-8개 인접 뉴클레오티드 길이, 예컨대, 3-6개, 예컨대, 4-5개 인접 뉴클레오티드 길이이다. 유리하게는, 영역 F'의 3'에 가장 가까운 뉴클레오시드는 당 변형된 뉴클레오시드이다. 일부 구체예들에서 영역 F'의 3'에 가장 가까운 2개의 뉴클레오시드는 당 변형된 뉴클레오시드이다. 일부 구체예들에서 영역 F'의 3'에 가장 가까운 2개의 뉴클레오시드는 LNA 뉴클레오시드이다. 일부 구체예들에서 영역 F'의 3'에 가장 가까운 뉴클레오시드는 LNA 뉴클레오시드이다. 일부 구체예들에서 영역 F의 3'에 가장 가까운 2개의 뉴클레오시드는 2' 치환된 뉴클레오시드 뉴클레오시드, 예컨대, 2개의 3' MOE 뉴클레오시드이다. 일부 구체예들에서 영역 F의 3'에 가장 가까운 뉴클레오시드는 2' 치환된 뉴클레오시드, 예컨대, MOE 뉴클레오시드이다.
영역 F 또는 F '의 길이가 1일 때 이는 유리하게는 LNA 뉴클레오시드임을 주목해야 한다.
일부 구체예에서, 영역 F 및 F'는 독립적으로 당 변형된 뉴클레오시드의 인접 서열로 구성되거나 이를 포함한다. 일부 구체예들에서, 영역 F의 당 변형된 뉴클레오시드는 2'-O-알킬-RNA 단위, 2'-O-메틸-RNA, 2'-아미노-DNA 단위, 2'-플루오로-DNA 단위, 2'-알콕시-RNA, MOE 단위, LNA 단위, 아라비노 핵산 (ANA) 단위 및 2'-플루오로-ANA 단위에서 독립적으로 선택될 수 있다.
일부 구체예에서, 영역 F 및 F'는 독립적으로 LNA 및 2' 치환된 변형된 뉴클레오시드 (혼합형 윙 디자인)를 모두 포함한다.
일부 구체예에서, 영역 F 및 F'는 오직 한 유형의 당 변형된 뉴클레오시드, 예를 들어, MOE만 또는 베타-D-옥시 LNA만 또는 ScET만으로 구성된다. 이러한 디자인은 또한 균일 플랭크 또는 균일 갭머 디자인으로 명명된다.
일부 구체예에서, 영역 F 또는 F', 또는 F 및 F'의 모든 뉴클레오시드는, 예컨대 예컨대, 베타-D-옥시 LNA, ENA 또는 ScET 뉴클레오사이드로부터 독립적으로 선택된 LNA 뉴클레오시드이다. 일부 구체예들에서 영역 F는 1-5, 예컨대, 2-4, 예컨대, 3-4, 예컨대, 1, 2, 3, 4 또는 5개의 인접 LNA 뉴클레오시드로 구성된다. 일부 구체예에서, 영역 F 및 F'의 모든 뉴클레오시드는 베타-D-옥시 LNA 뉴클레오시드이다.
일부 구체예에서, 영역 F 또는 F', 또는 F 및 F'의 모든 뉴클레오시드는 2' 치환된 뉴클레오시드, 예컨대, OMe 또는 MOE 뉴클레오시드이다. 일부 구체예들에서 영역 F는 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 또는 8개 인접 OMe 또는 MOE 뉴클레오시드로 구성된다. 일부 구체예들에서 연접 영역들 중 하나만이 2' 치환된 뉴클레오시드, 예컨대, OMe 또는 MOE 뉴클레오시드로 구성될 수 있다. 일부 구체예들에서 2' 치환된 뉴클레오시드, 예컨대, OMe 또는 MOE 뉴클레오시드로 구성되는 것은 5' (F) 연접 영역인 반면, 3' (F') 연접 영역은 하나 이상의 LNA 뉴클레오시드, 예컨대, 베타-D-옥시 LNA 뉴클레오시드 또는 cET 뉴클레오시드를 포함한다. 일부 구체예들에서 2' 치환된 뉴클레오시드, 예컨대, OMe 또는 MOE 뉴클레오시드로 구성되는 것은 3' (F) 연접 영역인 반면, 5' (F') 연접 영역은 하나 이상의 LNA 뉴클레오시드, 예컨대, 베타-D-옥시 LNA 뉴클레오시드 또는 cET 뉴클레오시드를 포함한다.
일부 구체예들에서, 영역 F 및 F'의 변형된 뉴클레오시드 모두는, 예컨대, 베타-D-옥시 LNA, ENA 또는 ScET 뉴클레오시드에서 독립적으로 선택된 LNA 뉴클레오시드이고, 이 때, 영역 F 또는 F', 또는 F 및 F'는 선택적으로 DNA 뉴클레오시드를 포함할 수 있다 (교번 연접, 자세한 내용은 이들의 정의 참고). 일부 구체예들에서, 영역 F 및 F'의 변형된 뉴클레오시드 모두는 베타-D-옥시 LNA 뉴클레오시드이고, 이 때, 영역 F 또는 F', 또는 F 및 F'는 선택적으로 DNA 뉴클레오시드를 포함할 수 있다 (교번 연접, 자세한 내용은 이들의 정의 참고).
일부 구체예들에서 영역 F 및 F'의 5'에 가장 가까운 그리고 3'에 가장 가까운 뉴클레오시드는 LNA 뉴클레오시드, 예컨대, 베타-D-옥시 LNA 뉴클레오시드 또는 ScET 뉴클레오시드이다.
일부 구체예들에서, 영역 F와 영역 G 사이의 뉴클레오시드간 연결은 포스포로티오에이트 뉴클레오시드간 연결이다. 일부 구체예들에서, 영역 F'와 영역 G 사이의 뉴클레오시드간 연결은 포스포로티오에이트 뉴클레오시드간 연결이다. 일부 구체예들에서, 영역 F 또는 F', F 및 F'의 뉴클레오시드들 사이의 뉴클레오시드간 연결은 포스포로티오에이트 뉴클레오시드간 연결이다.
LNA 갭머
LNA 갭머는 영역 F 및 F' 중 하나 또는 둘 모두가 LNA 뉴클레오시드를 포함하거나 이들로 구성된 갭머이다. 베타-D-옥시 갭머는 영역 F 및 F' 중 하나 또는 둘 모두가 베타-D-옥시 LNA 뉴클레오시드를 포함하거나 이들로 구성된 갭머이다.
일부 구체예들에서 LNA 갭머의 화학식은 다음과 같다: [LNA]1-5-[영역 G]-[LNA]1-5, 이 때, 영역 G는 갭머 영역 G 정의에서 정의된 바와 같다.
한 구체예에서 LNA 갭머는 화학식 [LNA]4-[영역 G]10-12-[LNA]4이다.
MOE 갭머
MOE 갭머는 영역 F 및 F'가 MOE 뉴클레오시드로 구성된 갭머이다. 일부 구체예들에서 MOE 갭머의 디자인은 [MOE]1-8-[영역 G]5-16-[MOE]1-8, 예컨대, [MOE]2-7-[영역 G]6-14-[MOE]2-7, 예컨대, [MOE]3-6-[영역 G]8-12-[MOE]3-6이고, 이 때, 영역 G는 갭머 정의에서 정의된 바와 같다. 5-10-5 디자인 (MOE-DNA-MOE)의 MOE 갭머가 해당 분야에서 널리 사용되어 왔다.
혼합형 윙 갭머
혼합형 윙 갭머는 LNA 갭머이고 이 때, 영역 F 및 F' 중 하나 또는 둘 모두는 2'-O-알킬-RNA 단위, 2'-O-메틸-RNA, 2'-아미노-DNA 단위, 2'-플루오로-DNA 단위, 2'-알콕시-RNA, MOE 단위, 아라비노 핵산 (ANA) 단위 및 2'-플루오로-ANA 단위, 예컨대, MOE 뉴클레오시드로 구성된 군에서 독립적으로 선택된 2' 치환된 뉴클레오시드, 예컨대, 2' 치환된 뉴클레오시드를 포함한다. 영역 F 및 F' 중 하나 이상, 또는 영역 F 및 F' 둘 모두가 하나 이상의 LNA 뉴클레오시드를 포함하는 일부 구체예에서, 영역 F 및 F'의 나머지 뉴클레오시드는 MOE 및 LNA로 구성된 군에서 독립적으로 선택된다. 영역 F 및 F' 중 하나 이상, 또는 영역 F 및 F' 둘 모두가 둘 이상의 LNA 뉴클레오시드를 포함하는 일부 구체예에서, 영역 F 및 F'의 나머지 뉴클레오시드는 MOE 및 LNA로 구성된 군에서 독립적으로 선택된다. 일부 혼합형 윙 구체예에서, 영역 F 및 F' 중 하나 또는 둘 모두는 하나 이상의 DNA 뉴클레오시드를 추가로 포함할 수 있다.
혼합형 윙 갭머 디자인은 WO2008/049085 및 WO2012/109395에 개시되어 있으며, 이들 모두는 본원에 참고문헌으로 포함된다.
교번 플랭크 갭머
연접 영역은 LNA 및 DNA 뉴클레오시드를 모두 포함할 수 있으며, LNA-DNA-LNA 뉴클레오시드의 교번 모티프를 포함하므로 "교번 플랭크"로 지칭된다. 이러한 교번 플랭크를 포함하는 갭머를 "교번 플랭크 갭머"라 지칭한다. "교번 플랭크 갭머"는 LNA 갭머 올리고뉴클레오티드로서 이 때, 플랭크 (F 또는 F') 중 하나 이상은 LNA 뉴클레오시드(들) 이외에 DNA를 포함한다. 일부 구체예들에서 영역 F 또는 F' 중 하나 이상, 또는 영역 F 및 F' 모두는, LNA 뉴클레오시드 및 DNA 뉴클레오시드 모두를 포함한다. 이러한 구체예에서, 연접 영역 F 또는 F', 또는 F 및 F' 모두는 3개 이상의 뉴클레오시드를 포함하고, 이 때, F 및/또는 F' 영역의 5' 및 3'에 가장 가까운 뉴클레오시드는 LNA 뉴클레오시드이다.
교번 플랭크 LNA 갭머는 WO2016/127002에 개시되어 있다.
교번 플랭크 영역은 최대 3개 인접 DNA 뉴클레오시드, 예컨대, 1 내지 2개, 또는 1, 2 또는 3개 인접 DNA 뉴클레오시드를 포함할 수 있다.
이러한 교번 플랭크는 LNA 뉴클레오시드 (L)의 수, 이에 이어 DNA 뉴클레오시드 (D)의 수를 나타내는 일련의 정수들로 주석처리될 수 있으며, 예를 들면 다음과 같다:
[L]1-3-[D]1-4-[L]1-3
[L]1-2-[D]1-2-[L]1-2-[D]1-2-[L]1-2
올리고뉴클레오티드 디자인에서 이들은 종종 숫자들로 나타내어질 것이고, 그리하여 2-2-1은 5' [L]2-[D]2-[L] 3'를 나타내고, 1-1-1-1-1은 5' [L]-[D]-[L]-[D]-[L] 3'를 나타낸다. 교번 플랭크를 가지는 올리고뉴클레오티드에서 플랭크 (영역 F 및 F')의 길이는 독립적으로 3 내지 10개의 뉴클레오시드, 예컨대, 4 내지 8개, 예컨대, 5 내지 6개의 뉴클레오시드, 예컨대, 4, 5, 6 또는 7개 변형된 뉴클레오시드일 수 있다. 일부 구체예에서 갭머 올리고뉴클레오티드의 플랭크 중 하나만이 교번인 반면, 다른 하나는 LNA 뉴클레오티드로 구성된다. 추가적인 엑소뉴클레아제 내성을 부여하기 위해 3' 플랭크 (F')의 3' 말단에 2개 이상의 LNA 뉴클레오시드를 갖는 것이 유리할 수 있다. 한 구체예에서 교번 플랭크 갭머의 플랭크는 전장이 5내지 8개의 뉴클레오시드이고 이 중 3 내지 5개는 LNA 뉴클레오시드이다. 교번 플랭크를 가지는 올리고뉴클레오티드의 일부 예는 다음과 같다:
[L]1-5-[D]1-4-[L]1-3-[G]5-16-[L]2-6
[L]1-2-[D]2-3-[L]3-4-[G]5-7-[L]1-2-[D]2-3-[L]2-3
[L]1-2-[D]1-2-[L]1-2-[D]1-2-[L]1-2-[G]5-16-[L]1-2-[D]1-3-[L]2-4
[L]1-5-[G]5-16-[L]-[D]-[L]-[D]-[L]2
[L]4-[G]6-10-[L]-[D]3-[L]2
단, 갭머의 전장은 12개 이상, 예컨대, 14개 이상의 뉴클레오티드 길이이다.
올리고뉴클레오티드의 영역 D' 또는 D"
본 발명의 올리고뉴클레오티드는 일부 구체예들에서 표적 핵산에 상보적인 올리고뉴클레오티드의 인접 뉴클레오티드 서열, 예컨대, 갭머 F-G-F', 및 추가 5' 및/또는 3' 뉴클레오시드를 포함하거나 이들로 구성될 수 있다. 추가 5' 및/또는 3' 뉴클레오시드는 표적 핵산에 완전히 상보적이거나 완전히 상보적이지는 않을 수 있다. 이러한 추가 5' 및/또는 3' 뉴클레오시드는 본원에서 영역 D' 및 D"으로 지칭될 수 있다.
영역 D' 는 D"의 첨가는 갭머와 같은 인접 뉴클레오티드 서열을 접합체 모이어티 또는 또 다른 작용기에 연결하기 위한 목적으로 사용될 수 있다. 이것이 인접 뉴클레오티드 서열을 접합체 모이어티와 연결하기 위해 사용되는 경우, 이는 생분해성 연결기로 기능할 수 있다. 대안적으로, 이는 엑소뉴클레아제 보호를 제공하거나 합성 또는 제조의 용이성을 위해 사용될 수 있다.
영역 D' 및 D"는 각각 영역 F의 5' 말단 또는 영역 F'의 3' 말단에 부착되어, 다음 식 D'-F-G-F', F-G-F'-D" 또는 D'-F-G-F'-D"의 디자인을 생성할 수 있다. 이 경우 F-G-F'는 올리고뉴클레오티드의 갭머 부분이고 영역 D' 또는 D"는 올리고뉴클레오티드의 별도 부분을 구성한다.
영역 D' 또는 D"는 표적 핵산에 상보적이거나 비-상보적일 수 있는 1, 2, 3, 4 또는 5개의 추가 뉴클레오티드를 독립적으로 포함하거나 이들로 구성될 수 있다. F 또는 F' 영역에 인접한 뉴클레오티드는 당 변형된 뉴클레오티드, 예컨대, 이의 DNA 또는 RNA 또는 염기 변형된 형태가 아니다. D' 또는 D' 영역은 뉴클레아제에 민감한 생분해성 연결기로 작용할 수 있다 (연결기 정의 참조). 일부 구체예들에서 또 다른 5' 및/또는 3' 말단 뉴클레오티드는 포스포디에스테르 연결로 연결되며, DNA 또는 RNA이다. 영역 D' 또는 D"로서 사용하기에 적합한 뉴클레오티드 기반 생분해성 연결기는 WO2014/076195에 개시되어 있으며, 이는 예로서 포스포디에스테르 연결된 DNA 디뉴클레오티드를 포함한다. 폴리-올리고뉴클레오티드 구조체에서 생분해성 연결기의 사용은 WO2015/113922에 개시되어 있으며, 이 때, 이들은 단일 올리고뉴클레오티드 내에서 다수의 안티센스 구조체들 (예컨대, 갭머 영역)을 연결하는데 사용된다.
한 구체예에서 본 발명의 올리고뉴클레오티드는 갭머를 구성하는 인접 뉴클레오티드 서열 이외에 영역 D' 및/또는 D"를 포함한다.
일부 구체예들에서, 본 발명의 올리고뉴클레오티드는 다음 식으로 나타낼 수 있다:
F-G-F'; 특히, F2-8-G6-16-F'2-8
D'-F-G-F', 특히, D'2-3-F1-8-G6-16-F'2-8
F-G-F'-D", 특히, F2-8-G6-16-F'2-8-D"1-3
D'-F-G-F'-D", 특히, D'1-3- F2-8-G6-16-F'2-8-D"1-3
일부 구체예들에서 영역 D'와 영역 F 사이에 위치한 뉴클레오시드간 연결은 포스포디에스테르 연결이다. 일부 구체예들에서 영역 F'와 영역 D" 사이에 위치한 뉴클레오시드간 연결은 포스포디에스테르 연결이다.
접합체
본원에서 사용된 용어 접합체는 비-뉴클레오티드 모이어티 (접합체 모이어티 또는 영역 C 또는 제 3 영역)에 공유적으로 연결된 올리고뉴클레오티드를 지칭한다.
본 발명의 올리고뉴클레오티드를 하나 이상의 비-뉴클레오티드 모이어티에 접합하면, 예를 들어, 올리고뉴클레오티드의 활성, 세포 분포, 세포 흡수 또는 안정성에 영향을 줌으로써 올리고뉴클레오티드의 약리학을 개선할 수 있다. 일부 구체예에서, 접합체 모이어티는 올리고뉴클레오티드의 세포 분포, 생체 이용률, 대사, 배설, 투과성 및/또는 세포 흡수를 개선함으로써 올리고뉴클레오티드의 약동학적 특성을 변형하거나 향상시킨다. 특히, 접합체는 올리고뉴클레오티드를 특정 기관, 조직 또는 세포 유형에 표적하여 해당 기관, 조직 또는 세포 유형에서 올리고뉴클레오티드의 효과를 향상시킬 수 있다. 동시에, 접합체는 비-표적 세포 유형, 조직 또는 기관에서 올리고뉴클레오티드의 활성, 예를 들어, 비-표적 세포 유형, 조직 또는 기관에서의 오프 타겟 활성 또는 활성을 감소시키는 역할을 할 수 있다.
올리고뉴클레오티드 접합체 및 이의 합성은 또한 Manoharan의 Antisense Drug Technology, Principles, Strategies, and Applications, S.T. Crooke, ed., Ch. 16, Marcel Dekker, Inc., 2001 및 Manoharan, Antisense and Nucleic Acid Drug Development, 2002, 12, 103에 종합 고찰에 보고된 바 있으며, 이들 각각은 본 명세서에 그 전문이 참고문헌으로 포함된다.
한 구체예에서, 비-뉴클레오티드 모이어티 (접합체 모이어티)는 탄수화물 (예컨대, GalNAc), 세포 표면 수용체 리간드, 약물 물질, 호르몬, 친유성 물질, 중합체, 단백질, 펩티드, 독소 (예컨대, 박테리아 독소), 비타민, 바이러스성 단백질 (예컨대, 캡시드) 또는 이들의 조합으로 구성된 군에서 선택된다.
일부 구체예에서, 접합체는 예를 들어 참고문헌으로 포함된 WO 2012/143379에 개시된 바와 같은 트랜스페린 수용체에 대한 특이적 친화성을 갖는 항체 또는 항체 단편이다. 일부 구체예에서 비-뉴클레오티드 모이어티는 항체 또는 항체 단편, 예컨대 혈액-뇌-장벽을 통한 전달을 촉진하는 항체 또는 항체 단편, 특히, 트랜스페린 수용체를 표적하는 항체 또는 항체 단편이다.
연결기
연결 또는 연결기는 하나 이상의 공유 결합을 통해 하나의 관심 화학 기 또는 세그먼트를 또 다른 관심 화학 기 또는 세그먼트에 연결하는 두 원자 사이의 연결이다. 접합체 모이어티는 직접적으로 또는 연결 모이어티 (예컨대, 연결기 또는 테더)를 통해 올리고뉴클레오티드에 부착될 수 있다. 연결기는 제 3 영역, 예를 들어, 접합체 모이어티 (영역 C)를 제 1 영역, 예를 들어, 표적 핵산 (영역 A)에 상보적인 올리고뉴클레오티드 또는 인접 뉴클레오티드 서열에 공유적으로 연결하는 역할을 한다.
본 발명의 일부 구체예에서, 본 발명의 접합체 또는 올리고뉴클레오티드 접합체는 선택적으로 표적 핵산 (영역 A 또는 제 1 영역)에 상보적인 올리고뉴클레오티드 또는 인접 뉴클레오티드 서열과 접합체 모이어티 (영역 C 또는 제 3 영역) 사이에 위치하는 연결기 영역 (제 2 영역 또는 영역 B 및/또는 영역 Y)을 포함할 수 있다.
영역 B는 통상적으로 만나게 되는 또는 포유동물 신체 내부에서 만나게 되는 조건과 유사한 조건하에서 절단가능한 생리학적으로 불안정한 결합을 포함하는 또는 이러한 결합으로 구성된 생분해성 연결기를 지칭한다. 생리학적으로 불안정한 연결기가 화학적 변형 (예컨대, 절단)을 거치게 되는 조건에는 화학적 조건, 예컨대, pH, 온도, 산화 또는 환원 조건 또는 물질, 포유동물 세포에서 발견되거나 만나게 되는 것과 유사한 염 농도가 포함된다. 포유류 세포내 조건은 또한 단백질분해 효소 또는 가수분해 효소 또는 뉴클레아제와 같은 포유동물 세포에 정상적으로 존재하는 효소 활성의 존재를 포함한다. 한 구체예에서 생분해성 연결기는 S1 뉴클레아제 절단에 민감하다. 바람직한 구체예에서, 뉴클레아제 민감성 연결기는 2개 이상의 연속 포스포디에스테르 연결, 예컨대, 3 또는 4 또는 5개 이상의 연속 포스포디에스테르 연결을 포함하는 1 내지 10개의 뉴클레오시드, 예컨대, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 또는 10개의 뉴클레오시드, 더욱 바람직하게는 2 내지 6개의 뉴클레오시드, 가장 바람직하게는 2 내지 4개 연결된 뉴클레오시드를 포함한다. 바람직하게는 뉴클레오시드는 DNA 또는 RNA이다. 생분해성 연결기를 함유하는 포스포디에스테르는 WO 2014/076195 (본원에 참고로 포함됨)에 보다 상세히 설명되어 있다.
영역 Y는 반드시 생분해성일 필요는 없지만 주로 접합체 모이어티 (영역 C 또는 제 3 영역)를 올리고뉴클레오티드 (영역 A 또는 제 1 영역)에 공유 연결하는 역할을 하는 연결기를 의미한다. 영역 Y 연결기는 사슬 구조 또는 반복 단위의 올리고머, 예컨대, 에틸렌 글리콜, 아미노산 단위 또는 아미노 알킬 기를 포함할 수 있다. 본 발명의 올리고뉴클레오티드 접합체는 다음과 같은 영역 요소들 A-C, A-B-C, A-B-Y-C, A-Y-B-C 또는 A-Y-C로 구성될 수 있다. 일부 구체예들에서 연결기 (영역 Y)는 아미노 알킬, 예컨대, 예를 들면 C6 내지 C12 아미노 알킬 기를 비롯한 C2-C36 아미노 알킬 기이다. 바람직한 구체예에서 연결기 (영역 Y)는 C6 아미노 알킬 기이다.
치료
본원에서 사용된 용어 '치료'는 기존 질환 (예를 들어, 본원에서 언급되는 질환 또는 장애)의 치료 또는 질환의 방지, 즉, 예방을 모두 지칭한다. 따라서, 본원에 언급된 치료는 일부 구체예에서 예방적일 수 있는 것으로 인정될 것이다.
일부 구체예들에서 치료는 신경계 장애, 예컨대, 타우병증, 알츠하이머 병 (AD), 진행성 핵상 마비 (PSP), 피질기저핵 신경절 변성 (CBD), 만성 외상성 뇌병증 (CTE), 전두-측두엽 치매 (FTD) 및 염색체 17과 연관된 파킨슨병이 있는 FTD (FTDP-17), 피크병 (PiD), 은친화입자병 (AGD), 매듭-우세 노인성 치매 (TPSD), 원발성 노화-관련 타우병증 (PART), 다운 증후군 및 라이티코-보딕 질환을 비롯한 신경퇴행성 질환들로 구성된 군에서 선택된 신경계 장애를 진단받은 바 있는 환자에서 실시된다. 병리학적 Tau의 상향조절은 일측성 거대뇌증 (HME), 결절성 경화증 복합체, 국소 피질 형성이상 2b형; 및 신경절교종을 비롯한 영아 타우병증과 관련되어 있다. 또한, 비정상적인 Tau 발현 및/또는 기능은 또한 뇌철 축적 1형 (NBIA1), 신경절 세포종 및 아급성 경화성 범뇌염을 동반한 신경퇴행으로도 알려진 할러포르덴-스파츠 증후군과 같은 다른 질환과 관련될 수 있다. Tau는 또한 발작 장애 (예컨대, 간질), 네트워크 기능장애 (예컨대, 우울증) 및 운동 장애 (예컨대, 파킨슨 병)에서 역할을 할 수 있다.
발명의 상세한 설명
본 발명의 올리고뉴클레오티드
본 발명은 Tau의 발현을 조절, 예컨대, Tau를 억제 (하향 조절)할 수 있는 올리고뉴클레오티드에 관한 것이다. 이러한 조절은 Tau를 인코드하는 표적 핵산에 혼성화함으로써 이루어진다. 표적 핵산은 포유동물 MAPT mRNA 서열, 예컨대, 서열식별번호: 1 및 2로 구성된 군으로부터 선택된 서열일 수 있다.
본 발명의 올리고뉴클레오티드는 MAPT를 표적하여 Tau 발현을 감소시키는 안티센스 올리고뉴클레오티드이다.
일부 구체예에서 본 발명의 안티센스 올리고뉴클레오티드는 표적을 억제하거나 하향-조절함으로써 표적의 발현을 조절할 수 있다. 바람직하게는, 이러한 조절은 표적의 정상 발현 수준에 비해 적어도 20%의 발현 억제, 더욱 바람직하게는 적어도 30%, 적어도 40%, 적어도 50%, 적어도 60%, 적어도 70%, 적어도 80%, 또는 적어도 90%의 억제를 가져온다. 일부 구체예들에서 본 발명의 올리고뉴클레오티드는 5 μM 올리고뉴클레오티드를 1차 신경 세포에 처리한 후 Tau mRNA의 발현 수준을 적어도 60% 또는 70% 시험관내 억제할 수 있다. 일부 구체예들에서 본 발명의 화합물은 0.5 μM 올리고뉴클레오티드를 1차 신경 세포에 처리한 후 Tau 단백질의 발현 수준을 적어도 50% 시험관내 억제할 수 있다. 적합하게는, 실시예들은 Tau RNA 또는 단백질 억제를 측정함에 사용될 수 있는 분석법을 제공한다 (예컨대, 실시예 1 및 3). 표적 조절은 올리고뉴클레오티드의 인접 뉴클레오티드 서열과 표적 핵산 사이의 혼성화에 의해 유발된다. 일부 구체예에서 본 발명의 올리고뉴클레오티드는 올리고뉴클레오티드와 표적 핵산 사이의 미스매치를 포함한다. 미스매치에도 불구하고 표적 핵산에 대한 혼성화는 원하는 Tau 발현 조절을 보여주기에 여전히 충분할 수 있다. 미스매치로 인한 결합 친화력 감소는 올리고뉴클레오티드 내 뉴클레오티드 수의 증가 및/또는 올리고뉴클레오티드 서열 내부에 존재하는 표적에 대한 결합 친화성을 증가시킬 수 있는 변형된 뉴클레오시드, 예컨대, LNA를 비롯한 2' 당 변형된 뉴클레오시드 수의 증가에 의해 보충될 수 있다.
본 발명의 한 양상은 서열식별번호: 3, 4 또는 5에 대해 적어도 90%의 상보성을 갖는 10개 이상의 뉴클레오티드 길이의 인접 뉴클레오티드 서열을 포함하는 안티센스 올리고뉴클레오티드에 관한 것이다.
일부 구체예들에서, 올리고뉴클레오티드는 10 내지 30개의 뉴클레오티드 길이의 인접 서열을 포함하며, 이는 표적 핵산 또는 표적 서열의 영역과 적어도 90% 상보적, 예컨대, 적어도 91%, 예컨대, 적어도 92%, 예컨대, 적어도 93%, 예컨대, 적어도 94%, 예컨대, 적어도 95%, 예컨대, 적어도 96%, 예컨대, 적어도 97%, 예컨대, 적어도 98%, 또는 100% 상보적이다.
본 발명의 올리고뉴클레오티드 또는 이의 인접 뉴클레오티드 서열이 표적 핵산의 영역에 대해 완전히 상보적 (100% 상보적)이거나 일부 구체예에서 올리고뉴클레오티드와 표적 핵산 사이에 1 또는 2개의 미스매치를 포함할 수 있는 경우 유리하다.
일부 구체예들에서 올리고뉴클레오티드는 서열식별번호: 1의 위치 12051 내지 12111, 39562 내지 39593 또는 72837 내지 72940 내부의 인접 뉴클레오티드에 대해 적어도 90% 상보적, 예컨대, 완전히 (또는 100%) 상보적인, 10 내지 30개 뉴클레오티드의 인접 뉴클레오티드 서열을 포함한다.
일부 구체예에서 올리고뉴클레오티드 서열은 서열식별번호: 1 및 서열식별번호: 2에 존재하는 상응하는 표적 핵산 영역에 100% 상보적이다.
안티센스 올리고뉴클레오티드가 표 4에 나열된 영역 중 하나에서 선택된 표적 서열에 상보적인 경우 유리하다. 일부 구체예들에서 안티센스 올리고뉴클레오티드의 인접 뉴클레오티드 서열은 R1-R2254에서 선택된 표적 서열에 적어도 90% 상보적, 예컨대, 완전히 상보적이다 (표 4). 일부 구체예들에서 올리고뉴클레오티드 서열은 R_223, R_738 또는 R_1298에 100% 상보적이다 (표 4 참고).
일부 구체예에서, 올리고뉴클레오티드 또는 인접 뉴클레오티드 서열은 표적 핵산의 영역에 대해 90% 상보적, 예컨대, 완전히 상보적이고, 이 때, 표적 핵산 영역은 서열식별번호: 1의 위치 12051-12111로 구성된 군에서 선택되는데, 예컨대, 서열식별번호: 1의 위치 12051-12079, 위치 12085-12111 또는 위치 12060-12078이다.
또 다른 구체예에서, 올리고뉴클레오티드 또는 인접 뉴클레오티드 서열은 표적 핵산의 영역에 대해 90% 상보적, 예컨대 완전히 상보적이고, 여기서, 표적 핵산 영역은 서열식별번호: 1의 위치 39562-39593으로 구성된 군에서 선택되는데, 예컨대, 서열식별번호: 1의 위치 39573-39592이다.
또 다른 구체예에서, 올리고뉴클레오티드 또는 인접 뉴클레오티드 서열은 표적 핵산 영역에 90% 상보적, 예컨대, 완전히 상보적이고, 이 때, 표적 핵산 영역은 서열식별번호: 1의 위치 72837-72940으로 구성된 군에서 선택되는데, 예컨대, 서열식별번호: 1의 위치 72861-72891 또는 위치 72862-72890이다.
일부 구체예들에서 올리고뉴클레오티드는 서열식별번호: 1의 위치 12060-12078 또는 39573-39592 또는 72862-72890 내부의 인접 뉴클레오티드에 대해 100% 상보적인, 16 내지 22개 뉴클레오티드, 예컨대, 16 내지 20개의 뉴클레오티드 길이의 인접 뉴클레오티드 서열을 포함한다.
일부 구체예들에서, 본 발명의 올리고뉴클레오티드는 10 내지 35 개 길이의 뉴클레오티드, 예컨대, 10 내지 30 개, 예컨대, 11 내지 25 개, 예컨대, 12 내지 22 개, 예컨대, 14 내지 20 개 또는 14 내지 18 개 길이의 인접 뉴클레오티드를 포함하거나 이들로 구성된다. 한 구체예에서, 올리고뉴클레오티드는 16 내지 22 개 길이의 뉴클레오티드를 포함하거나 이들로 구성된다. 바람직한 구체예에서, 올리고뉴클레오티드는 16 내지 20 개 길이의 뉴클레오티드를 포함하거나 이들로 구성된다.
일부 구체예에서, 올리고뉴클레오티드 또는 이의 인접 뉴클레오티드 서열은 22개 이하 길이의 뉴클레오티드, 예컨대 20개 이하의 뉴클레오티드, 예컨대 16, 17, 18, 19 또는 20개 뉴클레오티드를 포함하거나 이들로 구성된다. 본 명세서에 주어진 임의의 범위는 범위 종점을 포함하는 것으로 이해되어야 한다. 따라서, 올리고뉴클레오티드가 10 내지 30 개의 뉴클레오티드를 포함한다고 말하면, 10 개 및 30 개의 뉴클레오티드가 모두 포함된다.
일부 구체예들에서, 인접 뉴클레오티드 서열은 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29 또는 30개 길이의 인접 뉴클레오티드를 포함하거나 이들로 구성된다. 바람직한 구체예에서, 올리고뉴클레오티드는 16, 17, 18, 19 또는 20 개 길이의 뉴클레오티드를 포함하거나 이들로 구성된다.
일부 구체예에서, 올리고뉴클레오티드 또는 인접 뉴클레오티드 서열은 표 5 (재료 및 방법 섹션)에 나열된 서열로 구성된 군에서 선택된 서열을 포함하거나 이들로 구성된다.
일부 구체예에서, 안티센스 올리고뉴클레오티드 또는 인접 뉴클레오티드 서열은 서열식별번호: 6 내지 65로 구성된 군에서 선택된 서열에 대해 적어도 90%의 동일성, 바람직하게는 100% 동일성을 갖는 10 내지 30개의 뉴클레오티드를 포함하거나 이들로 구성된다 (표 5에 나열된 모티프 서열 참조).
일부 구체예에서, 안티센스 올리고뉴클레오티드 또는 인접 뉴클레오티드 서열은 서열식별번호: 9, 11, 49, 53, 56 및 62로 구성된 군에서 선택된 서열에 대해 적어도 90%의 동일성, 바람직하게는 100% 동일성을 갖는 10 내지 30개의 뉴클레오티드를 포함하거나 이들로 구성된다 (표 5에 나열된 모티프 서열 참조).
일부 구체예에서, 안티센스 올리고뉴클레오티드 또는 인접 뉴클레오티드 서열은 서열식별번호: 6 내지 37로 구성된 군에서 선택된 서열에 대해 적어도 90%의 동일성, 바람직하게는 100% 동일성을 갖는 10 내지 30개의 뉴클레오티드를 포함하거나 이들로 구성된다 (표 5에 나열된 모티프 서열 참조).
일부 구체예에서, 안티센스 올리고뉴클레오티드 또는 인접 뉴클레오티드 서열은 서열식별번호: 9 또는 11의 서열에 대해 적어도 90%의 동일성, 바람직하게는 100% 동일성을 갖는 10 내지 30개의 뉴클레오티드를 포함하거나 이들로 구성된다 (표 5에 나열된 모티프 서열 참조).
일부 구체예에서, 안티센스 올리고뉴클레오티드 또는 인접 뉴클레오티드 서열은 서열식별번호: 38 내지 51로 구성된 군에서 선택된 서열에 대해 적어도 90%의 동일성, 바람직하게는 100% 동일성을 갖는 10 내지 30개의 뉴클레오티드를 포함하거나 이들로 구성된다 (표 5에 나열된 모티프 서열 참조).
일부 구체예에서, 안티센스 올리고뉴클레오티드 또는 인접 뉴클레오티드 서열은 서열식별번호: 49 또는 51의 서열에 대해 적어도 90%의 동일성, 바람직하게는 100% 동일성을 갖는 10 내지 30개의 뉴클레오티드를 포함하거나 이들로 구성된다 (표 5에 나열된 모티프 서열 참조).
일부 구체예에서, 안티센스 올리고뉴클레오티드 또는 인접 뉴클레오티드 서열은 서열식별번호: 52 내지 65로 구성된 군에서 선택된 서열에 대해 적어도 90%의 동일성, 바람직하게는 100% 동일성을 갖는 10 내지 30개의 뉴클레오티드를 포함하거나 이들로 구성된다 (표 5에 나열된 모티프 서열 참조).
일부 구체예에서, 안티센스 올리고뉴클레오티드 또는 인접 뉴클레오티드 서열은 서열식별번호: 56 또는 62의 서열에 대해 적어도 90%의 동일성, 바람직하게는 100% 동일성을 갖는 10 내지 30개의 뉴클레오티드를 포함하거나 이들로 구성된다 (표 5에 나열된 모티프 서열 참조).
인접 핵염기 서열 (모티프 서열)은 예를 들어, 뉴클레아제 내성 및/또는 표적 핵산에 대한 결합 친화성을 증가시키기 위해 변형될 수 있는 것으로 이해된다.
변형된 뉴클레오시드 (예컨대, 고 친화성 변형된 뉴클레오시드)가 올리고뉴클레오티드 서열에 통합되는 패턴을 일반적으로 올리고뉴클레오티드 디자인이라고 한다.
본 발명의 올리고뉴클레오티드는 변형된 뉴클레오시드 및 DNA 뉴클레오시드로 디자인된다. 유리하게는, 고 친화성 변형된 뉴클레오시드가 사용된다.
한 구체예에서, 올리고뉴클레오티드는 1개 이상의 변형된 뉴클레오시드, 예컨대, 2개 이상, 3개 이상, 4개 이상, 5개 이상, 6개 이상, 7개 이상, 8개 이상, 9개 이상, 10개 이상, 11개 이상, 12개 이상, 13개 이상, 14개 이상, 15개 이상 또는 16개 이상의 변형된 뉴클레오시드를 포함한다. 한 구체예에서, 올리고뉴클레오티드는 1 내지 10 개의 변형된 뉴클레오시드, 예컨대 2 내지 9 개의 변형된 뉴클레오시드, 예컨대 3 내지 8 개의 변형된 뉴클레오시드, 예컨대 4 내지 7 개의 변형된 뉴클레오시드, 예컨대 6 또는 7 개의 변형된 뉴클레오시드를 포함한다. 적합한 변형은 "정의" 섹션의 "변형된 뉴클레오시드", "고 친화성 변형된 뉴클레오시드", "당 변형", "2' 당 변형" 및 "잠금 핵산 (LNA)"에 설명되어 있다.
한 구체예에서, 올리고뉴클레오티드는 하나 이상의 당 변형된 뉴클레오시드, 예컨대, 2' 당 변형된 뉴클레오시드를 포함한다. 바람직하게는 본 발명의 올리고뉴클레오티드는 2'-O-알킬-RNA, 2'-O-메틸-RNA, 2'-알콕시-RNA, 2'-O-메톡시에틸-RNA, 2'-아미노-DNA, 2'-플루오로-DNA, 아라비노 핵산 (ANA), 2'-플루오로-ANA 및 LNA 뉴클레오시드로 구성된 군에서 독립적으로 선택된 하나 이상의 2' 당 변형된 뉴클레오시드를 포함한다. 하나 이상의 변형된 뉴클레오시드 (들)가 잠금 핵산 (LNA)인 경우 유리하다.
추가 구체예에서 올리고뉴클레오티드는 하나 이상의 변형된 뉴클레오시드간 연결을 포함한다. 적합한 뉴클레오시드간 변형은 "정의" 섹션에 "변형된 뉴클레오시드간 연결"에 설명되어 있다. 인접 뉴클레오티드 서열 내부의 적어도 75%, 예컨대, 80%, 예컨대, 모든 뉴클레오시드간 연결이 포스포로티오에이트 또는 보라노포스페이트 뉴클레오시드간 연결인 경우 유리하다. 일부 구체예에서 올리고뉴클레오티드의 인접 서열 내 모든 뉴클레오티드간 연결은 포스포로티오에이트 연결이다.
일부 구체예에서, 본 발명의 올리고뉴클레오티드는 하나 이상의 LNA 뉴클레오시드, 예컨대 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 또는 8 개의 LNA 뉴클레오시드, 예컨대 2 내지 6 개의 LNA 뉴클레오시드, 예컨대 3 내지 7 개의 LNA 뉴클레오시드, 4 내지 8 개의 LNA 뉴클레오시드 또는 3, 4, 5, 6, 7 또는 8 개의 LNA 뉴클레오시드를 포함한다. 일부 구체예들에서, 올리고뉴클레오티드 내 변형된 뉴클레오시드의 적어도 75%가 LNA 뉴클레오시드이고, 예컨대, 변형된 뉴클레오시드의 80%, 예컨대, 85%, 예컨대, 90%가 LNA 뉴클레오시드, 특히, 베타-D-옥시 LNA 또는 ScET이다. 추가 구체예에서 올리고뉴클레오티드의 모든 변형된 뉴클레오시드는 LNA 뉴클레오시드이다. 추가 구체예에서, 올리고뉴클레오티드는 베타-D-옥시-LNA, 및 하나 이상의 다음 LNA 뉴클레오시드 모두를 포함할 수 있다: 베타-D 또는 알파-L 입체형태 중 하나 또는 이의 조합의 티오-LNA, 아미노-LNA, 옥시-LNA, ScET 및/또는 ENA. 추가 구체예에서, 모든 LNA 시토신 단위는 5-메틸-시토신이다. 올리고뉴클레오티드 또는 인접 뉴클레오티드 서열의 뉴클레아제 안정성에 있어서 뉴클레오티드 서열의 5' 말단에 1개 이상의 LNA 뉴클레오시드 및 3' 말단에 2개 이상의 LNA 뉴클레오시드를 가지는 것이 유리하다.
본 발명의 한 구체예에서 본 발명의 올리고뉴클레오티드는 RNase H를 동원할 수 있다.
본 발명에서 유리한 구조 디자인은 "정의" 섹션에 기재된, 예를 들어, "갭머", "LNA 갭머", "MOE 갭머" 및 "혼합형 윙 갭머", "교번 플랭크 갭머"의 갭머 디자인이다. 갭머 디자인은 균일 플랭크, 혼합형 윙 플랭크, 교번 플랭크, 및 갭브레이커 디자인의 갭머들을 포함한다. 본 발명에서, 본 발명의 올리고뉴클레오티드가 F-G-F' 디자인을 갖는 갭머, 특히 화학식 5'-F-G-F'-3'의 갭머인 경우 유리하며, 이 때, 영역 F 및 F'는 독립적으로 1-8개의 뉴클레오시드를 포함하고, 이 중 2-5개는 2' 당 변형된 것이고 F 및 F' 영역의 5' 및 3' 말단을 정의하고, G는 RNase H를 동원할 수 있는 6 내지 16개의 뉴클레오시드의 영역, 예컨대, 6-16개의 DNA 뉴클레오시드를 포함하는 영역이다.
일부 구체예들에서 갭머는 LNA 갭머이다.
본 발명의 일부 구체예에서 LNA 갭머는 다음의 균일 플랭크 디자인 4-10-4, 3-11-4, 4-11-4, 4-12-4 또는 4-14-2로부터 선택된다.
본 발명의 일부 구체예에서 LNA 갭머는 다음의 교번 플랭크 디자인 3-1-3-10-2, 1-3-4-6-1-3-2, 1-2-1-2-2-8-4 또는 3-3-1-8-2-1-2로부터 선택된다.
표 5 (재료 및 방법 섹션)에는 각 모티프 서열의 바람직한 디자인이 나열되어 있다.
모든 경우 F-G-F' 디자인은 "정의" 섹션의 "올리고뉴클레오티드의 영역 D' 또는 D"에 기재된 바와 같은 영역 D' 및/또는 D"를 추가로 포함할 수 있다. 일부 구체예들에서 본 발명의 올리고뉴클레오티드는 갭머 영역의 5' 또는 3' 말단에 1, 2 또는 3개 포스포디에스테르 연결된 뉴클레오시드 단위, 예컨대, DNA 단위를 가진다.
본 발명의 일부 구체예들에 있어서, 올리고뉴클레오티드는 화합물 식별번호: 6_1; 7_1; 8_1; 9_1; 9_2; 9_3; 9_4; 9_5; 9_6; 9_7; 9_8; 9_9; 9_10; 9_11; 9_12; 9_13; 9_14; 9_15; 9_16; 9_17; 9_18; 9_19; 9_20; 9_21; 9_22; 9_23; 9_24; 9_25; 9_26; 9_27; 9_28; 9_29; 9_30; 9_31; 9_32; 9_33; 9_34; 9_35; 9_36; 9_37; 9_38; 9_39; 9_40; 9_41; 9_42; 9_43; 9_44; 9_45; 9_46; 9_47; 9_48; 9_49; 9_50; 9_51; 9_52; 9_53; 9_54; 9_55; 9_56; 9_57; 9_58; 9_59; 9_60; 9_61; 9_62; 9_63; 9_64; 9_65; 9_66; 9_67; 9_68; 9_69; 9_70; 9_71; 9_72; 9_73; 9_74; 9_75; 9_76; 9_77; 9_78; 9_79; 9_80; 9_81; 9_82; 9_83; 9_84; 9_85; 9_86; 9_87; 9_88; 9_89; 9_90; 9_91; 9_92; 9_93; 9_94; 9_95; 9_96; 9_97; 9_98; 9_99; 9_100; 9_101; 9_102; 9_103; 9_104; 9_105; 9_106; 10_1; 10_2; 10_3; 10_4; 10_5; 10_6; 10_7; 10_8; 10_9; 10_10; 10_11; 10_12; 10_13; 10_14; 10_15; 10_16; 10_17; 10_18; 10_19; 10_20; 10_21; 10_22; 10_23; 10_24; 10_25; 10_26; 10_27; 10_28; 10_29; 10_30; 10_31; 10_32; 10_33; 10_34; 10_35; 10_36; 10_37; 10_38; 10_39; 10_40; 10_41; 10_42; 10_43; 10_44; 10_45; 10_46; 10_47; 10_48; 10_49; 10_50; 10_51; 10_52; 10_53; 10_54; 10_55; 10_56; 10_57; 10_58; 10_59; 10_60; 10_61; 10_62; 10_63; 10_64; 10_65; 10_66; 10_67; 10_68; 10_69; 10_70; 10_71; 10_72; 10_73; 10_74; 10_75; 10_76; 10_77; 10_78; 10_79; 10_80; 10_81; 10_82; 10_83; 10_84; 10_85; 10_86; 10_87; 10_88; 10_89; 11_1; 12_1; 13_1; 14_1; 15_1; 16_1; 17_1; 18_1; 19_1; 20_1; 21_1; 22_1; 23_1; 24_1; 24_2; 24_3; 24_4; 24_5; 24_6; 24_7; 24_8; 24_9; 24_10; 24_11; 24_12; 24_13; 24_14; 24_15; 24_16; 24_17; 24_18; 24_19; 24_20; 24_21; 24_22; 24_23; 24_24; 24_25; 24_26; 24_27; 24_28; 24_29; 24_30; 24_31; 24_32; 24_33; 24_34; 24_35; 24_36; 24_37; 24_38; 24_39; 24_40; 24_41; 24_42; 24_43; 24_44; 24_45; 24_46; 24_47; 24_48; 24_49; 24_50; 24_51; 24_52; 24_53; 24_54; 24_55; 24_56; 24_57; 24_58; 24_59; 24_60; 24_61; 24_62; 25_1; 25_2; 25_3; 25_4; 25_5; 25_6; 25_7; 25_8; 25_9; 25_10; 25_11; 25_12; 25_13; 25_14; 25_15; 25_16; 25_17; 25_18; 25_19; 25_20; 25_21; 25_22; 25_23; 25_24; 25_25; 25_26; 25_27; 25_28; 25_29; 25_30; 25_31; 25_32; 25_33; 25_34; 25_35; 25_36; 25_37; 25_38; 25_39; 25_40; 25_41; 25_42; 25_43; 26_1; 26_2; 26_3; 26_4; 26_5; 26_6; 26_7; 26_8; 26_9; 26_10; 26_11; 26_12; 26_13; 26_14; 26_15; 26_16; 26_17; 26_18; 26_19; 26_20; 26_21; 26_22; 26_23; 26_24; 26_25; 26_26; 26_27; 26_28; 26_29; 26_30; 26_31; 27_1; 28_1; 28_2; 28_3; 28_4; 28_5; 28_6; 28_7; 28_8; 28_9; 28_10; 28_11; 28_12; 28_13; 28_14; 28_15; 28_16; 28_17; 28_18; 28_19; 28_20; 28_21; 28_22; 28_23; 28_24; 28_25; 28_26; 28_27; 28_28; 28_29; 28_30; 28_31; 28_32; 28_33; 29_1; 29_2; 29_3; 29_4; 29_5; 29_6; 29_7; 29_8; 29_9; 29_10; 29_11; 29_12; 29_13; 29_14; 30_1; 30_2; 30_3; 30_4; 30_5; 30_6; 30_7; 30_8; 30_9; 30_10; 30_11; 30_12; 30_13; 30_14; 30_15; 30_16; 30_17; 30_18; 30_19; 30_20; 30_21; 30_22; 30_23; 30_24; 30_25; 31_1; 31_2; 31_3; 32_1; 32_2; 32_3; 32_4; 32_5; 32_6; 32_7; 32_8; 32_9; 32_10; 32_11; 32_12; 32_13; 32_14; 32_15; 32_16; 32_17; 32_18; 32_19; 32_20; 32_21; 32_22; 32_23; 32_24; 32_25; 32_26; 32_27; 32_28; 32_29; 32_30; 32_31; 32_32; 32_33; 32_34; 32_35; 32_36; 32_37; 32_38; 32_39; 32_40; 32_41; 32_42; 32_43; 32_44; 32_45; 32_46; 32_47; 32_48; 32_49; 32_50; 32_51; 33_1; 33_2; 33_3; 33_4; 33_5; 33_6; 33_7; 33_8; 33_9; 33_10; 33_11; 33_12; 33_13; 33_14; 33_15; 33_16; 33_17; 33_18; 33_19; 33_20; 33_21; 33_22; 33_23; 33_24; 33_25; 33_26; 33_27; 33_28; 33_29; 33_30; 33_31; 33_32; 33_33; 34_1; 35_1; 35_2; 35_3; 36_1; 37_1; 38_1; 39_1; 40_1; 41_1; 42_1; 43_1; 44_1; 45_1; 46_1; 47_1; 48_1; 49_1; 49_2; 49_3; 49_4; 49_5; 49_6; 49_7; 49_8; 49_9; 49_10; 49_11; 49_12; 49_13; 49_14; 49_15; 49_16; 49_17; 49_18; 49_19; 49_20; 49_21; 49_22; 49_23; 49_24; 49_25; 49_26; 49_27; 49_28; 49_29; 49_30; 49_31; 49_32; 49_33; 49_34; 49_35; 49_36; 49_37; 49_38; 49_39; 49_40; 49_41; 49_42; 49_43; 49_44; 49_45; 49_46; 49_47; 49_48; 49_49; 49_50; 49_51; 49_52; 49_53; 49_54; 49_55; 49_56; 49_57; 49_58; 49_59; 49_60; 49_61; 49_62; 49_63; 49_64; 49_65; 49_66; 49_67; 49_68; 49_69; 49_70; 49_71; 49_72; 49_73; 49_74; 49_75; 49_76; 49_77; 49_78; 49_79; 49_80; 49_81; 49_82; 49_83; 49_84; 49_85; 49_86; 49_87; 49_88; 49_89; 49_90; 49_91; 49_92; 49_93; 49_94; 49_95; 49_96; 49_97; 49_98; 49_99; 49_100; 49_101; 49_102; 49_103; 49_104; 49_105; 49_106; 49_107; 49_108; 49_109; 49_110; 49_111; 49_112; 49_113; 49_114; 49_115; 49_116; 49_117; 49_118; 49_119; 49_120; 49_121; 49_122; 49_123; 49_124; 49_125; 49_126; 49_127; 49_128; 49_129; 49_130; 49_131; 49_132; 49_133; 49_134; 49_135; 49_136; 49_137; 49_138; 49_139; 49_140; 49_141; 49_142; 49_143; 49_144; 49_145; 49_146; 49_147; 49_148; 49_149; 49_150; 49_151; 49_152; 49_153; 49_154; 49_155; 49_156; 49_157; 49_158; 49_159; 49_160; 49_161; 49_162; 49_163; 49_164; 49_165; 49_166; 49_167; 49_168; 49_169; 49_170; 49_171; 49_172; 49_173; 49_174; 49_175; 49_176; 49_177; 49_178; 49_179; 49_180; 49_181; 49_182; 49_183; 49_184; 49_185; 49_186; 49_187; 49_188; 49_189; 49_190; 49_191; 49_192; 50_1; 51_1; 52_1; 53_1; 54_1; 55_1; 56_1; 57_1; 58_1; 59_1; 60_1; 61_1; 62_1; 63_1; 64_1 및 65_1의 올리고뉴클레오티드 화합물들의 군에서 선택된다.
본 발명의 특정 구체예에 있어서, 올리고뉴클레오티드는 화합물 식별번호: 9_102; 9_103; 9_104; 11_1; 49_38; 49_51; 49_179; 49_189; 53_1; 56_1 및 62_1의 올리고뉴클레오티드 화합물들의 군에서 선택된다.
본 발명의 특정 구체예에 있어서, 올리고뉴클레오티드는 화합물 식별번호: 9_102; 9_103; 9_104 및 11_1의 올리고뉴클레오티드 화합물들의 군에서 선택된다.
본 발명의 특정 구체예에 있어서, 올리고뉴클레오티드는 화합물 식별번호: 49_38; 49_51; 49_179 및 49_189의 올리고뉴클레오티드 화합물들의 군에서 선택된다.
본 발명의 특정 구체예에 있어서, 올리고뉴클레오티드는 화합물 식별번호: 53_1; 56_1 및 62_1의 올리고뉴클레오티드 화합물들의 군에서 선택된다.
본 발명의 내용에서 특히 유리한 안티센스 올리고뉴클레오티드는 다음으로 구성된 군에서 선택된 올리고뉴클레오티드 화합물이다:
이 때, 대문자는 베타-D-옥시 LNA 뉴클레오시드이고, 소문자는 DNA 뉴클레오시드이고, 모든 LNA C는 5-메틸 시토신이고, 모든 뉴클레오시드간 연결은 포스포로티오에이트 뉴클레오시드간 연결이다.
한 구체예에서 안티센스 올리고뉴클레오티드는 도 2에 도시된 화합물 식별번호: 9_103이다.
한 구체예에서 안티센스 올리고뉴클레오티드는 도 3에 도시된 화합물 식별번호: 9_104이다.
한 구체예에서 안티센스 올리고뉴클레오티드는 도 4에 도시된 화합물 식별번호: 11_1이다.
한 구체예에서 안티센스 올리고뉴클레오티드는 도 5에 도시된 화합물 식별번호: 49_38이다.
한 구체예에서 안티센스 올리고뉴클레오티드는 도 6에 도시된 화합물 식별번호: 49_189이다.
제조 방법
또 다른 양상에서, 본 발명은 뉴클레오티드 단위를 반응시켜 올리고뉴클레오티드에 포함된 공유 결합된 인접 뉴클레오티드 단위를 형성하는 단계를 포함하는 본 발명의 올리고뉴클레오티드 제조 방법을 제공한다. 바람직하게는, 이러한 방법은 포스포라미다이트 화학을 사용한다 (예를 들면 Caruthers 외, 1987, Methods in Enzymology vol. 154, 페이지 287-313 참조). 추가 구체예에서, 이러한 방법은 접합 모이어티 (리간드)와 인접 뉴클레오티드 서열을 반응시켜 접합 모이어티를 올리고뉴클레오티드에 공유적으로 부착하는 단계를 추가로 포함한다. 추가 양상에서 본 발명의 올리고뉴클레오티드 또는 접합된 올리고뉴클레오티드를 약학적으로 허용되는 희석제, 용매, 담체, 염 및/또는 보조제와 혼합하는 단계를 포함하는, 본 발명의 조성물의 제조 방법이 제공된다.
약학적 염
본 발명의 화합물은 약학적으로 허용되는 염의 형태로 존재할 수 있다. 용어 "약학적으로 허용되는 염"은 본 발명의 화합물의 생물학적 효과 및 특성을 유지하고 적합한 무독성 유기 또는 무기 산 또는 유기 또는 무기 염기로부터 형성되는 통상적인 산 부가 염 또는 염기 부가 염을 지칭한다. 산 부가 염은, 예를 들어, 염화수소산, 브롬화수소산, 요오드화수소산, 황산, 설팜산, 인산 및 질산과 같은 무기산으로부터 유도된 것들, 및 p-톨루엔설폰산, 살리실산, 메탄설폰산, 옥살산, 숙신산, 구연산, 말산, 젖산, 푸마르산과 같은 유기산으로부터 유도된 것들 등을 포함한다. 염기-부가 염은 암모늄, 칼륨, 나트륨 및 4차 수산화암모늄, 예를 들어, 수산화 테트라메틸 암모늄으로부터 유도된 염을 포함한다. 약학적 화합물의 염으로의 화학적 변형은 화합물의 향상된 물리적 및 화학적 안정성, 흡습성, 유동성 및 용해도를 얻기 위해 약학분야 화학자에게 잘 알려진 기술이다. 이것은 예를 들면, Bastin, Organic Process Research & Development 2000, 4, 427-435 또는 Ansel, In: Pharmaceutical Dosage Forms and Drug Delivery Systems, 6th ed. (1995), pp. 196 및 1456-1457에 기재되어 있다. 예를 들어, 본원에 제공된 화합물의 약학적으로 허용되는 염은 나트륨 염일 수 있다.
또 다른 양상에서, 본 발명은 안티센스 올리고뉴클레오티드 또는 이의 접합체의 약학상 허용되는 염을 제공한다. 바람직한 구체예에서, 약학적으로 허용되는 염은 나트륨 또는 칼륨 염이다.
약학 조성물
또 다른 양상에서, 본 발명은 임의의 전술한 올리고뉴클레오티드 및/또는 올리고뉴클레오티드 접합체 또는 이의 염 및 약학상 허용되는 희석제, 담체, 염 및/또는 보조제를 포함하는 약학 조성물을 제공한다. 약학상 허용되는 희석제는 포스페이트 완충 식염수 (PBS)를 포함하고 약학상 허용되는 염은 나트륨 및 칼륨 염을 포함하지만 이에 제한되지 않는다. 일부 구체예에서 약학상 허용되는 희석제는 멸균 포스페이트 완충 식염수이다. 일부 구체예에서 올리고뉴클레오티드는 50 내지 300μM 용액의 농도로 약학적으로 허용되는 희석제에 사용된다.
본 발명에 사용하기에 적합한 제형은 Remington 's Pharmaceutical Sciences, Mack Publishing Company, Philadelphia, Pa., 17th ed., 1985에서 찾을 수 있다. 약물 전달 방법에 대한 간략한 검토는 예를 들어, Langer (Science 249:1527-1533, 1990)를 참조하라. WO 2007/031091은 약학상 허용되는 희석제, 담체 및 보조제의 적합하고 바람직한 추가 예를 제공한다 (본원에 참고문헌으로 포함됨). 적합한 투여량, 제형, 투여 경로, 조성물, 투여 형태, 다른 치료제와의 병용, 전구-약물 제형도 WO2007/031091에 제공된다.
본 발명의 올리고뉴클레오티드 또는 올리고뉴클레오티드 접합체는 약학 조성물 또는 제형의 제조를 위해 약학적으로 허용되는 활성 또는 불활성 물질과 혼합될 수 있다. 약학 조성물의 조성 및 제제화 방법은 투여 경로, 질환 정도 또는 투여될 용량을 비롯한 (그러나 이에 제한되지 않음) 다수의 기준에 따라 달라진다.
이들 조성물은 통상적인 멸균 기술에 의해 멸균되거나 멸균 여과될 수 있다. 생성된 수용액은 그대로 사용하기 위해 포장되거나 동결건조될 수 있으며, 동결건조된 제제는 투여 전에 멸균된 수성 담체와 조합된다. 제제의 pH는 전형적으로 3 내지 11, 보다 바람직하게는 5 내지 9 또는 6 내지 8, 가장 바람직하게는 7 내지 8, 예컨대 7 내지 7.5가 될 것이다. 생성된 고체 형태의 조성물은 다수의 단일 용량 단위로 포장될 수 있으며, 각 단위는 예컨대, 밀봉된 정제 또는 캡슐 포장으로 고정된 양의 전술한 제제 또는 제제들을 함유한다. 고체 형태의 조성물은 또한 예컨대, 국소 도포가능한 크림 또는 연고용으로 디자인된 압착가능한 튜브에 유동적인 양을 위한 용기로 포장될 수 있다.
일부 구체예에서, 본 발명의 올리고뉴클레오티드 또는 올리고뉴클레오티드 접합체는 전구약물이다. 특히, 올리고뉴클레오티드 접합체와 관련하여, 일단 전구 약물이 작용 부위, 예를 들어, 표적 세포로 전달되면 접합체 모이어티가 올리고뉴클레오티드로부터 절단된다.
응용
본 발명의 올리고뉴클레오티드는 예를 들어, 진단, 치료 및 예방을 위한 연구 시약으로 사용될 수 있다.
연구에서 이러한 올리고뉴클레오티드를 사용하여 세포 (예컨대, 시험관내 세포 배양) 및 실험 동물에서 Tau 단백질의 합성을 특이적으로 조절함으로써, 표적의 기능적 분석 또는 치료적 개입을 위한 표적으로서의 그 유용성 평가를 용이하게 할 수 있다. 전형적으로, 표적 조절은 단백질을 생산하는 mRNA를 분해 또는 억제함으로써 단백질 형성을 방지함에 의해 또는 단백질을 생산하는 유전자 또는 mRNA의 조절자를 분해 또는 억제함에 의해 이루어진다.
연구 또는 진단에 본 발명의 올리고뉴클레오티드를 사용하는 경우 표적 핵산은 cDNA 또는 DNA 또는 RNA로부터 유래된 합성 핵산일 수 있다.
본 발명은 Tau를 발현하는 표적 세포에서 Tau 발현을 조절하는 생체내 또는 시험관내 방법을 제공하며, 상기 방법은 본 발명의 올리고뉴클레오티드 유효량을 상기 세포에 투여하는 것을 포함한다.
일부 구체예에서, 표적 세포는 포유동물 세포, 특히 인간 세포이다. 표적 세포는 시험관내 세포 배양물 또는 포유동물 조직의 일부를 형성하는 생체내 세포일 수 있다. 바람직한 구체예에서 표적 세포는 뇌 또는 중추 신경계에 존재한다. 특히 뇌간, 소뇌, 소뇌 피질, 전두엽 피질, 연수/교뇌 및 중뇌 및 척수의 세포가 관련 표적 영역이다. 진행성 핵상 마비 (PSP)의 치료를 위해 뇌 영역 연수/교뇌 및 중뇌의 표적 감소가 유리하다. 뇌 영역에서 알츠하이머 표적 감소의 치료를 위해 뇌 피질, 연수/교뇌 및 중뇌가 유리하다. 특히, 뉴런에서 신경 세포, 엑손 및 기저핵은 관련 세포 유형이다.
진단에서 올리고뉴클레오티드는 노던 블롯팅, 제자리 혼성화 또는 유사한 기술에 의해 세포 및 조직에서 MAPT 발현을 검출하고 정량화하는데 사용될 수 있다.
치료제를 위해, 올리고뉴클레오티드는 Tau의 발현을 조절하여 치료할 수 있는 질환 또는 장애가 있는 것으로 의심되는 동물 또는 인간에게 투여될 수 있다.
본 발명은 본 발명의 올리고뉴클레오티드, 올리고뉴클레오티드 접합체 또는 약학 조성물의 치료적 또는 예방적 유효량을 질환을 앓고 있거나 이에 걸리기 쉬운 대상자에게 투여하는 단계를 포함하는, 질환의 치료 또는 예방 방법을 제공한다.
본 발명은 또한 약제로서 사용하기 위한 본원에 정의된 바와 같은 올리고뉴클레오티드, 조성물 또는 접합체에 관한 것이다.
본 발명에 따른 올리고뉴클레오티드, 올리고뉴클레오티드 접합체 또는 약학 조성물은 전형적으로 유효량으로 투여된다.
본 발명은 또한 본원에 언급된 장애의 치료를 위한 약제의 제조에 대해 기재된 바와 같은 본 발명의 올리고뉴클레오티드 또는 올리고뉴클레오티드 접합체의 사용 또는 본원에 언급된 장애의 치료 방법을 제공한다.
본원에 언급된 질환 또는 장애는 Tau의 발현과 관련된다. 일부 구체예에서 질환 또는 장애는 Tau 유전자의 돌연변이와 연관되거나 그 단백질 생성물이 Tau와 연관되거나 상호 작용하는 유전자와 연관될 수 있다. 따라서, 일부 구체예에서 표적 핵산은 Tau 서열의 돌연변이된 형태이고 다른 구체예에서 표적 핵산은 Tau 서열의 조절자이다.
본 발명의 방법은 바람직하게는 비정상적인 Tau 수준 및/또는 활성으로 인해 유발된 질환에 대한 치료 또는 예방에 사용된다.
본 발명은 또한 본원에 정의된 바와 같은 올리고뉴클레오티드, 올리고뉴클레오티드 접합체 또는 약학 조성물의, Tau의 비정상적 수준 및/또는 활성 치료용 약제의 제조를 위한 사용에 관한 것이다.
한 구체예에서, 본 발명은 타우병증, 알츠하이머 병 (AD), 진행성 핵상 마비 (PSP), 피질기저핵 신경절 변성 (CBD), 만성 외상성 뇌병증 (CTE), 전두-측두엽 치매 (FTD), FTDP-17, 피크병 (PiD), 은친화입자병 (AGD), 매듭-우세 노인성 치매 (TPSD), 원발성 노화-관련 타우병증 (PART), 다운 증후군, 라이티코-보딕 병, 일측성 거대뇌증 (HME)을 비롯한 영아 타우병증, 결절성 경화증 복합체, 국소 피질 이형성증 2b형, 신경절교종, 할러포르덴-스파츠 (Hallervorden-Spatz) 증후군, 뇌 철분 축적 1형을 동반한 신경퇴행 (NBIA1), 신경절세포종, 아급성 경화성 범뇌염, 발작 장애 (예컨대, 간질), 네트워크 기능장애 (예컨대, 우울증) 및 운동 장애 (예컨대, 파킨슨병)에서 선택된 질환 또는 장애의 치료에 사용하기 위한 올리고뉴클레오티드, 올리고뉴클레오티드 접합체 또는 약학 조성물에 관한 것이다.
특정 구체예에서, 질환은 알츠하이머 병 (AD), 진행성 핵상 마비 (PSP), 전두-측두엽 치매 (FTD) 또는 FTDP-17에서 선택된다.
투여
본 발명의 올리고뉴클레오티드 또는 약학 조성물은 비경구 (예컨대, 정맥내, 피하, 근육내, 뇌내, 뇌실내, 안구내 또는 척수강내 투여)를 통해 투여될 수 있다.
일부 구체예에서, 투여는 척수강내 투여를 통해 이루어진다.
유리하게는, 예컨대, 신경계 장애의 치료를 위해, 본 발명의 올리고뉴클레오티드 또는 약학 조성물은, 예컨대, 뇌내 또는 심실내 투여를 통해 척수강내 또는 두개내 투여된다.
본 발명은 또한 약제의 제조를 위한 올리고뉴클레오티드 또는 이의 접합체, 예컨대, 본 발명의 약학적 염 또는 조성물의 사용을 제공하며, 이 때, 약제는 피하 투여를 위한 투여 형태이다.
본 발명은 또한 약제의 제조를 위한 본 발명의 올리고뉴클레오티드 또는 이의 접합체, 예컨대, 본 발명의 약학적 염 또는 조성물의 사용을 제공하며, 이 때, 약제는 척수강내 투여를 위한 투여 형태이다.
본 발명은 또한 약제의 제조를 위한 기재된 바와 같은 본 발명의 올리고뉴클레오티드 또는 올리고뉴클레오티드 접합체의 사용을 제공하며, 이 때, 약제는 척수강내 투여를 위한 투여 형태이다.
병용 요법
일부 구체예들에서 본 발명의 올리고뉴클레오티드, 올리고뉴클레오티드 접합체 또는 약학 조성물은 또 다른 치료제와의 병용 치료에 사용하기 위한 것이다. 치료제는 예를 들면 상기 질환 또는 장애에 대한 치료의 표준일 수 있다.
구체예
본 발명의 다음의 구체예는 본원에 설명된 임의의 다른 구체예와 조합하여 사용될 수 있다.
1. 표 4의 임의의 표적 서열 (R_1-R_2254)에 대해, 적어도 90%의 상보성, 예컨대, 100% 상보성을 가지는, 10개 이상 뉴클레오티드 길이, 예컨대, 10-30 뉴클레오티드 길이의 인접 뉴클레오티드 서열을 포함하는, 10 내지 50개의 뉴클레오티드 길이의 안티센스 올리고뉴클레오티드.
2. 구체예 1에 있어서, 표적 서열은 각각 서열식별번호: 3, 4 또는 5에 상응하는 표적 영역 R_223, R_738 또는 R_1298 중 하나에서 선택되는, 안티센스 올리고뉴클레오티드.
3. 구체예 1 또는 2에 있어서, 인접 뉴클레오티드 서열은 서열식별번호: 1의 위치 12051 내지 12111, 39562 내지 39593 또는 72837 내지 72940 내의 인접 뉴클레오티드에 100% 상보적인, 올리고뉴클레오티드.
4. 구체예 1 내지 3에 있어서, 인접 뉴클레오티드 서열은 16개 이상 뉴클레오티드이고 서열식별번호: 1의 위치 12060 내지 12078, 위치 39573 내지 39592 또는 위치 72862 내지 72890 내 인접 뉴클레오티드에 100% 상보적인, 올리고뉴클레오티드.
5. 구체예 1 내지 4에 있어서, 올리고뉴클레오티드는 서열식별번호: 6 내지 65로 구성된 군에서 선택된 서열을 포함하는, 올리고뉴클레오티드.
6. 구체예 1 내지 5에 있어서, 올리고뉴클레오티드는 서열식별번호: 9 또는 11의 서열을 포함하는, 올리고뉴클레오티드.
7. 구체예 1 내지 5에 있어서, 올리고뉴클레오티드는 서열식별번호: 49의 서열을 포함하는, 올리고뉴클레오티드.
8. 구체예 1 내지 5에 있어서, 올리고뉴클레오티드는 서열식별번호: 53, 56 및 62로 구성된 군에서 선택된 서열을 포함하는, 올리고뉴클레오티드.
9. 구체예 1, 2, 5 또는 6에 있어서, 인접 뉴클레오티드 서열은 이에 상보적인 표적 서열과 비교하여 0 내지 3개의 미스매치를 가지는, 올리고뉴클레오티드.
10. 구체예 9에 있어서, 인접 뉴클레오티드 서열은 표적 서열과 비교하여 1개의 미스매치를 가지는, 올리고뉴클레오티드.
11. 구체예 9에 있어서, 인접 뉴클레오티드 서열은 표적 서열과 비교하여 2개의 미스매치를 가지는, 올리고뉴클레오티드.
12. 구체예 9에 있어서, 인접 뉴클레오티드 서열은 표적 서열에 완전히 상보적인, 올리고뉴클레오티드.
13. 구체예 1 내지 12에 있어서, 올리고뉴클레오티드는 Tau 발현을 조절할 수 있는, 올리고뉴클레오티드.
14. 구체예 13에 있어서, 올리고뉴클레오티드는 Tau 발현을 감소시킬 수 있는, 올리고뉴클레오티드.
15. 구체예 1 내지 14에 있어서, 올리고뉴클레오티드는 -10 kcal 미만의 △G°로 표적 서열에 혼성화할 수 있는, 올리고뉴클레오티드.
16. 구체예 1 내지 15에 있어서, 표적 서열은 RNA에 위치하는, 올리고뉴클레오티드.
17. 구체예 16에 있어서, RNA는 mRNA인, 올리고뉴클레오티드.
18. 구체예 17에 있어서, mRNA는 전구-mRNA인, 올리고뉴클레오티드.
19. 구체예 1 내지 18에 있어서, 인접 뉴클레오티드 서열은 14개 이상의 인접 뉴클레오티드, 특히 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 또는 22개 인접 뉴클레오티드를 포함하거나 이들로 구성되는, 올리고뉴클레오티드.
20. 구체예 1 내지 18에 있어서, 인접 뉴클레오티드 서열은 16 내지 22개 뉴클레오티드를 포함하거나 이들로 구성되는, 올리고뉴클레오티드.
21. 구체예 20에 있어서, 인접 뉴클레오티드 서열은 18 내지 20개 뉴클레오티드를 포함하거나 이들로 구성되는, 올리고뉴클레오티드.
22. 구체예 1 내지 21에 있어서, 올리고뉴클레오티드는 14 내지 30개 길이의 뉴클레오티드를 포함하거나 이들로 구성되는, 올리고뉴클레오티드.
23. 구체예 22에 있어서, 올리고뉴클레오티드는 16 내지 24개 길이의 뉴클레오티드를 포함하거나 이들로 구성되는, 올리고뉴클레오티드.
24. 구체예 22 또는 24에 있어서, 올리고뉴클레오티드는 18 내지 20개 길이의 뉴클레오티드를 포함하거나 이들로 구성되는, 올리고뉴클레오티드.
25. 구체예 1 내지 24에 있어서, 올리고뉴클레오티드 또는 인접 뉴클레오티드 서열은 단일 가닥인, 올리고뉴클레오티드.
26. 구체예 1 내지 25에 있어서, 올리고뉴클레오티드는 siRNA도 아니고 자기-상보적도 아닌, 올리고뉴클레오티드.
27. 구체예 1 내지 26에 있어서, 하나 이상의 변형된 뉴클레오시드를 포함하는, 올리고뉴클레오티드.
28. 구체예 27에 있어서, 하나 이상의 변형된 뉴클레오시드는 고-친화성 변형된 뉴클레오시드인, 올리고뉴클레오티드.
29. 구체예 27 또는 28에 있어서, 하나 이상의 변형된 뉴클레오시드는 2' 당 변형된 뉴클레오시드인, 올리고뉴클레오티드.
30. 구체예 29에 있어서, 하나 이상의 2' 당 변형된 뉴클레오시드는 2'-O-알킬-RNA, 2'-O-메틸-RNA, 2'-알콕시-RNA, 2'-O-메톡시에틸-RNA, 2'-아미노-DNA, 2'-플루오로-DNA, 2'-플루오로-ANA 및 LNA 뉴클레오시드로 구성된 군에서 독립적으로 선택되는, 올리고뉴클레오티드.
31. 구체예 29 또는 30에 있어서, 하나 이상의 2' 당 변형된 뉴클레오시드는 LNA 뉴클레오시드인, 올리고뉴클레오티드.
32. 구체예 31에 있어서, LNA 뉴클레오시드는 옥시-LNA, 아미노-LNA, 티오-LNA, cET, 및 ENA에서 선택되는, 안티센스 올리고뉴클레오티드.
33. 구체예 31 또는 32에 있어서, 변형된 LNA 뉴클레오시드는 후속 2'-4' 가교 -O-CH2-를 가지는 옥시-LNA인, 안티센스 올리고뉴클레오티드.
34. 구체예 33에 있어서, 옥시-LNA는 베타-D-옥시-LNA인, 안티센스 올리고뉴클레오티드.
35. 구체예 31 또는 32에 있어서, 변형된 LNA 뉴클레오시드는 후속 2'-4' 가교 -O-CH(CH3)-를 가지는 cET인, 안티센스 올리고뉴클레오티드.
36. 구체예 35에 있어서, cET는 (S)cET, 즉, 6'(S)메틸-베타-D-옥시-LNA인, 안티센스 올리고뉴클레오티드.
37. 구체예 31 또는 32에 있어서, LNA는 후속 2'-4' 가교 -O-CH2-CH2-를 가지는 ENA인, 안티센스 올리고뉴클레오티드.
38. 구체예 29 또는 30에 있어서, 하나 이상의 2' 당 변형된 뉴클레오시드는 MOE 뉴클레오시드인, 올리고뉴클레오티드.
39. 구체예 1 내지 38에 있어서, 올리고뉴클레오티드는 하나 이상의 변형된 뉴클레오시드간 연결을 포함하는, 올리고뉴클레오티드.
40. 구체예 39에 있어서, 변형된 뉴클레오시드간 연결은 뉴클레아제 내성인, 올리고뉴클레오티드.
41. 구체예 39 또는 40에 있어서, 인접 뉴클레오티드 서열 내 뉴클레오시드간 연결의 적어도 50%는 포스포로티오에이트 뉴클레오시드간 연결 또는 보라노포스페이트 뉴클레오시드간 연결인, 올리고뉴클레오티드.
42. 구체예 39 또는 41에 있어서, 인접 뉴클레오티드 서열 내 뉴클레오시드간 연결의 80%는 포스포로티오에이트 뉴클레오시드간 연결인, 올리고뉴클레오티드.
43. 구체예 39 내지 42에 있어서, 인접 뉴클레오티드 서열 내 모든 뉴클레오시드간 연결은 포스포로티오에이트 뉴클레오시드간 연결인, 올리고뉴클레오티드.
44. 구체예 1 내지 43에 있어서, 올리고뉴클레오티드는 RNase H를 동원할 수 있는, 올리고뉴클레오티드.
45. 구체예 44에 있어서, 올리고뉴클레오티드 또는 인접 뉴클레오티드 서열은 갭머인, 올리고뉴클레오티드.
46. 구체예 45에 있어서, 갭머는 화학식 5'-F-G-F'-3'를 가지며, 이 때, F 및 F' 윙 영역은 독립적으로 1-8 개의 뉴클레오시드를 포함하거나 이로 구성되며, 이 중 2-5개는 구체예 32 내지 38에 따른 2' 당 변형된 뉴클레오시드이고 G는 RNase H를 동원할 수 있는 6 내지 16개의 뉴클레오시드의 영역인, 올리고뉴클레오티드.
47. 구체예 46에 있어서, 각 윙 영역 (F 및 F')은 윙의 5' 말단 및 3' 말단에 하나 이상의 2' 당 변형된 뉴클레오시드를 가지는 것을 특징으로 하고 G 영역은 이러한 윙 영역 (예컨대, G 영역의 5' 및 3' 말단)에 인접한 하나 이상의 DNA 뉴클레오시드를 가지는, 안티센스 올리고뉴클레오티드.
48. 구체예 46 또는 47에 있어서, 영역 F 및 F' 내 2' 당 변형된 뉴클레오시드 모두는 동일한 LNA 뉴클레오시드인, 올리고뉴클레오티드.
49. 구체예 48에 있어서, LNA 뉴클레오시드 모두는 옥시-LNA 뉴클레오시드인, 올리고뉴클레오티드.
50. 구체예 46 또는 47에 있어서, 영역 F 및 F' 내 2' 당 변형된 뉴클레오시드 모두는 동일한 MOE 뉴클레오시드인, 올리고뉴클레오티드.
51. 구체예 46 내지 50에 있어서,
a. F 영역은 3 내지 8개의 뉴클레오티드 길이이고 3-5개의 동일한 LNA 뉴클레오시드 및 0-4개의 DNA 뉴클레오시드로 구성되고;
b. F' 영역은 2 내지 6개의 뉴클레오티드 길이이고 2-4개의 동일한 LNA 뉴클레오시드 및 0-2개의 DNA 뉴클레오시드로 구성되고;
c. 영역 G는 6 내지 14개의 DNA 뉴클레오티드인, 올리고뉴클레오티드.
52. 구체예 46 또는 47에 있어서, 영역 F 또는 F' 중 하나 이상은 2'-O-알킬-RNA, 2'-O-메틸-RNA, 2'-알콕시-RNA, 2'-O-메톡시에틸-RNA, 2'-아미노-DNA 및 2'-플루오로-DNA로 구성된 군에서 독립적으로 선택된 하나 이상의 2' 치환된 변형된 뉴클레오시드를 추가로 포함하는, 올리고뉴클레오티드.
53. 구체예 46 내지 50 또는 52에 있어서, 영역 G의 RNase H 동원 뉴클레오시드는 DNA, 알파-L-LNA, C4' 알킬화 DNA, ANA 및 2'F-ANA 및 UNA에서 독립적으로 선택되는, 올리고뉴클레오티드.
54. 구체예 53에 있어서, 영역 G의 뉴클레오시드는 DNA 및/또는 알파-L-LNA 뉴클레오시드인, 올리고뉴클레오티드.
55. 구체예 53 또는 54에 있어서, 영역 G는 적어도 75%의 DNA 뉴클레오시드로 구성되는, 올리고뉴클레오티드.
56. 구체예 53 내지 55에 있어서, G 영역 내 뉴클레오티드 모두는 DNA인, 올리고뉴클레오티드.
57. 구체예 1 내지 56에 있어서, 올리고뉴클레오티드는 화합물 식별번호: 9_102; 9_103; 9_104; 11_1; 49_38; 49_51; 49_179; 49_189; 53_1; 56_1 및 62_1에서 선택되는, 올리고뉴클레오티드.
58. 구체예 57에 있어서, 올리고뉴클레오티드는 다음으로 구성된 군에서 선택된 화합물인, 올리고뉴클레오티드:
이 때, 대문자는 베타-D-옥시 LNA 뉴클레오시드이고, 소문자는 DNA 뉴클레오시드이고, 모든 LNA C는 5-메틸 시토신이고, 모든 뉴클레오시드간 연결은 포스포로티오에이트 뉴클레오시드간 연결이다.
59. 구체예 1 내지 58에 있어서, 안티센스 올리고뉴클레오티드는 도 2에 도시된 화합물 식별번호: 9_103인, 안티센스 올리고뉴클레오티드.
60. 구체예 1 내지 58에 있어서, 안티센스 올리고뉴클레오티드는 도 3에 도시된 화합물 식별번호: 9_104인, 안티센스 올리고뉴클레오티드.
61. 구체예 1 내지 58에 있어서, 안티센스 올리고뉴클레오티드는 도 4에 도시된 화합물 식별번호: 11_1인, 안티센스 올리고뉴클레오티드.
62. 구체예 1 내지 58에 있어서, 안티센스 올리고뉴클레오티드는 도 5에 도시된 화합물 식별번호: 49_38인, 안티센스 올리고뉴클레오티드.
63. 구체예 1 내지 58에 있어서, 안티센스 올리고뉴클레오티드는 도 6에 도시된 화합물 식별번호: 49_189인, 안티센스 올리고뉴클레오티드.
64. 구체예 1 내지 63의 올리고뉴클레오티드 및 상기 올리고뉴클레오티드에 공유적으로 부착된 하나 이상의 접합체 모이어티를 포함하는 접합체.
65. 구체예 63에 있어서, 접합체 모이어티는 탄수화물, 세포 표면 수용체 리간드, 약물 물질, 호르몬, 친유성 물질, 중합체, 단백질, 펩티드, 독소, 비타민, 바이러스 단백질 또는 이들의 조합에서 선택되는, 올리고뉴클레오티드 접합체.
66. 구체예 64 또는 65에 있어서, 접합체는 혈관 뇌 장벽을 통한 전달을 용이하게 하는, 올리고뉴클레오티드 접합체.
67. 구체예 66에 있어서, 접합체는 트랜스페린 수용체를 표적하는 항체 또는 항체 단편인, 올리고뉴클레오티드 접합체.
68. 구체예 64 내지 67에 있어서, 올리고뉴클레오티드와 접합체 모이어티 사이에 위치하는 연결기를 포함하는, 올리고뉴클레오티드 접합체.
69. 구체예 68에 있어서, 연결기는 생리학적으로 불안정한 연결기인, 올리고뉴클레오티드 접합체.
70. 구체예 1 내지 63의 올리고뉴클레오티드 또는 구체예 64 내지 69의 접합체, 및 약학적으로 허용되는 희석제, 담체, 염 및/또는 보조제를 포함하는 약학 조성물.
71. 뉴클레오티드 단위를 반응시킴으로써, 올리고뉴클레오티드에 포함되는 공유 연결된 인접 뉴클레오티드 단위를 형성하는 단계를 포함하는, 구체예 1 내지 63의 올리고뉴클레오티드의 제조 방법.
72. 구체예 71에 있어서, 인접 뉴클레오티드 서열을 비-뉴클레오티드 접합 모이어티와 반응시키는 단계를 추가로 포함하는, 방법.
73. 구체예 71에 있어서, 올리고뉴클레오티드를 약학적으로 허용되는 희석제, 담체, 염 및/또는 보조제와 혼합하는 단계를 추가로 포함하는, 방법.
74. Tau 발현중인 표적 세포에서 Tau 발현을 조절하는 생체내 또는 시험관내 방법으로서, 상기 방법은 구체예 1 내지 63의 올리고뉴클레오티드 또는 구체예 64 내지 69의 접합체 또는 구체예 70의 약학 조성물을 유효량으로 상기 세포에 투여하는 단계를 포함하는, 방법.
75. 구체예 1 내지 63의 올리고뉴클레오티드 또는 구체예 64 내지 69의 접합체 또는 구체예 70의 약학 조성물의 치료적 또는 예방적 유효량을 질환을 앓고 있거나 질환에 취약한 대상자에게 투여하는 단계를 포함하는, 질환의 치료 또는 예방 방법.
76. 대상자의 질환을 치료 또는 예방하기 위한 약제로서 사용하기 위한, 구체예 1 내지 63의 올리고뉴클레오티드 또는 구체예 64 내지 69의 접합체 또는 구체예 70의 약학 조성물.
77. 대상자에서 질환의 치료 또는 예방용 약제의 제조를 위한 구체예 1 내지 63의 올리고뉴클레오티드 또는 구체예 64 내지 69의 접합체의 용도.
78. 구체예 75 내지 77에 있어서, 질환은 Tau의 생체내 활성과 관련되는, 방법, 올리고뉴클레오티드 또는 용도.
79. 구체예 75 내지 78에 있어서, 질환은 Tau의 과발현 및/또는 Tau의 비정상적 수준과 관련되는 방법, 올리고뉴클레오티드 또는 용도.
80. 구체예 79에 있어서, Tau는 구체예 1 내지 63의 올리고뉴클레오티드 또는 구체예 64 내지 69의 접합체 또는 구체예 70의 약학 조성물이 없을 경우의 발현과 비교하여 적어도 30%, 또는 적어도 40%, 또는 적어도 50%, 또는 적어도 60%, 또는 적어도 70%, 또는 적어도 80%, 또는 적어도 90%, 또는 적어도 95%만큼 감소되는, 방법, 올리고뉴클레오티드 또는 용도.
81. 구체예 75 내지 79에 있어서, 질환은 타우병증, 알츠하이머 병 (AD), 진행성 핵상 마비 (PSP), 피질기저핵 신경절 변성 (CBD), 만성 외상성 뇌병증 (CTE), 전두-측두엽 치매 (FTD), FTDP-17, 피크병 (PiD), 은친화입자병 (AGD), 매듭-우세 노인성 치매 (TPSD), 원발성 노화-관련 타우병증 (PART), 다운 증후군, 라이티코-보딕 병, 일측성 거대뇌증 (HME)를 비롯한 영아 타우병증, 결절성 경화증 복합체, 국소 피질 이형성증 2b형, 신경절교종, 할러포르덴-스파츠 증후군, 뇌 철분 축적 1형을 동반한 신경퇴행 (NBIA1), 신경절세포종, 아급성 경화성 범뇌염, 발작 장애 (예컨대, 간질), 네트워크 기능장애 (예컨대, 우울증) 및 운동 장애 (예컨대, 파킨슨병)에서 선택되는, 방법, 올리고뉴클레오티드 또는 용도.
82. 구체예 75 내지 79에 있어서, 질환은 알츠하이머 병 (AD), 진행성 핵상 마비 (PSP), 전두-측두엽 치매 (FTD) 또는 FTDP-17에서 선택되는, 방법, 올리고뉴클레오티드 또는 용도.
83. 구체예 75 내지 82에 있어서, 대상자가 포유동물인 방법, 올리고뉴클레오티드 또는 용도.
84. 구체예 83에 있어서, 포유동물은 인간인, 방법, 올리고뉴클레오티드 또는 용도.
실시예
재료 및 방법
올리고뉴클레오티드 모티프 서열 및 올리고뉴클레오티드 화합물
[표 5]
올리고뉴클레오티드 모티프 서열들 (서열식별번호로 표시), 이들의 디자인 및 모티프 서열을 기반으로 디자인된 특정 올리고뉴클레오티드 화합물 (화합물 식별번호로 표시)의 목록
모티프 서열은 올리고뉴클레오티드에 존재하는 핵염기의 인접 서열을 나타낸다.
디자인은 갭머 디자인, F-G-F'를 지칭한다. 고전적인 갭머 디자인, 예컨대, 3-10-3에서, 플랭크 (F 및 F') 내 뉴클레오티드 모두는 동일한 2'-당 변형된 뉴클레오시드, 예컨대, LNA, cET, 또는 MOE로 구성되며, 중간의 DNA의 스트레치는 갭 (G)을 형성한다. 교번 플랭크 디자인의 갭머에서 올리고뉴클레오티드의 플랭크는 일련의 정수들로 주석처리되며, 이는 2' 당 변형된 뉴클레오시드의 수 (M) 및 이에 이은 DNA 뉴클레오시드의 수 (D)를 나타낸다. 예를 들면 2-2-1 모티프를 가지는 플랭크는 5' [M]2-[D]2-[M] 3'를 나타내고 1-1-1-1-1 모티프는 5' [M]-[D]-[M]-[D]-[M] 3'를 나타낸다. 두 플랭크 모두 5' 및 3' 말단에 2' 당 변형된 뉴클레오시드를 가진다. 다수의 DNA 뉴클레오시드 (통상적으로 6 내지 16개)로 구성된 갭 영역 (G)은 플랭크들 사이에 위치한다.
표에서 제목 "올리고뉴클레오티드 화합물"은 모티프 서열의 특정 디자인을 나타낸다. 대문자는 베타-D-옥시 LNA 뉴클레오시드를 나타내고, 밑줄친 대문자는 MOE 뉴클레오시드를 나타내고, 소문자는 DNA 뉴클레오시드를 나타내고, 모든 LNA C는 5-메틸 시토신이고, e는 5-메틸 시토신 DNA를 나타내고, 뉴클레오티드들 사이에 아래첨자로 표시되지 않는 한 모든 뉴클레오시드간 연결은 포스포로티오에이트 뉴클레오시드간 연결이고, 아래첨자 o는 포스포디에스테르 연결을 나타낸다.
올리고뉴클레오티드 합성
올리고뉴클레오티드 합성은 일반적으로 해당 기술분야에 공지되어 있다. 다음은 적용될 수 있는 프로토콜이다. 본 발명의 올리고뉴클레오티드는 사용되는 기구, 지지체 및 농도 양상에서 약간 다른 방법들로 생산되었을 수 있다.
올리고뉴클레오티드는 1 μmol 스케일의 Oligomaker 48에서 포스포라미다이트 접근 방식을 사용하여 우리딘 범용 지지체에서 합성된다. 합성이 끝나면 60℃에서 5-16 시간 동안 암모니아 수용액을 사용하여 고체 지지체로부터 올리고뉴클레오티드를 절단한다. 올리고뉴클레오티드는 역상 HPLC (RP-HPLC) 또는 고체상 추출에 의해 정제되고 UPLC로 특성화되며 분자량은 ESI-MS에 의해 추가로 확인된다.
올리고뉴클레오티드의 신장:
β-시아노에틸-포스포라미다이트 (DNA-A(Bz), DNA-G(ibu), DNA-C(Bz), DNA-T, LNA-5-메틸-C(Bz), LNA-A(Bz), LNA-G(dmf), 또는 LNA-T)의 커플링은 아세토니트릴 중 0.1 M의 5'-O-DMT-보호된 아미다이트 및 아세토니트릴 (0.25 M) 중 DCI (4,5-디시아노이미다졸)의 용액을 활성화제로 사용하여 수행된다. 최종 주기의 경우, 원하는 변형, 예컨대, 접합체 기 또는 이러한 접합체 기를 부착하기 위한 C6 연결기를 가지는 포스포라미다이트가 사용될 수 있다. 포스포로티오에이트 연결을 도입시키기 위한 티올화는 잔탄 수소화물 (9:1의 아세토니트릴/피리딘 중 0.01 M)을 사용하여 수행된다. 포스포디에스테르 연결은 7:2:1의 THF/피리딘/물 중 0.02 M 아이오딘을 사용하여 도입될 수 있다. 나머지 시약은 올리고뉴클레오티드 합성에 일반적으로 사용되는 시약이다.
고상 합성 후 접합을 위해, 상업적으로 이용 가능한 C6 아미노 연결기 포스포라미다이트가 고상 합성 최종 주기에서 사용될 수 있으며, 고형 지지체로부터 탈보호 및 절단 후에 아미노연결된 탈보호된 올리고뉴클레오티드가 분리된다. 접합체는 표준 합성 방법을 사용하여 작용기의 활성화를 통해 도입된다.
RP-HPLC에 의한 정제:
미정제 화합물은 Phenomenex Jupiter C18 10μ 150x10 mm 컬럼에서 분취용 RP-HPLC로 정제된다. 0.1 M 암모늄 아세테이트 pH 8 및 아세토니트릴은 5 mL/분의 유속으로 완충액으로 사용된다. 수집된 분획은 동결건조되고 정제된 화합물은 전형적으로 백색 고체로 제공된다.
약어:
DCI: 4,5-디시아노이미다졸
DCM: 디클로로메탄
DMF: 디메틸포름아미드
DMT: 4,4'-디메톡시트리틸
THF: 테트라하이드로퓨란
Bz: 벤조일
Ibu: 이소뷰티릴
RP-HPLC: 역상 고성능 액체 크로마토 그래피
T m 분석:
올리고뉴클레오티드 및 RNA 표적 (인산염 연결, PO) 이중나선들을 500ml 무-RNase 물에 3mM로 희석하고 2x Tm-완충액 500ml (200mM NaCl, 0.2mM EDTA, 20mM Na포스페이트, pH 7.0)와 혼합한다. 용액을 3분 동안 95℃로 가열한 다음 실온에서 30분 동안 어닐링시킨다. 이중나선 용융 온도 (Tm)는 PE Templab 소프트웨어 (Perkin Elmer)를 사용하여 펠티에 (Peltier) 온도 프로그래머 PTP6이 장착된 Lambda 40 UV/VIS 분광광도계에서 측정된다. 온도를 20℃로부터 95℃로 상승시킨 다음 25℃로 낮추고, 260 nm에서의 흡수를 기록한다. 용융 및 어닐링의 1차 도함수와 국소 최대값을 사용하여 이중나선 Tm을 평가한다.
1차 뉴런 배양물
1차 뉴런 배양물은 마우스 Tau 녹아웃 배경에서 인간 Tau 이식유전자를 발현하는 E18 유전자이식 마우스의 전뇌로부터 만들어졌다 (Andorfer 외, J Neurochem 86:582-590 (2003)). 제조업자의 프로토콜 (Worthington Biochemical Corporation, LK0031050)에 따라 파파인 분해에 의해 1차 뉴런을 생성하였다. 간단히 말해서, 쥐의 MAPT-널 (null) 배경에서 전체 인간 미세소관-관련 단백질 Tau (MAPT) 유전자를 발현하는 hTau 마우스 E18 BAC-Tg 배아에서 전뇌를 절개하고 37℃에서 30-45분 동안 파파인/DNase/Earle 평형 염 용액 (EBSS)에서 배양하였다. 배산 및 세포 펠릿 원심분리 후, 프로테아제 억제제, 소 혈청 알부민 (BSA) 및 DNase를 함유하는 EBSS와 함께 배양하여 반응을 중단시켰다. 세포를 배산시키고 2 % B-27, 100μg/ml 페니실린, 85μg/ml 스트렙토마이신 및 0.5mM 글루타민이 보충된 Neurobasal (NB, Invitrogen)로 세척했다.
유전자이식 Tau 마우스 (hTau 마우스)
인간 PAC, Tau 프로모터에 의해 구동되는 H1 일배체형으로부터 유래된 Tau 이식유전자를 발현하는, 그리고 고유 마우스 Tau 유전자가 제거된, 수컷 및 암컷 유전자이식 마우스 (30-40g) (Polydoro et. al., J. Neurosci. (2009) 29 (34): 10741-9)를 사용하여 내성, 약력학적 결과변수 및 조직 약물 농도를 평가하였다.
동물을 일정한 온도 (21 ± 2℃) 및 습도 (50 ± 10 %)로 유지되는 집락실에 수용하고 하루 12시간 동안 조명 (06:00 시에 점등)하였다. 모든 동물은 연구 기간 동안 음식과 물에 자유롭게 접근할 수 있었다. 행동 연구는 07:00 시에서 15:00 시 사이에 수행되었다.
뇌실내 (ICV) 주사는 Haley와 McCormick의 방법에 따라 27 또는 30 게이지 바늘이 장착된 Hamilton 마이크로 주사기를 사용하여 수행되었다. 바늘에는 뇌로의 침투를 제한하기 위해 끝에서 2.5mm 떨어진 곳에 폴리에틸렌 가드가 장착되어 있었다. 이소플루란 마취제 (1.5-4 %)를 사용하여 마우스들을 마취시켰다. 주사할 마우스의 목 뒤의 느슨한 피부를 한 손의 엄지와 첫 번째 손가락으로 잡았다. 부드럽지만 단단한 압력을 가하여 동물의 머리를 단단한 평평한 표면에 대고 눌러 고정시켰다. 정수리에 대해 약 1mm 측부 및 1mm 꼬리에서 바늘 끝을 두피와 두개골을 통해 삽입하였다. 바늘이 위치되면, 식염수 비히클에 ASO가 5 마이크로리터의 부피로 제공되고 20-30초에 걸쳐 오른쪽 (또는 왼쪽) 측뇌실에 주입되었다. 바늘을 제거하기 전에 10초 동안 그대로 두었다. 이 절차는 수술이나 절개가 필요하지 않다. 동물들을 해당 절차에서 회수될 때까지 가열 패드에서 가온시켰다.
투여 후 3 일 및/또는 4주 후 마우스를 이소플루란 과다 투여로 희생시킨 다음 신속히 단두하고 차후 Tau qPCR을을 위해 뇌 조직 (오른쪽, 전두엽 피질 영역)을 드라이 아이스에 수집하였다.
인간 줄기 세포 유래 뉴런의 세포 배양 및 분화에 사용되는 배지
N2B27+ SFA 배지=N2B27 + S,F,A 사이토카인
N2B27+ BGAA 배지=N2B27 + B,G,Aa,cA 사이토카인 +P/S+라미닌
실시예 1: MAPT 인트론들을 표적하는 ASO의 시험관내 스크리닝
안티센스 올리고뉴클레오티드 (ASO) 스크리닝은 MAPT 인트론을 표적하는 807개 ASO를 사용하여 인간화된 Tau 마우스의 1차 뉴런 세포에서 수행되었다.
MAPT mRNA를 시험관내 감소시키는 ASO들의 능력을 QUANTIGENE® 분석으로 측정하였다. 각 Tau mRNA 감소는 분석 배경 신호를 빼고 하우스키핑 유전자 튜불린 mRNA 신호를 통해 각 웰을 정규화함으로써 표준화되었다.
1차 뉴런 세포 배양물들은 "재료 및 방법" 섹션에서 설명된 바와 같이 준비하고 웰당 10,000개 세포로 폴리-D-리신 코팅된 384 웰 플레이트에 도말하고 B27, 글루타맥스 및 페니실린-스트렙토마이신을 함유하는 Neurobasal 배지에서 유지시켰다. ASO를 물에 희석하고 DIV01에서 세포에 최종 농도 0.5 μM까지 첨가했다. ASO 첨가 후, 뉴런을 37℃ 및 5% CO2에서 5일 동안 배양하여 mRNA의 정상 상태 감소를 달성했다. 배지를 제거하고 세포를 DPBS에서 1X 세척하였다. 용해물 전령 RNA의 측정은 QUANTIGENE® 2.0 시약 시스템 (AFFYMETRIX®)을 사용하여 수행되었는데, 이는 특별히 디자인된 RNA 포획 프로브 세트에 의존하는 분지형 DNA-신호 증폭 방법을 사용하여 RNA를 정량화한다. 5ml의 예열된 용해 혼합물에 50μl 단백분해효소 K를 첨가하여 만든 작업 세포 용해 완충액을 사용하여 세포를 용해시키고 dH2O로 1:4 최종 희석액으로 희석하였다. 작업 용해 완충액을 플레이트 (45 μl/웰)에 첨가하고, 배산시켜 혼합하고, 밀봉하여, 30분간 55℃에서 배양하였다. 용해 후 웰들을 -80℃에 보관하거나 즉시 분석하였다.
용해물은 사용된 특정 포획 프로브 (Tau 또는 튜불린)에 따라 용해 혼합물에 희석되었다. 이어서 총 27 μl/웰을 포획 플레이트 (포획 프로브들로 코팅된 384 웰 폴리스티렌 플레이트)에 첨가하였다. 작업 프로브 세트 시약들을 제조업체 지침 (QUANTIGENE® 2.0 AFFYMETRIX®)에 따라 2.2 ml의 뉴클레아제-없는 물, 1.2 ml의 용해 혼합물, 184 μl 차단 시약, 및 66.8 μl의 특이적 2.0 프로브 세트 인간 MAPT 카탈로그 #15486 및 마우스 베타 3 튜불린, 카탈로그 #SB-17245를 조합하여 생성하였다. 이어서 7 μl 작업 프로브 세트 시약들을 포획 플레이트 상의 27 μl 용해물 희석액 (또는 배경 샘플의 경우 27 μl 용해 혼합물)에 첨가하였다. 플레이트를 원심분리한 다음 55℃에서 16-20 시간 동안 배양하여 혼성화 (표적 RNA 포획)하였다. 신호 증폭 및 표적 RNA의 검출은 완충액으로 플레이트를 3회 세척하여 결합되지 않은 물질을 제거함으로써 시작되었다. 2.0 사전-증폭기 혼성화 시약 (30 μl/웰)을 첨가하고 55℃에서 1 시간 동안 배양한 다음 흡인하고 세척 완충액을 첨가하고 3회 흡인시켰다. 이어서 2.0 증폭기 혼성화 시약을 기재된 바에 따라 (30 μl/웰) 첨가하고, 1 시간 동안 55℃에서 배양하고 전술한 바와 같이 세척을 반복하였다. 다음으로 2.0 라벨 프로브 혼성화 시약을 첨가하고 (30 μl/웰), 1 시간 동안 50℃에서 배양하고 전술한 바와 같이 세척을 반복하였다. 마지막으로, 플레이트를 원심분리하여 여분의 세척 완충액을 제거하고 2.0 기질을 첨가하였다 (30 μl/웰). 플레이트를 실온에서 5 분 동안 배양하고 플레이트를 발광계 모드에서 15분 이내에 PerkinElmer Envision 멀티라벨 판독기에서 이미지화했다.
관심 유전자의 경우, 평균 분석 배경 신호를 각 기술 복제물의 평균 신호에서 차감한다. 관심 유전자에 대한 배경-차감 평균 신호를 하우스키핑 튜불린 RNA에 대한 배경-차감 평균 신호로 나눈다. 처리된 샘플에 대한 억제 %는 처리되지 않은 샘플에 대하여 계산되었다 (즉, 수치가 낮을 수록 억제가 더 크다). 처리되지 않은 샘플들의 배경에 있어서의 변동성은 배경과 동일하거나 높은 처리된 샘플의 억제 %를 생성할 수 있으며, 이러한 경우에 억제 %는 대조군의 100% 억제로 표현된다 (즉, 억제없음).
도 1은 모든 807개 ASO들에 의해 달성된 MAPT mRNA 감소를 보여준다. 도면에 MAPT 표적 핵산 상의 세 영역들 A, B 및 C가 표시되어 있다. 이들 영역들은 표적을 대조군 (100%)에 비해 40% 이하까지 감소시키는 ASO들의 퍼짐이 높다.
실시예 2: MAPT에서 선택된 영역을 표적하는 ASO의 시험관내 스크리닝
실시예 1의 스크리닝을 기반으로, 도 1에 도시된 영역 A, B 및 C를 표적하는 새로운 ASO 라이브러리가 디자인되었다. 모티프 서열 및 올리고뉴클레오티드 화합물은 상기 표 5에 제시되어 있다.
스크리닝은 실시예 1에 기재된 바와 같이 수행되었다. 결과를 표 6에 제시한다.
[표 6]
항-MAPT 화합물들의 시험관내 스크리닝
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실시예 3: 선택된 올리고뉴클레오티드의 IC50 값
실시예 2의 가장 우수한 성능의 올리고뉴클레오티드 중 일부의 IC50을 96 웰 분석을 사용하여 1차 뉴런 세포들에서 시험관내 결정하였다.
1차 뉴런 세포 배양물들은 "재료 및 방법" 섹션에서 설명된 바와 같이 준비하고 웰당 50,000개 세포로 폴리-D-리신 코팅된 96 웰 플레이트에 도말하고 B27, 글루타맥스 및 페니실린-스트렙토마이신을 함유하는 Neurobasal 배지에서 유지시켰다. ASO를 물에 희석하고 (IC50 측정을 위해) 도말 후 (DIV01) 1일에 세포에 첨가했다. IC50 측정을 위해 뉴런은 0.5 내지 5 μM의 최고 농도로 처리되었으며 약 1:4의 농도 반응 희석을 사용하여 IC50을 정의했다. WO2016/126995의 ASO-001933에 해당하는 화합물 식별번호: 66_1을 양성 대조군으로 포함시켰다. ASO 처리 후, 뉴런들을 37℃에서 5일 동안 배양하여 mRNA의 정상 상태 감소를 달성했다. 배지를 제거하고 세포를 다음과 같이 용해시켰다. 용해물 전령 RNA의 측정은 Quantigene® 2.0 시약 시스템 (Affymetrix®)을 사용하여 수행되었는데, 이는 특별히 디자인된 RNA 포획 프로브 세트에 의존하는 분지형 DNA-신호 증폭 방법을 사용하여 RNA를 정량화한다. 작업 세포 용해 완충액을 5ml의 예열된 용해 혼합물에 50 μl 단백분해효소 K를 첨가하여 만들고 dH2O로 1:4 최종 희석액으로 희석하였다. 작업 용해 완충액을 플레이트 (150 μl/웰)에 첨가하고, 배산시켜 혼합하고, 밀봉하여, 30분간 55℃에서 배양하였다. 용해 후 웰들을 -80℃에 보관하거나 즉시 분석하였다.
용해물은 사용된 특정 포획 프로브 (Tau 또는 튜불린)에 따라 용해 혼합물에 희석되었다. 이어서 총 80 μl/웰을 포획 플레이트 (포획 프로브들로 코팅된 96 웰 폴리스티렌 플레이트)에 첨가하였다. 작업 프로브 세트 시약들을 제조업체 지침 (Quantigene® 2.0 Affymetrix®)에 따라 12.1 μl의 뉴클레아제-없는 물, 6.6 μl의 용해 혼합물, 1 μl 차단 시약, 및 0.3 μl의 특이적 2.0 프로브 세트 인간 MAPT 카탈로그 #15486 및 마우스 베타 3 튜불린, 카탈로그 #SB-17245를 조합하여 생성하였다. 이어서 20 μl 작업 프로브 세트 시약들을 포획 플레이트 상의 80 μl 용해물 희석액 (또는 배경 샘플의 경우 80 μl 용해 혼합물)에 첨가하였다. 플레이트를 원심분리한 다음 55℃에서 16-20 시간 동안 배양하여 혼성화 (표적 RNA 포획)하였다. 신호 증폭 및 표적 RNA의 검출은 완충액으로 플레이트를 3회 세척하여 결합되지 않은 물질을 제거함으로써 시작되었다. 2.0 사전-증폭기 혼성화 시약 (100 μl/웰)을 첨가하고 55℃에서 1 시간 동안 배양한 다음 흡인하고 세척 완충액을 첨가하고 3회 흡인시켰다. 이어서 2.0 증폭기 혼성화 시약을 기재된 바에 따라 (100 μl/웰) 첨가하고, 1 시간 동안 55℃에서 배양하고 전술한 바와 같이 세척을 반복하였다. 다음으로 2.0 라벨 프로브 혼성화 시약을 첨가하고 (100 μl/웰), 1 시간 동안 50℃에서 배양하고 전술한 바와 같이 세척을 반복하였다. 마지막으로, 플레이트를 원심분리하여 여분의 세척 완충액을 제거하고 2.0 기질을 첨가하였다 (100 μl/웰). 플레이트를 실온에서 5 분 동안 배양하고 플레이트를 발광계 모드에서 15분 이내에 PerkinElmer Envision 멀티라벨 판독기에서 이미지화했다.
데이터 결정: 관심 유전자의 경우, 평균 분석 배경 신호를 각 기술 복제물의 평균 신호에서 차감한다. 관심 유전자에 대한 배경-차감 평균 신호를 하우스키핑 튜불린 RNA에 대한 배경-차감 평균 신호로 나눈다. 처리된 샘플에 대한 억제 %는 처리되지 않은 샘플에 대하여 계산되었다 (즉, 수치가 낮을 수록 억제가 더 크다). 처리되지 않은 샘플들의 배경에 있어서의 변동성은 배경과 동일하거나 높은 처리된 샘플의 억제 %를 생성할 수 있으며, 이러한 경우에 억제 %는 대조군의 100% 억제로 표현된다 (즉, 억제없음). 결과를 표 7에 제시한다.
[표 7]
항-MAPT 화합물의 IC50
실시예 4: 생체내 내성 및 생체내 Tau mRNA 감소
실시예 2의 가장 우수한 성능의 올리고뉴클레오티드 중 일부를 인간화 Tau 마우스에서 생체내 테스트하여 단일 주사 후 3일 또는 28일 후 CNS에서의 급성 내성 및 MAPT mRNA 감소를 평가하였다.
유전자이식 Tau 마우스들에게 100 μg ASO를 뇌실내 (ICV) 주사로 투여하였다 (재료 및 방법 섹션의, 유전자이식 Tau 마우스 참고). WO2016/126995의 ASO-001933에 해당하는 화합물 식별번호: 66_1을 양성 대조군으로 포함시켰다. ASO ICV의 단일 주사 후 1 시간 동안 동물을 행동 부작용에 대해 관찰하였다. 부작용의 중증도에 대한 급성 내성을 0 (부작용 없음)에서 20 (경련으로 인한 안락사)까지의 등급으로 점수화하였다. 내성 등급은 다음과 같은 5개의 신경행동 범주로 나뉜다: 1) 과잉활동, 2) 활동 및 각성 감소, 3) 운동 기능장애/운동실조, 4) 비정상적 자세 및 호흡, 및 5) 떨림/경련. 각 범주를 0-4 등급으로 점수화하였으며, 가능한 최저점은 총점 20점이었다. 집 케이지에서 동물들의 행동 변화를 관찰한 다음, 그립 강도 측정과 올바른 반사를 포함하는 보다 자세한 관찰을 위해 집 케이지에서 동물들을 제거하였다. 본 발명의 ASO의 급성 내성에 대한 데이터는 표 8에 제시되어 있다.
우측 전두엽 피질 영역의 MAPT mRNA 감소는 다음과 같이 qPCR로 분석되었다. 포스파타제 억제제 칵테일 세트 2 및 3, 1 mM PMSF (Sigma, Saint Louis, MO), 및 완전 프로테아제 억제제 칵테일 무-EDTA (Roche, Indianapolis, IN)를 보충한 10x 부피의 높은 염/수크로스 완충액 (10 mM Tris-HCl, pH 7.4, 800 mM NaCl, 10% 수크로스 (w/v), 1 mM EGTA)에서 Quiagen TissueLyzer II를 사용하여 수집된 마우스 뇌 조직 (재료 및 방법 섹션의, 유전자이식 Tau 마우스 참고)을 균질화시켰다. 균질물을 20,000 x g에서 20분 동안 4℃에서 원심분리하였다. 상청액을 100,000 Xg에서 1 시간 동안 4℃에서 원심분리하였다.
cDNA 합성 및 후속 PCR을 위해, 뇌 조직 상청액으로부터의 300ng의 RNA를 96 웰 플레이트 (Axygen, PCR-96-CS)의 1 웰에 첨가했다. 각 웰에 7.5μl의 마스터 믹스 (반응 당 2.5mM NTP 믹스 5μL 및 2.5μL 랜덤 프라이머)를 첨가하고 플레이트를 1000rpm에서 원심분리하고 70℃에서 3분 동안 열 순환기에 두었다. 플레이트를 즉시 얼음에서 냉각시키고 4μl의 반응 마스터 믹스를 첨가하였다. PCR 전에 플레이트를 간단히 원심분리하여 웰의 바닥에 샘플을 모았다. cDNA 합성은 42℃에서 60분, 95℃에서 10분 동안 수행한 다음 4℃에서 유지시켰다. cDNA 샘플을 분자 생물학 등급의 물로 1:3 희석시키고 추가 사용시까지 -20℃에서 보관했다.
PCR의 경우, 각 샘플을 2 개의 프로브 세트 (MAPT: Taqman 발현 분석 Hs00902193_m1; GAPDH Taqman 발현 분석 Hs01922876_u1)로 3회 실시했다. 각 반응에 미리 희석된 cDNA 4μl와 마스터 믹스 6μL를 첨가하고 플레이트를 원심분리했다. 샘플을 95℃에서 20초 동안, 이어서 95℃에서 1초간 40 주기 및 60℃에서 20초 동안 배양하였다.
데이터는 델타 델타 Ct 방법을 사용하여 분석되었으며, 이 때, 각 샘플은 먼저 GAPDH로 표준화된 다음 처리되지 않은 대조군의 % (억제 %)로 표현되었다. 억제 %가 대조군 세포에서와 같거나 높으면 억제 %는 억제 0으로 표현되었다.
[표 8]
처리 후 3일 및 4주 후 생체내 hTau 마우스에서의 급성 내성 및 MAPT mRNA 감소
NA = 평가되지 않음
실시예 5: 인간 배아 줄기 세포 (hESC) 유래 뉴런에서의 시험관내 효능
실시예 2로부터 선택된 ASO는 인간 배아 줄기 세포 (hESC) 유래 뉴런을 사용하는 대안적인 시험관내 분석에서 3 가지 상이한 농도 (200 nM, 8 nM 및 0.32 nM)에서 시험되었다. 비교를 위해 MAPT를 표적하는 2개의 선행 기술 올리고뉴클레오티드, 즉, WO2016/126995의 ASO-001933에 해당하는 화합물 식별번호: 66_1 및 WO2018/064593의 화합물 번호: 814907에 해당하는 화합물 식별번호: 67:1을 포함시켰다.
인간 배아 줄기 세포들 (ESCs)의 배양 및 ASO 처리:
신경 줄기 세포 (NSC)는 공개된 절차에 따라 인간 ESC에서 유래되었다 (Chambers 외, 2009 Nat. Biotech. 7, 275-280). 신경 줄기 세포 (NSC)를 SFA 배지에서 1주 동안 복측화된 전구 세포와 함께 증식시킨 다음, 6주 동안 BGAA 배지에서 뉴런으로 분화되었다. 배지 내용물에 관하여는 재료 및 방법 섹션을 참조하라.
세포들을 폴리-오르니틴 및 라미닌으로 코팅된 플라스크에서 N2B27 + SFA 배지에 10,000 세포/cm2의 밀도로 씨딩되었다. 4일차에 배지를 교체하였다. N2B27 + SFA 배지에서 7일 후 세포를 트립신처리하고, 96 웰 플레이트에서 50,000 세포/웰의 밀도로 N2B27 + BGAA 배지에 복측화된 전구 세포로서 씨딩하였다.
배지를 주 2회 교체하였으며 ASO 처리는 첫 번째 배지 교체시 시작하여 6주간 계속되었다. 이후 세포들을 하기와 같이 수확하였다.
qPCR 분석:
처리된 뉴런을 다음과 같이 수확하였다: 배지를 제거한 다음 125 μL PureLink®Pro 96 용해 완충액 및 125 μL 70% 에탄올 첨가하였다. 제조업체의 지침에 따라 RNA를 정제하고 최종 부피 50 μL의 물에 용리시켜, RNA 농도가 10-20 ng/μL가 되었다. 다음으로, RNA를 1-단계 qPCR 반응 전에 물에 10배 희석시켰다.
1-단계 qPCR 반응의 경우, qPCR-믹스 (QauntaBio사의 qScriptTMXLE 1-단계 RT-qPCR ToughMix®Low ROX)를 2가지 Taqman 프로브와 10:1:1 (qPCR 믹스: 프로브1:프로브2) 비율로 혼합하여 마스터믹스를 생성하였다. qPCR은 기술적 복제로 수행되었으며 Taqman 프로브는 LifeTechnologies사에서 입수하였다: MAPT_Hs00902193_m1; GAPDH 4325792 (정규화에 사용되는 하우스키핑 유전자).
이후 마스터믹스 (6 μL) 및 RNA (4μL, 1-2 ng/μL)를 qPCR 플레이트 (MicroAmp®optical 384 웰, 카탈로그 번호 4309849)에서 혼합하였다. 플레이트 밀봉 후, 플레이트에 RT에서 1분 동안 1000g 빠른 회전을 제공하고, ViiaTM 7 시스템 (Applied Biosystems, Thermo)으로 옮겼다. 다음 PCR 조건이 사용되었다: 15분 동안 50℃; 3분 동안 95℃; 다음을 40 주기: 5초 동안 95℃, 이어서 1.6℃/초의 온도 감소, 이후 45초 동안 60℃. 데이터는 QuantStudioTM Real_time PCR 소프트웨어를 사용하여 분석되었다. ASO 처리된 샘플의 억제 %는 대조군 처리된 샘플과 비교하여 계산되었다 (낮은 수치는 높은 MAPT 감소를 나타냄). 결과를 두 기술 반복의 평균으로 표 9에 제시한다.
hESC 뉴런에서 Tau 단백질 및 pTau 단백질 측정:
PBS-세척된 세포들을 Cytobuster 단백질 추출 시약 (Merck-Millipore #71009), 1% 포스파타제 억제제 칵테일 3 (Sigma #P0044), 1% 프로테아제 억제제 세트 III (Calbiochem #539134), 1% DNAse-I (Roche # 4536282001) 및 10 mM MgCl2를 함유하는 완충액 내부로 추출시켰다. 세포 추출물을 위아래로 피펫팅하여 용해시킨 다음 사용시까지 -20℃에서 보관하였다.
세포 추출물의 총 Tau 수준을 Tau-특이적 항체 5A6 (DSHB 항체 등록 ID: AB_528487) 및 Roche사의 내부 Tau 단클론 항체 Tau 4/2를 포함하는 내부 분석 포맷을 사용하여 AlphaLISA로 측정하였다. 후자의 항체는 인간 전장 Tau, 즉, 최장 인간 뇌 아이소형, 441개 아미노산으로 마우스를 면역화하여 생성되었다. Tau 4/2는 아미노산 369와 441 사이에 위치한 Tau의 C-말단 에피토프에 결합한다. 간단히 말해서, 세포 추출물을 AlphaLISA Hi Block 분석 완충액 (PerkinElmer AL004C)으로 희석하고 비오티닐화된 5A6 및 Tau 4/2 코팅된 AlphaLISa 수용체 비드와 혼합했다. 실온에서 1시간 동안 배양 후, 스트렙타비딘-코팅된 공여체 비드를 혼합물에 첨가한다. 30분 동안 배양 후 샘플을 Envision 플레이트 판독기 (여기 680 nm, 방사 615 nm)에서 측정했습니다. 재조합 인간 Tau (Merck-Millipore #AG960)를 사용하여 표준 곡선을 그렸다.
Tau-특이적 항체 5A6 (DSHB 항체 등록 ID: AB_528487) 및 Tau-pS422-특이적 항체 5.6.11 (WO2010/142423 및 Collin 외, 2014 Brain vol 137 P 2834-2846에 기재)을 포함하는 Roche사 내부 분석 포맷을 사용하여 세포 추출물 내 포스포Tau (Tau-pS422) 수준을 알파LISA로 측정하였다. 세포 추출물은 분석 전에 분석 완충액 B로 희석된다. 완충액 B는 25 mM HEPES pH7.4, 0.5% Triton X-100, 0.1% Top Block (LuBio Science), 1 mg/ml Dextran500, 10 % ELISA Blocking 시약 (Roche)을 포함한다. 표준 곡선은 다음과 같이 제조된 ERK-인산화 Tau를 사용하여 준비되었다: 재조합 인간 Tau는 Grueninger 외의 문헌 (Neurobiology of Disease 37 [2010] pp294-306)에 기재된 바에 따라 제조되었다. 재조합 His-태그된 ERK2 (내부 생산)는 활성화된 MEKK1 (내부 생산)과의 배양에 의해 활성화되었다. 이후 활성화된 ERK2를 2mM ATP를 함유하는 완충액에서 1:50 몰비로 Tau와 함께 배양하였다. 이어서 ERk2는 Ni-NTA 아가로스 (Qiagen)를 통과시켜 제거되었다. S422에서 인산화 정도를 후속하여 질량 분광법으로 결정하였다.
결과를 표 9에 제시한다.
[표 9]
세 가지 상이한 농도로 처리 후 hESC 유래 뉴런에서 MAPT 감소 및 Tau 단백질 감소
실시예 6: 실시예 5로부터 선택된 화합물들의 IC50
실시예 5로부터 효능있는 ASO들을 선택하여 2가지 선행 기술 대조군 (화합물 식별번호: 66_1 및 화합물 식별번호: 67_1)과 함께 동일한 hESC 유래 뉴런 분석에서 시험하여, 표적 mRNA 감소 및 Tau 단백질 감소의 IC50을 결정하였다.
실험은 다음과 같은 올리고뉴클레오티드 농도를 사용하여 실시예 5에 기재된 바와 같이 수행되었다: 1000, 200, 40, 8, 1.6, 0.32, 0.064, 0.0128, 0.00256 nM.
IC50 값은 GraphPad PRISM 소프트웨어를 사용하여 적합되었다. 결과를 표 10에 제시한다.
[표 10]
MAPT 및 TAU 단백질에 대한 IC50 및 최대 효능 (대조군의 %로)
이들 데이터로부터 본 발명의 화합물 식별번호: 9_103 및 49_38은 모든 매개변수에 있어서 선행 기술의 화합물들보다 효능이 우수하고 보다 나은 IC50을 가지는 반면, 화합물 식별번호: 53_1은 선행 기술의 화합물들 보다 우수한 최대 녹다운 및 화합물 식별번호: 66_1과 유사한 IC50을 가지는 것으로 보임을 알 수 있다.
실시예 7: hTau 마우스의 특정 뇌 영역들에서의 생체내 활성
실시예 5로부터의 ASO를 선택하여 단일 저용량 ICV 투여 4 주 후 인간화된 Tau 마우스 (hTau 마우스)의 특정 뇌 영역에서 생체 내 표적을 감소시키는 능력에 대해 시험하였다.
이 실시예에서 사용된 인간화 Tau 마우스는 마우스 Tau 배경에 점 돌연변이 P301S를 갖는 인간 Tau (최장 인간 뇌 아이소형)를 과발현하는 내부 Roche hTau P301S 유전자이식 마우스 계통이다.
인간화된 Tau 마우스는 아래에 설명된 바와 같이 뇌실내 (ICV) 주사에 의해 25 μg ASO를 투여받았다. WO2016/126995의 ASO-001933에 해당하는 화합물 식별번호: 66_1을 비교 목적으로 포함시켰다.
생체내 ICV 마우스 평가:
동물 관리:
16-23-그램 체중의 혼합 성별 동물들을 일정한 온도 (22 ± 2℃) 및 습도 (55 ± 10 %)로 유지되는 집락실에 수용하고 하루 12시간 동안 조명 (06:00 시에 점등)하였다. 모든 동물은 연구 기간 동안 음식과 물에 자유롭게 접근할 수 있었다. 모든 마우스 프로토콜은 동물 실험에서의 윤리에 관한 덴마크 국가위원회의 승인을 받았다.
뇌실내 주사:
화합물들은 뇌실내 (ICV) 주사에 의해 마우스에 투여되었다. 6-8 마리의 혼합 성별 마우스들을 각 처리군에 포함시켰다. ICV 투여 전에, 마우스의 무게를 재고 이소플루란 또는 프로포폴 (30mg/kg)로 마취시켰다. 뇌실내 주사는 피부와 두개골을 통해 오른쪽 측부 뇌실로 정확한 거리 (3.9mm)를 관통하도록 조정된 스탠드에 고정시킨, 23 게이지 바늘이 장착된 FEP 카테터가 있는 Hamilton 마이크로 주사기를 사용하여 수행되었다.　주사할 마우스의 목덜미 부분을 한 손의 엄지와 첫 번째 손가락으로 잡았다. 부드럽지만 확고한 압력을 가하여 머리를 위쪽으로 눌러 바늘이 중앙선 (정중선)의 두개골 오른쪽 1-2mm, 눈 뒤쪽 1-2mm를 관통하도록 하였다. 5 μl 볼루스의 시험 화합물 또는 비히클을 사전에 결정된 주입 속도로 30초에 걸쳐 주사하였다. 역류를 피하기 위해 마우스를 5초 더 이 자세로 유지시킨 후 조심스럽게 바늘에서 멀어지도록 아래로 당겼다. 이 절차는 수술이나 절개가 필요하지 않았다. 동물들을 해당 절차에서 회수될 때까지 가열 램프 아래에 두었다.
연구 종료 (4 주)시, tau mRNA 및 단백질 분석을 위해 드라이 아이스에 뇌 조직 (피질, 연수/교뇌 및 중뇌)을 수집했다.
조직 균질화:
마우스 뇌 조직 샘플을 Qiagen TissueLyzer II를 사용하여 MagNA Pure LC RNA 분리 조직 용해 완충액 (Roche, Indianapolis, IN)에서 균질화시켰다. 균질물을 완전한 용해를 위해 실온에서 30분 동안 배양시켰다. 용해 후 이러한 균질물을 13000rpm에서 3분 동안 원심분리하고 상청액을 분석에 사용했다.
조직으로부터 RNA 정제:
RNA는 키트 세포 RNA 대용량 키트 (Cellular RNA Large Volume Kit) (Roche, Indianapolis, IN)를 사용하는 MagNA Pure 96 기기를 사용하여 350μL의 상청액으로부터 정제되었다. RNA 샘플은 RNase가 없는 물에서 2ng/μL로 정규화되었고 추가 사용시까지 -20℃에서 보관되었다. MAPT mRNA 수준을 실시예 5에 기재된 바와 같이 정량화하였다.
마우스 뇌 조직의 Tau 단백질 측정:
전-계량된 냉동 조직을 10 mM TrisCl pH 7.4, 800 mM NaCl, 1 mM EGTA, 10 % 수크로스, 1% 포스파타제 억제제 칵테일 3 (Sigma #P0044), 1% 프로테아제 억제제 세트 III (Calbiochem #539134)을 포함하는 10 부피 (wt/vol)의 추출 완충액으로 추출하였다. PreCellys 조직 파괴장치 (20 초, 6500 rpm)를 사용하여 균질물을 제조하였다. 이어서 균질물을 4℃에서 20분 동안 10,000xg에서 원심분리하고 분석을 위해 상청액을 유지시켰다.
추출물의 Tau 수준은 Perkin Elmer (Cat. Nr. AL271C)에서 공급하는 전체 Tau AlphaLISA 키트를 사용하여 AlphaLISA로 측정하였다. 이 분석에 사용된 항체는 키트와 함께 제공된 BT2 및 Tau-12이고, 둘 다 tau의 중앙 영역에 결합한다. 추출물을 HiBlock 분석 완충액으로 희석한 다음 각 샘플 5μl를 분석에 사용했다. 그밖의 분석을 공급자가 설명한 바와 같이 수행하였다.
mRNA 및 단백질 정량의 결과는 표 11에 제시되어 있다.
[표 11]
25 μg ASO의 단일 ICV 투약 4주 후 선택된 뇌 영역들에서 생체내 효능(MAPT mRNA를 대조군의 %로서 4개의 뇌 영역에 대해 표시하고 Tau 단백질을 대조군의 %로서 1개의 뇌 영역에 대해 표시한다)
이들 데이터로부터 25 μg의 상당히 낮은 농도에서도 본 발명의 화합물의 경우 대부분의 뇌 영역에서 20% 이상의 감소가 관찰됨을 관찰할 수 있으며, 대조 화합물은 이 농도에서 실제로 표적의 감소를 나타내지 않는다.
실시예 8: hTau 마우스에서 생체내 용량 반응 및 시간 경과
2개의 ASO (화합물 식별번호: 9_103 및 49_189)의 용량 반응을 3가지 상이한 용량들 (25, 50 및 100 μg)을 사용하여 평가하였으며 투여 후 1주 및 4주 후 특정 뇌 영역들에서의 표적 감소를 측정하였다. 비교를 위해 2개의 선행 기술 화합물 (화합물 식별번호: 66_1_103 및 67_1)을 1 주차 연구의 일부 투약에 포함시켰다.
실험은 본질적으로 실시예 7에 기재된 바와 같이 수행되었다. 그러나 Tau 단백질은 반감기가 1 주일을 넘기 때문에 1주 동안 실행된 용량 반응 연구에서는 측정되지 않았다. 결과를 표 12 및 13에 제시한다.
[표 12]
25 μg, 50 μg 또는 100 μg ASO의 단일 ICV 투여 1주 후 또는 100 μg ASO의 단일 ICV 투여 4주 후 선택된 뇌 영역들에서 생체내 효능(MAPT mRNA를 % 대조군으로서 4개의 뇌 영역들에 대해 나타낸다)
NA = 평가되지 않음
[표 13]
100 μg ASO의 단일 ICV 투여 4주 후 대조군의 %로서 Tau 단백질의 생체내 감소
표 12 및 13의 데이터로부터, 본 발명의 화합물은, 특히 100 μg으로 투여될 때 선행 기술의 화합물보다 훨씬 더 우수한 성능을 발휘함을 알 수 있다. MAPT 감소가 4주 동안 유지되는 것도 관찰할 수 있다. 더욱이, 본 발명의 화합물은 100 μg 화합물의 단일 용량으로 4주 처리 후 Tau 단백질의 현저한 감소를 보여준다.
SEQUENCE LISTING <110> F. Hoffmann-La Roche AG <120> OLIGONUCLEOTIDES FOR MODULATING TAU EXPRESSION <130> P34850-EP <140> PCT/EP2019/067799 <141> 2019-07-03 <150> US62/693,851 <151> 2018-07-03 <150> US62/726,005 <151> 2018-08-31 <160> 67 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 134004 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 1 acggccgagc ggcagggcgc tcgcgcgcgc ccactagtgg ccggaggaga aggctcccgc 60 ggaggccgcg ctgcccgccc cctcccctgg ggaggctcgc gttcccgctg ctcgcgcctg 120 cgccgcccgc cggcctcagg aacgcgccct cttcgccggc gcgcgccctc gcagtcaccg 180 ccacccacca gctccggcac caacagcagc gccgctgcca ccgcccacct tctgccgccg 240 ccaccacagc caccttctcc tcctccgctg tcctctcccg tcctcgcctc tgtcgactat 300 caggtaagcg ccgcggctcc gaaatctgcc tcgccgtccg cctctgtgca cccctgcgcc 360 gccgcccctc gccctccctc tccgcagact ggggcttcgt gcgccgggca tcggtcgggg 420 ccaccgcagg gcccctccct gcctcccctg ctcgggggct ggggccaggg cggcctggaa 480 agggacctga gcaagggatg cacgcacgcg tgagtgcgcg cgtgtgtgtg tgctggaggg 540 tcttcaccac cagattcgcg cagaccccag gtggaggctg tgccggcagg gtggggcgcg 600 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<212> DNA <213> Artificial <220> <223> Target region <400> 4 gaaggttgaa atgagaattg atttgagtta aa 32 <210> 5 <211> 104 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Target region <400> 5 tggttaccta taaactagtg caccctaatg aattaaaagg tgttgatgag ttaacttgtt 60 atgccttcca gataagacat gcaaatgggg cttcttcctc cttc 104 <210> 6 <211> 17 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic oligonucleotide <400> 6 tcactcatgc cttaatc 17 <210> 7 <211> 17 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic oligonucleotide <400> 7 taatcactca tgcctta 17 <210> 8 <211> 16 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic oligonucleotide <400> 8 taatcactca tgcctt 16 <210> 9 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic oligonucleotide <400> 9 ctttaattta atcactcat 19 <210> 10 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic oligonucleotide <400> 10 gctttaattt aatcactcat 20 <210> 11 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic oligonucleotide <400> 11 ctttaattta atcactca 18 <210> 12 <211> 17 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic oligonucleotide <400> 12 ctttaattta atcactc 17 <210> 13 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic oligonucleotide <400> 13 tccaagtcaa tgcctggctt 20 <210> 14 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic oligonucleotide <400> 14 atccaagtca atgcctggct 20 <210> 15 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic oligonucleotide <400> 15 accatccaag tcaatgcctg 20 <210> 16 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic oligonucleotide <400> 16 caccatccaa gtcaatgcct 20 <210> 17 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic oligonucleotide <400> 17 tacaccatcc aagtcaatgc 20 <210> 18 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic oligonucleotide <400> 18 ttacaccatc caagtcaatg 20 <210> 19 <211> 17 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic oligonucleotide <400> 19 acaccatcca agtcaat 17 <210> 20 <211> 17 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic oligonucleotide <400> 20 tacaccatcc aagtcaa 17 <210> 21 <211> 17 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic oligonucleotide <400> 21 ttacaccatc caagtca 17 <210> 22 <211> 16 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic oligonucleotide <400> 22 ttacaccatc caagtc 16 <210> 23 <211> 17 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic oligonucleotide <400> 23 aatattacac catccaa 17 <210> 24 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic oligonucleotide <400> 24 agaatattac accatccaa 19 <210> 25 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic oligonucleotide <400> 25 cagaatatta caccatccaa 20 <210> 26 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic oligonucleotide <400> 26 gaatattaca ccatccaa 18 <210> 27 <211> 16 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic oligonucleotide <400> 27 aatattacac catcca 16 <210> 28 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic oligonucleotide <400> 28 agaatattac accatcca 18 <210> 29 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic oligonucleotide <400> 29 cagaatatta caccatcca 19 <210> 30 <211> 17 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic oligonucleotide <400> 30 gaatattaca ccatcca 17 <210> 31 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic oligonucleotide <400> 31 tcagaatatt acaccatcca 20 <210> 32 <211> 17 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic oligonucleotide <400> 32 agaatattac accatcc 17 <210> 33 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic oligonucleotide <400> 33 cagaatatta caccatcc 18 <210> 34 <211> 16 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic oligonucleotide <400> 34 gaatattaca ccatcc 16 <210> 35 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic oligonucleotide <400> 35 tcagaatatt acaccatcc 19 <210> 36 <211> 16 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic oligonucleotide <400> 36 agaatattac accatc 16 <210> 37 <211> 16 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic oligonucleotide <400> 37 cagaatatta caccat 16 <210> 38 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic oligonucleotide <400> 38 caattctcat ttcaaccttc 20 <210> 39 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic oligonucleotide <400> 39 tcaattctca tttcaacctt 20 <210> 40 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic oligonucleotide <400> 40 atcaattctc atttcaacct 20 <210> 41 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic oligonucleotide <400> 41 aatcaattct catttcaacc 20 <210> 42 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic oligonucleotide <400> 42 aaatcaattc tcatttcaac 20 <210> 43 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic oligonucleotide <400> 43 caaatcaatt ctcatttcaa 20 <210> 44 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic oligonucleotide <400> 44 tcaaatcaat tctcatttca 20 <210> 45 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic oligonucleotide <400> 45 ctcaaatcaa ttctcatttc 20 <210> 46 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic oligonucleotide <400> 46 actcaaatca attctcattt 20 <210> 47 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic oligonucleotide <400> 47 aactcaaatc aattctcatt 20 <210> 48 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic oligonucleotide <400> 48 taactcaaat caattctcat 20 <210> 49 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic oligonucleotide <400> 49 ttaactcaaa tcaattctca 20 <210> 50 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic oligonucleotide <400> 50 tttaactcaa atcaattctc 20 <210> 51 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic oligonucleotide <400> 51 tttaactcaa atcaattct 19 <210> 52 <211> 16 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic oligonucleotide <400> 52 ccttttaatt cattag 16 <210> 53 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic oligonucleotide <400> 53 caacaccttt taattcatta 20 <210> 54 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic oligonucleotide <400> 54 aacacctttt aattcatt 18 <210> 55 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic oligonucleotide <400> 55 catcaacacc ttttaattca 20 <210> 56 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic oligonucleotide <400> 56 ctcatcaaca ccttttaatt 20 <210> 57 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic oligonucleotide <400> 57 actcatcaac accttttaat 20 <210> 58 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic oligonucleotide <400> 58 aactcatcaa caccttttaa 20 <210> 59 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic oligonucleotide <400> 59 taactcatca acacctttta 20 <210> 60 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic oligonucleotide <400> 60 ttaactcatc aacacctttt 20 <210> 61 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic oligonucleotide <400> 61 ttaactcatc aacaccttt 19 <210> 62 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic oligonucleotide <400> 62 ttaactcatc aacacctt 18 <210> 63 <211> 17 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic oligonucleotide <400> 63 ttaactcatc aacacct 17 <210> 64 <211> 17 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic oligonucleotide <400> 64 gttaactcat caacacc 17 <210> 65 <211> 16 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic oligonucleotide <400> 65 gttaactcat caacac 16 <210> 66 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic oligonucleotide <400> 66 atttccaaat tcacttttac 20 <210> 67 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic oligonucleotide <400> 67 ccgttttctt accaccct 18

Claims (27)

  1. 화학식 CTTTaatttaatcacTCAT(화합물 식별번호: 9_103; 서열식별번호: 9)의 안티센스 올리고뉴클레오티드 또는 그의 약학적으로 허용가능한 염으로서,
    상기 화학식에서 대문자는 베타-D-옥시 LNA 뉴클레오시드이고, 소문자는 DNA 뉴클레오시드이고, 모든 LNA C는 5-메틸 시토신이고, 모든 뉴클레오시드간 연결은 포스포로티오에이트 뉴클레오시드간 연결인, 안티센스 올리고뉴클레오티드 또는 그의 약학적으로 허용가능한 염.
  2. 청구항 1에 있어서,
    하기 화학식의 안티센스 올리고뉴클레오티드:
    .
  3. 청구항 1에 있어서,
    올리고뉴클레오티드는 타우(Tau)의 발현을 감소시킬 수 있고 RNase H를 동원할 수 있는, 안티센스 올리고뉴클레오티드.
  4. 청구항 1의 안티센스 올리고뉴클레오티드, 및 상기 안티센스 올리고뉴클레오티드에 공유 부착된 적어도 하나의 접합체 모이어티를 포함하는 접합체.
  5. 청구항 1의 안티센스 올리고뉴클레오티드 또는 상기 안티센스 올리고뉴클레오티드를 포함하는 접합체, 및 약학적으로 허용가능한 희석제, 용매, 담체, 염 및 보강제로부터 독립적으로 선택되는 하나 이상을 포함하는 조성물.
  6. 청구항 1 내지 3 중 어느 한 항의 안티센스 올리고뉴클레오티드, 청구항 4의 접합체 또는 청구항 5의 조성물의 유효량을 타우를 발현하는 표적 세포에 투여하는 단계를 포함하는, 타우를 발현하는 표적 세포에서 타우 발현을 조절하는 시험관내 방법.
  7. 청구항 1 내지 3 중 어느 한 항에 있어서,
    의약에 사용하기 위한 안티센스 올리고뉴클레오티드.
  8. 청구항 1 내지 3 중 어느 한 항에 있어서,
    알츠하이머병(AD), 진행성 핵상 마비(PSP), 전두-측두엽 치매(FTD) 및 염색체 17에 연관된 파킨슨증이 있는 FTD(FTDP-17)로부터 선택되는 질환의 치료 또는 예방에 사용하기 위한 안티센스 올리고뉴클레오티드.
  9. 청구항 8에 있어서,
    질환이 진행성 핵상 마비(PSP)인, 안티센스 올리고뉴클레오티드.
  10. 청구항 8에 있어서,
    질환이 알츠하이머병(AD)인, 안티센스 올리고뉴클레오티드.
  11. 청구항 4 에 있어서,
    의약에 사용하기 위한 접합체.
  12. 청구항 4 에 있어서,
    알츠하이머병(AD), 진행성 핵상 마비(PSP), 전두-측두엽 치매(FTD) 및 염색체 17에 연관된 파킨슨증이 있는 FTD(FTDP-17)로부터 선택되는 질환의 치료 또는 예방에 사용하기 위한 접합체.
  13. 청구항 12에 있어서,
    질환이 진행성 핵상 마비(PSP)인, 접합체.
  14. 청구항 12에 있어서,
    질환이 알츠하이머병(AD)인, 접합체.
  15. 청구항 1의 안티센스 올리고뉴클레오티드 또는 상기 안티센스 올리고뉴클레오티드를 포함하는 접합체, 및 약학적으로 허용가능한 희석제, 용매, 담체, 염 및 보강제로부터 독립적으로 선택되는 하나 이상을 포함하는, 알츠하이머병(AD), 진행성 핵상 마비(PSP), 전두-측두엽 치매(FTD) 및 염색체 17에 연관된 파킨슨증이 있는 FTD(FTDP-17)로부터 선택되는 질환의 치료 또는 예방에 사용하기 위한 약학 조성물.
  16. 청구항 15에 있어서,
    질환이 진행성 핵상 마비(PSP)인, 약학 조성물.
  17. 청구항 15에 있어서,
    질환이 알츠하이머병(AD)인, 약학 조성물.

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