KR102468177B1 - 트리틸-모노-GalNAc 화합물 및 이의 용도 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 일반적으로 포스포르아미다이트 유도체의 분야에 관한 것이다. 특히, 본 발명은 N-아세틸갈락토사민 (GalNAc) 화합물, 특히 오로지 하나의 GalNAc 모이어티 (화학식 II) 를 갖는 하기 화학식 (I) 의 포스포르아미다이트 또는 포스포노아미다이트 분자, 및 상기 N-아세틸갈락토사민 함유 분자와 핵산 분자의 콘쥬게이트에 관한 것이다. 또한 제공되는 것은 이러한 분자의 제조 방법 및 특히 의약에서의 이의 가능한 용도이다. 하기 식 중에서, R1 은 H 또는 C1-6 알킬이고; R2 는 트리페닐메틸-기반 히드록실 보호기이고, R3 는 인-함유 기, 특히 포스포르아미다이트 또는 포스포노아미다이트 기이고, K 는 하기 화학식 (II) 로 나타내어진다.
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Description

트리틸-모노-GalNAc 화합물 및 이의 용도
본 발명은 일반적으로 포스포르아미다이트 유도체의 분야에 관한 것이다. 특히, 본 발명은 N-아세틸갈락토사민 (GalNAc) 화합물, 특히 단일 GalNAc 모이어티를 갖는 포스포르아미다이트 또는 포스포노아미다이트 화합물 및 핵산 분자와 상기 N-아세틸갈락토사민 함유 분자의 콘쥬게이트 (conjugate) 에 관한 것이다. 또한 제공되는 것은 이들 분자의 제조 방법, 및 특히 의약에서의 이의 가능한 용도이다.
최근에, 핵산 분자를 치료법에서 사용하는 접근이 전개되었다. 약학적으로 관련 있는 특성에 유리하게 영향을 미치기 위해서, 핵산 분자는 특정 리간드 예컨대 펩티드, 지질, 스테롤, 및 탄수화물에 콘쥬게이트되었다. 핵산 콘쥬게이트는 siRNA 에서의 사용에 관해 심도 있게 평가되었으며, 여기에서 이는 충분한 생체내 (in vivo) 효능을 얻기 위해서 본질적으로 여겨진다. 예를 들어, 말단 갈락토스 또는 이의 유도체를 함유하는 콘쥬게이트 모이어티를 핵산에 부착하여, 핵산 분자를 아시알로글리코 단백질 수용체 (asialoglycoprotein receptor) (ASGPR) 에 대한 결합을 통해 간세포로 표적화한다.
간에서의 간세포에 치료적 이중가닥 핵산 분자, 예컨대 siRNA 를 전달하기 위한 아시알로글리코 단백질 수용체 (ASGPR) 에 결합되는 콘쥬게이트 모이어티의 용도는, 예를 들어 WO 2008/131419, WO2009/073809 및 WO2011/104169 에 기재되어 있다. 보다 최근에, 치료적 단일가닥 핵산 분자, 예컨대 안티센스 올리고뉴클레오티드는 또한 아시알로글리코 단백질 수용체 (ASGPR) 표적화 모이어티에 대한 콘쥬게이션으로부터 이점을 보이는 것으로 나타났다 (예를 들어, WO2014/118267 및 WO 2014/179620 참조).
아시알로글리코 단백질 수용체 (ASGPR) 표적화 모이어티, 예를 들어 N-아세틸-갈락토스아민 (GalNAc) 을 함유하는 모이어티 및 핵산 분자는 흔히 별도로 제조되고 이후 콘쥬게이트되고, 대안적으로는 콘쥬게이트 모이어티는 고체 지지체 상의 맞춤물 (custom made) 을 사용하여 핵산 분자에 부착된다. GalNAc 함유 모이어티가 핵산 분자의 고체상 (solid-phase) 합성과 함께 핵산 분자에 혼입되는, 몇몇 개시내용이 존재한다.
WO 2002/094185 및 Matulic-Adamic et al. 2002 (Bioconjugate Chemistry Vol 13(5), pp. 1071-1078) 는 ASGP 수용체에 대한 리보자임의 표적화에 유용한 GalNAc 콘쥬게이트의 고체상 합성 뿐만 아니라 콘쥬게이션에서 사용되는 GalNAc 포스포르아미다이트의 합성을 기재하고 있다.
WO 2015/006740 및 Rajeev et al. 2015 (ChemBioChem Vol 16, pp. 903-908) 은 1가 GalNAc 단위를 사용하는 siRNA 센스 가닥의 3' 말단에 대한 3가 GalNAc 콘쥬게이트의 고체상 합성을 기재하고 있다.
Yamamoto et al. 2016 (Bioorganic & Medicinal Chemistry Vol 24(1), pp. 26-32) 은, 1가 GalNAc 단위를 사용하는 LNA 안티센스 올리고뉴클레오티드의 3' 및 5' 말단에 대한 1가, 3가 및 5가 GalNAc 콘쥬게이트의 고체상 합성을 기재하고 있다. 분자의 일부가 간독성을 일으키는 징후가 존재한다.
통상적으로, 핵산 분자의 라이브러리는, 잠재적으로 수백 개의 핵산 분자를 구성하는 라이브러리의 구성원 각각에 콘쥬게이트를 첨가하는 작업으로 인해 콘쥬게이션 없이 (네이키드 (naked)) 스크리닝된다. 콘쥬게이션은 이후 소수의 강력한 분자가 선택되면, 수행된다. 그러나, 콘쥬게이션은 분자의 효능을 바꿀 수 있고 (예를 들어 WO 2015/071388 참조), 그 결과 이러한 접근은 잠재적으로 강력한 분자의 선택취소 (deselection) 를 야기할 수 있다.
본 발명의 목적
본 발명의 목적은, 제조 및 정제하기 용이하고 디자인과 관련하여 유연함 (flexibility) 이 있는 신규한 콘쥬게이트 모이어티를 제공하는 것이다. 이는 특히 치료적 핵산 분자의 스크리닝 라이브러리를 제조할 때와 관련이 있다. 또한, 신규한 모노-GalNAc 콘쥬게이트 모이어티를 사용하여 수득된 핵산 콘쥬게이트는 간독성을 야기하지 않는다.
본 발명자들은 이제 탄수화물 핵산 콘쥬게이트의 합성이 신규한 모노-GalNAc 화합물, 특히 포스포르아미다이트 또는 포스포노아미다이트를 사용함으로써 크게 촉진된다는 것을 발견하였다 이러한 화합물은 링커를 갖는 단일 GalNAc 모이어티 및 트리일-기반 히드록실 보호기, 예컨대 4,4'-디메톡시트리틸 (DMT) 을 함유한다. 이는 고체상 포스포르아미다이트 화학물질 및 표준 지지체를 사용하여, 핵산 분자, 특히 안티센스 올리고뉴클레오티드 또는 siRNA 의 5'- 또는 3'-말단 (또는 모든 말단) 에 대한 다중의 또는 단지 하나의 GalNAc 모이어티의 유연한 혼입을 가능하게 한다. 트리틸-모노-GalNAc 포스포르아미다이트를 사용하여 수득된 핵산 콘쥬게이트는 항상 분자의 5' 말단에 트리틸 기, 예를 들어 트리페닐메틸, 메톡시트리틸 또는 디메톡시트리틸을 함유한다. 이는 예를 들어 카트리지 상에서 비(非)-콘쥬게이트된 핵산 분자의 것과 유사한 후속 합성 정제를 허용한다. 이는 특히 시험관내 (in vitro) 스크리닝에 대해 GalNAc 콘쥬게이트된 핵산 분자의 소규모 (소량으로의 많은 화합물) 라이브러리를 제조하는데 유용하다. 또한 별도로 제조된 GalNAc 클러스터가 회피되기 때문에, GalNAc-올리고뉴클레오티드의 대규모 합성 (다량으로의 적은 화합물) 에 유리할 수 있다 (예를 들어 EP 출원 번호 1519481 1.4 참조).
본 발명에 의하면, 현재 사용된 3가 GalNAc 클러스터보다 더 적은 단계로 제조되는 트리틸-모노-GalNAc 포스포르아미다이트만이 공급될 필요가 있다.
데이터는, 3가 GalNAc 클러스터와 비교했을 때 뉴클레오티드 합성에 DMT-모노-GalNAc 포스포르아미다이트를 혼입함으로써 수득된 3가 구조물 (construct) 을 갖는 mRNA 녹다운 (knockdown) 에 대해 필적하는 활성을 달성할 수 있음을 보여준다.
본 발명의 요약
한 양상에서, 본 발명은 모노-N-아세틸갈락토사민 (GalNAc) 화합물, 예를 들어 포스포르아미다이트 또는 포스포노아미다이트에 관한 것이다.
추가 양상에서, 본 발명은 GalNAc-생체분자 콘쥬게이트, 특히 GalNAc-핵산 콘쥬게이트, 즉 포스포르아미다이트 화학을 사용하여 생체분자, 특히 핵산 분자에 공유결합되는 하나 이상의 (예를 들어 복수의) GalNAc 콘쥬게이트 모이어티를 포함하는 분자에 관한 것이다. 주어진 생체분자에 모노-GalNAc 화합물 (콘쥬게이트 모이어티) 을 연속으로 연결함으로써, 2, 3 개 또는 그 이상의 GalNAc 콘쥬게이트 모이어티를 포함하는 클러스터를 생성할 수 있다. 바람직하게는, 3 개의 모노-GalNAc 화합물은 핵산 분자의 3' 말단 또는 5' 말단에 혼입된다.
추가 양상에서, 본 발명은 트리틸-모노-GalNAc 화합물, 예를 들어 포스포르아미다이트 또는 포스포노아미다이트의 제조 방법에 관한 것이다.
보다 추가 양상에서, 본 발명은 기재된 신규한 트리틸-모노-GalNAc 화합물의 용도에 관한 것이다.
추가 양상에 따르면, 본 발명은 본 발명에 따른 화합물, 특히 GalNAc-핵산 콘쥬게이트의 의학적 용도를 제공한다
또한 제공되는 것은 본 발명에 따른 화합물, 특히 GalNAc-핵산 콘쥬게이트를 치료적 또는 진단적 유효량으로, 이를 필요로 하는 대상체에 투여하는 것을 포함하는 치료 방법이다.
도면의 간단한 설명
도 1 : 상이한 올리고뉴클레오티드 콘쥬게이트 (a) 단일 투약량 (dose) 0.1 mg/kg 및 (b) 단일 투약량 0.25 mg/kg 의 주사 10 일 이후 마우스에서의 총 혈청 콜레스테롤.
도 2: 0.1 mg/kg 의 단일 투약량으로 상이한 올리고뉴클레오티드 콘쥬게이트의 주사 14 일 이후 마우스에서의 총 혈청 콜레스테롤.
도 3: A) 4 시간 올리고뉴클레오티드 화합물 치료 및 72 시간의 총 인큐베이션 또는 B) 72 시간 올리고뉴클레오티드 화합물 치료 이후 1차 마우스 간세포에서의 상대적 ApoB mRNA 수준. J 올리고뉴클레오티드 화합물은 입체정의된 (stereodefined) GalNAc 모이어티를 포함하고, G 및 F 는 각각 GN2 콘쥬게이트 및 네이키드 대조군 화합물이다. 올리고뉴클레오티드 화합물 농도는 0.004 μM 내지 9 μM (3 배 희석) 이었고, 네이키드 화합물의 경우 27 μM 의 첨가 농도를 첨가하였다.
정의
생체분자
본 발명의 맥락에서 생체분자는 당, 지질, 펩타이드, 단백질 또는 핵산 또는 이러한 물질의 조합으로 이루어진 분자이다. 생체분자는 다양한 천연 공급원 (인간, 동물, 또는 미생물) 로부터 단리되거나, 발효 또는 합성에 의해 제조될 수 있다. 생체분자의 예는 핵산, 특히 안티센스 올리고뉴클레오티드, siRNA 분자 또는 리보자임; 펩타이드 또는 더 큰 단백질 예컨대 항체 또는 이의 절편; 호르몬; 스테로이드; 비타민; 다당류 예컨대 히알루론산이다. 생체분자는 약학적 약물로서 적합하고, 본 발명의 맥락에서 간의 질환 지료에 특히 적합하다.
콘쥬게이트
본원에서 사용된 바와 같은 용어 콘쥬게이트는 비(非)-뉴클레오티드 모이어티 (콘쥬게이트 모이어티 또는 영역 C 또는 제 3 영역) 에 공유결합되는 생체분자 (영역 A 또는 제 1 영역) 를 나타낸다. 본 발명의 특정 콘쥬게이트는 핵산 분자 (영역 A 또는 제 1 영역), 예를 들어 올리고뉴클레오티드 또는 siRNA 가 비-뉴클레오티드 모이어티 (콘쥬게이트 모이어티 또는 영역 C 또는 제 3 영역), 예컨대 본 발명의 GalNAc 콘쥬게이트 모이어티에 공유결합되는 핵산 콘쥬게이트이다. 본 발명에서, 올리고뉴클레오티드 콘쥬게이트는 올리고뉴클레오티드 합성의 시작 또는 종료시에 본 발명의 하나 이상의 모노-GalNAc 콘쥬게이트 모이어티를 혼입함으로써 달성된다.
핵산 분자
본원에서 사용된 바와 같은 용어 "핵산 분자" 는 2 개 이상의 공유결합적으로 연결된 뉴클레오시드 예컨대 DNA (데옥시리보핵산), RNA (리보핵산) 또는 개질된 뉴클레오시드를 포함하는 분자로서 당업자에 의해 일반적으로 이해되는 바와 같이 정의된다. 핵산 분자는 단일가닥 또는 이중가닥일 수 있거나, 이는 헤어핀 (hairpin) 과 같은 다양한 하위구조를 형성할 수 있다.
핵산 분자는 DNA, RNA 일 수 있거나, DNA 및/또는 RNA 뉴클레오시드 및 개질된 뉴클레오시드 모두를 포함하는 뉴클레오티드 서열을 포함할 수 있다. 특히 세포 내에서 RNA 를 조절 (modulate) 하는 개질된 핵산 분자가 바람직하다. 조절은 예를 들어 mRNA 의 분해, mRNA 전사의 차단, 스플라이스 (splice) 부위의 회복, 마이크로 RNA 의 스플라이싱 또는 차단의 방지를 촉진시킬 수 있다.
올리고뉴클레오티드
본원에서 사용된 바와 같은 용어 "올리고뉴클레오티드" 는 2 개 이상의 공유결합적으로 연결된 뉴클레오시드를 포함하는 분자로서 당업자에 의해 일반적으로 이해되는 바와 같이 정의된다. 상기 공유결합적으로 연결된 뉴클레오시드는 또한 핵산 분자 또는 올리고머로 칭해질 수 있다.
올리고뉴클레오티드는 통상적으로 고체상 화학물질 합성 이후 정제에 의해 실험실에서 제조된다. 올리고뉴클레오티드의 서열을 언급할 때, 공유결합적으로 연결된 뉴클레오티드 또는 뉴클레오티드의 핵염기 모이어티, 또는 이의 개질물의 서열 또는 순서가 언급된다. 본 발명의 올리고뉴클레오티드는 인공적이고, 화학적으로 합성되고, 전형적으로 정제 또는 단리된다. 본 발명의 올리고뉴클레오티드는 하나 이상의 개질된 뉴클레오시드 또는 뉴클레오티드를 포함할 수 있다.
안티센스 올리고뉴클레오티드
본원에서 사용된 바와 같은 용어 "안티센스 올리고뉴클레오티드" 는 표적 핵산, 특히 표적 핵산 상의 인접 (contiguous) 서열에 대한 하이브리드화에 의한 표적 유전자의 발현을 조절할 수 있는 올리고뉴클레오티드로서 정의된다. 안티센스 올리고뉴클레오티드는 본질적으로 이중가닥이 아니고, 이에 따라 siRNA 가 아니다. 바람직하게는, 본 발명의 안티센스 올리고뉴클레오티드는 단일가닥이다. 일부 구현예에서, 안티센스 올리고뉴클레오티드는 RNA (단위) 를 포함하지 않는다. 본 발명에 따른 화합물은 선형 분자이거나, 선형 분자로서 합성되는 것이 바람직하다. 안티센스 올리고뉴클레오티드는 일반적으로 길이가 7 내지 50 개의 뉴클레오티드, 예컨대 길이가 10 내지 30 개의 뉴클레오티드이다. 일부 구현예에서, 안티센스 올리고뉴클레오티드는 길이가 총 10 - 22, 예컨대 10 - 16, 예컨대 10 - 14, 예컨대 11 - 20, 예컨대 12 - 18, 예컨대 12 - 16, 예컨대 13 - 17, 또는 예컨대 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29 또는 30 개의 인접 뉴클레오티드인 인접 뉴클레오티드 서열을 포함하거나 이로 이루어진다.
간섭 RNA (RNAi)
본원에서 사용된 바와 같은 용어 "간섭 RNA" 또는 "짧은 간섭 RNA" 또는 "사일런싱 (silencing) RNA" 는, 전형적으로 길이가 15 내지 50 개의 뉴클레오티드, 예컨대 20 내지 30 개의 뉴클레오티드인 이중가닥 RNA-유사 분자로 정의된다. RNAi 폴리뉴클레오티드는 하기를 포함하는 군으로부터 선택될 수 있다: siRNA, 마이크로RNA, 이중가닥 RNA (dsRNA), 짧은 헤어핀 RNA (shRNA), 및 RNA 간섭을 유도할 수 있는 RNA 를 인코딩하는 발현 카세트.
siRNA 는 헤어핀 구조를 형성하는 2 개의 어닐링된 폴리뉴클레오티드 또는 단일 폴리뉴클레오티드로 구성될 수 있다. 본 발명의 siRNA 분자는 센스 영역 및 안티센스 영역을 포함한다. 뉴클레오티드 서열을 갖는 안티센스 영역은 표적 핵산과 동일 (완벽하게 상보적) 하거나 거의 동일 (부분적으로 상보적) 하다.
RNAi 분자는 본질적으로 합성, 인공적 분자이며, 전사 이후 mRNA 를 분해하여 번역되지 않게 함으로써 상보적 뉴클레오티드 서열을 갖는 표적 핵산을 간섭하는 RNA 간섭 (RNAi) 경로 내에서 작동한다. siRNA 는, siRNA 를 더 작은 절편으로 자르는 단백질 복합체 소위 Dicer 를 통해 상호작용한다. 이러한 절편 중 하나의 가닥, 대부분의 경우 안티센스 가닥은, 또다른 단백질 복합체, 소위 RNA-유도된 사일런싱 복합체 (RISC) 에 로딩된다. RISC 에 의해 결합된 가닥은 이후 염기 페어링에 의해 표적 핵산에 대해 복합체를 연결한다. 표적 핵산은 절단 (cleavage) 및 파괴되어, 단백질이 합성될 수 없다.
인접 뉴클레오티드 서열
용어 "인접 뉴클레오티드 서열" 은 표적 핵산에 상보적인 핵산 분자의 영역을 나타낸다. 일부 구현예에서, 핵산 분자의 뉴클레오티드 모두는 인접 뉴클레오티드 서열을 구성한다. 일부 구현예에서, 핵산 분자는 인접 뉴클레오티드 서열을 포함하고, 임의로는 추가 뉴클레오티드(들), 예를 들어 인접 뉴클레오티드 서열에 대한 관능기의 부착에 사용될 수 있는 뉴클레오티드 링커 영역을 포함할 수 있다. 뉴클레오티드 링커 영역은 표적 핵산에 상보적일 수 있거나 그렇지 않을 수 있다.
뉴클레오티드
뉴클레오티드는 핵산 분자의 빌딩 블록, 예컨대 단일가닥 올리고뉴클레오티드, 이중가닥 뉴클레오티드 및 폴리뉴클레오티드이고, 본 발명의 목적의 경우 자연 발생 및 비-자연 발생 뉴클레오티드 모두를 포함한다. 자연에서, 뉴클레오티드, 예컨대 DNA 및 RNA 뉴클레오티드는 리보오스 당 모이어티, 핵염기 모이어티 및 하나 이상의 포스페이트 기 (이는 뉴클레오시드에 부재함) 를 포함한다.
뉴클레오시드 및 뉴클레오티드는 또한 상호교환적으로 "단위" 또는 "모노머" 로 칭해질 수 있다. 뉴클레오티드 또는 모노머의 서열을 나타내는 경우, 언급되는 것은 염기, 예컨대 A, T, G, C 또는 U 또는 이의 유사체의 서열인 것으로 인식될 것이다.
개질된 뉴클레오시드
본원에서 사용되는 바와 같은 용어 "개질된 뉴클레오시드" 또는 "뉴클레오시드 개질" 은, 당 모이어티 또는 (핵)염기 모이어티의 하나 이상의 개질물의 도입에 의해 동등한 DNA 또는 RNA 뉴클레오시드와 비교하여 개질된 뉴클레오시드이다. 바람직한 구현예에서, 개질된 뉴클레오시드는 개질된 당 모이어티를 포함한다. 용어 개질된 뉴클레오시드는 또한 본원에서 용어 "뉴클레오시드 유사체" 또는 개질된 "단위" 또는 개질된 "모노머" 와 상호교환적으로 사용될 수 있다.
개질된 뉴클레오시드간 연결
용어 "개질된 뉴클레오시드간 연결" 은 2 개의 뉴클레오시드를 함께 공유결합적으로 커플링시키는 포스포디에스테르 (PO) 연결 이외의 연결로서 당업자에 의해 일반적으로 이해되는 바와 같이 정의된다. 개질된 뉴클레오시드간 연결을 갖는 뉴클레오티드는 또한 "개질된 뉴클레오티드" 로 칭해진다. 일부 구현예에서, 개질된 뉴클레오시드간 연결은 포스포디에스테르 연결에 비해 핵산 분자의 뉴클레아제 저항성을 증가시킨다. 자연 발생 핵산 분자의 경우, 뉴클레오시드간 연결은 인접한 뉴클레오시드 사이에 포스포디에스테르 결합을 발생시키는 포스페이트 기를 포함한다. 개질된 뉴클레오시드간 연결은 핵산 분자, 특히 생체내 사용을 위한 핵산 분자를 안정화시키는데 있어서 특히 유용하고, 핵산 분자에서의 DNA 또는 RNA 뉴클레오시드의 영역에서, 예를 들어 갭머 올리고뉴클레오티드의 갭 영역 내에서, 뿐만 아니라 개질된 뉴클레오시드의 영역에서 뉴클레아제 절단에 대항해 보호하는 역할을 할 수 있다.
구현예에서, 핵산 분자는 예를 들어 뉴클레아제 공격에 대해 더 저항성인 연결을 위해 천연 포스포디에스테르로부터 개질된 하나 이상의 뉴클레오시드간 연결을 포함한다. 뉴클레아제 저항성은 혈청 중 핵산 분자의 인큐베이팅에 의해 또는 뉴클레아제 저항성 검정 (예를 들어 뱀독 포스포디에스테라제 (SVPD)) 을 사용하여 측정될 수 있는데, 둘 모두는 당업계에 공지되어 있다. 핵산 분자의 뉴클레아제 저항성을 향상시킬 수 있는 뉴클레오시드간 연결은 뉴클레아제 저항성 뉴클레오시드간 연결로 칭해진다. 일부 구현예에서, 핵산 분자, 또는 이의 인접 뉴클레오티드 서열에서 뉴클레오시드간 연결 중 적어도 50 % 가 개질되고, 예컨대 핵산 분자, 또는 이의 인접 뉴클레오티드 서열에서 뉴클레오시드간 연결 중 적어도 60%, 예컨대 적어도 70%, 예컨대 적어도 80% 또는 예컨대 적어도 90% 가 개질된다. 일부 구현예에서, 핵산 분자, 또는 이의 인접 뉴클레오티드 서열의 모든 뉴클레오시드간 연결은 개질된다. 일부 구현예에서, 콘쥬게이트와 같이 비-뉴클레오티드 관능기에 핵산 분자를 연결하는 뉴클레오시드는 포스포디에스테르일 수 있음이 인식될 것이다. 일부 구현예에서 핵산 분자, 또는 이의 인접 뉴클레오티드 서열의 모든 뉴클레오시드간 연결은, 뉴클레아제 저항성 뉴클레오시드간 연결이다.
개질된 뉴클레오시드간 연결은 포스포로티오에이트, 디포스포로티오에이트 및 보라노포스페이트를 포함하는 군으로부터 선택될 수 있다. 일부 구현예에서, 개질된 뉴클레오시드간 연결은 본 발명의 올리고뉴클레오티드, 예를 들어 포스포로티오에이트, 디포스포로티오에이트 또는 보라노포스페이트의 RNaseH 동원 (recruitment) 과 양립할 수 있다.
일부 구현예에서, 뉴클레오시드간 연결은 황 (S), 예컨대 포스포로티오에이트 뉴클레오시드간 연결을 포함한다.
포스포로티오에이트 뉴클레오시드간 연결은 특히 뉴클레아제 저항성, 유익한 약동학 (pharmakokinetics) 및 생산의 용이함으로 인해 유용하다. 일부 구현예에서, 핵산 분자, 또는 이의 인접 뉴클레오티드 서열에서의 뉴클레오시드간 연결 중 적어도 50 % 는 포스포로티오에이트이고, 예컨대 핵산 분자, 또는 이의 인접 뉴클레오티드 서열에서의 뉴클레오시드간 연결 중 적어도 60%, 예컨대 적어도 70%, 예컨대 적어도 80% 또는 예컨대 적어도 90% 는 포스포로티오에이트이다. 일부 구현예에서, 핵산 분자, 또는 이의 인접 뉴클레오티드 서열의 모든 뉴클레오시드간 연결은 포스포로티오에이트이다.
일부 구현예에서, 핵산 분자는 하나 이상의 중성 뉴클레오시드간 연결, 특히 포스포트리에스테르, 메틸포스포네이트, MMI, 아미드-3, 포름아세탈 또는 티오포름아세탈로부터 선택되는 뉴클레오시드간 연결을 포함한다.
추가 뉴클레오시드간 연결은 WO2009/124238 (본원에서 참조 인용됨) 에 개시되어 있다. 구현예에서, 뉴클레오시드간 연결은 WO2007/031091 (본원에서 참조 인용됨) 에서 개시된 링커로부터 선택된다. 특히, 뉴클레오시드간 연결은 -O-P(O)2-O-, -O-P(O,S)-O-, -O-P(S)2-O-, -S-P(O)2-O-, -S-P(O,S)-O-, -S-P(S)2-O-, -O-P(O)2-S-, -O-P(O,S)-S-, -S-P(O)2-S-, -O-PO(RH)-O-, O-PO(OCH3)-O-, -O-PO(NRH)-O-, -O-PO(OCH2CH2S-R)-O-, -O-PO(BH3)-O-, -O-PO(NHRH)-O-, -O-P(O)2-NRH-, -NRH-P(O)2-O-, -NRH-CO-O-, -NRH-CO-NRH- 로부터 선택될 수 있고/있거나, 뉴클레오시드간의 링커는 -O-CO-O-, -O-CO-NRH-, -NRH-CO-CH2-, -O-CH2-CO-NRH-, -O-CH2-CH2-NRH-, -CO-NRH-CH2-, -CH2-NRHCO-, -O-CH2-CH2-S-, -S-CH2-CH2-O-, -S-CH2-CH2-S-, -CH2-SO2-CH2-, -CH2-CO-NRH-, -O-CH2-CH2-NRH-CO -, -CH2-NCH3-O-CH2- 로 이루어지는 군으로부터 선택될 수 있고, 여기서 RH 는 수소 및 C1-4-알킬로부터 선택된다.
뉴클레아제 저항성 연결, 예컨대 포스포로티오에이트 연결 (PS 연결) 은, 특히 갭머를 위한 영역 G, 또는 헤드머 및 테일머의 비-개질된 뉴클레오시드 영역과 같은 표적 핵산과 듀플렉스를 형성할 때, 뉴클레아제를 동원할 수 있는 올리고뉴클레오티드 영역에서 유용하다. 그러나, 포스포로티오에이트 연결은 또한 갭머를 위한 영역 F 및 F' 또는 헤드머 및 테일머의 개질된 뉴클레오시드 영역과 같은 비-뉴클레아제 동원 영역 및/또는 친화성 향상 영역에서 유용할 수 있다.
그러나, 디자인 영역 각각은, 특히 개질된 뉴클레오시드, 예컨대 LNA 가 뉴클레아제 분해에 대하여 연결을 보호하는 영역에서, 포스포로티오에이트 이외의 뉴클레오시드간 연결, 예컨대 포스포디에스테르 연결을 포함할 수 있다. 특히 개질된 뉴클레오시드 단위 사이에 또는 이에 인접한 (전형적으로 비-뉴클레아제 동원 영역에서) 포스포디에스테르 연결, 예컨대 1 또는 2 개의 연결의 포함은, 올리고뉴클레오티드의 생체이용률 및/또는 생체분포 (bio-distribution) 를 개질시킬 수 있다 (본원에서 참조 인용된 WO2008/113832 참조).
구현예에서, 핵산 분자에서의 모든 뉴클레오시드간 연결은 포스포로티오에이트 및/또는 보라노포스페이트 연결이다. 바람직하게는, 핵산 분자에서의 모든 뉴클레오시드간 연결은 포스포로티오에이트 연결이다.
핵염기
용어 핵염기는 핵산 하이브리드화에서 수소 결합을 형성하는 뉴클레오시드 및 뉴클레오티드에 존재하는 퓨린 (예를 들어 아데닌 및 구아닌) 및 피리미딘 (예를 들어 우라실, 티민 및 시토신) 모이어티를 포함한다. 본 발명의 맥락에서, 용어 핵염기는 또한 자연 발생 핵염기와 상이할 수 있지만 핵산 하이브리드화 동안 기능적인 개질된 핵염기를 포함한다. 이러한 맥락에서, "핵염기" 는 자연 발생 핵염기 예컨대 아데닌, 구아닌, 시토신, 티미딘, 우라실, 잔틴 및 하이포잔틴, 뿐만 아니라 비-자연 발생 변이체 모두를 나타낸다. 상기 변이체는 예를 들어 Hirao et al (2012) Accounts of Chemical Research vol 45 page 2055 및 Bergstrom (2009) Current Protocols in Nucleic Acid Chemistry Suppl. 37 1.4.1 에 기재되어 있다.
일부 구현예에서, 핵염기 모이어티는 퓨린 또는 피리미딘을 개질된 퓨린 또는 피리미딘, 예컨대 치환된 퓨린 또는 치환된 피리미딘으로 바꿈으로써 개질되고, 예컨대 이소시토신, 슈도이소시토신, 5-메틸 시토신, 5-티오졸로-시토신, 5-프로피닐-시토신, 5-프로피닐-우라실, 5-브로모우라실 5-티아졸로-우라실, 2-티오-우라실, 2'-티오-티민, 이노신, 디아미노퓨린, 6-아미노퓨린, 2-아미노퓨린, 2,6-디아미노퓨린 및 2-클로로-6-아미노퓨린으로부터 선택되는 핵염기이다.
핵염기 모이어티는 각각의 상응하는 핵염기에 대하여 문자 코드, 예를 들어 A, T, G, C 또는 U 로 나타내어질 수 있고, 여기서 각각의 문자는 임의로는 동등한 기능의 개질된 핵염기를 포함할 수 있다. 예를 들어, 예시된 핵산 분자에서, 핵염기 모이어티는 A, T, G, C, 및 5-메틸 시토신으로부터 선택된다. 임의로는, LNA 갭머의 경우, 5-메틸 시토신 LNA 뉴클레오시드가 사용될 수 있다.
개질된 핵산 분자
용어 개질된 핵산 분자는 하나 이상의 당-개질된 뉴클레오시드 및/또는 개질된 뉴클레오시드간 연결을 포함하는 핵산 분자를 기재한다. 용어 "키메라성 올리고뉴클레오티드" 는 개질된 뉴클레오시드를 갖는 올리고뉴클레오티드를 기재하기 위해 문헌에서 사용되는 용어이다.
상보성
용어 "상보성" 은 뉴클레오시드/뉴클레오티드의 왓슨-크릭 (Watson-Crick) 염기쌍의 용량 (capacity) 을 기재하고 있다. 왓슨-크릭 염기쌍은 구아닌 (G)-시토신 (C) 및 아데닌 (A) - 티민 (T)/우라실 (U) 이다. 핵산 분자는 개질된 핵염기를 갖는 뉴클레오시드를 포함할 수 있고, 예를 들어 5-메틸 시토신이 흔히 시토신 대신에 사용되고, 이와 같이 용어 상보성은 비-개질된 핵염기와 개질된 핵염기 사이에 왓슨 크릭 염기쌍을 포함하는 것으로 이해될 것이다 (예를 들어 Hirao et al (2012) Accounts of Chemical Research vol 45 page 2055 및 Bergstrom (2009) Current Protocols in Nucleic Acid Chemistry Suppl. 37 1.4.1).
본원에서 사용된 바와 같은 용어 "% 상보적" 은, 별개의 핵산 분자 (예를 들어 표적 핵산) 의 주어진 위치에서, 인접 뉴클레오티드 서열과 주어진 위치에서 상보적인 (즉, 이와 왓슨 크릭 염기쌍을 형성함) 핵산 분자 (예를 들어 올리고뉴클레오티드 또는 siRNA) 중 인접 뉴클레오티드 서열의 백분율로의 뉴클레오티드의 수를 나타낸다. 백분율은 두 서열 사이에서 쌍을 형성하는 정렬된 염기의 수를 계수하고, 핵산 분자 중 뉴클레오티드의 총 수로 나누고, 100 을 곱함으로써 계산된다. 상기 비교에서, 정렬되지 않은 핵염기/뉴클레오티드 (염기쌍을 형성함) 는 미스매치 (mismatch) 로 칭해진다.
용어 "완전히 상보적" 은 100% 상보성을 나타낸다.
동일성
본원에서 사용된 바와 같은 용어 "동일성" 은, 별개의 핵산 분자 (예를 들어 표적 핵산) 의 주어진 위치에서 인접 뉴클레오티드 서열과 주어진 위치에서 동일한 (즉, 상보적 뉴클레오시드와 왓슨 크릭 염기쌍을 형성하는 이의 능력에 있어서) 핵산 분자 (예를 들어, 올리고뉴클레오티드 또는 siRNA 의 센스 또는 안티센스 가닥) 중 인접 뉴클레오티드 서열의 백분율로의 뉴클레오티드의 수를 나타낸다.
백분율은 갭을 포함하여 두 서열 사이에서 동일한 정렬된 염기의 수를 계수하고, 핵산 분자 중 뉴클레오티드의 총 수로 나누고, 100 을 곱함으로써 계산된다. 백분율 동일성 = (매치 x 100)/정렬된 영역의 길이 (갭을 가짐).
하이브리드화
본원에서 사용된 바와 같은 용어 "하이브리드" 또는 "하이브리드화" 는, 반대편 가닥 상의 염기쌍 사이에서 수소 결합을 형성하여 듀플렉스를 형성하는, 2 개의 핵산 가닥 (예를 들어, 올리고뉴클레오티드 및 표적 핵산 또는 표적 핵산을 갖는 siRNA 안티센스 가닥) 으로서 이해되어야 한다. 2 개의 핵산 가닥 사이의 결합의 친화성은 하이브리드화의 강도이다. 이는 흔히 올리고뉴클레오티드의 절반이 표적 핵산과 듀플렉스되는 온도로서 정의된 용융 온도 (Tm) 에 관하여 기재된다. 생리학적 조건에서, Tm 은 친화성에 엄격하게 비례하지는 않는다 (Mergny and Lacroix, 2003,Oligonucleotides 13:515-537). 표준 상태 깁스 자유 에너지 (Gibbs free energy) △G°는 결합 친화성의 더 정확한 표현이고, △G°= -RTln(Kd) (여기서, R 은 기체 상수이고, T 는 절대 온도임) 에 의한 반응의 해리 상수 (Kd) 와 관련된다. 따라서, 올리고뉴클레오티드와 표적 핵산 사이의 반응의 초저 △G°는 올리고뉴클레오티드 및 표적 핵산 사이의 강한 하이브리화를 반영한다. △G°는 수성 농도가 1 M 이고, pH 가 7 이고, 온도가 37 ℃ 인 반응과 관련된 에너지이다. 올리고뉴클레오티드의 표적 핵산에 대한 하이브리드화는 자발적 반응이고, 자발적 반응의 경우 △G°는 0 미만이다. △G°은 예를 들어 Hansen et al., 1965,Chem. Comm. 36-38 및 Holdgate et al., 2005, Drug Discov Today 에 기재된 바와 같은 등온 적정 열량측정 (ITC: isothermal titration calorimetry) 방법의 사용에 의해 실험적으로 측정될 수 있다. 당업자는 시판 장비가 △G°측정에 이용가능함을 알 것이다. △G°는, 또한 Sugimoto et al., 1995, Biochemistry 34:11211-11216 및 McTigue et al., 2004, Biochemistry 43:5388-5405 에 의해 기재된 적절하게 유래된 열역학적 파라미터를 사용하여, SantaLucia, 1998, Proc Natl Acad Sci USA. 95: 1460-1465 에 의해 기재된 바와 같은 가장 가까운 이웃 모델을 사용하여 수치적으로 추정될 수 있다. 하이브리드화에 의해 이의 의도된 핵산 표적을 조절할 가능성을 갖기 위해, 본 발명의 올리고뉴클레오티드는 길이가 10-30 개의 뉴클레오티드인 올리고뉴클레오티드에 대해 -10 kcal 미만의 추정된 △G°값을 갖는 표적 핵산에 하이브리드화된다. 일부 구현예에서, 하이브리드화의 정도 또는 강도는 표준 상태 깁스 자유 에너지 △G°에 의해 측정된다. 올리고뉴클레오티드는 길이가 8-30 개의 뉴클레오티드인 올리고뉴클레오티드에 대해 -10 kcal 의 범위 미만, 예컨대 -15 kcal 미만, 예컨대 -20 kcal 미만 및 예컨대 -25 kcal 미만의 추정된 △G°값을 갖는 표적 핵산에 대해 하이브리드화될 수 있다. 일부 구현예에서, 올리고뉴클레오티드는 -10 내지 -60 kcal, 예컨대 -12 내지 -40, 예컨대 -15 내지 -30 kcal 또는 -16 내지 -27 kcal 예컨대 -18 내지 -25 kcal 의 추정된 △G°값을 갖는 표적 핵산에 대해 하이브리드화된다.
표적 핵산
본 발명에 따르면, 표적 핵산은 세포주 또는 포유 동물에서의 기능을 조절하는 것이 바람직한 핵산을 나타낸다. 바람직한 구현예에서, 표적 핵산의 조절은 관심 대상인 병리학을 변화시킨다.
표적 핵산은, 세포 내의 메커니즘, 예컨대 바이러스성 감염 메커니즘, RNA 사일런싱 또는 유전자 발현의 전사후 조정 (regulation) 에 대해 조정 효과를 발휘하는 비(非)-코딩 DNA 또는 RNA 분자 또는 인간 표적 폴리펩타이드와 같은 포유 동물 표적 폴리펩타이드를 인코딩하는 DNA 또는 RNA 일 수 있다. 비-코딩 RNA 분자는 예를 들어 마이크로 RNA, snRNA, snoRNA, 또는 긴 비-코딩 RNA 일 수 있다. 바람직한 구현예에서 표적 핵산은, 시험관내 (in vitro) 또는 생체내 (in vivo) 에서 세포, 예컨대 포유동물 세포 특히 인간 세포에 존재하는, 유전자, 바이러스성 RNA, mRNA, 및 예비-mRNA, 성숙 mRNA 또는 cDNA 서열 또는 마이크로 RNA (miRNA) 이다.
표적 세포
본원에서 사용된 바와 같은 용어 "표적 세포" 는 표적 핵산를 발현하는 세포를 나타낸다. 일부 구현예에서, 표적 세포는 생체내 또는 시험관내에 있을 수 있다. 일부 구현예에서, 표적 세포는 포유동물 세포 예컨대 설치류 세포, 예컨대 마우스 세포 또는 랫트 세포, 또는 영장류 세포 예컨대 원숭이 세포 또는 인간 세포이다. 바람직한 구현예에서, 표적 세포는, 표면, 예컨대 간 세포 및 고환 세포, 특히 간세포 및 라이디히 (Leydig) 세포 상에 아시알로글리코 단백질 수용체 (ASPGR) 를 갖는다.
발현의 조절
본원에서 사용되는 바와 같은 용어 "발현의 조절" 은, 핵산 분자의 투여 이전에 표적 핵산의 양과 비교했을 때 표적 핵산의 양을 바꾸는 핵산 분자의 능력에 대한 전반적인 용어로서 이해되어야 한다. 대안적으로 발현의 조절은 대조군 실험을 참고로 결정될 수 있다. 일반적으로 대조군은, 염수 조성물로 처리된 개체 (individual) 또는 표적 세포 또는 비-표적화 핵산 분자 (모의 (mock)) 로 처리된 개체 또는 표적 세포인 것으로 이해된다. 그러나, 이는 또한 케어의 표준으로 처리된 개체일 수 있다.
조절의 한 유형은 예를 들어 mRNA 의 분해 또는 전사의 차단에 의해, 표적 핵산의 발현을 저해, 하향-조정, 감소, 억제, 제거, 중단, 차단, 방지, 경감, 저하, 회피 또는 종료시키는 핵산 분자의 능력이다. 조절의 또다른 유형은 예를 들어 스플라이스 부위의 회복 또는 스플라이싱의 방지 또는 저해 메커니즘 예컨대 마이크로RNA 억제의 제거 또는 차단에 의한 발현 표적 핵산의 복원, 증가 또는 향상시키는 핵산 분자의 능력이다.
고친화성 개질된 뉴클레오시드
고친화성 개질된 뉴클레오시드는, 핵산 분자에 혼입될 때, 예를 들어 용융 온도 (Tm) 에 의해 측정되는 바와 같은 이의 상보적 표적에 대한 핵산 분자의 친화성을 향상시키는 개질된 뉴클레오티드이다. 본 발명의 고친화성 개질된 뉴클레오시드는 바람직하게는 개질된 뉴클레오시드 당 +0.5 내지 +12°C, 더 바람직하게는 +1.5 내지 +10°C 및 가장 바람직하게는 +3 내지 +8°C 의 용융 온도의 증가를 야기한다. 수많은 고친화성 개질된 뉴클레오시드가 당업계에 공지되어 있고, 예를 들어 많은 2' 치환된 뉴클레오시드 뿐만 아니라 잠긴 (locked) 핵산 (LNA) 을 포함한다 (예를 들어 Freier & Altmann; Nucl. Acid Res., 1997, 25, 4429-4443 및 Uhlmann; Curr. Opinion in Drug Development, 2000, 3(2), 293-213 참조).
당 개질물
본 발명의 올리고머는 개질된 당 모이어티, 즉 DNA 및 RNA 에서 발견되는 리보오스 당 모이어티와 비교했을 때 당 모이어티의 개질물을 갖는 하나 이상의 뉴클레오시드를 포함할 수 있다.
리보오스 당 모이어티의 개질물을 갖는 수많은 뉴클레오시드는 주로 핵산 분자의 특정 특성, 예컨대 친화성 및/또는 뉴클레아제 저항성의 개선을 목적으로 제조된다.
상기 개질물은 리보오스 고리 구조가 예를 들어 헥소오스 고리 (HNA), 또는 바이시클릭 고리 (이는 전형적으로 리보오스 고리 (LNA) 상의 C2 탄소와 C4 탄소 사이에 바이라디클 (biradicle) 가교를 가짐) 또는 C2 탄소와 C3 탄소 사이에 결합이 전형적으로 결여된 비연결된 리보오스 고리 (예를 들어 UNA) 로의 대체에 의해 개질된 것이다. 다른 당 개질된 뉴클레오시드는 예를 들어 바이시클로헥소오스 핵산 (WO2011/017521) 또는 트리시클릭 핵산 (WO2013/154798) 을 포함한다. 개질된 뉴클레오시드는 또한 당 모이어티가 예를 들어 펩타이드 핵산 (PNA), 또는 모르폴리노 핵산의 경우 비(非)-당 모이어티로 대체되는 뉴클레오시드를 포함한다.
당 개질물은 또한 리보오스 고리 상의 치환기를 DNA 및 RNA 뉴클레오시드에서 자연적으로 발견되는 2'-OH 기 또는 수소 이외의 기로 바꾸는 것을 통해 제조된 개질물을 포함한다. 치환기는 예를 들어 2', 3', 4' 또는 5' 위치에서 도입될 수 있다.
개질된 당 모이어티를 갖는 뉴클레오시드는 또한 2' 개질된 뉴클레오시드, 예컨대 2' 치환된 뉴클레오시드를 포함한다. 사실상, 2' 치환된 뉴클레오시드를 발현하는데 훨씬 많은 초점이 기울여졌고, 수많은 2' 치환된 뉴클레오시드는 핵산 분자에 혼입될 때 유익한 특성, 예컨대 향상된 뉴클레오시드 저항성 및 향상된 친화성을 갖는 것으로 밝혀졌다.
2' 개질된 뉴클레오시드
2' 당 개질된 뉴클레오시드는 2' 위치에 H 또는 -OH 이외의 치환기를 갖는 뉴클레오시드 (2' 치환된 뉴클레오시드) 이거나, 2' 연결된 바이라디클을 포함하고, 2' 치환된 뉴클레오시드 및 LNA (2'-4' 바이라디클 가교됨) 뉴클레오시드를 포함한다. 예를 들어, 2' 개질된 당은 핵산 분자에 대해 향상된 결합 친화성 및/또는 증가된 뉴클레아제 저항성을 제공할 수 있다. 2' 치환된 개질된 뉴클레오시드의 예는 2'-O-알킬-RNA, 2'-O-메틸-RNA, 2'-알콕시-RNA, 2'-O-메톡시에틸-RNA (MOE), 2'-아미노-DNA, 2'-플루오로-RNA, 및 2'-F-ANA 뉴클레오시드이다. 추가 예에 관하여서는, 예를 들어 Freier & Altmann; Nucl. Acid Res., 1997, 25, 4429-4443 및 Uhlmann; Curr. Opinion in Drug Development, 2000, 3(2), 293-213, 및 Deleavey and Damha, Chemistry and Biology 2012, 19, 937 를 참조한다. 하기는 일부 2' 치환된 개질된 뉴클레오시드의 예시이다.
Figure 112018108847179-pct00001
잠긴 핵산 뉴클레오시드 (LNA)
LNA 뉴클레오시드는 뉴클레오티드의 리보오스 당 고리의 C2' 와 C4' 사이에 링커기 (바이라디클 또는 가교로 나타냄) 을 포함하는 개질된 뉴클레오시드이다. 이러한 뉴클레오시드는 또한 문헌에서 가교된 핵산 또는 바이시클릭 핵산 (BNA) 으로 칭해진다.
일부 구현예에서, 본 발명의 올리고머의 개질된 뉴클레오시드 또는 LNA 뉴클레오시드는 하기 화학식 I 또는 II 의 일반적 구조를 갖는다:
Figure 112018108847179-pct00002
[식 중,
W 는 -O-, -S-, -N(Ra)-, -C(RaRb)-, 예컨대 일부 구현예에서 -O- 로부터 선택되고;
B 는 핵염기 또는 개질된 핵염기 모이어티를 나타내고;
Z 는 인접한 뉴클레오시드에 대한 뉴클레오시드간 연결, 또는 5'-말단기를 나타내고;
Z* 는 인접한 뉴클레오시드에 대한 뉴클레오시드간 연결, 또는 3'-말단기를 나타내고;
X 는 -C(RaRb)-, -C(Ra)=C(Rb)-, -C(Ra)=N-, -O-, -Si(Ra)2-, -S-, -SO2-, -N(Ra)-, 및 >C=Z 로 이루어지는 목록으로부터 선택되는 기를 나타내고,
일부 구현예에서, X 는 -O-, -S-, NH-, NRaRb, -CH2-, CRaRb, -C(=CH2)-, 및 -C(=CRaRb)- 로 이루어지는 군으로부터 선택되고,
일부 구현예에서, X 는 -O- 이고;
Y 는 -C(RaRb)-, -C(Ra)=C(Rb)-, -C(Ra)=N-, -O-, -Si(Ra)2-, -S-, -SO2-, -N(Ra)-, 및 >C=Z 로 이루어지는 군으로부터 선택되고,
일부 구현예에서, Y 는 -CH2-, -C(RaRb)-, -CH2CH2-, -C(RaRb)-C(RaRb)-, -CH2CH2CH2-, -C(RaRb)C(RaRb)C(RaRb)-, -C(Ra)=C(Rb)-, 및 -C(Ra)=N- 로 이루어지는 군으로부터 선택되고,
일부 구현예에서, Y 는 -CH2-, -CHRa-, -CHCH3-, CRaRb- 로 이루어지는 군으로부터 선택되고;
또는 -X-Y- 는 함께 2가 링커 기 (또한 라디클로 칭함) 를 나타내고, 함께 -C(RaRb)-, -C(Ra)=C(Rb)-, -C(Ra)=N-, -O-, -Si(Ra)2-, -S-, -SO2-, -N(Ra)-, 및 >C=Z 로 이루어지는 군으로부터 선택되는 1, 2, 3 또는 4 개의 기/원자로 이루어지는 2가 링커 기를 나타내고,
일부 구현예에서, -X-Y- 는 -X-CH2-, -X-CRaRb-, -X-CHRa-, -X-C(HCH3)-, -O-Y-, -O-CH2-, -S-CH2-, -NH-CH2-, -O-CHCH3-, -CH2-O-CH2, -O-CH(CH3CH3)-, -O-CH2-CH2-, OCH2-CH2-CH2-,-O-CH2OCH2-, -O-NCH2-, -C(=CH2)-CH2-, -NRa-CH2-, N-O-CH2, -S-CRaRb- 및 -S-CHRa- 로 이루어지는 군으로부터 선택되는 바이라디클을 나타내고,
일부 구현예에서, -X-Y- 는 -O-CH2- 또는 -O-CH(CH3)- 를 나타내고,
Z 는 -O-, -S-, 및 -N(Ra)- 로부터 선택되고,
Ra 및 존재하는 경우 Rb 는 각각 독립적으로 수소, 임의 치환된 C1-6-알킬, 임의 치환된 C2-6-알케닐, 임의 치환된 C2-6-알키닐, 히드록시, 임의 치환된 C1-6-알콕시, C2-6-알콕시알킬, C2-6-알케닐옥시, 카르복시, C1-6-알콕시카르보닐, C1-6-알킬카르보닐, 포르밀, 아릴, 아릴옥시-카르보닐, 아릴옥시, 아릴카르보닐, 헤테로아릴, 헤테로아릴옥시-카르보닐, 헤테로아릴옥시, 헤테로아릴카르보닐, 아미노, 모노- 및 디(C1-6-알킬)아미노, 카르바모일, 모노- 및 디(C1-6-알킬)-아미노-카르보닐, 아미노-C1-6-알킬-아미노카르보닐, 모노- 및 디(C1-6-알킬)아미노-C1-6-알킬-아미노카르보닐, C1-6-알킬-카르보닐아미노, 카르바미도, C1-6-알카노일옥시, 설포노, C1-6-알킬설포닐옥시, 니트로, 아지도, 설파닐, C1-6-알킬티오, 할로겐으로부터 선택되고, 여기서 아릴 및 헤테로아릴은 임의 치환될 수 있고, 2 개의 같은자리 치환기 Ra 및 Rb 는 함께 임의 치환된 메틸렌 (=CH2) 을 나타내고, 여기서 모든 키랄 중심에 대하여, 비대칭 기는 R 또는 S 배향으로 발견될 수 있고,
R1, R2, R3, R5 및 R5* 는 독립적으로 수소, 임의 치환된 C1-6-알킬, 임의 치환된 C2-6-알케닐, 임의 치환된 C2-6-알키닐, 히드록시, C1-6-알콕시, C2-6-알콕시알킬, C2-6-알케닐옥시, 카르복시, C1-6-알콕시카르보닐, C1-6-알킬카르보닐, 포르밀, 아릴, 아릴옥시-카르보닐, 아릴옥시, 아릴카르보닐, 헤테로아릴, 헤테로아릴옥시-카르보닐, 헤테로아릴옥시, 헤테로아릴카르보닐, 아미노, 모노- 및 디(C1-6-알킬)아미노, 카르바모일, 모노- 및 디(C1-6-알킬)-아미노-카르보닐, 아미노-C1-6-알킬-아미노카르보닐, 모노- 및 디(C1-6-알킬)아미노-C1-6-알킬-아미노카르보닐, C1-6-알킬-카르보닐아미노, 카르바미도, C1-6-알카노일옥시, 설포노, C1-6-알킬설포닐옥시, 니트로, 아지도, 설파닐, C1-6-알킬티오, 할로겐으로 이루어지는 군으로부터 선택되고, 여기서 아릴 및 헤테로아릴은 임의 치환될 수 있고, 2 개의 같은자리 치환기는 함께 옥소, 티옥소, 이미노, 또는 임의 치환된 메틸렌을 나타낼 수 있고,
일부 구현예에서 R1, R2, R3, R5 및 R5* 는 독립적으로 C1-6 알킬, 예컨대 메틸, 및 수소로부터 선택되고,
일부 구현예에서 R1, R2, R3, R5 및 R5* 모두는 수소이고,
일부 구현예에서 R1, R2, R3 은 모두 수소이고, R5 및 R5* 중 하나는 또한 수소이고 R5 및 R5* 중 다른 하나는 수소가 아니고, 예컨대 C1-6 알킬 예컨대 메틸이고,
일부 구현예에서, Ra 는 수소 또는 메틸이고, 일부 구현예에서, 존재하는 경우, Rb 는 수소 또는 메틸이고,
일부 구현예에서, Ra 및 Rb 중 하나 또는 둘 모두는 수소이고,
일부 구현예에서, Ra 및 Rb 중 하나는 수소이고 다른 하나는 수소가 아니고,
일부 구현예에서, Ra 및 Rb 중 하나는 메틸이고, 다른 하나는 수소이고,
일부 구현예에서, Ra 및 Rb 둘 모두는 메틸임].
일부 구현예에서, 바이라디클 -X-Y- 는 -O-CH2- 이고, W 는 O 이고, R1, R2, R3, R5 및 R5* 모두는 모두 수소이다. 상기 LNA 뉴클레오시드는 본원에서 참조 인용되는 WO99/014226, WO00/66604, WO98/039352 및 WO2004/046160 에 개시되어 있고, 베타-D-옥시 LNA 및 알파-L-옥시 LNA 뉴클레오시드로서 통상적으로 공지된 것을 포함한다.
일부 구현예에서, 바이라디클 -X-Y- 는 -S-CH2- 이고, W 는 O 이고, R1, R2, R3, R5 및 R5* 모두는 모두 수소이다. 상기 티오 LNA 뉴클레오시드는 본원에서 참조 인용되는 WO99/014226 및 WO2004/046160 에 개시되어 있다.
일부 구현예에서, 바이라디클 -X-Y- 는 -NH-CH2- 이고, W 는 O 이고, 및 R1, R2, R3, R5 및 R5* 모두는 모두 수소이다. 상기 아미노 LNA 뉴클레오시드는 본원에서 참조 인용되는 WO99/014226 및 WO2004/046160 에 개시되어 있다.
일부 구현예에서, 바이라디클 -X-Y- 는 -O-CH2-CH2- 또는 -O-CH2-CH2-CH2- 이고, W 는 O 이고, R1, R2, R3, R5 및 R5* 모두는 모두 수소이다. 상기 LNA 뉴클레오시드는 본원에서 참조 인용되는 WO00/047599 및 Morita et al, Bioorganic & Med.Chem. Lett. 12 73-76 에 개시되어 있고, 2'-O-4'C-에틸렌 가교된 핵산 (ENA) 으로 통상적으로 공지된 것을 포함한다.
일부 구현예에서, 바이라디클 -X-Y- 는 -O-CH2- 이고, W 는 O 이고, R1, R2, R3 모두, 및 R5 및 R5* 중 하나는 수소이고, R5 및 R5* 중 다른 하나는 수소가 아니고 예컨대 C1-6 알킬, 예컨대 메틸이다. 상기 5' 치환된 LNA 뉴클레오시드는 본원에서 참조 인용되는 WO2007/134181 에 개시되어 있다.
일부 구현예에서, 바이라디클 -X-Y- 은 -O-CRaRb- 이고, 여기서 Ra 및 Rb 중 하나 또는 둘 모두는 수소가 아니고, 예컨대 메틸이고, W 는 O 이고, R1, R2, R3 모두, 및 R5 및 R5* 중 하나는 수소이고, R5 및 R5* 중 다른 하나는 수소가 아니고, 예컨대 C1-6 알킬, 예컨대 메틸이다. 상기 비스 개질된 LNA 뉴클레오시드는 본원에서 참조 인용되는 WO2010/077578 에 개시되어 있다.
일부 구현예에서, 바이라디클 -X-Y- 는 2가 링커 기 -O-CH(CH2OCH3)- 를 나타낸다 (2' O-메톡시에틸 바이시클릭 핵산 - Seth at al., 2010, J. Org. Chem. Vol 75(5) pp. 1569-81). 일부 구현예에서, 바이라디클 -X-Y- 는 2가 링커기 -O-CH(CH2CH3)- (2' O-에틸 바이시클릭 핵산 - Seth at al., 2010, J. Org. Chem. Vol 75(5) pp. 1569-81) 를 나타낸다. 일부 구현예에서, 바이라디클 -X-Y- 는 -O-CHRa- 이고, W 는 O 이고, R1, R2, R3, R5 및 R5* 모두는 모두 수소이다. 상기 6' 치환된 LNA 뉴클레오시드는 본원에서 참조 인용되는 W010036698 및 WO07090071 에 개시되어 있다.
일부 구현예에서, 바이라디클 -X-Y- 는 -O-CH(CH2OCH3)- 이고, W 는 O 이고, R1, R2, R3, R5 및 R5* 모두는 수소이다. 상기 LNA 뉴클레오시드는 당업계에 시클릭 MOE (cMOE) 로 또한 공지되어 있고, WO07090071 에 개시되어 있다.
일부 구현예에서, 바이라디클 -X-Y- 는 2가 링커 기 -O-CH(CH3)- (R- 또는 S- 배열임) 를 나타낸다. 일부 구현예에서, 바이라디클 -X-Y- 은 함께 2가 링커 기 -O-CH2-O-CH2- 를 나타낸다 (Seth at al., 2010, J. Org. Chem). 일부 구현예에서, 바이라디클 -X-Y- 는 -O-CH(CH3)- 이고, W 는 O 이고, R1, R2, R3, R5 및 R5* 모두는 수소이다. 상기 6' 메틸 LNA 뉴클레오시드는 당업계에 cET 뉴클레오시드로 또한 공지되어 있고, (S)cET 또는 (R)cET 입체 이성질체일 수 있다 (본원에서 참조 인용되는 WO07090071 (베타-D) 및 WO2010/036698 (알파-L) 에 개시된 바와 같음).
일부 구현예에서, 바이라디클 -X-Y- 는 -O-CRaRb- 이고, 여기서 Ra 또는 Rb 는 수소이고, W 는 O 이고, R1, R2, R3, R5 및 R5* 모두는 모두 수소이다. 일부 구현예에서, Ra 및 Rb 둘 모두는 메틸이다. 상기 6' 2치환된 LNA 뉴클레오시드는 본원에서 참조 인용되는 WO 2009006478 에 개시되어 있다.
일부 구현예에서, 바이라디클 -X-Y- 는 -S-CHRa- 이고, W 는 O 이고, R1, R2, R3, R5 및 R5* 모두는 모두 수소이다. 상기 6' 치환된 티오 LNA 뉴클레오시드는 본원에서 참조 인용되는 W011156202 에 개시되어 있다. 일부 6' 치환된 티오 LNA 구현예에서, Ra 는 메틸이다.
일부 구현예에서, 바이라디클 -X-Y- 는 -C(=CH2)-C(RaRb)-, 예컨대 -C(=CH2)-CH2-, 또는 -C(=CH2)-CH(CH3)- 이고, W 는 O 이고, R1, R2, R3, R5 및 R5* 모두는 모두 수소이다. 상기 비닐 카르보 LNA 뉴클레오시드는 본원에서 참조 인용되는 WO08154401 및 WO09067647 에 개시되어 있다.
일부 구현예에서 바이라디클 -X-Y- 는 -N(-ORa)- 이고, W 는 O 이고, R1, R2, R3, R5 및 R5* 모두는 모두 수소이다. 일부 구현예에서 Ra 는 C1-6 알킬 예컨대 메틸이다. 상기 LNA 뉴클레오시드는 N 치환된 LNA 로 또한 공지되어 있고, 본원에서 참조 인용되는 WO2008/150729 에 개시되어 있다. 일부 구현예에서, 바이라디클 -X-Y- 는 함께 2가 링커 기 -O-NRa-CH3- 를 나타낸다 (Seth at al., 2010, J. Org. Chem). 일부 구현예에서 바이라디클 -X-Y- 는 -N(Ra)- 이고, W 는 O 이고, R1, R2, R3, R5 및 R5* 모두는 수소이다. 일부 구현예에서 Ra 는 C1-6 알킬 예컨대 메틸이다.
일부 구현예에서, R5 및 R5* 중 하나 또는 둘 모두는 수소이고, 치환된 경우 R5 및 R5* 중 다른 하나는 C1-6 알킬 예컨대 메틸이다. 상기 구현예에서, R1, R2, R3 은 모두 수소일 수 있고, 바이라디클 -X-Y- 은 -O-CH2- 또는 -O-C(HCRa)-, 예컨대 -O-C(HCH3)- 로부터 선택될 수 있다.
일부 구현예에서, 바이라디클은 -CRaRb-O-CRaRb-, 예컨대 CH2-O-CH2- 이고, W 는 O 이고, R1, R2, R3, R5 및 R5* 모두는 수소이다. 일부 구현예에서 Ra 는 C1-6 알킬 예컨대 메틸이다. 상기 LNA 뉴클레오시드는 형태적으로 제한된 뉴클레오티드 (CRN: conformationally restricted nucleotide) 로 또한 공지되어 있고, 본원에서 참조 인용되는 WO2013036868 에 개시되어 있다.
일부 구현예에서, 바이라디클은 -O-CRaRb-O-CRaRb-, 예컨대 O-CH2-O-CH2- 이고, W 는 O 이고, R1, R2, R3, R5 및 R5* 모두는 모두 수소이다. 일부 구현예에서 Ra 는 C1-6 알킬 예컨대 메틸이다. 상기 LNA 뉴클레오시드는 COC 뉴클레오티드로 또한 공지되어 있고, 본원에서 참조 인용되는 Mitsuoka et al., Nucleic Acids Research 2009 37(4), 1225-1238 에 개시되어 있다.
달리 명시되지 않는 한, LNA 뉴클레오시드는 베타-D 또는 알파-L 입체 이성질체일 수 있음이 인식될 것이다.
LNA 뉴클레오시드의 특정 예는 아래 도식 1 에 나타나 있다.
도식 1
Figure 112018108847179-pct00003
예시에 설명된 바와 같이, 본 발명의 일부 구현예에서, 핵산 분자에서의 LNA 뉴클레오시드는 베타-D-옥시-LNA 뉴클레오시드이다.
뉴클레아제 매개된 분해
뉴클레아제 매개된 분해는, 상기 서열과 듀플렉스를 형성할 때 상보적 뉴클레오티드 서열의 분해를 매개할 수 있는 올리고뉴클레오티드를 나타낸다.
일부 구현예에서, 올리고뉴클레오티드는 표적 핵산의 뉴클레아제 매개된 분해를 통해 기능할 수 있고, 여기서 본 발명의 올리고뉴클레오티드는 뉴클레아제, 특히 및 엔도뉴클레아제, 바람직하게는 엔도리보뉴클레아제 (RNase), 예컨대 RNase H 를 동원할 수 있다. 뉴클레아제 매개된 메커니즘을 통해 작동하는 올리고뉴클레오티드 디자인의 예는, 전형적으로 적어도 5 또는 6 개의 DNA 뉴클레오시드의 영역을 포함하고, 친화성 향상 뉴클레오시드, 예를 들어 갭머, 헤드머 및 테일머에 의해 한면 또는 양면에 플랭크 (flank) 되는 올리뉴클레오티드이다.
RNase H 활성 및 동원
안티센스 올리고뉴클레오티드의 RNase H 활성은 상보적 RNA 분자와의 듀플렉스일 때 RNase H 를 동원하는 이의 능력을 나타낸다. WO01/23613 은 RNaseH 를 동원하는 능력을 측정하는데 사용될 수 있는 RNaseH 활성을 측정하기 위한 시험관내 방법을 제공한다. 전형적으로 올리고뉴클레오티드는, 이것이 상보적 표적 핵산 서열과 함께 제공될 때, 시험되는 개질된 올리고뉴클레오티드와 동일한 염기 서열을 갖지만 올리고뉴클레오티드에서의 모든 모노머 사이에 포스포로티오에이트 연결을 갖는 DNA 모노머만을 함유하는 올리고뉴클레오티드를 사용하고, WO01/23613 (본원에서 참조 인용됨) 의 실시예 91-95 에 의해 제공된 방법론을 사용하였을 때 측정된 초기 속도의 적어도 5%, 예컨대 적어도 10% 또는 20 % 초과의 초기 속도 (pmol/l/min 으로 측정됨) 를 갖는다.
갭머
본원에서 사용된 바와 같은 용어 갭머는 하나 이상의 친화성 향상 개질된 뉴클레오시드를 포함하는 영역 (플랭크 또는 윙) 에 의해 플랭크된 5' 및 3' 인 올리고뉴클레오티드를 동원하는 RNase H 의 영역 (갭) 을 포함하는 안티센스 올리고뉴클레오티드를 나타낸다. 다양한 갭머 디자인은 본원에 기재되어 있다. 헤드머 및 테일머는 플랭크 중 하나가 누락되어 있는, 즉 올리고뉴클레오티드의 말단 중 오로지 하나가 친화성 향상 개질된 뉴클레오시드를 포함하는 RNase H 를 동원할 수 있는 올리고뉴클레오티드이다. 헤드머의 경우, 3' 플랭크가 누락되어 있고 (즉, 5' 플랭크는 친화성 향상 개질된 뉴클레오시드를 포함함) 및 테일머의 경우, 5' 플랭크가 누락되어 있다 (즉, 3' 플랭크는 친화성 향상 개질된 뉴클레오시드를 포함함).
LNA 갭머
용어 LNA 갭머는 친화성 향상 개질된 뉴클레오시드 중 적어도 하나가 LNA 뉴클레오시드인 갭머 올리고뉴클레오티드이다.
혼합된 윙 갭머
용어 혼합된 윙 갭머 또는 혼합된 플랭크 갭머는, 플랭크 영역 중 적어도 하나가 적어도 하나의 LNA 뉴클레오시드 및 적어도 하나의 비-LNA 개질된 뉴클레오시드, 예컨대 적어도 하나의 2' 치환된 개질된 뉴클레오시드, 예컨대 예를 들어, 2'-O-알킬-RNA, 2'-O-메틸-RNA, 2'-알콕시-RNA, 2'-O-메톡시에틸-RNA (MOE), 2'-아미노-DNA, 2'-플루오로-RNA 및 2'-F-ANA 뉴클레오시드(들) 를 포함하는 LNA 갭머를 나타낸다. 일부 구현예에서, 혼합된 윙 갭머는 오로지 LNA 뉴클레오시드 (예를 들어 5' 또는 3') 만을 포함하는 하나의 플랭크를 갖고, 다른 플랭크 (각각 3' 또는 5') 는 2' 치환된 개질된 뉴클레오시드(들) 및 임의로는 LNA 뉴클레오시드를 포함한다.
갭브레이커
용어 "갭브레이커 올리고뉴클레오티드" 는 심지어 갭 영역이 비-RNaseH 동원 뉴클레오시드 (갭-브레이커 뉴클레오시드, E) 에 의해 파괴되어, 갭 영역이 5 개 미만의 연속적 DNA 뉴클레오시드를 포함함에도 불구하고 RNAseH 동원을 유지할 수 있는 갭머와 관련하여 사용된다. 비-RNaseH 동원 뉴클레오시드는 예를 들어 3' 엔도 형태의 뉴클레오시드, 예컨대 뉴클레오시드의 리보오스 당 고리의 C2' 와 C4' 사이의 가교가 베타 형태인 LNA, 예컨대 베타-D-옥시 LNA 또는 ScET 뉴클레오시드이다. RNaseH 를 동원하는 갭브레이커 올리고뉴클레오티드의 능력은 전형적으로 서열 또는 심지어 화합물 특이적이다 - Rukov et al. 2015 Nucl. Acids Res. Vol. 43 pp. 8476-8487 (이는 일부 경우에서, 표적 RNA 의 더 많은 특이적 절단을 제공하는 RNaseH 를 동원하는 "갭브레이커" 올리고뉴클레오티드를 개시함) 참조.
일부 구현예에서, 본 발명의 올리고뉴클레오티드는 갭브레이커 올리고뉴클레오티드이다. 일부 구현예에서, 갭브레이커 올리고뉴클레오티드는 5'-플랭크 (F), 갭 (G) 및 3'-플랭크 (F') 를 포함하고, 여기서 갭은 비(非)-RNaseH 동원 뉴클레오시드 (갭-브레이커 뉴클레오시드, E) 에 의해 파괴되어, 갭이 적어도 3 또는 4 개의 연속적인 DNA 뉴클레오시드를 함유한다. 일부 구현예에서, 갭브레이커 뉴클레오시드 (E) 는, 뉴클레오시드의 리보오스 당 고리의 C2' 와 C4' 사이의 가교가 베타 형태이고 갭 영역 내에 배치되어, 갭-브레이커 LNA 뉴클레오시드가 적어도 3 (5') 및 3 (3') 또는 적어도 3 (5') 및 4 (3') 또는 적어도 4 (5') 및 3 (3') 개의 DNA 뉴클레오시드에 의해 플랭크된 5' 및 3' 이고, 여기서 올리고뉴클레오티드는 RNaseH 를 동원할 수 있는 LNA 뉴클레오시드이다.
갭브레이커 올리고뉴클레오티드는 하기 화학식에 의해 나타내어질 수 있다:
Figure 112018108847179-pct00004
여기서 영역 D' 및 D" 는 섹션 "갭머 디자인" 에 기재된 바와 같다.
일부 구현예에서, 갭브레이커 뉴클레오시드 (E) 는 베타-D-옥시 LNA 또는 ScET 또는 또다른 베타-LNA 뉴클레오시드 (도식 1) 에 나타냄) 이다.
생절단성 링커 (Biocleavable linker)
본 발명에 따른 "생절단성 링커" 는 포유동물의 신체에서 통상적으로 맞닥뜨리는 조건 또는 맞닥뜨리는 조건과 유사한 조건 하에 절단될 수 있는 생리학적으로 불안정한 결합을 포함하거나 이로 이루어진다. 생리학적으로 불안정한 링커가 화학적 변형 (예를 들어, 절단) 되는 조건은, 화학적 조건 예컨대 pH, 온도, 산화 또는 환원 조건 또는 작용제, 및 포유동물 세포에서 발견되는 염 농도 또는 포유동물 세포에서 맞닥뜨리는 염 농도와 유사한 염 농도를 포함한다. 포유동물의 세포내 조건은 또한 단백분해 효소 또는 가수분해 효소 또는 뉴클레아제로부터와 같은 포유동물 세포에 정상적으로 존재하는 효소 활성의 존재를 포함한다. 한 구현예에서, 생절단성 링커는 S1 뉴클레아제 절단되기 쉽다. 바람직한 구현예에서, 뉴클레아제 민감성 링커는 1 내지 10 개의 뉴클레오시드, 예컨대 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 또는 10 개의 뉴클레오시드, 더 바람직하게는 2 내지 6 개의 뉴클레오시드 및 가장 바람직하게는 2 내지 4 개의 연결된 뉴클레오시드 (적어도 2 개의 연속적 포스포디에스테르 연결, 예컨대 적어도 3 또는 4 또는 5 개의 연속적 포스포디에스테르 연결을 포함함) 를 포함한다. 바람직하게는, 뉴클레오시드는 DNA 또는 RNA 이다. 포스포디에스테르 함유 생절단성 링커는 WO 2014/076195 (본원에서 참조 인용됨) 에 더 상세하게 기재되어 있다. GalNAc 콘쥬게이트 모이어티 사이의 연결은 특정 구현예에서, 생절단성 포스포디에스테르 연결 (예를 들어 화학식 (VII) 또는 (VIII) 참조) 이고, 이러한 포스포디에스테르 연결 이외에 추가 포스포디에스테르 연결은, GalNAc 모이어티와 표적에 상보적인 안티센스 올리고뉴클레오티드 사이에 예를 들어 포스포디에스테르 연결된, 뉴클레오시드, 디뉴클레오티드 또는 트리뉴클레오티드를 삽입함으로써 도입될 수 있다. 바람직한 구현예에서, 포스포디에스테르 연결된 디뉴클레오티드는 데옥시시티딘-데옥시아데노신 (ca) 디뉴클레오티드이다.
치료
본원에서 사용되는 바와 같은 용어 '치료' 는, 기존 질환 (예를 들어, 본원에서 언급된 질환 또는 장애) 의 치료 또는 질환의 방지, 즉 예방을 나타낸다. 따라서, 본원에서 나타내어지는 치료는 일부 구현예에서 예방적일 수 있는 것으로 인식될 것이다.
본 발명의 상세한 설명
트리틸-모노-GalNAc 화합물
한 양상에서, 본 발명은 신규한 모노-N-아세틸갈락토사민 (GalNAc) 화합물에 관한 것이다. 따라서, 본 발명은 하기로 나타내어지는 화학식 (I) 을 갖는 화합물 및 이의 임의의 염을 제공한다:
Figure 112018108847179-pct00005
[식 중, R1 은 H 또는 C1-6 알킬이고;
R2 는 트리페닐메틸-기반 히드록실 보호기이고,
R3 은 인-함유 기, 특히 포스포르아미다이트 또는 포스포노아미다이트 기이고,
K 는 하기 화학식 (II) 로 나타내어지고:
Figure 112018108847179-pct00006
(식 중, A1 는 각 경우에 동일 또는 상이할 수 있는 히드록실 보호기이고, L 은 링커임)].
화학식 (I) 의 화합물은 키랄이고, 적어도 하나의 비대칭 탄소 원자 또는 거울상 이성질체 중심을 갖는다. 본 발명은 화학식 (I) 의 화합물의 모든 거울상 이성질체 뿐만 아니라 이의 모든 가능한 혼합물을 포함한다.
L 은 특히 탄소 원자 및 임의로는 헤테로원자 예컨대 N 및/또는 O 원자로부터 선택되는 2-30 개의 원자의 사슬 길이를 갖는 링커 기이다. L 은 GalNAc 화합물의 원하는 적용에 따라 선택된다. PCT/EP2015/073331 에서, 링커 길이가 놀랍게도 기능성 GalNAc 클러스터를 생성하는 것과 관련하여 유연하다는 것이 밝혀졌다. 일부 구현예에서, 사슬은 하나 이상의 -NH-CO-, -CO-NH- 기 및/또는 헤테로원자, 특히 O 를 함유할 수 있다. 대체의 수는, 링커의 총 길이가 대체 이후에 30 개의 원자를 초과하지 않고, -NH-CO-, -CO-NH 의 경우 탄소 원자로서 대체에 대해 적어도 하나의 이웃한 원자를 유지하고 헤테로원자 대체의 경우 적어도 2 개의 이웃한 탄소 원자를 유지하도록 적합화되어야 한다. 일부 구현예에서, 대체의 수는 5 미만이고, 대체에 대해 이웃한 원자는 탄소 원자이다. 일부 구현예에서, 1 개 이하 또는 2 개의 대체는 사슬에서 이루어지고, 대체에 대해 이웃한 원자는 탄소 원자이다. 예를 들어, GalNAc 와 포스포르아미다이트 사이의 링커는 단순 디올로부터 유래될 수 있다. 이론적으로, 임의의 대칭 또는 비대칭 디올은 본 발명의 GalNAc 포스포르아미다이트에서 링커로서 사용될 수 있고, 단 이는 다른 친핵성 기를 함유하지 않는다. 일부 구현예에서, 사슬 내의 탄소 원자는 -(CH2CH2O)- 기의 배열 (array) 을 형성하기 위해 산소 원자로 대체된다.
특정 구현예에서, L 은 C2-C30-알킬렌, C2-C30-알케닐렌, 및 -(CH2)0-8(CH2CH2O)0-8-(CH2)0-4- (식 중, 개별 기는 L 이 적어도 2 개의 C-원자를 함유하도록 선택됨) 로 이루어지는 군으로부터 선택되고, 각각은 카르보닐 기 (-C(O)-) 에 부착된다. 더 구체적으로, 링커 기 L 은 -(CH2)m-C(O)- (식 중, m = 2-12, 특히 4, 5 또는 11 임); -(CH2-CH2-O)n-CH2-C(O)- (식 중, n = 1-5, 특히 2, 3 또는 4 및 더욱 특히 3 임); -(CH2)m1-CO-NH-(CH2)m2-NH-C(O)- (식 중, ml 및 m2 은 각각 독립적으로 1-5, 특히 3, 4 또는 5 임); -(CH2)m3-CO-NH-(CH2)m4-C(O)- (식 중, m3 및 m4 는 각각 독립적으로 1-5, 특히 3, 4 또는 5 임); -(CH2)m6-NH-C(O)- (식 중, m6 은 2-12, 특히 12 임) 로 이루어지는 군으로부터 선택될 수 있고; 여기서 각각의 경우에 C(O)- 는 NR1 에 부착된다.
특히 링커 기 L 은 -(CH2)4-C(O)-, -(CH2)5-C(O)-, -(CH2)11-C(O)-, -(CH2)6-NH-C(O)-, -(CH2)12-NH-C(O)-, -(CH2)5-CO-NH-(CH2)5-C(O)-, -(CH2)4-CO-NH-(CH2)3-NH-C(O)-, -(CH2)4-CO-NH-(CH2)4-NH-C(O)-, -(CH2)5-CO-NH-(CH2)3-NH-C(O)-, -(CH2)5-CO-NH-(CH2)4-NH-C(O)-, -(CH2)6-NH-CO-CH2-NH-C(O)-, -(CH2CH2O)2-(CH2)2-NH-C(O)- 로 이루어지는 군으로부터 선택될 수 있고, 여기서 각각의 경우에 C(O)- 는 NR1 에 부착된다. 한 바람직한 구현예에 따르면, L 은 화학식 (CH2CH2O)3-CH2-C(O)- (식 중, C(O)- 는 NR1 에 부착됨) 로 나타내어지는 트리에틸렌글리콜 (TEG)-아세테이트 링커이다.
GalNAc 모이어티는 알파 또는 베타 배열일 수 있다. 바람직한 구현예에서, GalNAc 모이어티는 베타 배열이다.
본원에서 사용된 바와 같은 용어 "GalNAc 모이어티" 는 GalNAc 를 포함하는 구조의 N-아세틸갈락토사민 (GalNAc) 부분이다. 예를 들어, 화학식 (II) 에서, GalNAc 모이어티는 L 을 구성하지 않는 분자의 일부이다.
본원에서 사용된 바와 같은 용어 "GalNAc 콘쥬게이트 모이어티" 는 적어도 하나의 GalNAc 모이어티를 포함하고 특정 질환의 치료에서의 약물로서 사용될 수 있는 생체분자, 특히 핵산에 콘쥬게이트될 수 있는 분자를 나타낸다. 바람직하게는, GalNAc 콘쥬게이트 모이어티는 아시알로글리코 단백질 수용체에 대해 친화성을 갖는다.
화학식 (I) 의 R1 은 수소 및 C1-C6-알킬, 특히 수소, 메틸, 에틸, 프로필, 이소프로필, n-부틸, sec-부틸, t-부틸, n-펜틸 및 n-헥실로부터 선택된다. 특정 바람직한 구현예에서, R1 은 수소이다.
화학식 (I) 에서 R2 는 트리페닐메틸-기반 히드록실 보호기이다. 특히, R2 는 트리페닐메틸, 메톡시트리틸 및 디메톡시트리틸로부터 선택된다. 특정 바람직한 구현예에서, R2 는 디메톡시트리틸 (DMT) 이다.
화학식 (I) 에서 R3 은 인-함유 기이다. 본원에서 사용된 바와 같은 용어 "인 함유 기" 또는 "포스포르아미다이트" 는, 적어도 하나의 질소 원자에 공유 결합되는 산화 상태 III 에서 인 원자를 함유하는 임의의 화합물을 의미한다. 본 발명의 바람직한 포스포르아미다이트는, 적어도 하나의 질소 원자 및 2 개의 산소 원자에 공유결합적으로 결합되는 산화 상태 III 의 인 원자를 함유하는 화합물 ("엄밀한 의미로 포스포르아미다이트") 이다. 대안적으로, 본 발명의 포스포르아미다이트는 적어도 하나의 질소 원자 및 하나의 산소 원자에 공유결합적으로 결합되고, 제 2 산소 대신에 황 원자 ("티오포스포르아미다이트") 또는 C1-C6-알킬 기 ("포스포노아미다이트") 를 갖는 산화 상태 III 의 인 원자를 함유하는 화합물이다.
특정 구현예에서, R3 은 하기 화학식 (III) 으로 나타내어진다:
Figure 112018108847179-pct00007
[식 중, R4 및 R5 는 독립적으로 C1-6 알킬로부터 선택되거나, R4 및 R5 는 함께 5- 또는 6-원 고리 (이는 치환될 수 있고, N 및 O 로부터 선택되는 하나의 추가 헤테로원자를 함유할 수 있음) 를 형성하고; X 는 O 또는 S 이고; n 은 0 또는 1 이고; R6 은 티오, 옥소, 할로 및/또는 CN 으로 임의 치환된 C1-8 알킬임].
특정 구현예에서, 화학식 (III) 에서 아미노 기 -NR4R5 의 R4 및 R5 는 독립적으로 C1-C6-알킬, 특히 메틸, 에틸, 프로필, 이소프로필, n-부틸, sec-부틸, t-부틸, n-펜틸 및 n-헥실로부터 선택된다. 특정 구현예에서, R4 및 R5 와 동일하고, -NR4R5 은 이때 바람직하게는 디메틸아미노, 디에틸아미노, 디이소프로필아미노, 및 디부틸아미노로 이루어지는 군으로부터 선택된다. 바람직한 구현예에서 R4 및 R5 각각은 이소프로필이다. 다른 구현예에서, R4 및 R5 는 함께 5- 또는 6-원 고리 (이는 치환될 수 있고, N 및 O 로부터 선택되는 하나의 추가 헤테로원자를 함유할 수 있음) 를 형성한다. 일부 구현예에서, R4 및 R5 는 비치환된 5-원 고리를 형성하고, 다른 구현예에서, 이는 비치환된 6-원 고리를 형성한다. 보다 추가의 구현예에서, 5-원 또는 6-원 고리는 하나 이상의 탄소 원자에서 치환된다. 예를 들어, 고리는 1, 2, 3 또는 4 개의 탄소 원자, 바람직하게는 1 또는 2 탄소 원자에서 치환될 수 있다. 바람직한 치환기는 메틸 및 에틸이다. 특히, 고리는 피롤리디노, 피페리디노, 2,6-디메틸피페리디노, 모르폴리노, 이미다졸릴 및 4-메틸이미다졸릴로 이루어지는 군으로부터 선택된다.
화학식 (III) 의 모이어티 XR6 은 일부 구현예에 따르면, C1-C6-알킬, 특히 메틸 및 에틸로 이루어지는 군으로부터 선택된다.
추가 구현예에서, XR6 은 보호된 히드록시 기 (-OH) 또는 보호된 티오 기 (-SH) 이다. 예시적인 비-제한된 보호된 히드록시 기는 에테르 기이고, 예시적인 비-제한된 보호된 티오 기는 티오에테르 기이다. 특히, XR6 로 나타내어지는 보호된 -OH 또는 -SH 기는 2-시아노에톡시, 2-시아노에틸티오, 메톡시, 에톡시, S-이소부타노일-2-(2-메르캅토-에톡시)에톡시, S-피발로일-2-(2-메르캅토-에톡시)에톡시, 및 S-피발로일-2-메르캅토에톡시로 이루어지는 군으로부터 선택된다. 바람직한 구현예에서, XR6 은 2-시아노에톡시 기이다.
특정 바람직한 구현예에서, NR4R5 은 디메틸아미노, 디에틸아미노, 디-n-프로필아미노, 디이소프로필아미노, 디부틸아미노, 피롤리디노, 피페리디노, 2,6-디메틸피페리디노, 모르폴리노, 이미다졸릴, 및 4-메틸이미다졸릴로부터 선택되고, XR6 은 메틸, 에틸, 2-시아노에틸옥시, 2-시아노에틸티오, 메톡시, 에톡시, S-이소부타노일-2-(2-메르캅토에톡시)에톡시, S-피발로일-2-(2-메르캅토에톡시)에톡시, 및 S-피발로일-2-메르캅토에톡시로부터 선택된다. 한 구현예에 따르면, NR4R5 는 디이소프로필아미노이고, XR6 은 2-시아노에톡시이다.
화학식 (II) 의 히드록실 보호기 A1 의 경우, 많은 상이한 가능성이 이용가능하다. 당업자는 포스포르아미다이트의 제조 방법, 및 올리고뉴클레오티드 합성 방법의 커플링 및 산화 단계에서 사용된 반응 조건에 대해 안정한 보호기를 어떻게 선택하는지를 알고 있을 것이다. 화학식 (II) 에 따른 적합한 히드록실 보호기 A1 의 예로서, 아실 기 및 실릴 기가 언급될 수 있다. 바람직하게는, 보호기 A1 은 아세틸, 벤조일, 페녹시-아세틸, 디메톡시트리틸 (DMT), 피발로일, 이소부티릴, t-부틸디메틸실릴, t-부틸디페닐실릴, 트리이소프로필실릴 및 이소프로필디메틸실릴로 이루어지는 군으로부터 선택된다.
일부 구현예에서, 아세틸은 보호기 A1 로서 사용된다. 화학식 (I) 에 따른 GalNAc 포스포르아미다이트가 핵산 콘쥬게이트의 합성에서 사용되는 경우, 아세틸 기는 예를 들어 LNA 합성에서 통상적으로 사용되는 절단 및 탈보호 단계에서, 핵산, 예를 들어 LNA 또는 DNA 의 보호기와 함께 제거될 수 있다.
일부 구현예에서, 디메톡시트리틸 (DMT) 는 GalNAc 모이어티의 탄소 원자 6 에서 보호기 A1 로서 사용된다. 이러한 위치에서 DMT 를 사용하는 것의 장점은, 이것이 정제 동안 실패 서열 (failure sequence) (예를 들어, 합성에서의 실패가, 첨가되지 않은 GalNAc 모이어티를 야기하는 불완전한 구조물) 의 용이한 분리를 허용한다는 것이다.
일부 구현예에서, 본 발명의 트리틸-모노-GalNAc 포스포르아미다이트는 하기 화학식 (XVI) 로 나타내어진다:
Figure 112018108847179-pct00008
.
상기 식에서, L 은 -(CH2)4-C(O)-, -(CH2)5-C(O)-, -(CH2)11C(O)-, -(CH2)6-NH-C(O)-, -(CH2)12-NH-C(O)-, -(CH2)5-CO-NH-(CH2)5-C(O)-, -(CH2)4-CO-NH-(CH2)3-NH-C(O)-, -(CH2)4-CO-NH-(CH2)4-NH-C(O)-, -(CH2)5-CO-NH-(CH2)3-NH-C(O)-, -(CH2)5-CO-NH-(CH2)4-NH-C(O)-, -(CH2)6-NH-CO-CH2-NH-C(O)-, -(CH2CH2O)2-(CH2)2-NH-C(O)- 로 이루어지는 군으로부터 선택되는 링커이고, 여기서 각각의 경우에 C(O)- 는 N 에 부착된다. 한 바람직한 구현예에 따르면, L 은 화학식 (CH2CH2O)3-CH2-C(O)- (식 중, C(O)- 는 N 에 부착됨) 로 나타내어지는 트리에틸렌글리콜 (TEG)-아세테이트 링커이다.
본 발명에 따른 특정 구현예에서, 화합물은 화학식 (I) 을 갖고, 여기서 R1 은 H 이고, R2 는 4,4'-디메톡시트리틸이고, R3 은 화학식 (III) 로 나타내어지고, 여기서 NR4R5 는 디이소프로필아미노이고, XR6 은 2-시아노에톡시이고, K 는 화학식 (II) 로 나타내어지고, 여기서 L 은 TEG-아세테이트이고, A1 은 아세틸이다.
한 구현예에서, 본 발명의 트리틸-모노-GalNAc 포스포르아미다이트는 하기 화학식 (XV) 로 나타내어진다:
Figure 112018108847179-pct00009
.
한 구현예에서, 본 발명의 트리틸-모노-GalNAc 포스포르마이다이트는 (2R,3R,4R,5R,6R)-5-아세트아미도-2-(아세톡시메틸)-6-((4-((((2-시아노에톡시)(디이소프로필아미노)포스파닐)옥시)메틸)-1,1-비스(4-메톡시페닐)-6-옥소-1-페닐-2,8,11,14-테트라옥사-5-아자헥사데칸-16-일)옥시)테트라히드로-2H-피란-3,4-디일 디아세테이트이다.
GalNAc 콘쥬게이트
추가 양상에서, 본 발명은 신규한 GalNAc 콘쥬게이트, 예컨대 생체분자-GalNAc 콘쥬게이트, 특히 GalNAc-핵산 콘쥬게이트에 관한 것이다. 상기 기재된 모노-GalNAc 화합물은 모노-GalNAc 모이어티와 생체분자의 콘쥬게이트를 생성하는데 사용될 수 있다. GalNAc 콘쥬게이트 모이어티는 부착된 생체분자, 특히 부착된 핵산의 약동학적 및 약력학적 특성을 개질 또는 향상시킬 수 있다.
본 발명의 모노-GalNAc 화합물의 커플링이 주로 본원의 핵산 분자와 관련하여 기재되는 한편, 유사한 커플링이 마찬가지로 다른 생체분자와 함께 가능하다는 것이 이해되어야 한다.
본 발명에 따르면, 생체분자, 특히 핵산 분자에의 혼입을 위한 빌딩 블록으로서 청구항 제 1 항 내지 제 11 항 중 어느 한 항에 따른 화학식 (I) 의 화합물의 사용이 고려된다. 특정 구현예에서, 이러한 사용은 화학식 (I) 의 화합물이 혼입되는 생체분자가 증가된 효능을 갖는다는 효과를 가질 수 있다. 특히, 개질된 생체분자는 향상된 약동학적 및 약력학적 특성을 나타낸다. 예를 들어, 화합물은 GalNAc 화합물이 없는 생체분자와 비교했을 때, 간, 특히 간세포에서 생체분자의 효과를 증가시킨다.
상기 언급된 바와 같이, 핵산 분자는 본 발명에 따른 특정 관심 대상의 생체분자이다. 따라서, 본 발명은 한 양상에서, 본원에서 정의된 바와 같은 화학식 (I) 의 화합물로부터 유래된 적어도 하나의 빌딩 블록이 5'-말단 및/또는 3'-말단에 부착된 핵산 분자에 관한 것이다. 일부 구현예에서, 화학식 (I) 의 화합물로부터 유래된, 즉 트리틸-모노-GalNAc 포스포르아미다이트로부터 유래된 적어도 하나의 빌딩 블록은 핵산 분자의 5'-말단에 부착되고, 예컨대 2 GalNAc 화합물, 예컨대 3 GalNac 화합물, 예컨대 4 GalNAc 화합물, 예컨대 5 GalNAc 화합물 (핵산 분자의 5' 말단에 부착됨) 이다. 다른 구현예에서, 화학식 (I) 의 화합물로부터 유래된 적어도 하나의 빌딩 블록은 핵산 분자의 3'-말단에 부착된다. 보다 추가의 구현예에서, 화학식 (I) 의 화합물로부터 유래된 적어도 하나의 빌딩 블록은 5'-말단에 부착되고, 화학식 (I) 의 화합물로부터 유래된 적어도 하나의 빌딩 블록은 핵산 분자의 3'-말단에 부착에 부착되고, 예컨대 2 GalNAc 화합물, 예컨대 3 GalNac 화합물, 예컨대 4 GalNAc 화합물, 예컨대 5 GalNAc 화합물 (핵산 분자의 5' 말단에 부착됨) 이다. 일부 구현예에서, 핵산 분자와 GalNAc 화합물 사이의 연결은 포스포디에스테르 연결이다. 다중 GalNAc 화합물이 핵산 분자에 콘쥬게이트되는 구현예에서, 제 1 GalNac 화합물과 제 2 GalNAc 화합물 사이의 연결 (핵산 분자의 말단으로부터 카운트되는 경우) 은 포스포디에스테르 연결이다. 추가 구현예에서, 제 1 과 제 2 및 제 2 와 제 3 GalNAc 화합물 사이의 연결은 포스포디에스테르 연결이다. 일부 구현예에서, GalNAc 화합물 사이의 모든 연결은 포스포디에스테르 연결이다.
특히, 상기 5'- 및/또는 3'- 말단 개질된 핵산 분자는 하기로 나타내어지는 화학식 (IV) 를 갖는 화합물 및 이의 임의의 염을 포함한다:
5'-R7O-(Y1)p-NA-(Y2)q-OR8-3' (IV).
화학식 (IV) 에서, NA 는 핵산 분자이고; p 및 q 는 0 내지 6; 특히 0 내지 4 의 정수이고, 단, p+q 는 적어도 1 이다. 이는, 핵산 분자가 본 발명에 따른 적어도 하나의 모노-GalNAc 콘쥬게이트 모이어티로 개질됨을 의미한다. 12 개 이하의 모노-GalNAc 콘쥬게이트 모이어티, 즉 최대 6 개가 어느 한 쪽의 말단에 존재하는 것이 가능하다. 모노-GalNAc 함유 모이어티의 바람직한 수가 아래에 제시된다.
화학식 (IV) 에서 R7 은 H, 트리페닐메틸-기반 히드록실 보호기 또는 5'-히드록실 캡핑기로부터 선택되고; R8 은 H 또는 3'-히드록실 캡핑기로부터 선택된다. 또한 Y1 은 각각의 경우에 독립적으로 하기 화학식 (V) 의 화합물로 나타내어진다:
Figure 112018108847179-pct00010
[식 중, R1 은 H 또는 C1-6 알킬이고, K' 는 하기 화학식 (II') 로 나타내어지고:
Figure 112018108847179-pct00011
Z1 및 Z2 는 각각의 경우에 독립적으로 O 및 S 로부터 선택됨].
보다 더욱, Y2 는 각각의 경우에 독립적으로 하기 화학식 (VI) 의 화합물로 나타내어진다:
Figure 112018108847179-pct00012
[식 중, R1 은 H 또는 C1-6 알킬이고, K' 는 하기 화학식 (II') 로 나타내어지고:
Figure 112018108847179-pct00013
Z1 및 Z2 는 각각의 경우에 독립적으로 O 및 S 로부터 선택됨].
독립적으로 화학식 (II') 의 각각의 외관에서, L 은 링커, 특히 상기 정의된 바와 같이 2-30 개의 원자의 사슬 길이를 갖는 링커 기이고, Z1 및 Z2 는 각각의 경우에 독립적으로 O 및 S 로부터 선택된다. 특정 구현예에서, 화학식 (II') 에서 링커 기 L 은 -(CH2)m-C(O)- (식 중, m = 2-12, 특히 4, 5 또는 11 임); -(CH2-CH2-O)n-CH2-C(O)- (식 중, n = 1-5, 특히 2, 3 또는 4 및 더욱 특히 3 임); -(CH2)m1-CO-NH-(CH2)m2-NH-C(O)- (식 중, ml 및 m2 은 각각 독립적으로 1-5, 특히 3, 4 또는 5 임); -(CH2)m3-CO-NH-(CH2)m4-C(O)- (식 중, m3 및 m4 은 각각 독립적으로 1-5, 특히 3, 4 또는 5 임); -(CH2)m6-NH-C(O)- (식 중, m6 은 2-12, 특히 12 임) 로 이루어지는 군으로부터 선택되고; 각각의 경우에 C(O)- 는 NR1 에 부착된다.
특히, 화학식 (II') 에서 링커 기 L 은 -(CH2)4-C(O)-, -(CH2)5-C(O)-, -(CH2)11-C(O)-, -(CH2)6-NH-C(O)-, -(CH2)12-NH-C(O)-, -(CH2)5-CO-NH-(CH2)5-C(O)-, -(CH2)4-CO-NH-(CH2)3-NH-C(O)-, -(CH2)4-CO-NH-(CH2)4-NH-C(O)-, -(CH2)5-CO-NH-(CH2)3-NH-C(O)-, -(CH2)5-CO-NH-(CH2)4-NH-C(O)-, -(CH2)6-NH-CO-CH2-NH-C(O)-, -(CH2CH2O)2-(CH2)2-NH-C(O)- 로 이루어지는 군으로부터 선택되고, 여기서 각각의 경우에 C(O)- 는 NR1 에 부착된다. 한 바람직한 구현예에 따르면, L 은 화학식 (CH2CH2O)3-CH2-C(O)- (식 중, C(O)- 는 NR1 에 부착됨) 로 나타내어지는 트리에틸렌글리콜 (TEG)-아세테이트 링커이다.
핵산 분자의 일부 구현예에서, Z1 는 S 이고 Z2 는 O 이거나, Z1 및 Z2 둘 모두는 O 이다. Z1 및 Z2 가 하나의 핵산 분자에서 1 회 초과로 나타나는 경우, 독립적으로 각 경우에 Z1 은 S 이고 Z2 는 O 이거나, Z1 및 Z2 둘 모두는 O 이다.
특정 바람직한 구현예에서, 핵산 분자는 5'-말단 또는 3'-말단에서 개질되는데, 즉 화학식 (IV) 에서 p 또는 q 는 영 (0) 이다. 따라서, 일부 구현예에서, q 는 0 이다. 특정 바람직한 구현예에서, p 는 1 이고, q 는 0 이거나; p 는 2 이고 q 는 0 이거나; p 는 3 이고 q 는 0 이거나; p 는 4 이고 q 는 0 이다. 다른 구현예에서, p 는 0 이다. 특정 바람직한 구현예에서, p 는 0 이고 q 는 1 이거나; p 는 0 이고 q 는 2 이거나; p 는 0 이고 q 는 3 이거나; p 는 0 이고 q 는 4 이다. 한 바람직한 특정 구현예에서, p 는 3 이고 q 는 0 이다. 또다른 바람직한 특정 구현예에서, p 는 0 이고 q 는 3 이다.
추가 특정 구현예에서, 5'-말단 개질된 핵산 분자는 하기 화학식 (VII-XY) 로 나타내어진다:
Figure 112018108847179-pct00014
[식 중, n 은 0 내지 6 의 정수이고, Y 및 X 는 독립적으로 S 및 O 로부터 선택됨].
추가 특정 구현예에서, 5'-말단 개질된 핵산 분자는 하기 화학식 (VII-OO) 로 나타내어진다:
Figure 112018108847179-pct00015
[식 중, n 은 0 내지 6, 예컨대 1 내지 5, 예컨대 2 내지 4, 예컨대 1, 2 또는 3 의 정수임].
추가 특정 구현예에서, 5'-말단 개질된 핵산 분자는 하기 화학식 (VII) 로 나타내어진다:
Figure 112018108847179-pct00016
[식 중, n 은 0 내지 6, 예컨대 1 내지 5, 예컨대 2 내지 4, 예컨대 1, 2 또는 3 의 정수임]. 추가 특정 구현예에서, 3'-말단 개질된 핵산 분자는 하기 화학식 (VIII-XY) 로 나타내어진다:
Figure 112018108847179-pct00017
[식 중, n 은 0 내지 6 의 정수이고, Y 및 X 는 독립적으로 S 및 O 로부터 선택됨].
추가 특정 구현예에서, 3'-말단 개질된 핵산 분자는 하기 화학식 (VIII-OO) 로 나타내어진다:
Figure 112018108847179-pct00018
[식 중, n 은 0 내지 6, 예컨대 1 내지 5, 예컨대 2 내지 4, 예컨대 1, 2 또는 3 의 정수임].
추가 특정 구현예에서, 3'-말단 개질된 핵산 분자는 하기 화학식 (VIII) 로 나타내어진다:
Figure 112018108847179-pct00019
[식 중, n 은 0 내지 6, 예컨대 1 내지 5, 예컨대 2 내지 4, 예컨대 1, 2 또는 3 의 정수임].
화학식 (VII) 및 화학식 (VIII) 에서 용어 올리고뉴클레오티드는 특히 본원에 기재된 바와 같이 핵산의 폭넓은 맥락에서 이해되어야 한다.
본 발명에 따른 모노-GalNAc 핵산 콘쥬게이트는 아시알로글리코 단백질 수용체 (ASGPR) 에 결합하기 위해 특이적으로 설계될 수 있다. 따라서, 일부 구현예에 따르면, 본 발명에 따른 1가, 2가 또는 바람직하게는 3가 GalNAc 핵산 콘쥬게이트는 ASGPR 에 대해 강한 친화성을 갖는다. 본 발명과 관련하여 "강한 친화성" 은 50 nM 미만, 바람직하게는 25 nM 이하, 더 바람직하게는 10 nM 이하, 더 바람직하게는 5 nM 이하의 IC50 값에 의해 특징지어지는 친화성을 의미한다.
특히 바람직한 구현예에서, 1가 GalNAc-핵산 콘쥬게이트의 ASGPR 에 대한 IC50 은 50 nM, 바람직하게는 25 nM 이하, 더 바람직하게는 15 nM 이하, 더 바람직하게는 10 nM 이하, 더 바람직하게는 5 nM 이하이다.
특히 바람직한 구현예, 2가 GalNAc-핵산 콘쥬게이트의 ASGPR 에 대한 IC50 은 50 nM, 바람직하게는 25 nM 이하, 더 바람직하게는 15 nM 이하, 더 바람직하게는 10 nM 이하, 더 바람직하게는 5 nM 이하이다.
추가 특히 바람직한 구현예에서, 3가 GalNAc-핵산 콘쥬게이트의 ASGPR 에 대한 IC50 은 25 nM 이하, 바람직하게는 15 nM 이하, 더 바람직하게는 10 nM 이하, 더 바람직하게는 5 nM 이하, 더 바람직하게는 1 nM 내지 5 nM, 예를 들어 약 3 nM 이다. IC50 은 ASPGR 에 결합하는 표지된 리간드를 50 % 로 저해하는 GalNAc-핵산 콘쥬게이트의 농도이다. IC50 은 Rensen et al 2001 Journal of Viological Chemistry Vol 276 pp 37577 에 기재된 방법에 의해 측정될 수 있다. 간단히 말해서, 간세포 (1차 또는 배양액에서) 는, 조사하고자 하는 GalNAc-핵산 콘쥬게이트의 증가되는 양의 존재 하에, 4 ℃ 에서 2 h 동안 하나의 농도 (예를 들어 5 nM) 에서 리간드 125I-표지된 아시알릴화된 오로소뮤코이드 (ASOR) 와 함께 인큐베이션된다. 1가 GalNAc-핵산 콘쥬게이트의 경우, 농도는 2 내지 200 mM 일 수 있고; 2가 GalNAc-핵산 콘쥬게이트의 경우, 농도는 1 내지 1000 nM 일 수 있고; 3가 GalNAc-핵산 콘쥬게이트의 경우, 농도는 0.2 내지 200 nM (증가되는 농도에서) 일 수 있다. 표지된 ASOR 의 결합은, 조사하고자 하는 GalNAc-핵산 콘쥬게이트의 존재 하에 전개된다. 비특이적 결합은 100 mM GalNAc 의 존재 하에 측정될 수 있다.
대체 결합 데이터는 단일 부위 결합 모델을 사용하여 분석될 수 있고, IC50 이 계산된다.
트리틸-모노-GalNAc 화합물의 제조
추가 양상에서, 본 발명은 모노-GalNAc 화합물의 제조 방법에 관한 것이다. 따라서, 본 발명은 하기 단계를 포함하는, 화학식 (I) 의 화합물의 제조 방법을 제공한다:
(i) 하기 화학식 (IX) 의 화합물:
Figure 112018108847179-pct00020
과 세리놀을 반응시켜, 하기 화학식 (X) 의 화합물을 생성하는 단계:
Figure 112018108847179-pct00021
;
(ii) 화학식 (X) 의 화합물의 자유 히드록실 기 중 하나를 보호하여, 하기 화학식 (XI) 를 생성하는 단계:
Figure 112018108847179-pct00022
; 및
(iii) 화학식 (XI) 의 화합물과 화학식 (LG)-R3 (여기서, (LG) 는 이탈기임) 의 화합물을 반응시켜, 하기 화학식 (XII) 의 화합물을 생성하는 단계:
Figure 112018108847179-pct00023
.
화학식 (IX), (X), (XI), 및 (XII) 에서, 변수 R1, R2, R3, A1 및 L 은 화학식 (I) 및 (II) 와 관련하여 상기 정의된 바와 같다.
화학식 (LG)-R3 의 예시적인 화합물로서, 2-시아노에틸 N,N,N',N'-테트라이소프로필포스포로디아미다이트 (비스(디이소프로필아미노)(2-시아노에톡시)포스핀으로 또한 공지됨) 가 언급될 수 있고, 여기서 디이소프로필아미노 기 중 하나는 이탈기 (LG) 를 나타내고, 분자의 나머지는 R3 을 나타낸다.
핵산 분자
본 발명의 GalNAc 콘쥬게이트 모이어티에 콘쥬게이트되는 핵산 분자는 전형적으로 포유동물 예컨대 인간 세포에서 표적 핵산을 조절할 수 있다. 일부 구현예에서, 핵산 분자는 표적 핵산에 결합하고, 정상 발현 수준에 비해 적어도 10% 또는 20% 의 발현 억제, 더 바람직하게는 정상 발현 수준 (예컨대 핵산 분자 또는 핵산 분자 콘쥬게이트의 부재 하에서의 발현 수준) 에 비해 적어도 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90% 또는 95% 억제에 영향을 준다. 발현 수준의 조절은, 단백질 수준의 측정, 예를 들어 표적 단백질에 대항해 상승된 적합한 항체를 사용하는 웨스턴 블랏팅 (western blotting) 이 뒤따르는 SDS-PAGE 와 같은 방법에 의해 결정될 수 있다. 대안적으로, 발현 수준의 조절은 예를 들어 노던 블랏팅 (northern blotting) 또는 정량적 RT-PCR 에 의한 mRNA 의 수준의 측정에 의해 결정될 수 있다.
핵산 분자는 표적 핵산의 역 상보체 (reverse complement) 에 해당하는 인접 뉴클레오티드 서열을 포함하거나 이로 이루어질 수 있다. 일부 구현예에서, 핵산 분자는 표적 핵산 서열에 하이브리드화될 때 1, 2, 3, 또는 4 개의 미스매치를 용인할 수 있고, 여전히 충분히 표적에 결합하여, 원하는 효과, 즉 표적 핵산의 조절을 나타낼 수 있다. 미스매치는 예를 들어 핵산 분자의 증가된 길이 및/또는 개질된 뉴클레오시드의 증가된 수, 예컨대 핵산 분자에 존재하는 LNA 뉴클레오시드를 포함하는 2' 당 개질된 뉴클레오시드에 의해 보상될 수 있다.
일부 구현예에서, 인접 뉴클레오티드 서열은 표적 핵산, 예컨대 포유동물 표적 단백질을 인코딩하는 핵산 서열의 상응하는 영역에 하이브리드화될 때 3 개 이하의 미스매치, 예컨대 2 개 이하의 미스매치를 포함한다.
일부 구현예에서, 인접 뉴클레오티드 서열은 표적 핵산, 예컨대 포유동물 표적 단백질을 인코딩하는 핵산 서열의 상응하는 영역에 하이브리드화될 때 단일 이하의 미스매치를 포함한다.
핵산 분자의 길이는 원하는 적용에 따라 선택된다. 바람직한 구현예에서, 핵산 분자는 길이가 7 내지 50 개의 뉴클레오티드이다. 다른 구현예에서, 핵산 분자의 길이는 10 내지 30, 예컨대 11 내지 22, 예컨대 12 내지 18, 예컨대 13 내지 17 또는 14 내지 16 개의 인접 뉴클레오티드 길이이다. 특정 구체적 구현예에서, 핵산 분자는 길이가 14, 15, 16, 17, 18, 19, 또는 20 개의 뉴클레오티드이다.
핵산 분자의 뉴클레오티드 서열은 바람직하게는 표적 핵산에 존재하는 상응하는 서열의 역 상보체와 적어도 80 % 동일, 예컨대 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 91 %, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96% 동일, 적어도 97% 동일, 적어도 98% 동일, 적어도 99% 동일, 예컨대 100% 동일하다.
mRNA 조절은 RNAi-유도된 사일런싱 복합체 (RISC) 와 관련된 세포의 RNA 간섭 경로 머시너리 (interference pathway machinery) 와의 상호작용을 통해 용이해질 수 있다.
한 구현예에서, 콘쥬게이트의 RNAi 핵산 분자는, 2 개의 올리고뉴클레오티드 절편으로부터 조립되고, 여기서 하나의 절편은 RNAi 분자의 안티센스 가닥의 뉴클레오티드 서열을 포함하고, 제 2 절편은 RNAi 분자의 센스 영역의 뉴클레오티드 서열을 포함한다. 또다른 구현예에서, 센스 가닥은 링커 분자, 예컨대 폴리뉴클레오티드 링커 또는 비-뉴클레오티드 링커를 통해 안티센스 가닥에 연결된다. 바람직하게는, 본 발명의 콘쥬게이트는 RNAi 분자의 센스 가닥에 커플링된다. 절단성 링커가 RNAi 와 콘쥬게이트의 사이에 존재하는 경우, 콘쥬게이트는 센스 또는 안티센스 가닥에 연결될 수 있다. 본 발명의 일부 구현예에 따르면, 청구된 핵산 분자는 이중가닥 RNAi 분자이다. 특히, 개질은 GalNAc 함유 모이어티 또는 GalNAc 함유 모이어티가 센스 또는 안티센스 가닥에 부착되는 정도일 수 있다. 바람직한 구현예에서, GalNAc 함유 모이어티(들)은 센스 가닥에 부착된다. 즉, 화학식 (IV) 의 용어 R7O-(Y1)p 또는 용어 (Y2)q-OR8 은 siRNA 분자의 센스 가닥과 관련된다.
마이크로RNA (miRNA) 는, 이의 mRNA 표적의 직접적인 파괴 또는 번역 억제인, 약 22 개의 뉴클레오티드 길이의 작은 비코딩 (noncoding) RNA 유전자 생성물이다. miRNA 와 표적 핵산 사이의 상보성이 부분적인 경우, 표적 핵산의 번역은 억제된다. 상보성이 광범위한 경우, 표적 핵산이 절단된다. miRNA 의 경우, 복합체는 전형적으로 miRNA 와 오로지 부분적 상동성만을 공유하는 mRNA 의 3' UTR 에 일반적으로 위치한 표적 부위에 결합한다. "종자 영역" - 이의 표적과 완벽한 염기 쌍을 형성하는 miRNA 의 5' 말단 상의 약 일곱 (7) 개의 연속적인 뉴클레오티드의 스트레치- 는 miRNA 특이성에서 핵심 역할을 한다. 올리고뉴클레오티드에 의한 miRNA 의 종자 영역의 차단 또는 mRNA 에 대한 RISC/miRNA 복합체의 결합의 촉진은, 단백질 번역의 억제 및 mRNA 의 절단 및 분해를 야기할 수 있다.
RNAi 폴리뉴클레오티드 발현 카세트는, RNAi 분자, 별개의 센스 및 안티-센스 가닥 선형 siRNA, 또는 miRNA 로서 기능할 수 있는 작은 헤어핀 RNA 를 생성하기 위해 세포에서 전사될 수 있다. RNA 폴리머라아제 III 전사된 DNA 는 하기를 포함하는 목록으로부터 선택되는 프로모터를 함유한다: U6 프로모터, HI 프로모터, 및 tRNA 프로모터. RNA 폴리머라아제 II 프로모터는 UI, U2, U4, 및 U5 프로모터, snRNA 프로모터, 마이크로RNA 프로모터, 및 mRNA 프로모터를 포함한다.
대안적으로, RNA 조절은 표적 핵산에 상보적인 단일가닥 올리고뉴클레오티드 (상기 올리고뉴클레오티드는 또한 안티센스 올리고뉴클레오티드로 칭해짐) 에 의해 용이해질 수 있다. 안티센스 올리고뉴클레오티드는 번역의 입체 장애, 스플라이스 스위칭, 또는 다른 방법에 의해서와 같이 표적 핵산의 비(非) RNase 매개된 분해를 통해 기능할 수 있으나, 본 발명의 바람직한 안티센스 올리고뉴클레오티드는 엔도리보뉴클레아제 (RNase), 예컨대 RNase H 를 동원할 수 있음이 인식된다. 본 발명의 일부 바람직한 구현예에 따르면, 청구된 핵산 분자는 단일가닥 안티센스 올리고뉴클레오티드이다.
본 발명의 특정 바람직한 구현예에서, 핵산 분자는 RNase H 를 동원할 수 있다.
RNase H 를 동원하기 위해, 안티센스 올리고뉴클레오티드, 또는 인접 뉴클레오티드 서열은 갭머, 헤드머 또는 믹스머의 형태일 수 있다. 특정한 특정 구현예에서, 본 발명의 핵산 분자는 갭머이다.
"헤드머" 는 영역 X 의 3'-최말단 (3'-most) 모노머에 연결된 영역 Y 의 5'-최말단 (5'-most) 모노머를 갖는, 영역 X 및 및 이에 인접한 영역 Y 를 포함하는 안티센스 올리고뉴클레오티드로서 정의된다. 영역 X 는 비-RNase 동원 뉴클레오시드 유사체의 인접 스트레치를 포함하고, 영역 Y 는 RNase 에 의해 인식 및 절단가능한 뉴클레오시드 유사체 모노머 또는 DNA 모노머의 인접 스트레치 (예컨대 적어도 7 개의 인접 모노머) 를 포함한다.
"테일머" 는 영역 X 의 3'-최말단 모노머에 연결된 영역 Y 의 5'-최말단 모노머를 갖는, 영역 X 및 이에 인접한 영역 Y 를 포함하는 안티센스 올리고뉴클레오티드로서 정의된다. 영역 X 는 RNase 에 의해 인식 및 절단가능한 DNA 모노머 또는 뉴클레오시드 유사체 모노머의 인접 스트레치 (예컨대 적어도 7 개의 인접 모노머) 를 포함하고, 영역 X 는 비-RNase 동원 뉴클레오시드 유사체의 인접 스트레치를 포함한다.
"믹스머" 는 (i) RNase 에 의해 인식 및 절단가능한 DNA 모노머 또는 뉴클레오시드 유사체 모노머, 및 (ii) 비-RNase 동원 뉴클레오시드 유사체 모노머의 교대 조성으로 이루어진다. 믹스머의 예는 WO2005/023995 (본원에서 참조 인용됨) 에서 찾을 수 있다.
"갭머" 는 본원에서 이하 상세하게 정의된다.
본 발명의 바람직한 구현예에서, 청구된 핵산 분자는 특히 각각의 경우에 독립적으로 2'-O-알킬-RNA, 2'-O-메틸-RNA, 2'-알콕시-RNA, 2'-O-메톡시에틸-RNA, 2'-아미노-DNA, 2'-플루오로-DNA, 아라비노 핵산 (ANA), 2'-플루오로-ANA 및 LNA 뉴클레오시드로 이루어지는 군으로부터 선택되는 적어도 하나의 개질된 뉴클레오시드를 포함한다.
특정 바람직한 구현예에서, 청구된 핵산 분자의 적어도 하나의 개질된 뉴클레오시드는 2'-4'-가교된 뉴클레오시드이다.
본 발명에 따른 핵산 분자의 일부 바람직한 구현예에 따르면, 2'-4'-가교된 뉴클레오시드는 LNA 뉴클레오시드, 특히 2'-O-CH2-4'-, 2'-O-CH2-CH2-4'-, 2'-O-CH(CH3)-4'-, 2'-O-CH(OCH2CH3)-4'- 또는 2'-O-C(CH3)2-4'-뉴클레오시드이다. 특히, LNA 뉴클레오시드는 베타-D-옥시 LNA 또는 알파-L-옥시-LNA 이다.
핵산 분자에서 뉴클레오티드간 연결은, 표적화된 RNA 의 RNase H 절단을 허용하도록, 포스포디에스테르, 포스포로티오에이트 또는 보라노포스페이트일 수 있다. 포스포로티오에이트는 개선된 뉴클레아제 저항성 및 다른 이유, 예컨대 생산의 용이함으로 바람직하다.
따라서, 본 발명의 일부 구현예에서, 청구된 핵산 분자는 적어도 하나의 개질된 뉴클레오시드간 연결을 포함한다. 특히, 핵산 분자는 인접 뉴클레오티드 서열 내에서 적어도 하나의 뉴클레오시드간 연결이 포스포로티오에이트 뉴클레오시드간 연결인, 적어도 하나의 개질된 뉴클레오시드간 연결을 포함할 수 있다.
갭머 디자인
바람직한 구현예에서, 본 발명의 핵산 분자는 안티센스 올리고뉴클레오티드이고, 이는 결국 갭머이다.
본 발명의 특정 바람직한 구현예에서, 올리고뉴클레오티드의 갭머 구조는 이에 따라 적어도 3 개의 구별되는 구조적 영역 5'-플랭크, 갭 및 3'-플랭크 (F-G-F', '5 -> 3' 방향으로) 를 포함한다. 이러한 디자인에서, 플랭크된 영역 F 및 F' (또한 소위 윙 영역) 은 표적 핵산에 상보적인 개질된 뉴클레오시드의 인접 스트레치를 포함하는 한편, 갭 영역, G 는 올리고뉴클레오티드가 표적 핵산과 듀플렉스일 때, 뉴클레아제, 바람직하게는 엔도뉴클레아제 예컨대 RNase, 예를 들어 RNase H 를 동원할 수 있는 뉴클레오티드의 인접 스트레치를 포함한다. 뉴클레아제, 특히 RNase H 를 동원할 수 있는 뉴클레오시드는, DNA, 알파-L-옥시-LNA, 2'-플루오로-ANA 및 UNA 로 이루어지는 군으로부터 선택될 수 있다. 영역 F 및 F', 영역 G 의 플랭크된 5' 및 3' 말단은 바람직하게는 비-뉴클레아제 동원 뉴클레오시드 (3' 엔도 구조를 갖는 뉴클레오시드), 더 바람직하게는 하나 이상의 친화성 향상 개질된 뉴클레오시드를 포함한다. 일부 구현예에서, 3' 플랭크는 적어도 하나의 LNA 뉴클레오시드, 바람직하게는 적어도 2 개의 LNA 뉴클레오시드를 포함한다. 일부 구현예에서, 5' 플랭크는 적어도 하나의 LNA 뉴클레오시드를 포함한다. 일부 구현예에서, 5' 및 3' 플랭크된 영역 모두는 LNA 뉴클레오시드를 포함한다. 일부 구현예에서, 플랭크된 영역에서 모든 뉴클레오시드는 LNA 뉴클레오시드이다. 다른 구현예에서, 플랭크된 영역은 LNA 뉴클레오시드 및 다른 뉴클레오시드 (혼합된 플랭크) 모두, 예컨대 DNA 뉴클레오시드 및/또는 비-LNA 개질된 뉴클레오시드, 예컨대 2' 치환된 뉴클레오시드를 포함할 수 있다. 이 경우, 갭은 친화성 향상 개질된 뉴클레오시드, 바람직하게는 LNA, 예컨대 베타-D-옥시-LNA 에 의해 5' 및 3' 말단에서 플랭크된 적어도 5 개의 RNase H 동원 뉴클레오시드 (2' 엔도 구조를 갖는 뉴클레오시드, 바람직하게는 DNA) 의 인접 서열로서 정의된다. 결과적으로, 갭 영역에 인접한 5' 플랭크된 영역 및 3' 플랭크된 영역의 뉴클레오시드는 개질된 뉴클레오시드, 바람직하게는 비-뉴클레아제 동원 뉴클레오시드이다.
영역 F
영역 G 의 '5 말단에 부착된 영역 F (5' 플랭크 또는 5' 윙) 는 적어도 하나의 개질된 뉴클레오시드 예컨대 적어도 2, 적어도 3, 적어도 4, 적어도 5, 적어도 6, 적어도 7 개의 개질된 뉴클레오시드를 포함하거나, 함유하거나, 이로 이루어진다. 구현예에서, 영역 F 는 1 내지 7 개의 개질된 뉴클레오시드, 예컨대 2 내지 6 개의 개질된 뉴클레오시드, 예컨대 2 내지 5 개의 개질된 뉴클레오시드, 예컨대 2 내지 4 개의 개질된 뉴클레오시드, 예컨대 1 내지 3 개의 개질된 뉴클레오시드, 예컨대 1 , 2, 3 또는 4 개의 개질된 뉴클레오시드를 포함하거나 이로 이루어진다. F 영역은 영역의 5' 말단 및 3' 말단에 개질된 뉴클레오시드 적어도 하나를 갖는 것으로 정의된다.
일부 구현예에서, 영역 F 의 개질된 뉴클레오시드는 3' 엔도 구조를 갖는다.
구현예에서, 영역 F 의 개질된 뉴클레오시드 중 하나 이상은 2' 개질된 뉴클레오시드이다. 한 구현예에서, 영역 F 에서 뉴클레오시드 모두는 2' 개질된 뉴클레오시드이다.
또다른 구현예에서, 영역 F 는 2' 개질된 뉴클레오시드 이외에 DNA 및/또는 RNA 를 포함한다. DNA 및/또는 RNA 를 포함하는 플랭크는 F 영역의 5' 말단 및 3' 말단 (G 영역에 인접함) 에 2' 개질된 뉴클레오시드를 갖는 것에 의해 특징지어진다. 한 구현예에서, 영역 F 는 DNA 뉴클레오시드, 예컨대 1 내지 3 개의 인접 DNA 뉴클레오시드, 예컨대 1 내지 3 또는 1 내지 2 개의 인접 DNA 뉴클레오시드를 포함한다. 플랭크에서 DNA 뉴클레오시드는 바람직하게는 RNase H 를 동원할 수 없어야 한다. 일부 구현예에서, F 영역에서 2' 개질된 뉴클레오시드 및 DNA 및/또는 RNA 뉴클레오시드는 1 내지 3 개의 2' 개질된 뉴클레오시드 및 1 내지 3 개의 DNA 및/또는 RNA 뉴클레오시드와 교대된다. 상기 플랭크는 또한 교대 플랭크로 칭해질 수 있다. 교대 플랭크를 갖는 올리고뉴클레오티드에서 5' 플랭크 (영역 F) 의 길이는 4 내지 10 개의 뉴클레오시드, 예컨대 4 내지 8, 예컨대 4 내지 6 개의 뉴클레오시드, 예컨대 4, 5, 6 또는 7 개의 개질된 뉴클레오시드일 수 있다. 일부 구현예에서, 오로지 올리고뉴클레오티드의 5' 플랭크만이 교대이다. 교대 뉴클레오시드를 갖는 영역 F 의 특정예는 하기이다:
Figure 112018108847179-pct00024
.
상기 식에서, 2' 는 개질된 뉴클레오시드를 나타내고, N' 은 RNA 또는 DNA 를 나타낸다. 일부 구현예에서, 교대 플랭크에서의 모든 개질된 뉴클레오시드는 LNA 이고, N' 는 DNA 이다. 추가 구현예에서, 영역 F 에서 2' 개질된 뉴클레오시드 중 하나 이상은 2'-O-알킬-RNA 단위, 2'-O-메틸-RNA, 2'-아미노-DNA 단위, 2'-플루오로-DNA 단위, 2'-알콕시-RNA, MOE 단위, LNA 단위, 아라비노 핵산 (ANA) 단위 및 2'-플루오로-ANA 단위로부터 선택된다.
일부 구현예에서 F 영역은 LNA 및 2' 치환된 개질된 뉴클레오시드 모두를 포함한다. 이는 흔히 혼합된 윙 또는 혼합된 플랭크 올리고뉴클레오티드로 칭해진다.
본 발명의 한 구현예에서, 영역 F 의 모든 개질된 뉴클레오시드는 LNA 뉴클레오시드이다. 추가 구현예에서, 영역 F 의 모든 뉴클레오시드는 LNA 뉴클레오시드이다. 추가 구현예에서 영역 F 의 LNA 뉴클레오시드는 독립적으로 옥시-LNA, 티오-LNA, 아미노-LNA, cET, 및/또는 ENA (베타-D 또는 알파-L 배열임) 또는 이의 조합으로 이루어지는 군으로부터 선택된다. 바람직한 구현예에서 영역 F 는 적어도 1 개의 베타-D-옥시 LNA 단위를 인접 서열의 5' 말단에 포함한다.
영역 G
영역 G (갭 영역) 는 바람직하게는 상기 언급된 뉴클레아제, 특히 RNaseH 를 동원할 수 있는 연속 뉴클레오시드를 적어도 4, 예컨대 적어도 5, 예컨대 적어도 6, 적어도 7, 적어도 8, 적어도 9, 적어도 10, 적어도 11 , 적어도 12, 적어도 13, 적어도 14, 적어도 15 또는 적어도 16 개 포함하거나, 함유하거나, 이로 이루어진다. 추가 구현예에서, 영역 G 는 상기 언급된 뉴클레아제를 동원할 수 있는 연속 뉴클레오티드 단위를 5 내지 12, 또는 6 내지 10 또는 7 내지 9, 예컨대 8 개 포함하거나, 함유하거나, 이로 이루어진다.
뉴클레아제를 동원할 수 있는 영역 G 에서의 뉴클레오시드 단위는 구현예에서, DNA, 알파-L-LNA, C4' 알킬화된 DNA (본원에서 참조 인용되는 PCT/EP2009/050349 및 Vester et al., Bioorg. Med. Chem. Lett. 18 (2008) 2296- 2300 에 기재됨), 아라비노오스 유래된 뉴클레오시드 예컨대 ANA 및 2'F-ANA (Mangos et al. 2003 J. AM. CHEM. SOC. 125, 654-661), UNA (비잠금 핵산) (본원에서 참조 인용되는 Fluiter et al., Mol. Biosyst., 2009, 10, 1039 에 기재됨) 으로 이루어지는 군으로부터 선택된다. UNA 는 비잠금 핵산이고, 전형적으로 여기서 리보오스의 C2 와 C3 사이의 결합이 제거되어, 비차단된 "당" 잔기를 형성한다.
보다 추가의 구현예에서, 영역 G 에서의 적어도 하나의 뉴클레오시드 단위는 DNA 뉴클레오시드 단위, 예컨대 1 내지 12 개의 DNA 단위, 예컨대 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 또는 11 개의 DNA 단위, 바람직하게는 2 내지 12 개의 DNA 단위, 예컨대 4 내지 12 개의 DNA 단위, 더 바람직하게는 5 내지 11, 또는 2 내지 10 개, 4 내지 10 개 또는 6 내지 10 개의 DNA 단위, 예컨대 7 내지 10 개의 DNA 단위, 가장 바람직하게는 8, 9 또는 10 개의 DNA 단위이다. 일부 구현예에서, 영역 G 는 100% DNA 단위로 이루어진다.
추가 구현예에서, 영역 G 는 RNase H 절단을 매개할 수 있는 다른 뉴클레오시드 및 DNA 의 혼합물로 이루어질 수 있다. 영역 G 는 적어도 50% DNA, 더 바람직하게는 60 %, 70% 또는 80 % DNA, 및 더욱 더 바람직한 90% 또는 95% DNA 로 이루어질 수 있다.
보다 추가의 구현예에서, 영역 G 에서의 적어도 하나의 뉴클레오시드 단위는 알파-L-LNA 뉴클레오시드 단위, 예컨대 적어도 하나의 알파-L-LNA, 예컨대 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8 또는 9 개의 알파-L-LNA 이다. 추가 구현예에서, 영역 G 는 알파-L-옥시-LNA 인 적어도 하나의 알파-L-LNA 를 포함한다. 추가 구현예에서, 영역 G 는 DNA 및 알파-L-LNA 뉴클레오시드 단위의 조합을 포함한다.
일부 구현예에서 영역 G 에서의 인접 서열의 크기는 더 긴, 예컨대 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 또는 20 개의 뉴클레오시드 단위일 수 있다.
일부 구현예에서, 영역 G 에서의 뉴클레오시드는 2' 엔도 구조를 갖는다.
일부 구현예에서 영역 G 는 갭브레이커 뉴클레오시드를 포함하여, 갭브레이커 올리고뉴클레오티드를 야기할 수 있고, 이는 RNase H 를 동원할 수 있다.
영역 F'
영역 G 의 '3 말단에 부착된 영역 F' (3' 플랭크 또는 3' 윙) 은, 적어도 하나의 개질된 뉴클레오시드 예컨대 적어도 2, 적어도 3, 적어도 4, 적어도 5, 적어도 6, 적어도 7 개의 개질된 뉴클레오시드를 포함하거나, 함유하거나, 이로 이루어진다. 한 구현예에서, 영역 F' 는 1 내지 7 개의 개질된 뉴클레오시드, 예컨대 2 내지 6 개의 개질된 뉴클레오시드, 예컨대 2 내지 4 개의 개질된 뉴클레오시드, 예컨대 1 내지 3 개의 개질된 뉴클레오시드, 예컨대 1, 2, 3 또는 4 개의 개질된 뉴클레오시드를 포함하거나 이로 이루어진다. F' 영역은 영역의 5' 말단 및 3' 말단에 개질된 뉴클레오시드 적어도 하나를 갖는 것으로 정의된다.
일부 구현예에서, 영역 F' 에서의 개질된 뉴클레오시드는 3' 엔도 구조를 갖는다.
구현예에서, 영역 F' 에서 개질된 뉴클레오시드 중 하나 이상은 2' 개질된 뉴클레오시드이다. 한 구현예에서 영역 F' 에서 모든 뉴클레오시드는 2' 개질된 뉴클레오시드이다.
구현예에서, 영역 F' 에서 개질된 뉴클레오시드 중 하나 이상은 2' 개질된 뉴클레오시드이다.
한 구현예에서 영역 F' 에서 모든 뉴클레오시드는 2' 개질된 뉴클레오시드이다. 또 다른 구현예에서 영역 F' 는 2' 개질된 뉴클레오시드 이외에 DNA 또는 RNA 를 포함한다. DNA 또는 RNA 를 포함하는 플랭크는, F' 영역의 5' 말단 (G 영역에 인접함) 및 3' 말단에 2' 개질된 뉴클레오시드를 갖는 것으로 특징지어진다. 한 구현예에서, 영역 F' 는 DNA 뉴클레오시드, 예컨대 1 내지 4 개의 인접 DNA 뉴클레오시드, 예컨대 1 내지 3 또는 1 내지 2 개의 인접 DNA 뉴클레오시드를 포함한다. 플랭크에서 DNA 뉴클레오시드는 바람직하게는 RNase H 를 동원할 수 없어야 한다. 일부 구현예에서, F' 영역에서 2' 개질된 뉴클레오시드 및 DNA 및/또는 RNA 뉴클레오시드는 1 내지 3 개의 2' 개질된 뉴클레오시드 및 1 내지 3 개의 DNA 및/또는 RNA 뉴클레오시드와 교대하고, 상기 플랭크는 또한 교대 플랭크로 칭해질 수 있다. 교대 플랭크를 갖는 올리고뉴클레오티드에서 3' 플랭크 (영역 F') 의 길이는 4 내지 10 개의 뉴클레오시드, 예컨대 4 내지 8, 예컨대 4 내지 6 개의 뉴클레오시드, 예컨대 4, 5, 6 또는 7 개의 개질된 뉴클레오시드일 수 있다. 일부 구현예에서, 오로지 올리고뉴클레오티드의 3' 플랭크만이 교대한다. 교대 뉴클레오시드를 갖는 영역 F' 의 특정 예는 하기이다:
Figure 112018108847179-pct00025
.
상기 식에서, 2' 는 개질된 뉴클레오시드를 나타내고, N' 은 RNA 또는 DNA 이다. 일부 구현예에서, 교대 플랭크에서 모든 개질된 뉴클레오시드는 LNA 이고, N' 은 DNA 이다. 추가 구현예에서, 영역 F' 에서의 개질된 뉴클레오시드는 2'-O-알킬-RNA 단위, 2'-O-메틸-RNA, 2'-아미노-DNA 단위, 2'-플루오로-DNA 단위, 2'-알콕시-RNA, MOE 단위, LNA 단위, 아라비노 핵산 (ANA) 단위 및 2'-플루오로-ANA 단위로부터 선택된다.
일부 구현예에서, F' 영역은 LNA 및 2' 치환된 개질된 뉴클레오시드 모두를 포함한다. 이는 흔히 혼합된 윙 또는 혼합된 플랭크 올리고뉴클레오티드로 칭해진다.
본 발명의 한 구현예에서 영역 F' 에서의 모든 개질된 뉴클레오시드는 LNA 뉴클레오시드이다. 추가 구현예에서 영역 F' 에서의 모든 뉴클레오시드는 LNA 뉴클레오시드이다. 추가 구현예에서 영역 F' 에서의 LNA 뉴클레오시드는 독립적으로 옥시-LNA, 티오-LNA, 아미노-LNA, cET 및/또는 ENA (베타-D 또는 알파-L 배열임) 또는 이의 조합으로 이루어지는 군으로부터 선택된다. 바람직한 구현예에서 영역 F' 는 적어도 2 베타-D-옥시 LNA 단위를 인접 서열의 3' 말단에 갖는다.
영역 D' 및 D"
영역 D' 및 D" 는 영역 F 의 5' 말단 또는 영역 F' 의 3' 말단에 각각 부착될 수 있다.
영역 D' 또는 D" 는 독립적으로 1, 2, 3, 4 또는 5 개의 추가 뉴클레오티드를 포함하고, 이는 표적 핵산에 대해 상보적 또는 비-상보적일 수 있다. 이러한 양상에서, 본 발명의 올리고뉴클레오티드는 일부 구현예에서, 추가의 뉴클레오티드에 의해 5' 및/또는 3' 말단에서 플랭크된 표적을 조절할 수 있는 인접 뉴클레오티드 서열을 포함할 수 있다. 상기 추가의 뉴클레오티드는 뉴클레아제 민감성 생절단성 링커로서 역할할 수 있다.
일부 구현예에서, 추가의 5' 및/또는 3' 말단 뉴클레오티드는 포스포디에스테르 연결로 연결되고, DNA 또는 RNA 일 수 있다. 또다른 구현예에서, 추가의 5' 및/또는 3' 말단 뉴클레오티드는, 예를 들어 뉴클레아제 안정성을 향상시키고 합성의 용이함을 위해 포함될 수 있는 개질된 뉴클레오티드이다. 본 발명의 올리고뉴클레오티드의 구현예에서, 인접 뉴클레오티드 서열 이외에 영역 D' 및/또는 D" 를 포함한다.
일부 구현예에서, 영역 D' 또는 D" 는 서열 AA, AT, AC, AG, TA, TT, TC, TG, CA, CT, CC, CG, GA, GT, GC, 또는 GG 의 디뉴클레오티드를 포함하고, 여기서 C 는 5-메틸시토신 (또한 mC 로 칭해짐) 일 수 있고/있거나 T 는 U 로 대체될 수 있다.
본 발명의 갭머 올리고뉴클레오티드는 하기 식으로 나타내어질 수 있다:
Figure 112018108847179-pct00026
.
영역 F, G 및 F', D' 및 D" 에서 뉴클레오시드의 바람직한 수 및 유형은 상기 기재되어 있다.
본 발명의 특정 바람직한 구현예에서, 핵산 분자는 식 5'-F-G-F'-3' 의 갭머이고, 여기서 영역 F 및 F' 는 각각의 경우 독립적으로 1 내지 7 개의 개질된 뉴클레오시드를 포함하고, G 는 RNase H 를 동원할 수 있는 6 내지 16 개의 뉴클레오시드 사이의 영역이다.
본 발명의 올리고뉴클레오티드 콘쥬게이트는, 올리고뉴클레오티드, 특히 상기 나타낸 갭머 올리고뉴클레오티드의 5' 또는 3' 말단에 공유결합적으로 부착된 영역 C 를 가질 수 있다.
한 구현예에서, 본 발명의 올리고뉴클레오티드 콘쥬게이트는 식 5'-D'-F-G-F'-3' 또는 5'-F-G-F'-D"-3' 를 갖는 올리고뉴클레오티드를 포함하고, 여기서 영역 F 및 F' 는 독립적으로 1-7 개의 개질된 뉴클레오시드를 포함하고, G 는 RNaseH 를 동원할 수 있는 6 내지 16 개의 뉴클레오시드 사이의 영역이고, 영역 D' 또는 D" 는 1-5 개의 포스포디에스테르 연결된 뉴클레오시드를 포함한다. 바람직하게는 영역 D' 또는 D" 는 콘쥬게이트 모이어티에 대한 콘쥬게이션이 고려되는 올리고뉴클레오티드의 말단에 존재한다.
교대 플랭크를 갖는 올리고뉴클레오티드의 예는 하기 식으로 나타내어질 수 있다:
Figure 112018108847179-pct00027
.
여기서, 플랭크는 F 또는 F' 로 나타내어지고, 이는 오로지 2' 개질된 뉴클레오시드, 예컨대 LNA 뉴클레오시드를 함유하고, 2' 는 개질된 뉴클레오시드를 나타내고, N' 는 RNA 또는 DNA 이다. 교대 영역, 및 영역 F, G 및 F', D' 및 D" 에서의 뉴클레오시드의 바람직한 수 및 유형은 상기 기재되어 있다.
일부 구현예에서, 올리고뉴클레오티드는 길이 10, 11, 12, 13, 14, 15 또는 16 개의 뉴클레오티드로 이루어지는 갭머이고, 여기서 각각의 영역 F 및 F' 는 독립적으로 표적 핵산에 상보적인 1, 2, 3 또는 4 개의 개질된 뉴클레오시드 단위로 이루어지고, 영역 G 는 표적 핵산과 듀플렉스일 때 뉴클레아제를 동원할 수 있는 7, 8, 9, 또는 10 개의 뉴클레오시드 단위로 이루어진다.
추가 구현예에서, 올리고뉴클레오티드는, 각각의 영역 F 및 F' 가 독립적으로 3, 4, 5 또는 6 개의 개질된 뉴클레오시드 단위, 예컨대 2'-O-메톡시에틸-리보오스 당 (2'-MOE) 을 함유하는 뉴클레오시드 단위 또는 2'-플루오로-데옥시리보스 당을 함유하는 뉴클레오시드 및/또는 LNA 단위로 이루어지고, 영역 G 는 8, 9, 10, 1 1 또는 12 개의 뉴클레오시드 단위, 예컨대 DNA 단위 또는 다른 뉴클레아제 동원 뉴클레오시드 예컨대 알파-L-LNA 또는 DNA 와 뉴클레아제 동원 뉴클레오시드의 혼합물로 이루어지는 갭머이다.
추가 특정 구현예에서, 올리고뉴클레오티드는 각각의 영역 F 및 F' 영역이 각각 2 개의 LNA 단위로 이루어지고, 영역 G 가 8, 9 또는 10 개의 뉴클레오시드 단위, 바람직하게는 DNA 단위로 이루어지는 갭머이다. 이러한 성질의 특정 갭머 디자인은 2-8-2, 2-9-2 및 2-10-2 를 포함한다.
추가 특정 구현예에서, 올리고뉴클레오티드는 각각의 영역 F 및 F' 가 독립적으로 3 개의 LNA 단위로 이루어지고, 영역 G 가 8, 9 또는 10 개의 뉴클레오시드 단위, 바람직하게는 DNA 단위로 이루어지는 갭머이다. 이러한 성질의 특정 갭머 디자인은 3-8-3, 3-9-3 및 3-10-3 을 포함한다.
추가 특정 구현예에서, 올리고뉴클레오티드는 각각의 영역 F 및 F' 가 각각 4 개의 LNA 단위로 이루어지고, 영역 G 가 8 또는 9 또는 10 개의 뉴클레오시드 단위, 바람직하게는 DNA 단위로 이루어지는 갭머이다. 이러한 성질의 특정 갭머 디자인은 4-8-4, 4-9-4 및 4-10-4 를 포함한다.
이러한 성질의 특정 갭머 디자인은 1-6-1, 1-6-2, 2-6-1, 1-6-3, 3-6-1, 1-6-4, 4-6-1, 2-6-2, 2-6-3, 3-6-2, 2-6-4, 4-6-2, 3-6-3, 3-6-4 및 4-6-3 갭머를 포함하는 윙에 독립적으로 1 내지 4 개의 개질된 뉴클레오시드 및 6 개의 뉴클레오시드를 갖는 갭으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 F-G-F' 디자인을 포함한다.
이러한 성질의 특정 갭머 디자인은 1-7-1, 2-7-1, 1-7-2, 1-7-3, 3-7-1, 1-7-4, 4-7-1, 2-7-2, 2-7-3, 3-7-2, 2-7-4, 4-7-2, 3-7-3, 3-7-4, 4-7-3 및 4-7-4 갭머를 포함하는 윙에 독립적으로 1 내지 4 개의 개질된 뉴클레오시드 및 7 개의 뉴클레오시드를 갖는 갭으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 F-G-F' 디자인을 포함한다.
이러한 성질의 특정 갭머 디자인은 1-8-1, 1-8-2, 1-8-3, 3-8-1, 1-8-4, 4-8-1, 2-8-1, 2-8-2, 2-8-3, 3-8-2, 2-8-4, 4-8-2, 3-8-3, 3-8-4, 4-8-3, 및 4-8-4 갭머를 포함하는 윙에 독립적으로 1 내지 4 개의 개질된 뉴클레오시드 및 8 개의 뉴클레오시드를 갖는 갭으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 F-G-F' 디자인을 포함한다.
이러한 성질의 특정 갭머 디자인은 1-9-1, 2-9-1, 1-9-2, 1-9-3, 3-9-1, 1-9-4, 4-9-1, 2-9-2, 2-9-3, 3-9-2, 2-9-4, 4-9-2, 3-9-3, 3-9-4, 4-9-3 및 4-9-4 갭머를 포함하는 윙에 독립적으로 1 내지 4 개의 개질된 뉴클레오시드 및 9 개의 뉴클레오시드를 갖는 갭으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 F-G-F' 디자인을 포함한다.
이러한 성질의 특정 갭머 디자인은, 1-10-1, 2-10-1, 1-10-2, 1-10-3, 3-10-1, 1-10-4, 4-10-1, 2-10-2, 2-10-3, 3-10-2, 2-10-4, 4-10-2, 3-10-3, 3-10-4, 4-10-3 및 4-10-4 갭머를 포함하는, 10 개의 뉴클레오시드를 갖는 갭으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 F-G-F' 디자인을 포함한다.
모든 경우에, F-G-F' 디자인은 추가로 영역 D' 및/또는 D" 를 포함할 수 있고, 이는 1, 2 또는 3 개의 뉴클레오시드 단위, 예컨대 DNA 단위를 가질 수 있다. 바람직하게는, 영역 F 및 F' 에서 뉴클레오시드는 개질된 뉴클레오시드인 한편, 영역 G 에서 뉴클레오티드는 바람직하게는 비개질된 뉴클레오시드이다.
각각의 디자인에서, 바람직한 개질된 뉴클레오시드는 LNA 이다.
또다른 구현예에서, 갭머에서 갭 내의 모든 뉴클레오시드간 연결은 포스포로티오에이트 및/또는 보라노포스페이트 연결이다. 또다른 구현예에서, 갭머에서 플랭크 (F 및 F' 영역) 내의 모든 뉴클레오시드간 연결은 포스포로티오에이트 및/또는 보라노포스페이트 연결이다. 또다른 바람직한 구현예에서, 갭머에서 D' 및 D" 영역 내의 모든 뉴클레오시드간 연결은 포스포디에스테르 연결이다.
본원에 개시된 바와 같은 특정 갭머의 경우, 시토신 (C) 잔기가 5-메틸-시토신으로 주석이 달릴 때, 다양한 구현예에서, 올리고뉴클레오티드에 존재하는 C 중 하나 이상은 비개질된 C 잔기일 수 있다.
특정 구현예에서, 갭머는 본원에서 참조 인용되는 WO2008/113832 에 기재된 바와 같이 소위 쇼트머 (shortmer) 이다.
추가 갭머 디자인은 본원에서 참조 인용되는 WO2004/046160, WO2007/146511 에 개시되어 있다.
본 발명에 따른 콘쥬게이트에 혼입될 수 있는 예시적인 핵산 분자는 5'-GmCattggtatTmCA-3' (SEQ ID NO: 1) 이고, 대문자는 LNA 뉴클레오시드를 나타내고; 모든 LNA C 는 5'메틸 C 이고; 소문자는 DNA 뉴클레오시드를 나타내고; 뉴클레오시드간 연결은 포스포로티오에이트 연결이다.
본 발명에 따른 콘쥬게이트에 혼입될 수 있는 추가 예시적인 핵산 분자는 5'-caGmCattggtatTmCA-3' (SEQ ID NO: 2) 이고, 대문자는 LNA 뉴클레오시드를 나타내고; 모든 LNA C 는 5'메틸 C 이고; 소문자는 DNA 뉴클레오시드를 나타내고; 5' 말단으로부터 2 개의 제 1 뉴클레오시드간 연결은 포스포디에스테르 연결이고, 나머지 뉴클레오시드간 연결은 포스포로티오에이트 연결이다.
표적
본 발명의 핵산 콘쥬게이트는 핵산 표적의 조절을 위해 사용될 수 있다. 일부 구현예에서, 핵산 분자는 간-발현된 RNA, 예컨대 간-발현된 mRNA 또는 마이크로RNA 를 조절한다. 특히 mRNA 또는 마이크로RNA 는 간세포에서 발현된다. 일부 구현예에서, 핵산 분자는 아래 표 1 로부터 선택된 표적 핵산을 조절한다. 본 발명의 핵산 콘쥬게이트는 아래 표 1 로부터 선택되는 하나 이상의 질환을 치료하기 위한 의약에서 사용될 수 있다.
표 1: 간 표적 및 관련 질환
Figure 112018108847179-pct00028
Figure 112018108847179-pct00029
Figure 112018108847179-pct00030
조성물
본 발명의 핵산 콘쥬게이트는 약학 제형 및 조성물에서 사용될 수 있다. 적합하게는, 상기 조성물은 약학적으로 허용가능한 희석제, 용매, 담체, 염 및/또는 아쥬반트를 포함한다. 따라서, 본 발명의 일부 구현예에서, 상기 약학 조성물은 본원에 기재된 바와 같은 핵산 분자 및 약학적으로 허용가능한 희석제, 용매, 담체, 염 및/또는 아쥬반트를 포함한다. 약학적으로 허용가능한 희석제는 포스페이트-완충 식염수 (PBS) 를 포함하고, 약학적으로 허용가능한 염은 비제한적으로 나트륨 및 칼륨 염을 포함한다. 일부 구현예에서, 약학적으로 허용가능한 희석제는 멸균된 포스페이트 완충 식염수이다. 일부 구현예에서, 올리고뉴클레오티드는 50-300μM 용액의 농도로 약학적으로 허용가능한 희석제 중에서 사용된다.
본 발명에서 사용하기에 적합한 제형은 Remington's Pharmaceutical Sciences, Mack Publishing Company, Philadelphia, Pa., 17th ed., 1985 에서 찾는다. 약물 전달 방법의 간략한 검토를 위해, 예를 들어 Langer (Science 249:1527-1533, 1990) 를 참조한다. WO2007/031091 은 본원에서 참조 인용되는 적합한 및 바람직한 약학적으로 허용가능한 희석제, 담체 및 아쥬반트를 제공한다. 적합한 투약량, 제형, 투여 경로, 조성물, 투약 형태, 다른 치료제와의 조합, 전구약물 제형은 또한 본원에서 참조 인용되는 WO2007/031091 에 제공되어 있다.
이러한 조성물은 통상적인 멸균 기술에 의해 멸균될 수 있거나, 멸균 여과될 수 있다. 생성된 수용액은 그 자체로 사용을 위해 포장되거나 동결건조될 수 있고, 동결건조된 제제는 투여 전에 멸균된 수성 담체와 조합된다. 제제의 pH 는 전형적으로 3 내지 11, 더 바람직하게는 5 내지 9 또는 6 내지 8, 및 가장 바람직하게는 7 내지 8, 예컨대 7 내지 7.5 일 것이다. 고체 형태로 생성된 조성물은 다중 단일 투약량 단위로 포장될 수 있고, 각각은 상기-언급된 작용제(들)의 고정된 양을 함유한다 (예컨대 정제 또는 캡슐의 밀봉된 패키지에). 고체 형태의 조성물은 또한 국소적으로 적용가능한 크림 또는 연고를 위해 고안된 짤 수 있는 튜브와 같이 유연한 양을 위한 용기에 포장될 수 있다.
일부 구현예에서, 본 발명의 핵산 콘쥬게이트는 전구약물이다. 특히 생절단성 링커를 갖는 핵산 콘쥬게이트와 관련하여, 여기서 콘쥬게이트 모이어티는 전구약물이 작용 부위, 예를 들어 표적 세포에 전달되면 핵산 분자에서 절단된다.
적용
본 발명의 화합물은 예를 들어, 진단, 치료 및 예방을 위한 연구 시약으로서 이용될 수 있다.
특히, 본원에 청구된 핵산 분자 또는 약학 조성물은 의약, 특히 인간 의약에서 사용하기 위한 것이다. 의약은 표 1 에 열거된 질환 중 임의의 것의 치료에 사용될 수 있다.
본 발명은 상기 세포에서 표적 단백질 및/또는 mRNA 및/또는 마이크로RNA 및/또는 긴 비-코딩 RNA 의 발현 또는 기능을 다운-조정 또는 저해하기 위해 상기 세포에 본 발명에 따른 핵산 콘쥬게이트를 투여하는 것을 포함하는, 표적 세포에서 단백질 및/또는 mRNA 및/또는 마이크로RNA 및/또는 긴 비-코딩 RNA 의 발현 또는 기능을 조절, 예를 들어 다운-조정 또는 저해하는 방법을 제공한다. 적합하게는 세포는 포유동물 세포 예컨대 인간 세포이고, 바람직하게는 이는 간 세포이다. 투여는 일부 구현예에서 시험관내에서 발생할 수 있다. 투여는 일부 구현예에서 생체내에서 발생할 수 있다. 조성물의 투여는 장애의 치료 또는 방지에 효과적이거나 인간에서 생리학적 상태를 조정하기에 충분한 양이다.
또한 제공되는 것은, 본 발명의 핵산 콘쥬게이트 중 하나 이상의 치료적 또는 예방적 유효량을 투여하는 것에 의해, 질환 또는 병상을 갖거나 이에 걸리기 쉬운 것으로 의심되는 포유동물의 치료 방법, 예컨대 인간의 치료 방법이다. 본 발명에 따른 핵산 콘쥬게이트 또는 약학 조성물은 전형적으로 유효량으로 투여된다.
특히 화학식 (IV) 의 화합물은 본 발명의 적용에서 사용될 수 있다.
본 발명은 또한 장애의 치료용 약제의 제조 또는 표적 핵산의 조절에 의해 영향을 받는 장애와 같은 것의 치료 방법을 위한, 기재된 바와 같은 본 발명의 핵산 콘쥬게이트의 용도를 제공한다.
본 발명은 또한 본 발명에 따른 화합물 및/또는 본 발명에 따른 약학 조성물을 이를 필요로 하는 환자에게 투여하는 것을 포함하는, 장애의 치료 방법을 제공한다.
치료하고자 하는 장애의 예는 표 1 에 열거된 것과 같은 간 질환이다.
한 구현예에서, 본 발명의 핵산 콘쥬게이트는 간에서의 감염성 질환, 예컨대 바이러스성 간 감염, 예컨대 HBV 또는 HCV 의 치료를 위한 약제의 제조에서 사용된다.
한 구현예에서, 본 발명의 핵산 콘쥬게이트는 대사성 장애 예컨대 고콜레스테롤혈증, 가족성 고콜레스테롤혈증, 고지혈증, 고중성지질혈증, 고혈당증, 혈당 항상성, 심장혈관계 질환, 심장대사 질환, 아테롬성 동맥경화증, 급성 관동맥 증후군, 관상동맥성 심장 질환, 비만, 대사 증후군, 인슐린 저항성, 비알콜성 지방간염 (NASH), 비알콜성 지방간 질환 (NAFLD), 비인슐린 의존성 당뇨병 (NIDDM). 제2형 당뇨병, 제1형 당뇨병, 포르피린증의 치료를 위한 약제의 제조에서 사용된다.
한 구현예에서, 본 발명의 핵산 콘쥬게이트는 증식성 질환 예컨대 간암의 치료를 위한 약제의 제조에서 사용된다.
한 구현예에서, 본 발명의 핵산 콘쥬게이트는 혈액 또는 상보체 시스템과 관련한 장애, 예컨대 혈전증, 혈우병 A, B 희귀, 빈혈증, 발작성 야간 헤모글로빈뇨 (PNH), 비정형 용혈성 요독증후군 (aHUS), 및 혈색소 침착증의 치료를 위한 약제의 제조에서 사용된다.
한 구현예에서, 본 발명의 핵산 콘쥬게이트는 염증성 장애 예컨대 관절염 및 대장염의 치료를 위한 약제의 제조에서 사용된다.
구현예
본 발명의 하기 구현예는 본원에 기재된 임의의 다른 구현예와 조합하여 사용될 수 있다.
1. 하기로 나타내어지는 화학식 (I) 을 갖는 화합물 및 이의 임의의 염:
Figure 112018108847179-pct00031
[식 중,
R1 은 H 또는 C1-6 알킬이고;
a. R2 는 트리페닐메틸-기반 히드록실 보호기이고,
b. R3 은 인-함유 기, 특히 포스포르아미다이트 또는 포스포노아미다이트 기이고,
K 는 하기 화학식 (II) 로 나타내어짐:
Figure 112018108847179-pct00032
(식 중, A1 은 각각의 경우에 동일 또는 상이할 수 있는 히드록실 보호기이고, L 은 링커임)].
2. 구현예 1 에 있어서, R1 이 H 인 화합물.
3. 구현예 1 또는 2 에 있어서, R2 가 트리페닐메틸, 메톡시트리틸 또는 디메톡시트리틸, 특히 디메톡시트리틸인 화합물.
4. 구현예 1-3 중 어느 하나에 있어서, R3 이 하기 화학식 (III) 으로 나타내어지는 화합물:
Figure 112018108847179-pct00033
[식 중,
R4 및 R5 는 독립적으로 C1-6 알킬로부터 선택되거나, R4 및 R5 는 함께 5- 또는 6-원 고리 (이는 치환될 수 있고, N 및 O 로부터 선택되는 하나의 추가 헤테로원자를 함유할 수 있음) 를 형성하고;
X 는 O 또는 S 이고;
n 은 0 또는 1 이고;
R6 은 티오, 옥소, 할로 및/또는 CN 으로 임의 치환된 C1-8 알킬임].
5. 구현예 4 에 있어서,
NR4R5 가 디메틸아미노, 디에틸아미노, 디-n-프로필아미노, 디이소프로필아미노, 디부틸아미노, 피롤리디노, 피페리디노, 2,6-디메틸피페리디노, 모르폴리노, 이미다졸릴, 및 4-메틸이미다졸릴로부터 선택되고/되거나
XR6 이 메틸, 에틸, 2-시아노에틸옥시, 2-시아노에틸티오, 메톡시, 에톡시, S-이소부타노일-2-(2-메르캅토에톡시)에톡시, S-피발로일-2-(2-메르캅토에톡시)에톡시, 및 S-피발로일-2-메르캅토에톡시로부터 선택되는 화합물.
6. 구현예 4 또는 5 에 있어서, NR4R5 가 디이소프로필아미노이고/이거나 XR6 이 2-시아노에톡시인 화합물.
7. 구현예 1-6 중 어느 하나에 있어서, A1 이 아실 기 및 실릴 기, 바람직하게는 아세틸, 벤조일, 페녹시-아세틸, 피발로일, 이소부티릴, t-부틸디메틸실릴, t-부틸디페닐실릴, 트리이소프로필실릴 및 이소프로필디메틸실릴로부터 선택되는 화합물.
8. 구현예 1-7 중 어느 하나에 있어서, A1 이 아세틸인 화합물.
9. 구현예 1-8 중 어느 하나에 있어서, L 이 사슬 길이가 2-30 개의 원자인 링커 기인 화합물.
10. 구현예 1-9 중 어느 하나에 있어서, L 이 하기로 이루어지는 군으로부터 선택되는 화합물:
-(CH2)m-C(O)- (식 중, m = 2-12, 특히 4, 5 또는 11 임);
-(CH2-CH2-O)n-CH2-C(O)- (식 중, n = 1-5, 특히 2, 3 또는 4, 더욱 특히 3 임);
-(CH2)m1-CO-NH-(CH2)m2-NH-C(O)- (식 중, m1 및 m2 는 각각 독립적으로 1-5, 특히 3, 4 또는 5 임);
-(CH2)m3-CO-NH-(CH2)m4-C(O)- (식 중, m3 및 m4 는 각각 독립적으로 1-5, 특히 3, 4 또는 5 임); 및
-(CH2)m6-NH-C(O)- (식 중, m6 은 2-12, 특히 12 임);
각각의 경우에서 C(O)- 는 NR1 에 부착됨.
11. 구현예 1-10 중 어느 하나에 있어서, 하기 화학식 (XV) 로 나타내어지는 화합물:
Figure 112018108847179-pct00034
.
12. 구현예 1-11 중 어느 하나에 있어서, L 이 -(CH2)4-C(O)-, -(CH2)5-C(O)-, -(CH2)11-C(O)-, -(CH2)6-NH-C(O)-, -(CH2)12-NH-C(O)-, -(CH2)5-CO-NH-(CH2)5-C(O)-, -(CH2)4-CO-NH-(CH2)3-NH-C(O)-, -(CH2)4-CO-NH-(CH2)4-NH-C(O)-, -(CH2)5-CO-NH-(CH2)3-NH-C(O)-, -(CH2)5-CO-NH-(CH2)4-NH-C(O)-, -(CH2)6-NH-CO-CH2-NH-C(O)-, 및 -(CH2CH2O)2-(CH2)2-NH-C(O)- 로 이루어지는 군으로부터 선택되고, 각각의 경우에 C(O)- 가 NR1 또는 NH 에 부착되는 화합물.
13. 구현예 1-12 중 어느 하나에 있어서, 하기 화학식 (XV) 로 나타내어지는 화합물:
Figure 112018108847179-pct00035
.
14. 생체분자에의 혼입을 위한 빌딩 블록으로서의 구현예 1-13 중 어느 하나에 따른 화학식 (I) 의 화합물의 용도.
15. 구현예 14 에 있어서, 화합물이 화합물 없는 생체분자와 비교했을 때 간, 특히 간세포에서의 생체분자의 효과를 증가시키는 용도.
16. 구현예 14 또는 15 에 있어서, 생체분자가 핵산 분자인 용도.
17. 구현예 1-13 중 어느 하나에 정의된 화학식 (I) 의 화합물로부터 유래된 적어도 하나의 빌딩 블록이 5'-말단 및/또는 3'-말단에 부착된 핵산 분자.
18. 하기로 나타내어지는 화학식 (IV) 을 갖는 화합물 및 이의 임의의 염을 포함하는 5'- 및/또는 3'- 말단 개질된 핵산 분자:
5'-R7O-(Y1)p-NA-(Y2)q-OR8-3' (IV)
[식 중,
NA 는 핵산 분자이고,
p 및 q 는 0 내지 6, 특히 0 내지 4 의 정수이고, 단 p+q 는 적어도 1 이고,
R7 은 H, 트리페닐메틸-기반 히드록실 보호기 또는 5'-히드록실 캡핑기로부터 선택되고,
R8 은 H 또는 3'-히드록실 캡핑기로부터 선택되고,
Y1 은 각각의 경우에 독립적으로 하기 화학식 (V) 의 화합물로 나타내어지고:
Figure 112018108847179-pct00036
,
Y2 는 각각의 경우에 독립적으로 하기 화학식 (VI) 의 화합물로 나타내어짐:
Figure 112018108847179-pct00037
{식 중, 각각의 Y1 및 Y2 에 대해 독립적으로,
R1 은 H 또는 C1-6 알킬이고;
K' 는 하기 화학식 (II') 로 나타내어지고:
Figure 112018108847179-pct00038
(식 중, L 은 링커임),
Z1 및 Z2 는 각각의 경우에 독립적으로, O 및 S 로부터 선택됨}].
19. 구현예 18 에 있어서, 링커가 2-30 개의 원자의 사슬 길이를 갖는 링커 기, 특히 구현예 10 또는 구현예 11 에 정의된 바와 같은 링커인 핵산 분자.
20. 구현예 18 또는 19 에 있어서, 각각의 경우에 독립적으로 Z1 이 S 이고 Z2 가 O 이거나, Z1 및 Z2 가 O 인 핵산 분자.
21. 구현예 18-20 중 어느 하나에 있어서, 하기와 같은 핵산 분자:
i) p 는 1 이고, q 는 0 이거나,
ii) p 는 2 이고, q 는 0 이거나,
iii) p 는 3 이고, q 는 0 이거나,
iv) p 는 4 이고, q 는 0 이거나,
v) p 는 0 이고, q 는 1 이거나,
vi) p 는 0 이고, q 는 2 이거나,
vii) p 는 0 이고, q 는 3 이거나,
viii) p 는 0 이고, q 는 4 임.
22. 구현예 18-21 중 어느 하나에 있어서, p 가 3 이고 q 가 0 이거나, p 가 0 이고 q 가 3 인 핵산 분자.
23. 구현예 21 또는 22 에 있어서, Z1 및 Z2 가, NA 에 인접한 Y1 및/또는 Y2 모이어티의 경우 O 이고, 여기서 Z1, Z2, Y1, 및 Y2 가 구현예 18 에 따라 정의되는 핵산 분자.
24. 구현예 21 내지 23 에 있어서, Z1 및 Z2 이, 제 1 Y1 및/또는 Y2 모이어티에 인접한 Y1 및/또는 Y2 모이어티의 경우 O 인 핵산 분자.
25. 구현예 23 또는 24 에 있어서, 본원의 Z1 및 Z2 가, Y1 및/또는 Y2 모이어티의 나머지의 경우 S 인 핵산 분자.
26. 구현예 21 또는 22 에 있어서, Z1 및 Z2 가, 모든 Y1 및/또는 Y2 모이어티의 경우 O 이고, 여기서 Z1, Z2, Y1, 및 Y2 가 구현예 18 에 따라 정의되는 핵산 분자.
27. 구현예 18-21 에 있어서, 분자가 하기 화학식 (VII-XY) 또는 화학식 (VIII-XY) 으로 나타내어지는 핵산 분자:
Figure 112018108847179-pct00039
[식 중, n 은 0 내지 6 의 정수이고, Y 및 X 는 독립적으로 S 및 O 로부터 선택됨].
28. 구현예 18-21 중 어느 하나에 있어서, 분자가 하기 화학식 (VII) 로 나타내어지고, n 이 0 내지 6 의 정수인 핵산 분자:
Figure 112018108847179-pct00040
.
29. 구현예 18-21 중 어느 하나에 있어서, 분자가 하기 화학식 (VII-OO) 로 나타내어지고, n 이 0 내지 6 의 정수인 핵산 분자:
Figure 112018108847179-pct00041
.
30. 구현예 18-21 중 어느 하나에 있어서, 분자가 하기 화학식 (VIII) 로 나타내어지고, n 이 0 내지 6 의 정수인 핵산 분자:
Figure 112018108847179-pct00042
.
31. 구현예 18-21 중 어느 하나에 있어서, 분자가 하기 화학식 (VIII-OO) 로 나타내어지고, n 이 0 내지 6 의 정수인 핵산 분자:
Figure 112018108847179-pct00043
.
32. 구현예 27 내지 29 에 있어서, n 이 1, 2 또는 3 인 핵산 분자.
33. 구현예 17-31 중 어느 하나에 있어서, 핵산 분자가 길이가 10 내지 50 개의 뉴클레오티드인 핵산 분자.
34. 구현예 17-33 중 어느 하나에 있어서, 핵산 분자가 특히 각각의 경우에 독립적으로 2'-O-알킬-RNA, 2'-O-메틸-RNA, 2'-알콕시-RNA, 2'-O-메톡시에틸-RNA, 2'-아미노-DNA, 2'-플루오로-DNA, 아라비노 핵산 (ANA), 2'-플루오로-ANA 및 LNA 뉴클레오시드로 이루어지는 군으로부터 선택되는, 적어도 하나의 개질된 뉴클레오시드를 포함하는 핵산 분자.
35. 구현예 34 에 있어서, 적어도 하나의 개질된 뉴클레오시드가 LNA 뉴클레오시드인 핵산 분자.
36. 구현예 34 또는 35 에 있어서, LNA 뉴클레오시드가 2'-O-CH2-4'-, 2'-O-CH2-CH2-4'-, 2'-O-CH(CH3)-4'-, 2'-O-CH(OCH2CH3)-4'- 및 2'-O-C(CH3)2-4'-뉴클레오시드로 이루어지는 군으로부터 선택되는 2'-4'-가교된 뉴클레오시드인 핵산 분자.
37. 구현예 34-36 중 어느 하나에 있어서, LNA 뉴클레오시드가 베타-D-옥시-LNA-뉴클레오시드 또는 알파-L-옥시-LNA-뉴클레오시드인 핵산 분자.
38. 구현예 17-37 중 어느 하나에 있어서, 핵산 분자가 적어도 하나의 개질된 뉴클레오시드간 연결을 포함하는 핵산 분자.
39. 구현예 38 에 있어서, 핵산 분자에서 모든 뉴클레오시드간 연결이 개질되는 핵산 분자.
40. 구현예 38 또는 39 에 있어서, 개질된 뉴클레오시드간 연결이 포스포로티오에이트 뉴클레오시드간 연결인 핵산 분자.
41. 구현예 17-40 중 어느 하나에 있어서, 분자가 단일가닥 안티센스 올리고뉴클레오티드인 핵산 분자.
42. 구현예 17-40 중 어느 하나에 있어서, 핵산 분자가 RNase H 를 동원할 수 있고, 특히 핵산 분자가 갭머인 핵산 분자.
43. 구현예 17-42 중 어느 하나에 있어서, 핵산 분자가 식 5'-F-G-F'-3' 의 갭머이고, 여기서 영역 F 및 F' 는 각각의 경우에 독립적으로 1 내지 7 개의 개질된 뉴클레오시드를 포함하고, G 는 RNase H 를 동원할 수 있는 6 내지 16 개의 뉴클레오시드 사이의 영역인 핵산 분자.
44. 구현예 17-40 중 어느 하나에 있어서, 분자가 이중가닥 RNAi 분자인 핵산 분자.
45. 구현예 44 에 있어서, 화학식 (I) 을 갖는 화합물 또는 화학식 (IV) 의 용어 R7O-(Y1)p 또는 용어 (Y2)q-OR8 이 분자의 센스 가닥과 연관되고, R7, R8, Y1, 및 Y2 가 구현예 18 에 정의된 바와 같은 핵산 분자.
46. 구현예 17-45 중 어느 하나의 핵산 분자, 및 약학적으로 허용가능한 희석제, 용매, 담체, 염 및/또는 아쥬반트를 포함하는 약학 조성물.
47. 의약, 특히 인간 의약에서 사용하기 위한, 구현예 17-46 중 어느 하나의 핵산 분자 또는 구현예 46 의 약학 조성물.
실시예
실시예 1: DMT-모노-GalNAc 포스포르아미다이트의 합성
이러한 실시예는 상기 기재된 트리틸-모노-GalNAc 포스포르아미다이트의 특정 예로서 DMT-모노-GalNAc 포스포르아미다이트의 제조 방법을 기재한다. 화학식 (IX) 의 화합물로부터 출발하는 화학식 (XII) 의 화합물의 합성은 하기 반응식에 의해 예시된다:
Figure 112018108847179-pct00044
.
화합물 1 은 WO 2012/083046 (페이지 54-55) 에 기재된 바와 같이 제조하였다.
화합물 2 는 하기와 같이 제조하였다: 60 mL 디메틸포름아미드 중 화합물 1 (7.00 g, 12.1 mmol, 아세토니트릴 및 톨루엔과 함께 공동-증발됨) 의 용액에, 세리놀 (1.37 g, 15.0 mmol) 및 1-히드록시벤조트리아졸 (HOAT, 2.04 g 15.0 mmol) 을 첨가했다. 반응 혼합물을 0 ℃ (얼음 배쓰) 로 냉각시키고, N-(3-디메틸아미노프로필)-N'-에틸카르보디이미드 히드로클로라이드 (EDC·HCl, 2.88 g 15.0 mmol) 를 20 min 동안 분획으로 첨가하였다. 반응 혼합물을 5 h 동안 실온에서 교반하고, 물 (5 mL) 을 첨가하고, 용매를 증발시켰다 (50 ℃, 6 mbar). 잔류물을 실리카겔 크로마토그래피 (용리액, 디클로로메탄 중 에탄올, 5% → 15%) 에 의해 정제하였다. 화합물 2 를 무색 오일로서 수득하였다 (7.62 g).
화합물 3 을 아래와 같이 제조하였다: 150 mL 테트라히드로푸란 중 2 (2.32 g, 3.97 mmol, 아세토니트릴 및 톨루엔과 함께 3회 동시 증발됨) 의 용액에, 디이소프로필에틸아민 (1.31 mL, 7.6 mmol) 을 첨가하고, 이후 4,4'-디메톡시트리틸 클로라이드 (1.67 g, 4.94 mmol) 을 3 h 에 분획으로 첨가하였다. 반응 혼합물을 20 h 동안 실온에서 교반하였다. 물 (1.5 ml) 및 에탄올 (1.5 mL) 을 반응물에 첨가하고, 용매를 증발시켰다. 잔류물을 실리카겔 크로마토그래피 (용리액, 디클로로메탄 중 에탄올, 0% → 20%) 에 의해 정제하였다. 화합물 3 을 백색 폼 (foam) 으로서 수득하였다 (2.27 g).
화합물 4 를 아래와 같이 제조하였다: 디클로로메탄 (55 mL) 중 3 (2.60 g 2.85 mmol, 아세토니트릴 및 톨루엔과 함께 공동-증발됨) 의 용액에, 아세토니트릴 (5 mL) 중 4,5-디시아노이미다졸 (DCI, 235 mg 2.00 mmol) 의 용액 및 DCM (5 mL) 중 2-시아노에틸 테트라이소프로필포스포로디아미다이트 (1.03 g, 3.42 mmol) 의 용액을 20 min 에 0 ℃ 에서 동시에 첨가하였다. 반응 혼합물을 0 ℃ 에서 및 실온에서 3 h 동안 교반하고, 디클로로메탄 (100 mL) 으로 희석시키고, 포화 NaHC03 (100 mL), 염수 (100 mL) 로 추출하고, Na2S04 로 건조시키고, 증발시켰다. 실리카겔 크로마토그래피 (용리액, 헥산 중 에틸아세테이트, 70% → 100 % + 5% 트리에틸아민) 에 의해 잔류물을 정제하였다. 화합물 4 를 백색 폼으로서 수득하였다 (2.72 g).
실시예 2: 올리고뉴클레오티드의 합성
미정제 올리고뉴클레오티드를 표준 포스포르아미다이트 화학에 의해 NittoPhase UnyLinker 200 지지체 상에서 1μmol 스케일로 DMT-ON 모드에서 합성하였다. 4,5-디시아노이미다졸 (아세토니트릴 중 0.5 M) 을 활성화제로서 사용하였다. 잔탄 히드라이드 (피리딘/아세토니트릴 1:5 중 22mM) 를 티오산화에 사용하였다. 산화제 0.05M (SAFC, 카탈로그 번호 L560250) 을 산화에 사용하였다. 벤조일 보호된 A 및 C 및 이소부티릴 보호된 G 를 갖는 표준 DNA 포스포르아미다이트를 사용하였다. 벤조일 보호된 A 및 5-메틸-C 및 디메틸포름아미딘 보호된 LNA-G 를 갖는 LNA 포스포르아미다이트를 사용하였다. DNA 및 LNA 모노머에 대한 커플링 시간은 각각 2x 3 및 5 분이었다. 모노머 4 의 경우, 커플링은 2x 10 분으로 연장되었다. 말단 합성 이후, 지지체를 0.5 mL 의 농축 수산화암모늄에 60 ℃ 에서 16 시간 동안 현탁시켰다. 지지체를 여과 제거하고, 용액을 진공 하에 증발 건조시켰다. 미정제 DMT-ON 올리고뉴클레오티드를 고체상 추출 카트리지 (Waters Oasis HLB 6cc 200mg) 상에서 정제하였다. 카트리지를 먼저 아세토니트릴 및 0.1 M 암모늄 아세테이트로 평형화시켰다. 미정제 올리고뉴클레오티드를 0.1 M 암모늄 아세테이트에 용해시켜 적용하고, 카트리지를 0.1 M 암모늄 아세테이트 중 15% 아세토니트릴에 의해 용리시켰다. DMT 기를 10 min 동안 3% 트리플루오로아세트산으로 제거하고, 컬럼에 0.1 M 암모늄 아세테이트 이후 물을 첨가하였다. 올리고뉴클레오티드를 물 중 15% 아세토니트릴로 용리시키고, 용매를 증발시켜, 순수한 화합물을 생성하였다. 순도 및 정체를 UPLC-MS 분석에 의해 확인하였다.
실시예 3: 구체적 모노-GalNAc 핵산 콘쥬게이트
실시예 2 의 올리고뉴클레오티드 합성에서 실시예 1 의 DMT-모노-GalNAc 포스포르아미다이트를 사용하여, 표 1 및 2 에 나타낸 GalNAc 핵산 콘쥬게이트를 합성하였다.
올리고뉴클레오티드의 5'-말단에 혼입된 본 발명의 하나 이상의 모노-GalNAc 모이어티를 갖는 예시적인 올리고뉴클레오티드 콘쥬게이트의 화학식은 하기 화학식 (VII) 로 나타내어진다:
Figure 112018108847179-pct00045
.
이러한 화학식 (VII) 를 기반으로 하는 특정 화합물이 합성되었고, 아래 표 2 에서 화합물 A, B, C 및 D 로 나타내어진다.
표 2: 5' 콘쥬게이트된 핵산 화합물
Figure 112018108847179-pct00046
유사하게, 올리고뉴클레오티드의 3'-말단에 혼입된 하나 이상의 모노-GalNAc 모이어티를 갖는 예시적인 올리고뉴클레오티드 콘쥬게이트의 화학식은 하기 화학식 (VIII) 로 나타내어진다:
Figure 112018108847179-pct00047
이러한 화학식 (VIII) 를 기반으로 하는 하나의 특정 화합물이 합성되었고, 아래 표 3 에서 화합물 E 로 나타내어진다.
표 3: 3' 콘쥬게이트된 핵산 화합물
Figure 112018108847179-pct00048
비교 목적으로, 하기 참조 화합물 F (네이키드 올리고뉴클레오티드, 즉 GalNAc 없음) 및 G (맞춤 제작 3가 GalNAc) 가 아래 표 4 에 나타낸 바와 같이 제조되었다.
표 4: 참조 화합물
Figure 112018108847179-pct00049
Figure 112018108847179-pct00050
실시예 4: 모노-DMT-모노-GalNAc-포스포르아미다이트로부터 제조된 GalNAc 올리고뉴클레오티드 콘쥬게이트의 생체내 효과
흑색의 6 마리의 마우스를, 표 1 내지 3 에 나타낸 올리고뉴클레오티드 콘쥬게이트 또는 대조군 화합물에 적용하고, ApoB mRNA 의 녹 다운, 올리고뉴클레오티드의 조직 함량 및 총 콜레스테롤을 측정하였다.
암컷 C57BL6/J 마우스 (5 마리/군, 도착시에 약 20 g) 를 단일 투약량 염수 또는 0.25 mg/kg 비콘쥬게이트된 LNA-안티센스 올리고뉴클레오티드 (화합물 F) 또는 0.25mg/kg 또는 0.1 mg/kg의 GalNAc 콘쥬게이트된 LNA 안티센스 올리고뉴클레오티드 (본 발명의 화합물 C 또는 E 또는 참조 화합물 G) 로 피하 (sc) 주사하였다. 50 ㎕ 의 혈액 샘플을, 투약전 제 -6 일에 및 투약후 제 3 일 및 제 7 일에 수집하였다. 동물을 제 10 일에 희생시키고, 전체 혈청 뿐만 아니라 간 및 신장을 수집하였다.
ApoB mRNA 녹다운을 qPCR 에 의해 분석하였다. 간단히 말해서, RNA 를 제조사의 지침에 따라 MagnaPure RNA 단리 및 정제 시스템 (카탈로그 #03604721001 및 #05467535001 ; Roche) 을 사용하여 균질화된 간 및 신장으로부터 단리시켰다. RT-QPCR 은 제조사 프로토콜에 따라, Taqman Fast Universal PCR Master Mix 2x (Applied Biosystems Cat #4364103) 및 Taqman 유전자 발현 검정 (mApoB, Mn01545150_m1 및 mGAPDH #4352339E) 을 사용하여 이루어졌다. 결과를 아래 표 5 에 나타냈다.
표 5: 염수의 % 로서의 ApoB mRNA 발현
Figure 112018108847179-pct00051
간 및 신장에서 올리고뉴클레오티드 함량을 ELISA (예를 들어 Straarup et al 2010 Nucleic Acid Res Vol 38 pp7100-7111 참조) 를 사용하여 측정하고, 결과를 아래 표 6 에 나타냈다.
표 6: 간 및 신장에서 올리고뉴클레오티드 함량
Figure 112018108847179-pct00052
혈청 중 총 콜레스테롤을, 제조사의 지침에 따라 ABX Pentra Cholesterol CP (Triolab, Brondby, Denmark) 을 사용하여 측정하였다. 결과를 도 1 에 나타냈다. ABX Pentra ALT CP 시약 (A11A01627 Triolab, Brondby, Denmark) 을 사용하여 ALT (알라닌 아미노트랜스퍼라아제) 를 측정하였다. 결과를 아래 표 7 에 나타냈다.
표 7: 염수 L 의 % 로서 제 10 일에 혈청 중 ALT 수준
Figure 112018108847179-pct00053
결론: ApoB LNA 안티센스 올리고뉴클레오티드 (화합물 C 및 E) 에 콘쥬게이트된 DMT-모노-GalNAc 포스포르아미다이트로 제조된 신규한 GalNAc 올리고뉴클레오티드 콘쥬게이트는, 비콘쥬게이트된 (네이키드) ApoB LNA 올리고뉴클레오티드 (화합물 F) 와 비교했을 때 간에서 ApoB mRNA 의 개선된 녹 다운을 나타냈다. 3' 콘쥬게이트된 신규한 GalNAc 올리고뉴클레오티드 콘쥬게이트 구조물 (화합물 E) 은 GalNAc2 클러스터 콘쥬게이트된 LNA 올리고뉴클레오티드 (화합물 G) 에 필적하는 ApoB mRNA 의 녹 다운을 나타내는 한편, 5' 콘쥬게이트된 신규한 GalNAc 올리고뉴클레오티드 콘쥬게이트 구조물 (화합물 C) 은 높은 투약량 농도에서 GalNAc2 콘쥬게이트된 LNA 올리고뉴클레오티드보다 더 양호한 녹다운을 나타냈다 (표 5). 더 낮은 투약량 수준 (0.1 mg/kg) 에서, GalNAc 콘쥬게이트된 LNA 올리고뉴클레오티드는, 필적하는 간에서의 ApoB mRNA 의 녹 다운을 나타냈다. 총 콜레스테롤의 감소를 나타내는 데이터는 mRNA 녹 다운과 연관한 관찰과 관련이 있다 (도 1a 및 도 1b).
올리고뉴클레오티드의 조직 함량 (표 6) 은 얼마나 GalNAc 콘쥬게이트된 LNA 올리고뉴클레오티드 (화합물 C, E 및 G) 가, 비콘쥬게이트된 올리고뉴클레오티드 (화합물 F) 와 비교하여, 향상된 간에서의 흡수 및 감소된 신장에서의 흡수를 갖는지를 보여준다. 또한, 5' 콘쥬게이트된 신규한 GalNAc 올리고뉴클레오티드 콘쥬게이트 구조물 (화합물 C) 은, 높은 투약량에서 GalNAc2 콘쥬게이트된 LNA 올리고뉴클레오티드 (화합물 G) 와 비교했을 때 향상된 간/신장 분포 비율을 갖는 것으로 나타난다.
모든 시험된 화합물은 안전했다. 시험된 구조물 중 어떠한 것도 표 7 에 나타낸 바와 같이 상승된 ALT 판독을 나타내지 않았다.
실시예 5: 모노-GalNAc 단위와 올리고뉴클레오티드 사이의 PS 및 PO 연결을 변화시킨 GalNAc 핵산 콘쥬게이트
실시예 2 의 올리고뉴클레오티드 합성에서 실시예 1 의 DMT-모노-GalNAc 포스포르아미다이트를 사용하여, 표 8 에 나타낸 GalNAc 핵산 콘쥬게이트를 합성하였다.
분자는, 생절단성 ca 포스포디에스테르 (PO) 연결된 디뉴클레오티드가 제거되거나, 화학식 (VII) 에서의 포스포르티오에이트 (PS) 연결 대신에 모노-GalNAc 단위 사이에서 포스포디에스테르 연결로 치환되거나, 이로 보충된다는 점에서, 실시예 3 에서의 것과 상이하다.
표 8: 핵산 분자의 5' 말단에 혼입된 3가 및 2가 GalNAc 화합물
Figure 112018108847179-pct00054
올리고뉴클레오티드의 5'-말단에 혼입된 본 발명의 하나 이상의 모노-GalNAc 모이어티를 갖는 예시적인 올리고뉴클레오티드 콘쥬게이트의 화학식은 하기 화학식 (VII-XY) 로 나타내어진다:
Figure 112018108847179-pct00055
표 4 에서의 참조 화합물 이외에, 참조 화합물 M 은, 5'-GalNAc2ocoaoGs mCsaststsgsgstsastsTs mCsA-3' (SEQ ID NO:2) 이 제조되었다. 이러한 화합물은, 표적 핵산 및 GalNAc2 모이어티와 상보적인 안티센스 올리고뉴클레오티드 (SEQ ID NO:1) 사이에 포스포디에스테르 연결된 ca 디뉴클레오티드의 형태의 생절단성 링커를 가짐으로써 참조 화합물 G 와 상이하다.
실시예 6: 모노-GalNAc 단위와 안티센스 올리고뉴클레오티드 사이의 PS 및 PO 연결의 변화
흑색의 6 마리의 마우스를 모노-GalNAc 단위 및 안티센스 올리고뉴클레오티드 화합물 사이에서 변화된 포스포르티오에이트 (PS) 및 포스포디에스테르 (PO) 연결을 갖는 올리고뉴클레오티드 콘쥬게이트에 적용하였다. ApoB mRNA 의 녹 다운, 올리고뉴클레오티드의 조직 함량, 총 콜레스테롤 및 ALT 를 측정하였다.
암컷 C57BL6/J 마우스 (5 마리/군, 도착시에 약 20 g) 를, 단일 투약량 염수, 0.22 mg/kg, 0.45 mg/kg 또는 0.89 mg/kg 의 GalNAc 콘쥬게이트된 LNA 안티센스 올리고뉴클레오티드 (본 발명의 화합물 H, I 또는 J) 또는 네이키드 참조 화합물 F 로 정맥내 (iv) 주사하였다. 50 ㎕ 의 혈액 샘플을 투약전 제 -6 일에 수집하였다. 동물을 제 3 일에 희생시켰다. 전체 혈청 뿐만 아니라 간 및 신장을 수집하였다.
ApoB mRNA 녹 다운을 실시예 4 에 기재된 바와 같이 측정하였고, 그 결과를 아래 표 9 및 10 에 나타냈다.
표 9: 간에서 염수의 % 로서의 ApoB mRNA/ mGAPDH 발현
Figure 112018108847179-pct00056
표 10: 신장에서 염수의 % 로서의 ApoB mRNA 발현
Figure 112018108847179-pct00057
ELISA (예를 들어 Straarup et al 2010 Nucleic Acid Res Vol 38 pp7100-7111 참조) 를 사용하여 간 및 신장에서 올리고뉴클레오티드 함량을 측정하고, 그 결과를 아래 표 11A 및 11B 에 나타냈다.
표 11A: 간 조직 1 g 당 ㎍ 로의 올리고뉴클레오티드 함량
Figure 112018108847179-pct00058
표 11B: 신장 조직 1 g 당 ㎍ 로의 올리고뉴클레오티드 함량
Figure 112018108847179-pct00059
혈청 중 총 콜레스테롤을, 제조사의 지침에 따라 ABX Pentra Cholesterol CP (Triolab, Brondby, Denmark) 을 사용하여 측정하였다. 결과를 아래 표 12 에 나타냈다.
표 12: 염수의 혈청 콜레스테롤 백분율
Figure 112018108847179-pct00060
ABX Pentra ALT CP 시약 (A11A01627 Triolab, Brondby, Denmark) 를 사용하여 ALT (알라닌 아미노트랜스퍼라아제) 를 측정하였다. 결과를 아래 표 13 에 나타냈다.
표 13: 염수의 % 로서 제 3 일에 혈청 중 ALT 수준 (U/L)
Figure 112018108847179-pct00061
결론: ApoB LNA 안티센스 올리고뉴클레오티드에 혼입된 DMT-모노-GalNAc 포스포르아미다이트로 제조된 GalNAc 올리고뉴클레오티드 콘쥬게이트 (화합물 H, I 및 J) 모두는, 비콘쥬게이트된 (네이키드) ApoB LNA 올리고뉴클레오티드 (화합물 F) 와 비교했을 때, 향상된 간 대 신장 비율을 나타냈다 (표 9 내지 11). 혈청 콜레스테롤 감소 및 간에서의 향상된 ApoB 녹 다운을 달성하기 위해, 적어도 하나의 포스포디에스테르 연결이 존재해야 했다 (화합물 I 및 J, 표 9 및 12). 일반적으로 시험된 화합물은 간독성에 관하여 안전했다. 화합물 J 의 경우, 일부 동물은 최고 투약량에서 ALT 수준 증가를 나타냈는데, 이는 과장된 약리학으로 인한 것일 수 있다 (표 13).
실시예 7: PO 연결의 위치의 변화
흑색의 6 마리의 마우스를, 모노-GalNAc 단위 및 안티센스 올리고뉴클레오티드 화합물 사이의 상이한 위치에 포스포디에스테르 (PO) 뉴클레오시드 연결을 갖는 올리고뉴클레오티드 콘쥬게이트에 적용하였다 (표 14). ApoB mRNA 의 녹 다운, 올리고뉴클레오티드의 조직 함량, 총 콜레스테롤 및 ALT 를 측정하였다.
표 14: 핵산 분자의 5' 말단에서 혼입된 3가 및 2가 GalNAc 화합물
Figure 112018108847179-pct00062
암컷 C57BL6/J 마우스 (5 마리/군, 도착시에 약 20 g) 을, 단일 투약량 염수 또는 0.1 mg/kg 의 GalNAc 콘쥬게이트된 LNA 안티센스 올리고뉴클레오티드 (본 발명의 화합물 J, K, L, B 또는 C 또는 참조 화합물 M) 로 정맥내 (iv) 주사하였다. 50 ㎕ 의 혈액 샘플을 투약전 제 -6 일 및 투약후 제 3 일, 제 7 일, 제 10 일 및 제 14 일에 수집하였다. 동물을 제 7 일 또는 제 14 일에 희생시키고, 전체 혈청 뿐만 아니라 간 및 신장을 수집하였다.
ApoB mRNA 녹 다운을 실시예 4 에 기재된 바와 같이 측정하였다. 그 결과를 아래 표 15 에 나타냈다.
표 15: 간 및 신장에서 염수의 % 로서 ApoB mRNA / mGAPDH 발현
Figure 112018108847179-pct00063
간 및 신장에서 올리고뉴클레오티드 함량을, ELISA (예를 들어 Straarup et al 2010 Nucleic acid Res Vol 38 pp7100-7111 참조) 를 사용하여 측정하고, 그 결과를 아래 표 16 에 나타냈다.
표 16: 간 또는 신장 조직 1 g 당 ㎍ 으로의 올리고뉴클레오티드 함량
Figure 112018108847179-pct00064
혈청 중 총 콜레스테롤을, 제조사의 지침에 따라 ABX Pentra Cholesterol CP (Triolab, Brondby, Denmark) 를 사용하여 측정하였다. 결과를 도 2 에 나타냈다.
ABX Pentra ALT CP 시약 (A11A01627 Triolab, Brondby, Denmark) 을 사용하여 ALT (알라닌 아미노트랜스퍼라아제) 를 측정하였다. 그 결과를 아래 표 17 에 나타냈다.
표 17: 염수의 % 로서의 제 3 일에 혈청 중 ALT 수준 (U/L)
Figure 112018108847179-pct00065
결론: 모든 GalNAc 콘쥬게이트된 화합물은, 오로지 0.1 mg/kg 으로의 단일 치료 이후 ApoB mRNA 수준 뿐만 아니라 콜레스테롤 수준을 감소시킬 수 있었다 (표 15 및 도 2). 작용 기간은 GalNAc2 모이어티를 갖는 대조군 화합물과 비교하여 본 발명의 화합물의 경우에 약간 더 짧은 것으로 보인다 (표 15, 제 14 일). 모든 화합물은 절단성 포스포디에스테르 (PO) 연결의 위치와 기능적으로 무관하였다. 2가 콘쥬게이트된 안티센스 올리고뉴클레오티드는, 이러한 분자에 대하여 간에서의 올리고뉴클레오티드의 총량이 3가 콘쥬게이트된 분자에 대해서보다 낮다는 사실에도 불구하고, 3가 콘쥬게이트된 안티센스 올리고뉴클레오티드만큼 강력한 것으로 드러난다 (표 16). 분자 중 어떠한 것도 ALT 상승 징후를 나타내지 않았다.
따라서, 전반적 결론은 GalNAc 콘쥬게이트된 안티센스 올리고뉴클레오티드에 대한 전체 디자인 스펙트럼은 상당히 폭넓으며, 목적에 따른 최적화를 허용한다는 것이다.
실시예 8: 입체정의된 모노-GalNAc 포스포르아미다이트의 제조
Figure 112018108847179-pct00066
DMT-보호된 세리놀 5-L 및 5-D 를, Putnam and Bashkin 2006 Nucleosides, Nucleotides, and Nucleic Acids, 24 (9): 1309-1323 에 기재된 바와 같이, 각각 L- 및 D-세린 메틸 에스테르로부터 제조하였다.
화합물 6-D 를 아래와 같이 제조하였다: DMF (12 mL) 중 1 (1 .23 g, 2.29 mmol, MeCN 및 톨루엔과 공동-증발됨) 의 용액에 5-D (900 mg, 2.29 mmol) 및 HOAT (31 1 mg, 2.29 mmol) 을 첨가했다. 반응 혼합물을 0 ℃ (얼음 배쓰) 로 냉각시키고, EDC·HCl (438 mg, 2.29 mmol) 을 20 min 동안 분획으로 첨가하였다. 반응 혼합물을 실온에서 26 h 동안 교반하였다. 물 (1 mL) 를 첨가하고, 혼합물을 증발시켰다. EtOAc (70 mL) 을 잔류물에 첨가하고, 혼합물을 10% 시트르산 (30 mL), 포화 NaHCO3 (30 mL), 염수 (30 mL) 로 추출하고, Na2SO4 로 건조시키고, 증발시켰다. 잔류물을 컬럼 크로마토그래피 (용리액, DCM 중 EtOH 2% → 8%) 에 의해 정제하여, 화합물 6-D 를 백색 폼으로서 생성하였다 (1.77 g).
동일한 절차를 화합물 6-L 을 제조하는데 사용하였다.
화합물 7-D 를 하기와 같이 제조하였다: DCM (20 mL) 중 6-D (1.65 g, 1.81 mmol, MeCN, 톨루엔 (3x) 과 함께 공동-증발됨) 의 용액에, DCM (15 mL) 중 2-시아노에틸 테트라이소프로필포스포로디아미다이트 (599 mg, 1.99 mmol) 의 용액 및 MeCN (2.5 mL) 중 4,5-디시아노이미다졸 (DCI, 149 mg, 1.27 mmol) 의 용액을 0 ℃ 에서 25 min 에 동시에 첨가하였다. 반응 혼합물을 0 ℃ 에서 30 min 동안 및 실온에서 3 h 동안 교반하고, DCM (100 mL) 로 희석하고, 포화 NaHCO3 (50 mL), 염수 (50 mL) 로 추출하고, Na2SO4 로 건조시키고, 증발시켰다. 잔류물을 컬럼 크로마토그래피 (용리액, 헥산 중 EtOAc 60% → 100 % + 5% NEt3) 에 의해 정제하여, 화합물 7-D 를 백색 고체로서 수득하였다 (1.23 g).
동일한 절차를 화합물 7-L 을 제조하는데 사용하였다.
실시예 9: 입체정의된 모노-GalNAc 모이어티를 갖는 GalNAc 콘쥬게이트의 성능의 조사
본 발명의 모노-GalNAc 모이어티의 혼입은, 아래에서 별표로 예시되는 바와 같은 포스포네이트 연결 사이의 골격에 입체 중심을 도입한다.
Figure 112018108847179-pct00067
본 실시예에서는, 화합물의 입체정의된 버전이 효능 및 올리고 함량에 영향을 줄지 여부를 조사하였다. 실험은 1차 마우스 간세포에서 수행하였다.
표 18 에서의 화합물은, 실시예 3 의 방법을 사용하여, 입체정의된 DMT-모노-GalNAc 포스포르아미다이트 7-D 및 7-L (실시예 8 참조) 을 사용해 생성하였다. 콘쥬게이션에 사용된 올리고뉴클레오티드는, 5'-Gs mCsaststsgsgstsastsTs mCsA (SEQ ID NO: 1) 이었다. 혼입은 올리고뉴클레오티드와 제 1 모노-GalNAc 모이어티의 사이 뿐만 아니라 하기 입체정의된 모노-GalNAc 단위들 사이에 포스포디에스테르 연결을 갖는 올리고뉴클레오티드의 5' 말단에서 있었다. 화합물은 화합물 J 의 입체정의된 버전이다. 올리고뉴클레오티드에서 각각의 GalNAc 단위의 입체배열은, 올리고뉴클레오티드 합성에서 포스포르아미다이트 7-D (D) 또는 7-L (L) 의 사용을 나타낸다. 입체배열 D 및 L 은 올리고뉴클레오티드 J-1 - J-8 또는 화합물 5-D, 5-L, 6-D, 6-L, 7-D, 또는 7-L 의 임의의 측정된 광학 회전을 나타내지 않는다.
표 18: 화합물 J 의 입체정의된 버전
Figure 112018108847179-pct00068
입체정의된 화합물 이외에, 연구는 화합물 F (비콘쥬게이트된 올리고뉴클레오티드) 및 화합물 G (GalNAc2 콘쥬게이트된 올리고뉴클레오티드) 를 포함하였다.
1차 마우스 간세포를 C57BL/6J 암컷 마우스로부터 단리하였다. 마우스를 마취시키고, 5 분 동안 15 mM Hepes 및 0.38 mM EGTA 를 함유하는 행크 균형 염 용액 (Hank's balanced salt solution) 이후 12 분 동안 콜라게나아제 용액 (0.17 mg/ml 콜라게나아제 제2형 (Worthington 4176), 0.03% BSA, 3.2 mM CaCl2 및 1.6 g/l NaHCO3 을 함유하는 행크 균형 염 용액) 을 사용하여, 대정맥을 통해 분당 7 ml 의 흐름 속도로 간에 관류 (perfuse) 시켰다. 관류 이후, 간을 제거하고, 간 캡슐을 개방하고, 간 현탁액을 William E 배지를 사용하여 70 ㎛ 세포 여과기 (cell strainer) 를 통해 여과하였다. 세포 현탁액을 50 xg 에서 3 min 동안 원심분리하였다. 50 xg 에서 10 min 동안 45% Percoll (Sigma cat. No. P4937) 과 함께 구배 원심분리하여 생 간세포 (viable hepatocyte) 를 추가 강화하였다. 펠릿을 세척하고, 25 mL William E 배지(Sigma cat. no. W1878, 1x Pen/Strep, 2 mM L-글루타민 및 10% FBS (ATCC #30-2030) 으로 보충됨) 에 재현탁시키고, 콜라겐 코팅된 96 웰 플레이트에서 25.000 세포/웰 로 파종하였다. 3 시간 이후, 배지를 교환하고, 9 로부터 000.4 μM 까지 3 배 희석물을 사용하여 올리고뉴클레오티드를 첨가하였다. 2 개의 상이한 인큐베이션 요법 (regimen) 을 사용하였고, 하나는 세포를 올리고뉴클레오티드와 함께 4 시간 동안 인큐베이션한 후, 배지를 교환하고, 총 72 시간까지 인큐베이션을 지속하였다. 제 2 요법에서는, 세포를 올리고뉴클레오티드와 함께 72 시간 동안 인큐베이션하였다.
전체 mRNA 를, 제조사의 지침에 따라 PureLink Pro 96 RNA 정제 키트 (Ambion) 를 사용하여 세포로부터 추출하였다. 유전자 발현 분석을 위해, 제조사 프로토콜에 따라, Taqman 유전자 발현 검정 (mApoB, Mm01545150_m1 및 mGAPDH #4352339E, Thermo Sceintific) 과 함께 듀플렉스 셋업에서, qScript™ XLT One-Step RT-qPCR ToughMix®, Low ROX™ (Quanta Bioscience) 를 사용하여 qPCR 을 수행하였다. GAPDH 에 비한 ApoB mRNA 발현 수준을 대조군 (PBS 처리된 세포) 의 백분율로서 도 3 에 나타냈고, IC50 값을 아래 표 19 에 나타냈다.
표 19: μM 로의 IC50 값, n=2
Figure 112018108847179-pct00069
ELISA (예를 들어 Straarup et al 2010 Nucleic Acid Res Vol 38 pp 7100-7111 참조) 를 사용하여 올리고뉴클레오티드 함량 분석을 수행하고, 그 결과를 아래 표 20 및 21 에 나타냈다.
표 20: 4 시간 올리고뉴클레오티드 처리 (펄스) 및 72 시간 총 인큐베이션 이후 세포 배양에서 올리고뉴클레오티드 함량 (pmol/㎍ 단백질), n=2
Figure 112018108847179-pct00070
화합물 F (네이키드 올리고뉴클레오티드) 를 또한 27 μM 의 투약량에서 분석하였고, 여기서 올리고뉴클레오티드 함량은 1.4 +/- 0.2 pmol/㎍ 단백질 이었다.
표 21: 72 시간 올리고뉴클레오티드 처리 이후 세포 배양에서 올리고뉴클레오티드 함량 (pmol/㎍ 단백질), n=2
Figure 112018108847179-pct00071
화합물 F (네이키드 올리고뉴클레오티드) 를 또한 27 μM 의 투약량에서 분석하였고, 여기서 올리고뉴클레오티드 함량은 34.2 +/- 0.7 pmol/㎍ 단백질 이었다.
결론: 입체정의된 GalNAc 콘쥬게이트는 표적 녹 다운 및 올리고뉴클레오티드 함량 모두와 관련하여 매우 유사하게 거동한다. 화합물 G (선행기술 GalNAc 구조물 - GalNAc2) 와 비교했을 때, 입체정의된 GalNAc 화합물의 특이적 활성은, ApoB 의 등가 녹 다운이 세포 중의 더 적은 올리고뉴클레오티드 함량으로 달성된다는 점에서, 약간 더 높은 것으로 보인다. 2 개의 상이한 인큐베이션 요법을 비교했을 때, 매우 효율적인 표적 녹 다운이 오로지 4 시간의 올리고뉴클레오티드를 사용한 인큐베이션 이후에 달성될 수 있는 한편, 네이키드 올리고뉴클레오티드의 경우, 흡수가 더 느리므로, 표적 녹 다운을 달성하기 위해 세포에 충분한 올리고뉴클레오티드를 얻는데 4 시간 초과가 필요하다. 올리고뉴클레오티드와 함께 72 시간 인큐베이션으로, GalNAc 콘쥬게이트는 4 시간 올리고뉴클레오티드 인큐베이션을 적용했을 때에 비해 0.33 μM 미만의 투약량에서 더 높은 ApoB 의 녹다운을 달성한다.
SEQUENCE LISTING <110> Roche Innovation Center Copenhagen A/S <120> TRITYL-MONO-GalNAc COMPOUNDS AND THEIR USE <130> P33532-WO <160> 3 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 13 <212> DNA <213> artificial <220> <223> Oligonucleotide sequence <400> 1 gcattggtat tca 13 <210> 2 <211> 15 <212> DNA <213> artificial <220> <223> oligonucleotide <400> 2 cagcattggt attca 15 <210> 3 <211> 15 <212> DNA <213> artificial <220> <223> Oligonucleotide sequence <400> 3 gcattggtat tcaca 15

Claims (16)

  1. 임의의 염을 포함하는 화학식 (IV) 를 갖는 핵산 분자 콘쥬게이트로서, 화합물 (IV) 가 하기로 나타내어지는 핵산 분자 콘쥬게이트:
    5'-R7O-(Y1)p-NA-(Y2)q-OR8-3' (IV)
    [식 중,
    NA 는 7 내지 50 개의 뉴클레오티드로 이루어진 핵산 분자이고,
    p 및 q 는 0 내지 6 의 정수이고, 단 p+q 는 적어도 1 이고,
    R7 은 H 또는 트리페닐메틸-기반 히드록실 보호기이고,
    R8 은 H 또는 3'-히드록실 캡핑기로부터 선택되고,
    Y1 은 각각의 경우에 독립적으로 하기 화학식 (V) 의 화합물로 나타내어지고:
    Figure 112021147165214-pct00075
    ,
    Y2 는 각각의 경우에 독립적으로 하기 화학식 (VI) 의 화합물로 나타내어짐:
    Figure 112021147165214-pct00076

    {식 중, 각각의 Y1 및 Y2 에 대해 독립적으로,
    R1 은 H 또는 C1-6 알킬이고;
    K' 는 하기 화학식 (II') 로 나타내어지고:
    Figure 112021147165214-pct00077

    (식 중, L 은
    -(CH2)m-C(O)- (식 중, m = 2 ~ 12);
    -(CH2-CH2-O)n-CH2-C(O)- (식 중, n = 1 ~ 5);
    -(CH2)m1-CO-NH-(CH2)m2-NH-C(O)- (식 중, m1 및 m2 는 각각 독립적으로 1 ~ 5);
    -(CH2)m3-CO-NH-(CH2)m4-C(O)- (식 중, m3 및 m4 는 각각 독립적으로 1 ~ 5);
    -(CH2)m6-NH-C(O)- (식 중, m6 은 2 ~ 12);
    -(CH2)6-NH-CO-CH2-NH-C(O)-; 및
    -(CH2CH2O)2-(CH2)2-NH-C(O)-
    로 이루어진 군으로부터 선택되는 링커이고, 각각의 경우에 C(O)- 는 NR1 에 부착됨),
    Z1 및 Z2 는 각각의 경우에 독립적으로, O 및 S 로부터 선택되고, 단 적어도 하나의 Z1 은 S 임}].
  2. 제 1 항에 있어서,
    (i) p 가 1 이고, q 가 0 이거나,
    (ii) p 가 2 이고, q 가 0 이거나,
    (iii) p 가 3 이고, q 가 0 이거나,
    (iv) p 가 4 이고, q 가 0 이거나,
    (v) p 가 0 이고, q 가 1 이거나,
    (vi) p 가 0 이고, q 가 2 이거나,
    (vii) p 가 0 이고, q 가 3 이거나,
    (viii) p 가 0 이고, q 가 4 인 핵산 분자 콘쥬게이트.
  3. 제 1 항에 있어서, 분자가 하기 화학식 (VII-XY) 또는 화학식 (VIII-XY) 로 나타내어지는 핵산 분자 콘쥬게이트:
    Figure 112021147165214-pct00078

    [식 중, n 은 0 내지 3 의 정수이고, Y 및 X 는 독립적으로 S 및 O 로부터 선택되고, 단 적어도 하나의 X 는 S 임].
  4. 제 1 항에 있어서, 핵산 분자가 적어도 하나의 개질된 뉴클레오시드를 포함하는 핵산 분자 콘쥬게이트.
  5. 제 1 항에 있어서, 핵산 분자가 적어도 하나의 개질된 뉴클레오시드간 연결을 포함하는 핵산 분자 콘쥬게이트.
  6. 제 1 항에 있어서, 핵산 분자가 RNase H 를 동원할 수 있는 핵산 분자 콘쥬게이트.
  7. 제 1 항의 핵산 분자 콘쥬게이트, 및 약학적으로 허용가능한 희석제, 용매, 담체, 염 및/또는 아쥬반트를 포함하는 조성물.
  8. 제 1 항에 있어서, 의약에서 사용하기 위한 핵산 분자 콘쥬게이트.
  9. 제 1 항에 있어서, L 이 -(CH2)4-C(O)-, -(CH2)5-C(O)-, -(CH2)11-C(O)-, -(CH2)6-NH-C(O)-, -(CH2)12-NH-C(O)-, -(CH2)5-CO-NH-(CH2)5-C(O)-, -(CH2)4-CO-NH-(CH2)3-NH-C(O)-, -(CH2)4-CO-NH-(CH2)4-NH-C(O)-, -(CH2)5-CO-NH-(CH2)3-NH-C(O)-, -(CH2)5-CO-NH-(CH2)4-NH-C(O)-, -(CH2)6-NH-CO-CH2-NH-C(O)- 및 -(CH2CH2O)2-(CH2)2-NH-C(O)- 로 이루어지는 군으로부터 선택되는 핵산 분자 콘쥬게이트.
  10. 제 1 항에 있어서, 모든 Z1 이 S 인 핵산 분자 콘쥬게이트.
  11. 제 3 항에 있어서, 모든 X 가 S 인 핵산 분자 콘쥬게이트.
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