TW202246500A - 用於抑制 ｒｔｅｌ１ 表現之增強型寡核苷酸 - Google Patents
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Abstract
本發明涉及靶向端粒延長解旋酶調節因子 1 (RTEL1) 之增強型反義寡核苷酸，得以調節 RTEL1 之表現或調節 RTEL1 活性。本發明特別是涉及該靶向 RTEL1 之增強型反義寡核苷酸用於治療及/或預防 B 型肝炎病毒 (HBV) 感染，特別是慢性 HBV 感染之用途。本發明特別是涉及該靶向 RTEL1 之增強型反義寡核苷酸用於去穩定 cccDNA，例如 HBV cccDNA 之用途。本發明還包含醫藥組成物以及其在治療及/或預防 HBV 感染中之用途。
Description
本發明涉及靶向 RTEL1 (端粒延長解旋酶調節因子 1) 之增強型反義寡核苷酸，得以調節 RTEL1 之表現或調節 RTEL1 活性。本發明特別是涉及靶向 RTEL1 之增強型反義寡核苷酸用於治療及/或預防 B 型肝炎病毒 (HBV) 感染，特別是慢性 HBV 感染之用途。本發明特別是涉及該靶向 RTEL1 之增強型反義寡核苷酸用於去穩定 cccDNA，例如 HBV cccDNA 之用途。本發明還包含醫藥組成物以及其在治療及/或預防 HBV 感染中之用途。
B 型肝炎係由 B 型肝炎病毒 (HBV) 引起之傳染病， B 型肝炎病毒係一種透過逆轉錄複製之小型嗜肝病毒。慢性 HBV 感染係導致嚴重肝病例如肝硬化、肝細胞癌之關鍵因素。當下對於慢性 HBV 感染之治療係基於投予聚乙二醇化第 1 型干擾素或核苷 (酸) 類似物，例如拉米夫定 (lamivudine)、阿德福韋 (adefovir)、恩替卡韋 (entecavir)、替諾福韋地索普西 (tenofovir disoproxil) 及替諾福韋艾拉酚胺 (tenofovir alafenamide)，該等藥物靶向病毒聚合酶，亦即一種多功能逆轉錄酶。治療成功通常以 B 型肝炎表面抗原 (HBsAg) 之丟失來衡量。然而，由於 B 型肝炎病毒 DNA 在感染後仍然存在於體內，因此很少能完全清除 HBsAg。HBV 之持久性由 HBV 基因體之游離形式媒介，該形式穩定地維持在細胞核中。該游離形式稱為「共價閉合環狀 DNA」(cccDNA)。cccDNA 充當所有 HBV 轉錄本之模板，包括前基因體 RNA (pgRNA)，亦即一種病毒複製中間體。幾個 cccDNA 複本之存在可能足以重新引發 HBV 感染。當下對於 HBV 之治療並不靶向 cccDNA。然而，慢性 HBV 感染之治癒將會要求消除 cccDNA (由 Nassal，Gut.2015 Dec;64(12):1972-84. doi: 10.1136/gutjnl-2015-309809 綜述)。
端粒延長解旋酶調節因子 1 (RTEL1) 編碼 DNA 解旋酶，該酶在端粒之穩定性、保護及延長中起作用，且與已知在 DNA 複製期間保護端粒之遮蔽素複合物 (shelterin complex) 中的蛋白質交互作用。該基因中之突變與先天性角化不良症及 Hoyerall-Hreidarsson 症候群有關 (參見例如由 Vannier 等人, 2014 Trends Cell Biol. Vol 24 p.416 綜述)。
RTEL1 位於細胞核中，作為 ATP 依賴性 DNA 解旋酶，參與端粒長度調節、DNA 修復及基因體穩定性之維持。RTEL1 作為抗重組酶，在減數分裂期間抵消毒性重組且限制互換，並且藉由物理解離鏈入侵事件來調節減數分裂重組及互換恆定性，從而藉由減數分裂合成依賴性鏈黏著 (SDSA) 來促進非互換修復以及分解 D 環重組中間體。此外，RTEL1 分解 T‑環且藉由抵消端粒 G4-DNA 結構來防止端粒脆弱，該等作用共同確保端粒之動態性及穩定性。
RTEL1 已在 siRNA 篩選中被鑑定為 HPV 游離基因體之穩定劑：(Edwards 等人, 2013 PLoS One Vol 8, e75406)。同樣，靶向 RTEL1 之 siRNA 也已經用於鑑定在 Hoyeraal-Hreidarsson 症候群中與 RTEL1 之交互作用物 (Schertzer 等人 2015 Nucleic Acid Res Vol 43 p. 1834)。此外，RTEL1 在對必需宿主蛋白之 siRNA 篩選中被鑑定為 HIV 宿主依賴性因子，以提供抑制 HIV 感染之標靶 (WO 2007/094818)。
在 WO 2020/011902 中，顯示用反義寡核苷酸靶向 RTEL1 導致 RTEL1 減少。此外，觀察到對於 HBV 感染參數例如 HBV cccDNA、pgRNA、HBsAg 及 HBeAg 的影響。
需要能夠特異性地抑制 RTEL1 的治療劑。我們已經篩選了超過 1000 種靶向人類 RTEL1 之反義寡核苷酸，並鑑定了特別有效且特異性地靶向人類 RTEL1 的序列及化合物。具體而言，鑑定了四種
LNA 間隙子寡核苷酸，該等寡核苷酸在活體外對於人類 RTEL1 具有強烈的下調作用。經鑑定之 LNA 間隙子寡核苷酸靶向人類 RTEL1 前驅 mRNA 之內含子區域。
本發明的目的
本發明提供調節 RTEL1 (「端粒延長解旋酶調節因子 1」) 表現之反義寡核苷酸及其結合物。我們鑑定了存在於人類 RTEL1 前驅 mRNA 中之內含子標靶序列，該序列可為反義寡核苷酸或其結合物所靶向以給出有效的 RTEL1 抑制。例如，靶向 SEQ ID NO: 1 的位置 8681-8701 或 11753-11774 有利於減少 RTEL1。據此，本發明之一個目的為提供靶向
RTEL1 之增強型反義寡核苷酸或其結合物，其中該反義寡核苷酸能夠在活體外及或活體內抑制
RTEL1 之表現，從而減少經 HBV 感染之細胞中的 cccDNA。靶向 RTEL1 之增強型反義寡核苷酸或其結合物可用於治療 HBV 感染。
本發明提供與 RTEL1 核酸互補且能夠抑制其表現之反義寡核苷酸或其結合物，及其在醫藥中之用途。
本發明提供一種反義寡核苷酸，其包含與人類 RTEL1 前驅 mRNA 之區域 (如 SEQ ID NO: 1 中所例示)，例如來自 SEQ ID NO: 1 之核苷酸 8681-8701 或核苷酸 11753-11774 之區域互補，例如完全互補的連續核苷酸序列。
在一些實施例中，該反義寡核苷酸或其連續核苷酸序列與來自 SEQ ID NO: 1 之核苷酸 8681-8701 的區域互補，例如完全互補。
在一些實施例中，該反義寡核苷酸或其連續核苷酸序列與來自 SEQ ID NO: 1 之核苷酸 11753-11774 的區域，例如與來自 SEQ ID NO: 1 之核苷酸 11757-11774、11756-11774 或 11753-11770 的區域互補，例如完全互補。
本發明之反義寡核苷酸之長度通常為 12 至 24 個核苷酸，例如長度為 12 至 22 個，例如 16 至 22 個核苷酸，並且包含至少 12 個核苷酸之連續核苷酸序列，該連續核苷酸序列與人類 RTEL1 前驅 mRNA (如 SEQ ID NO: 1 中所例示) 之選自 SEQ ID NO: 1 之核苷酸 8681-8701 及 11753-11774 的區域互補，例如完全互補。
本發明提供一種反義寡核苷酸，其長度為 12 至 22 個核苷酸，其中該反義寡核苷酸包含長度為 12 至 22 個核苷酸之連續核苷酸序列，其中該連續核苷酸序列與 SEQ ID NO 7、SEQ ID NO 8、SEQ ID NO 9 及/或 SEQ ID NO 10 互補，例如完全互補。
本發明提供一種反義寡核苷酸，其長度為 12 至 22 個核苷酸 (例如長度為 15、16、17、18、19 或 20 個核苷酸)，其中該反義寡核苷酸包含長度為 12 至 18 個核苷酸 (例如長度為 15、16、17 或 18 個核苷酸) 之連續核苷酸序列，其中該連續核苷酸序列與 SEQ ID NO 11 互補，例如完全互補。
本發明提供一種反義寡核苷酸，其長度為 10 至 30 個核苷酸，該反義寡核苷酸包含長度為 10 至 30 個核苷酸之連續核苷酸序列，其中該連續核苷酸序列與選自由 SEQ ID NO: 3、SEQ ID NO: 4、SEQ ID NO: 5 及 SEQ ID NO: 6 所組成之群組或其至少 14 個連續核苷酸的序列 100% 相同。
本發明提供一種反義寡核苷酸，其長度為 10 至 30 個核苷酸，該反義寡核苷酸包含長度為 10 至 30 個核苷酸之連續核苷酸序列，其中該連續核苷酸序列與選自由 SEQ ID NO: 3、SEQ ID NO: 4、SEQ ID NO: 5 及 SEQ ID NO: 6 所組成之群組或其至少 15 個連續核苷酸的序列 100% 相同。
本發明提供一種反義寡核苷酸，其長度為 10 至 30 個核苷酸，該反義寡核苷酸包含長度為 10 至 30 個核苷酸之連續核苷酸序列，其中該連續核苷酸序列與選自由 SEQ ID NO: 3、SEQ ID NO: 4、SEQ ID NO: 5 及 SEQ ID NO: 6 所組成之群組或其至少 16 個連續核苷酸的序列 100% 相同。
本發明提供一種反義寡核苷酸，其包含連續核苷酸序列，該連續核苷酸序列與選自由 SEQ ID NO: 3、SEQ ID NO: 4、SEQ ID NO: 5 及 SEQ ID NO: 6 所組成之群組或其至少 14 個連續核苷酸的序列 100% 相同。
本發明提供一種反義寡核苷酸，其包含連續核苷酸序列，該連續核苷酸序列選自由 SEQ ID NO: 3、SEQ ID NO: 4、SEQ ID NO: 5 及 SEQ ID NO: 6 所組成之群組。
本發明提供一種反義寡核苷酸，其包含連續核苷酸序列，該連續核苷酸序列與 SEQ ID NO: 3 (AATTTTACATACTCTGGT) 或其至少 14 個、15 個、16 個或 17 個連續核苷酸 100% 相同。
本發明提供一種反義寡核苷酸，其包含連續核苷酸序列，該連續核苷酸序列與 SEQ ID NO: 4 (AATTTTACATACTCTGGTC) 或其至少 14 個、15 個、16 個、17 個或 18 個連續核苷酸 100% 相同。
本發明提供一種反義寡核苷酸，其包含連續核苷酸序列，該連續核苷酸序列與 SEQ ID NO: 5 (TTACATACTCTGGTCAAA) 或其至少 14 個、15 個、16 個或 17 個連續核苷酸 100% 相同。
本發明提供一種反義寡核苷酸，其包含連續核苷酸序列，該連續核苷酸序列與 SEQ ID NO: 6 (CTTTATTATAACTTGAATCTC) 或其至少 14 個、15 個、16 個、17 個、18 個、19 個、20 個或 21 個連續核苷酸 100% 相同。
本發明提供一種反義寡核苷酸，其包含選自由化合物 ID No 3_1、ID No 4_1、ID No 5_1 及 ID No 6_1 (參見例如下表 6) 所組成之群組之化合物的連續核苷酸。
在一些實施例中，該反義寡核苷酸不是選自由 WO 2020/011902 A1 之化合物 ID No 36_1、ID No 35_1、ID No 33_1、ID No 34_1 及 ID No 37_1 (參見例如 WO 2020/011902 A1 之表 6) 所組成之群組的反義寡核苷酸。
在一些實施例中，該反義寡核苷酸不是選自由 WO 2020/011902 A1 之化合物 ID No 23_1 (參見例如 WO 2020/011902 A1 之表 6) 的反義寡核苷酸。
本發明提供選自表 1 所列的群組中的反義寡核苷酸或其醫藥上可接受之鹽。
本發明提供一種選自由以下所組成之群組的反義寡核苷酸：
AATTttacatactctgGT (SEQ ID NO: 3，化合物 ID No 3_1)，
AAttttacatactctGGTC (SEQ ID NO: 4，化合物 ID No 4_1)，
TTacatactctggtCAAA (SEQ ID NO: 5，化合物 ID No 5_1)，及
CTttattataactTgaAtCTC (SEQ ID NO: 6，化合物 ID No 6_1)，
其中大寫字母為 β-D-氧 LNA 核苷，小寫字母為 DNA 核苷，所有 LNA C 皆為 LNA 5-甲基胞嘧啶，且所有核苷間鍵結皆為硫代磷酸酯核苷間鍵結。
本發明還提供一種本發明之反義寡核苷酸之醫藥上可接受之鹽。
本發明提供選自表 1 所列的群組中的反義寡核苷酸或其醫藥上可接受之鹽。
表 1. 化合物表 ( 本發明之示例性反義寡核苷酸 ) – HELM 註釋格式
Helm 註解鍵：[LR](G) 為 β-D-氧-LNA 鳥嘌呤核苷，
[LR](T) 為 β-D-氧-LNA 胸腺嘧啶核苷，
[LR](A) 為 β-D-氧-LNA 腺嘌呤核苷，
[LR]([5meC]) 為 β-D-氧-LNA 5-甲基胞嘧啶核苷，
[dR](G) 為 DNA 鳥嘌呤核苷，
[dR](T) 為 DNA 胸腺嘧啶核苷，
[dR](A) 為 DNA 腺嘌呤核苷，
[dR](C) 為 DNA 胞嘧啶核苷，
[sP] 為硫代磷酸酯核苷間鍵結，
P 為磷酸二酯核苷間鍵結。
| 序列識別號 | 化合物識別號 # | HELM 標注 寫成 5’ – 3’ | 由以下圖中所示之結合物組成： |
| 3 | 3_1 | [LR](A)[sP].[LR](A)[sP].[LR](T)[sP].[LR](T)[sP].[dR](T)[sP].[dR](T)[sP].[dR](A)[sP].[dR](C)[sP].[dR](A)[sP].[dR](T)[sP].[dR](A)[sP].[dR](C)[sP].[dR](T)[sP].[dR](C)[sP].[dR](T)[sP].[dR](G)[sP].[LR](G)[sP].[LR](T) | 1 |
| 4 | 4_1 | [LR](A)[sP].[LR](A)[sP].[dR](T)[sP].[dR](T)[sP].[dR](T)[sP].[dR](T)[sP].[dR](A)[sP].[dR](C)[sP].[dR](A)[sP].[dR](T)[sP].[dR](A)[sP].[dR](C)[sP].[dR](T)[sP].[dR](C)[sP].[dR](T)[sP].[LR](G)[sP].[LR](G)[sP].[LR](T)[sP].[LR]([5meC]) | 2 |
| 5 | 5_1 | [LR](T)[sP].[LR](T)[sP].[dR](A)[sP].[dR](C)[sP].[dR](A)[sP].[dR](T)[sP].[dR](A)[sP].[dR](C)[sP].[dR](T)[sP].[dR](C)[sP].[dR](T)[sP].[dR](G)[sP].[dR](G)[sP].[dR](T)[sP].[LR]([5meC])[sP].[LR](A)[sP].[LR](A)[sP].[LR](A) | 4 |
| 6 | 6_1 | [LR]([5meC])[sP].[LR](T)[sP].[dR](T)[sP].[dR](T)[sP].[dR](A)[sP].[dR](T)[sP].[dR](T)[sP].[dR](A)[sP].[dR](T)[sP].[dR](A)[sP].[dR](A)[sP].[dR](C)[sP].[dR](T)[sP].[LR](T)[sP].[dR](G)[sP].[dR](A)[sP].[LR](A)[sP].[dR](T)[sP].[LR]([5meC])[sP].[LR](T)[sP].[LR]([5meC]) | 3 |
本發明因此提供一種反義寡核苷酸，該反義寡核苷酸選自化合物 ID No # 3_1、ID No # 4_1、ID No # 5_1 及 ID No # 6_1。
本發明進一步提供一種結合物，其包含根據本發明之反義寡核苷酸以及至少一個共價連接至該反義寡核苷酸之結合物部分。
在一些實施例中，該結合物部分能夠結合至去唾液酸糖蛋白受體，例如人類去唾液酸糖蛋白受體。例如，該結合物部分可包含至少一個選自由半乳糖、半乳胺糖、N-甲醯基-半乳胺糖、N-乙醯基半乳胺糖、N-丙醯基-半乳胺糖、N-正丁醯基-半乳胺糖及 N-異丁醯基半乳胺糖所組成之群組的去唾液酸糖蛋白受體靶向部分。
在一些實施例中，該去唾液酸糖蛋白受體靶向部分為 N-乙醯基半乳胺糖 (GalNAc)。因此，本發明之反義寡核苷酸可以與至少一個包含至少一個 N-乙醯基半乳胺糖 (GalNAc) 部分之結合物部分結合，例如與至少一個包含至少一個如下所述之 N-乙醯基半乳胺糖 (GalNAc) 部分的結合物部分結合。根據本發明之一個態樣，該結合物部分為如下文所述之 GalNAc 殘基 R。
在一些實施例中，該結合物部分為至少三價，例如二價、三價或四價 GalNAc 殘基殘基 R。較佳地，該結合物部分為三價 GalNAc 殘基 R。如本文所用之術語「三價 GalNAc 殘基」指代包含三個 N-乙醯基半乳胺糖部分的殘基，亦即較佳三個下式之部分
該結合物部分或該 GalNAc 殘基 R 中之各者及該反義寡核苷酸可以經由連接子 L，例如生物可切割連接子 L 連接在一起。因此，該結合物化合物可以包含連接子 L，其定位在反義寡核苷酸與結合物部分或 GalNAc 殘基 R 中之各者之間。
在一個實施例中，該結合物部分為三價 N-乙醯基半乳胺糖 (GalNAc)，例如圖 5 所示之彼等。在一個實施例中，該結合物部分為圖 5A-1 或 圖5A-2 之三價 N-乙醯基半乳胺糖 (GalNAc)，或兩者之混合物。在一個實施例中，該結合物部分為圖 5B-1 或 圖5B-2 之三價 N-乙醯基半乳胺糖 (GalNAc)，或兩者之混合物。在一個實施例中，該結合物部分為圖 5C-1 或 圖5C-2 之三價 N-乙醯基半乳胺糖 (GalNAc)，或兩者之混合物。在一個實施例中，該結合物部分為圖 5D-1 或 圖5D-2 之三價 N-乙醯基半乳胺糖 (GalNAc)，或兩者之混合物。該結合物部分與該反義寡核苷酸可以經由連接子，例如生物可切割連接子連接在一起。因此，該結合物化合物可以包含定位在反義寡核苷酸與結合物部分之間的連接子。
在一些實施例中，該連接子包含 1 至 10 個經連接之核苷或由 1 至 10 個經連接之核苷組成，例如 1 個、2 個、3 個、4 個、5 個、6 個、7 個、8 個、9 個或 10 個經連接之核苷，例如 2 到 6 個之間的經連接之核苷，例如 2 到 5 個之間的經連接之核苷，例如 2 到 4 個之間的經連接之核苷。在一些實施例中，該連接子包含兩個經連接之核苷酸。因此，該等核苷可以為 DNA 核苷。通常，該等核苷經由磷酸二酯核苷間鍵結連接。此外，該連接子可以經由磷酸二酯核苷間鍵結連接至反義化合物。
表 2 中提供示例性結合物 (以 HELM 註釋格式)。除了表 1 中所示之化合物外，該化合物亦包含兩個核苷酸「ca」作為 5' 末端之可切割連接子。此係表 2 中之序列的 HELM 註釋之一部分。在 GalNAc 媒介之遞送成功後，可切割連接子被切割掉，留下化合物作為活性藥物。
本發明提供選自表 2 中所列述之結合物群組的結合物或其醫藥上可接受之鹽。
表 2.化合物表 (本發明之示例性結合物) - HELM 註釋格式 (對於 HELM 註釋上之註釋，參見針對表 1 的解釋)。
| 序列識別號 | 寡核苷酸化合物 ID 編號 # (根據上表 1) | HELM 標注 寫成 5’ – 3’。 | 示例性化合物 – 見圖： |
| 3 | 3_1_GalNAc | {[5gn2c6]P.[dR](C)P.[dR](A)P.[LR](A)[sP].[LR](A)[sP].[LR](T)[sP].[LR](T)[sP].[dR](T)[sP].[dR](T)[sP].[dR](A)[sP].[dR](C)[sP].[dR](A)[sP].[dR](T)[sP].[dR](A)[sP].[dR](C)[sP].[dR](T)[sP].[dR](C)[sP].[dR](T)[sP].[dR](G)[sP].[LR](G)[sP].[LR](T) | 1 |
| 4 | 4_1_GalNAc | {[5gn2c6]P.[dR](C)P.[dR](A)P.[LR](A)[sP].[LR](A)[sP].[dR](T)[sP].[dR](T)[sP].[dR](T)[sP].[dR](T)[sP].[dR](A)[sP].[dR](C)[sP].[dR](A)[sP].[dR](T)[sP].[dR](A)[sP].[dR](C)[sP].[dR](T)[sP].[dR](C)[sP].[dR](T)[sP].[LR](G)[sP].[LR](G)[sP].[LR](T)[sP].[LR]([5meC])} | 2 |
| 5 | 5_1_GalNAc | [5gn2c6]P.[dR](C)P.[dR](A)P.[LR](T)[sP].[LR](T)[sP].[dR](A)[sP].[dR](C)[sP].[dR](A)[sP].[dR](T)[sP].[dR](A)[sP].[dR](C)[sP].[dR](T)[sP].[dR](C)[sP].[dR](T)[sP].[dR](G)[sP].[dR](G)[sP].[dR](T)[sP].[LR]([5meC])[sP].[LR](A)[sP].[LR](A)[sP].[LR](A) | 4 |
| 6 | 6_1_GalNAc | {[5gn2c6]P.[dR](C)P.[dR](A)P.[LR]([5meC])[sP].[LR](T)[sP].[dR](T)[sP].[dR](T)[sP].[dR](A)[sP].[dR](T)[sP].[dR](T)[sP].[dR](A)[sP].[dR](T)[sP].[dR](A)[sP].[dR](A)[sP].[dR](C)[sP].[dR](T)[sP].[LR](T)[sP].[dR](G)[sP].[dR](A)[sP].[LR](A)[sP].[dR](T)[sP].[LR]([5meC])[sP].[LR](T)[sP].[LR]([5meC]) | 3 |
在上表中，5gn2c6 為圖 5D-1 或 圖 5D-2 之三價 N-乙醯基半乳胺糖 (GalNAc)，或兩者之混合物。在一些實施例中，5gn2c6 為具有下式之 GalNAc 殘基 R：
應理解，上圖所示之 R 為圖 5D1 及圖 5D2 所示之兩種立體異構物之混合物。
根據本發明之又一態樣，上圖所示之 R 為如圖 5D1 所示之立體異構物。
根據本發明之又一態樣，如上圖所示之 R 為如圖 5D2 所示之立體異構體。表 2 中提供之結合物的結構如圖 1 至圖 4 所示。
本發明提供圖 1 之結合物或其醫藥上可接受之鹽。本發明提供化合物識別號 3_1 的反義寡核苷酸或其醫藥上可接受之鹽。
本發明提供圖 2 之結合物或其醫藥上可接受之鹽。本發明提供化合物識別號 4_1 的反義寡核苷酸或其醫藥上可接受之鹽。
本發明提供圖 3 之結合物或其醫藥上可接受之鹽。本發明提供化合物識別號 6_1 的反義寡核苷酸或其醫藥上可接受之鹽。
本發明提供圖 4 之結合物或其醫藥上可接受之鹽。本發明提供化合物識別號 5_1 的反義寡核苷酸或其醫藥上可接受之鹽。
式
(I)
化合物
本發明還提供下式 (I) 之化合物
(I)
其中
n 為 0 或 1
p 為 0 或 1
前提條件是在 n 為 1 的情況下，p 較佳為 1，
並且前提條件是在 n 為 0 且 p 為 0 的情況下，R 較佳為 H，
L 為連接子，較佳地 L 為包含 2 至 10 個核苷，例如 2 至 5 個核苷或由其組成的連接子，
R 為 GalNAc 殘基，較佳為三價 GalNAc 殘基，
且 A 為根據本發明之反義寡核苷酸殘基。
術語「反義寡核苷酸殘基」指代根據本發明之反義寡核苷酸，該反義寡核苷酸藉由其 5’ 末端經由 -(L)
n-(O-P(=O)(-OH)-)
p- 連接至殘基 R，例如表 6 中所示之反義寡核苷酸。較佳之反義寡核苷酸殘基如圖 1A、圖 2A、圖 3A、圖 4A、圖 5A、圖 6A、圖 7A 及圖 8A 所示。
GalNAc
殘基
R
R 為 GalNAc 殘基，較佳為三價 GalNAc 殘基。如本文所用，術語「GalNAc 殘基」指代一種殘基，其包含至少一個 N-乙醯基半乳胺糖 (GalNAc) 部分，亦即至少一個下式之部分：
如本文所用，術語「三價 GalNAc 殘基」指代一種殘基，其包含三個 N-乙醯基半乳胺糖 (GalNAc) 部分，亦即較佳三個下式之部分：
較佳地，該 GalNAc 殘基包含至少一個，較佳三個具有以下結構之 GalNAc 構建單元 (L
a)，
(L
a)
其中連接子
a係選自烷基、烷基-氧-烷基、包含至少一個磷酸二酯鍵結之烷基、包含至少一個醯胺鍵結之烷基、包含至少一個磷酸二酯鍵結之烷基-氧-烷基、及包含至少一個醯胺鍵結之烷基-氧-烷基。
術語「烷基」指代經取代或未經取代之直鏈或支鏈烷基，例如 C1 至 C20 烷基，較佳為 C2 至 C8，例如 C2、C3、C4、C5、C6、C7 或 C8 烷基。較佳地，烷基未經取代，更佳為直鏈且未經取代之烷基。
術語「烷基-氧-烷基」指代至少兩個經由氧連接之烷基，較佳為乙基-氧-乙基，例如 -(CH
2-O)
x- 基團，其中整數 x 較佳在 2 至 20 範圍內，更較佳在 2 至 6 範圍內，例如 2、3、4、5 或 6，更佳地，x 為 3 或 5。
根據本發明之一個態樣，該 GalNAc 構建單元 (L
a) 係選自以下結構 (L
a) 之群組。
如果 GalNAc 殘基中存在多於一個殘基 (
La)，例如三價 GalNAc 殘基中之三個殘基，則所有殘基較佳係相同。
最佳地，L
a具有結構
在該結合物部分 R 包含多個，例如較佳三個 GalNAc 部分的情況下，R 除了包含該等 GalNAc 構建單元 (L
a) 之外，亦包括一個多價 (較佳四價) 構建單元 (L
b)，該等構建單元 (L
a) 較佳連接至該多價構建單元，且該多價構建單元經由 -(L)
n-(O-P(=O)(-OH)-)
p- 連接至反義寡核苷酸殘基 A。
L
b較佳選自以下結構中之一者：
其中 X 為 O 或 S，且其中 Z 為 O 或 NH，並且其中 n 為 1 至 4，較佳為 2 或 3，更佳為 2。
更佳地，L
b具有結構
，
應理解，L
b具有結構 L
b* 或結構 L
b** 或者為其混合物。根據較佳態樣，L
b為 L
b* 與 L
b** 之混合物。 :
(L
b*)
(L
b**)
因此，結合物部分 R 較佳包含結構 (L
a)
3-L
b-，更佳地，R 包含以下結構中之一者：
更佳地，結構
，
其中 L
b較佳地為 L
b* 與 L
b** 之混合物，
並且其中 X 為 O 或 S，且 Z 為 O 或 NH，並且其中 n 為 1 至 3，較佳為 2，且 L
a如上所述，較佳地，其中 L
a係選自由以下所組成之群組：
及其混合物，其中較佳地，GalNAc 殘基內之所有殘基 (L
a) 係相同。
如果 (L
a)
3-L
b為
則 L
a係更佳選自由以下所組成之群組：
如果 (L
a)
3-L
b為
或
，
較佳為
，
L
a較佳為
視情況，結合物部分 R 額外地包含連接子 L
c。因此，R 較佳具有結構 (L
a)
3-L
b-(L
c)
c-，其中整數 c 為 1 或 0。
該等連接子化合物係本領域具有通常知識者已知的並且經適當選擇以將 (L
a)
3-L
b連接至該化合物之剩餘部分，亦即，經由 (L)
n-(O-P(=O)(-OH)-)
p- 連接至反義寡核苷酸殘基。
取決於 L
b之結構，L
c係選自由以下所組成之群組：烷基、烷基-氧-烷基、胺基-烷基 (-NH-烷基-)、胺基-烷基-氧-烷基、非天然胺基酸殘基及天然胺基酸殘基。根據本發明之一個態樣，L
c為經取代或未經取代之離胺酸基團。
根據本發明之一個態樣，R 為 (L
a)
3-L
b-(L
c)
c，其中 c = 1 且 (L
a)
3-L
b為
L
c較佳為胺基-烷基或胺基酸，例如經取代或未經取代之離胺酸基團，特別是 L
C係例如選自由以下所組成之群組：
其中胺基連接至 L
b之羰基，從而形成醯胺鍵。根據該態樣之較佳殘基 R 在圖 5A1、圖5A2、圖 5C1、圖 5C2、圖 5D1、圖 5D2 中描述。因此，根據本發明之一個態樣，R 選自圖 5A1、圖 5A2、圖 5C1、圖 5C2、圖 5D1 及圖 5D2 中描述之殘基。
根據本發明之又一態樣，R 具有結構 (L
a)
3-L
b-(L
c)
c，其中 c 為 0，並且其中 (L
a)
3-L
b為
根據本發明之該態樣的較佳殘基 R 在圖 5B1 及圖 5B2 中描述。
根據本發明之又一態樣，R 具有結構 (L
a)
3-L
b-(L
c)
c，其中 (L
a )
3-L
b為
並且 Z 為 O。在這種情況下，c 較佳為 1，L
c較佳為烷基，更佳為 C3 至 C6 烷基，更佳為丙基，最佳為正丙基。根據該態樣之較佳殘基 R 在圖 5E1、圖 5F1、圖 5G1 及圖 5H1 中描述。因此，根據本發明之一個態樣，R 選自圖 5E1、圖 5F1、圖 5G1 及圖 5H1 中描述之殘基
根據本發明之又一態樣，R 具有結構 (L
a)
3-L
b-(L
c)
c，其中 (L
a )
3-L
b為
且 Z 為 NH。在這種情況下，c 較佳為 1 且 L
c較佳為烷基、包含胺基酸之基團或具有以下結構之基團：
特別是，在這種情況下，L
c為
。
根據本發明之該態樣的較佳殘基 R 在圖 5J1 中描述。
根據本發明之又一態樣，R 具有結構 (L
a)
3-L
b-(L
c)
c，其中 (L
a )
3-L
b為
且其中 Z 為 NH，且 c 為 0。根據本發明之該態樣的較佳殘基 R 在圖 5I1 中描述。
根據本發明之一個態樣，R 為 (L
a)
3-L
b-(L
c)
c，其中 c = 0 且其中 (L
a)
3-L
b為
根據本發明之該態樣的較佳殘基 R 在圖 5L1 及圖 5L2 中描述。
因此，R 較佳係選自圖 5A1、圖 5A2；圖 5B1、圖 5B2、圖 5C1、圖 5C2、圖 5D1、圖 5D2、圖 5E1、圖 5F1、圖 5G1、圖 5H1、圖 5I1、圖 5J1、圖 5L1、圖 5L2 中描述之殘基及其混合物，例如 5A1 與 5A2、5B1 與 5B2、5C1 與 5C2、或者 5D1 與 D2 之立體異構混合物，更佳地，R 係選自 5D1、5D2 中描述之殘基及其混合物，更佳地，R 為 5D1 與 5D2 中描述之殘基的混合物，例如具有 10: 90 至 90:10 範圍內，例如 30:70 至 70:30 範圍內，例如 45:55 至 55:45 範圍內之 5D1 與 5D2 莫耳比的混合物。
因此，化合物 (I) 較佳係選自圖 6A1、圖 6A2；圖 6B1、圖 6B2、圖 6C1、圖 6C2、圖 6D1、圖 6D2、圖 6E1、圖 6F1、圖 6G1、圖 6H1、圖 6I1、圖 6J1、圖 6L1、圖 6L2 中描述之化合物及其混合物，例如 6A1 與 6A2、6B1 與 6B2、6C1 與 6C2、或者 6D1 與 6D2 之立體異構混合物，更佳地，化合物(I) 係選自由 6D1、6D2 中描述之化合物及其混合物所組成之群組，更佳地，化合物(I) 為 6D1 與 6D2 中描述之化合物的混合物，例如具有 10: 90 至 90:10 範圍內，例如 30:70 至 70:30 範圍內，例如 45:55 至 55:45 範圍內之 6D1 與 6D2 莫耳比的混合物。
連接子
L
在上式中，L 為如本文所定義之連接子，較佳地，L 為包含 2 至 10 個核苷，例如 2 至 5 個核苷，例如 2 個核苷或由其組成的連接子，其中視情況該等核苷為經磷酸二酯連接之核苷。
作為連接子，L 包含 1 至 10 個之間的經連接之核苷，例如 1、2、3、4、5、6、7、8、9 或 10 個經連接之核苷，例如 2 到 6 個之間的經連接之核苷，例如 2 到 5 個之間的經連接之核苷，例如 2 到 4 個之間的經連接之核苷，或由其組成。在一些實施例中，該連接子包含兩個經連接之核苷酸。因此，該等核苷可以為 DNA 核苷。通常，該等核苷經由磷酸二酯核苷間鍵結連接。此外，連接子 L 可以經由磷酸二酯核苷間鍵結與反義化合物連接。此外，連接子 L 經由適合之官能基與結合物部分 R 連接，例如經由醯胺、胺、醚、酯、磷酸二酯 (-O-P(=O)(-OH)-O-) 或硫代磷酸二酯 (-O-P(=S)(-OH)-O-) 鍵結。應理解，L 可視情況在核苷與將 L 連接至 R 之官能基之間額外地包含烷基或烷基-氧-烷基。在這種情況下，核苷較佳經由磷酸二酯鍵連接至烷基或烷基-氧-烷基，該基團繼而經由適合之官能基連接至 R，例如經由醯胺、胺、醚、酯、磷酸二酯 (-O-P(=O)(-OH)-O-) 或硫代磷酸二酯 (-O-P(=S)(-OH)-O-) 鍵
根據一個較佳實施例，L 為
反義
(A)
寡核苷酸殘基
A 為根據本發明之反義寡核苷酸殘基，該反義寡核苷酸如表 6 中所示，藉由其 5’ 最末端經由 -(L)
n-(O-P(=O)(-OH)-)
p連接至 R。較佳地，A 為選自圖 1A、圖 2A、圖 3A 及圖 4 中描述之殘基的反義寡核苷酸殘基。
因此，化合物 (I) 較佳係選自圖 6A1、圖 6A2; 6B1、圖 6B2、圖 6C1、圖 6C2、圖 6D1、圖 6D2、圖 6E1、圖 6F1、圖 6G1、圖 6H1、圖 6I1、圖 6J1、圖 6L1、圖 6L2 中描述之化合物及其混合物，例如 6A1 與 6A2、6B1 與 6B2、6C1 與 6C2、或者 6D1 與 6D2 之立體異構混合物，更佳地，化合物 (I) 係選自 6D1 及 6D2 中描述之化合物及其混合物，更佳地，化合物 (I) 為化合物 6D1 與 6D2 之混合物，較佳地，其中 A 係選自表 6 中所示之反義寡核苷酸，較佳地，其中 A 為選自圖 1A、圖 2A、圖3A、圖 4A、圖 5A、圖 6A、圖 7A 及圖 8A 中描述之殘基的反義寡核苷酸殘基，且 L 為包含 2 至 10 個核苷，例如 2 至 5 個核苷，例如 2 個核苷或由其組成的鏈接子，其中視情況該等核苷為經磷酸二酯連接之核苷，
更佳地，其中 L 為
在又一態樣中，R 為具有結構 (I) 之殘基
L 為如本文所定義之連接子，較佳地，L 為包含 2 至 10 個核苷，例如 2 至 5 個核苷，例如 2 個核苷或由其組成的連接子，其中視情況該等核苷為經磷酸二酯連接之核苷，更佳地，L 為
及
A 為根據本發明之反義寡核苷酸，例如表 6 中所示之反義寡核苷酸。
根據本發明之一個態樣，A 為選自圖 1A、圖 2A、圖 3A 及圖 4A 中描述之殘基的反義寡核苷酸殘基，
例如，A 為下式之反義寡核苷酸：
本發明提供醫藥組成物，該等醫藥組成物包含本發明之反義寡核苷酸或其結合物以及醫藥上可接受之稀釋劑、載劑、鹽及/或佐劑。
本發明提供一種本發明之反義寡核苷酸或其結合物的醫藥上可接受之鹽。在某些實施例中，醫藥上可接受之鹽選自由鈉鹽、鉀鹽及銨鹽所組成之群組。
本發明提供一種本發明之反義寡核苷酸或其結合物之醫藥溶液，其中該醫藥溶液包含本發明之反義寡核苷酸或其結合物以及醫藥上可接受之溶劑，例如食鹽水。
本發明提供固體粉末形式例如凍乾粉末形式的本發明之反義寡核苷酸或其結合物。
本發明提供一種本發明之反義寡核苷酸或其結合物的醫藥上可接受之鹽。
本發明提供一種根據本發明之反義寡核苷酸或本發明之結合物的醫藥上可接受之鹽，其中該醫藥上可接受之鹽為鈉鹽或鉀鹽。
本發明提供一種醫藥組成物，其包含本發明之反義寡核苷酸或本發明之結合物，或本發明之鹽以及醫藥上可接受之稀釋劑、溶劑、載劑、鹽及/或佐劑。
本發明提供一種在表現 RTEL1 之標靶細胞中抑制 RTEL1 表現之方法，該方法包含向該細胞投予有效量的本發明之反義寡核苷酸、或本發明之結合物、或或本發明之鹽、或本發明之組成物。該方法可以為
體內方法或
體外方法。
本發明提供一種在個體例如人類中治療及/或預防 HBV 感染之方法，包含投予治療或預防有效量的本發明之反義寡核苷酸、或本發明之結合物、或本發明之鹽、或本發明之組成物，例如以治療及/或預防 HBV 感染，例如慢性 HBV 感染。
在一些實施例中，本發明之反義寡核苷酸、或本發明之結合物、或本發明之鹽、或本發明之醫藥組成物係用於治療及/或預防 HBV 感染，例如慢性 HBV 感染。
本發明提供本發明之反義寡核苷酸、或本發明之結合物、或醫藥組成物、或本發明之鹽，其用於醫藥中。
在又一態樣中，本發明提供在表現 RTEL1 之標靶細胞中抑制 RTEL1 表現之方法，該方法藉由以有效量向該細胞投予本發明之反義寡核苷酸或本發明之結合物來進行。在又一態樣中，本發明提供一種在表現
RTEL1 之標靶細胞中抑制 RTEL1
表現之活體內或活體外方法，該方法藉由以有效量向該細胞投予本發明之反義寡核苷酸或本發明之結合物來進行。例如，細胞可以為人類細胞，例如肝臟細胞，例如肝細胞。
在又一態樣中，本發明提供在經 HBV 感染之細胞中減少 cccDNA 之方法，該方法藉由以有效量向該細胞投予本發明之反義寡核苷酸或本發明之結合物來進行。在又一態樣中，本發明提供在經
HBV
感染之細胞中減少 cccDNA 之活體內或活體外方法，該方法藉由以有效量向該細胞投予本發明之反義寡核苷酸或本發明之結合物來進行。
在又一態樣中，本發明提供治療及/或預防 HBV 感染例如慢性 HBV 感染之方法。
在又一態樣中，本發明之反義寡核苷酸、或本發明之結合物、或本發明之醫藥組成物係用於治療及/或預防病毒性肝臟感染，例如 HBV、HCV、HDV 或寄生蟲感染，例如瘧疾、弓蟲症、利什曼病及錐蟲病，或者肝癌或肝臟中之轉移。
在又一態樣中，本發明提供反義寡核苷酸、或本發明之結合物、或本發明之醫藥組成物，其用於製造治療及/或預防 HBV 感染，例如慢性 HBV 感染之藥物。
在又一態樣中，本發明提供反義寡核苷酸、或本發明之結合物、或本發明之醫藥組成物，其用於製造抗病毒藥物。
本發明提供本發明之反義寡核苷酸、或本發明之結合物、或本發明之醫藥組成物，其用於治療 HBV 感染，例如慢性 HBV 感染。
序列表
隨本申請呈送的序列表藉由引用方式併入本文。如果序列表與說明書或圖式不一致，則說明書 (包括圖式) 中揭露之資訊應視為正確。
界定
HBV
感染
術語「B 型肝炎病毒感染 (hepatitis B virus infection)」或「HBV 感染 (HBV infection)」在本領域中是眾所周知的，並且是指由 B 型肝炎病毒 (HBV) 引起並影響肝臟的傳染病。HBV 感染可以是急性或慢性感染。慢性 B 型肝炎病毒 (CHB) 感染係一種全球性疾病負擔，影響全球 2.48 億人。每年約有 686,000 人死於 HBV 相關的終末期肝病及肝細胞癌 (HCC) (GBD 2013; Schweitzer 等人, 2015)。世衛組織預計，如果不擴大干預，在未來 40 至 50 年內，慢性 B 型肝炎感染人數將保持在當下之高水平，2015 年至 2030 年期間將有 2,000 萬人死亡 (WHO 2016)。CHB 感染不是具有單一臨床表現的同種疾病。經感染之個體在其一生中經歷與 CHB 相關之肝病之多個階段；該等疾病階段也是標準照護 (SOC) 治療的基礎。當下之指南建議僅基於以下三個標準治療選定之 CHB 感染個體：血清 ALT 含量、HBV DNA 含量及肝病嚴重程度 (EASL, 2017)。該建議係因為以下事實：SOC 亦即核苷 (酸) 類似物 (NA) 及聚乙二醇化干擾素-α (PEG-IFN) 不具治癒療效且必須長期投予，因而增加了其安全風險。NA 有效抑制 HBV DNA 複製；然而，其等對其他病毒標記之影響非常有限/沒有影響。HBV 感染之兩個標誌，B 型肝炎表面抗原 (HBsAg) 及共價閉合環狀 DNA (cccDNA) 為針對 HBV 治癒之新型藥物的主要標靶。在 CHB 個體之血漿中，HBsAg 次病毒 (空) 顆粒之數量為 HBV 病毒粒子之 10
3到 10
5倍 (Ganem & Prince, 2014)；據信其過量有助於疾病之免疫發病機制，包括個體無法產生中和抗 HB 抗體，該抗體為在急性 HBV 感染消退後觀察到的血清學標記物。
cccDNA (
共價閉合環狀
DNA)
cccDNA 為病毒遺傳模板，存在於經感染之肝細胞的細胞核中，其在該處產生了生產性感染所需之所有 HBV RNA 轉錄本，且係慢性 HBV 感染之自然過程期間病毒持續存在的原因 (Locarnini & Zoulim, 2010 Antivir Ther. 15 增刊 3:3-14. doi: 10.3851/IMP1619)。cccDNA 充當病毒儲庫，為治療停止後病毒反彈之來源，需要長期，通常是終生治療。由於其各種副作用，PEG-IFN 只能投予至 CHB 之一個小子集。
因此，迫切需要能夠為大多數 CHB 患者提供完全治癒之新型療法，即降解或消除 HBV cccDNA。
化合物
本文中，術語「化合物」意指能夠抑制 RTEL1 表現或活性之任何分子。本發明之特定化合物為根據本發明之反義寡核苷酸或包含該核酸分子之任何結合物。例如，本文中，化合物可以為靶向 RTEL1 的核酸分子，特別是反義寡核苷酸。
寡核苷酸
本文所用的「寡核苷酸」一詞的定義如同具有通常技術者所知，是指包含兩個或多個共價連結核苷的分子。該等共價鍵結核苷亦可稱為核酸分子或寡聚物。寡核苷酸通常是在實驗室中製作，先經固相化學合成後再加以純化和分離。提及寡核苷酸的序列時，是指共價連結核苷酸或核苷的核鹼基部分或其修飾的序列或順序。本發明之寡核苷酸為人造的，且為化學合成的，通常經過純化或分離。本發明之寡核苷酸可包含一個或多個修飾核苷，如 2’ 糖修飾核苷。本發明之寡核苷酸可包含一個或多個修飾核苷間鍵結，如一個或多個硫代磷酸酯核苷間鍵結。
反義寡核苷酸
如本文所用，術語「反義寡核苷酸」定義為能夠藉由與標靶核酸，特別是標靶核酸上之連續序列雜交而調節標靶基因之表現的寡核苷酸。反義寡核苷酸實質上並非雙股，因此不是 siRNA 或 shRNA。本發明之反義寡核苷酸較佳的是單股。應理解，只要跨寡核苷酸全長之序列內或序列間自我互補程度低於 50%，本發明之單股寡核苷酸便可形成髮夾或分子間雙鏈體結構 (同一寡核苷酸的兩個分子之間的雙鏈體)。
在一些實施例中，本發明之單股反義寡核苷酸可以不含有 RNA 核苷。
有利的是，本發明之反義寡核苷酸含有一個或多個修飾核苷或核苷酸，例如 2’ 糖修飾核苷。此外，有利的是，所述未經修飾的核苷是 DNA 核苷。
連續核苷酸序列
術語「連續核苷酸序列」指代寡核苷酸之與標靶核酸互補的區域。在本文中，該術語可與「連續核鹼基序列」和「寡核苷酸模體序列」交替使用。在某些實施例中，該寡核苷酸的全部核苷組成該連續核苷酸序列。在某些實施例中，該寡核苷酸包含該連續核苷酸序列，如 F-G-F’ 間隙子區域，且可視情況包含一個或多個其他核苷酸，例如可用於將官能基團 (例如，結合物基團) 連附至該連續核苷酸序列之核苷酸連接子區域。所述核苷酸連接子區域可與標靶核酸互補或不互補。在某些實施例中，該反義寡核苷酸的該核鹼基序列為該連續核苷酸序列。
核苷酸和核苷
核苷酸和核苷為寡核苷酸及聚核苷酸的建構組元，在本發明中，包括自然產生及非自然產生核苷酸和核苷。在本質上，例如 DNA 及 RNA 核苷酸等核苷酸包含核糖部分、核鹼基部分以及一個或多個磷酸根 (核苷中則無磷酸根)。核苷及核苷酸亦可互換稱為「單元」或「單體」。
修飾核苷
本文中所用的「修飾核苷」或「核苷修飾」一詞意指藉由導入糖部分或 (核) 鹼基部分的一個或多個修飾，對照相等 DNA 或 RNA 核苷進行修飾的核苷。有利的是，本發明之反義寡核苷酸之修飾核苷中的一個或多個包含修飾糖部分。「修飾核苷」一詞在本文中亦可與「核苷類似物」或修飾「單元」或修飾「單體」等詞互換使用。本文中將具有未修飾 DNA 或 RNA 糖部分的核苷稱為 DNA 或 RNA 核苷。在 DNA 或 RNA 核苷的鹼基區域中包含修飾的核苷，若允許瓦特生克立克 (Watson Crick) 鹼基配對，則大體上仍稱為 DNA 或 RNA。
修飾核苷間鍵結
「修飾核苷間鍵結」一詞，如具有通常技術者所知之定義，是指除磷酸二酯 (PO) 鍵結以外，可將兩個核苷共價耦接在一起的鍵結。因此，本發明之寡核苷酸可包含一個或多個經修飾之核苷間鍵結，例如一個或多個硫代磷酸酯核苷間鍵結，或一個或多個二硫代磷酸酯核苷間鍵結。
在一些實施例中，該寡核苷酸或其連續核苷酸序列中之該等核苷間鍵結中的至少 50% 為硫代磷酸酯，該寡核苷酸或其連續核苷酸序列中之該等核苷間鍵結中的例如至少 60%，例如至少 70%，例如至少 75%，例如至少 80% 或例如至少 90% 為硫代磷酸酯。在某些實施例中，該寡核苷酸或其連續核苷酸序列中的所有該核苷間鍵結均為硫代磷酸酯。
在某些有利的實施例中，該寡核苷酸的該連續核苷酸序列的所有該核苷間鍵結均為硫代磷酸酯，或該寡核苷酸的所有該核苷間鍵結均為硫代磷酸酯鍵結。
應知，如 EP 2 742 135 中所揭露，反義寡核苷酸可包含其他核苷間鍵結 (磷酸二酯、硫代磷酸酯及二硫代磷酸酯除外)，例如磷酸烷酯/磷酸甲酯核苷間，其依據 EP 2 742 135 可例如耐受於缺口區域中不同狀態之 DNA 硫代磷酸酯。
核鹼基
術語核鹼基包括存在於核苷及核苷酸中之嘌呤 (例如，腺嘌呤及鳥嘌呤) 及嘧啶 (例如，尿嘧啶、胸腺嘧啶及胞嘧啶) 部分，其在核酸雜交中形成氫鍵。在本發明範圍內，術語核鹼基亦包含與自然產生核鹼基不同但在核酸雜交過程中具有功能性的修飾核鹼基。於本說明書中，「核鹼基」意指例如腺嘌呤、鳥嘌呤、胞嘧啶、胸苷、脲嘧啶、黃嘌呤和次黃嘌呤等自然產生核鹼基以及非自然產生變異體。此類變異體例如是 Hirao 等人 (2012) Accounts of Chemical Research vol 45 page 2055 以及 Bergstrom (2009) Current Protocols in Nucleic Acid Chemistry Suppl. 37 1.4.1 中所描述的變異體。
在某些實施例中，該核鹼基部分藉由將嘌呤或嘧啶改變為修飾嘌呤或嘧啶而被修飾，如取代嘌呤或取代嘧啶，如選自異胞嘧啶、偽異胞嘧啶、5-甲基胞嘧啶、5-噻唑並-胞嘧啶、5-丙炔基-胞嘧啶、5-丙炔基-脲嘧啶、5-溴脲嘧啶、5-噻唑並-脲嘧啶、2-硫基-脲嘧啶、2’硫基-胸腺嘧啶、肌苷、二胺基嘌呤、6-胺基嘌呤、2-胺基嘌呤、2,6-二胺基嘌呤及 2-氯-6-胺基嘌呤的核鹼基。
該核鹼基部分可用每一對應的核鹼基的字母代碼表示，例如 A、T、G、C 或 U，其中各字母可視情況包括對等功能的修飾核鹼基。例如，在例示的寡核苷酸中，所述核鹼基部分選自 A、T、G、C 及 5-甲基胞嘧啶。視情況，5-甲基胞嘧啶 LNA 核苷可用於 LNA 間隙子。
修飾寡核苷酸
修飾寡核苷酸一詞描述包含一個或多個糖修飾核苷及/或修飾核苷間鍵結的寡核苷酸。「嵌合寡核苷酸」一詞在文獻中用於描述包含糖修飾核苷和DNA核苷的寡核苷酸。本發明之反義寡核苷酸有利地為嵌合寡核苷酸。
互補性
「互補性」一詞是用來形容核苷/核苷酸的瓦特生克立克 (Watson-Crick) 鹼基配對能力。瓦特生克立克 (Watson-Crick) 鹼基對是鳥嘌呤 (G) - 胞嘧啶 (C) 及腺嘌呤 (A) - 胸腺嘧啶 (T)/脲嘧啶 (U)。應知寡核苷酸可包含具有修飾核鹼基的核苷，例如 5-甲基胞嘧啶經常用來取代胞嘧啶，因此互補性一詞包括非修飾核鹼基與修飾核鹼基之間的瓦特生克立克 (Watson-Crick) 鹼基配對 (見例如 Hirao 等人 (2012) Accounts of Chemical Research vol 45 page 2055 以及 Bergstrom (2009) Current Protocols in Nucleic Acid Chemistry Suppl 37 1.4.1)。
本文所用的「% 互補」一詞意指核酸分子 (例如寡核苷酸) 中的連續核苷酸序列中與參考序列 (例如標靶序列或序列模體) 互補的核苷酸所佔的比例 (百分比)，該核酸分子橫跨該連續核苷酸序列。互補性百分率的計算方式是先算出兩個序列間互補 (形成瓦特生克立克 (Watson-Crick) 鹼基對) 的對齊核鹼基 (當對齊於標靶序列 5’-3’ 及寡核苷酸序列 3’-5’) 的數目，將該數字除以所述寡核苷酸中的核苷酸總數，再乘以 100。在該等比對中，未對齊 (形成鹼基對) 的核鹼基/核苷酸稱為錯配。計算連續核苷酸序列的 % 互補性時不可進行插入和刪除。應知在判定互補性時，只要核鹼基形成瓦特生克立克 (Watson-Crick) 鹼基配對的功能留存，即可不考量核鹼基的化學修飾 (例如在計算 % 相同度時，5’-甲基胞嘧啶與胞嘧啶視為相同)。
「完全互補」意指具有 100% 互補性。
相同度
本文所用的「相同度」一詞意指核酸分子 (例如寡核苷酸) 中的連續核苷酸序列中與參考序列 (例如序列模體) 完全相同的核苷酸所佔的比例 (以百分比表達)，該核酸分子橫跨該連續核苷酸序列。相同度百分比的計算方式是，算出兩個序列 (在本發明之化合物的連續核苷酸序列中及在參考序列中) 之間相同 (為一個匹配) 的對齊核鹼基的數目，將該數字除以寡核苷酸中的核苷酸總數，再乘以 100。因此，相同度百分比 = (匹配數 x 100)/對齊區域 (例如連續核苷酸序列) 長度。計算連續核苷酸序列的相同度百分比時不可對序列進行插入和刪除。應知在判定相同度時，只要核鹼基形成瓦特生克立克 (Watson-Crick) 鹼基配對的功能留存，即可不考量核鹼基的化學修飾 (例如在計算 % 相同度時，5’-甲基胞嘧啶與胞嘧啶視為相同)。
雜交
本文所用的「雜交」一詞理解為兩股核酸鏈 (例如一股寡核苷酸及一股標靶核酸) 在相對股上的鹼基對之間形成氫鍵，從而形成雙鏈體 (duplex)。兩股核酸之間的結合親和力是指雜交的強度。其通常用融化溫度 (T
m) 來描述，所述融化溫度的定義是一半寡核苷酸與標靶核酸形成雙鏈體時的溫度。在生理條件下，T
m並非嚴格地與親和力成比例 (Mergny 與 Lacroix, 2003, Oligonucleotides 13:515–537)。標準狀態吉布斯自由能 ΔG° 更能準確代表結合親和力，並且與反應的離解常數 (K
d) 之間具有 ΔG° = -RTln(K
d) 的關係，其中 R 是氣體常數，而 T 是絕對溫度。因此，寡核苷酸與該標靶核酸之間的反應的非常低的 ΔG° 體現該寡核苷酸與該標靶核酸之間的強勢雜交。ΔG° 為與其中含水濃度為 1M、pH 為 7、溫度為 37℃ 之反應關聯的能量。寡核苷酸與標靶核酸之雜交為自發性反應，而自發性反應之 ΔG° 小於零。ΔG° 可經由實驗來測量：例如，利用如 Hansen 等人 1965 年在 Chem.Comm.36–38 及 Holdgate 等人, 2005, Drug Discov Today 中所述之等溫滴定量熱法 (ITC)。具有通常技術者應知，市面上可購得用於測量 ΔG° 的商用設備。ΔG° 亦可透過數值方式進行估計，例如藉由利用 SantaLucia 於 1998 年在 Proc Natl Acad Sci USA.95: 1460–1465 中描述的最近鄰模型或利用 Sugimoto 等人., 1995, Biochemistry 34:11211–11216 及 McTigue 等人, 2004, Biochemistry 43:5388–5405 中描述的適當取得之熱力學參數。為了能夠經由雜交調節本發明之寡核苷酸的預期核酸標靶，將長度為 10-30 個核苷酸的寡核苷酸以低於 -10 千卡的估計 ΔG° 值雜交至標靶核酸。在某些實施例中，雜交的程度或強度藉由標準狀態吉布斯自由能 ΔG° 來測量。長度為 8 至 30 個核苷酸的寡核苷酸可以低於 -10 千卡範圍的估計 ΔG° 值雜交至標靶核酸，例如低於 -15 千卡，例如低於 -20 千卡，及例如低於 -25 千卡。在一些實施例中，以 -10 至 -60 kcal、例如 -12 至 -40 kcal、例如 -15 至 -30 kcal、或 -16 至 -27 kcal、例如 -18 至 -25 kcal 的估計 ΔG° 值，該寡核苷酸與標靶核酸雜交。
標靶
如本文所用，術語「標靶」指代哺乳動物蛋白 RTEL1 (「端粒延長解旋酶調節因子 1」)，或者稱為「KIAA1088」或「C20ORF41」或「端粒長度之調節因子」或「端粒長度調節因子」或「染色體 20 開讀框 41」。智人
RTEL1 基因位於第 20 號染色體，63,657,810 至 63,696,253，補體 (智人更新註釋，版本
109.20200228，GRCh38.p13)。RTEL1 蛋白係一種 ATP 依賴性 DNA 解旋酶，與端粒長度調節、DNA 修復及基因體穩定性之維持有關。人類 RTEL1 之胺基酸序列係本領域已知者並且可以經由 UniProt 評估，參見關於人類 RTEL1 之 UniProt 條目 Q9NZ71，其藉由引用併入本文。
標靶核酸
根據本發明，標靶核酸為編碼哺乳動物 RTEL1 之核酸且可以例如為基因、RNA、mRNA 及前驅 mRNA、成熟 mRNA 或 cDNA 序列。因此標靶可稱為 RTEL1 標靶核酸。
本發明之反義寡核苷酸可以例如靶向哺乳動物 RTEL1 之外顯子區域，或可以例如靶向 RTEL1 前驅 mRNA 中之內含子區域。人類 RTEL1 基因編碼 15 個轉錄本，此等轉錄本中之 7 個係蛋白質編碼者，因此為潛在之核酸標靶。表 3 列述該等 7 個轉錄本之預測外顯子及內含子區域，定位在 SEQ ID NO: 1 之人類 RTEL1 前驅 mRNA 上。
表 3.用於不同蛋白質編碼 RTEL1 mRNA 轉錄本的人類 RTEL1 前驅 mRNA (SEQ ID NO: 1) 中之轉錄本、外顯子及內含子區域
| 轉錄本 ID | 轉錄本區域 | 外顯子區域 | 內含子區域 | |||||
| 開始 | 結束 | 外顯子 | 開始 | 結束 | 內含子 | 開始 | 結束 | |
| RTEL1-205 ENST00000370018 | 1 | 38444 | 1 | 1 | 657 | 1 | 657 | 1424 |
| 2 | 1424 | 1695 | 2 | 1695 | 3489 | |||
| 3 | 3489 | 3687 | 3 | 3687 | 4041 | |||
| 4 | 4041 | 4134 | 4 | 4134 | 4737 | |||
| 5 | 4737 | 4818 | 5 | 4818 | 5020 | |||
| 6 | 5020 | 5080 | 6 | 5080 | 8195 | |||
| 7 | 8195 | 8270 | 7 | 8270 | 9660 | |||
| 8 | 9660 | 9744 | 8 | 9744 | 14747 | |||
| 9 | 14747 | 14812 | 9 | 14812 | 16131 | |||
| 10 | 16131 | 16284 | 10 | 16284 | 20336 | |||
| 11 | 20336 | 20374 | 11 | 20374 | 20459 | |||
| 12 | 20459 | 20537 | 12 | 20537 | 22040 | |||
| 13 | 22040 | 22137 | 13 | 22137 | 22855 | |||
| 14 | 22855 | 22910 | 14 | 22910 | 27714 | |||
| 15 | 27714 | 27788 | 15 | 27788 | 27982 | |||
| 16 | 27982 | 28063 | 16 | 28063 | 29829 | |||
| 17 | 29829 | 29961 | 17 | 29961 | 30128 | |||
| 18 | 30128 | 30241 | 18 | 30241 | 30330 | |||
| 19 | 30330 | 30370 | 19 | 30370 | 30492 | |||
| 20 | 30492 | 30577 | 20 | 30577 | 30719 | |||
| 21 | 30719 | 30796 | 21 | 30796 | 31246 | |||
| 22 | 31246 | 31323 | 22 | 31323 | 31693 | |||
| 23 | 31693 | 31839 | 23 | 31839 | 31941 | |||
| 24 | 31941 | 32056 | 24 | 32056 | 32278 | |||
| 25 | 32278 | 32401 | 25 | 32401 | 32485 | |||
| 26 | 32485 | 32632 | 26 | 32632 | 32996 | |||
| 27 | 32996 | 33138 | 27 | 33138 | 33933 | |||
| 28 | 33933 | 34028 | 28 | 34028 | 34996 | |||
| 29 | 34996 | 35194 | 29 | 35194 | 35334 | |||
| 30 | 35334 | 35474 | 30 | 35474 | 36563 | |||
| 31 | 36563 | 36679 | 31 | 36679 | 36932 | |||
| 32 | 36932 | 37165 | 32 | 37165 | 37257 | |||
| 33 | 37257 | 37412 | 33 | 37412 | 37519 | |||
| 34 | 37519 | 37671 | 34 | 37671 | 37969 | |||
| 35 | 37969 | 38444 | ||||||
| RTEL1-203 ENST00000360203 | 485 | 38433 | 1 | 485 | 657 | 1 | 657 | 1424 |
| 2 | 1424 | 1695 | 2 | 1695 | 3489 | |||
| 3 | 3489 | 3687 | 3 | 3687 | 4041 | |||
| 4 | 4041 | 4134 | 4 | 4134 | 4737 | |||
| 5 | 4737 | 4818 | 5 | 4818 | 5020 | |||
| 6 | 5020 | 5080 | 6 | 5080 | 8195 | |||
| 7 | 8195 | 8270 | 7 | 8270 | 9660 | |||
| 8 | 9660 | 9744 | 8 | 9744 | 14747 | |||
| 9 | 14747 | 14812 | 9 | 14812 | 16131 | |||
| 10 | 16131 | 16284 | 10 | 16284 | 20336 | |||
| 11 | 20336 | 20374 | 11 | 20374 | 20459 | |||
| 12 | 20459 | 20537 | 12 | 20537 | 22040 | |||
| 13 | 22040 | 22137 | 13 | 22137 | 22855 | |||
| 14 | 22855 | 22910 | 14 | 22910 | 27714 | |||
| 15 | 27714 | 27788 | 15 | 27788 | 27982 | |||
| 16 | 27982 | 28063 | 16 | 28063 | 29829 | |||
| 17 | 29829 | 29961 | 17 | 29961 | 30128 | |||
| 18 | 30128 | 30241 | 18 | 30241 | 30330 | |||
| 19 | 30330 | 30370 | 19 | 30370 | 30492 | |||
| 20 | 30492 | 30577 | 20 | 30577 | 30719 | |||
| 21 | 30719 | 30796 | 21 | 30796 | 31246 | |||
| 22 | 31246 | 31323 | 22 | 31323 | 31693 | |||
| 23 | 31693 | 31839 | 23 | 31839 | 31941 | |||
| 24 | 31941 | 32056 | 24 | 32056 | 32278 | |||
| 25 | 32278 | 32401 | 25 | 32401 | 32485 | |||
| 26 | 32485 | 32632 | 26 | 32632 | 32996 | |||
| 27 | 32996 | 33138 | 27 | 33138 | 33933 | |||
| 28 | 33933 | 34028 | 28 | 34028 | 34996 | |||
| 29 | 34996 | 35194 | 29 | 35194 | 35334 | |||
| 30 | 35334 | 35474 | 30 | 35474 | 36563 | |||
| 31 | 36563 | 36679 | 31 | 36679 | 36932 | |||
| 32 | 36932 | 37165 | 32 | 37165 | 37257 | |||
| 33 | 37257 | 37412 | 33 | 37412 | 37519 | |||
| 34 | 37519 | 37841 | 34 | 37841 | 37969 | |||
| 35 | 37969 | 38433 | ||||||
| RTEL1-212 ENST00000508582 | 482 | 38171 | 1 | 482 | 657 | 1 | 657 | 1424 |
| 2 | 1424 | 1695 | 2 | 1695 | 3489 | |||
| 3 | 3489 | 3687 | 3 | 3687 | 4041 | |||
| 4 | 4041 | 4134 | 4 | 4134 | 4665 | |||
| 5 | 4665 | 4818 | 5 | 4818 | 5020 | |||
| 6 | 5020 | 5080 | 6 | 5080 | 8195 | |||
| 7 | 8195 | 8270 | 7 | 8270 | 9660 | |||
| 8 | 9660 | 9744 | 8 | 9744 | 14747 | |||
| 9 | 14747 | 14812 | 9 | 14812 | 16131 | |||
| 10 | 16131 | 16284 | 10 | 16284 | 20336 | |||
| 11 | 20336 | 20374 | 11 | 20374 | 20459 | |||
| 12 | 20459 | 20537 | 12 | 20537 | 22040 | |||
| 13 | 22040 | 22137 | 13 | 22137 | 22855 | |||
| 14 | 22855 | 22910 | 14 | 22910 | 27714 | |||
| 15 | 27714 | 27788 | 15 | 27788 | 27982 | |||
| 16 | 27982 | 28063 | 16 | 28063 | 29829 | |||
| 17 | 29829 | 29961 | 17 | 29961 | 30128 | |||
| 18 | 30128 | 30241 | 18 | 30241 | 30330 | |||
| 19 | 30330 | 30370 | 19 | 30370 | 30492 | |||
| 20 | 30492 | 30577 | 20 | 30577 | 30719 | |||
| 21 | 30719 | 30796 | 21 | 30796 | 31246 | |||
| 22 | 31246 | 31323 | 22 | 31323 | 31693 | |||
| 23 | 31693 | 31839 | 23 | 31839 | 31941 | |||
| 24 | 31941 | 32056 | 24 | 32056 | 32278 | |||
| 25 | 32278 | 32401 | 25 | 32401 | 32485 | |||
| 26 | 32485 | 32632 | 26 | 32632 | 32996 | |||
| 27 | 32996 | 33138 | 27 | 33138 | 33933 | |||
| 28 | 33933 | 34028 | 28 | 34028 | 34996 | |||
| 29 | 34996 | 35194 | 29 | 35194 | 35334 | |||
| 30 | 35334 | 35474 | 30 | 35474 | 36563 | |||
| 31 | 36563 | 36679 | 31 | 36679 | 36932 | |||
| 32 | 36932 | 37165 | 32 | 37165 | 37257 | |||
| 33 | 37257 | 37412 | 33 | 37412 | 37519 | |||
| 34 | 37519 | 37671 | 34 | 37671 | 37969 | |||
| 35 | 37969 | 38171 | ||||||
| RTEL1-201 ENST00000318100 | 505 | 38434 | 1 | 505 | 650 | 1 | 650 | 3489 |
| 2 | 3489 | 3687 | 2 | 3687 | 4041 | |||
| 3 | 4041 | 4134 | 3 | 4134 | 4737 | |||
| 4 | 4737 | 4818 | 4 | 4818 | 5020 | |||
| 5 | 5020 | 5080 | 5 | 5080 | 8195 | |||
| 6 | 8195 | 8270 | 6 | 8270 | 9660 | |||
| 7 | 9660 | 9744 | 7 | 9744 | 14747 | |||
| 8 | 14747 | 14812 | 8 | 14812 | 16131 | |||
| 9 | 16131 | 16284 | 9 | 16284 | 20336 | |||
| 10 | 20336 | 20374 | 10 | 20374 | 20459 | |||
| 11 | 20459 | 20537 | 11 | 20537 | 22040 | |||
| 12 | 22040 | 22137 | 12 | 22137 | 22855 | |||
| 13 | 22855 | 22910 | 13 | 22910 | 27714 | |||
| 14 | 27714 | 27788 | 14 | 27788 | 27982 | |||
| 15 | 27982 | 28063 | 15 | 28063 | 29829 | |||
| 16 | 29829 | 29961 | 16 | 29961 | 30128 | |||
| 17 | 30128 | 30241 | 17 | 30241 | 30330 | |||
| 18 | 30330 | 30370 | 18 | 30370 | 30492 | |||
| 19 | 30492 | 30577 | 19 | 30577 | 30719 | |||
| 20 | 30719 | 30796 | 20 | 30796 | 31246 | |||
| 21 | 31246 | 31323 | 21 | 31323 | 31693 | |||
| 22 | 31693 | 31839 | 22 | 31839 | 31941 | |||
| 23 | 31941 | 32056 | 23 | 32056 | 32278 | |||
| 24 | 32278 | 32401 | 24 | 32401 | 32485 | |||
| 25 | 32485 | 32632 | 25 | 32632 | 32996 | |||
| 26 | 32996 | 33138 | 26 | 33138 | 33933 | |||
| 27 | 33933 | 34028 | 27 | 34028 | 34996 | |||
| 28 | 34996 | 35194 | 28 | 35194 | 35334 | |||
| 29 | 35334 | 35474 | 29 | 35474 | 36563 | |||
| 30 | 36563 | 36679 | 30 | 36679 | 36932 | |||
| 31 | 36932 | 37165 | 31 | 37165 | 37257 | |||
| 32 | 37257 | 37412 | 32 | 37412 | 37519 | |||
| 33 | 37519 | 37671 | 33 | 37671 | 37969 | |||
| 34 | 37969 | 38434 | ||||||
| RTEL1-202 ENST00000356810 | 551 | 16284 | 1 | 551 | 650 | 1 | 650 | 1424 |
| 2 | 1424 | 1695 | 2 | 1695 | 3489 | |||
| 3 | 3489 | 3687 | 3 | 3687 | 4041 | |||
| 4 | 4041 | 4134 | 4 | 4134 | 4587 | |||
| 5 | 4587 | 4818 | 5 | 4818 | 5020 | |||
| 6 | 5020 | 5080 | 6 | 5080 | 8195 | |||
| 7 | 8195 | 8270 | 7 | 8270 | 9660 | |||
| 8 | 9660 | 9744 | 8 | 9744 | 14747 | |||
| 9 | 14747 | 14812 | 9 | 14812 | 16131 | |||
| 10 | 16131 | 16284 | ||||||
| RTEL1-206 ENST00000425905 | 30530 | 33067 | 1 | 30530 | 30577 | 1 | 30577 | 30719 |
| 2 | 30719 | 30796 | 2 | 30796 | 31246 | |||
| 3 | 31246 | 31323 | 3 | 31323 | 31941 | |||
| 4 | 31941 | 32056 | 4 | 32056 | 32278 | |||
| 5 | 32278 | 32401 | 5 | 32401 | 32485 | |||
| 6 | 32485 | 32632 | 6 | 32632 | 32996 | |||
| 7 | 32996 | 33067 | ||||||
| RTEL1-214 ENST00000646389 | 811 | 3653 | 1 | 811 | 943 | 1 | 943 | 1424 |
| 2 | 1424 | 1695 | 2 | 1695 | 3489 | |||
| 3 | 3489 | 3653 |
適合的是，該標靶核酸編碼 RTEL1 蛋白，特別是哺乳動物 RTEL1，例如人類 RTEL1 (參見例如表 3 及表 4)，其提供用於人類及猴 RTEL1 的 前驅 mRNA 序列。
在一些實施例中，該標靶核酸係選自 SEQ ID NO: 1 及/或 SEQ ID NO: 2 或其天然出現之變異體 (例如編碼哺乳動物 RTEL1 蛋白之序列)。
若在研究或診斷中採用本發明之反義寡核苷酸或本發明之結合物，則標靶核酸可以為 cDNA 或衍生自 DNA 或 RNA 之合成核酸。
對於活體內或活體外應用，本發明之反義寡核苷酸通常能夠在表現
RTEL1 標靶核酸之細胞中抑制
RTEL1 標靶核酸之表現。本發明之寡核苷酸的核鹼基之連續序列通常與 RTEL1 標靶核酸互補，如在整個反義寡核苷酸長度上所測量，視情況有一個或兩個錯配的例外，且視情況不包括可以將寡核苷酸與視情況存在之官能基例如結合物或其他非互補末端核苷酸 (例如區域 D’或 D’’) 連接的基於核苷酸之連接子區域。在一些實施例中，標靶核酸可以為 RNA 或 DNA，例如訊息 RNA，例如 前驅 mRNA，例如人類 RTEL1，例如人類 RTEL1 前驅 mRNA 序列，例如作為 SEQ ID NO: 1 揭露者，或食蟹猴 RTEL1 前驅 mRNA 序列，例如作為 SEQ ID NO: 2 揭露者。SEQ ID NO: 1 及 SEQ ID NO:2 為 DNA 序列 – 應理解，標靶 RNA 序列具有尿嘧啶 (U) 鹼基替代胸苷鹼基 (T)。
表 4 及表 5 中提供有關示例性標靶核酸之進一步資訊。
表 4.RTEL1 跨物種基因組及組裝資訊。
Fwd = 正向股。基因組座標提供前 mRNA 序列 (基因組序列)。NCBI 參考提供 mRNA 序列 (cDNA 序列)。
| 物種 | 染色體 | 股 | 基因組學座標 開始 結束 | 組裝 | ensembl 基因_id | |
| 人 | 20 | fwd | 63657810 | 63696253 | GRCh38.p12 | ENSG00000258366 |
| 食蟹猴 | 10 | fwd | 95853726 | 95890939 | Macaca_fascicularis_5.0 | ENSMFAG00000043680 |
表 5.RTEL1 跨物種序列詳情。
| 物種 | RNA 類型 | 長度 (核苷酸數) | SEQ ID NO |
| 人 | 前 mRNA | 38444 | 1 |
| 猴 | 前 mRNA | 37214 | 2 |
註：SEQ ID NO: 2 包含多個 NNNN 之區域，其中定序已經無法準確地細化序列，因此包括簡併序列。為避免疑問，本發明之化合物與實際標靶序列互補，因此不是簡併化合物。
在一些實施例中，該標靶核酸為 SEQ ID NO: 1。
在一些實施例中，該標靶核酸為 SEQ ID NO: 2。
在一些實施例中，該標靶核酸為 SEQ ID NO: 1 及 SEQ ID NO: 2。
標靶序列
如本文所用，術語「標靶序列」指代存在於標靶核酸中之核苷酸序列，其包含與本發明之寡核苷酸互補的核鹼基序列。在某些實施例中，所述標靶序列包含標靶核酸上的一個區域，所述區域的核鹼基序列與本發明之寡核苷酸的連續核苷酸序列為互補。所述標靶核酸的此一區域也可互換地稱為標靶核苷酸序列、標靶序列或標靶區域。在一些實施例中，標靶序列比單一寡核苷酸之互補序列更長，且可能例如代表標靶核酸之較容易被本發明之數種寡核苷酸所靶向之區域。
本發明之寡核苷酸包含連續核苷酸序列，該連續核苷酸序列與標靶核酸，例如本文所述之標靶序列互補及雜交。
與該反義寡核苷酸互補之標靶序列通常包含至少 10 個核苷酸之連續核鹼基序列。該連續核苷酸序列的長度在 10 至 30 個核苷酸之間，如 12 至 30 個核苷酸 (如 14 至 20 個)，如 15 至 18 個連續核苷酸 (如 15 個、16 個、17 個連續核苷酸)。
標靶序列區域
發明人已經鑑定了 RTEL1 標靶核酸之特別有效之序列，該序列可以被本發明之寡核苷酸或其結合物靶向。
在一些實施例中，該標靶序列為 SEQ ID NO: 7。
在一些實施例中，該標靶序列為 SEQ ID NO: 8。
在一些實施例中，該標靶序列為 SEQ ID NO: 9。
在一些實施例中，該標靶序列為 SEQ ID NO: 10。
在一些實施例中，該標靶序列為 SEQ ID NO: 11。
SEQ ID NO 7：TTTGACCAGAGTATGTAAAATT
SEQ ID NO 8：ACCAGAGTATGTAAAATT
SEQ ID NO: 9：GACCAGAGTATGTAAAATT
SEQ ID NO: 10：TTTGACCAGAGTATGTAA
SEQ ID NO: 11：GAGATTCAAGTTATAATAAAG
SEQ ID NO: 7 至 SEQ ID NO: 11 為 DNA 序列 – 應理解，標靶 RNA 序列具有尿嘧啶 (U) 鹼基替代胸苷鹼基 (T)。
SEQ ID NO: 7 至 SEQ ID NO: 10 所示之標靶序列可以在人類 RTEL1 之內含子 8 中找到。SEQ ID No: 11 所示之標靶序列可以在人類 RTEL1 之內含子 7 中找到。
在一些實施例中，該標靶序列為來自 SEQ ID NO: 1 之核苷酸 11753-11774 的區域。
在一些實施例中，該標靶序列為來自 SEQ ID NO: 1 之核苷酸 11757-11774 的區域。
在一些實施例中，該標靶序列為來自 SEQ ID NO: 1 之核苷酸 11756-11774 的區域。
在一些實施例中，該標靶序列為來自 SEQ ID NO: 1 之核苷酸 11753-11770 的區域。
在一些實施例中，該標靶序列為來自 SEQ ID NO: 1 之核苷酸 8681-8701 的區域。
標靶細胞
如本文所用，術語「標靶細胞」指代表現標靶核酸之細胞。在一些實施例中，標靶細胞可以為活體內細胞或活體外細胞。在某些實施例中，該標靶細胞為哺乳動物細胞 (如囓齒動物細胞、小鼠細胞或大鼠細胞)，或靈長類動物細胞 (如猴子細胞或人類細胞等)。
一般而言，該標靶細胞表達 RTEL1 mRNA，如 RTEL1 前 mRNA 或 RTEL1 成熟 mRNA。對於實驗評估，可以使用表現包含標靶序列之核酸 (例如人類 RTEL1 前驅 mRNA，例如 SEQ ID NO: 1) 的標靶細胞。
RTEL1 mRNA 的複 A 尾部在反義寡核苷酸標定上通常予以忽略。
本發明之反義寡核苷酸通常能夠例如在活體內或活體外在表現
RTEL1
標靶核酸之細胞 (標靶細胞) 中抑制 RTEL1 標靶核酸之表現。
此外，標靶細胞可以為肝細胞。在一個實施例中，標靶細胞為 HBV 感染之原代人類肝細胞，其來源於 HBV 感染之個體或來源於具有人源化肝臟之 HBV 感染之小鼠 (PhoenixBio，PXB 小鼠)。
根據本發明，標靶細胞可以被 HBV 感染。此外，標靶細胞可以包含 HBV cccDNA。因此，該標靶細胞較佳包含 RTEL1 mRNA，例如 RTEL1 前驅 mRNA 或 RTEL1 成熟 mRNA 以及 HBV cccDNA。
自然產生之變異體
「自然產生變體」一詞意指與所述標靶核酸源自相同基因座但可有差異的 RTEL1 基因或轉錄的變體，所述差異可例如是出於基因碼簡併造成多重密碼子編碼同一個胺基酸，或因前 mRNA 的選擇性剪接，或多態性的存在，例如單核苷酸多態性 (SNP) 及等位基因變體。基於與寡核苷酸的足夠互補序列的存在，本發明的寡核苷酸因此可以靶向標靶核酸及其自然產生的變異體。
在一些實施例中，自然產生之變異體與哺乳動物 RTEL1 標靶核酸，例如 SEQ ID NO:1 之標靶核酸，具有至少 95%，例如至少 98% 或至少 99% 的同源性。在一些實施例中，自然產生之變異體與 SEQ ID NO: 1 之人類 RTEL1 標靶核酸具有至少 99% 的同源性。
表現的抑制
本文所用的「表現的抑制」一詞應理解為寡核苷酸抑制標靶細胞中 RTEL1 的量或活性的能力的總稱。可以藉由測量 RTEL1 前 mRNA 或 RTEL1 mRNA 的水平，或藉由測量細胞中 RTEL1 或 RTEL1 活性的水平來判定活性的抑制。因此可以在活體外或活體內測定表現之抑制。
一般而言，藉由比較對標靶細胞投予有效量的該反義寡核苷酸而產生的活性抑制，並將該水平與不投予該反義寡核苷酸而從標靶細胞獲得的參考水平或已知的參考水平 (例如在投予有效量的該反義寡核苷酸之前的表現水平或預定的或其他已知的表現水平) 進行比較 (對照實驗) 來判定表現抑制。
例如，對照實驗可以為動物或人，或用鹽水組成物或參考寡核苷酸處理的標靶細胞 (通常是加擾的對照)。
術語抑制 (inhibition) 或抑制 (inhibit) 亦可以稱為下調、減少、阻遏、減輕、降低 RTEL1 例如 RTEL1 前驅 mRNA 之表現。
表現之抑制可以例如藉由前驅 mRNA 或 mRNA (例如使用 RNaseH 招募寡核苷酸，例如間隙子) 之降解而發生。
高親和力修飾核苷
高親和力修飾核苷係一種修飾核苷酸，當併入該寡核苷酸中時，可提升該寡核苷酸對其互補標靶至親和力，例如，如藉由解鏈溫度 (Tm) 所測量。本發明之高親和力修飾核苷較佳地導致每一修飾核苷之解鏈溫度增加 +0.5 至 +12℃ 之間，更佳 +1.5 至 +10℃ 之間，最佳 +3 至 +8℃ 之間。該技術領域中已有眾多已知之高親和力修飾核苷，包括例如許多 2’ 取代之核苷以及鎖核酸 (LNA) (參見例如 Freier & Altmann; Nucl. Acid Res., 1997, 25, 4429-4443 及 Uhlmann; Curr. Opinion in Drug Development, 2000, 3(2), 293-213)。
糖修飾
本發明之寡聚物可包含一個或多個具有經修飾之糖部分的核苷，亦即與 DNA 及 RNA 中之核糖糖部分相較為經過修飾的糖部分。
目前已製成了眾多包含經修飾核糖部分的核苷，主要目的為改善寡核苷酸的特定特性，例如親和力及/或核酸酶抗性。
此種修飾包括對核糖環結構的修飾，例如取代為己糖環 (HNA)，或通常在核糖環 (LNA) 上的 C2 與 C4 碳原子之間具有雙自由基橋，或通常在 C2 與 C3 碳原子之間無鍵的未連結核糖環 (例如 UNA)。其他糖修飾核苷包括，例如，雙環己糖核酸 (WO2011/017521) 或三環核酸 (WO2013/154798)。修飾核苷也包括將糖部分取代為非糖部分的核苷，例如胜肽核酸 (PNA) 或嗎啉基核酸的情形。
糖修飾也包括經由將核糖環上的取代基團改變為除在 DNA 及 RNA 核苷中自然存有的氫或 2’-OH 基團以外的基團來進行修飾。取代基可例如在 2’、3’、4’ 或 5’位置導入。
2’
糖修飾核苷
2’ 糖修飾核苷是在 2’ 位置 (2’ 取代的核苷) 具有非 H 或 –OH 的取代基的核苷或包含能夠在核糖環中的 2’ 碳與第二碳之間形成架橋的 2’ 連結雙自由基的核苷，如 LNA (2’ – 4’ 雙自由基架橋) 核苷。
更確切地，2’ 糖取代核苷的開發頗受關注，目前也已發現許多 2’ 取代核苷在併入寡核苷酸中時具有助益特性。例如，2’ 修飾糖可加強所述寡核苷酸的結合親和力及/或增加所述寡核苷酸的核酸酶抗性。2’ 取代修飾核苷的實例包括 2’-O-烷基-RNA、2’-O-甲基-RNA、2’-烷氧基-RNA、2’-O-甲氧基乙基-RNA (MOE)、2’-胺基-DNA、2’-氟基-RNA 及 2’-F-ANA 核苷。對於又一些實例，請參閱例如 Freier & Altmann; Nucl. Acid Res., 1997, 25, 4429-4443 及 Uhlmann; Curr. Opinion in Drug Development, 2000, 3(2), 293-213 以及 Deleavey 與 Damha, Chemistry and Biology 2012, 19, 937。以下為 2’ 取代修飾核苷的圖解。
在本發明中，2’ 取代糖修飾核苷並不包括 2’ 橋接核苷，如 LNA。
鎖核酸核苷
(LNA
核苷
)
「LNA 核苷」是一種 2’- 修飾核苷，所述 2’- 修飾核苷包含連結所述核苷的核糖環之 C2’ 與 C4’ 的雙自由基 (此雙自由基亦稱為「2’ - 4’ 架橋」)，其可限制或鎖定所述核糖環的構造。該等核苷於文獻中也稱為橋接核酸或雙環核酸 (BNA)。鎖定核糖的構造，可在將 LNA 併入寡核苷酸中而產生互補 RNA 或 DNA 分子時提升雜交親和力 (雙鏈體穩定化)。藉由測量寡核苷酸/補體雙鏈體的融化溫度，可對此進行常規的判定。
非限制性地，例示性 LNA 核苷於 WO 99/014226、WO 00/66604、WO 98/039352、WO 2004/046160、WO 00/047599、WO 2007/134181、WO 2010/077578、WO 2010/036698、WO 2007/090071、WO 2009/006478、WO 2011/156202、WO 2008/154401、WO 2009/067647、WO 2008/150729、Morita 等人，Bioorganic & Med.Chem.Lett.12, 73-76，Seth 等人 J. Org.Chem. 2010, Vol 75(5) pp. 1569-81 及 Mitsuoka 等人，Nucleic Acids Research 2009, 37(4), 1225-1238 以及 Wan 與 Seth，J. Medical Chemistry 2016, 59, 9645−9667 中揭露。
方案 1 中揭露了其他非限制性例示 LNA 核苷。
方案 1：
特定 LNA 核苷為 β-D-氧基-LNA、6’-甲基-β-D-氧基 LNA，如 (S)-6’-甲基-β-D-氧基-LNA (ScET) 及 ENA。具有特定優勢的 LNA 為 β-D-氧基-LNA。
核酸酶媒介之降解
核酸酶中介降解意指一寡核苷酸能夠在與互補核苷酸序列形成雙股螺旋時，居中影響所述序列的降解。
在一些實施例中，該寡核苷酸可經由核酸酶媒介之標靶核酸的降解而發揮作用，其中本發明之寡核苷酸能夠招募核酸酶，特別是核酸內切酶，較佳是核糖核酸酶 (RNase)，例如核糖核酸酶 H。經由核酸酶媒介機轉而運作之寡核苷酸設計的實例為寡核苷酸，該等寡核苷酸通常包含長度為至少 5 或 6 個接連 DNA 核苷的區域，且在一側或兩側上側接有親和力增強型核苷，例如間隙子。
RNase H
活性與招募
反義寡核苷酸的 RNase H 活性是指當其與互補 RNA 分子在雙鏈體中時，招募 RNase H 的能力。WO01/23613 提供用於測定核糖核酸酶 H 活性之活體外方法，該方法可用於測定招募核糖核酸酶 H 的能力。以使用具有與所測試的經修飾之寡核苷酸相同的鹼基序列但在寡核苷酸中所有單體之間僅包含具有硫代磷酸酯鍵結的 DNA 單體之寡核苷酸，並且使用 WO01/23613 (藉由引入併入於此) 提供的實例 91 至 95 所述之方法，以皮莫耳/公升/分鐘 (pmol/l/min) 為單位測量的初始速率為基準，如果寡核苷酸與互補標靶核酸序列反應之初始速率為上述基準初始速率的至少 5%，例如至少 10% 或超過 20%，則通常認為該寡核苷酸能夠招募核糖核酸酶 H。為了用於測定 RNase H 活性，重組人類 RNase H1 (與大腸桿菌中表現之 His 標籤融合的重組人類 H1) 可從 Creative Biomart® 獲得。
間隙子
本發明之反義寡核苷酸，或其連續核苷酸序列，可為一間隙子，亦稱為間隙子寡核苷酸或間隙子設計。反義間隙子常用於透過 核糖核酸酶 H 中介降解來抑制標靶核酸。一個間隙子寡核苷酸包含至少三個有區別的結構區域，也就是一個 5’-側翼、一個缺口和一個 3’-側翼，F-G-F’ 為 ‘5 -＞ 3’ 方向。該「缺口」區域 (G) 包含一段使得寡核苷酸能夠招募 RNase H 的連續 DNA 核苷酸。該缺口區域側接包含一個或多個糖修飾核苷 (有利的是高親和力糖修飾核苷) 的 5’ 側翼區域 (F)，且側接包含一個或多個糖修飾核苷 (有利的是高親和力糖修飾核苷) 的 3’ 側翼區域 (F’)。區域 F 及 F’ 中之一個或多個糖修飾核苷可增強寡核苷酸對於標靶核酸的親和力 (亦即其為親和力增強型糖修飾核苷)。在某些實施例中，區域 F 及 F’ 中的一或多個糖修飾核苷是 2’ 糖修飾核苷，例如高親和力 2’ 糖修飾，例如獨立選自 LNA 及 2’-MOE。
在間隙子設計中，缺口區域的 5’ 及 3’ 多數核苷為 DNA 核苷，且位置分別鄰近 5’ (F) 或 3’ (F’) 區域的糖修飾核苷。該側翼可進一步定義為在距離該缺口區域最遠之端具有至少一個糖修飾核苷，即在 5’ 側翼的 5’ 端及在 3’ 側翼的 3’ 端。在一些實施例中，式 F-G-F' 之間隙子區域的核苷之間的所有核苷間鍵結皆為硫代磷酸酯核苷間鍵結。
區域 F-G-F’ 形成一個連續核苷酸序列。本發明之反義寡核苷酸，或其連續核苷酸序列，可包含式 F-G-F’ 的間隙子區域。
該間隙子設計 F-G-F’ 之整體長度可以為，例如 12 至 32 個核苷，例如 13 至 24 個，例如 14 至 22 個核苷，例如 15 至 20 個，例如 16 至 18 個核苷。
舉例而言，本發明之間隙子寡核苷酸可由下式代表：
F
1-8-G
5-16-F’
1-8，例如
F
1-8-G
7-16-F’
2-8或
F
1-8-G
11-16-F’
2-8，
附帶條件是所述間隙子區域 F-G-F’ 的整體長度為至少 12 個，例如至少 14 個核苷酸。
在本發明之一個態樣中，該反義寡核苷酸或其連續核苷酸序列包含式 5’-F-G-F’-3’ 的間隙子或由其組成，其中區域 F 及 F' 獨立地包含 1 至 8 個核苷或由其組成，其中 1 至 4 個核苷經 2' 糖修飾，並限定區域 F 及 F' 的 5’ 及和 3' 端，並且 G 為 6 至 16 個核苷之間的區域，其能夠招募 RNase H。
以下進一步定義了區域 F、G 及 F'，並且可以將其合併到 F-G-F’ 式中。
間隙子
-
區域
G
間隙子之區域 G (缺口區域) 為使得寡核苷酸能夠招募 RNaseH 例如人類 RNase H1 的核苷區域，通常為 DNA 核苷。RNaseH 係一種細胞酶，其可在 DNA 與 RNA 之間辨識雙股螺旋，並酶切 RNA 分子。適合的是，間隙子可具有長度為至少 5 個或 6 個連續 DNA 核苷，例如 5 至 16 個連續 DNA 核苷，例如 6 至 15 個連續 DNA 核苷，例如 7 至 14 個連續 DNA 核苷，例如 8 至 12 個連續 DNA 核苷酸，例如 8 至 12 個連續 DNA 核苷酸的缺口區域 (G).在一些實施例中，缺口區域 G 可由 6、7、8、9、10、11、12、13、14、15 或 16 個連續 DNA 核苷組成。此外，區域 G 可以具有 11 至 16 個連續 DNA 核苷酸的長度。
在一些情況下，缺口區域中的一個或多個胞嘧啶 (C) DNA 可能經甲基化 (例如當 DNA c 後接 DNA g 時)，該等殘基被注釋為 5-甲基-胞嘧啶 (
meC)。在一些實施例中，缺口區域 G 可以由 6、7、8、9、10、11、12、13、14、15 或 16 個經硫代磷酸酯連接之連續 DNA 核苷組成。
在一些實施例中，缺口中的所有核苷間鍵結是硫代磷酸酯鍵結。
間隙子
-
側翼區域，
F
及
F'
區域 F 緊鄰區域 G 的 5’ DNA 核苷。區域 F 最 3’端的核苷為糖修飾的核苷，諸如高親和力糖修飾的核苷，例如 2’ 取代的核苷，諸如 MOE 核苷，或 LNA 核苷。
區域 F 緊鄰區域 G 的 3’ DNA 核苷。區域 F 最 5’端的核苷為糖修飾的核苷，諸如高親和力糖修飾的核苷，例如 2’ 取代的核苷，諸如 MOE 核苷，或 LNA 核苷。
區域 F 長度為 1 - 8 個連續核苷酸，諸如長度為 2 - 6 個，諸如 2 - 4 個連續核苷酸。在一些實施例中，區域 F 之長度為 2 個連續核苷酸。在一些實施例中，區域 F 之長度為 3 個連續核苷酸。在一些實施例中，區域 F 之長度為 4 個連續核苷酸。
有利地，區域 F 的 5’ 最末端核苷為糖修飾核苷。在一些實施例中，區域 F 的兩個 5' 最末端核苷為糖修飾核苷。在一些實施例中，區域 F 的 5' 最末端核苷為 LNA 核苷。在一些實施例中，區域 F 的兩個 5’ 最末端核苷為 LNA 核苷。
區域 F’ 的長度為 1 至 8 個連續核苷酸，例如長度為 2 至 6 個連續核苷酸。在一些實施例中，區域 F’ 之長度為 2 個連續核苷酸。在一些實施例中，區域 F’ 之長度為 4 個連續核苷酸。在一些實施例中，區域 F’ 之長度為 5 個連續核苷酸。在一些實施例中，區域 F’ 之長度為 6 個連續核苷酸。
有利地，區域 F’ 的 3’ 最末端核苷為糖修飾核苷。在一些實施例中，區域 F’ 的兩個 3' 最末端核苷為糖修飾核苷。在一些實施例中，區域 F’ 的兩個 3’ 最末端核苷為 LNA 核苷。在一些實施例中，區域 F’ 的 3' 最末端核苷為 LNA 核苷。
應注意，當區域 F 的長度為一個核苷時，其有利地為 LNA 核苷。此外，注意到當區域 F 及/或 F’ 的長度為兩個核苷時，區域 F 及/或 F’ 的兩個核苷有利地為 LNA 核苷。
在一些實施例中，區域 F 及 F’ 中的糖修飾核苷酸僅由一種類型的糖修飾核苷組成，例如僅由 MOE 或僅由 β-D-氧 LNA 或僅由 ScET 組成。該等設計亦稱為均一側翼或均一間隙子設計。
在一些實施例中，區域 F 或 F’或者 F 及 F’ 的所有核苷皆為 LNA 核苷，例如 β-D-氧 LNA 核苷。在替代性實施例中，區域 F 及 F' 的所有糖修飾核苷皆為 LNA 核苷，例如 β-D-氧 LNA 核苷，其中區域 F 或 F' 或者區域 F 及 F’ 兩者可視情況包含 DNA 核苷 (交替側翼，更多詳細資訊參見此等之定義)。
在一些實施例中，區域 F 及 F' 的 5' 最末端及 3' 最末端核苷為 LNA 核苷，例如 β-D-氧 LNA 核苷。
在一些實施例中，區域 F 與區域 G 之間的核苷間鍵結及/或區域 F’ 與區域 G 之間的核苷間鍵結為硫代磷酸酯核苷間鍵結。在一些實施例中，區域 F 或 F’ 之核苷之間、F 與 F’之間的核苷間鍵結為硫代磷酸酯核苷間鍵結。
LNA
間隙子
LNA 間隙子是指其中區域 F 及 F’ 中任一者或兩者都包含或具有 LNA 核苷的間隙子。β-D-氧基間隙子是指其中區域 F 及 F’ 中任一者或兩者都包含或具有 β-D-氧基 LNA 核苷的間隙子。
在某些實施例中，該 LNA 間隙子系如下式：[LNA]
1-5-[區域 G]-[LNA]
1-5，其中區域 G 為或包含能夠招募 RNase H 的連續 DNA 核苷之區域。
MOE
間隙子
MOE 間隙子是其中區域 F 及 F’ 由 MOE 核苷所構成的間隙子。在一些實施例中，MOE 間隙子的設計為 [MOE]
1-8-[區域 G]
5-16-[MOE]
1-8，例如 [MOE]
2-7-[區域 G]
6-14-[MOE]
2-7，例如 [MOE]
3-6-[區域 G]
8-12-[MOE]
3-6，其中區域 G 具有如該間隙子定義中的定義。具有 5-10-5 設計 (MOE-DNA-MOE) 的 MOE 間隙子已廣泛用於本技術領域中。
混合型翼間隙子
混合型翼間隙子是一種 LNA 間隙子，其中區域 F 及 F’ 中的一者或兩者包含 2’ 取代核苷，如獨立選自由 2’-O-烷基-RNA 單元、2’-O-甲基-RNA、2’-胺基-DNA 單元、2’-氟基-DNA 單元、2’-烷氧基-RNA、MOE 單元、阿糖基核酸 (ANA) 單元及 2’-氟基-ANA 單元所組成之群組的 2’ 取代核苷，如 MOE 核苷。在某些實施例中，其中區域 F 及 F’ 中的至少一個或區域 F 及 F’ 兩者均包含至少一個 LNA 核苷，區域 F 及 F’ 的其餘核苷為獨立選自由 MOE 及 LNA 所組成之群組。在某些實施例中，其中區域 F 及 F’ 中的至少一個或區域 F 及 F’ 兩者均包含至少兩個 LNA 核苷，區域 F 及 F’ 的其餘核苷為獨立選自以 MOE 及 LNA 所組成之群組。在某些混合型翼的實施例中，區域 F 及 F’ 中的一或兩者可進一步包含一或多個 DNA 核苷。
交替側翼間隙子
側翼區域可包含 LNA 及 DNA 核苷兩者，並且由於其包含 LNA-DNA-LNA 核苷的交替模體，因此稱為「交替側翼」。包含至少一個交替側翼之間隙子稱為「交替側翼間隙子」。因此，「選擇性側翼間隙子」是指 LNA 間隙子寡核苷酸，其中至少一個側翼 (F 或 F’) 在一個或多個 LNA 核苷之外還包含 DNA。在某些實施例中，區域 F 或 F’ 中的至少一個或兩個包含 LNA 核苷及 DNA 核苷這兩者。在該等實施例中，側翼區域 F 或 F’，或 F 和 F’ 兩者，包含至少三個核苷，其中 F 及/或 F’ 區域的 5’ 及 3’ 多數核苷為 LNA 核苷。交替側翼 LNA 間隙子在 WO2016/127002 中揭露。
一種交替側翼區域可包含至多 3 個連續 DNA 核苷，例如 1 個至 2 個或 1 個或 2 個或 3 個連續 DNA 核苷。
交替側翼區域可以註釋為一系列整數，代表 LNA 核苷 (L) 的數量，然後是 DNA 核苷 (D) 的數量，例如 [L]1-3-[D]1-3-[L]1-3 或 [L]1-2-[D]1-2-[L]1-2-[D]1-2-[L]1-2。在寡核苷酸設計中，此等通常表示為數字，使得 2-2-1 表示 5' [L]2-[D]2-[L] 3'，並且 1-1-1-1-1 表示 5' [L]-[D]-[L ]-[D]-[L] 3'。具有交替側翼之寡核苷酸中的側翼 (區域 F 及 F') 的長度可以如上文針對此等區域所描述者，例如 4 至 8 個，例如 5 至 6 個核苷，例如 4、5、6 或 7 個經修飾之核苷。可能有利的是，在 3' 側翼 (F') 的 3' 末端具有至少兩個 LNA 核苷，以賦予額外的核酸外切酶抗性。
寡核苷酸中的區域
D’
或
D’’
在一些實施例中，本發明之寡核苷酸可以包含寡核苷酸之連續核苷酸序列或由其組成，該連續核苷酸序列與標靶核酸例如間隙子區域 F-G-F’ 以及進一步之 5’ 及/或 3’ 核苷互補。所述進一步的 5’ 及/或 3’ 核苷可與或不與所述標靶核酸為完全互補。該等進一步的 5’ 及/或 3’ 核苷本文中可稱為區域 D’ 及 D’’。
區域 D’ 或 D’’ 的加入可用於將所述連續核苷酸序列，例如間隙子，連接至結合物部分或另一官能基團。當用於接合所述連續核苷酸序列與結合物部分時，其可做為生物可切斷型連接子。替代性地，其可用於提供核酸外切酶保護或促進合成或製造。
區域 D’ 及 D’’ 可分別連附至區域 F 的 5’ 端或區域 F’ 的 3’ 端，以分別產生下式的設計：D’-F-G-F’、F-G-F’-D’’ 或 D’-F-G-F’-D’’。在此實例中，F-G-F’ 是所述寡核苷酸的間隙子部位，且區域 D’ 或 D’’ 構成所述寡核苷酸的一個分離部分。
區域 D’ 或 D’’ 可獨立包含或具有 1、2、3、4 或 5 個外加核苷酸，其可與所述標靶核酸為互補或不為互補。鄰接 F 或 F’ 區域的核苷酸並非糖修飾核苷酸，例如 DNA 或 RNA 或其鹼基修飾版本。D’ 或 D’’ 區域可做為對核酸酶易感的生物可切斷型連接子 (見連接子定義)。在某些實施例中，該外加 5’ 及/或 3’ 端核苷酸是與磷酸二酯鍵結連結，且為 DNA 或 RNA。適用為區域 D’ 或 D’’ 的核苷酸基生物可切斷型連接子可參照 WO2014/076195 的揭露，舉例而言可包括磷酸二酯連結 DNA 二核苷酸。生物可切割連接子在聚寡核苷酸構造體中的使用可參照 WO2015/113922 中所揭露，在該案中該等連接子係用於連接單一寡核苷酸中的多個反義構造體 (例如間隙子區域)。
在一個實施例中，本發明之寡核苷酸除包含構成該間隙子的連續核苷酸序列之外，還包含區域 D’ 及/或 D’’。
在一些實施例中，本發明之寡核苷酸可由下式代表：
F-G-F’；特別是 F
1-8-G
5-16-F’
2-8D’-F-G-F’；特別是 D’
1-3-F
1-8-G
5-16-F’
2-8F-G-F’-D’’；特別是 F
1-8-G
5-16-F’
2-8-D’’
1-3D’-F-G-F’-D’’；特別是 D’
1-3- F
1-8-G
5-16-F’
2-8-D’’
1-3
在某些實施例中，該位在區域 D’ 與區域 F 之間的核苷間鍵結是磷酸二酯鍵結。在某些實施例中，該位在區域 F’ 與區域 D’’ 之間的核苷間鍵結是磷酸二酯鍵結。
結合物
如本文所用，術語結合物指代寡核苷酸，其與非核苷酸部分 (結合物部分或區域 C 或第三區域) 共價連接。結合物部分可以視情況透過連接子基團 (如區域 D’ 或 D’) 共價連接至反義寡核苷酸。
寡核苷酸共軛體及其合成業經報導於 Manoharan 在 Antisense Drug Technology, Principles, Strategies, and Applications, S.T.Crooke 編輯，第 16 章, Marcel Dekker, Inc., 2001 中之綜合評論及 Manoharan, Antisense and Nucleic Acid Drug Development, 2002, 12, 103。
在一些實施例中，該非核苷酸部分 (結合物部分) 係選自由碳水化合物 (例如 GalNAc)、細胞表面受體配體、原料藥、激素、親脂性物質、聚合物、蛋白質、胜肽、毒素 (例如細菌毒素)、維生素、病毒蛋白 (例如殼體) 或其組合所組成之群組。
示例性結合物部分包括彼等能夠結合至去唾液酸糖蛋白受體 (ASGPR) 者。特別是，三價 N-乙醯基半乳胺糖結合物適合用於結合至 ASGPR，參見例如 WO 2014/076196、WO 2014/207232 及 WO 2014/179620。此類結合物用於增強肝臟對寡核苷酸的攝取。
在某些實施例中，所述結合物是對運鐵蛋白受體具有特定親和力的抗體或抗體片段，例如 WO 2012/143379 中所揭露者，該案經參照併入本文。在一些實施例中，該非核苷酸部分為抗體或抗體片段，例如有助於跨血腦障壁之遞送的抗體或抗體片段，特別是靶向運鐵蛋白受體的抗體或抗體片段。
連接子
鍵結或連接子是兩個原子之間的連接，用以將一個關注中的化學基團或區段經由一或多個共價鍵連結至另一個關注中的化學基團或區段。結合物部分可直接或透過連接部分 (例如連接子或繫鏈) 連接至寡核苷酸。連接子用於將第三區域，例如結合物部分 (區域 C)，共價連結至第一區域，例如與標靶核酸互補的寡核苷酸或連續核苷酸序列 (區域 A)。
在本發明的一些實施例中，本發明之結合物或寡核苷酸結合物可視情況包含連接子區域 (第二區域或區域 B 及/或區域 Y)，其定位在與標靶核酸互補之寡核苷酸或連續核苷酸序列 (區域 A 或第一區域) 與結合物部分 (區域 C 或第三區域) 之間。
生物可切割連接子 (區域 B) 包含生理不穩定鍵或由其組成，該生理不穩定鍵在正常情況下或類似於哺乳動物體內遇到的條件下可切割。生理不安定連接子經歷化學轉換 (例如，切斷) 的條件包括化學條件，例如 pH、溫度、氧化或還原條件或作用劑，以及哺乳動物細胞內所常態存在或與之類似的鹽濃度。哺乳動物細胞內條件亦包括通常存在於哺乳動物細胞中的酵素活性，例如蛋白分解酶或水解酶或核酸酶的活性。在一個實施例中，生物可切斷型連接子容易受到 S1 核酸酶切斷。在一些實施例中，該生理不穩定連接子 (生物可切割) 包含 1 至 10 個之間的經連接之核苷，例如 1、2、3、4、5、6、7、8、9 或 10 個經連接至核苷，例如 2 至 6 個之間的經連接之核苷，例如 2 至 5 個之間的經連接之核苷，例如 2 至 4 個之間的經連接之核苷，其中至少兩個接連鍵結為生物可切割，例如磷酸二酯鍵結，例如至少 3 或 4 或 5 個接連磷酸二酯鍵結。該核苷較佳的是 DNA 或 RNA。
在一個實施例中，寡核苷酸與結合物部分之間的連接子為生理不穩定連接子，其由 2 至 5 個經接連磷酸二酯連接的核苷組成，在反義寡核苷酸之連續核苷酸序列的 5’ 或 3’ 末端包含至少兩個接連磷酸二酯鍵結。
在一些實施例中，該生理不穩定連接子包含 DNA 二核苷酸或由其組成，該 DNA 二核苷酸具有選自由 AA、AT、AC、AG、TA、TT、TC、TG、CA、CT、CC、CG、GA、GT、GC 或 GG 所組成之群組，其中在兩個 DNA 核苷之間存在磷酸二酯鍵結，並且在二核苷酸之 5' 或 3' 端存在至少又一個磷酸二酯，將核酸分子之寡核苷酸與該二核苷酸連接或將該結合物部分與該二核苷酸連接。例如，連接子可以為 CA 二核苷酸。在一些實施例中，該生理不穩定之連接子包含下列序列之 DNA 三核苷酸或由其組成：AAA、AAT、AAC、AAG、ATA、ATT、ATC、ATG、ACA、ACT、ACC、ACG、AGA、AGT、AGC、AGG、TAA、TAT、TAC、TAG、TTA、TTT、TTC、TAG、TCA、TCT、TCC、TCG、TGA、TGT、TGC、TGG、CAA、CAT、CAC、CAG、CTA、CTG、CTC、CTT、CCA、CCT、CCC、CCG、CGA、CGT、CGC、CGG、GAA、GAT、GAC、CAG、GTA、GTT、GTC、GTG、GCA、GCT、GCC、GCG、GGA、GGT、GGC 或 GGG，其中在 DNA 核苷之間存在磷酸二酯鍵結，並且可能在三核苷酸之 5' 或 3' 端存在又一個磷酸二酯。包含磷酸二酯的生物可切割連接子在 WO 2014/076195 (在此藉由引用併入) 中更詳細地描述。當與標準品相比時，在具有生物可切割連接子的結合物化合物中，至少約 50% 的結合物部分被從寡核苷酸切割，例如至少約 60% 被切割，例如至少約 70% 被切割，例如至少約 80% 被切割，例如至少約 85% 被切割，例如至少約 90% 被切割，例如至少約 95% 的結合物部分被從寡核苷酸切割。
區域 Y 意指未必為生物可切斷型但主要功能是將結合物部分 (區域 C 或第三區域) 共價連接至寡核苷酸 (區域 A 或第一區域) 的連接子。區域 Y 連接子可包含鏈結構或重複單元的寡聚物，諸如乙二醇、胺基酸單元或胺基烷基基團。本發明之寡核苷酸結合物可由以下區域元件構造：A-C、A-B-C、A-B-Y-C、A-Y-B-C 或 A-Y-C。在一些實施例中，連接子 (區域 Y) 為胺基烷基，如 C2 至 C36 胺基烷基團，包括例如 C6 至 C12 胺基烷基。在某些實施例中，該連接子 (區域 Y) 為 C6 胺基烷基團。
較佳地，可切割連接子在將本發明之結合物遞送至其標靶細胞後被切割。例如，在進行結合物至標靶細胞 (例如肝臟細胞) 的 GalNAc 媒介之遞送後，連接子被切掉，留下裸露之化合物作為活性藥物。例如，在實例部分中測試的結合物包含 CA 二核苷酸連接子。
醫藥上可接受之鹽
術語「醫藥上可接受之鹽」指代保有生物學有效性及游離鹼或游離酸之特性，且並非在生物學上或在其他方面有不利之處的鹽。該鹽類是以無機酸形成，例如鹽酸、氫溴酸、硫酸、硝酸、磷酸，具體是鹽酸，以及以有機酸形成，例如乙酸、丙酸、乙醇酸、丙酮酸、草酸、馬來酸、丙二酸、琥珀酸、延胡索酸、酒石酸、檸檬酸、苄酸、肉桂酸、苦杏仁酸、甲磺酸、乙磺酸、對甲苯磺酸、水楊酸、N-乙醯半胱胺酸。此外，此等鹽可由無機鹼或有機鹼添加至游離酸中來製備。衍生自無機鹼的鹽包括但不限於鈉、鉀、鋰、銨、鈣、鎂鹽。衍生自有機鹼的鹽包括但不限於一級胺、二級胺、和三級胺的鹽、取代胺，包括天然存在的取代胺、環胺和鹼性離子交換樹脂，諸如異丙胺、三甲胺、二乙胺、三乙胺、三丙胺、乙醇胺、離胺酸、精胺酸、N-乙基哌啶、哌啶、多胺樹脂。本發明之化合物亦可以兩性離子之形式存在。特佳的式 (I) 化合物的醫藥上可接受的鹽為鹽酸、氫溴酸、硫酸、磷酸和甲磺酸的鹽。
治療
本文所用的「治療」一詞意指治療既有疾病 (例如本文所提及之疾病或疾患)，或防範疾病，也就是預防。因此應知，本文中所稱的治療，於某些實施例中，是屬於預防疾病性質。預防可以理解為防止 HBV 感染轉為慢性 HBV 感染或防止慢性 HBV 感染引起的嚴重肝病例如肝硬化及肝細胞癌。
預防
在本文中，術語「預防」、「防止」或「阻止」涉及預防性治療，亦即，其目的為預防而非治癒疾病的措施或程序。預防意指獲得期望的藥理學及/或生理學效果，該效果在完全或部分地防止疾病或其症狀方面是預防性的。據此，本文中，「預防 HBV 感染」包括防止 HBV 感染在個體中發生，以及防止 HBV 感染症狀的發生。在本發明中，特別考慮了預防來自 HBV 感染之母親的兒童之 HBV 感染。還考慮預防急性 HBV 感染轉變為慢性 HBV 感染。
患者
對於本發明之目的，「個體」或「患者」可以為脊椎動物。在本發明之語境中，術語「個體」包括人類及其他動物，特別是哺乳動物及其他生物。因此，本文提供的手段及方法適用於人類療法及獸醫應用兩者。據此，本文中之個體可以為動物，例如小鼠、大鼠、倉鼠、兔、豚鼠、雪貂、貓、狗、雞、羊、牛科物種、馬、駱駝或靈長類動物。較佳地，個體為哺乳動物。更佳地，個體為人類。在一些實施例中，患者罹患本文提及之疾病，例如 HBV 感染。在一些實施例中，患者易患該疾病。
發明實施方式
受感染之肝臟細胞中之 B 型肝炎病毒 (HBV) 共價閉合環狀 DNA (cccDNA) 負責持續的慢性感染及再活化，係所有病毒次基因體轉錄本及前基因體 RNA (pgRNA) 的模板，以確保新合成之病毒後代及經由細胞內核鞘循環之 cccDNA 池補充兩者。RTEL1 與 cccDNA 穩定性有關。RTEL1 之抑制導致經 HBV 感染之個體中 cccDNA 的去穩定，這繼而為慢性感染之 HBV 患者的完全治癒提供了機會。
本發明之一個態樣為靶向 RTEL1 之增強型反義寡核苷酸或其結合物，其用於治療及/或預防 HBV 感染，特別是慢性 HBV 感染。
在一個實施例中，靶向 RTEL1 之反義寡核苷酸或其結合物可以例如減少 RTEL1 蛋白之表現、RTEL1 蛋白與 cccDNA 之結合，從而減少被感染之細胞例如 HBV 感染之細胞中的 cccDNA 及/或 pgRNA。
在一個實施例中，靶向 RTEL1 之反義寡核苷酸或其結合物能夠在活體內減少 HBV 感染之個體的
HBsAg 及/或 HBeAg。
在一個實施例中，靶向 RTEL1 之反義寡核苷酸或其結合物能夠在活體內減少 HBV 感染之個體的
cccDNA。
在一個實施例中，靶向 RTEL1 之反義寡核苷酸或其結合物能夠在活體內減少 HBV 感染之個體的
pgRNA。
本發明之反義寡核
苷酸
本發明之增強型反義寡核苷酸或其結合物可能為優異之 RTEL1 抑制劑，因為它們可以靶向 RTEL1 轉錄本並且經由 RNase H 切割促進其降解。
本發明之一個態樣為一種增強型反義寡核苷酸或其結合物，其用於治療及/或預防 HBV 感染。
本部分描述適合用於治療及/或預防 HBV 感染的新型寡核苷酸。
本發明之反義寡核苷酸或其結合物能夠在活體外及活體內抑制
RTEL1
之表現。藉由將寡核苷酸與編碼 RTEL1 或參與調節 RTEL1 的標靶核酸雜交來達成抑制。標靶核酸可以為哺乳動物 RTEL1 序列，例如 SEQ ID NO: 1 及/或 SEQ ID NO: 2 之序列。
在一些實施例中，本發明之反義寡核苷酸或其結合物能夠藉由抑制或下調標靶之表現而調節該標靶之表現。較佳地，該調節相較於標靶之正常表現水平可產生至少 20% 的表現抑制，更佳相較於正常表現水平產生至少 30%、至少 40%、至少 50%、至少 60%、至少 70%、至少 80%，或至少 90% 的表現抑制。在一些實施例中，本發明之反義寡核苷酸或其結合物能夠在活體外使用
10 μM 在 PXB-PHH 細胞中將 RTEL1 mRNA之表現水平抑制至少 60％ 或 70％。在一些實施例中，本發明之反義寡核苷酸或其結合物可能能夠在活體外使用 10 μM 在 PXB-PHH 細胞中將
RTEL1 蛋白之表現水平抑制至少50%，該標靶減少範圍在選擇與 cccDNA 減少具有良好相關性的反義寡核苷酸方面是有利的。適合的是，實例提供可用於測量 RTEL1 RNA 抑制的測定 (例如實例 1)。藉由反義寡核苷酸之連續核苷酸序列與標靶核酸之間的雜交來觸發標靶抑制。在某些實施例中，本發明之反義寡核苷酸包含反義寡核苷酸與標靶核酸之間的錯配。儘管存在錯配，但與標靶核酸的雜交仍可能足以顯示出所期望的 RTEL1 表現抑制。藉由增加反義寡核苷酸中核苷酸的數量及/或增加能夠增加與存在於寡核苷酸序列內之標靶 (例如 2’ 糖修飾核苷，包括 LNA) 的結合親和力的經修飾之核苷的數量，可以有利地補償由錯配導致的減少的結合親和力。
本發明之一個態樣涉及長度為 12 至 60 個核苷酸之增強型反義寡核苷酸，其包含長度為至少 10 個核苷酸，例如長度為至少 12 至 30 個核苷酸的連續核苷酸序列，其與哺乳動物 RTEL1 標靶核酸，特別是人類 RTEL1 核酸為至少 95% 互補，例如完全互補。反義寡核苷酸能夠抑制 RTEL1 之表現。
在一些實施例中，本發明之反義寡核苷酸包含 12 至 22 個核苷酸，例如 15 至 20 個核苷酸的連續核苷酸序列，與 SEQ ID NO: 7 之標靶核酸具有至少 90％ 的互補性，例如完全互補。
在一些實施例中，反義寡核苷酸包含 15 至 18 個核苷酸，例如 17 或 18 個核苷酸的連續核苷酸序列，與 SEQ ID NO: 8 之標靶核酸為至少 90％ 互補，例如完全互補。
在一些實施例中，反義寡核苷酸包含 15 至 19 個核苷酸，例如 18 或 19 個核苷酸的連續核苷酸序列，與 SEQ ID NO: 9 之標靶核酸為至少 90％ 互補，例如完全互補。
在一些實施例中，反義寡核苷酸包含 15 至 18 個核苷酸，例如 17 或 18 個核苷酸的連續核苷酸序列，與 SEQ ID NO: 10 之標靶核酸為至少 90％ 互補，例如完全互補。
在一些實施例中，本發明之反義寡核苷酸包含 12 至 22 個核苷酸，例如 17 至 22 個核苷酸的連續核苷酸序列，與 SEQ ID NO: 11 之標靶核酸具有至少 90％ 的互補性，例如完全互補。
在一些實施例中，該反義寡核苷酸包含 15 至 22 個核苷酸，例如 15 至 18 個核苷酸，例如 17 或 18 個核苷酸的連續核苷酸序列，與以下選自 SEQ ID NO: 1 之區域的標靶核酸具有至少 90% 的互補性，例如完全互補：SEQ ID NO: 1 之 8681-8701、SEQ ID NO: 1 之 11753-11774，例如來自 SEQ ID NO: 1 之核苷酸 11757-11774、11756-11774 或 11753-11770 的區域。
本發明之一個態樣涉及一種反義寡核苷酸，其係長度為 12 至 30 個核苷酸之反義寡核苷酸，包含長度為至少 10 個核苷酸，例如至少 10 至 30 個核苷酸的連續核苷酸序列，其與哺乳動物 RTEL1 為至少 90% 互補，例如完全互補。
本發明之又一態樣涉及反義寡核苷酸，其包含長度為 12 至 20 個，例如 15 至 22 個核苷酸之連續核苷酸序列，該連續核苷酸序列與 SEQ ID NO: 1 之標靶核酸具有至少 90% 之互補性，例如完全互補。
在一些實施例中，該反義寡核苷酸包含長度為 10 至 30 個核苷酸的連續序列，該連續序列與標靶核酸或標靶序列之區域為至少 90% 互補，例如至少 91%、例如至少 92%、例如至少 93%、例如至少 94%、例如至少 95%、例如至少 96%、例如至少 97%、例如至少 98%、或 100% 互補。
如果本發明之反義寡核苷酸或其連續核苷酸序列與標靶核酸之區域完全互補 (100% 互補)，則是有利的，或者在一些實施例中，該寡核苷酸與標靶核酸之間可包含一個或兩個錯配。
在一些實施例中，該反義寡核苷酸序列與 SEQ ID NO: 1 之相應標靶核酸為 100% 互補。
在一些實施例中，本發明之反義寡核苷酸或連續核苷酸序列與 SEQ ID NO: 1 及 SEQ ID NO: 2 的標靶核酸為至少 95% 互補，例如完全 (或 100%) 互補。
在一些實施例中，該連續核苷酸序列包含選自由 SEQ ID NO: 3、SEQ ID NO: 4、SEQ ID NO: 5 及 SEQ ID NO: 6 或其至少 14 個連續核苷酸所組成之群組的序列。
在某些實施例中，本發明之反義寡核苷酸或其連續核苷酸序列包含長度為 10 個至 30 個核苷酸或由其組成，如長度為 12 個至 25 個核苷酸、如 11 個至 22 個核苷酸、如 12 個至 20 個核苷酸、如 14 個至 18 個或 14 個至 16 個連續核苷酸。
在某些實施例中，反義寡核苷酸或其連續核苷酸序列包含 22 個或更少之核苷酸或由其組成，如 20 個或更少之核苷酸，如 18 個或更少之核苷酸，如 14 個、15 個、16 個或 17 個核苷酸。應知在本文中給定之所有範圍均包括範圍端點。據此，若本文中描述一寡核苷酸包括自 10 個至 30 個核苷酸，則 10 個及 30 個核苷酸均包含在內。
在一些實施例中，連續核苷酸序列之長度包含 10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21 或 22 個連續核苷酸或由其組成。
在一些實施例中，反義寡核苷酸或其連續核苷酸序列包含選自 SEQ ID NO: 3、SEQ ID NO: 4、SEQ ID NO: 5 及 SEQ ID NO: 6 之序列或由其組成。
本發明提供根據本發明之反義寡核苷酸，例如長度為 12 至 24 個核苷酸，例如長度為 12 至 18 個核苷酸的反義寡核苷酸，其中該反義寡核苷酸包含連續核苷酸序列，該連續核苷酸序列包含至少 12 個，例如至少 13 個，例如至少 14 個，例如至少 15 個或至少 16 個存在於 SEQ ID NO: 7 中的連續核苷酸。
本發明提供反義寡核苷酸，例如長度為 12 至 24 個核苷酸，例如長度為 12 至 18 個核苷酸的反義寡核苷酸，其中該反義寡核苷酸包含連續核苷酸序列，該連續核苷酸序列包含至少 12 個，例如至少 13 個，例如至少 14 個，例如至少 15 個或至少 16 個存在於 SEQ ID NO: 8 中的連續核苷酸。
本發明提供反義寡核苷酸，例如長度為 12 至 24 個核苷酸，例如長度為 12 至 18 個核苷酸的反義寡核苷酸，其中該反義寡核苷酸包含連續核苷酸序列，該連續核苷酸序列包含至少 12 個，例如至少 13 個，例如至少 14 個，例如至少 15 個或至少 16 個存在於 SEQ ID NO: 9 中的連續核苷酸。
本發明提供反義寡核苷酸，例如長度為 12 至 24 個核苷酸，例如長度為 12 至 18 個核苷酸的反義寡核苷酸，其中該反義寡核苷酸包含連續核苷酸序列，該連續核苷酸序列包含至少 12 個，例如至少 13 個，例如至少 14 個，例如至少 15 個或至少 16 個存在於 SEQ ID NO: 10 中的連續核苷酸。
本發明提供反義寡核苷酸，例如長度為 12 至 24 個核苷酸，例如長度為 12 至 18 個核苷酸的反義寡核苷酸，其中該反義寡核苷酸包含連續核苷酸序列，該連續核苷酸序列包含至少 12 個，例如至少 13 個，例如至少 14 個，例如至少 15 個或至少 16 個存在於 SEQ ID NO: 11 中的連續核苷酸。
在有利的實施例中，反義寡核苷酸包含一個或多個糖修飾核苷，如一個或多個 2’ 糖修飾核苷，如一個或多個獨立選自由 2'-O-烷基-RNA、2'-O-甲基-RNA、2'-烷氧基-RNA、2'-O-甲氧基乙基-RNA、2'-胺基-DNA、2'-氟-DNA、阿拉伯核酸 (ANA)、2' -氟-ANA和 LNA 核苷所組成之群組之 2'糖修飾核苷。若修飾核苷中的一個或多個為鎖核酸 (LNA)，則是有利的。
在某些實施例中，連續核苷酸序列包含 LNA 核苷。
在本發明之寡核苷酸的一些實施例中，所有 LNA 核苷皆為 β-D-氧 LNA 核苷。
在某些實施例中，連續核苷酸序列包含 LNA 核苷和 DNA 核苷。
在某些實施例中，連續核苷酸序列包含 2'-O-甲氧基乙基 (2'MOE) 核苷。
在某些實施例中，連續核苷酸序列包含 2'-O-甲氧基乙基 (2'MOE) 核苷和 DNA 核苷。
有利的是，反義寡核苷酸之 3' 最末端核苷或其連續核苷酸序列為 2’ 糖修飾核苷。
有利的是，反義寡核苷酸包含至少一個修飾核苷間鍵結，如硫代磷酸酯或二硫代磷酸酯。
在一些實施例中，連續核苷酸序列中的至少一個核苷間鍵結為硫代磷酸酯核苷間鍵結。
在某些實施例中，連續核苷酸序列中的至少一個核苷間鍵結為二硫代磷酸酯核苷間鍵結。
在某些實施例中，連續核苷酸序列中的至少一個核苷間鍵結為磷酸雙酯核苷間鍵結。
在某些實施例中，連續核苷酸序列內的所有核苷間鍵結都為硫代磷酸酯核苷間鍵結。
在一些實施例中，反義寡核苷酸或其連續核苷酸序列內之核苷間鍵結中的至少 75% 為硫代磷酸酯核苷間鍵結。
在某些實施例中，反義寡核苷酸或其連續核苷酸序列內所有核苷間鍵結為硫代磷酸酯核苷間鍵結。
在本發明之有利的實施例中，本發明之反義寡核苷酸能夠招募 RNase H，如 RNase H1。在某些實施例中，本發明之反義寡核苷酸或其連續核苷酸序列是間隙子。
在某些實施例中，反義寡核苷酸或其連續核苷酸序列包含式 5’-F-G-F’-3 的間隙子或由其組成。
在一些實施例中，區域 G 由 6 至 16 個 DNA 核苷，例如11 至 16 個 DNA 核苷組成。在一些實施例中，區域 F 包含 2 至 4 個 DNA 核苷且/或區域 F’ 包含 2 至 6 個 DNA 核苷。
在某些實施例中，區域 F 和 F’ 各自包含至少一個 LNA 核苷。
在一些實施例中，本發明之寡核苷酸為具有均一側翼的 LNA 間隙子。例如，具有均一側翼的 LNA 間隙子可能具有選自以下設計的設計：4-12-2、2-13-4 及 2-12-5。表 6 列述每個模體序列的較佳設計。
在本發明之一些實施例中，LNA 間隙子為交替側翼 LNA 間隙子。在一些實施例中，交替側翼 LNA 間隙子包含至少一個交替側翼 (例如側翼 F')。在一些實施例中，交替側翼 LNA 間隙子包含一個交替側翼 (例如側翼 F') 及一個均一側翼 (例如側翼 F)。例如，具有一個交替 F' 側翼的 LNA 間隙子可以具有以下設計：2-11-1-2-1-1-3。
本發明提供以下寡核苷酸化合物 (表 6)：
表 6：本發明之寡核苷酸模體序列 (以 SEQ ID NO 表示)、其設計以及基於該模體序列所設計的具體寡核苷酸化合物 (以 CMP ID NO 表示) 的列述。
| SEQ ID NO | 模體序列 | SEQ ID NO: 1 上的位置 | 設計 | CMP 識別號 | 寡核苷酸化合物 | |
| 開始 | 結束 | |||||
| 3 | AATTTTACATACTCTGGT | 11757 | 11774 | 4-12-2 | 3_1 | AATTttacatactctgGT |
| 4 | AATTTTACATACTCTGGTC | 11756 | 11774 | 2-13-4 | 4_1 | AAttttacatactctGGTC |
| 5 | TTACATACTCTGGTCAAA | 11753 | 11770 | 2-12-5 | 5_1 | TTacatactctggtCAAA |
| 6 | CTTTATTATAACTTGAATCTC | 8681 | 8701 | 2-11-1-2-1-1-3 | 6_1 | CTttattataactTgaAtCTC |
表中的標題「寡核苷酸化合物」代表模體序列的具體設計。大寫字母為 β-D-氧 LNA 核苷，小寫字母為 DNA 核苷，所有 LNA C 皆為 5-甲基胞嘧啶，所有核苷間鍵結皆為硫代磷酸酯核苷間鍵結。標題「設計」指代間隙子設計，F-G-F'。在經典的間隙子設計中，亦即具有均一側翼的間隙子 (例如 4-12-2)，側翼 (F 及 F') 中的所有核苷酸皆由相同類型的 2'-糖修飾核苷 (例如 LNA、cET 或 MOE) 以及中間形成缺口 (G) 的一段 DNA 組成。在具有交替側翼設計的間隙子中，寡核苷酸的側翼被註釋為一系列整數，代表多個 β-D-氧 LNA 核苷 (L)，後接一定數量的 DNA 核苷 (D)。例如，具有 1-2-1-1-3 模體的側翼 F' 代表 LDDLDLLL (參見 CMP ID NO 6_1)。兩個側翼的 5' 及 3' 末端皆具有一個 β-D-氧 LNA 核苷。由一定數量的 DNA 核苷構成的缺口區 (G) 位於側翼之間。
對於本發明之一些實施例，該寡核苷酸係選自由具有CMP-ID-NO: 3_1、CMP-ID-NO: 4_1、CMP-ID-NO: 5_1 及 CMP-ID-NO: 6_1 (參見表 6) 所組成之寡核苷酸化合物群組。
在所有情況下，F-G-F′ 設計可以進一步包括區域 D’ 及/或 D’’，如在「定義」部分中「寡核苷酸中的區域 D’ 或 D’’」下所述。在一些實施例中，本發明之反義寡核苷酸在間隙子區域的 5′ 或 3′ 端，例如在 5′ 端，具有 1、2 或 3 個經磷酸二酯連接的核苷單元，例如 DNA 單元。在一些實施例中，本發明之反義寡核苷酸由以下所組成：兩個經磷酸二酯連接的 5’ DNA 核苷，後接如上定義的 F-G-F’ 間隙子區域。在 5’ 或 3’ 端含有經磷酸二酯連接之 DNA 單元的寡核苷酸適用於結合作用，並可以進一步包含本文所述的結合物部分。對於遞送至肝臟，ASGPR 靶向部分作為結合物部分特別有利，請參閱結合物部分了解更多細節。
共軛物
由於 HBV 感染主要影響肝臟中的肝細胞，因此有利的是將本發明之增強型反義寡核苷酸與結合物部分結合，與未結合的反義寡核苷酸相比，將會增加反義寡核苷酸向肝臟之遞送。在一個實施例中，肝臟靶向部分係選自包含膽固醇或其他脂質的部分或者能夠結合至去唾液酸糖蛋白受體 (ASGPR) 的結合物部分。
在一些實施例中，本發明提供一種結合物，其包含共價連接至結合物部分的本發明之反義寡核苷酸。
去唾液酸糖蛋白受體 (ASGPR) 結合物部分包含一個或多個能夠以等於或大於半乳糖的親和力結合至去唾液酸糖蛋白受體的碳水化合物部分 (ASPGR 靶向部分)。許多半乳糖衍生物對於去唾液酸糖蛋白受體的親和力已經得以研究 (參見例如：Jobst, S.T. 與 Drickamer, K. JB.C.1996, 271, 6686) 或使用本領域典型之方法容易地測定。
在一個實施例中，該結合物部分包含至少一個去唾液酸糖蛋白受體靶向部分，其係選自由半乳糖、半乳胺糖、N-甲醯基-半乳胺糖、N-乙醯基半乳胺糖、N-丙醯基-半乳胺糖、N-正丁醯基-半乳胺糖及 N-異丁醯基半乳胺糖所組成之群組。有利地，去唾液酸糖蛋白受體靶向部分為 N-乙醯基半乳胺糖 (GalNAc)。
為了生成 ASGPR 結合物部分，可以將 ASPGR 靶向部分 (較佳 GalNAc) 連接至結合物支架。通常，ASPGR 靶向部分可以在支架的同一端。在一個實施例中，該結合物部分由與間隔子連接的 2 至 4 個末端 GalNAc 部分組成，該間隔子將每個 GalNAc 部分與支鏈分子連接，從而可以與反義寡核苷酸結合。
在又一實施例中，該結合物部分相對於去唾液酸糖蛋白受體靶向部分為單價的、二價的、三價的或四價的。有利地，去唾液酸糖蛋白受體靶向部分包含 N-乙醯基半乳胺糖 (GalNAc) 部分。
GalNAc 結合物部分可以包括例如 WO 2014/179620 及 WO 2016/055601 及 PCT/EP2017/059080 (藉由引用於此處併入) 中描述之彼等，以及連接有 GalNAc 部分的小胜肽，例如 Tyr-Glu-Glu-(胺基己基 GalNAc) 3 (YEE(ahGalNAc)3；一種結合至肝細胞上之去唾液酸糖蛋白受體的醣三肽，參見例如 Duff 等人, Methods Enzymol, 2000, 313, 297)；基於離胺酸之半乳糖簇 (例如，L3G4；Biessen 等人, Cardovasc.Med., 1999, 214）；以及膽烷為基礎的半乳糖簇（例如，去唾液酸糖蛋白受體的碳水化合物識別模體）。
可以使用本領域已知的方法將 ASGPR 結合物部分，特別是三價 GalNAc 結合物部分連接至寡核苷酸的 3’ 或 5’ 端。在一個實施例中，該 ASGPR 結合物部分與寡核苷酸的 5’ 端連接。
在一個實施例中，該結合物部分為三價 N-乙醯基半乳胺糖 (GalNAc)，例如圖 5 所示之彼等。在一個實施例中，該結合物部分為圖 5A-1 或 圖5A-2 之三價 N-乙醯基半乳胺糖 (GalNAc)，或兩者之混合物。在一個實施例中，該結合物部分為圖 5B-1 或 圖5B-2 之三價 N-乙醯基半乳胺糖 (GalNAc)，或兩者之混合物。在一個實施例中，該結合物部分為圖 5C-1 或 圖5C-2 之三價 N-乙醯基半乳胺糖 (GalNAc)，或兩者之混合物。在一個實施例中，該結合物部分為圖 5D-1 或 圖5D-2 之三價 N-乙醯基半乳胺糖 (GalNAc)，或兩者之混合物。
在一些實施例中，該結合物係選自由以下所組成之群組：
5'-GN2-C6
oc
oa
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sT
st
st
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s，及
5'-GN2-C6
oc
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sc
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sg
sg
st
s mC
sA
sA
sA
s其中大寫字母代表 β-D-氧 LNA 核苷，小寫字母代表 DNA 核苷，其中每個 LNA 胞嘧啶為 5-甲基胞嘧啶，並且其中下標 s 代表硫代磷酸酯核苷間鍵結，且下標 o 代表磷酸二酯核苷間鍵結，並且 GN2-C6 為三價 N-乙醯基半乳胺糖 (GalNAc)，例如圖 5 所示之彼等，例如圖 5D-1 或圖 5D-2 的三價 N-乙醯基半乳胺糖 (GalNAc)，或兩者之混合物。
代表一些分子的化學圖如圖 1 至圖 4 所示。
在一些實施例中，結合物為如圖 1 所示的結合物。
在一些實施例中，結合物為如圖 2 所示的結合物。
在一些實施例中，結合物為如圖 3 所示的結合物。
在一些實施例中，結合物為如圖 4 所示的結合物。
圖 1 至圖 4 中所示的化合物以質子化形式示出，亦即，硫代磷酸酯鍵結上的硫原子經質子化；應理解，質子之存在將取決於分子之環境酸性以及替代性陽離子之存在 (例如當該寡核苷酸為鹽形式時)。質子化硫代磷酸酯是以互變異構的形式存在。
醫藥上可接受之鹽
根據本發明之化合物可以以其醫藥上可接受之鹽的形式存在。術語「醫藥上可接受之鹽」係指習知的酸加成鹽或鹼加成鹽，其保留了本發明化合物的生物學效力和特性，並由合適的無毒有機或無機酸或有機或無機鹼形成。酸加成鹽包括例如衍生自無機酸的那些，諸如氫氯酸、氫溴酸、氫碘酸、硫酸、胺磺酸、磷酸和硝酸，以及衍生自有機酸的那些，諸如對甲苯磺酸、水楊酸、甲磺酸、草酸、琥珀酸、檸檬酸、蘋果酸、乳酸、富馬酸等。鹼加成鹽包括衍生自氫氧化銨、氫氧化鉀、氫氧化鈉和四級銨氫氧化物的那些，諸如例如四甲基氫氧化銨。將藥物化合物進行化學修飾成鹽是藥物化學家眾所周知的技術，以獲得改善之化合物的物理和化學穩定性、吸濕性、流動性和溶解性。例如，在 Bastin, Organic Process Research & Development 2000, 4, 427-435，或在 Ansel 的以下文獻中對此進行了描述：Pharmaceutical Dosage Forms and Drug Delivery Systems，第六版，(1995)，第 196 頁和第 1456-1457 頁。例如，本文提供之化合物的醫藥上可接受之鹽可以是鈉鹽。
在又一態樣中，本發明提供反義寡核苷酸或其結合物之醫藥上可接受之鹽，例如醫藥上可接受之鈉鹽、銨鹽或鉀鹽。
製造方法
在又一態樣中，本發明提供製造本發明之寡核苷酸之方法，該方法包含使核苷酸單元反應並藉此形成包含在寡核苷酸中的共價連接之連續核苷酸單元。較佳地，該方法使用磷醯亞胺化學 (參見例如 Caruthers 等人, 1987, Methods in Enzymology 第 154 卷，第 287-313 頁)。在又一實施例中，該方法進一步包含使連續核苷酸序列與結合物部分 (配體) 反應，以將結合物部分共價連接至寡核苷酸。在又一態樣中，提供一種用以製造本發明之組成物之方法，該方法包含將本發明之寡核苷酸或結合之寡核苷酸與一種醫藥上可接受之稀釋劑、溶劑、載劑、鹽及/或佐劑混合。
醫藥組成物
在又一態樣中，本發明提供醫藥組成物，其包含任一前述寡核苷酸及/或寡核苷酸結合物或其鹽以及一種醫藥上可接受之稀釋劑、載劑、鹽及/或佐劑。醫藥上可接受之稀釋劑包括磷酸鹽緩衝生理食鹽水 (PBS)，而醫藥上可接受之鹽包括但不限於鈉鹽及鉀鹽。在一些實施例中，醫藥上可接受之稀釋劑為無菌磷酸鹽緩衝生理食鹽水。在一些實施例中，該寡核苷酸係以 50 至 300 µM 溶液之濃度用於該醫藥上可接受之稀釋劑中。
適合用於本發明之調配物可參閱 Remington's Pharmaceutical Sciences, Mack Publishing Company, Philadelphia, Pa.，第 17 版, 1985。對於藥物遞送方法的簡要說明，參見例如 Langer (Science 249:1527-1533, 1990)。WO 2007/031091 提供了醫藥上可接受之稀釋劑、載體和佐劑的進一步合適和較佳的實例 (在此藉由引用併入)。WO2007/031091 中還提供了合適的劑量、製劑、投予途徑、組成物、劑型、與其他治療劑的組合、前藥製劑。
在一些實施例中，本發明之反義寡核苷酸或其結合物或其醫藥上可接受之鹽為固體形式，例如粉末，例如凍乾粉末。
在一些實施例中，本發明之反義寡核苷酸或其結合物可以與醫藥上可接受之活性或惰性物質混合，用以製備醫藥組成物或調配物。組成物及用以形成醫藥組成物製劑的方法取決於若干標準，包括但不限於，投予途徑、疾病程度或要投予的劑量。
這些組成物可經由習知消毒技術消毒或經過濾滅菌。如此製成的水溶液可經包裝後直接使用，或經凍乾，使用前先將凍乾製劑與無菌水性載體結合再行投予。製劑的 pH 通常為介於 3 和 11 之間，更佳的是介於 5 和 9 之間或是介於 6 和 8 之間，最佳的是介於 7 和 8 之間，例如 7 至 7.5。製成的固態組成物可分為單劑包裝，每劑中包含固定數量的上述作用劑，例如為藥錠或膠囊的密封包裝。固體形式之組成物也可以包裝在容器中，以利靈活調整用量，例如在設計用於局部應用的乳膏或軟膏的可擠壓管中。
在一些實施例中，本發明之反義寡核苷酸或其結合物為前驅藥。特別是關於反義寡核苷酸結合物，一旦將該前驅藥遞送至作用位點例如標靶細胞，結合物部分即從反義寡核苷酸上被切掉。
應用
本發明之增強型反義寡核苷酸可作為研究試劑用於例如診斷、治療及預防。
在研究中，可在細胞 (例如活體外細胞培養物) 及實驗動物中使用該反義寡核苷酸來特異性地調節
RTEL1 蛋白的合成，藉此促進對於標靶的功能分析，或評估其做為治療介入標靶的實用性。一般而言，標靶調節藉由調降或抑制產生此蛋白質的 mRNA 而實現，從而預防蛋白質形成，或藉由對致使基因或 mRNA 產生此蛋白質的調節劑進行調降或抑制。
若在研究或診斷中採用本發明之反義寡核苷酸，則標靶核酸可以為 cDNA 或衍生自 DNA 或 RNA 的合成核酸。
本發明還涵蓋一種在表現 RTEL1
之標靶細胞中調節
RTEL1 表現的活體內或活體外方法，該方法包含以有效量向該細胞投予本發明之反義寡核苷酸、其結合物或醫藥組成物。
在一些實施例中，標靶細胞為哺乳動物細胞，特別是人類細胞。標靶細胞可以為活體外細胞培養物或形成哺乳動物組織的一部分的活體內細胞。在較佳實施例中，標靶細胞存在於肝臟中。標靶細胞可以為肝細胞。
本發明之一個態樣涉及本發明之反義寡核苷酸、其結合物或醫藥組成物，其用作藥物。
在本發明之一個態樣中，本發明之反義寡核苷酸、其結合物或醫藥組成物能夠降低被感染之細胞中的 cccDNA 含量並因此抑制 HBV 感染。特別是，該反義寡核苷酸或其結合物能夠在被感染之細胞中影響以下參數中的一者或多者：i) 減少 cccDNA 及/或 ii) 減少 pgRNA 及/或 iii) 減少 HBV DNA 及/或 iv) 減少 HBV 病毒抗原。
例如，抑制 HBV 感染的反義寡核苷酸或其結合物可以 i) 與對照相比，將被感染之細胞中的 cccDNA 含量降低至少 40%，例如 50%、60%、70%、80% 或 90%；或 ii) 與對照相比，將 pgRNA 含量降低至少 40%，例如 50%、60%、70%、80% 或 90%。對照可以為未經治療的細胞或動物，或用適當對照治療的細胞或動物。
HBV 感染的抑制可以使用
HBV 感染的原代人類肝細胞在活體外或使用人源化肝細胞 PXB 小鼠模型 (可在 PhoenixBio 獲得，也參見 Kakuni 等人 2014 Int. J. Mol. Sci. 15:58-74)
在活體內測量。HBsAg 及/或 HBeAg 之分泌的抑制可以藉由 ELISA 測定，例如根據製造商的說明使用 CLIA ELISA 套組 (Autobio Diagnostic)。細胞內 cccDNA 或 HBV mRNA 及 pgRNA 的減少可藉由 qPCR 測定，例如，如「材料與方法」部分所述。評估測試化合物是否抑制 HBV 感染的其他方法，是藉由 qPCR（例如 WO 2015/173208 中所述）或使用北方墨點法、原位雜交技術或免疫螢光法來測定 HBV DNA 的分泌。
由於 RTEL1 含量的降低，本發明之反義寡核苷酸、其結合物或醫藥組成物可用於抑制 HBV 感染的發展或用於治療 HBV 感染。特別是 cccDNA 之去穩定化及減少，與僅減少 HBsAg 之分泌的化合物相比，本發明之反義寡核苷酸、其結合物或醫藥組成物更有效地抑制慢性 HBV 感染的發展或治療慢性 HBV 感染。
據此，本發明之一個態樣涉及本發明之反義寡核苷酸、其結合物或醫藥組成物的用途，其用來減少 HBV 感染之個體中的 cccDNA 及/或 pgRNA。
本發明之又一態樣涉及本發明之反義寡核苷酸、其結合物或醫藥組成物之用途，其用來抑制慢性 HBV 感染的發展或治療慢性 HBV 感染。
本發明之又一態樣涉及本發明之反義寡核苷酸、其結合物或醫藥組成物的用途，其用來降低 HBV 感染者的傳染性。在本發明之特定態樣中，本發明之反義寡核苷酸、其結合物或醫藥組成物抑制慢性 HBV 感染的發展。
待使用本發明之反義寡核苷酸、其結合物或醫藥組成物治療 (或預防性地接受本發明之反義寡核苷酸、其結合物或醫藥組成物) 的個體較佳為人類，更佳為 HBsAg 陽性及/或 HBeAg 陽性之人類患者，甚至更佳為 HBsAg 陽性及 HBeAg 陽性之人類患者。
據此，本發明涉及一種治療 HBV 感染之方法，其中該方法包含投予有效量的本發明之反義寡核苷酸、其結合物或醫藥組成物。本發明進一步涉及一種預防由慢性 HBV 感染引起的肝硬化及肝細胞癌之方法。
本發明還提供本發明之反義寡核苷酸、其結合物或醫藥組成物的用途，其用於製造藥物，特別是用於治療 HBV 感染或慢性 HBV 感染或降低 HBV 感染者之傳染性的藥物。在較佳實施例中，藥物經製造為用於皮下投予的劑型。
本發明還提供本發明之反義寡核苷酸、其結合物、醫藥組成物的用途，其用於製造藥物，其中該藥物為用於靜脈內投予的劑型。
本發明之反義寡核苷酸、其結合物或醫藥組成物可用於組合療法。例如，本發明之反義寡核苷酸、其結合物或醫藥組成物可以與其他抗 HBV 藥物組合，例如干擾素 α-2b、干擾素 α-2a 及干擾素 αcon-1 (聚乙二醇化及非聚乙二醇化)、利巴韋林 (ribavirin)、拉米夫定 (lamivudine) (3TC)、恩替卡韋 (entecavir)、替諾福韋 (tenofovir)、替比夫定 (telbivudine) (LdT)、阿德福韋 (adefovir) 或其他新興抗 HBV 藥物，例如 HBV RNA 複製抑制劑、HBsAg 分泌抑制劑、HBV 殼體抑制劑、反義寡聚體 (例如，如 WO2012/145697、WO 2014/179629 及 WO2017/216390 中所述)、siRNA (例如 WO 2005/014806、WO 2012/024170、WO 2012/2055362、WO 2013/003520、WO 2013/159109、WO 2017/027350 及 WO2017/015175 中所述)、HBV 治療性疫苗、HBV 預防性疫苗、HBV 抗體療法 (單株或多株) 或用於治療及/或預防 HBV 的 TLR 2、3、7、8 或 9 促效劑。
組合療法
在一些實施例中，本發明之增強型反義寡核苷酸、其結合物或醫藥組成物係用於與另一治療劑進行組合治療。該治療劑例如可以為上述疾病或疾患之照護標準。
舉例而言，該反義寡核苷酸、其結合物或醫藥組成物可以與其他活性物質組合使用，該等其他活性物質例如基於寡核苷酸之抗病毒劑，例如基於序列特異性寡核苷酸之抗病毒劑，其透過反義 (包括其他 LNA 寡聚物)、siRNA (例如 ARC520)、適體、嗎啉代物或任何其他抗病毒劑、核苷酸序列依賴性作用模式起作用。
進一步舉例而言，該反義寡核苷酸、其結合物或醫藥組成物可以與其他活性物質組合使用，該等其他活性物質例如免疫刺激性抗病毒化合物，例如干擾素 (例如聚乙二醇化干擾素 α)、TLR7 促效劑 (例如 GS-9620) 或治療性疫苗。
進一步舉例而言，該反義寡核苷酸、其結合物或醫藥組成物可以與具有抗病毒活性的其他活性物質例如小分子組合使用。此等其他活性物質可以為例如核苷/核苷酸抑制劑 (例如恩替卡韋或富馬酸替諾福韋地索普西)、衣殼化抑制劑（encapsidation inhibitor）、進入抑制劑 (例如 Myrcludex B)。
在某些實施例中，額外治療劑可以為 HBV 劑、C 型肝炎病毒 (HCV) 劑、化療劑、抗生素、鎮痛劑、非類固醇抗炎 (NSAID) 劑、抗真菌劑、抗寄生蟲劑、抗噁心劑、止瀉劑或免疫抑制劑。
特別是相關實施例，抗病毒劑可以選自干擾素 α-2b、干擾素 α-2a 及干擾素 αcon-1 (聚乙二醇化及非聚乙二醇化)；利巴韋林 (ribavirin)；HBV RNA 複製抑制劑；第二反義寡聚物；HBV 治療性疫苗；HBV 預防性疫苗；拉米夫定 (lamivudine) (3TC)；恩替卡韋 (entecavir) (ETV)；替諾福韋延胡索酸酯 (tenofovir diisoproxil fumarate) (TDF)；替比夫定 (telbivudine) (LdT)；阿德福韋 (adefovir)；及 HBV 抗體療法 (單株或多株)。
在其他具體相關的實施例中，額外 HCV 劑可以為干擾素 α-2b、干擾素 α-2a 及干擾素 αcon-1 (聚乙二醇化及非聚乙二醇化)；利巴韋林；聚乙二醇化干扰素 (pegasys)； HCV RNA 複製抑制劑 (例如 ViroPharma 的 VP50406 系列)；HCV 反義劑；HCV 治療性疫苗；HCV 蛋白酶抑制劑；HCV 解旋酶抑制劑；或 HCV 單株或多株抗體療法。
投予
本發明之增強型反義寡核苷酸、其結合物或醫藥組成物可以局部投予 (例如，至皮膚、吸入、眼用或耳用) 或腸內投予 (例如，口服或透過胃腸道) 或腸胃外投予 (例如、靜脈內、皮下或肌肉內)。
在較佳實施例中，本發明之反義寡核苷酸、其結合物或醫藥組成物係藉由胃腸外途徑投予，包括靜脈內、動脈內、皮下、腹腔內或肌肉內投予。在一個實施例中，活性反義寡核苷酸或其結合物係經靜脈內投予。在另一實施例中，活性反義寡核苷酸或其結合物係經皮下投予。
在一些實施例中，本發明之反義寡核苷酸、其結合物或醫藥組成物係以 0.1 - 15 mg/kg，例如 0.2 - 10 mg/kg，例如 0.25 - 5 mg/kg 之劑量投予。投予可為每週一次、每兩週一次、每三週一次或甚至每月一次。
本發明還提供如所述之本發明之反義寡核苷酸或其結合物用於製造藥物之用途，其中該藥物係用於皮下投予之劑型。
發明之實施例
本發明之以下實施例可與本文所述之任何其他實施例結合運用：上文提供之定義及解釋，特別是在「發明內容」、「定義」及「發明實施方式」部分中提供之定義及解釋加以必要修訂應用於下文。
1. 一種反義寡核苷酸，其包含與 RTEL1 核酸具有至少 90％ 互補性，例如 100％ 互補性之連續核苷酸序列，其中該反義寡核苷酸能夠抑制細胞中之 RTEL1，例如人類 RTEL1 之表現。
2. 如實施例 1 之反義寡核苷酸，其中該連續核苷酸序列與來自如 SEQ ID NO: 1 中所示之人類 RTEL1 前驅 mRNA 之核苷酸 11753-11774 的區域，例如來自 SEQ ID NO: 1 之核苷酸 11757-11774、核苷酸 11756-11774 或核苷酸 11753-11770 之區域完全互補。
3. 如實施例 1 及實施例 2 之反義寡核苷酸，其中該連續核苷酸序列與 SEQ ID NO: 7、SEQ ID NO: 8、SEQ ID NO: 9 及/或 SEQ ID NO: 10 完全互補。
4. 如實施例 1 之反義寡核苷酸，其中該連續核苷酸序列與來自 SEQ ID NO: 1 中所示之人類 RTEL1 前驅 mRNA 之核苷酸 8681-8701 的區域完全互補。
5. 如實施例 1 及實施例 4 之反義寡核苷酸，其中該連續核苷酸序列與 SEQ ID NO: 11完全互補。
6. 如實施例 1 至 5 中任一項之反義寡核苷酸，其中該反義寡核苷酸之長度為 12 至 30 個核苷酸，例如 12 至 22 個核苷酸，例如 16 至 20 個核苷酸。
7. 如實施例 1 至 6 中任一項之反義寡核苷酸，其中該連續核苷酸序列為至少 12 個核苷酸，例如 14、15、16、17、18、19 或 20 個核苷酸之連續序列。
8. 如實施例 7 之反義寡核苷酸，其中該連續核苷酸序列為 18 或 19 個核苷酸的連續序列。
9. 如實施例 1 至 8 中任一項之反義寡核苷酸，其中該連續核苷酸序列與選自由 SEQ ID NO: 3、SEQ ID NO: 4、SEQ ID NO: 5 及 SEQ ID NO: 6 所組成之群組的序列或其至少 15 個連續核苷酸為 100%相同。
10. 如實施例 1 至 9 中任一項之反義寡核苷酸，其在該連續核苷酸序列中包含一個或多個經修飾之核苷。
11. 如實施例 10 之反義寡核苷酸，其中該連續核苷酸序列中之一個或多個經修飾之核苷為 2’ 糖修飾核苷。
12. 如實施例 11 之反義寡核苷酸，其中該一個或多個 2’ 糖修飾核苷係獨立地選自由以下所組成之群組：2’-O-烷基-RNA、2’-O-甲基-RNA、2’-烷氧基-RNA、2’-O-甲氧基乙基-RNA、2’-胺基-DNA、2’-氟-DNA、阿糖基核酸 (ANA)、2’-氟-ANA 及 LNA 核苷。
13. 如實施例 10 至 12 中任一項之反義寡核苷酸，其中該一個或多個經修飾之核苷為 LNA 核苷，例如具有以下 2'-4’ 橋-O-CH
2- 的氧-LNA。
14. 如實施例 13 之反義寡核苷酸，其中該一個或多個經修飾之核苷為 β-D-氧-LNA。
15. 如實施例 1 至 14 中任一項之反義寡核苷酸，其中該連續核苷酸序列中的至少一個核苷間鍵結為硫代磷酸酯核苷間鍵結。
16. 如實施例 1 至 15 中任一項之反義寡核苷酸，其中該連續核苷酸序列中的至少一個核苷間鍵結為二硫代磷酸酯核苷間鍵結。
17. 如實施例 1 至 16 中任一項之反義寡核苷酸，其中該連續核苷酸序列中的至少一個核苷間鍵結為磷酸二酯核苷間鍵結。
18. 如實施例 17 之反義寡核苷酸，其中該連續核苷酸序列中的所有核苷間鍵結皆為硫代磷酸酯核苷間鍵結。
19. 如實施例 1 至 18 中任一項之反義寡核苷酸，其中該反義寡核苷酸為能夠募集 RNase H，例如 RNase H1 的反義寡核苷酸。
20. 如實施例 19 之反義寡核苷酸，其中該反義寡核苷酸或其連續核苷酸序列包含式 5’-F-G-F’-3’ 之間隙子或由其組成。
21. 根據實施例 20 之反義寡核苷酸，其中區域 G 具有 6 至 16 個 DNA 核苷，例如 11 至 16 個 DNA 核苷之長度。
22. 根據實施例 19 至 21 中任一項之反義寡核苷酸，其中區域 F 及 F’ 各自包含至少一個 LNA 核苷，例如其中區域 F 及 F'各自包含至少一個 LNA 核苷。
23. 根據實施例 19 至 22 中任一項之反義寡核苷酸，其中區域 F 具有 1 至 8 個 DNA 核苷，例如 2 至 4 個 DNA 核苷之長度。
24. 根據實施例 19 至 23 中任一項之反義寡核苷酸，其中區域 F’ 具有 1 至 8 個 DNA 核苷，例如 2 至 6 個 DNA 核苷之長度。
25. 根據實施例 19 至 24 中任一項之反義寡核苷酸，其中該反義寡核苷酸或其連續核苷酸序列包含式 F
2-4-G
11-16-F’
2-6之間隙子或由其組成。
26. 根據實施例 19 至 25 中任一項之反義寡核苷酸，其中該間隙子包含至少一個交替側翼。
27. 根據實施例 19 至 25 中任一項之反義寡核苷酸，其中該間隙子包含兩個均一側翼。
28. 根據實施例 1 至 27 中任一項之反義寡核苷酸，其中該反義寡核苷酸係選自由以下所組成之反義寡核苷酸之群組：
AATTttacatactctgGT (SEQ ID NO: 3，化合物 ID No 3_1)，
AAttttacatactctGGTC (SEQ ID NO: 4，化合物 ID No 4_1)，
TTacatactctggtCAAA (SEQ ID NO: 5，化合物 ID No 5_1)，及
CTttattataactTgaAtCTC (SEQ ID NO: 6，化合物 ID No 6_1)，
其中大寫字母為 β-D-氧基 LNA 核苷，小寫字母為 DNA 核苷，所有 LNA C 皆為 5-甲基胞嘧啶，所有核苷間鍵結皆為硫代磷酸酯核苷間鍵結。
29. 一種結合物，其包含如實施例 1 至 28 中任一項之反義寡核苷酸，以及至少一個共價連接至該反義寡核苷酸之結合物部分。
30. 如實施例 29 之結合物，其中該結合物部分包含至少一個去唾液酸糖蛋白受體靶向部分，其係選自由半乳糖、半乳胺糖、N-甲醯基-半乳胺糖、N-乙醯基半乳胺糖、N-丙醯基-半乳胺糖、N-正丁醯基-半乳胺糖及 N-異丁醯基半乳胺糖所組成之群組。
31. 如實施例 30 之結合物，其中該去唾液酸糖蛋白受體靶向部分為 N-乙醯基半乳胺糖 (GalNAc)。
32. 如實施例 30 或 31 之化合物，其中該結合物部分相對於去唾液酸糖蛋白受體靶向部分為單價的、二價的、三價的或四價的。
33. 如實施例 32 之化合物，其中該結合物部分由二至四個末端 GalNAc 部分及間隔子組成，該間隔子將每個 GalNAc 部分與支鏈分子連接，從而可以與反義化合物結合。
34. 如實施例 33 之結合物，其中該間隔子為 PEG 間隔子。
35. 如實施例 30 至 34 中任一項之結合物，其中該結合物部分為三價 N-乙醯基半乳胺糖 (GalNAc) 部分。
36. 如實施例 30 至 35 中任一項之化合物，其中該結合物部分係選自圖 5 中的三價 GalNAc 部分之一者。
37. 如實施例 36 之結合物，其中該結合物部分為圖 5 中的三價 GalNAc 部分，例如圖 5D-1 或圖 5D-2 之三價 GalNAc 部分，或兩者之混合物。
38. 如實施例 29 至 37 中任一項之結合物，其包含定位在反義寡核苷酸與結合物部分之間的連接子。
39. 如實施例 38 之結合物，其中該生理不穩定之連接子包含 2 至 5 個接連的磷酸二酯連接之核苷，例如 2 個接連的磷酸二酯連接之核苷或由其組成。
40. 根據實施例 29 至 39 中任一項之結合物，其中該結合物係選自由以下所組成之群組：
5'-GN2-C6
oc
oa
oA
sA
sT
sT
st
st
sa
sc
sa
st
sa
sc
st
sc
st
sg
sG
sT，
5'-GN2-C6
oc
oa
oA
sA
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st
st
st
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sc
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sa
sc
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sc
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sG
sG
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s mC，
5'-GN2-C6
oc
oa
o mC
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sa
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sa
st
sa
sa
sc
st
sT
sg
sa
sA
st
s mC
sT
s mC，及
5'-GN2-C6
oc
oa
oT
sT
sa
sc
sa
st
sa
sc
st
sc
st
sg
sg
st
s mC
sA
sA
sA
其中大寫字母代表 β-D-氧 LNA 核苷，小寫字母代表 DNA 核苷，其中每個 LNA 胞嘧啶為 5-甲基胞嘧啶，且
mc 為 5-甲基胞嘧啶 DNA，並且其中下標 s 代表硫代磷酸酯核苷鍵結，且下標 o 代表磷酸二酯核苷間鍵結，GN2-C6 為下式之殘基：
其中殘基 GN2-C6 在寡核苷酸 5’ 端經由磷酸二酯鍵結連接，並且/或其中 GN2-C6 為圖 5D1 或圖 5D2 之三價 N-乙醯基半乳胺糖 (GalNAc)，或兩者之混合物，更佳地，其中 GN2-C6 為圖 5D1 或圖 5D2 中描繪的三價 N-乙醯基半乳胺糖 (GalNAc) 殘基之混合物
41. 結合物如圖 1 所示。
42. 結合物如圖 2 所示。
43. 結合物如圖 3 所示。
44. 結合物如圖 4 所示。
45. 一種如實施例 1 至 28 中任一項之反義寡核苷酸的醫藥上可接受之鹽，或根據實施例 29 至 44 之結合物。
46. 一種醫藥組成物，其包含如實施例 1 至 28 中任一項之反義寡核苷酸、如實施例 29 至 44 中任一項之結合物或如實施例 45 之醫藥上可接受之鹽，以及一種醫藥上可接受之稀釋劑、溶劑、載劑、鹽及/或佐劑。
47. 一種用於在表現 RTEL1 之標靶細胞中調節 RTEL1 表現之活體內或活體外方法，該方法包含以有效量對該細胞投予如實施例 1 至 28 中任一項之反義寡核苷酸、如實施例 29 至 44 中任一項之結合物、如實施例 45 之醫藥上可接受之鹽或如實施例 46 之醫藥組成物。
48. 一種用於治療或預防疾病之方法，其包含對罹患或易患該疾病之個體投予治療或預防有效量的如實施例 1 至 28 中任一項之反義寡核苷酸、如實施例 29 至 44 中任一項之結合物、如實施例 45 之醫藥上可接受之鹽或如實施例 46 之醫藥組成物，其中該疾病為 B 型肝炎病毒 (HBV) 感染，例如慢性 HBV 感染。
49. 如實施例 1 至 28 中任一項之反義寡核苷酸、如實施例 29 至 44 中任一項之結合物、如實施例 45 之醫藥上可接受之鹽、或如實施例 46 之醫藥組成物，其用於醫藥中。
50. 如實施例 1 至 28 中任一項之反義寡核苷酸、如實施例 29 至 44 中任一項之結合物、如實施例 45 之醫藥上可接受之鹽或如實施例 46 之醫藥組成物，其用於治療或預防 B 型肝炎病毒 (HBV) 感染，例如慢性 HBV 感染。
51. 如實施例 1 至 28 中任一項之反義寡核苷酸、如實施例 29 至 44 中任一項之結合物、如實施例 45 之醫藥上可接受之鹽或如實施例 46 之醫藥組成物用於製備藥物的用途，該藥物用於治療或預防 B 型肝炎病毒 (HBV) 感染，例如慢性 HBV 感染。
實例
材料與方法
寡核苷酸合成
寡核苷酸合成已為此技術領域中所公知。以下為可採用的合成方式。本發明之寡核苷酸的製造方法可能在所用裝置、撐體及濃度方面略有差異。
在 Oligomaker 48 上，以 1 微莫耳刻度，透過亞磷醯胺法，於脲苷通用撐體上合成寡核苷酸。在合成結束時，於 60℃ 用氨水處理 5 至 16 小時，將該寡核苷酸自固體載體上切割。藉由逆相 HPLC (RP-HPLC) 或藉由固相萃取來純化寡核苷酸，並藉由 UPLC 進行特性分析，再藉由 ESI-MS 進一步確認分子質量。
使用 5’-O-DMT-保護之醯胺在乙腈中的 0.1 M 溶液以及 DCI (4,5–二氰基咪唑) 的乙腈 (0.25 M) 溶液做為活化劑，進行 β-氰基乙基-亞磷醯胺 (DNA-A(Bz)、DNA-G(ibu)、DNA-C(Bz)、DNA-T、LNA-5-甲基-C(Bz)、LNA-A(Bz)、LNA-G(dmf) 或 LNA-T) 之偶合。於最終循環時，可使用具有所需修飾的亞磷醯胺，所需修飾例如用以連附結合物基團的 C6 連接子，或結合物基團本身。為導入硫代磷酸酯鍵結，使用氫化黃原素 (0.01 莫耳於乙腈/吡啶 9:1) 執行硫醇化處理。可利用 0.02 莫耳的碘於 THF/吡啶/水 7:2:1 導入磷酸二酯鍵聯。其餘試劑為通常用於寡核苷酸合成者。
可於固相合成的最後循環使用經商購取得的 C6 胺基連接子亞磷醯胺來進行後固相合成接合，在脫保護及自撐體裂解後，便可分離出胺基連結脫保護寡核苷酸。接著使用標準合成方法，透過官能基團的活化來導入結合物。
使用製備型 RP-HPLC 在 Phenomenex Jupiter® C18 10µ 150x10 mm 管柱上對粗產化合物進行純化。使用 pH 為 8 的 0.1 M 乙酸銨及乙腈為緩衝液，流速為 5 mL/min。將蒐集而得的碎片凍乾以產生純化的化合物，其通常為白色固體狀。
縮寫：DCI：4,5-二氰基咪唑
DCM：二氯甲烷
DMF：二甲基甲醯胺
DMT：4,4’-二甲氧三苯甲基
THF：四氫呋喃
Bz：苯甲醯基
Ibu：異丁醯基
RP-HPLC：逆相高效液相層析法
原代人類肝細胞
(PXB-PHH)
從人源化小鼠 (uPA/SCID 小鼠) 中採集的新鮮原代人類肝細胞 (PXB-PHH) - 本文稱為 PHH - 以 96 孔形式從 PhoenixBio Co.，Ltd (日本) 獲得且在改良肝細胞選殖生長培養基 (dHCGM) 中培養。dHCGM 為一種 DMEM 培養基，其含有 100 U/ml 青黴素、100 μg/ml 鏈黴素、20 mM Hepes、44 mM NaHCO
3、15 μg/ml L-脯胺酸、0.25 μg/ml 胰島素、50 nM 地塞米松、5 ng/ml EGF、 0.1 mM Asc-2P、2% DMSO 及 10% FBS (Ishida 等人，2015)。
將細胞於具有 5% CO
2之加濕環境中於 37℃ 培養。除週末外，每 2 天更換一次培養基直至收穫。
HBV
感染及寡核苷酸治療
將 PHH 與 HBV (從慢性 B 型肝炎 (CHB) 個體中純化) 以 40 的感染複數 (MOI) 及 4% PEG 一起孵育 24 小時。次日去除病毒接種物，用 PBS 洗滌細胞 3 次，然後加入新鮮培養基。
為了建立 cccDNA，PHH 中的化合物治療在 HBV 感染後第 3 天開始。從 10 μM 開始，細胞以 1:10 稀釋階梯劑量反應方式投予。在 HBV 感染後第 3 天、第 5 天及第 7 天，在 dHCGM 培養基的最終體積為 100 μl/孔中，對細胞投予寡核苷酸化合物。10 nM 恩替卡韋 (ETV) 治療在感染後第 5 天開始，確保藉由 qPCR 進行真實 cccDNA 測量，並且每兩天 (週末除外) 更換包括 10 nM ETV 的培養基，直到在 HBV 感染後第 16 天收穫細胞。實驗以生物學三重複方式進行。
細胞內
RTEL1 RNA
的即時
PCR
使用 Qiagen BioRobot 通用系統及 RNeasy 96 孔提取平盤 (RNeasy 96 BioRobot 8000 套組 (12)/目錄號.II D：967152) 根據製造商之方案，從細胞中提取總 mRNA。在 ABI QuantStudio™ 12k Flex 上使用即時 PCR 分析 mRNA 表現水平。β-肌動蛋白 (ACT B) 係藉由 qPCR 使用 TaqMan Fast 高級預混液 (Life Technologies，目錄號 4444558) 以技術性二重複方式進行定量。RTEL1 基因之 qPCR 使用 Fast SYBR™ Green 預混液 (Life Technologies，Cat.No 4385612) 進行。結果歸一化至人類 ACT B 內源性對照。mRNA 表現係使用歸一化至參考基因 ACT B 及未處理之細胞的比較性循環閾值 2-ΔΔCt 方法進行分析。用於 ACTB RNA 及 RTEL1 RNA 定量之引子列述於表 7：
表 7: ACT B 及 RTEL1 RNA qPCR 引子
| 參數 | 方向 | 引子序列 | Seq ID No |
| RTEL1 | Fwd | 5’- CCATCCTGGACATTGAGGACT-3’ | 15 |
| Rev | 5’- CAGGTTCCGGGACAGGTAGTA-3’ | 16 | |
| 管家基因引子 ACT B (VIC)：Hs01060665_g1 (Thermo Fisher Scientific) |
HBV cccDNA
定量
使用 SDS 裂解緩衝液 (50 mM Tris pH8、5mM EDTA、1% SDS) 從 HBV 感染的原代人類肝細胞中提取 DNA。在 80 μl SDS 裂解緩衝液中裂解細胞後，將樣品在 -80℃ 冷凍至少 2 小時。樣品在 37℃ 解凍，向 96 孔平盤之每個孔中加入 1 μl 蛋白酶 K (目錄號 AM25448 @ Ambion biosciences，20 mg/mL 原料液)，樣品在 56℃ 孵育 30 分鐘。孵育後，加入 3 體積的來自 ZYMO Research Genomic DNA Clean & Concentrator 套組 (ZymoResearch，目錄號 D4067) 之 ChIP DNA 結合緩衝液，並按照製造商的方案純化 DNA。DNA 在 20 µl DNA 溶析緩衝液中溶析，並使用 2 µl DNA 進行 qPCR。
使用比較性循環閾值 2-ΔΔCt 方法以技術性二重複方式將 cccDNA 表現水平定量。在 QuantStudio 12K Flex PCR 系統 (Applied Biosystems) 上進行定量即時聚合酶連鎖反應測量。使用 Fast SYBR™ Green 預混液 (Life Technologies，Cat.No 4385612) 歸一化至粒線體 DNA (mitoDNA) 及作為內源對照的未處理之細胞。將循環儀設置調整為在 95℃ 孵育 5 分鐘，然後 45 個循環，每個循環為 95℃ 1 秒及 60℃ 35 秒。使用的引子列述於下表 8 中 (圖表中的所有探針皆為 SYBR Green)：
表 8：cccDNA qPCR 引子。
| 參數 | 方向 | 引子序列 | Seq ID No |
| cccDNA | Fwd | 5′- CGTCTGTGCCTTCTCATCTGC-3` | 17 |
| Rev | 5′- GCACAGCTTGGAGGCTTGAA -3′ | 18 | |
| 粒線體 DNA | Fwd | 5’- CCGTCTGAACTATCCTGCCC -3’ | 19 |
| Rev | 5’- GCCGTAGTCGGTGTACTCGT-3’ | 20 |
實例
1
：靶向
RTEL1
的反義寡核苷酸對
HBV
感染之
PHH
細胞中之
RTEL1 RNA
及
cccDNA
的影響。
使用來自表 6 之寡核苷酸化合物測試 RTEL1 敲低對 RTEL1 RNA 及 cccDNA 的影響。如材料與方法部分所述培養 PHH。如上所述，用來自表 6 之化合物處理 HBV 感染之 PHH 細胞。在 16 天的治療後，RTEL1 mRNA 及 cccDNA 係如上所述藉由 qPCR 測量。結果在表 9 中顯示為相對於平均無藥物對照 (NDC) 樣品的百分比 (亦即，值愈低，抑制/減少愈大)。
表 9：用 LNA ASO 敲低 RTEL1 後，對 cccDNA 的影響
| CMP 識別號 | SEQ ID NO | 化合物 | 相對於對照的 cccDNA 百分比 ( 平均值 ) | cccDNA SD | 相對於對照的 RTEL1 百分比 ( 平均值 ) | RTEL1 SD |
| 3_1 | 3 | AATTttacatactctgGT | 28 | 13 | 19 | 3 |
| 4_1 | 4 | AAttttacatactctGGTC | 3 | 1 | 24 | 2 |
| 5_1 | 5 | TTacatactctggtCAAA | 21 | 6 | 35 | 11 |
| 6_1 | 6 | CTttattataactTgaAtCTC | 39 | 5 | 21 | 8 |
對於化合物：大寫字母代表 LNA 核苷 (使用 β-D-氧 LNA 核苷)，所有 LNA 胞嘧啶皆為 5-甲基胞嘧啶，小寫字母代表 DNA 核苷。所有核苷間鍵結皆為硫代磷酸酯核苷間鍵結。
實例
2
：以濃度反應曲線測試不同濃度之人類
MDA-MB-231
細胞株中靶向
RTEL1 mRNA
的反義寡核苷酸的活體外功效。
人類 MDA-MB-231 細胞株係購自 ATCC，並按照供應商的建議保存在 37℃ 及具有 5% CO
2之加濕培養箱中。對於測定，將 3500 個細胞/孔在 96 孔平盤中接種在培養基中。在加入溶解在 PBS 中的寡核苷酸之前，將細胞培養 24 小時。寡核苷酸的最高篩選濃度：50 µM 及隨後分 8 步進行 1:1 稀釋。添加寡核苷酸後 3 天，收穫細胞。根據製造商的說明，使用 PureLink™ Pro 96 RNA 純化套組 (Thermo Fisher Scientific) 提取 RNA，並在50 µl 水中溶析。隨後用不含 DNase/RNase 的水 (Gibco) 將 RNA 稀釋 10 倍，並加熱至 90℃，保持一分鐘。
對於基因表現分析，在雙工設置中使用 qScript™ XLT 一步 RT-qPCR ToughMix®, Low ROX™ (Quantabio) 進行一步 RT-qPCR。以下 TaqMan 引子測定用於 qPCR：RTEL1_Hs00249668_m1 [FAM-MGB] 及內源性對照 GUSB_Hs99999908_m1 [VIC-MGB]。所有引子組皆購自 Thermo Fisher Scientific。IC50 測定係於 GraphPad Prism7.04 中從生物學重複 n=2 進行。用 50 μM 寡核苷酸處理時的相對 RTEL1 mRNA 含量在表 10 中顯示為相對於對照 (經 PBS 處理之樣品) 的百分比。
表 10：IC50 值及 Max K
D時的 mRNA 含量
| SEQ ID NO | 模體 | CMP 識別號 | 化合物 | MDA-MB-231 中之 IC 50 | SD | 在 MDA-MB-231 中之最大 KD 時 mRNA 含量 | SD |
| 3 | aattttacatactctggt | 3_1 | AATTttacatactctgGT | 0.6 | 0.1 | 38 | 1 |
| 4 | aattttacatactctggtc | 4_1 | AAttttacatactctGGTC | 0.3 | 0.1 | 14 | 1 |
| 5 | ttacatactctggtcaaa | 5_1 | TTacatactctggtCAAA | 0.9 | 0.3 | 9 | 4 |
| 6 | ctttattataacttgaatctc | 6_1 | CTttattataactTgaAtCTC | 0.4 | 0.1 | 18 | 3 |
如圖 7 中提供的人類細胞株 MDA-MB-231 中之濃度反應曲線所示，該等化合物對人類 RTEL1 mRNA 的敲低顯示出非常好的功效及效力。
實例
3
：本發明化合物與先前技術化合物之活體內功效的直接比較
在該實驗中，將本發明的化合物 (CMP ID NO: 3_1、CMP ID NO: 4_1、5_1 及 CMP ID NO: 6_1，參見例如表 6) 與 WO 2020/011902 A1 中揭露之化合物進行比較。所測試之先前技術化合物如表 11 所示 (CMP ID NO: 7_1 至 CMP ID NO: 23_1)。具體而言，測試了對人類 MDA-MB-231 細胞中 RTEL1 mRNA 含量的影響。
人類 MDA-MB-231 細胞株係購自 ATCC，並按照供應商的建議保存在 37℃ 及具有 5% CO
2的加濕培養箱中。對於測定，將 3500 個細胞/孔在 96 孔平盤中接種在培養基中。在加入溶解在 PBS 中的寡核苷酸之前，將細胞培養 24 小時。寡核苷酸的最高篩選濃度：50 µM 及隨後分 8 步進行 1:1 稀釋。添加寡核苷酸後 3 天，收穫細胞。根據製造商的說明，使用 PureLink™ Pro 96 RNA 純化套組 (Thermo Fisher Scientific) 提取 RNA，並在50 µl 水中溶析。隨後用不含 DNase/RNase 的水 (Gibco) 將 RNA 稀釋 10 倍，並加熱至 90℃，保持一分鐘。
對於基因表現分析，在雙工設置中使用 qScript™ XLT 一步 RT-qPCR ToughMix®, Low ROX™ (Quantabio) 進行一步 RT-qPCR。以下 TaqMan 引子測定用於 qPCR：RTEL1_Hs00249668_m1 [FAM-MGB] 及內源性對照 GUSB_Hs99999908_m1 [VIC-MGB]。所有引子組皆購自 Thermo Fisher Scientific。IC50 測定係於 GraphPad Prism7.04 中從生物學重複 n=2 進行。用 50 μM 寡核苷酸處理時的相對 RTEL1 mRNA 含量在表 11 中顯示為相對於對照 (經 PBS 處理之樣品) 的百分比。結果亦顯示於圖 8。
表 11：IC50 值及 Max K
D時的 mRNA 含量
| CMP 識別編號 | SEQ ID NO | 化合物 | MDA-MB-231 中之 IC 50 | 在 MDA-MB-231 中之最大 KD 時 mRNA 含量 |
| 3_1 | 3 | AATTttacatactctgGT | 0.7 | 32 |
| 4_1 | 4 | AAttttacatactctGGTC | 0.2 | 6 |
| 5_1 | 5 | TTacatactctggtCAAA | 0.9 | 9 |
| 6_1 | 6 | CTttattataactTgaAtCTC | 0.2 | 7 |
| 7_1 | 21 | GAattttacatactctGGT | 0.6 | 15 |
| 8_1 | 22 | GAAttttacatactctgGTC | 0.3 | 8 |
| 9_1 | 23 | CAAaaaacagtaggTCC | 2.0 | 18 |
| 10_1 | 24 | Gagggaggtggag mcgTT | - | 55 |
| 11_1 | 25 | AGCTttattataacttgaAT | - | 55 |
| 12_1 | 26 | TTttacatactctggtCAAA | 0.8 | 17 |
| 13_1 | 27 | TTTtacatactctggTCA | 0.4 | 4 |
| 14_1 | 28 | GAgaattttacatactcTGG | 0.6 | 16 |
| 15_1 | 29 | GCatccaacaagtaattGT | - | 35 |
| 16_1 | 30 | GgtgggtggatgTTTC | 0.8 | 32 |
| 17_1 | 31 | GgtggtgtggagaAGC | - | 52 |
| 18_1 | 32 | GGCatccaacaagtaaTT | 2.1 | 22 |
| 19_1 | 33 | GGaataaaacagtaGGTC | 0.5 | 18 |
| 20_1 | 34 | GCcattttcactgtCAA | 0.3 | 7 |
| 21_1 | 35 | GTGcagaagtcagaacaAA | 0.9 | 26 |
| 22_1 | 36 | CAAAatgcccttacagtGA | 0.3 | 6 |
| 23_1 | 37 | GGAataaaacagtaGGT | 0.2 | 13 |
實例
4
：以
100 nM
濃度在
HepG2
及
3T3
細胞中篩選反義寡核苷酸凋亡蛋白酶
(Caspase) 24
小時。
在該實驗中，藉由在 HepG2 細胞中之凋亡蛋白酶篩選來評估本發明之化合物 (CMP ID NO: 3_1、CMP ID NO: 4_1、5_1 及 CMP ID NO: 6_1，參見例如表 6) 之毒性。實例 3 中測試之先前技術化合物包括在該研究中。再者，分析了全長 CMP ID NO: 3_1 及 CMP ID NO: 5_1 的較短代謝物 (更多細節參見實例 6)。
HepG2 或 3T3 細胞係於大約70% 融合在具有 GlutaMax (Gibco #41090；HepG2) 之 MEM 培養基中培養或在具有 Glutamax (Gibco #31966) 之 DMEM 培養基中連同 5 mM HEPES (3T3) 培養，該等培養基添加有 10% 熱滅活胎牛血清。用 0.25% 胰蛋白酶-EDTA 溶液 (Gibco #25200056) 分離細胞，並且以 1 x 10
4個細胞/孔 (HepG2) 或 0.25x 10
4個細胞/孔 (3T3) 之密度接種於黑色透明 96 孔平盤 (Corning #3904, NY, USA) 中。使用溶解在 Opti-MEM (Gibco #31985) 中的 100 nM 寡核苷酸，用 Lipofectamine 2000 (Life Technologies #11668019) 瞬時轉染接種後 24 小時的細胞。使用 Caspase-Glo® 3/7 測定 (Promega Corporation, Madison WI, USA) 確定 Caspase-3/7 活性。將重構之 Caspase-Glo® 3/7 試劑添加到轉染後 24 小時的細胞中，孵育 60 分鐘，將細胞裂解物轉移到不透明的 96 孔平盤 (Corning #3600, NY, USA) 中，然後根據製造商的說明，在 Enspire 多模式平盤分析儀 (Perkin Elmer) 上測定發光。
結果顯示於表 12 中。
表 12：凋亡蛋白酶評分之結果
| CMP-ID | SEQ ID NO | 化合物 | HepG2 中之凋亡蛋白酶 (% AW) | 3T3 中之凋亡蛋白酶 (% AW) |
| 3_1 | 3 | AATTttacatactctgGT | -4 | 20 |
| 3_1-1 | 38 | AATTttacatactctgG | -5 | 11 |
| 3_1-2 | 39 | AATTttacatactctg | -6 | 3 |
| 4_1 | 4 | AAttttacatactctGGTC | 32 | 23 |
| 5_1 | 5 | TTacatactctggtCAAA | 8 | 29 |
| 5_1-1 | 40 | TTacatactctggtCAA | 8 | 30 |
| 5_1-2 | 41 | TTacatactctggtCA | 0 | 13 |
| 6_1 | 6 | CTttattataactTgaAtCTC | 6 | 22 |
| 7_1 | 21 | GAattttacatactctGGT | 2 | 26 |
| 8_1 | 22 | GAAttttacatactctgGTC | 11 | 35 |
| 9_1 | 23 | CAAaaaacagtaggTCC | 2 | 26 |
| 10_1 | 24 | Gagggaggtggag mcgTT | 11 | -7 |
| 11_1 | 25 | AGCTttattataacttgaAT | 5 | 47 |
| 12_1 | 26 | TTttacatactctggtCAAA | 23 | 72 |
| 13_1 | 27 | TTTtacatactctggTCA | 33 | 47 |
| 14_1 | 28 | GAgaattttacatactcTGG | 13 | 44 |
| 15_1 | 29 | GCatccaacaagtaattGT | 53 | 102 |
| 16_1 | 30 | GgtgggtggatgTTTC | 114 | 12 |
| 17_1 | 31 | GgtggtgtggagaAGC | 110 | 80 |
| 18_1 | 32 | GGCatccaacaagtaaTT | 94 | 144 |
| 19_1 | 33 | GGaataaaacagtaGGTC | 44 | 73 |
| 20_1 | 34 | GCcattttcactgtCAA | 59 | 23 |
| 21_1 | 35 | GTGcagaagtcagaacaAA | 20 | 69 |
| 22_1 | 36 | CAAAatgcccttacagtGA | 143 | 44 |
| 23_1 | 37 | GGAataaaacagtaGGT | 70 | 51 |
具有超過 60% AW 值的化合物視為有毒 (T)。具有 40-60% AW 值的化合物視為具有中度毒性 (MT)。具有 20-40% AW 值的化合物視為具有輕度毒性 (M)。具有低於 20% AW 值的化合物視為無毒 (NT)
由於可在表 12 推導得出，化合物 CMP ID NO: 11_1 (MT)、CMP ID NO: 12_1 (T)、CMP ID NO: 13_1 (MT)、CMP ID NO: 14_1 (MT)、CMP ID NO: 15_1 (T)、CMP ID NO: 16_1 (T)、CMP ID NO: 17_1 (T)、CMP ID NO: 18_1 (T)、CMP ID NO: 19_1 (T)、CMP ID NO: 20_1 (MT)、CMP ID NO: 21_1、CMP ID NO: 22_1 及 CMP ID NO: 23_1 顯示具有中度毒性 (MT) 或有毒 (T)，故取消選擇該等化合物進行進一步分析。
實例
5
：以濃度反應曲線測試不同濃度之人類
MDA-MB-231
細胞株中靶向
RTEL1 mRNA
的全長反義寡核苷酸及其代謝物的活體外功效。
已知反義寡核苷酸在細胞中代謝。在本實驗中，測試了全長寡核苷酸及其等之
3' 端代謝物 (亦即 n-1、n-2、n-3、n-4、n-5 及 n-6) 的減少 RTEL1 mRNA 標靶的活體外效力。
人類 MDA-MB-231 細胞株係購自 ATCC，並按照供應商的建議保存在 37℃ 及具有 5% CO
2的加濕培養箱中。對於測定，將 3500 個細胞/孔在 96 孔平盤中接種在培養基中。在加入溶解在 PBS 中的寡核苷酸之前，將細胞培養 24 小時。寡核苷酸的最高篩選濃度：50 µM 及隨後分 8 步進行稀釋。添加寡核苷酸後 3 天，收穫細胞。根據製造商的說明，使用 PureLink™ Pro 96 RNA 純化套組 (Thermo Fisher Scientific) 提取 RNA，並在50 µl 水中溶析。隨後用不含 DNase/RNase 的水 (Gibco) 將 RNA 稀釋 10 倍，並加熱至 90℃，保持一分鐘。
對於基因表現分析，在雙工設置中使用 qScript™ XLT 一步 RT-qPCR ToughMix®, Low ROX™ (Quantabio) 進行一步 RT-qPCR。以下 TaqMan 引子測定用於 qPCR：RTEL1_ Hs01548056_m1 [FAM-MGB] 及內源性對照 GUSB_Hs99999908_m1 [VIC-MGB]。所有引子組皆購自 Thermo Fisher Scientific。相對 RTEL1 mRNA 含量顯示為相對於對照 (經 PBS 處理的樣品) 之百分比，及使用 GraphPad Prism7.04 測定 IC
50。
結果顯示於圖 9 及表 13 中
表 13：全長寡核苷酸及其代謝物的活體外效力
| CMP-ID | SEQ ID NO | 化合物 | MDA-MB-231 中之 IC 50 [µM] | MDA-MB-231 中 50 µM 時的 RTEL1 mRNA 含量 (%) |
| 5_1 | 5 | TTacatactctggtCAAA | 0.6 | 2 |
| 5_1-1 | 40 | TTacatactctggtCAA | 0.4 | 3 |
| 5_1-2 | 41 | TTacatactctggtCA | 0.7 | 3 |
| 5_1-3 | 42 | TTacatactctggtC | 2.5 | 13 |
| 5_1-4 | 43 | TTacatactctggt | - | 33 |
| 5_1-5 | 44 | TTacatactctgg | - | 33 |
| 5_1-6 | 45 | TTacatactctg | - | 72 |
| 7_1 | 21 | GAattttacatactctGGT | 0.4 | 3 |
| 7_1-1 | 46 | GAattttacatactctGG | 1.0 | 11 |
| 7_1-2 | 47 | GAattttacatactcTG | - | 62 |
| 7_1-3 | 48 | GAattttacatactcT | - | 72 |
| 7_1-4 | 49 | GAattttacatactc | - | 72 |
| 7_1-5 | 50 | GAattttacatact | - | 79 |
| 7_1-6 | 51 | GAattttacatac | - | 84 |
| 8_1 | 22 | GAAttttacatactctgGTC | 0.1 | 3 |
| 8_1-1 | 52 | GAAttttacatactctgGT | 1.4 | 16 |
| 8_1-2 | 53 | GAAttttacatactctgG | 3.1 | 34 |
| 8_1-3 | 54 | GAAttttacatactctg | - | 68 |
| 8_1-4 | 55 | GAAttttacatactct | - | 67 |
| 8_1-5 | 56 | GAAttttacatactc | - | 68 |
| 8_1-6 | 57 | GAAttttacatact | 77 | |
| 9_1 | 23 | CAAaaaacagtaggTCC | 1.2 | 11 |
| 9_1-1 | 58 | CAAaaaacagtaggTC | - | 64 |
| 9_1-2 | 59 | CAAaaaacagtaggT | - | 73 |
| 9_1-3 | 60 | CAAaaaacagtagg | - | 68 |
| 9_1-4 | 61 | CAAaaaacagtag | - | 78 |
| 9_1-5 | 62 | CAAaaaacagta | - | 83 |
| 9_1-6 | 63 | CAAaaaacagt | - | 79 |
| 10_1 | 24 | Gagggaggtggag mcgTT | - | 46 |
| 10_1-1 | 64 | Gagggaggtggag mcgT | - | 38 |
| 10_1-2 | 65 | Gagggaggtggag mcg | - | 39 |
| 10_1-3 | 66 | Gagggaggtggag mc | - | 34 |
| 10_1-4 | 67 | Gagggaggtggag | - | 47 |
| 10_1-5 | 68 | Gagggaggtgga | - | 51 |
| 10_1-6 | 69 | Gagggaggtgg | - | 54 |
如可自表 13 及圖 9a 推導得出，全長寡核苷酸 CMP 5_1 的 IC
50為 0.6 µM。有利地，第一及第二代謝物 (CMP 5_1-1 及 CMP 5_1-2) 在進一步代謝物 (n-3 至 n-6) 顯示以最大功效及效力降低之前，保持相似的標靶敲低活性，IC
50分別為 0.4 µM 及 0.7 µM。對於所有其他化合物，與其等各自之全長序列化合物相比，n-1 及 n-2 代謝物已經顯示出效力及/或最大效力的顯著損失。
實例
6
：
CMP 5_1-GalNAc
反義寡核苷酸的活體內研究
研究時間表
該研究在 HBV 感染之 PXB-mice® (一種具有穩定人類肝細胞移植 (PhoenixBio) 的嵌合小鼠模型) 中運行總計 77 天，分為 3 組 (媒液、CMPD3_1_GalNAc、CMPD5_1_GalNAc)，每組 20 隻動物。每週使用 10 mg/kg 化合物或等效體積之媒液對動物給藥。在第 28 天及第 56 天分別犧牲每組 5 隻動物。其餘動物在第 77 天犧牲，然後對動物的肝臟進行生物分析。研究方案顯示於圖 10 中。
方法與材料
用於 CMP 3_1 及 CMP 5_1 之 GalNAc 結合物藉由本領域已知之方法產生 (參見例如 Javanbakh 等人 Liver-Targeted Anti-HBV Single-Stranded Oligonucleotides with Locked Nucleic Acid Potently Reduce HBV Gene Expression In Vivo. Mol Ther Nucleic Acids. 2018 Jun 1;11:441-454. doi: 10.1016/j.omtn.2018.02.005. Epub 2018 Feb 23. PMID: 29858079; PMCID: PMC5992345)。所產生之結合物分別如圖 1 劑圖 4 所示。
動物及處置
HBV 基因型 C 感染的人類肝嵌合 uPA/SCID 小鼠 (PXB 小鼠；供體肝細胞 BD195 (Corning Incorporated)) 購自 PhoenixBio Co, Ltd。動物處置由位於日本東廣島的 PhoenixBio Co, Ltd. 現場完成。選擇在給藥開始 (第 0 天) 時為至少 20 週齡、在給藥開始前一天 (第 -1 天) 測定之體重為 18 g 或更大的雄性小鼠用於研究。小鼠在給藥開始前至少 6 週已經感染 HBV 基因型 C (編號：PBB004，批號：180118，PhoenixBio Co., Ltd.) 並在第 -7 天顯示血清 HBV-DNA 含量 ＞ 1x10
6複本/ml，如藉由 qPCR 所測定。基於體重的算術平均值以及血液 h-Alb 濃度及血清 HBV-DNA 濃度的幾何平均值，在第-1 天確定研究開始時的組隨機化。
10 mg/kg 的所有劑量皆基於在給藥日投予前取得之小鼠個體的體重計算。在第 0、7、14、28、35、42、49、56、63 及 70 天，使用帶有永久連接針頭的一次性 1.0 mL 注射器 (Terumo Corporation)，將劑量調配物注射到所有受試小鼠上背部的頸部皮下組織中。
在各自的犧牲日，用異氟醚麻醉標靶動物並藉由心臟穿刺及放血犧牲。提取肝臟並將左側葉分成大約 100 mg 的塊。記錄準確的重量，並將肝臟樣品在液氮中速凍並儲存在 -80℃，直到進一步處理。
根據需要，犧牲具有垂死徵象或體重減輕 ＞ 20％ 之初始體重的動物。所有過早終止/發現死亡的動物以及犧牲時具有胸腺瘤/淋巴瘤的小鼠皆排除在分析之外。
RTEL1 mRNA
表現的定量
將肝組織樣品冷凍直至在 MagNA Pure LC RNA 分離組織裂解緩衝液 (產品號 03604721001，Roche) 中裂解，然後根據用戶手冊，使用 MagNA Pure 96 細胞 RNA 大體積套組 (產品號 05467535001，Roche) 在 MagNA Pure 96 儀器 (Roche) 上繼續提取 RNA，並且用水調整 RNA 濃度。
對於基因表現分析，使用 qScript™ XLT 一步 RT-qPCR ToughMix®, Low ROX™ (Quantabio) 進行一步 RT-qPCR。以下 TaqMan 引子測定用於 qPCR：Hs01548056_m1；Hs00249680_m1；Hs00249668_m1 及參考基因 GAPDH_Hs99999905_m1；PGK1_Hs99999906_m1 及 GUSB_Hs99999908_m1。所有引子組皆購自 Thermo Fisher Scientific。相對 mRNA 表現水平顯示為相對於食鹽水處理之對照組的百分比。
結果顯示於圖 11。分析顯示，使用每週給藥 10 mg/kg 的 CMP3_1_GalNAc，敲低效率為大約 80%；使用每週給藥 10 mg/kg 的 CMP5_1_GalNAc，敲低效率為約 95%。
實例
7
：原代人類肝細胞的活體外研究
方法與材料
細胞培養基
藉由膠原酶灌注法從具有人源化肝臟的嵌合尿激酶型胞漿素原活化物/嚴重合併性免疫缺失 (uPA/SCID) 小鼠中分離的原代人類肝細胞 (PHH) 獲自 PhoenixBio (日本廣島)。PHH 以每孔 7 × 10
4個細胞的濃度在第 I 型膠原蛋白包被之 96 孔平盤上接種在改良之肝細胞選殖生長培養基 (dHCGM) 中。dHCGM 為一種 DMEM 培養基，其含有 100 U/ml 青黴素、100 μg/ml 鏈黴素、20 mM Hepes、44 mM NaHCO
3、15 μg/ml L-脯胺酸、0.25 μg/ml 胰島素、50 nM 地塞米松、5 ng/ml EGF、 0.1 mM Asc-2P、2% DMSO 及 10% FBS (Ishida 等人, 2015)。
將細胞於具有 5% CO
2之加濕環境中於 37℃ 培養。除週末外，每 2 天更換一次培養基直至收穫。
然後將感染複數 (MOI) 為 40 的 HBV 基因型 C 添加到 96 孔平盤中的細胞中，最終濃度為 4% PEG 8000 (Sigma-Aldrich)。感染的細胞在 37℃ 孵育 20 小時，然後用 PBS 洗滌兩次以去除 HBV 接種物並且用完全培養基重新填充。在感染後第 4 天，用不同濃度的 LNA 處理細胞。在感染後第 6 天及第 8 天用新的 LNA 更換培養基。磷酸鹽緩衝生理食鹽水 (PBS) 用作「無藥物」對照 (NDC)。在感染後第 19 天收穫上清液及細胞，並用於 HBV 標記及標靶基因敲低分析。
根據製造商的方案，使用細胞計數套組 8 (Sigma-Aldrich) 評估 LNA 的細胞毒性，並表示為相對於 NDC 的細胞毒性百分比。
RNA
提取及即時定量
PCR
根據製造商的方案，使用 MagNA Pure 96 機器人及 MagNA Pure 96 細胞 RNA 大體積套組 (Roche) 從細胞中提取細胞內 mRNA。使用 QuantStudio 12K Flex (Life Technologies)，使用 TaqMan RNA-to-Ct 1 步套組 (Applied Biosystems，#4392938)，以技術性二重複方式進行相對總 HBV、RTEL1、pgRNA 及 β-葡萄醣醛酸酶 (GusB) 內源性對照 mRNA 的定量。mRNA 表現係使用歸一化至參考基因 GusB 及無藥物對照的比較性循環閾值 2-ΔΔCt 方法進行分析。TaqMan 引子及測定 ID 如下：RTEL1、Hs02568623_s1；總 HBV RNA Pa03453406_s1；HBV pgRNA AILJKX5。作為參考基因 GusB，使用 Hs00939627_m1。所有引子及探針組皆購自 ThermoFisher。
25 µM 反義寡核苷酸的結果顯示在表 14 中，該表尤其包括有關細胞之細胞毒性及 RTEL1 mRNA 敲低的資訊。CMP10_1 顯示出高細胞毒性及在靶向 RTEL1 mRNA 方面的不良功效。此外，CMP9_1 顯示第二差的 RTEL1 mRNA 敲低，57% 的 RTEL1 mRNA 剩餘。
表
14
：原代人類肝細胞的活體外研究
(25 µM
反義寡核苷酸
)
| LNA @25 µM | 細胞毒性百分比 | 相對於 NDC 的 RTEL1 mRNA 百分比 | 相對於 NDC 的 pgRNA 百分比 | 相對於 NDC 的 總 HBV-RNA 百分比 |
| 5_1 | 4 | 17 | 70 | 72 |
| 5_1_GalNAc | 5 | 15 | 57 | 46 |
| 7_1 | 1 | 24 | 83 | 76 |
| 8_1 | 3 | 13 | 74 | 81 |
| 9_1 | 2 | 57 | 103 | 94 |
| 10_1 | 30 | 101 | 61 | 53 |
5 µM 反義寡核苷酸之結果顯示於表 15。CMP10_1 顯示在靶向 RTEL1 mRNA 方面的不良功效。此外，CMP9_1 再次顯示第二差的 RTEL1 mRNA 敲低，79% 的 RTEL1 mRNA 剩餘。
表
15
：原代人類肝細胞的活體外研究
(5 µM
反義寡核苷酸
)
| LNA@5 µM | 細胞毒性百分比 | 相對於 NDC 的 RTEL1 mRNA 百分比 | 相對於 NDC 的 pgRNA 百分比 | 相對於 NDC 的 總 HBV-RNA 百分比 |
| 5_1 | 4 | 47 | 77 | 80 |
| 5_1_GalNAc | 2 | 29 | 62 | 72 |
| 7_1 | 0 | 40 | 84 | 92 |
| 8_1 | 1 | 28 | 78 | 101 |
| 9_1 | -1 | 79 | 146 | 130 |
| 10_1 | -4 | 106 | 175 | 116 |
實例
8
：
CMP5_1-GalNAc
概念的活體內驗證
研究時間表
該研究在 HBV 感染的 PXB-mice® (一種具有穩定人類肝細胞移植 (PhoenixBio) 的嵌合小鼠模型) 中進行，小鼠在第 56 天及第 105 天犧牲。CMP5_1-GalNac 在進行 8 次 5、10 及 20 mg/kg 每週給藥後 (第 56 天，參見圖 12) 評估。此外，CMP5_1-GalNac 還在進行 15 次 10 mg/kg 每週給藥後 (第 105 天) 評估。對於每個組，有一個單獨的媒液對照小組接受與治療動物相同體積的媒液。在研究開始時，所有組的小鼠數目為 6 隻。對動物的肝臟進行生物分析。
方法與材料
動物及處置
HBV 基因型 C 感染的人類肝嵌合 uPA/SCID 小鼠 (PXB 小鼠；供體肝細胞 BD195 (Corning Incorporated)) 購自 PhoenixBio Co, Ltd。動物處置由日本宇土的 LSIM Safety Institute Corporation 完成。選擇在給藥開始 (第 0 天) 時為至少 25 週齡、在給藥開始前一天 (第 -1 天) 測定之體重為 18 g 或更大的雄性小鼠用於研究。小鼠在給藥開始前至少 6 週已經感染 HBV 基因型 C (編號：PBB004，批號：180118，PhoenixBio Co., Ltd.) 並在第 -7 天顯示血清 HBV-DNA 含量 ＞ 1x10
6複本/ml，如藉由 qPCR 所測定。在研究開始時，在第 -1 天基於體重以及血液 h-Alb 濃度及血清 HBV-DNA 濃度進行分層隨機化。
所有劑量皆基於在給藥日投予前取得之小鼠個體的體重計算。所有受試小鼠皆接受將劑量調配物或匹配的媒液注射到上背部的頸部皮下組織中。第 56 天犧牲的動物在第 0、7、14、21、28、35、42 及 49 天注射 (參見圖 12)。20 mg/kg/週的劑量以 10 mg/kg 的兩次連續注射給予，以避免嵌合肝臟中的 ASGPR 過載。因此，此等小鼠在第 0、1、7、8、14、15、21、22、28、29、35、36、42、43、49 及 50 天給藥。在第 105 天犧牲的動物在第 0、7、14、21、28、35、42、49、56、63、70、77、84、91 及 98 天使用帶有永久連接針頭的一次性 1.0 mL 注射器 (Terumo Corporation) 投予 10mg/kg (參見圖 12)。
在各自的犧牲日，用異氟醚麻醉標靶動物並藉由心臟穿刺及放血犧牲。提取肝臟並將左側葉分成大約 100 mg 的塊。記錄準確的重量，並將肝臟樣品在液氮中速凍並儲存在 -80℃，直到進一步處理。
根據需要，犧牲具有垂死徵象或體重減輕 ＞ 20％ 之初始體重的動物。所有過早終止/發現死亡的動物以及犧牲時具有胸腺瘤/淋巴瘤的小鼠皆排除在分析之外。
藉由南方墨點分析測定
cccDNA
將肝組織冷凍直至在 DNA 提取緩衝液 (50 mM Tris pH8、5 mM EDTA、150 mM NaCl、1% SDS) 中均質化。提取物首先在環境溫度用 RNase 混合液 (ThermoFisher) 消化 30 分鐘，然後在輕微攪拌下在 56℃ 用蛋白酶 K (ThermoFisher) 消化 2 小時。藉由離心沉澱碎片，並藉由與 1 體積超純緩衝液飽和苯酚 (ThermoFisher) 一起搖晃三次從上清液中提取 DNA，然後用 1 體積的苯酚:氯仿:異戊醇 (25:24:1；ThermoFisher) 提取。然後藉由在-20℃ 添加 1 體積的 100% 乙醇及 60 mM (最終) NaAc (SigmaAldrich) 隔夜來沉澱 DNA。然後藉由離心沉澱 DNA，用 70% 乙醇洗滌沉澱並風乾，然後再懸浮在 10 mM Tris-HCl pH8 (ThermoFisher) 中。
使用 NanoDrop (ThermoFisher) 定量 DNA 含量，並將濃度歸一化至 1.5 µg/µl。然後將 30 µg DNA 用 70 U T5 核酸外切酶 (New England Biolabs) 在 1x CutSmart 緩衝液 (New England Biolabs) 中於 37℃ 消化 2 小時。對於每個樣品，等體積與 Blue Juice 裝載緩衝液 (ThermoFisher) 混合並裝載至 0.95% 瓊脂糖-TAE 凝膠 (SigmaAldrich) 上。在每組 (生物) 樣品之間，添加 1 個裝載有 DNA 分子量標記 VII (Roche) 的泳道 (每個泳道中的量相同)。分離後，將凝膠轉移到新鮮的 0.2 M HCl (Acros Organics) 中 10 分鐘，然後用水沖洗三次。隨後，將凝膠於變性緩衝液 (0.5 M NaOH、1.5 M NaCl) 中放置 30 分鐘並用水沖洗一次。接下來，將凝膠轉移到中和緩衝液 (0.5 M Tris pH7.5，1.5 M NaCl) 中 30 分鐘。最後，凝膠用 20x SSC 緩衝液 (ThermoFisher) 平衡 30 分鐘。然後根據製造商的說明，使用 TurboBlotter 套組 (Cytiva) 將 DNA 轉移到 Hybond-XL 膜 (Cytiva) 上，使用 20x SSC 緩衝液 (ThermoFisher) 進行隔夜轉移。轉移後，藉由使用 1800 J UV 輻射將 DNA 交聯到膜上，然後乾燥膜。
對於 HBV cccDNA 之特異性偵測，根據製造商的說明，將 DIG 核酸偵測套組與 DIG EasyHyb 緩衝液及 DIG 洗滌與封閉緩衝液組 (所有皆來自 Roche) 一起使用。根據製造商的說明，使用 DIG PCR 探針套組 (Roche) 藉由 PCR 生成探針。含有 HBV 基因型 C 基因體之質體用作模板，具有以下引子：正向，GTTTTTCACCTCTGCCTAATCATC (SEQ ID NO: 70)；反向，GCAAAAAGTTGCATGGTGCTGGT (SEQ ID NO: 71)。
使用在 100℃ 變性 5 分鐘的探針進行雜交，然後快速冷卻至 4℃ 在 37℃ 隔夜。根據製造商的說明進行清洗及偵測。使用 FUSION FX 系統 (Vilber) 獲取圖像，該系統設置適當的曝光時間以偵測媒液對照樣品中的 cccDNA。為進行分析，使用 ImageStudio 軟體 (Licor) 對 cccDNA 條帶 (2.1 kB 大小) 進行定量。為了解釋不均勻的轉移，還對 DNA 分子量標記 VII 的 2.8 kB 條帶定量，並且將 cccDNA 條帶強度歸一化至構成該組的兩個條帶的平均強度。然後將各個值歸一化為媒液對照組的平均條帶強度。
RTEL1 mRNA
分析
將肝組織樣品冷凍直至在 MagNA Pure LC RNA 分離組織裂解緩衝液 (產品號 03604721001，Roche) 中裂解，然後根據用戶手冊，使用 MagNA Pure 96 細胞 RNA 大體積套組 (產品號 05467535001，Roche) 在 MagNA Pure 96 儀器 (Roche) 上繼續提取 RNA，並且用水調整 RNA 濃度。
對於基因表現分析，使用 qScript™ XLT 一步 RT-qPCR ToughMix®, Low ROX™ (Quantabio) 進行一步 RT-qPCR。以下 TaqMan 引子測定用於 qPCR：Hs01548056_m1；Hs00249680_m1；Hs00249668_m1 及參考基因 GAPDH_Hs99999905_m1；PGK1_Hs99999906_m1 及 GUSB_Hs99999908_m1。所有引子組皆購自 Thermo Fisher Scientific。相對 mRNA 表現水平顯示為相對於食鹽水處理之對照組的百分比。
圖 13A 顯示每週給藥 CMP5_1-GalNAc，持續 105 天的實例，使 RTEL1 mRNA 減少至約 15%，且 cccDNA 減少至約 20%
圖 13B 顯示每週給藥 5、10 及 20 mg/kg CMP5_1-GalNac 後，在第 56 天，RTEL1 mRNA 的敲低分別為 87%、91% 及 97%。對於 10 及 20 mg/kg CMP5_1-GalNac，cccDNA 分別減少 59% 及 73%。
結論：從上述實例可以看出，CMP ID 5_1
展示了一種安全有效的化合物，其可在活體內及活體外靶向
RTEL1 mRNA。我們在此已經展示了 CMP ID_5_1 的良好活體外藥物特性曲線，並且我們已經展示了 RTEL1
之標靶可以在活體內非常有效地參與隨後的病毒 cccDNA 減少。此外，我們已經利用 B 型肝炎感染的人源化小鼠模型證明，藉由下調 RTEL1 mRNA，可以對病毒 cccDNA 產生顯著的劑量依賴性影響。化合物 5_1 還具有從 3’ 末端降解後保持活性的特性。這意味著從 3' 端開始的 n-1 及 n-2 與全長 CMP ID_5_1
相比具有可比較的活體外效力。n-3 降解還保留了對 RTEL1 的活性，儘管活體外效力較低。由於母體分子的代謝物仍然對 RTEL1 mRNA 產生所希望的影響，因此該特徵為該分子帶來了明顯的益處。
圖 1化合物 3_1 (SEQ ID NO: 3) 經由經磷酸二酯連接之 DNA 二核苷酸與三價 GalNAc 部分結合
圖 1A化合物 3_1 (SEQ ID NO:3) 之殘基 A
圖 2化合物 4_1 (SEQ ID NO: 4) 經由經磷酸二酯連接之 DNA 二核苷酸與三價 GalNAc 部分結合
圖 2A化合物 4_1 (SEQ ID NO:4) 之殘基 A
圖 3化合物 6_1 (SEQ ID NO: 6) 經由經磷酸二酯連接之 DNA 二核苷酸與三價 GalNAc 部分結合
圖 3A化合物 6_1 (SEQ ID NO:6) 之殘基 A
圖 4化合物 5_1 (SEQ ID NO: 5) 經由經磷酸二酯連接之 DNA 二核苷酸與三價 GalNAc 部分結合
圖 4A化合物 5_1 (SEQ ID NO:5) 之殘基 A
圖 5圖 5A1 至圖 5L2 說明示例性 GalNAc 部分。圖5L1 及圖 5L2 中之化合物由單體 GalNAc 磷醯亞胺組成，X 為 S 或 O，Y 為 S 或 O，且 n = 1 至 3 (參見 WO 2017/178656)，其添加到寡核苷酸中但同時仍在固相支持物上作為合成的一部分。圖5B1 及圖 5B2 以及圖5D1 及 5D2 在本文中亦分別稱為 GalNAc2 或 GN2，分別不具有及具有 C6 連接子。
圖 6圖 6 A1-L2：說明示例性反義寡核苷酸結合物，其中該寡核苷酸由如上所述之術語「A」表示。圖 6A1-D2 中之化合物包含二-離胺酸支鏈分子、PEG3 間隔子及三個末端 GalNAc 碳水化合物部分。在圖 6A (圖 6A-1 及圖 6A-2 顯示同一化合物之兩種不同非鏡像異構物) 及圖 6B (圖 6B-1 及圖 6B-2 顯示同一化合物之兩種不同非鏡像異構物) 之化合物中，寡核苷酸直接連接至去唾液酸糖蛋白受體靶向結合物部分，不具有烷基連接子。在圖 6C (圖 6C-1 及圖 6C-2 顯示同一化合物之兩種不同非鏡像異構物) 及圖 6D (圖 6D-1 及圖 6D-2 顯示同一化合物之兩種不同非鏡像異構物) 之化合物中，寡核苷酸經由 C6 連接子連接至去唾液酸糖蛋白受體靶向結合物部分。圖 6E-J 中之化合物包含可商業獲得之三分支分子以及不同長度及結構之間隔子以及三個末端 GalNAc 碳水化合物部分。圖6L1 及圖 6L2 中之化合物由單體 GalNAc 磷醯亞胺組成，其中 X = S 或 O，且獨立地，Y = S 或 O，且 n = 1 至 3 (參見 WO 2017/178656)，其添加到寡核苷酸中但同時仍在固相支持物上作為合成的一部分。
圖 7 ：在活體外測試寡核苷酸
CMP ID No 3_1、CMP ID No 4_1、CMP ID No 5_1 及 CMP ID No 6_1 在人類細胞系 MDA-MB-231 中的濃度依賴性效力及功效。
圖 8 ：在活體外測試寡核苷酸 CMP ID No 3_1、CMP ID No 4_1、CMP ID No 5_1 及 CMP ID No 6_1
以及先前技術化合物 (CMP ID No 7_1 至 CMP ID No 23_1) 在人類細胞系 MDA-MB-231 中的濃度依賴性效力及功效。
圖 9 ：在活體外測試寡核苷酸反義分子及其較短之代謝物在人類細胞系 MDA-MB-231
中的濃度依賴性效力及功效。
A) CMP ID 5_1，
B)CMP ID 7_1，
C)CMP ID 8_1，
D)CMP ID 9_1，
E)CMP ID 10_1。
圖 10 ：對用 GalNAc 結合之 CMP ID 5_1
治療的小鼠進行活體內分析之研究方案
圖 11 ：來自用 GalNAc 結合之寡核苷酸反義 CMP ID No 3_1 及 CMP ID No 5_1 治療的 PXB 小鼠之肝臟組織中的 RTEL1 mRNA 含量
圖 12 ：對用 GalNAc 結合之 CMP ID 5_1 治療的
HBV 感染之 PXB 小鼠進行活體內分析之研究方案。
圖 13 ：來自用 GalNAc 結合之 CMP ID 5_1 及對照治療的 HBV 感染之 PXB 小鼠之肝臟組織中的RTEL1 mRNA 含量及 HBV cccDNA 含量：
A) 第 105 天，
B)第 56 天。
<![CDATA[<110> 瑞士商赫孚孟拉羅股份公司 (F. Hoffmann-La Roche AG)]]>
<![CDATA[<120> 用於抑制 RTEL1 表現之增強型寡核苷酸]]>
<![CDATA[<130> P35909]]>
<![CDATA[<160> 71 ]]>
<![CDATA[<170> PatentIn 3.5 版]]>
<![CDATA[<210> 1]]>
<![CDATA[<211> 38444]]>
<![CDATA[<212> DNA]]>
<![CDATA[<213> 智人]]>
<![CDATA[<400> 1]]>
agtcagccct gctgccagcc agtgccgggt gctggggact cagggaggcc cgccgggacc 60
actgcgggac agtgagccga gcagaagctg gaacgcagga gaggaaggag agggggcggt 120
cagggctctc aggagccggg tcctgggcaa ggcgcagccg ttttcaaatt ttcaggaaag 180
cggtcggctc acactcgagc agtaaaaaga tgcctctggg gaggaggccc gtgcagctct 240
ccgggcaatg gtggtggctc ggcctagaga ggcggtagtg gaacgcagac cctggtgggg 300
gaatgacatc aagggaggag acgggcggga ccccagattt ctgcctgtgg gcgatggaag 360
tgaggttcac tggccagcgg agccggacac agaacgcgca aaacgccgtg taggcctgga 420
ggagccgaag agcaggcgga ccccctccgc gggggaacag tttccgccgg gagcacaaag 480
caacggaccg gaagtggggg gcggaagtgc agtgggctca gcgccgactg cgcgcctctg 540
cccgcgaaaa ctctgagctg gctgacagct ggggacgggt ggcggccctc gactggagtc 600
ggttgagttc ctgagggacc ccggttctgg aaggttcgcc gcggagacaa gtgagcagtg 660
agtcgcagtg accctacaag tggttctttt acccgagcgg ctcgtaggcg cgttgcggtt 720
tttcgaaact acagctcccg gcaggcccca agccgccctc ggggccgcgg gtcggcggat 780
tggccgcgct gcattttggg acctgtagtt tcctgcgctc gtggcgctgg cgccgcggcg 840
ttggctgagc ccttgaccgg ggctggaggg aagggccgac attcagtgtg tccgcgtctg 900
ttctgttagt cccagttccc gggcgggatt gaggcttaga gaagttgagt gatttgctga 960
gggctgcacg ggttggcatc ccggcatgct ctttcgctac tttggctgca tctggttgcc 1020
cacccgggcg gatggggaat ggactccagc cagccaggag ggcagagggc tggagaggca 1080
gggccggagg ttcagaccct ccgctctgac gttgcgcctg gtgaggccgg gaggggtgcc 1140
gcttgcctct tcagccctca cgctcttgtg gaagtcgcgg aattactgca ggcggaactt 1200
gcagcactgt gggcgtcttt tccagagaag gacggagttg tggggcggga ggataaggca 1260
aggcccagcc acttcgcatc ttcgccccgc cagctcctcg agatgggata taccagggtt 1320
gctctccaac cctctccgca ggagggactg atggaaacgc ctgggaaagt agcccggtac 1380
ccacaaaggc tgtctacaaa cagagtctta ctgtctttcc caggtctgtg ccatagggat 1440
tctcgaagag aacagcgttg tgtcccagtg cacatgctcg catcgcttac caggagtgcc 1500
cgagacccta agatgttcgg agtggttttt tcgcacagac ccgaatagcc tgcccctcag 1560
ccacgctctg tgcccttctg agaacaggct gatatgccca agatagtcct gaatggtgtg 1620
accgtagact tccctttcca gccctacaaa tgccaacagg agtacatgac caaggtcctg 1680
gaatgtctgc agcaggtaga gcacaggccc cgaggaaagg actgcgggtg ggtggagctt 1740
cagccaggac ggggtgtgct tccctctccc ggcccattcc agccaggccc ctccgggcca 1800
gaggcagcgt ctgtcataaa aagggctggt gttccaggtg gggtcagaga gaggattgac 1860
aagtaaaaac gatcgtcctt tgaagggggc cggcccctcc acacctgtgg gtatttctca 1920
tcaggcggga cgagagactg agaaaatgaa taagacacag agacaaagta tagagagaaa 1980
agtgggccca ggggaccggc gctcagcata cagaggacct gcaccggcac cagtctctga 2040
gtttcctcag tattcattaa ttactatttt cactatctca gcaagaggaa tgcggcagga 2100
cagcaaggtg atagtgggga gaaggtcagc aagaaaacgt gagcaaagga atctgggtca 2160
caaataagtt caagggaagg tactatgcct ggatgtgcac gtaggctagt tttatgcttt 2220
tctccaccca aacatctcgg tggagtaaag agtaacagag cagcattgct gccaatatgt 2280
ctcgcctcct gccacagggc ggcttttctc ctatctcaga attgaacaaa tgtacaatcg 2340
ggttttatac cgaaacattc agttcccagg ggcaggcagg agacagtggc cttcctctat 2400
ctcgactgca agaggctttc ctcttttact aatcctcagc acagaccctt cacgggtgtt 2460
gggctggggg actgtcaggt ctttcccatc ccacgaggcc atatttcaga ctatcacatg 2520
gagagaaacc ttgggcaata cccggctttc cagggcagag gtccctgcgg ctttccgcag 2580
tgcatcgtgc ccctggttta tcgagactgg agaatggcga tgacttttac caagcatact 2640
gcctgtaaac atattgttaa caaggcacgt tctgcacagc tctagatccc ttaaaccttg 2700
attccataca acacatgttt ctgtgagctc aaggctgggg caaagttaca gattaacagc 2760
atcttagggc aaagcaattg ttcagggtac aggtcaaaat ggagtgtgtt atgtcttccc 2820
tttctacata gacacagtaa cagtctgatc tctcttttcc ctacagtcct tgagggtgac 2880
agacttagga gtgccttggg ggcctctctg aggagcagct gatattcacg ggtcaggagg 2940
aagcatttcc attagagggg cagccggtgg ccagcctcac ttggaaggtc tttgaacctc 3000
gggggtgcag ggaggtggca gtggtgcagg ttgccttctc ctgggttcct tgaggtgccc 3060
tcttgtaccc ggctcacacc cttcccctcc ccgagtttcc tgctcaggtt cccgtctgag 3120
agcttgtatg taggacgtca gataggacag cataaatgtt tggatccaga aacgcagaac 3180
agtttcctat tttgagactt gacacctaat tagtcatctt actatttaag ctgaaaaata 3240
gtgtcgtgtt ttgggtaacg ttctgcaaat cgtttgctaa tggcggctga gttgcttcac 3300
gccctttagg gcaagagtgg gacttgcctg tggacttctc cgcggtccca cagggctctc 3360
gccacctggc agtggcctct gcatctgcaa agagctgccc gctggctgcc gaagcttgtc 3420
tcagggcagc ttgtgtggcc tcgcctcttc ctggcttccc cgtaaccctt gctccgaact 3480
ccgttcagaa ggtgaatggc atcctggaga gccctacggg tacagggaag acgctgtgcc 3540
tgctgtgcac cacgctggcc tggcgagaac acctccgaga cggcatctct gcccgcaaga 3600
ttgccgagag ggcgcaagga gagcttttcc cggatcgggc cttgtcatcc tggggcaacg 3660
ctgctgctgc tgctggagac cccataggtg accctagttc ccaggcctct cctggcctcc 3720
tgtggggatg gttggcaagg gatggcgctg agggtggggt gggcccatgg ggactcctgc 3780
cgtctctcaa gcagaactca aggagaattt tttagctgct gtataatttc tcgccatcgt 3840
gggtgtaaac ctagggttgg gcttttttgc tgaattaggg cacggcagat gcccacttca 3900
cccatttttg ataaaccagt atctggggtg tcagattctt ggctgtctgc agggccgagt 3960
tagccgaatg ccacctgcct ttgatacgtg agaacgttgt ctgagaaccg tgacttctgt 4020
gcttgcttgt gtctggtcag cttgctacac ggacatccca aagattattt acgcctccag 4080
gacccactcg caactcacac aggtcatcaa cgagcttcgg aacacctcct accggtgggt 4140
cagacgagtt tacacctgtc tcggggtcct caagagaacc agcttggcat ggtgctgagt 4200
ccacagcccc atgctgtgct gtggtggagg gtggtggtct ttctagacgc tcccccgaag 4260
tgtgcagagc gctggtgccc aggggtgggg tgcggcctgg gctgcctcca atgcccatta 4320
cttgtgagga agcagctttg catctgtgtg ctgaccttgg gcgggcgtcc tgagctcctc 4380
gcaggtgctg ttgtagcagc tgtgcagtag gtcagggctg gcccccagtg cagctttgca 4440
catgaagtag gaggaggccc tgctgcttgt cagagcccag cagagtcttg gtgttctgtc 4500
gggttcctgt ggccggacca gtggcagggt gctgtggaag ctgtcgaatc tcctccctct 4560
gtccagtacc cccgctcgtc ttctagctcc ctcctacgcc cgggccacgt ttcagttatg 4620
ctcacttcct ctgaccgccg aggctcctgc gtgtctccat acagctcacg ctgcagggcc 4680
acgctgtggg tgttggagac agctcctcct cgacccacgg tgctctctcc caccaggcct 4740
aaggtgtgtg tgctgggctc ccgggagcag ctgtgcatcc atcctgaggt gaagaaacaa 4800
gagagtaacc atctacaggt aggctcctgg gctcccgctc cggctcagtg tccgacaggc 4860
gagtgctgct gggtgtccag agccccaggc tgcgctcccg ctgggctagg gtttgaagtt 4920
cactggggga ctgcagggga ggacctggtg ggggtgggga ctggcttcgg tcctttcttg 4980
gccgtgcttc agctgcgcac tctgcccttc ctcccacaga tccacttgtg ccgtaagaag 5040
gtggcaagtc gctcctgtca tttctacaac aacgtagaag gtacaagcag ctgggtggga 5100
ccagggtcgg gttggagtgt gtgcagcctc tcagggtgga gctcagtggt gtcacagcct 5160
ggttgtgctt gcccggtggg gcggccagtg cggccatgta cctgggccct gtcttctgac 5220
tcggggccac ccatgttaga cttctgtgtg gaagagctca cacagtggtc tgagacagcc 5280
agccggcaag actgcctctg gctggtgcct ggggccttgg attttgggaa ggctccctcc 5340
atttcctgat gagagggtct ccctgcacct aacctgctgg tgcaaacagt aggggttttg 5400
ctgaacaccg gctttctctt cggggacttt gttgcttgcc cagcagcagg tgctccagtg 5460
accggccctc ataccatctt gggagggtgt cctggaagcc gtgtctggcc tcccgcgacc 5520
ctgccccgtg tgtctttttc ctgtgctgac cttgctgcgg aaaattatgg ccctgagtgt 5580
gactccaggc tgagtcctgt gggtccaaca cgggatgcct tggggcctct tctggagacg 5640
ggatgtgagt gacaggagcc ggccggggca gcttgccctg tgactgcacg tggccacagc 5700
ctgtgagggc cgggggtgct tctccaccca cgtggctgcc cctcgggtat gtcaagggct 5760
tctggggctc atcacggggt cctagagaca gtggcagggt gcacccccgt tggctgccct 5820
tacagtttct gtgacctgag ggtggcatct gtgcagtcgg cgcggtctgt gcttctgtgg 5880
gatcagggtt ccctctgttt cctgcctcag ttggggctca agcctcaggt gaggtggccc 5940
cggagcactc agaaggcatc ggcggtcctg tgggctgctt tctgcactca cgtttgctga 6000
gtgctcagtg tgccaggact gaggaccctg aagctgctct tgtatttagg gcggcgctcc 6060
cctggcagag actgagccag gtggtcccgc atgacccact accaggcgtt tctgggccct 6120
ggcccttgga gggacagggt gggcggaaca tgggcctgca gggaggctcc cgcttactgg 6180
aggcatgtgc tgtgttgctg gagacatcct ctgtgttgct tcttgttcgc tgtggttttt 6240
ggtctggtgg caccaaggac cctcagtcat cttgatgtgt ggttgtccag gcctttttgt 6300
tggtcctaag aaggggctct gcctttgtgc ccccaggttc cctgacagga gctgccggct 6360
cgtcccggtg atgcctgcag gacgtgactc tgggacgggg ggttgggcag atgtgctgat 6420
ggaaattctc aagcaggcgt catttccgag gtcctcacct ggatttccag gacaggagtg 6480
cctgctgggt gtccccagtc ccatgcagcg ggggtccttg ggatagcatg gaacgctgag 6540
catgggcctg gccggccgtg gtcctggaca agggcagtgc cccggtggct gctgggcctg 6600
ggacctggtg gggacgctgg gcctggtacc tggtggggat gctgggcctg ggacctggtg 6660
gggaggcctc tgactgcctc ctggtgctgc ttccgtctgt gttaggcctc tgggtattgg 6720
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ccctgcctgt cccccttggc ttgggctctc actgcccgac ctggcgggag gttgcctagc 6840
cgtgaacctt cgcaccctgt ctgccaccgg acaggctgtg agggggtgtc tgcagcacct 6900
gcaccggcct gagcatcttc agagtgggct gcagctcctg gaggggtctg agaggaaggg 6960
aggcaggtat tttgggcgaa tgaggagaca gctggagagc tggcaccctt cctggcctgc 7020
gtcctgtgag gactctggtt ggggacagca agcttggggt cagcctgggg cagagcctct 7080
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gtctgttgct atggtgctgc ccaggggtgt gcttttcctc ccctgccttc cctgctatcc 7260
ctgggagtat ctggggttgg gtcatcgctg gtgtgtgtga gtgtgtgtgt gtgtgtatgt 7320
gcacgtgtgc atatgtgtgc gcttctggcc tctgcagctg agtcctggcc ctcggggggc 7380
ctggcacctc ctggggacag gcacaaagca gccatgatgg agtcgggagc tgggggaggc 7440
cccattgccc cacgtggctg ccctgtgact ctggggtgct tgttagaaga ggtatctggt 7500
tctgtctgtg tttaagcaac tccctaagga attcttgtgg ttccagtttg gggggcctgt 7560
actgtagagg caagggaggg gcaggacatc ccccagactc tgacttctga agccttttct 7620
gcccggggcc tctccgccag tacaggcagt gtcctttgcc agggctgcca tgctgcagag 7680
gggagtgggc cactgtttag cccaggaaaa cctggctctc ccttagctgg aagttctggg 7740
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tttgtgggag atgcctctgt gggttggggc gataggctga ggggctgttc ttccctgccc 7860
tgaggagggc tgagtgtagc cgccactcct gtcctgtctt gggctgtctc ggagaggatg 7920
cgtagaaccc tcgggatcct gctggcctcc gtctggtcca ccctgaacct caggccttct 7980
gggggcagag gaggattccc tcaggatcac tcgggtgggg gcctctcttg ggcacctgag 8040
accctcagtg ggtgctttgt ggcgcgttca cggttggtgg gggacgccca gccctgcccg 8100
ccgtgtagga gccgttctgt cctgggcatc cccctgtggt ctgggactta gtggaccctg 8160
agggtgtgtg tttacccctg cctcacacct gcagaaaaaa gcctggagca ggagctggcc 8220
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tcagtgaggc cacgaccact gtccttccat ggcccagctc tcctgtgacc tgtggaggcc 8340
cggatatatt tcttcacttt tctttgttcc tttttaaatt atgaaactaa ccaccattca 8400
gtacgaaaaa gtttaagcag ctctgaggaa gatagagtaa aaaattgtct ccctcttccc 8460
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ggacagcaga tgtctcctat gtctacctct tacagcttca gagattcaag ttataataaa 8700
gctcttctta tattgagggg gaaacctccc tccccctttt ttttgaaaca gggtctcgct 8760
ctgctaccca ggctgcagtg cagtgtcaca gtcttggctc actgcagcct cagcctccca 8820
ggctcaagcg attttcccac ctcagcctcc caagtagccg ggactgcagg cacacaccac 8880
catgcctggt taatttttgt attttttgta cagacagggt ctcactctgt tgctcaggcc 8940
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ccaccacgtc tggctaattt tctgtatttt tagtagagac ggggtttcac cgtgttagcc 9240
aggatggtct cgatcttctg accttgtgat ccgcccacct cggcctccca aagtgctggg 9300
attacaggag tgagccaccg cgcccggccc agctctgctt tttcttagtg gttctgcgtt 9360
gtgtttgttt ctatccagga atagggttgg ttttactttt ccatcgagtt tttaaagaga 9420
cgacgattta catggtcgga aactcacgag gactccccat cccttggtcg gaaactcaca 9480
tggactcccc atcccttggt cagaaactca cgtggactcc catccatccc aggcagcagc 9540
ttcccacctg ggccctacgt gcaggatgag ggctccttcc gggtcagaag acatggcggc 9600
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gatcagcagg cctgggtggg aggactcacc tctgtcactg ggcaggggct caacctggcc 9900
agacacactt gtgagcagcc ccaggccaca ggtcagtttt ctgagcagtc tgggagcggg 9960
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acccacacgc atgtggtcat tgtttttttt ttcagttgga atctcactct gtcacccagg 11220
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cttaactctt gttttaccct gtataaacct aaatgtaaaa gctaaactaa aagttataga 11520
aaggaacatg ggggaggtct ttgcaacttt ggggtaggca gagatttctt agtatggata 11580
cacaaggcac tagccatgaa gaaaaacatt aaaatttaga cttcaccaaa atttaaagct 11640
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ctttcaaagg acttaaaaaa ttttttcagc cctcctctga tttgaaagga cctttgacca 11760
gagtatgtaa aattctccca taactaagca aacaacccac ttaaccactg ggaagggatc 11820
tggacagacg tttcaccaag atgggtggaa tggccagtta accactggga gagcatccgg 11880
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gtttcgccaa gatgggtgga atggccagtt aaccactggg agagcatccg gacagacgtt 12060
tcgccaagat gggtggaatg gccagttaac cactgggaga gcatccggac agacgtttcg 12120
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gtggaatggc cagttaacca ctgggagagc atccggacag acgtttcgcc aagatgggtg 12360
gaatggccag ttaaccactg ggagagcatc cggacagacg tttcgccaag atgggtggaa 12420
tggccagtta accactggga gagcatccgg acagacgttt cgccaagatg ggtggaatgg 12480
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gttaaccact gggagagcat ccggacagac gtttcgccaa gatgggtgga atggccagtt 12600
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tcagtggctc acgcctgtaa tcccagaact ttaggggcca aggctggggg atcgcttaag 12960
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cactaacagc agccacgggc gtggactgtg gtcacacagc agcagggagc cgatgagtct 13200
cggacatgct aacccagaga ggcccattga ggaggaccta ctgttttttg tgtttttgtt 13260
ttttgttttg aaatggagtc tcgctctgtg gtgcaggctg gagtgcagtg gtgtggtctt 13320
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ttgtgtcctg accccggcgg ttgtggcctc tttgctgtct gggagtcagg atttttcaca 19320
ctcatgtcct gctccagacc tggaatcagc caagtctcca agaagccctg ctttcttttc 19380
ctgcaagacg gtatttcaag acccgccatg cggcagcggg ttggtcatgg ttactgggtt 19440
ggtcgttgtt actgggtgtt ttcgtggaga tacagccata cgcacaggtg tgttcacaaa 19500
tgttaattct aaaggtcaaa cacccggcca ggcataaggg ctcagcggta atcccagcac 19560
tttgggagac caagactggt ggatcacctg aggtcaggag tttaagacca gcctgagcaa 19620
cagggtgaaa ccccatctct actaaaaatg cgaaaattag ccgggcatgg tggcgcacac 19680
ctatagtccc agctagtcgg gagacagaca cgagaattgc ttgaacctgg gacatggagg 19740
ttgcagtgag cagagatggc gctgctgcac ccctgcctgg gtgacagagt gacaccctgt 19800
ctcaaaaatg aatagataaa taaagataaa acacctgctc ctcttggtgt ctccagtttg 19860
gatttggcct gtgtagcctc ttccttcgcc tgttggtgga tttggcctgc acggattctg 19920
tgtggcctct tccttcccct gttggtggat ttggcctgca cggattctgt gtggcctctt 19980
ccttcccctg ttggtggatt tggcctgcac ggattctgtg tggcctcttc cttcccctgt 20040
tggtggattt ggcctgcacg gattctgtgt ggcctcttcc ttcccctgtt ggtggatttg 20100
gcctgcacgg attctgtgtg gcctcttcct tcccctgttg gtggatttgg cctgcacgga 20160
ttctgtgtgg cctcttcctt cccatgttgg tggatttggc ctgcatggat tctgtgtggc 20220
ctcttccttt ccatgttggt gtcctttttt ccatgccagg aatcctggtt ctcaagggcg 20280
gggttgttgg cacgagcgtg atgcagactg cctttgctgc ctttctcttg cccagggctg 20340
aacatggagc tggaagacat tgcaaagctg aagagtaagt gttgccctcc ccgcctcctt 20400
gcagctgggt ggggcctcct ccttgcgagg aggtgggtga cacctcctcg acccacagtg 20460
atcctgctgc gcctggaggg ggccatcgat gctgttgagc tgcctggaga cgacagcggt 20520
gtcaccaagc cagggaggtg agaggcgggg agccagcccc ttcactgcag gcccagccta 20580
gagctagaaa cgggccatgg tgcagtcctg ggctgtcaca tcacgagtga ggcctgtttt 20640
caggcctgtt ttcccttttt gagacctggg aggagcacct gctttgcatg atctggttgc 20700
tgagatgttg agaggagcag cacacactcc cacgggacag cacacagccc cccacggaac 20760
ggcacacaca cccatggaac agcacacaca ctcccacgaa cagcacacac actcccacga 20820
acagcacaca cactcccacg gaacagcaca cacacccacg gaacggcaca cacacccacg 20880
gaacagcaca cacactccca cggaacagca cacacaccca cggaacggca cacactccca 20940
cggaacggca cactctccca cggaacagca cactctccca cggaacagca cacacactcc 21000
cacggaacag cacacacacc cacggaacgg cacacactcc cacggaacag cagactctcc 21060
cacggaacag cacacacact cccacagaca gcacacacac acccacggaa cagcacactc 21120
tcccacgcgg ggccgctggg tttcctgcag tttctcctcc tccaggcctt tccctggacc 21180
ctggtccagt ccgtcatttg agcacaggtg cctgttagaa cgagaccttc ttgttaggac 21240
gatgagtgtc ccagccacca cctcttttgg actccgggag gcctggaacg ttctgaacgc 21300
tccgtggggc tccagtcttc tccgcagcca gggcagcagg gtttgctgtc tgtcctgcag 21360
gcagatgagg agtcagggct ggggcctgtg tgggggctct cctgagcgca cagccgccga 21420
ggtggagcgt gttctgcctg agcgccgacc tggtcggggg aatcccagtt gcttccaggt 21480
ggagccactg tcctcagcgt aatgctcaag gctctggcct ggctcctcgg ccaccctgca 21540
ccctcagggt cccctcctgt agcttctgct gccccatcac tgtcactctc caaagctttg 21600
gggactctgc ccagagccac cgcctcccag aagcccctga caacctcttg acgaccccct 21660
agtgacccca tccctcccct ctgacggcgg cccctgctct gaggcggctt cttttcctcg 21720
gtgctgttct cgtgctggcc aggcctcctc tccccacctg gaggctcctg agggcggagg 21780
cctctcacct ccaatgctgg cgtcccctgg agggctgaat ttgtttccga gggaaggaaa 21840
cttccacagt tgttgccttc agttccaaag ctgcagcctg atttccccct ccaggctcga 21900
gcctgttttc ttctcggcag ctacatcttt gaccagtgtc gtcccccctc aggcccgagc 21960
ctgccttctt ctcctcagtt cccaaagctg cagtctggtc cccccgccag gctcgagcct 22020
gccttcttct cctcggcagc tacatctttg agctgtttgc tgaagcccag atcacgtttc 22080
agaccaaggg ctgcatcctg gactcgctgg accagatcat ccagcacctg gcaggacgtg 22140
agtgctggca cggggtcttt ggtgcgggca aatgtggcgt agggggtgca gcaggcctcc 22200
atcttggcag tcagggctcc cctggccgtc acctggccgt cagcaggaac aggcccacag 22260
aacctcatct tctgatcggg gcgtggaggc gttagtgcca cttgccagct gccgtagagc 22320
ctgtcccagt tctgcagctg gcggcttcgt cctacagcct catcccatta ttctgctttt 22380
gagaaagagc agcccaaggc cctagctggc ttgtggggcc tctggcttct ccacaccacc 22440
ccgagttctg cttctcagag ttgtggggtc cagaggcttt gcccagaggc ggtgtcccca 22500
tgggctgctc tggtttgaga cgccgggccc agcggggtct ctcctctgct gcgctcccgg 22560
gtgctgggga gggtggcttt tgctgcttca acccttaggc gaccatagag cctcttttca 22620
agtcccactg acccccttgg agactctgtc cctgcctggc ttctctcctg gctgctggga 22680
agagcaggcg aactgcccgc cctgaatgga tgctgcgctc caccctgggc cccccattgg 22740
gcaggagatg gagcttggca gtcgggctga gcgggctcat gctggaaggg ccggggctgg 22800
ggtcggggcc tcccctgcct gcagtgtggg tgtcagcgcc ctgctgccct ccaggtgctg 22860
gagtgttcac caacacggcc ggactgcaga agctggcgga cattatccag gtggggcctg 22920
ctcctctgtg gcatctcctt ccctgatgga agccgggcgg gtgccttctc ctgctgtatt 22980
agttaactga ttctagactt ggggatggga gaaaggcccc tacaccacct gtttctgatt 23040
ggcaaactct cggctccttt ccagtgccct aaacccacac tgggcctcct gcagggatgg 23100
gggaggacga ggtctggtgg cacatgccca gggtgatgct ggtgagggag gacgcaaagg 23160
acagtggggg ccggggagcc gctcctgccc tgtccgggcc ctcaggccag gggggaccca 23220
ctgctggcag ccccagcagc cccagctgca cgcagatgaa gagctctgga cacacgcggc 23280
ttcctgaaca gcttctccag ggacagacaa atggggaccc tgcaggttcc cggcaggggt 23340
gtccctggga gcccatgatt gggggtgcga ccctggcccc cttctcattg gccccgtcct 23400
gtcctgcaat gcccgtccca tgtgaggtct gcttctggct ccatgcctat ggcagcacct 23460
gctttccctg gcgtagaggt gcttgtccgg tttgtggagg gcacgcccca ttttgggtgc 23520
tctgggcacg ttgcctctcc ggggcctcgg tggctttttt agaagcagac tcagaagtcc 23580
ctgactgggg aagccaaggc acaggtggct gtgtggagcc ctgtgaggcc tcctctgtgc 23640
tgcccacgct gtacctgctg gccacacgag atcatggcag ggttaggcag ggctgcccag 23700
cgctatgaca gcttcatgag tgtccatctg gcctgtgggg tgcttgagct gggggaggcc 23760
gcagaagaac cctgggatgc atggctggcc tgtgcatgct gctgggcatg gagctgcaga 23820
tcccggaaca agcaggcact gccttctcct tcacagacgc agctctgagc gggggcgaga 23880
cctgggcagg gaccaggtgg ggtgggcaca gggtggtggg gcccaggctc agccctccct 23940
ccactgtggc cgtctctgtg gccagtgacg ccacagcctg tgtcttctct gtgcggtagc 24000
tggggctgga aggacagcac tgccttgtcc tcccaactcc tccccaaagg cacggtgggc 24060
atcccaggcc cagacccctc tgtctgtggc tcctgcctgc caagggctgc tgtgctgtcc 24120
cgcatggagt gtggttggct cttcaagcag gaggccgtgc acctatcagg cggacctgct 24180
tccatgtccc tgatgggtca ctgcaaagca cctccagcac atggccaggc gaggtagccc 24240
tgcagcccag ggcctggagg gcaggtgtga gctggcccgg gcctgtccct ccctggaata 24300
cagcttccca ggctcccact tatggagaag tctcctccac actatggaac tgaatcctag 24360
aatgtggctt ctgaggttcc tacactcgaa ctgaatcctg gaatgcggct tccaaggctt 24420
ccagctatgg agaagactcc acactctgga accgaatcct ggaacgcggc ctcccaggcc 24480
cccagctatg gagaagactc cacactctgg aaccgaatcc tggaacgcgg cctcccaggc 24540
ccccagctat ggagaagact ccacactctg gaaccggatc ctggaacgcg gcctcccagc 24600
ctcccactta aggagaagtc tccacactct ggaaccggat cctggaacgt ggcctcccag 24660
gcccccactt aaggagaaga ctccacactc tggaaccgaa tcctgcacac tccatcggtt 24720
tggaatttcc tttggctgct gctctaagta gccgctggtg gatgactcag cttctgccag 24780
ccctcgggtg cctggaggat gagggactgc acacagtgct cacccgcgtt ggctcctgag 24840
cccctgcagg tgtgggcggt gcccataggg ctggtgctgg gttgggcctg cagccctgag 24900
tcacaggtga ccctgggggc agagtggggc cagtggcccc aggaagagga tgtgggatgc 24960
acagctcagc tggaggcgaa ctccaggcag ggtcaggccg tgtgctcgga agtcagggct 25020
tagctggagg caaactctgg gcagtgctgg cccgtgttgg ggaaccagtt gcccctgggc 25080
ccccgtgaga ctgctgggtc ctcatccctc tctgcctgag gccggagctg ccctgggctg 25140
aggcacaggg ggatttgtgg tggtgttttt ttgagaaagg gtctcgcttt gtcaccccgg 25200
ctggagtgca ggggcttgat cacagctcac tgcagcctca acctcctggg cccaagtgat 25260
cctcttgcct cagccacccg aggagctgtg aacacaggtg tgcaccaccg cactcagcta 25320
atttttaaaa tttttttgta gagatgaggt cttgccatgt ttcccaggct ggtctcaaac 25380
tcctgggctc aggcagtctg cccgccttgg cctcccaaag tgctgggatt acaggcaaga 25440
gcttccatgc ctgcccagca gaaggctttt cgaaggaagc tgtttcctga ggcagactca 25500
gccctgctca tggcagccac cagcgtgggg gtgaacttgt tctgttactt ccatccccgt 25560
gggccaaatg ctttggtaaa acacaaggcc ctgtgtttag ctgtcttgac agtgaaaatg 25620
gctgggaagg aaggaaggaa cggaaggaaa tttctctctc cttctgtgcg tacccaggca 25680
cgtgcacatg catgcagagt acgcacacac gcacgcacgc ctgcacaaat ccacgcatgt 25740
tgccaagtct ctgtgttcca gccgtggtgt ctgccccccg gtgttctcta gttcggcttc 25800
tccgcatttc tgtgaatgat tccggcttct tggtgttccc agcagaactc cctcaagtct 25860
gcggcggggc tctgacggcg gtggcttggc tgacatggcc acattgctga gcctgttggg 25920
ggctttgcgt tcctgttctg gccgtttttg gctcgttttc caggaacggt cgtcacgcgc 25980
tcctctccta gtgcaggcat cattcctttc ccattgattt gcagggttct ctgtaagttc 26040
tgaggatccc atatacatat actctctgta agttctgagg atcccatata catattctct 26100
ctctaagttc tgaggatccc atatacatat tctctctcta agttctgagg atcccatgcc 26160
gacatacata ttctttcctt gtctcatgct ggtcattttt tccattttca tgacaggttt 26220
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ctaaaccggg tcttgtgtat tctccaaact gcactgtaga gtgacggagc tttgtgtctg 26340
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tcctggtgtt ggcctgaacc aatttctttt tgtttgtttt tgagacagag ttttgctctt 26580
gttgcccagg ctggagtgca gtggcgcgat ctcggctcac tgcaagctcc gcctcccggg 26640
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ggtgtgagcc accacgcccg gcctcttgtt cttttgaaac ctgccctgac gttttttcca 27000
tagtgcatct tggagtcagc gtgtctactt cctgtaaaaa tcttactgtg attttgacta 27060
gaatgtgttg aattcctgtt ttttttttga gtcagggtct ctctgttgcc caggctggag 27120
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tttttttttt tttttggtga acaccctggg gttgcaccat gttgcccagg ctggtctcga 27300
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gagccactgc actaggccat gttgaatttc tagattaatt tggggccctc aggggcacag 27420
agaggagggc tgggccagtt ggcgggagga gaggcccctc gggctgccgc attttcagtg 27480
catggagatg gcctatgttg ggggaacaca gagctcaccg ggggtccctg cagggaggag 27540
aaagggtcag gcaggtgcca gctcctgtcc attggcctgg ggctgcatga tggcaggggc 27600
cggtgaaccg atgacccctg ggtgtcctgt gaccttctgt gtatgcggct gatgctgcag 27660
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tcagtgtgga cccctccgag ggcagccctg gttccccagc agggctgggg gccttacagt 27780
cctataaggt aggggccacc tccaggaggc aggtggaggg cagcccttgt tccccggcag 27840
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gggtcttctg gtcctaaaag gtaaggggct gcccccagga catgggcggg gcctccacac 27960
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gcccagccgt ggatctcctg cccccatggg cctggccacc ttctccatat ccaggccaat 28200
ccagagcatt ctcctcactg tccctctgaa gattggagtt actgagagac gtaggagatg 28260
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acagtgaggc acggctctgc ctgctgcctc cacgcagcgc ctggccgggc caagcctcag 28440
ggtcacatct gaagggggcc cggctggccc tgttgtccga agcccctggt gcgctcagcc 28500
ccgaggcccc acgtgccttc ttggcttcct gtgctccgtg gcgtcttcga gtcggtgctg 28560
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cggctgcagc tgcgggagct gctgcccctg ccttgtgctc cagtggggcc ttgcctctgg 28740
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ccactccctg cactgggcgt ttgtaggaaa tgagctcctg gaggaggggg tggggaagtt 29160
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gaatcgcagt cagagtcgtt ctgcttgtgc cgtgttgaat tcccggcatc cggcatccag 29280
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catgtcacag tttctgcaga agtttagggt tggagtgggc tgacctctct gcaggtgtcc 29580
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cctcatcgga tcggcggcgt gaccagggct gccgtgtccc tgcctcttcc tcccacaggc 30720
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tcccctgcct ctcacagctt ccccaaggct gaccactggc cctgaccatg ggctccggcg 30900
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cctagtcggc caccctggcc ctggggttcc ccgtgttttc tgggaagcac tgagcaggcg 31080
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cccacaggca ggaccccaag tgctgggact ctcccccaag aggggctttg ccacaggcag 32940
ggaccccagc tggggccccc cgtgggcttc actgcgcact cgggtgcccc tgcagggtca 33000
ccagctgccg gggaccccga gagtagcctg tgtgtggagt atgagcagga gccagttcct 33060
gcccggcaga ggcccagggg gctgctggcc gccctggagc acagcgaaca gcgggcgggg 33120
agccctggcg aggagcaggt acagttccag ggccttggga tggacacaga ccctctgtct 33180
cctgaggcca acccgacccc gcccatctgg cctcaggcac ctccccacac acccctgtaa 33240
atcccctgcc tggcaggcag gcgggcaagc gggcggggga tcccagctgc ctggctgtct 33300
gtgggtcctc caccccacct cacccacagg ctgctggctc ccaggtggtg catgccctgg 33360
ccctccgcgg gtgcccccca catcactttg gttctctggc gggtcagctt ggctcagtgc 33420
actcaaggtc gggtgcccct gccactggct gcgcttgagg ctggcctttc tccaggaatg 33480
tgctgcgggt ggaacccagg ttccttcttc cttggggcct tttgccccag aagcccataa 33540
ttcctcaggc caacccgaaa ttttctccct gcttcctgct gggagccatt cccctcttcc 33600
tgcccatccc tgcccttcag gcccctggag tgagctccag gtgcaggcac caggcacctg 33660
tgtccccttc ctgccagccc ctcgctgtgg tcggactgtc ttccctggac ctgctcttac 33720
aagtcaccac ctgcgagcct catgagccgc tggtgtgact tggacaggac caagttgtgg 33780
cactgtcacc ggggtgtgct gtgcccccct cccccgacct ccatcttggc tcagggctcc 33840
ttgggaccat cttccctgtg cgtccaggtg ctttgggacc ccagagtgtg tggttggggt 33900
ctgtgtgtgg ttgtgagctg tgtcctcctc aggcccacag ctgctccacc ctgtccctcc 33960
tgtctgagaa gaggccggca gaagaaccgc gaggagggag gaagaagatc cggctggtca 34020
gccacccggt gcgtgagctg tccctgcacc tgtgccgacc accatagaca cgcatgggaa 34080
cgcagccgtg ggtgccccca gccacggctg gtcccgatgg gaccagggaa tccaccccca 34140
ggagctgatg tccagggcag ctgtgatgct gacggccagg ggctcaagtg tgtggtttct 34200
tctgcagggg gctcatgagt cccagctgga atcaggcccc acccttgggc aggtttggca 34260
tggggcctgc agcactgggc ttggccctgg catttccctc aagtgtggat gcacacctgc 34320
ctcatgtgag ggacacagcc cattcctagc cttggatcaa agaacggagt tatagccgga 34380
gccaggaagc cccctgcctg ctggaaaacc ccaagtgtgg cggcctttgt ccatgtccct 34440
tggcttctgg gaagaactgg gtggtgccca ggcagggctg gtgccatcag gaagtgggtg 34500
gctgctgagg ggcctgggct ggcgagggcc tgggtgggga gtgcctgggc cgcccctgcc 34560
ttggtttcca cgtttccgtg ttggtctggg gtgtgtagag agatgggcac tgctcatccg 34620
gaagcccctc cttgtgcgct gccatcctgg gagcctcagc cgcatccgct gtggggcagg 34680
gggcttgagg gaggaggaga gagacgggcc atgcaggacc cctggcttga ggcagagcca 34740
atctaccctt tgcccattca ctgctctcag ttccctgcca gcctctcact gtgtgacctc 34800
agacgggccc agccccacag ctttcttccc gcagcccctc cctatgtcca tccagccagc 34860
cagtttctca ggcagcagcc ccacctcggc agtcactgtc ccagggaacg ctcaatgttc 34920
caaggaaggc tctgcagccc cagggaccag atgatgaggc tggccctgat ggagcctcgg 34980
gcctgtgtcc tgcaggagga gcccgtggct ggtgcacaga cggacagggc caagctcttc 35040
atggtggccg tgaagcagga gttgagccaa gccaactttg ccaccttcac ccaggccctg 35100
caggactaca agggttccga tgacttcgcc gccctggccg cctgtctcgg ccccctcttt 35160
gctgaggacc ccaagaagca caacctgctc caaggtgccc tggcttgcag aggccaccca 35220
ccctgagggc agtgctgccg ccgcgtgtgg ggtgggggcc atctgggtcc aaggtggtct 35280
ctgttctcta gagaaaaagg ggcagatggg gacagacgcc ccttcctcta caggcttcta 35340
ccagtttgtg cggccccacc ataagcagca gtttgaggag gtctgtatcc agctgacagg 35400
acgaggctgt ggctatcggc ctgagcacag cattccccga aggcagcggg cacagccggt 35460
cctggacccc actggtaaat ggggccccag gtgggaccct cagactcctg cgtggaaggc 35520
agtgtgggcc agagtcctgg gctgcttggg gtgggcatcc tcgggccctg cttggccccg 35580
cctctctgtt cccctatggg agtgatgggg gcctccacct ccaccaccag caccagcagc 35640
accacctcca cctccacctc cacctccacc tccaccacca cctccacctc caccaccacc 35700
tcctccacca ccaccacctc caccaccacc accaccacca ccacctccac ctccaccacc 35760
tccacctcca ccaccaccac ctccacctcc accaccacca cctccacctc caccaccacc 35820
tccaccacca ccacctccac ctccaccacc acctccacca ccaccaccac caccaccacc 35880
accaccacca ccacctccac caccaccacc tgcaccacca cctccacctc caccaccacc 35940
accacctcca cctccaccag cagcagcatc acttgttggg gagaccctgt gcaactccat 36000
gcacagccct gtccctgcca tagccccgac ccctaagcac agccctgtcc aactgccaca 36060
cgtcccctgc ctcccatgca tggtcctggg gggtcaactg cacacgccag ggtcctaggg 36120
tcctagaccc ctgtcctccc tgtttctgcc tctgtttggg gtggagtcca agtctccaga 36180
ggcggaagca tctgtgttcg tgtgttaatg aacagcccct acagagttcc cctagttcac 36240
ccagggggga acctagcctg ttgggacgac cccagatccc ttctgggctt ggtactcact 36300
gggatatcct catgcctgca cccagcctac ggctctgagc tcctgagtgg ggctttggcc 36360
tgcccgccac tgttccagcc cccatccagc aggctggtgt ctcctctgat gcccccagca 36420
cccaggcgtg tacctgcctg ggttttcccg ccctggtctg aggtgggtga ggcctggcct 36480
ccctagccag ccctgccccc ccaccccagg gaactttcca gatgctctcg accagctttg 36540
tggctctaca tctcttcatc aggaagaacg gcgccggatc ccaagctgac cgtgtccacg 36600
gctgcagccc agcagctgga cccccaagag cacctgaacc agggcaggcc ccacctgtcg 36660
cccaggccac ccccaacagg tagctgactc ctgaaccgtg tgcagcctac gacttggtgg 36720
gtccctcagt ggcttcacga ggctaactct tgagtgtggc cggggctgcc cctgtgggga 36780
gccatctcat ggtggggact gctcccggtt ctgcaccccg cagttgtcct gagcagctct 36840
ccaggagttc ctggaggaag ggcgggcagg gcggtgggac tctcagtcct ccaccccagc 36900
gccactctga gccatgctac tcccacacca ggagaccctg gcagccaacc acagtggggg 36960
tctggagtgc ccagagcagg gaagcagggc cagcacgccg tgagcgccta cctggctgat 37020
gcccgcaggg ccctggggtc cgcgggctgt agccaactct tggcagcgct gacagcctat 37080
aagcaagacg acgacctcga caaggtgctg gctgtgttgg ccgccctgac cactgcaaag 37140
ccagaggact tccccctgct gcacagcaag tggccctggc gtggggaaca gccggtgggg 37200
tggggggcag gggacaaaat gggggctgtg ccgggtctga ttgaagctcc ccgcagggtt 37260
cagcatgttt gtgcgtccac accacaagca gcgcttctca cagacgtgca cagacctgac 37320
cggccggccc tacccgggca tggagccacc gggaccccag gaggagaggc ttgccgtgcc 37380
tcctgtgctt acccacaggg ctccccaacc aggtagggca cctgcctggc tgctcctggc 37440
agcgccccaa ccgcacgcag ccctgggagt gagcagcaaa gccccaggcc cccctcagac 37500
tcaagtctct gtctccaggc ccctcacggt ccgagaagac cgggaagacc cagagcaaga 37560
tctcgtcctt ccttagacag aggccagcag ggactgtggg ggcgggcggt gaggatgcag 37620
gtcccagcca gtcctcagga cctccccacg ggcctgcagc atctgagtgg ggtgagcctc 37680
atgggagaga catcgctggg cagcaggcca cgggagctcc gggcgggccc ctctcagcag 37740
gctgtgtgtg ccagggctgt ggggcagagg acgtggtgcc cttccagtgc cctgcctgtg 37800
acttccagcg ctgccaagcc tgctggcaac ggcaccttca ggttggtgcc tggccactac 37860
agttcctgct gggtgtagcc ccaggtgatg ggctgagggg gaaagggcag gcccttgtcc 37920
tggtggcaac gcctggcaga cgtgtgcagt gggccggttg tctcacaggc ctctaggatg 37980
tgcccagcct gccacaccgc ctccaggaag cagagcgtca tgcaggtctt ctggccagag 38040
ccccagtgag tgcccacgga ggcccccagc acacccaacg tggcttgatc acctgcctgt 38100
ccagctctgg tgggccaaga acccacccaa cagaataggc cagcccatgc cagccggctt 38160
ggcccgctgc aggcctcagg caggcggggc ccatggttgg tccctgcggt gggaccggat 38220
ctgggcctgc ctctgagaag ccctgagcta ccttggggtc tggggtgggt ttctgggaaa 38280
gtgcttcccc agaacttccc tggctcctgg cctgtgagtg gtgccacagg ggcaccccag 38340
ctgagcccct caccgggaag gaggagaccc ccgtgggcac gtgtccactt ttaatcaggg 38400
gacagggctc tctaataaag ctgctggcag tgcccaggac ggtg 38444
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atgcccaaga tagtcctgaa tggtgtgacc atagacttcc cattccagcc ctacaaatgc 60
caacaggagt acatgaccaa ggtcctggaa tgcctgcagc aggtagagca caggctggga 120
ggaaaggact gcaggcaggt ggagctgggg ctgggtgtgc gtccctctcc cgacccattc 180
cagccaggcc cctccagagg cagcctctgt cataaaaagg ctggtgttcc aggtggggtc 240
agagagagga ttgacaagta aaaacatcgt ccttgagagt gacagactta gtgccttggg 300
ggcctctgag gagcggctgg tattcacagg tcaggaggaa gcatttccat cagaggggca 360
gccgggggcc agcctcactt tgaaggtctt tgaacctttg gggtgcaggg aggtggcagc 420
ggcgcaggtt gccttctcct gggttccttg aggtgccctc ttgtacccgg ctcacacccc 480
tcccctcccc gagtttcccg ctcaggttcc catctgagag ctcgtatgta ggacatcaga 540
taggacagcg taagtgtttg gatctggaaa cacagaacag tttcctattt tgagacttga 600
tgcctaatta gtcatcttac tatttaggct gaaaaatact gttgcatttc gggtaacgtt 660
ctgcaaatgg tctgctgatg gcagctggag ttgcttcacg ccctttaggg caagagtgga 720
aagtgtcctg cggacttatc catggtcccg tggggctctc gccacctgac agcggcctct 780
gcatctgcga agagctgccc actggctgct gaggcttgtc tcagggtggt ttgtgtggcc 840
ttgcctcttc ctggcttccc cgtaaccctt gcccccaact ctgttcagaa ggtgaacggc 900
attctggaga gccccacggg cacggggaag acgctgtgcc tgctgtgtac cacgctggcc 960
tggcgagaac acctccgaga caccatctct gcccgcaaga ttgccgagag ggttcaaggg 1020
gagcttttcc cgaatcaggc cttgtcgtcc tggggcaacg ctgctgctgc tgctgaagat 1080
cccataggtg accctagttc ccaggccttc cctgacctcc tgtggggatg gctggcaagg 1140
gatggcgctg agggtagggt gggcccatgg ggacttctgc cagcagagct caaggagaat 1200
tttgtagctg ccacataatt tctcgccatc gtgggtataa acctagggtt gggctttttt 1260
gctgaattag ggcgtggcag gtgtacactt cgcccgtttg tgataaacga gtctctgggg 1320
tgtcagattc ttggctgtct gcagggctga gttagccgaa tgccacccgc ctttaacacg 1380
tgagaaccat gacctctgtg cttgcttgtg tctgggcagc ttgctacacg gatatcccaa 1440
agatcattta cgcctccagg acccactcgc aactcacgca ggtcatcaac gagcttcgga 1500
acacctccta ccggtgggtc agacgagttc acgcctgtct tggggtcctc gagagaacca 1560
gcttgacgtg gtgctgggtc cacagaccac gctgtgctgt agtggagggg gcggtctttc 1620
cagacgctcc ccagaagtat gcagtgtgct ggtgcccagg ggtggggcgg ggcccgggct 1680
gtccctagtg cccattactt gtgaggaggc agctttgcat ttgtgtgctg accttgggct 1740
ggcgtcctga gctcctttca ggtgctgttg tggcagctgt gtggcaggtc agggccggcc 1800
cccagtgcag ctttgcacat gaagtgggag gaggccctgc cgcttgtcag agccctgcag 1860
agtcttggtg ttctgtcggg ttcctgtgga ggggccgatg gcggggtgct gtggaagctg 1920
tcgaatctcg tccctctgtc cagttccccc gcttgtctcc ttgctccctc ctactcccgg 1980
gccacgatcc tatgccgggg ccactctcct gcacccggac cacgctccta cgcccaggcc 2040
actctcctac gcctggacca cattgcagtt atgctgactt cctctggctg ccagtgctcc 2100
tgtgtgtctc catacagctc acgctgcggg accacgctgt ggctgttgga ggcagctcct 2160
cctccaccca tagtgctctc tccctccagg cctaaggtgt gtgtgctggg ctcccgggag 2220
cagctgtgca tccatccaga ggtgaagaaa caagagagta accacatgca ggtgggctcc 2280
tggctcccgc tccggctcag ggttccgtga ggcgagtgct gctgggtatc cagagtccca 2340
ggctgtgctc ctgctgggct ggggttcgaa gttcactggg ggactgcagg cgagggcctg 2400
gtgggggtgg ggactggctc gggtcctttc ttggccatac tccagccgcg cactctgccc 2460
ttcctcccgc agatccactt gtgccgcaag aaggtggcaa gtcgctcctg tcatttctac 2520
aacaacgtgg aaggtacagg cagctcggtg ggaccaggct tgggttggag tgtgtgcagc 2580
ctctcagggc gtcagcctgg ttgtgcttgc cgggtggggc ggccagtgca gccgtgtacc 2640
tgggcactgt cttctgactc gggaccaccc gtgttagtct tctgtgtgga agagctcacc 2700
cagtggtctg agacagccag ccggccggac tgcctgtggc tggtgcctgg ggccttggat 2760
tttgggaagg ctccctccat ttccggacga gaagggctcc ctgcacctga ctactggtgc 2820
atacagcagc ggttttgctg aacacctgct ttgtcttcgg ggagcctgag gttttgttgc 2880
ttgcccagca gcgggtgctc ctgtgaccgg cccttgtacc atcttgggag ggtgtcctgg 2940
aagccgtgtc tggcctcccc cgaccttgcc gcatgtgtct ttgtcctgtg ctgacgttgc 3000
agagaaaaat tacagccccg agcgtgactc caggctgagt cctgtgggtc cgacacggga 3060
ggccttgggg cctcttcagg agacgggatg agtgagtgat gggagcagag ccagggcacc 3120
tcgccctgtg actgcaggtg gccacagcct gtgagggcca ggggtgcttc tccacccacg 3180
tggctgcccc tcgggtatgt caggggcttc tggggctctt cacgaggtct cagagacagt 3240
agcagggtgt gcccccgtcg gctgccctta cagtttctgt gacctgaggg tggcatctgt 3300
gcggttggca tggcctgagc ttctgtggga tcagagttcc ctttgtttcc tgcctcagtt 3360
ggggctcaag cctcaggtga cgtggccctg gagcacctgg aaggcgtcgg cggtcctgcg 3420
ggctgctgtc tgcactcgtg tttgctgagt gctcagtatg ccaggactga ggaccctgaa 3480
gctgctgtta tatttaggac ggttctcccc tggcagagac ggagccgggt ggtcccgcct 3540
gacccaccac caggcgtttc tgggccctgg agggacaggg tgggcggaac atgggcctgc 3600
agggagacct ccacttactg gaggctcgtg ctgtgttgct ggaggcatct tctgtgttgc 3660
ttcttgtttg ctgtgtcttt tgttctggtg gcaccaagga cctccagtca ccttgatgtg 3720
tggttgtcca ggcctttttg gtggtcctga gaaggggtct gaggggctct gcctctgccg 3780
ccaggttccc tgatggaagc tgcccactcg tcctggtggt gcccacagga cgtgactctg 3840
gcacaggagg gcagatgtgc tgttggagat tctcagcccg tcgtcgtcat ttccaaagtc 3900
ctcacccgca tttctgggac aggacaggag tgcctgctgg gtgtccccgg tcccatgcag 3960
cgggggtcct tgggatagtg tggaacgctg agtgtgggcc tgtccggcgg tggtcctgga 4020
caagggtagc acccctgtgg ccgccgggcc tggtgcctgg tgcctagcgg ggaggccgct 4080
gaccgcctcc tgtgctgctt ccatccgtgt caggcctctg ggtgttgggc ccccatctgt 4140
ctccccccag gcctgtggga tcagtccaag aagactcaat ccagccccag cctgtccccc 4200
ttggcttggg ctctcactgc ccgacctggc aggaggttgc ctagcggtga acctttgcat 4260
cctgtctgcc ccctggacag gctctgaggg ggtgtctgca acacctgtgc cagcctgggc 4320
atcttttttt tttttttttt cttttgagac gaaatctcgc tctgccgccc aggctggagt 4380
gcagtggcgt gatctcagct cactgcaagc tccacctccc gggttcacgc cattctcctg 4440
cctcagcctc ccgagtagtt gggactacag gtgcccgcca ccatgcccgg ctaatttttt 4500
gtattttttt tctttttttt tttgnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn 4560
nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn 4620
nnnntttgag acggagtctc gctatgtcgc ccagggtgga gtgcagtggc cggatctcag 4680
ctcactgcaa gctccgcctc ccgggttttt acgccattct cctgcctcag cctcccgagt 4740
agccgggact acaggcgccc gccacctcgc ccggctagtt ttttgtattt tttagtagag 4800
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ctcggcctcc caaagtgctg ggattacagg cttgagccac cgcgcccggc cttnnnnnnn 4920
nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn 4980
nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnttttgta tattttttta gtagagatgg 5040
ggtttcaccg tgttagccag gatggtctcg atgatctgac cgcgtgatcc gcccacctcg 5100
gcctcccaaa gtgctgggat tgcaggcttg agccaccgtg cccggccagc ctgggcatct 5160
ttagagtggg ctgcagctcc tggaggggtc tgagaggaag gaaggcaggt attttgtgaa 5220
tgaagagaca gctagagagc tggcaccctt cctggcctgc gtcctgtgag gactctggtt 5280
ggggacagca agcttggggt tagcctgggg cagagcctct gggaggcccc tgccccttgt 5340
cccccttccc cttgcagctc ctgtcctcgc cccgccctca gctctctgcc agggaaggtt 5400
tggcaagtgc cgctgtgcgg cagtgcgtgc tgattggctg gtcgttgcta tggtgccgct 5460
cagggatatg cttttcctcc cctgccttcc ctgctatccc tgggagcatc tggagttgag 5520
tcatcgctgg tgtgtgtgtg tgtgtgtgag tgtgtgtgtg agtgtgtgag tgtgtgtgtg 5580
cgtgtgtgtg tgtgtgtgtg agtgtgtgag tgtgtgtgtg tgagtgtgtg tgtgagtgtg 5640
tgtgtgtgtg agtgtgtgtg tgtgtgtgtg tgtgtgtgtg tgtgagtgtg tgtgtgagtg 5700
tgtgtgtgtg tgtgtgtgtg tgagtgtgtg tgtgtgtgtg tgtgtcagtg tgtgtgtgtg 5760
tgtgtgtgtg tgtgtgagtg tgtgtgtgtg tgtgtgtgtg tgagtgtgtg tgtgagtgtg 5820
tgtgtgagtg tgtgtgtgag tgtgtgtgag tgtgtgtgag tgtgtgtgtg agtgtgtgtg 5880
agagtgtgtg tgagagtgtg tgtgagtgtg tgtgtgtgag tgtgtgtgtg agtgtgtgtg 5940
tgagagtgtg tgtgtgagtg tgtgtgtgtg tgtgagagtg tgtgtgtgtg agtgtgtgtg 6000
tgtgagtgtg tgtgtgtgtg tttgtgcccg tgtgcgcctc tggcctctgc agctgagtcc 6060
tggctctcag ggggcctggc acctcccggg gatgggcaca aagcagccac gatgcagccg 6120
ggagctgggg aaggccccat tgccccacac ggctgcccta agactctggg gtgcttcttg 6180
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ggttgggggc ctgtgctgtg gaggcgaggg aggggcagga cccccaactc cctgaagcct 6300
tttctggcct ggtcctctca gccagcatag gcagggccct ttcccagggc tgccatgctg 6360
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ctgggcctgt tgtggttggc agggaagctg agccacggtg ctcatcacag gggcacctcc 6480
aggatttttg ggagatgcct ccgtgggctg gggcgatacg ctgaggagct gttcttccct 6540
gccctgagga gggctgagtg tagccgtcac ccctgtcctg tcttgggctg tctcagggag 6600
gatgcataga accctcggaa ccctgctggc ccttgtctga tccaccctca acctcaggcc 6660
ttctaggggc acaggagggc tccgtcggga tcactgcggg tgggggcctc ccttggacac 6720
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gagaaagttg aagcagctct gaggaacgta gagtaaaaag cgaaaccgcc tccctcttcc 7140
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ctcagcgttg tgggtagctt cgcatgctgg tgctggtcgt ccggcttcgt tcttctgagg 7320
acagcaaata tgtcctttgt ccacctcttt tatagtttca gagattcaag ttataataaa 7380
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tccagtcttg aactcctgag ctcaagagtt ccacccgcct cggcctccca aagttctggg 7680
attccaggcg tgagcaccac gcccgaccca gctctgcttt gttttagtgg ttctgtttgt 7740
gtttgtttct gatgacctct atccaggaat agggttggtt tttcttttcc atggagtttt 7800
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nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn 9540
nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nttttgagac agagtctcgc tgtgtcgccc 9600
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ttccgaggga aggaaacttc cacagttgct gccttcagtt cccaaagctg cagcctgatc 21600
ccccgtccag gctcgagcct gccttcttct cctcgcagct acatctttga gctgtttgct 21660
gaagcccgga tcacgtttca gaccaagggc tgcatcctgg actcgctgga ccagatcatc 21720
cagcacctgg ccggacgtga gtgccggggc ggggtccttg gtgtgggcag acgtggcgta 21780
gggggtgcag caggcctcca tcctggcagt cagggctcgc ctggccatca cctggccgtc 21840
agcaggaaca ggctcacaga acctcacctg gtcggggcgt ggaggcgtta gtgccggttg 21900
cccactgccg tagagcctgt cccagttctg cagctggcgg cttcgtcctg cagactcatc 21960
ccattattcc ccttttaagg aagagcagcc caaggccctg gctgggttgt ggggcctcag 22020
gcttctccac acaccctgag ttctgcttct cagagctgtg gggtccagag gctttgccca 22080
gaggcagtgt cgtcatgggc tgctctggtt tgagatgccg gcccgccggg gcctctgctg 22140
tgctcccagg tgctggggag ggcggctctt gctgcttcaa accttaggtg accatagagc 22200
ctcttttcaa gttccaccgg cccccttgga gacgctgtcc ctgcctggct gctctcctgg 22260
ctgctgggaa gggcaggcga gctgcccgcc ctgagtggac actgcgctcc accctgggcc 22320
ccccgttggg caggagatgg agcttggcag tcgggctgag ctggcttatg gctggaaggg 22380
cgggggctgg ggtcggggcc tcccctgcct gcagtgcggg tgtcagcgcc cggcatgcta 22440
cctccccagg tgctggagtg ttcaccaaca cggccggact gcagaagctg gcggacatca 22500
tccaggtggg gcctgctcct ctggcgtctc cttccctgat ggaagccggg cgggtgcctt 22560
ctcctgctgt attagttact gactctagac gtgggggtgg gagaacggcc cccacaccac 22620
ctgtttccga ctggcaaacg cttggctcct ttcctgtgac ccaaacccac actgggcctc 22680
ccgcggggat gggggaggac gaggtctggt ggcccgtgcc cagggtgacg ctggtggggg 22740
aggacgtgaa ggggagtggg ggccagggag ccgctcctgc cctgtccggg ccctcaggcc 22800
ggggggaccc actcctggca gccccagcta cacgcagatg aagagctctg gacacacgta 22860
gcttcctgaa cagcttctcc agggacagac aaacggggac cctgcaggtt gccggcgggg 22920
gtgtccctgc gagcccatga tgggggatgc ggccccggcc cccttcttgg ccccgtcctg 22980
ccctgtgatg cccgtcccct cccatgtgag gttgctcctg gctctgtgcc tgtggcagca 23040
cctgctttcc ctgaggcaga cgggcttgtg cggtttgtgg agggcaagcc ccatttttgg 23100
gtgctctggg cacacacttg cctctcctgg acctcggtgc attttttaga agcagaccca 23160
caagtccctg actgggaggc catcagtcct tggggaaacc gaggcacagg tggctgtgtg 23220
gagccatgtg aggctgcctc tgtgctgccc acactgaacc tcctggccac acgaggtcat 23280
ggcagggtta ggtggggctg cccagctctg tgacaacttc gtgagtgtcc gcctggggtg 23340
gggggtgctt gagctggggg aggccgcaga agaaccctgg aatgtaccgc cggcctgtgc 23400
atgcagtgcg gtgctctgtg catgctactg ggcgtggagc tgcaggcccc aggacgacca 23460
ggcactgcct tcttcataga cgtggctctg agcaggggcg agacctgggc agggaccagg 23520
tggggtgggc acagcaggtg gtagggccca ggctcagccc tacctccacc gtggccttct 23580
ctgcggccag tgatgccaca gccagtgtct tctctgtgtg gcagctgggg ctggaaagac 23640
ggcactgcta tgtctcccag ctcctcccca aaagcacggt gggcatccca gggccagacc 23700
cctctctctg tggctcctgc ctgccaaggg ctgctttgcc gtcccgcctg gagcgtggtt 23760
ggctcttcaa gcaggaggcc gtgcacctgc caggcggacc tgcttccatg tcctgacggg 23820
tcactcaaag cacctccagc acatggccat cgaggcagcc ctgcagccca gggcctggag 23880
ggcaggtgtg agctggcccg ggcctgcccc tccctggaat gtggcttccc aggctccagt 23940
atggagcagt gtccacactc tggaaccaaa tcttgttcac cccattggtt tggaatttcc 24000
tttggctgct gctctaagta gccactggga gatgactcag ctcctcccaa ccctggggac 24060
tgcacaccgt gttcaccctc ggctgctcct gagtccctgc aggtgtgggc actgctcata 24120
gggctgctgc tgggctggac ttgcagccct gaggcacagg tgaccctggg gacagagtgg 24180
ggctagagtg gggctagtgg ccccaggaag aggatgtggg atgcacggtt cagttggagg 24240
caagtccggg cagggccagg ctgtgtgctg gggaggtaga gcttagctgg aggcaaactc 24300
tgggcagtgc tggcccgtgc tgggcagcca gtcaccgctg ggcccctgtg agactagtgg 24360
gtcccctttc ttctctgcct gagctgccct ggggctgaag cacggggcgg tttgtagtgg 24420
tgtttttttg agacagggtc tcgctctgtc accccagcgg gagtgcaggg ccttgtcacc 24480
agctcactgc agcctcagcc tcctgggccc aggccatcct cttgcctcag ccacctgagt 24540
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ggtcttgcca tgttgcccag gctggtctca aagtcctggg ctccggcagt ctgcccacct 24720
tggcctccca cagtgctggg attacaggta agagcttcca ggcctgccca tcagagggct 24780
ggctttttga gggaagctgt ttcctgaggc agcctcagcc cctgctcatg gcagcccctg 24840
gtgtcatggt gaatttgttc tgttgtttcc atccctgtgg gccaaatgct ttggtaaaac 24900
gcaaggcctt gtatttagct gtcttgacag tgaaaatggc tgggaaggaa ggaaggaagg 24960
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ttggggcttc acgttcctgt tctggccatt tccggctctt tttccgggaa gggtcatcac 25260
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cgtggtggtt ttgtcgtaag tcctggtgtc ggccagaacc aatttctgtt tttgtttgtt 25740
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agcacggagc cccacagtga ggcacagctt tccctgctgc ctccacccag cgcctggctg 27420
ggccaagcct cagggtctca tctgaagggg gcccgactgg ccctgttgtc cgaagcctct 27480
ggtgcgctcg gccctgaggc cccacgtgcc ttgttggctt cctgtgctct gtggcgtctt 27540
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cggtggctcg gtgatggcct cgtggcaagg cgtctcccag caggaagcgt ccatcctggg 27960
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tctatttgtt ccattgacct gtgacgtcac ttgacttctg agaagcagcc gctccctgcg 28080
ttgggtgttt gtaggaaatg agttcctgga ggcggaggtc gggaagttcc cccgctgcag 28140
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gaccccgagt cacagtcagc gtcgttctgc ttgtgccgtg tttaattcct ggtgtccggt 28260
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aggaacttcc tttgaaccgg tgcccttgtt cgctgctgac gccactcgga ggcttcctgg 28380
cggagcgggg aactcgcact tcctcttgtg cgcgtccctg gaatgtcggg acgctggcgc 28440
ttgcttcccg tgcgctcttg gcgggatgag cttgccctga gctgcatgtc actgtttctg 28500
cagaagttta gggttggagt tggctgacct ctctggaggt gtccccagca tctgcctggg 28560
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gctcacactc agggcagcct cctttgttct gacttctgca cgctgggcct gggtggctgt 28680
gggcggctca cttgcttgat gccagtgggt gagagggtga tgggcagaga ggcaggcggt 28740
caggccccca gtcccgtcct cacaccctgt gtcccctgct cccctccgcc ccacagggaa 28800
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cgtccgctcc ctcatcctta ccagcggcac gctggccccg gtgtcctcct ttgccctgga 28920
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tcttcccttc ctatcctgtc atggagaaga gcctggagtt ctggcgagta tgtctcccct 29580
gtgtgtcctg ggtggggtgg gtgagggcag ggctggagca cgaagcaggc agtggccaca 29640
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ccccctcgtg cctcccgtgc ccctcacagc ttccccgagg ctgaccacca gccctgacca 29880
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ggcaggcccc acctgtcgcc cagaccaccc cccacaggta gctgagtcct gaactgtgtg 35280
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nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn 36060
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nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn 36240
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nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnggg 36360
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gcaaaaagtt gcatggtgct ggt 23
Claims (15)
- 一種反義寡核苷酸，其選自由以下所組成之反義寡核苷酸之群組： TTacatactctggtCAAA (SEQ ID NO: 5)、 AATTttacatactctgGT (SEQ ID NO: 3)、 AAttttacatactctGGTC (SEQ ID NO: 4) 及 CTttattataactTgaAtCTC (SEQ ID NO: 6)， 其中大寫字母為 β-D-氧 LNA 核苷，小寫字母為 DNA 核苷，所有 LNA C 皆為 5-甲基胞嘧啶，且所有核苷間鍵結皆為硫代磷酸酯核苷間鍵結。
- 一種結合物，其包含如請求項 1 之反義寡核苷酸，以及至少一個共價連接至該反義寡核苷酸之結合物部分。
- 如請求項 2 之結合物，其中該至少一個結合物部分能夠結合至去唾液酸糖蛋白受體。
- 如請求項 2 或 3 之結合物，其中該結合物部分係選自圖 5 中之三價 GalNAc 部分中的一個。
- 如請求項 4 之結合物，其中該結合物部分為圖 5D 中之三價 GalNAc 部分，諸如圖 5D-1 或圖 5D-2 之三價 GalNAc 部分，或二者之混合物。
- 如請求項 2 至 5 中任一項之結合物，其包含位在該反義寡核苷酸與該結合物部分之間的連接子。
- 如請求項 6 之結合物，其中該連接子包含 2 至 5 個連續的磷酸二酯連接的核苷，或該連接子由 2 至 5 個連續的磷酸二酯連接的核苷組成。
- 一種結合物，其選自由以下所組成之群組：圖 1、圖 2、圖 3 及圖 4 所示之結合物。
- 一種如請求項 1 之反義寡核苷酸或如請求項 2 至 8 中任一項之結合物之醫藥上可接受之鹽。
- 一種醫藥組成物，其包含如請求項 1 之反義寡核苷酸、如請求項 2 至 8 中任一項之結合物或如請求項 9 之醫藥上可接受之鹽，以及醫藥上可接受之稀釋劑、溶劑、載劑、鹽及/或佐劑。
- 一種在表現 RTEL1 之標靶細胞中調節 RTEL1 表現之活體內或活體外方法，該方法包含向該細胞投予有效量之如請求項 1 之反義寡核苷酸、如請求項 2 至 8 中任一項之結合物、如請求項 9 之醫藥上可接受之鹽或如請求項 10 之醫藥組成物。
- 一種治療或預防疾病之方法，其包含向患有或易罹患該疾病之個體投予治療或預防有效量之如請求項 1 之反義寡核苷酸、如請求項 2 至 8 中任一項之結合物、如請求項 9 之醫藥上可接受之鹽或如請求項 10 之醫藥組成物，其中該疾病為 B 型肝炎病毒 (HBV) 感染，例如慢性 HBV 感染。
- 如請求項 1 之反義寡核苷酸、如請求項 2 至 8 中任一項之結合物、如請求項 9 之醫藥上可接受之鹽或如請求項 10 之醫藥組成物，其用於醫藥中。
- 如請求項 1 之反義寡核苷酸、如請求項 2 至 8 中任一項之結合物、如請求項 9 之醫藥上可接受之鹽或如請求項 10 之醫藥組成物，其用於治療或預防 B 型肝炎病毒 (HBV) 感染，例如慢性 HBV 感染。
- 一種如請求項 1 之反義寡核苷酸、如請求項 2 至 8 中任一項之結合物、如請求項 9 之醫藥上可接受之鹽或如請求項 10 之醫藥組成物用於製備藥物之用途，該藥物用於治療或預防 B 型肝炎病毒 (HBV) 感染，例如慢性 HBV 感染。
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