KR20210033004A - Rtel1의 발현을 조절하기 위한 올리고뉴클레오티드 - Google Patents

Rtel1의 발현을 조절하기 위한 올리고뉴클레오티드 Download PDF

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리케 페데르센
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다니엘 제레미 털리
앙겔리나 발리어
지타오 데이비드 장
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Abstract

본원 발명은 HBV 감염, 특히 만성 HBV 감염의 치료에서 이용을 위한 RTEL1 저해제에 관계한다. 본원 발명은 특히, cccDNA, 예컨대 HBV cccDNA를 불안정화하기 위한 RTEL1 저해제의 용도에 관계한다. 본원 발명은 또한, RTEL1에 상보적이고 RTEL1 mRNA를 감소시킬 수 있는 안티센스 올리고뉴클레오티드에 관계한다. 제약학적 조성물 및 HBV 감염의 치료 및/또는 예방에서 이의 용도 역시 본원 발명 내에 포함된다.

Description

RTEL1의 발현을 조절하기 위한 올리고뉴클레오티드
발명의 분야
본원 발명은 RTEL1에 상보적이고, RTEL1의 발현의 조절 또는 RTEL1 활성의 조절을 야기하는 RTEL1 저해제, 예컨대 올리고뉴클레오티드 (소중합체)에 관계한다. 본원 발명은 특히, B형 간염 바이러스 (HBV) 감염, 특히 만성 HBV 감염을 치료하고 및/또는 예방하는 데 이용을 위한 RTEL1 표적화 핵산 분자의 용도에 관계한다. 본원 발명은 특히, cccDNA, 예컨대 HBV cccDNA를 불안정화하기 위한 RTEL1 저해제의 용도에 관계한다. 제약학적 조성물 및 HBV 감염의 치료 및/또는 예방에서 이의 용도 역시 본원 발명 내에 포함된다.
배경
B형 간염은 역전사를 통해 복제하는 작은 간친화성 바이러스인 B형 간염 바이러스 (HBV)에 의해 유발되는 감염성 질환이다. 만성 HBV 감염은 심각한 간 질환, 예컨대 간경화증 및 간세포 암종에 대한 핵심 인자이다. 만성 HBV 감염에 대한 현재의 치료는 다중기능성 역전사효소인 바이러스 중합효소를 표적으로 하는 페길화된 1형 인터페론 또는 뉴클레오시(티)드 유사체, 예컨대 라미부딘, 아데포비르, 엔테카비르, 테노포비르 디소프록실 및 테노포비르 알라페나미드의 투여에 기초된다. 치료 성공은 통상적으로, B형 간염 표면 항원 (HBsAg)의 상실로서 계측된다. 하지만, 완전한 HBsAg 소실은 좀처럼 달성되지 않는데, 그 이유는 B형 간염 바이러스 DNA가 감염 후 체내에서 존속하기 때문이다. HBV 존속은 핵에서 안정되게 유지되는 HBV 유전체의 에피솜 형태에 의해 매개된다. 이러한 에피솜 형태는 "공유결합 폐쇄 환상 DNA" (cccDNA)로 불린다. cccDNA는 바이러스 복제 중간산물인 전유전체 RNA (pgRNA)를 비롯한, 모든 HBV 전사체에 대한 주형으로서 역할을 한다. cccDNA의 소수 사본의 존재가 완전히 진행된 HBV 감염을 재개하는 데 충분할지도 모른다. HBV에 대한 현재의 치료는 cccDNA를 표적으로 하지 않는다. 하지만, 만성 HBV 감염의 치유는 cccDNA의 제거를 필요로 할 것이다 (Nassal, Gut. 2015 Dec;64(12):1972-84. doi: 10.1136/gutjnl-2015-309809에 의해 검토됨).
말단소립 신장 헬리카아제 1 (RTEL1)의 조절인자는 말단소립의 안정성, 보호 및 신장에서 기능하고, 그리고 DNA 복제 동안 말단소립을 보호하는 것으로 알려진 셀테린 복합체에서 단백질과 상호작용하는 DNA 헬리카아제를 인코딩한다. 이러한 유전자에서 돌연변이는 선천성 각화이상증 및 Hoyerall-Hreidarsson 증후군과 연관되었다 (참조: 예를 들면, Vannier et al 2014 Trends Cell Biol. Vol 24 p.416에 의한 검토).
핵 내에 위치되면, RTEL1은 말단소립-길이 조절, DNA 수복 및 유전체 안정성의 유지에 연루된 ATP-의존성 DNA 헬리카아제로서 기능한다. RTEL1은 독성 재조합을 상쇄시키고, 감수분열 동안 교차를 제한하고, 가닥 침투 사건을 물리적으로 분리함으로써 감수분열 재조합 및 교차 항상성을 조절하고, 그리고 따라서 감수분열 합성 의존성 가닥 어닐링 (SDSA)뿐만 아니라 D 루프 재조합 중간체의 분해에 의해 비-교차 수복을 증진하는 항-재조합효소로서 행동한다. 게다가 RTEL1은 T 루프를 분해하고, 그리고 말단 G4-DNA 구조를 상쇄시킴으로써 말단소립 취약성을 예방하는데, 이들은 함께 말단소립의 동역학 및 안정성을 담보한다.
RTEL1은 siRNA 스크린에서 HPV 에피솜의 안정제로서 확인되었다: (Edwards et al 2013 PLoS One Vol 8, e75406). RTEL1을 표적으로 하는 siRNA가 Hoyeraal-Hreidarsson 증후군에서 RTEL1과의 반응물을 확인하는 데 유사하게 이용되었다 (Schertzer et al 2015 Nucleic Acid Res Vol 43 p. 1834). 이에 더하여, RTEL1은 HIV 감염 저해를 위한 표적을 제공하기 위한, 필수적인 숙주 단백질에 대한 siRNA 스크린으로부터 HIV 숙주 의존성 인자로서 확인되었다 (WO 2007/094818).
우리가 아는 바로는, RTEL1이 cccDNA 안정성 및 유지의 맥락에서 cccDNA 의존성 인자로서 확인된 바가 없을 뿐만 아니라, RTEL1을 저해하는 분자가 HBV 감염의 치료를 위한 cccDNA 불안정화제로서 제안된 바가 없다.
발명의 목적
본원 발명은 HBV 감염된 세포에서 RTEL1의 저해 및 cccDNA의 감소 사이에 상관관계가 있고, 이것이 HBV 감염된 개체의 치료에서 유의미하다는 것을 보여준다. 본원 발명의 목적은 HBV 감염된 세포에서 cccDNA를 감소시키는 RTEL1 저해제를 확인하는 것이다. 이런 RTEL1 저해제는 HBV 감염의 치료에서 이용될 수 있다.
본원 발명은 시험관내와 생체내에서 RTEL1의 발현을 저해할 수 있는 신규한 핵산 분자를 더욱 확인한다.
발명의 요약
본원 발명은 RTEL1의 발현을 조절할 수 있는 핵산을 표적으로 하는 올리고뉴클레오티드에 관계하고, 그리고 RTEL1의 기능에 관련된 질환을 치료하거나 예방하는 것에 관계한다.
따라서, 첫 번째 양상에서 본원 발명은 B형 간염 바이러스 (HBV) 감염의 치료 및/또는 예방에서 이용을 위한 RTEL1 저해제를 제공한다. 특히, cccDNA 및/또는 전유전체 RNA (pgRNA)를 감소시킬 수 있는 RTEL1 저해제가 유용하다. 이런 저해제는 유리하게는, RTEL1 mRNA를 감소시킬 수 있는 길이에서 12 내지 60개 뉴클레오티드의 핵산 분자, 예컨대 포유류 RTEL1에 상보적인 단일 가닥 안티센스 올리고뉴클레오티드, siRNA 또는 shRNA에서 선택된다.
추가의 양상에서 본원 발명은 포유류 RTEL1에 상보적인 적어도 10개 뉴클레오티드, 특히 16 내지 20개 뉴클레오티드의 연속 뉴클레오티드 서열을 포함하는 12-60개 뉴클레오티드, 예컨대 12-30개 뉴클레오티드의 올리고뉴클레오티드에 관계한다. 이런 올리고뉴클레오티드는 RTEL1의 발현을 저해할 수 있다. 상기 올리고뉴클레오티드는 단일 가닥 안티센스 올리고뉴클레오티드 또는 shRNA 핵산 분자일 수 있다.
안티센스 올리고뉴클레오티드는 갭머 설계를 가질 수 있다. 바람직하게는, 안티센스 올리고뉴클레오티드는 표적 핵산의 개열에 의해 RTEL1의 발현을 저해할 수 있다. 개열은 바람직하게는 뉴클레아제 모집을 통해 달성된다.
추가의 양상에서, 본원 발명은 본원 발명의 안티센스 올리고뉴클레오티드 및 제약학적 부형제를 포함하는 제약학적 조성물을 제공한다.
추가의 양상에서, 본원 발명은 RTEL1을 발현하는 표적 세포에 본원 발명의 안티센스 올리고뉴클레오티드 또는 조성물을 효과량으로 투여함으로써, 상기 세포에서 RTEL1 발현의 조절을 위한 생체내 또는 시험관내 방법을 위한 방법을 제공한다.
추가의 양상에서 본원 발명은 RTEL1의 생체내 활성과 연관된 질환, 장애 또는 기능장애를 치료하거나 예방하기 위한 방법을 제공하는데, 이들 방법은 본원 발명의 안티센스 올리고뉴클레오티드의 치료 또는 예방 효과량을 상기 질환, 장애 또는 기능장애를 앓거나 또는 이것에 취약한 개체에게 투여하는 단계를 포함한다.
본원 발명의 추가 양상은 본원 발명의 핵산 분자의 접합체 및 본원 발명의 분자를 포함하는 제약학적 조성물이다. 특히 간을 표적으로 하는 접합체, 예컨대 GalNAc 클러스터가 관심된다.
도면의 간단한 설명
도 1: 예시적인 안티센스 올리고뉴클레오티드 접합체를 도해하는데, 여기서 올리고뉴클레오티드는 물결선 (A-D)으로서 또는 "올리고뉴클레오티드" (E-H)로서 또는 T2 (I)로서 표현되고, 그리고 아시알로당단백질 수용체 표적화 접합 모이어티는 삼가 N-아세틸갈락토사민 모이어티이다. 화합물 A 내지 D는 디-리신 가지치기 분자, PEG3 스페이서 및 3개의 말단 GalNAc 탄수화물 모이어티를 포함한다. 화합물 A 및 B에서 올리고뉴클레오티드는 링커 없이 아시알로당단백질 수용체 표적화 접합 모이어티에 직접적으로 부착된다. 화합물 C 및 D에서 올리고뉴클레오티드는 C6 링커를 통해 아시알로당단백질 수용체 표적화 접합 모이어티에 부착된다. 화합물 E-I는 상업적으로 가용한 트레블러 가지치기 분자 및 변하는 길이와 구조의 스페이서 및 3개의 말단 GalNAc 탄수화물 모이어티를 포함한다.
정의
HBV 감염
용어 "B형 간염 바이러스 감염" 또는 "HBV 감염"은 당해 분야에 통상적으로 공지되고, 그리고 B형 간염 바이러스 (HBV)에 의해 유발되고 간에 영향을 주는 감염성 질환을 지칭한다. HBV 감염은 급성 또는 만성 감염일 수 있다. 만성 B형 간염 바이러스 (CHB) 감염은 전 세계적으로 248 백만 명에게 영향을 주는 전체적 질환 부담이다. 연간 대략 686,000건의 사망이 HBV-관련된 말기 간 질환 및 간세포 암종 (HCC)에 기인한다 (GBD 2013; Schweitzer et al., 2015). WHO는 확대된 개입이 없다면, CHB 감염을 안고 살아가는 사람들의 숫자가 다가오는 40-50 년 동안 현재와 같은 높은 수준에 머물러 있을 것이며, 2015년 및 2030년 사이에 누적으로 20 백만 건의 사망이 발생할 것이라고 예측하였다 (WHO 2016). CHB 감염은 단일한 임상적 표현을 나타내는 균질한 질환이 아니다. 감염된 개체는 그들의 일생 동안 CHB-연관된 간 질환의 여러 시기를 겪게 된다; 질환의 이들 시기 또한, 관리 기준 (SOC)으로 치료에 대한 기초가 된다. 현재 지침은 3가지 기준 - 혈청 ALT 수준, HBV DNA 수준, 그리고 간 질환의 심각도에 근거하여 선별된 CHB-감염된 개체만을 치료하도록 권고한다 (EASL, 2017). 이러한 권고는 SOC, 다시 말하면, 뉴클레오시(티)드 유사체 (NA) 및 페길화된 인터페론-알파 (PEG-IFN)가 치유력이 없고 긴 기간 동안 투여되어야 하고, 따라서 그들의 안전성 위험이 증가한다는 사실에 기인하였다. NA는 HBV DNA 복제를 효과적으로 저해한다; 하지만, 이들은 다른 바이러스 마커에 대한 매우 한정된 효과를 갖거나/효과가 없다. HBV 감염의 2가지 홀마크, B형 간염 표면 항원 (HBsAg) 및 공유결합 폐쇄 환상 DNA (cccDNA)가 HBV 치유를 목적으로 하는 신규한 약물의 주된 표적이다. CHB 개체의 혈장에서, HBsAg 서브바이러스 (비어 있는) 입자는 103 내지 105의 계수로 HBV 비리온보다 숫자가 더 많다 (Ganem & Prince, 2014); 이의 과잉은 급성 HBV 감염의 해소 이후에 관찰되는 혈청학적 마커인 중화 항-HBs 항체를 개체가 발달시킬 수 없는 것을 비롯하여, 상기 질환의 면역병인에 기여하는 것으로 생각된다.
cccDNA (공유결합 폐쇄 환상 DNA)
cccDNA는 감염된 간세포의 핵 내에 체류하는 바이러스 유전적 주형인데, 여기서 이것은 생산적 감염에 필요하고 만성 HBV 감염의 자연 코스 동안 바이러스 존속을 책임지는 모든 HBV RNA 전사체를 생성한다 (Locarnini & Zoulim, 2010 Antivir Ther. 15 Suppl 3:3-14. doi: 10.3851/IMP1619). 바이러스 병원소로서 작용하는 cccDNA는 치료의 휴지 후 바이러스 반동의 근원이며, 장기간, 종종, 평생 치료를 필요하게 만든다. PEG-IFN은 이의 다양한 부작용으로 인해 CHB의 작은 부분집합에게만 투여될 수 있다.
결과적으로, HBV cccDNA의 분해 또는 제거에 의해 규정되는 완전한 치유를 대다수의 CHB 환자에게 전달할 수 있는 신규한 요법이 고도로 요구된다.
화합물
본원에서, 용어 "화합물"은 RTEL1 발현 또는 활성을 저해할 수 있는 임의의 분자를 의미한다. 본원 발명의 특정 화합물은 핵산 분자, 예컨대 본원 발명에 따른 RNAi 분자 또는 안티센스 올리고뉴클레오티드, 또는 이런 핵산 분자를 포함하는 임의의 접합체이다. 예를 들면, 본원에서 화합물은 RTEL1을 표적으로 하는 핵산 분자, 특히 안티센스 올리고뉴클레오티드 또는 siRNA일 수 있다.
올리고뉴클레오티드
본원에서 이용된 용어 "올리고뉴클레오티드"는 당업자에게 일반적으로 이해되는 바와 같이 2개 또는 그 이상의 공유 결합된 뉴클레오시드를 포함하는 분자로서 규정된다. 이런 공유 결합된 뉴클레오시드는 또한 핵산 분자 또는 소중합체로 지칭될 수 있는데, 이들은 교체가능하게 이용될 수 있다.
상세한 설명 및 청구항에서 지칭된 올리고뉴클레오티드는 일반적으로 길이에서 70개 미만 뉴클레오티드의 치료적 올리고뉴클레오티드이다. 올리고뉴클레오티드는 단일 가닥 안티센스 올리고뉴클레오티드이거나 또는 이를 포함할 수 있거나, 또는 다른 소중합성 핵산 분자, 예컨대 CRISPR RNA, siRNA, shRNA, 앱타머 또는 리보자임일 수 있다. 치료적 올리고뉴클레오티드 분자는 통상적으로 실험실에서 고체상 화학적 합성, 그 이후에 정제 및 단리에 의해 제조된다. 하지만, shRNA는 종종 렌티바이러스 벡터를 이용하여 세포에 전달되고, 이후 이들로부터 전사되어 RNA 간섭 기구 (RNA-유도 침묵 복합체 (RISC) 포함)와 상호작용할 수 있는 스템 루프 (헤어핀) RNA 구조를 형성할 단일 가닥 RNA를 생성한다. 본원 발명의 구체예에서 shRNA는 화학적으로 생산된 shRNA 분자이다 (플라스미드 또는 바이러스로부터 세포 기초된 발현에 의존하지 않음).
올리고뉴클레오티드의 서열을 언급할 때, 공유 결합된 뉴클레오티드 또는 뉴클레오시드의 핵염기 모이어티 또는 이의 변형체의 서열 또는 순서가 언급된다. 일반적으로, 본원 발명의 올리고뉴클레오티드는 인공적이고 화학적으로 합성되며 전형적으로 정제 또는 단리된다. 하지만 일부 구체예에서 본원 발명의 올리고뉴클레오티드는 표적 세포 내로 진입 시에 벡터로부터 전사되는 shRNA이다. 본원 발명의 올리고뉴클레오티드는 하나 또는 그 이상의 변형된 뉴클레오시드 또는 뉴클레오티드를 포함할 수 있다.
일부 구체예에서, 본원 발명의 올리고뉴클레오티드는 길이에서 10 내지 70개 뉴클레오티드, 예컨대 길이에서 12 내지 60개, 예컨대 13 내지 50개, 예컨대 14 내지 40개, 예컨대 15 내지 30개, 예컨대 12-25개, 예컨대 16 내지 22개, 예컨대 16 내지 20개의 연속 뉴클레오티드를 포함하거나 또는 이들로 구성된다. 따라서, 본원 발명의 올리고뉴클레오티드는 일부 구체예에서, 12-25개 뉴클레오티드의 길이를 가질 수 있다. 대안으로, 본원 발명의 올리고뉴클레오티드는 일부 구체예에서, 15-22개 뉴클레오티드의 길이를 가질 수 있다.
일부 구체예에서, 올리고뉴클레오티드 또는 이의 연속 뉴클레오티드 서열은 24개 또는 그 이하의 뉴클레오티드, 예컨대 22개의 뉴클레오티드, 예컨대 20개 또는 그 이하의 뉴클레오티드, 예컨대 18개 또는 그 이하의 뉴클레오티드, 예컨대 14, 15, 16 또는 17개의 뉴클레오티드를 포함하거나 또는 이들로 구성된다. 본원에 제공된 임의의 범위는 범위의 종점을 포함하는 것으로 이해되어야 한다. 따라서, 핵산 분자가 12 내지 25개의 뉴클레오티드를 포함한다고 일컬어지는 경우에, 12개 및 25개의 뉴클레오티드 둘 모두 포함된다.
일부 구체예에서, 연속 뉴클레오티드 서열은 길이에서 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21 또는 22개의 연속 뉴클레오티드를 포함하거나 이들로 구성된다.
올리고뉴클레오티드(들)는 포유동물에서 표적 핵산의 발현을 조절하기 위한 것이다. 일부 구체예에서, siRNA, shRNA 또는 안티센스 올리고뉴클레오티드와 같은 핵산 분자는 전형적으로 표적 핵산(들)의 발현을 저해하기 위한 것이다.
본원 발명의 구체예에서, 올리고뉴클레오티드는 RNAi 작용제, 예컨대 siRNA 또는 shRNA에서 선택된다. 다른 구체예에서, 올리고뉴클레오티드는 단일 가닥 안티센스 올리고뉴클레오티드, 예컨대 RNaseH와 상호작용하는 높은 친화성 변형된 안티센스 올리고뉴클레오티드이다.
일부 구체예에서, 본원 발명의 올리고뉴클레오티드는 하나 또는 그 이상의 변형된 뉴클레오시드 또는 뉴클레오티드, 예컨대 2' 당 변형된 뉴클레오시드를 포함할 수 있다.
일부 구체예에서, 올리고뉴클레오티드는 포스포로티오에이트 뉴클레오시드간 연쇄를 포함한다.
일부 구체예에서, 올리고뉴클레오티드는 비-뉴클레오시드 모이어티 (접합 모이어티)에 접합될 수 있다.
올리고뉴클레오티드의 라이브러리는 변이체 올리고뉴클레오티드의 집합물인 것으로 이해되어야 한다. 올리고뉴클레오티드의 라이브러리의 목적은 변할 수 있다. 일부 구체예에서, 올리고뉴클레오티드의 라이브러리는 올리고뉴클레오티드의 라이브러리 내에 가장 강력한 서열을 확인하는 목적으로, 하나 또는 그 이상의 포유류 RTEL1 표적 핵산을 표적으로 하는 중첩되는 핵염기 서열을 갖는 올리고뉴클레오티드로 구성된다. 일부 구체예에서, 올리고뉴클레오티드의 라이브러리는 부모 또는 조상 올리고뉴클레오티드의 올리고뉴클레오티드 설계 변이체 (자식 핵산 분자)의 라이브러리인데, 여기서 이들 올리고뉴클레오티드 설계 변이체는 부모 핵산 분자의 코어 핵염기 서열을 유지한다.
안티센스 올리고뉴클레오티드
본원에서 이용된 용어 "안티센스 올리고뉴클레오티드"는 표적 핵산, 특히 표적 핵산 상의 연속 서열에 혼성화함으로써 표적 유전자의 발현을 조절할 수 있는 올리고뉴클레오티드로서 규정된다. 본원에서 안티센스 올리고뉴클레오티드는 본질적으로 이중 가닥이 아니고, 그리고 이런 이유로 siRNA 또는 shRNA가 아니다. 바람직하게는, 본원 발명의 안티센스 올리고뉴클레오티드는 단일 가닥이다. 본원 발명의 단일 가닥 올리고뉴클레오티드는, 내적으로 또는 상호간에 자기-상보성의 정도가 올리고뉴클레오티드의 전체 길이에 걸쳐 50% 미만인 한, 헤어핀 또는 분자간 이중나선 구조 (동일한 올리고뉴클레오티드의 두 분자 사이의 이중나선)를 형성할 수 있는 것으로 이해된다.
바람직하게는, 본원 발명의 단일 가닥 안티센스 올리고뉴클레오티드는 RNA 뉴클레오시드를 내포하지 않는데, 그 이유는 이것이 뉴클레아제 내성을 감소시킬 것이기 때문이다.
바람직하게는, 본원 발명의 올리고뉴클레오티드는 하나 또는 그 이상의 변형된 뉴클레오시드 또는 뉴클레오티드, 예컨대 2' 당 변형된 뉴클레오시드를 포함한다. 또한, 변형되지 않은 뉴클레오시드는 DNA 뉴클레오시드인 것이 바람직하다.
RNAi 분자
본원에서, 용어 "RNA 간섭 (RNAi) 분자"는 세포의 세포질에서 RNA-유도된 침묵 복합체 (RISC)를 통해 RNA-의존성 유전자 침묵을 유도할 수 있는 짧은 이중 가닥 RNA 기초된 올리고뉴클레오티드를 지칭하는데, 여기서 이들은 촉매성 RISC 성분 아르고노트와 상호작용한다. RNAi 분자는 세포, 예를 들면, 개체, 예컨대 포유류 개체 내에 세포에서 표적 핵산의 발현을 조절한다, 예를 들면, 저해한다. RNAi 분자의 한 가지 유형은 짧은 간섭 RNA (siRNA)인데, 이것은 2개의 상보성 올리고뉴클레오티드로 구성되는 이중 가닥 RNA 분자이고, 여기서 전사 후 상보성 mRNA에 한쪽 가닥의 결합은 이의 분해 및 번역의 상실을 야기한다. 작은 헤어핀 RNA (shRNA)는 DICER 및 RNA 유도된 침묵 복합체 (RISC)를 통해 mRNA를 감소시킬 수 있는 스템 루프 (헤어핀) 구조를 형성하는 단일 가닥 RNA-기초된 올리고뉴클레오티드이다. RNAi 분자는 관심되는 유전자의 서열 (표적 핵산)에 기초하여 설계될 수 있다. 상응하는 RNAi는 이후, 화학적으로 또는 시험관내 전사에 의해 합성되거나, 또는 벡터 또는 PCR 산물로부터 발현될 수 있다.
siRNA
용어 siRNA는 짧은 간섭 리보핵산 RNAi 분자를 지칭한다. 이것은 이중 가닥 RNA 분자의 한 부류이며, 당해 분야에서 짧은 간섭 RNA 또는 침묵 RNA로서 또한 알려져 있다. siRNA는 전형적으로 센스 가닥 (운송 가닥으로서 또한 지칭됨) 및 안티센스 가닥 (안내 가닥으로서 또한 지칭됨)을 포함하는데, 여기서 각 가닥은 길이에서 17 - 30개 뉴클레오티드, 전형적으로 길이에서 19 - 25개 뉴클레오시드이고, 여기서 상기 안티센스 가닥은 표적 핵산 (적절하게는 성숙 mRNA 서열)에 상보적, 예컨대 적어도 95% 상보적, 예컨대 완전히 상보적이고, 그리고 센스 가닥은 센스 가닥 및 안티센스 가닥이 이중나선 또는 이중나선 영역을 형성하도록 안티센스 가닥에 상보적이다. siRNA 가닥은 평활 말단 이중나선을 형성할 수 있거나, 또는 유리하게는 센스와 안티센스 가닥 3' 단부는 생체내에서 RISC 기질을 형성하는, Dicer에 의해 생산된 산물과 유사한 예를 들면, 1, 2 또는 3개 뉴클레오시드의 3' 오버행을 형성할 수 있다. 효과적인 신장된 형태의 Dicer 기질은 본원에 참조로서 편입된 US 8,349,809 및 US 8,513,207에서 기술되었다. 일부 구체예에서, 센스 가닥 및 안티센스 가닥 둘 모두 2nt 3' 오버행을 갖는다. 이중나선 영역은 이런 이유로, 예를 들면, 길이에서 17 - 25개 뉴클레오티드, 예컨대 길이에서 21-23개 뉴클레오티드일 수 있다.
일단 세포 내부에 위치하면, 안티센스 가닥은 RISC 복합체 내로 통합되고, 이것은 표적 핵산의 표적 분해 또는 표적 저해를 매개한다. siRNA는 전형적으로 RNA 뉴클레오시드 이외에 변형된 뉴클레오시드를 포함한다. 한 구체예에서 siRNA 분자는 변형된 뉴클레오티드간 연쇄 및 2' 당 변형된 뉴클레오시드, 예컨대 LNA 및 cET 또는 2'-O-알킬-RNA, 2'-O-메틸-RNA, 2'-알콕시-RNA, 2'-O-메톡시에틸-RNA (MOE), 2'-아미노-DNA, 2'-플루오로-DNA, 아라비노 핵산 (ANA), 2'-플루오로-ANA의 2' 치환된 변형체를 비롯한, 2'-4' 이중환상 리보오스 변형된 뉴클레오시드를 이용하여 화학적으로 변형될 수 있다. 특히 2'플루오로, 2'-O-메틸 또는 2'-O-메톡시에틸이 siRNA 내로 통합될 수 있다.
일부 구체예에서 siRNA 센스 (운송) 가닥의 모든 뉴클레오티드는 2' 당 변형된 뉴클레오시드, 예컨대 LNA으로 변형될 수 있다 (참조: 예를 들면, WO2004/083430, WO2007/085485). 일부 구체예에서 siRNA의 운송 가닥은 불연속적일 수 있다 (참조: 예를 들면, WO2007/107162). siRNA의 안티센스 가닥의 씨앗 영역에서 발생하는 열에 의한 불안정화 뉴클레오티드의 통합은 siRNA의 표적 이탈 활성을 감소시키는 데 유용한 것으로 보고되었다 (참조: 예를 들면, WO2018/098328). 적절하게는 siRNA는 안티센스 가닥의 5' 단부에서 5' 인산염 기 또는 5'-인산염 모방체를 포함한다. 일부 구체예에서 안티센스 가닥의 5' 단부는 RNA 뉴클레오시드이다.
한 구체예에서, siRNA 분자는 적어도 하나의 포스포로티오에이트 또는 메틸포스포네이트 뉴클레오시드간 연쇄를 더욱 포함한다. 포스포로티오에이트 또는 메틸포스포네이트 뉴클레오시드간 연쇄는 어느 한쪽 또는 양쪽 가닥 (예를 들면, 안티센스 가닥; 또는 센스 가닥)의 3' 말단에 있을 수 있거나; 또는 포스포로티오에이트 또는 메틸포스포네이트 뉴클레오시드간 연쇄는 어느 한쪽 또는 양쪽 가닥 (예를 들면, 안티센스 가닥; 또는 센스 가닥)의 5' 말단에 있을 수 있거나; 또는 포스포로티오에이트 또는 메틸포스포네이트 뉴클레오시드간 연쇄는 어느 한쪽 또는 양쪽 가닥 (예를 들면, 안티센스 가닥; 또는 센스 가닥)의 5' 말단 및 3' 말단 둘 모두에 있을 수 있다. 일부 구체예에서 나머지 뉴클레오시드간 연쇄는 포스포디에스테르 연쇄이다. 일부 구체예에서, siRNA 분자는 하나 또는 그 이상의 포스포로티오에이트 뉴클레오시드간 연쇄를 포함한다. siRNA 분자에서 포스포로티오에이트 뉴클레오시드간 연쇄는 RICS에서 뉴클레아제 개열을 감소시킬 수 있고, 이런 이유로 안티센스 가닥에서 모든 뉴클레오시드간 연쇄가 변형되지는 않는 것이 바람직하다.
siRNA 분자는 리간드를 더욱 포함할 수 있다. 일부 구체예에서, 리간드는 센스 가닥의 3' 단부에 접합된다.
생물학적 분포를 위해, siRNA는 표적화 리간드에 접합될 수 있고 및/또는 예를 들면, 지질 나노입자로 조제될 수 있다.
본원 발명의 다른 양상은 dsRNA, 예컨대 치료적 용도에 적합한 siRNA 분자를 포함하는 제약학적 조성물, 그리고 예를 들면, 본원에서 개시된 바와 같은 다양한 질환 상태의 치료를 위해 이들 dsRNA 분자, 예컨대 본원 발명의 siRNA를 투여함으로써 표적 유전자의 발현을 저해하는 방법에 관계한다.
shRNA
짧은 헤어핀 RNA 또는 shRNA 분자는 일반적으로 길이에서 40 내지 70개의 뉴클레오티드, 예컨대 길이에서 45 내지 65개의 뉴클레오티드, 예컨대 길이에서 50 내지 60개의 뉴클레오티드이고 스템 루프 (헤어핀) RNA 구조를 형성하는데, 상기 구조는 Dicer로 알려진 엔도뉴클레아제와 상호작용하고, 이것은 dsRNA를 특징적인 2개의 염기 3' 오버행을 갖는 19-23개 염기쌍 짧은 간섭 RNA로 처리하는 것으로 생각되고, 이들은 이후 RNA-유도 침묵 복합체 (RISC) 내로 통합된다. 적합한 표적 mRNA에 결합 시에, RISC 내에 하나 또는 그 이상의 엔도뉴클레아제가 표적을 개열하여 침묵을 유도한다. RNAi 올리고뉴클레오티드는 변형된 뉴클레오티드간 연쇄 및 2' 당 변형된 뉴클레오시드, 예컨대 LNA 및 cET 또는 2'-O-알킬-RNA, 2'-O-메틸-RNA, 2'-알콕시-RNA, 2'-O-메톡시에틸-RNA (MOE), 2'-아미노-DNA, 2'-플루오로-DNA, 아라비노 핵산 (ANA), 2'-플루오로-ANA의 2' 치환된 변형체를 비롯한 2'-4' 이중환상 리보오스 변형된 뉴클레오시드를 이용하여 화학적으로 변형될 수 있다.
일부 구체예에서, shRNA 핵산 분자는 하나 또는 그 이상의 포스포로티오에이트 뉴클레오시드간 연쇄를 포함한다. RNAi 분자에서 포스포로티오에이트 뉴클레오시드간 연쇄는 RICS에서 뉴클레아제 개열을 감소시킬 수 있고, 이런 이유로 shRNA 분자의 스템 루프에서 모든 뉴클레오시드간 연쇄가 변형되지는 않는 것이 바람직하다. 포스포로티오에이트 뉴클레오시드간 연쇄는 바람직하게는 shRNA 분자의 스템 루프의 3' 및/또는 5' 단부 내에, 특히 표적 핵산에 상보적이지 않은 분자의 부분 (예를 들면, siRNA 분자의 센스 가닥 또는 운송 가닥) 내에 위치할 수 있다. 하지만, 표적 핵산에 상보적인 shRNA 분자의 영역은 또한, Dicer에 의한 개열 이후에 3' 및/또는 5' 말단이 될 것으로 예측되는 부분에서 첫 2 내지 3개의 뉴클레오시드간 연쇄에서 변형될 수도 있다.
연속 뉴클레오티드 서열
용어 "연속 뉴클레오티드 서열"은 표적 핵산에 상보적인 올리고뉴클레오티드의 영역을 지칭한다. 상기 용어는 본원에서 용어 "연속 핵염기 서열" 및 용어 "올리고뉴클레오티드 모티프 서열"과 교체가능하게 이용된다. 일부 구체예에서, 올리고뉴클레오티드의 모든 뉴클레오티드는 연속 뉴클레오티드 서열을 구성한다. 일부 구체예에서 연속 뉴클레오티드 서열은 siRNA 분자의 안내 가닥 내에 포함된다. 일부 구체예에서 연속 뉴클레오티드 서열은 표적 핵산에 100% 상보적인 shRNA 분자의 부분이다. 일부 구체예에서 올리고뉴클레오티드는 연속 뉴클레오티드 서열, 예컨대 F-G-F' 갭머 영역을 포함하고, 그리고 기능기 (예를 들면, 표적화를 위한 접합체 기)를 연속 뉴클레오티드 서열에 부착하는 데 이용될 수 있는 추가 뉴클레오티드(들), 예를 들면 뉴클레오티드 링커 영역을 임의적으로 포함할 수 있다. 뉴클레오티드 링커 영역은 표적 핵산에 상보적이거나 상보적이지 않을 수 있다. 일부 구체예에서, 안티센스 올리고뉴클레오티드의 핵염기 서열은 연속 뉴클레오티드 서열이다. 일부 구체예에서, 연속 뉴클레오티드 서열은 표적 핵산에 100% 상보적이다.
뉴클레오티드 및 뉴클레오시드
뉴클레오티드 및 뉴클레오시드는 올리고뉴클레오티드 및 폴리뉴클레오티드의 빌딩 블록이고, 그리고 본원 발명의 목적을 위해 자연 발생 및 비자연 발생 뉴클레오티드 및 뉴클레오시드를 모두 포함한다. 자연에서, 뉴클레오티드, 예컨대 DNA와 RNA 뉴클레오티드는 리보오스 당 모이어티, 핵염기 모이어티 및 하나 또는 그 이상의 인산염 기 (뉴클레오시드에는 없음)를 포함한다. 뉴클레오시드 및 뉴클레오티드는 또한 "단위" 또는 "단량체"로 교체가능하게 지칭될 수 있다.
변형된 뉴클레오시드
본원에서 이용된 용어 "변형된 뉴클레오시드" 또는 "뉴클레오시드 변형"은 당 모이어티 또는 (핵)염기 모이어티에 하나 또는 그 이상의 변형을 도입함으로써 등가 DNA 또는 RNA 뉴클레오시드와 비교하여 변형된 뉴클레오시드를 지칭한다. 바람직한 구체예에서, 변형된 뉴클레오시드는 변형된 당 모이어티를 포함한다. 용어 변형된 뉴클레오시드는 또한 본원에서 용어 "뉴클레오시드 유사체" 또는 변형된 "단위" 또는 변형된 "단량체"와 교체가능하게 이용될 수 있다. 변형되지 않은 DNA 또는 RNA 당 모이어티를 갖는 뉴클레오시드는 본원에서 DNA 또는 RNA 뉴클레오시드로 명명된다. DNA 또는 RNA 뉴클레오시드의 염기 영역 내에서 변형을 갖는 뉴클레오시드는 왓슨 크릭 (Watson Crick) 염기 대합을 허용하면, 여전히 일반적으로 DNA 또는 RNA로 명명된다.
변형된 뉴클레오시드간 연쇄
용어 "변형된 뉴클레오시드간 연쇄"는 당업자에 의해 일반적으로 이해되는 바와 같이 2개의 뉴클레오시드를 함께 공유 결합하는, 포스포디에스테르 (PO) 연쇄 이외의 연쇄로서 규정된다. 본원 발명의 올리고뉴클레오티드는 이런 이유로, 하나 또는 그 이상의 변형된 뉴클레오시드간 연쇄, 예컨대 하나 또는 그 이상의 포스포로티오에이트 뉴클레오시드간 연쇄, 또는 하나 또는 그 이상의 포스포로디티오에이트 뉴클레오시드간 연쇄를 포함할 수 있다. 일부 구체예에서, 변형된 뉴클레오시드간 연쇄는 포스포디에스테르 연쇄와 비교하여 올리고뉴클레오티드의 뉴클레아제 내성을 증가시킨다. 자연 발생 올리고뉴클레오티드의 경우, 뉴클레오시드간 연쇄는 인접한 뉴클레오시드 사이에 포스포디에스테르 결합을 생성하는 인산염 기를 포함한다. 변형된 뉴클레오시드간 연쇄는 생체내 이용을 위해 올리고뉴클레오티드를 안정화시키는 데 특히 유용하고, 그리고 본원 발명의 올리고뉴클레오티드 내에 DNA 또는 RNA 뉴클레오시드의 영역에서, 예를 들면 갭머 올리고뉴클레오티드의 갭 영역 G 내에서 뿐만 아니라 영역 F 및 F'와 같은 변형된 뉴클레오시드의 영역에서 뉴클레아제 개열로부터 보호하는 역할을 할 수 있다.
한 구체예에서, 올리고뉴클레오티드는 자연 포스포디에스테르로부터 변형된 하나 또는 그 이상의 뉴클레오시드간 연쇄, 예컨대 뉴클레아제 공격에 더욱 내성이 있는 하나 또는 그 이상의 변형된 뉴클레오시드간 연쇄를 포함한다. 뉴클레아제 내성은 혈청에서 올리고뉴클레오티드를 배양함으로써 또는 뉴클레아제 내성 분석 (예를 들면, 뱀 독 포스포디에스테라아제 (SVPD))을 이용함으로써 판별될 수 있으며, 이들 둘 모두 당해 분야에 잘 알려져 있다. 올리고뉴클레오티드의 뉴클레아제 내성을 향상시킬 수 있는 뉴클레오시드간 연쇄는 뉴클레아제 내성 뉴클레오시드간 연쇄로 지칭된다. 일부 구체예에서 올리고뉴클레오티드 또는 이의 연속 뉴클레오티드 서열에서 뉴클레오시드간 연쇄 중에서 적어도 50%가 변형된다, 예컨대 올리고뉴클레오티드 또는 이의 연속 뉴클레오티드 서열에서 뉴클레오시드간 연쇄 중에서 적어도 60%, 예컨대 적어도 70%, 예컨대 적어도 75%, 예컨대 적어도 80%, 또는 예컨대 적어도 90%가 변형된다. 일부 구체예에서 올리고뉴클레오티드 또는 이의 연속 뉴클레오티드 서열의 모든 뉴클레오시드간 연쇄가 변형된다. 일부 구체예에서 본원 발명의 올리고뉴클레오티드를 비뉴클레오티드 기능기, 예컨대 접합체에 연결하는 뉴클레오시드는 포스포디에스테르일 수 있는 것으로 인식될 것이다. 일부 구체예에서, 올리고뉴클레오티드 또는 이의 연속 뉴클레오티드 서열의 모든 뉴클레오시드간 연쇄는 뉴클레아제 내성 뉴클레오시드간 연쇄이다.
본원 발명의 올리고뉴클레오티드에서 포스포로티오에이트 뉴클레오시드간 연쇄를 이용하는 것이 바람직하다.
포스포로티오에이트 뉴클레오시드간 연쇄는 뉴클레아제 내성, 유리한 약물동력학 및 제조 용이성으로 인해 특히 유용하다. 일부 구체예에서, 올리고뉴클레오티드 또는 이의 연속 뉴클레오티드 서열에서 뉴클레오시드간 연쇄 중에서 적어도 50%는 포스포로티오에이트이다, 예컨대 올리고뉴클레오티드 또는 이의 연속 뉴클레오티드 서열에서 뉴클레오시드간 연쇄 중에서 적어도 60%, 예컨대 적어도 70%, 예컨대 적어도 75%, 예컨대 적어도 80%, 또는 예컨대 적어도 90%는 포스포로티오에이트이다. 일부 구체예에서, 올리고뉴클레오티드 또는 이의 연속 뉴클레오티드 서열의 모든 뉴클레오시드간 연쇄는 포스포로티오에이트이다.
포스포로티오에이트 연쇄와 같은 뉴클레아제 내성 연쇄는 표적 핵산과 이중나선을 형성할 때 뉴클레아제를 모집할 수 있는 올리고뉴클레오티드 영역, 예컨대 갭머의 경우 영역 G에서 특히 유용하다. 하지만, 포스포로티오에이트 연쇄는 또한 비-뉴클레아제 모집 영역 및/또는 친화성 향상 영역, 예컨대 갭머의 경우 영역 F 및 F'에서 유용할 수 있다. 갭머 올리고뉴클레오티드는 일부 구체예에서 영역 F 또는 F'에서, 또는 영역 F 및 영역 F' 둘 모두에서 하나 또는 그 이상의 포스포디에스테르 연쇄를 포함할 수 있고, 여기서 영역 G에서 모든 뉴클레오시드간 연쇄는 포스포로티오에이트일 수 있다.
유리하게는, 올리고뉴클레오티드의 연속 뉴클레오티드 서열의 모든 뉴클레오시드간 연쇄는 포스포로티오에이트이거나, 또는 올리고뉴클레오티드의 모든 뉴클레오시드간 연쇄는 포스포로티오에이트 연쇄이다.
EP 2 742 135에서 개시된 바와 같이, 안티센스 올리고뉴클레오티드는 다른 뉴클레오시드간 연쇄 (포스포디에스테르 및 포스포로티오에이트 이외에), 예를 들면 EP 2 742 135에 따라서 예를 들면 그 외의 DNA 포스포로티오에이트 갭 영역에서 용인될 수 있는 알킬 포스포네이트/메틸 포스포네이트 뉴클레오시드간 연쇄를 포함할 수 있는 것으로 인식된다.
핵염기
용어 핵염기는 핵산 혼성화에서 수소 결합을 형성하는 뉴클레오시드 및 뉴클레오티드 내에 존재하는 퓨린 (예를 들면, 아데닌 및 구아닌) 및 피리미딘 (예를 들면, 우라실, 티민 및 시토신) 모이어티를 포함한다. 본원 발명의 맥락에서, 용어 핵염기는 또한 자연 발생 핵염기와는 다를 수 있지만 핵산 혼성화 동안 기능적인 변형된 핵염기를 포괄한다. 이러한 맥락에서, "핵염기"는 아데닌, 구아닌, 시토신, 티미딘, 우라실, 크산틴 및 히포크산틴과 같은 자연 발생 핵염기뿐만 아니라 비-자연 발생 변이체 둘 모두를 지칭한다. 이런 변이체는 예를 들면 Hirao et al (2012) Accounts of Chemical Research vol 45 page 2055 및 Bergstrom (2009) Current Protocols in Nucleic Acid Chemistry Suppl. 37 1.4.1에서 기술된다.
일부 구체예에서, 핵염기 모이어티는 퓨린 또는 피리미딘을 변형된 퓨린 또는 피리미딘, 예컨대 치환된 퓨린 또는 치환된 피리미딘, 예컨대 이소시토신, 슈도이소시토신, 5-메틸 시토신, 5-티오졸로-시토신, 5-프로피닐-시토신, 5-프로피닐-우라실, 5-브로모우라실, 5-티아졸로-우라실, 2-티오-우라실, 2'-티오-티민, 이노신, 디아미노퓨린, 6-아미노퓨린, 2-아미노퓨린, 2,6-디아미노퓨린 및 2-클로로-6-아미노퓨린에서 선택되는 핵염기로 변화시킴으로써 변형된다.
핵염기 모이어티는 각각의 상응하는 핵염기에 대한 문자 코드, 예를 들면 A, T, G, C 또는 U로 표시될 수 있는데, 여기서 각 문자는 등가 기능의 변형된 핵염기를 임의적으로 포함할 수 있다. 예를 들면, 예시된 올리고뉴클레오티드에서, 핵염기 모이어티는 A, T, G, C 및 5-메틸 시토신에서 선택된다. 임의적으로, LNA 갭머의 경우, 5-메틸 시토신 LNA 뉴클레오시드가 이용될 수 있다.
변형된 올리고뉴클레오티드
용어 변형된 올리고뉴클레오티드는 하나 또는 그 이상의 당-변형된 뉴클레오시드 및/또는 변형된 뉴클레오시드간 연쇄를 포함하는 올리고뉴클레오티드를 설명한다. 용어 "키메라 올리고뉴클레오티드"는 변형된 뉴클레오시드 및 DNA 뉴클레오시드를 갖는 올리고뉴클레오티드를 설명하기 위해 문헌에서 이용된 용어이다. 본원 발명의 안티센스 올리고뉴클레오티드는 유리하게는 키메라 올리고뉴클레오티드이다.
상보성
용어 "상보성"은 뉴클레오시드/뉴클레오티드의 왓슨-크릭 염기 대합에 대한 능력을 설명한다. 왓슨-크릭 염기쌍은 구아닌 (G)-시토신 (C) 및 아데닌 (A)-티민 (T)/우라실 (U)이다. 올리고뉴클레오티드는 변형된 핵염기를 갖는 뉴클레오시드를 포함할 수 있는 것으로 이해될 것이다, 예를 들면 5-메틸 시토신이 종종 시토신을 대신하여 이용되고, 그리고 그 결과 용어 상보성은 변형되지 않은 핵염기 및 변형된 핵염기 사이의 왓슨 크릭 염기 대합을 포괄한다 (참조: 예를 들면, Hirao et al. (2012) Accounts of Chemical Research vol 45 page 2055 및 Bergstrom (2009) Current Protocols in Nucleic Acid Chemistry Suppl. 37 1.4.1).
본원에서 이용된 용어 "% 상보성"은 연속 뉴클레오티드 서열 전역에서 참조 서열 (예를 들면, 표적 서열 또는 서열 모티프)에 상보적인, 핵산 분자 (예를 들면, 올리고뉴클레오티드) 내에 연속 뉴클레오티드 서열의 뉴클레오티드의 비율 (퍼센트로 표시)을 의미한다. 상보성의 백분율은 따라서 2개의 서열 사이에서 상보적인 정렬된 핵염기 (왓슨 크릭 염기쌍으로부터)의 숫자를 계수하고 (5'-3'로 표적 서열 및 3'-5'로 올리고뉴클레오티드 서열과 함께 정렬될 때), 상기 숫자를 올리고뉴클레오티드 내에 뉴클레오티드의 총 수로 나누고, 그리고 여기에 100을 곱함으로써 계산한다. 이런 비교에서, 정렬되지 않은 (염기쌍을 형성하는) 핵염기/뉴클레오티드는 부정합 (mismatch)으로 명명된다. 삽입 및 결실은 연속 뉴클레오티드 서열의 % 상보성의 계산에서 허용되지 않는다. 왓슨 크릭 염기 대합을 형성할 수 있는 핵염기의 기능적 능력이 유지되는 한, 상보성을 결정함에 있어서 핵염기의 화학적 변형은 무시되는 것으로 이해될 것이다 (예를 들면, 5'-메틸 시토신은 % 상보성을 계산할 목적으로 시토신과 동일한 것으로 간주된다).
용어 "완전히 상보적"은 100% 상보성을 의미한다.
다음은 표적 핵산 (서열 번호: 11)과 완전히 상보적인 올리고뉴클레오티드 모티프 (서열 번호: 33)의 예이다.
5'- CTTTGACCAGAGTATGTAAAATTCTC-3' (서열 번호: 11)
3'-AAACTGGTCTCATACATTTT -5' (서열 번호: 33)
동일성
본원에서 이용된 용어 "동일성"은 연속 뉴클레오티드 서열 전역에서 참조 서열 (예를 들면, 서열 모티프)와 동일한 핵산 분자 (예를 들면, 올리고뉴클레오티드) 내에 연속 뉴클레오티드 서열의 뉴클레오티드의 비율 (퍼센트로 표시)을 의미한다. 따라서 동일성의 백분율은 두 서열 (본원 발명의 화합물의 연속 뉴클레오티드 서열에서 및 참조 서열에서) 사이에서 동일한 정렬된 핵염기 (정합)의 숫자를 계수하고, 상기 숫자를 올리고뉴클레오티드 내에 뉴클레오티드의 총 수로 나누고, 그리고 여기에 100을 곱함으로써 계산한다. 이런 이유로, 동일성의 백분율 = (정합 x 100)/정렬된 영역 (예를 들면, 연속 뉴클레오티드 서열)의 길이. 삽입 및 결실은 연속 뉴클레오티드 서열의 동일성의 백분율을 계산할 때 허용되지 않는다. 왓슨 크릭 염기 대합을 형성할 수 있는 핵염기의 기능적 능력이 유지되는 한, 동일성을 결정함에 있어서 핵염기의 화학적 변형은 무시되는 것으로 이해될 것이다 (예를 들면, 5-메틸 시토신은 % 동일성을 계산할 목적으로 시토신과 동일한 것으로 간주된다).
혼성화
본원에서 이용된 용어 "혼성화하는" 또는 "혼성화한다"는 두 핵산 가닥 (예를 들면, 올리고뉴클레오티드 및 표적 핵산)이 반대 가닥 상의 염기쌍 사이에 수소 결합을 형성함으로써 이중나선을 형성하는 것으로 이해되어야 한다. 두 핵산 가닥 사이의 결합 친화성은 혼성화의 강도이다. 이것은 올리고뉴클레오티드의 절반이 표적 핵산과 이중나선을 형성하는 온도로서 규정되는 용융 온도 (Tm)의 관점에서 종종 설명된다. 생리학적 조건에서 Tm은 친화성과 엄격하게 비례하지는 않는다 (Mergny and Lacroix, 2003,Oligonucleotides 13:515-537). 표준 상태 Gibbs 자유 에너지 △G°는 결합 친화성을 나타내는 더욱 정확한 표시이고 △G° = -RTln(Kd)에 의한 반응의 해리 상수 (Kd)와 관련되는데, 여기서 R은 기체 상수이고 T는 절대 온도이다. 이런 이유로, 올리고뉴클레오티드 및 표적 핵산 사이에 반응의 매우 낮은 △G°는 올리고뉴클레오티드 및 표적 핵산 사이의 강한 혼성화를 반영한다. △G°는 수성 농도가 1M이고, pH가 7이고, 온도가 37℃인 반응과 연관된 에너지이다. 표적 핵산에 대한 올리고뉴클레오티드의 혼성화는 자발적 반응이고, 그리고 자발적 반응의 경우 △G°는 0보다 작다. △G°는, 예를 들면 Hansen et al., 1965,Chem. Comm. 36-38 및 Holdgate et al., 2005, Drug Discov Today에서 기술된 바와 같이 등온 적정 열량 측정 (ITC) 방법을 이용하여 실험적으로 계측될 수 있다. 당업자는 상용 장비가 △G° 계측에 이용가능하다는 것을 알 것이다. △G°는 또한, Sugimoto et al., 1995, Biochemistry 34:11211-11216 및 McTigue et al., 2004, Biochemistry 43:5388-5405에 의해 기술된 적절하게 도출된 열역학 매개변수를 이용하는, SantaLucia, 1998, Proc Natl Acad Sci USA. 95: 1460-1465에 의해 기술된 바와 같은 최근접 이웃 모델을 이용함으로써 수치적으로 추정될 수 있다. 혼성화에 의해 의도된 핵산 표적을 조절할 수 있는 가능성을 갖기 위해, 본원 발명의 올리고뉴클레오티드는 길이에서 10-30개의 뉴클레오티드인 올리고뉴클레오티드에 대해 -10 kcal 미만의 추정된 △G° 값으로 표적 핵산에 혼성화한다. 일부 구체예에서, 혼성화의 정도 또는 강도는 표준 상태 Gibbs 자유 에너지 △G°에 의해 계측된다. 올리고뉴클레오티드는 길이에서 8-30개의 뉴클레오티드인 올리고뉴클레오티드에 대해 -10 kcal의 범위 미만, 예컨대 -15 kcal 미만, 예컨대 -20 kcal 미만 및 예컨대 -25 kcal 미만의 추정된 △G° 값으로 표적 핵산에 혼성화할 수 있다. 일부 구체예에서, 올리고뉴클레오티드는 -10 내지 -60 kcal, 예컨대 -12 내지 -40 kcal, 예컨대 -15 내지 -30 kcal 또는 -16 내지 -27 kcal, 예컨대 -18 내지 -25 kcal의 추정된 △G° 값으로 표적 핵산에 혼성화한다.
표적 핵산
본원 발명에 따라서, 표적 핵산은 포유류 RTEL1을 인코딩하는 핵산이고, 그리고 예를 들면 유전자, RNA, mRNA 및 프리-mRNA, 성숙 mRNA 또는 cDNA 서열일 수 있다. 이런 이유로, 표적은 RTEL1 표적 핵산으로 지칭될 수 있다.
본원 발명의 올리고뉴클레오티드는 예를 들면 포유류 RTEL1의 표적 엑손 영역 (특히, siRNA 및 shRNA 표적 엑손 영역뿐만 아니라 안티센스 올리고뉴클레오티드)일 수 있거나, 또는 예를 들면 RTEL1 프리-mRNA에서 표적 인트론 영역 (특히, 안티센스 올리고뉴클레오티드 표적 인트론 영역)일 수 있다. 인간 RTEL1 유전자는 15개의 전사체를 인코딩하고, 이들 중에서 7개는 단백질 코딩이고, 그리고 이런 이유로 잠재적인 핵산 표적이다. 표 1은 서열 번호: 1의 인간 RTEL1 프리-mRNA 상에 위치된 대로, 이들 7개 전사체의 예측된 엑손과 인트론 영역을 열거한다. 본원 발명의 올리고뉴클레오티드는 표 1에서 열거된 전사체 중에서 하나 또는 그 이상의 성숙 mRNA 서열을 표적으로 할 수 있는 것으로 이해된다.
표 1. 상이한 단백질 코딩 RTEL1 mRNA 전사체에 대한 인간 RTEL1 프리-mRNA (서열 번호: 1)에서 전사체, 엑손 및 인트론 영역
Figure pct00001
Figure pct00002
Figure pct00003
Figure pct00004
Figure pct00005
Figure pct00006
Figure pct00007
Figure pct00008
적절하게는, 표적 핵산은 RTEL1 단백질, 특히 포유류 RTEL1, 예컨대 인간 RTEL1 (참조: 예를 들면, 표 2 및 3)을 인코딩하는데, 이것은 인간과 원숭이 RTEL1에 대한 프리-mRNA 서열을 제공한다.
일부 구체예에서, 표적 핵산은 서열 번호: 1 및/또는 2 또는 이들의 자연 발생 변이체 (예를 들면, 표 1에서 포유류 RTEL1 단백질을 인코딩하는 서열)에서 선택된다.
연구 또는 진단에서 본원 발명의 올리고뉴클레오티드를 이용하는 경우, 표적 핵산은 cDNA, 또는 DNA 또는 RNA로부터 유래된 합성 핵산일 수 있다.
생체내 또는 시험관내 적용을 위해, 본원 발명의 올리고뉴클레오티드는 전형적으로 RTEL1 표적 핵산을 발현하는 세포 내에서 RTEL1 표적 핵산의 발현을 저해할 수 있다. 본원 발명의 올리고뉴클레오티드의 핵염기의 연속 서열은 올리고뉴클레오티드의 길이에 걸쳐 계측되는 바와 같이, 임의적으로 하나 또는 두 개의 부정합을 제외하고, 그리고 임의적으로 올리고뉴클레오티드를 임의적 기능기, 예컨대 접합체 또는 다른 비-상보적 말단 뉴클레오티드 (예를 들면, 영역 D' 또는 D'')에 결합시킬 수 있는 뉴클레오티드 기반의 링커 영역을 제외하고, 전형적으로 RTEL1 표적 핵산에 상보적이다. 표적 핵산은 일부 구체예에서, RNA 또는 DNA, 예컨대 전령 RNA, 예컨대 성숙 mRNA (예를 들면, 표 1에서 열거된 전사체의 엑손 영역) 또는 프리-mRNA일 수 있다.
일부 구체예에서 표적 핵산은 포유류 RTEL1 단백질, 예컨대 인간 RTEL1을 인코딩하는 RNA 또는 DNA, 예를 들면, 인간 RTEL1 mRNA 서열, 예컨대 서열 번호 1로서 개시된 것이다. 예시적인 표적 핵산에 대한 추가 정보는 표 2 및 3에 제시된다.
표 2. 종간 RTEL1에 대한 유전체 및 조립 정보.
Figure pct00009
Fwd = 정방향 가닥. 유전체 좌표는 프리-mRNA 서열 (유전체 서열)을 제공한다. NCBI 참조는 mRNA 서열 (cDNA 서열)을 제공한다.
표 3. 종간 RTEL1에 대한 서열 상세 정보.
Figure pct00010
서열 번호 2가 복수의 NNNNs의 영역을 포함하고, 여기서 염기서열결정이 상기 서열을 정확하게 정밀화할 수 없었고, 그리고 이런 이유로, 축중 서열이 포함된다는 점에 유의한다. 의심할 여지를 없애기 위해 본원 발명의 화합물은 실제 표적 서열에 상보적이고, 그리고 이런 이유로, 축중 화합물이 아니다.
일부 구체예에서, 표적 핵산은 서열 번호 1이다.
일부 구체예에서, 표적 핵산은 서열 번호 2이다.
표적 서열
본원에서 이용된 용어 "표적 서열"은 본원 발명의 올리고뉴클레오티드에 상보적인 핵염기 서열을 포함하는 표적 핵산 내에 존재하는 뉴클레오티드의 서열을 지칭한다. 일부 구체예에서, 표적 서열은 본원 발명의 올리고뉴클레오티드의 연속 뉴클레오티드 서열에 상보적인 핵염기 서열을 갖는 표적 핵산 상의 영역으로 구성된다. 표적 핵산의 이러한 영역은 표적 뉴클레오티드 서열, 표적 서열 또는 표적 영역으로 교체가능하게 지칭될 수 있다. 일부 구체예에서, 표적 서열은 단일 올리고뉴클레오티드의 상보적 서열보다 길고, 그리고 예를 들면 본원 발명의 몇몇 올리고뉴클레오티드에 의해 표적화될 수 있는 표적 핵산의 바람직한 영역을 나타낼 수 있다.
일부 구체예에서, 표적 서열은 인간 RTEL1 mRNA 엑손, 예컨대 상기 표 1에서 목록으로부터 선택된 RTEL1 인간 mRNA 엑손으로 구성된 군에서 선택되는 서열이다.
일부 구체예에서, 표적 서열은 인간 RTEL1 mRNA 인트론, 예컨대 상기 표 1에서 목록으로부터 선택된 RTEL1 인간 mRNA 인트론으로 구성된 군에서 선택되는 서열이다.
본원 발명의 올리고뉴클레오티드는 표적 핵산, 예컨대 본원에서 기술된 표적 서열에 상보적이거나 또는 이것에 혼성화하는 연속 뉴클레오티드 서열을 포함한다.
올리고뉴클레오티드가 상보적이거나 또는 혼성화하는 표적 서열은 일반적으로 적어도 10개 뉴클레오티드의 연속 핵염기 서열을 포함한다. 연속 뉴클레오티드 서열은 10 내지 35개의 뉴클레오티드, 예컨대 12 내지 30개, 예컨대 14 내지 20개, 예컨대 16 내지 20개의 연속 뉴클레오티드이다. 본원 발명의 구체예에서 표적 서열은 표 4에서 도시된 바와 같은 서열 번호: 3-21로 구성된 군에서 선택된다.
표 4: 인간 RTEL1 프리-mRNA (서열 번호: 1) 상에서 표적 서열
Figure pct00011
일부 구체예에서, 표적 서열은 표 5A 또는 5B에서 도시된 영역에서 선택된다.
표적 세포
본원에서 이용된 용어 "표적 세포"는 표적 핵산을 발현하는 세포를 지칭한다. 본원 발명의 치료적 용도를 위해, 표적 세포는 HBV로 감염되는 것이 바람직하다. 일부 구체예에서, 표적 세포는 생체내 또는 시험관내에 있을 수 있다. 일부 구체예에서, 표적 세포는 포유류 세포, 예컨대 설치류 세포, 예컨대 생쥐 세포 또는 쥐 세포, 또는 우드척 세포 또는 영장류 세포, 예컨대 원숭이 세포 (예를 들면, 시노몰구스 원숭이 세포) 또는 인간 세포이다.
바람직한 구체예에서, 표적 세포는 RTEL1 mRNA, 예컨대 RTEL1 프리-mRNA 또는 RTEL1 성숙 mRNA를 발현한다. RTEL1 mRNA의 폴리 A 꼬리는 안티센스 올리고뉴클레오티드 표적화에서는 전형적으로 무시된다.
게다가, 표적 세포는 간세포일 수 있다. 한 구체예에서 표적 세포는 HBV 감염된 개체로부터 유래되거나, 또는 인간화 간을 갖는 HBV 감염된 생쥐 (PhoenixBio, PXB-생쥐)로부터 유래된 HBV 감염된 일차 인간 간세포이다.
본원 발명에 따라서, 표적 세포는 HBV로 감염될 수 있다. 게다가, 표적 세포는 HBV cccDNA를 포함할 수 있다. 따라서, 표적 세포는 바람직하게는 RTEL1 mRNA, 예컨대 RTEL1 프리-mRNA 또는 RTEL1 성숙 mRNA, 그리고 HBV cccDNA를 포함한다.
자연 발생 변이체
용어 "자연 발생 변이체"는 표적 핵산과 동일한 유전자 좌위로부터 유래하지만, 예를 들면, 동일한 아미노산을 인코딩하는 코돈의 다중성을 유발하는 유전자 코드의 축중성으로 인해, 또는 프리-mRNA의 대안적 스플라이싱, 또는 다형성, 예컨대 단일 뉴클레오티드 다형성 (SNP) 및 대립형질 변이체의 존재로 인해 상이할 수 있는 RTEL1 유전자 또는 전사체의 변이체를 지칭한다. 올리고뉴클레오티드와 충분하게 상보적인 서열의 존재에 기초하여, 본원 발명의 올리고뉴클레오티드는 표적 핵산 및 이의 자연 발생 변이체를 표적으로 할 수 있다.
일부 구체예에서, 자연 발생 변이체는 포유류 RTEL1 표적 핵산, 예컨대 서열 번호 1 및/또는 2의 표적 핵산과 적어도 95%, 예컨대 적어도 98% 또는 적어도 99%의 상동성을 갖는다. 일부 구체예에서, 자연 발생 변이체는 서열 번호: 1의 인간 RTEL1 표적 핵산과 적어도 99%의 상동성을 갖는다. 일부 구체예에서, 자연 발생 변이체는 공지된 다형성이다.
발현의 조절
본원에서 이용된 용어 "발현의 조절"은 올리고뉴클레오티드의 투여 전 RTEL1의 양과 비교할 때, RTEL1의 양을 변경시킬 수 있는 올리고뉴클레오티드의 능력에 대한 총체적인 용어로서 이해되어야 한다. 대안적으로, 발현의 조절은 대조 실험을 참조하여 결정될 수 있다. 일반적으로 대조는 식염수 조성물로 처리된 개체 또는 표적 세포, 또는 비-표적화 올리고뉴클레오티드 (모의)로 처리된 개체 또는 표적 세포인 것으로 이해된다.
조절의 한 유형은, 예를 들면 mRNA의 분해 또는 전사의 차단에 의해 RTEL1의 발현을 저해, 하향 조절, 감소, 억제, 제거, 정지, 차단, 예방, 약화, 저하, 회피 또는 종결시킬 수 있는 올리고뉴클레오티드의 능력이다. 조절의 다른 유형은, 예를 들면 스플라이스 부위의 수복 또는 스플라이싱의 예방 또는 저해 메커니즘, 예컨대 마이크로RNA 억제의 제거 또는 차단에 의해 RTEL1의 발현을 회복, 증가 또는 향상시킬 수 있는 올리고뉴클레오티드의 능력이다.
당 변형
본원 발명의 올리고뉴클레오티드는 변형된 당 모이어티, 다시 말하면, DNA와 RNA에서 발견되는 리보오스 당 모이어티와 비교할 때 당 모이어티의 변형을 갖는 하나 또는 그 이상의 뉴클레오시드를 포함할 수 있다.
리보오스 당 모이어티의 변형을 갖는 다수의 뉴클레오시드는 주로 올리고뉴클레오티드의 일정한 특성, 예컨대 친화성 및/또는 뉴클레아제 내성을 개선하기 위한 목적으로 만들어졌다.
이런 변형은 리보오스 고리 구조가, 예를 들면 헥소오스 고리 (HNA) 또는 이중환상 고리로 대체에 의해 변형되는 것들을 포함하는데, 이들은 전형적으로 리보오스 고리 (LNA) 상에, 또는 전형적으로 C2 및 C3 탄소 사이에 결합이 없는 비-연결된 리보오스 고리 (예를 들면, UNA) 상에 C2 및 C4 탄소 사이에 2가 라디칼 브리지를 갖는다. 다른 당 변형된 뉴클레오시드는, 예를 들면 비시클로헥소오스 핵산 (WO2011/017521) 또는 삼중환상 핵산 (WO2013/154798)을 포함한다. 변형된 뉴클레오시드는 또한, 예를 들면 펩티드 핵산 (PNA) 또는 모르폴리노 핵산의 경우에 당 모이어티가 비-당 모이어티로 대체되는 뉴클레오시드를 포함한다.
당 변형은 또한 리보오스 고리 상의 치환기를 수소 이외의 기, 또는 DNA와 RNA 뉴클레오시드에서 자연적으로 발견되는 2'-OH 기로 변경하는 것을 통해 만들어진 변형을 포함한다. 예를 들면, 2', 3', 4' 또는 5' 위치에서 치환기가 도입될 수 있다.
높은 친화성 변형된 뉴클레오시드
높은 친화성 변형된 뉴클레오시드는 올리고뉴클레오티드 내로 통합될 때, 예를 들면 용융 온도 (Tm)에 의해 계측되는 바와 같이 상보적인 표적에 대한 올리고뉴클레오티드의 친화성을 향상시키는 변형된 뉴클레오티드이다. 본원 발명의 높은 친화성 변형된 뉴클레오시드는 바람직하게는 변형된 뉴클레오시드마다 +0.5 내지 +12℃, 더욱 바람직하게는 +1.5 내지 +10℃, 가장 바람직하게는 +3 내지 +8℃의 용융 온도 증가를 유발한다. 다수의 높은 친화성 변형된 뉴클레오시드는 당해 분야에 공지되어 있고, 그리고 예를 들면 많은 2' 치환된 뉴클레오시드뿐만 아니라 잠금 핵산 (LNA)을 포함한다 (참조: 예를 들면, Freier & Altmann; Nucl. Acid Res., 1997, 25, 4429-4443 및 Uhlmann; Curr. Opinion in Drug Development, 2000, 3(2), 293-213).
2' 당 변형된 뉴클레오시드
2' 당 변형된 뉴클레오시드는 2' 위치에서 H 또는 -OH 이외의 치환기를 갖는 뉴클레오시드 (2' 치환된 뉴클레오시드)이거나, 또는 리보오스 고리에서 2' 탄소 및 두 번째 탄소 사이에 브리지를 형성할 수 있는 2' 결합된 2가 라디칼을 포함하는 뉴클레오시드, 예컨대 LNA (2'-4' 2가 라디칼 브리지) 뉴클레오시드이다.
실제로, 2' 당 치환된 뉴클레오시드의 개발에 많은 관심이 집중되어 왔고, 그리고 수많은 2' 치환된 뉴클레오시드가 올리고뉴클레오티드 내로 통합될 때 유익한 특성을 갖는 것으로 밝혀졌다. 예를 들면, 2' 변형된 당은 올리고뉴클레오티드에 향상된 결합 친화성 및/또는 증가된 뉴클레아제 내성을 제공할 수 있다. 2' 치환된 변형 뉴클레오시드의 실례는 2'-O-알킬-RNA, 2'-O-메틸-RNA, 2'-알콕시-RNA, 2'-O-메톡시에틸-RNA (MOE), 2'-아미노-DNA, 2'-플루오로-RNA 및 2'-F-ANA 뉴클레오시드이다. 추가적인 실례를 위해, 예를 들면 Freier & Altmann; Nucl. Acid Res., 1997, 25, 4429-4443 및 Uhlmann; Curr. Opinion in Drug Development, 2000, 3(2), 293-213, 그리고 Deleavey and Damha, Chemistry and Biology 2012, 19, 937을 참조한다. 아래에는 일부 2' 치환된 변형 뉴클레오시드가 예시된다.
Figure pct00012
본원 발명과 관련하여, 2' 치환된 당 변형된 뉴클레오시드는 LNA와 같은 2' 가교된 뉴클레오시드를 포함하지 않는다.
잠금 핵산 뉴클레오시드 (LNA 뉴클레오시드)
"LNA 뉴클레오시드"는 리보오스 고리의 형태를 제한하거나 잠금시키는, 상기 뉴클레오시드의 리보오스 당 고리의 C2' 및 C4'를 연결하는 2가 라디칼 ("2'-4' 브리지"로 또한 지칭됨)을 포함하는 2'-당 변형된 뉴클레오시드이다. 이들 뉴클레오시드는 또한 문헌에서 가교된 핵산 또는 이중환상 핵산 (BNA)으로 명명된다. 리보오스 형태의 잠금은 LNA가 상보적 RNA 또는 DNA 분자에 대한 올리고뉴클레오티드 내로 통합될 때 혼성화의 친화성 향상 (이중나선 안정화)과 연관된다. 이것은 올리고뉴클레오티드/상보적 이중나선의 용융 온도를 계측함으로써 일과적으로 결정될 수 있다.
무제한적이고 예시적인 LNA 뉴클레오시드는 WO 99/014226, WO 00/66604, WO 98/039352, WO 2004/046160, WO 00/047599, WO 2007/134181, WO 2010/077578, WO 2010/036698, WO 2007/090071, WO 2009/006478, WO 2011/156202, WO 2008/154401, WO 2009/067647, WO 2008/150729, Morita et al., Bioorganic & Med. Chem. Lett. 12, 73-76, Seth et al. J. Org. Chem. 2010, Vol 75(5) pp. 1569-81, Mitsuoka et al., Nucleic Acids Research 2009, 37(4), 1225-1238, 그리고 Wan and Seth, J. Medical Chemistry 2016, 59, 9645-9667에서 개시된다.
본원 발명의 LNA 뉴클레오시드의 특정 실례는 반응식 1 (여기서 B는 상기 규정된 바와 같다)에서 제시된다.
반응식 1
Figure pct00013
특정 LNA 뉴클레오시드는 베타-D-옥시-LNA, 6'- 메틸-베타-D-옥시 LNA, 예컨대 (S)-6'-메틸-베타-D-옥시-LNA(ScET) 및 ENA이다.
제약학적으로 허용되는 염
용어 "제약학적으로 허용되는 염"은 생물학적으로 바람직하지 않거나 또는 달리 바람직하지 않은 경우가 아닌, 유리 염기 또는 유리 산의 생물학적 효과와 특성을 보유하는 염을 지칭한다. 염은 염산, 브롬화수소산, 황산, 질산, 인산, 구체적으로는 염산과 같은 무기산, 그리고 아세트산, 프로피온산, 글리콜산, 피루브산, 옥살산, 말레산, 말론산, 숙신산, 푸마르산, 타르타르산, 시트르산, 벤조산, 계피산, 만델산, 메탄술폰산, 에탄술폰산, p-톨루엔술폰산, 살리실산, N-아세틸시스테인과 같은 유기산으로 형성된다. 이에 더하여, 이들 염은 유리 산에 무기 염기 또는 유기 염기를 첨가하여 제조될 수 있다. 무기 염기로부터 유래된 염은 나트륨, 칼륨, 리튬, 암모늄, 칼슘, 마그네슘 염을 포함하지만 이들에 한정되지 않는다. 유기 염기로부터 유래된 염은 1차, 2차 및 3차 아민의 염, 자연 발생된 치환된 아민을 비롯한 치환된 아민, 시클릭 아민 및 염기성 이온 교환 수지, 예컨대 이소프로필아민, 트리메틸아민, 디에틸아민, 트리에틸아민, 트리프로필아민, 에탄올아민, 리신, 아르기닌, N-에틸피페리딘, 피페리딘, 폴리아민 수지를 포함하지만 이들에 한정되지 않는다. 화학식 (I)의 화합물은 또한 쌍성 이온의 형태로 존재할 수 있다. 화학식 (I)의 화합물의 특히 바람직한 제약학적으로 허용되는 염은 염산, 브롬화수소산, 황산, 인산 및 메탄술폰산의 염이다.
RNase H 활성 및 모집
안티센스 올리고뉴클레오티드의 RNase H 활성은 상보적 RNA 분자와의 이중나선 형태로 있을 때, RNase H를 모집하는 능력을 지칭한다. WO01/23613은 RNaseH 활성을 결정하기 위한 시험관내 방법을 제공하는데, 이들은 RNaseH를 모집하는 능력을 결정하는 데 이용될 수 있다. 전형적으로, 올리고뉴클레오티드는 상보적 표적 핵산 서열이 제공될 때, pmol/l/분으로 계측되는 바와 같이, 검사되는 변형된 올리고뉴클레오티드와 동일한 염기 서열을 갖지만 올리고뉴클레오티드 내에 모든 단량체 사이에 포스포로티오에이트 연쇄를 갖는 DNA 단량체만을 내포하는 올리고뉴클레오티드를 이용하고 WO01/23613 (본원에 참조로서 편입됨)의 실시예 91-95에 의해 제공된 방법을 이용할 때 결정된 초기 속도의 적어도 5%, 예컨대 적어도 10% 또는 20% 이상의 초기 속도를 갖는 경우에 RNase H를 모집할 수 있는 것으로 간주된다. RNase H 활성을 결정하는 데 이용을 위해, 재조합 인간 RNase H1은 Creative Biomart® (대장균 (E. coli)에서 발현된 His 태그와 융합된 재조합 인간 RNASEH1)로부터 가용하다.
갭머
본원 발명의 안티센스 올리고뉴클레오티드 또는 이의 연속 뉴클레오티드 서열은 갭머 올리고뉴클레오티드 또는 갭머 설계로 또한 명명되는 갭머일 수 있다. 안티센스 갭머는 RNase H 매개 분해를 통해 표적 핵산을 저해하는 데 통상적으로 이용된다. 갭머 올리고뉴클레오티드는 '5 -> 3' 방향으로 5'-측부, 갭 및 3'-측부인 F-G-F'의 적어도 3개의 별개의 구조 영역을 포함한다. "갭" 영역 (G)은 올리고뉴클레오티드가 RNase H를 모집할 수 있도록 하는 연속 DNA 뉴클레오티드의 스트레치를 포함한다. 갭 영역은 하나 또는 그 이상의 당 변형된 뉴클레오시드, 바람직하게는 높은 친화성 당 변형된 뉴클레오시드를 포함하는 5' 측부 영역 (F)에 의해, 그리고 하나 또는 그 이상의 당 변형된 뉴클레오시드, 바람직하게는 높은 친화성 당 변형된 뉴클레오시드를 포함하는 3' 측부 영역 (F')에 의해 측접된다. 영역 F 및 F' 내에 하나 또는 그 이상의 당 변형된 뉴클레오시드는 표적 핵산에 대한 올리고뉴클레오티드의 친화성을 향상시킨다 (즉, 친화성 향상 당 변형된 뉴클레오시드이다). 일부 구체예에서, 영역 F 및 F' 내에 하나 또는 그 이상의 당 변형된 뉴클레오시드는 2' 당 변형된 뉴클레오시드, 예컨대 LNA 및 2'-MOE에서 독립적으로 선택된 것과 같은 높은 친화성 2' 당 변형체이다.
갭머 설계에서, 갭 영역의 5' 및 3'에 가장 가까운 뉴클레오시드는 DNA 뉴클레오시드이고, 그리고 각각 5' (F) 또는 3' (F') 영역의 당 변형된 뉴클레오시드에 인접하게 위치된다. 측부는 갭 영역으로부터 가장 먼 단부에서, 다시 말하면, 5' 측부의 5' 단부 및 3' 측부의 3' 단부에서 적어도 하나의 당 변형된 뉴클레오시드를 가짐으로써 추가로 규정될 수 있다.
영역 F-G-F'는 연속 뉴클레오티드 서열을 형성한다. 본원 발명의 안티센스 올리고뉴클레오티드 또는 이의 연속 뉴클레오티드 서열은 화학식 F-G-F'의 갭머 영역을 포함할 수 있다.
갭머 설계 F-G-F'의 전체 길이는, 예를 들면 12 내지 32개의 뉴클레오시드, 예컨대 13 내지 24개, 예컨대 14 내지 22개의 뉴클레오시드, 예컨대 14 내지 17개, 예컨대 16 내지 18개의 뉴클레오시드일 수 있다. 예로서, 본원 발명의 갭머 올리고뉴클레오티드는 하기 화학식으로 나타낼 수 있고:
F1-8-G5-18-F'1-8, 예컨대
F1-8-G5-16-F'1-8, 예컨대
F1-8-G7-16-F'2-8
단서로써, 갭머 영역 F-G-F'의 전체 길이는 적어도 12개, 예컨대 적어도 14개 뉴클레오티드의 길이를 갖는다.
본원 발명의 한 양상에서 안티센스 올리고뉴클레오티드 또는 이의 연속 뉴클레오티드 서열은 화학식 5'-F-G-F'-3'의 갭머로 구성되거나 또는 이것을 포함하는데, 여기서 영역 F 및 F'는 1-8개의 뉴클레오시드를 독립적으로 포함하거나 또는 이들로 구성되고, 이들 중에서 1-4개는 2' 당 변형되고 F 및 F' 영역의 5' 및 3' 단부를 규정하고, 그리고 G는 RNaseH를 모집할 수 있는 6 내지 18개, 예컨대 6 내지 16개 뉴클레오시드의 영역이다. 일부 구체예에서 G 영역은 DNA 뉴클레오시드로 구성된다.
영역 F, G 및 F'는 아래에 추가로 규정되고 F-G-F' 화학식 내로 통합될 수 있다.
갭머 - 영역 G
갭머의 영역 G (갭 영역)는 올리고뉴클레오티드가 RNaseH, 예컨대 인간 RNase H1을 모집할 수 있도록 하는 뉴클레오시드, 전형적으로 DNA 뉴클레오시드의 영역이다. RNaseH는 DNA와 RNA 사이의 이중나선을 인식하고 RNA 분자를 효소적으로 개열하는 세포 효소이다. 적합하게는 갭머는 길이에서 적어도 5 또는 6개의 연속 DNA 뉴클레오시드, 예컨대 5 - 18개의 연속 DNA 뉴클레오시드, 5 - 17개의 연속 DNA 뉴클레오시드, 예컨대 5 - 16개의 연속 DNA 뉴클레오시드, 예컨대 6 - 15개의 연속 DNA 뉴클레오시드, 예컨대 7 - 14개의 연속 DNA 뉴클레오시드, 예컨대 8 - 12개의 연속 DNA 뉴클레오티드, 예컨대 8 - 12개의 연속 DNA 뉴클레오티드의 갭 영역 (G)을 가질 수 있다. 갭 영역 (G)은, 일부 구체예에서 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17 또는 18개의 연속 DNA 뉴클레오시드로 구성될 수 있다. 갭 영역에서 시토신 (C) DNA는 일부 사례에서 메틸화될 수 있으며, 이런 잔기는 5'-메틸-시토신 (meC 또는 c 대신에 e가 있음)으로서 주해된다. 갭에서 시토신 DNA의 메틸화는 만약 잠재적 독성을 감소시키기 위해 cg 디뉴클레오티드가 갭 내에 존재하면 바람직하며, 이러한 변형은 올리고뉴클레오티드의 효능에 대한 유의미한 영향을 갖지 않는다. 5' 치환된 DNA 뉴클레오시드, 예컨대 5' 메틸 DNA 뉴클레오시드가 DNA 갭 영역에서 이용에 대해 보고되었다 (EP 2 742 136).
일부 구체예에서, 갭 영역 G는 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17 또는 18개의 연속 포스포로티오에이트 결합된 DNA 뉴클레오시드로 구성될 수 있다. 일부 구체예에서, 갭 내의 모든 뉴클레오시드간 연쇄는 포스포로티오에이트 연쇄이다.
전통적인 갭머는 DNA 갭 영역을 갖지만, 갭 영역 내에서 이용될 때 RNaseH 모집을 가능하게 하는 변형된 뉴클레오시드의 많은 실례가 있다. 갭 영역 내에 포함될 때 RNaseH를 모집할 수 있는 것으로 보고된 변형된 뉴클레오시드에는, 예를 들면 알파-L-LNA, C4' 알킬화 DNA (PCT/EP2009/050349 및 Vester et al., Bioorg. Med. Chem. Lett. 18 (2008) 2296-2300에서 기술된 바와 같이, 이들 둘 모두 본원에 참조로서 편입됨), ANA 및 2'F-ANA와 같은 아라비노스 유래 뉴클레오시드 (Mangos et al. 2003 J. AM. CHEM. SOC. 125, 654-661), UNA (잠금 해제된 핵산) (본원에 참조로서 편입되는 Fluiter et al., Mol. Biosyst., 2009, 10, 1039에서 기술된 바와 같이)가 포함된다. UNA는 잠금 해제된 핵산인데, 전형적으로 여기서 리보오스의 C2 및 C3 사이의 결합이 제거되어 잠금 해제된 "당" 잔기가 형성된다. 이런 갭머에 이용되는 변형된 뉴클레오시드는 갭 영역 내로 도입될 때 2' 엔도 (DNA 유사) 구조를 채택하는 뉴클레오시드, 다시 말하면, RNaseH 모집을 허용하는 변형체일 수 있다. 일부 구체예에서, 본원에서 기술된 DNA 갭 영역 (G)은 이러한 갭 영역 내로 도입될 때 2' 엔도 (DNA 유사) 구조를 채택하는 1 내지 3개의 당 변형된 뉴클레오시드를 임의적으로 내포할 수 있다.
갭머 - 측부 영역, F 및 F'
영역 F는 영역 G의 5' DNA 뉴클레오시드에 바로 인접하여 위치한다. 영역 F의 3'에 가장 가까운 뉴클레오시드는 당 변형된 뉴클레오시드, 예컨대 높은 친화성 당 변형된 뉴클레오시드, 예를 들면 2' 치환된 뉴클레오시드, 예컨대 MOE 뉴클레오시드 또는 LNA 뉴클레오시드이다.
영역 F'는 영역 G의 3' DNA 뉴클레오시드에 바로 인접하여 위치한다. 영역 F'의 5'에 가장 가까운 뉴클레오시드는 당 변형된 뉴클레오시드, 예컨대 높은 친화성 당 변형된 뉴클레오시드, 예를 들면 2' 치환된 뉴클레오시드, 예컨대 MOE 뉴클레오시드 또는 LNA 뉴클레오시드이다.
영역 F는 길이에서 1-8개의 연속 뉴클레오티드, 예컨대 길이에서 2-6개, 예컨대 3-4개의 연속 뉴클레오티드이다. 바람직하게는, 영역 F의 5'에 가장 가까운 뉴클레오시드는 당 변형된 뉴클레오시드이다. 일부 구체예에서, 영역 F의 2개의 5'에 가장 가까운 뉴클레오시드는 당 변형된 뉴클레오시드이다. 일부 구체예에서, 영역 F의 5'에 가장 가까운 뉴클레오시드는 LNA 뉴클레오시드이다. 일부 구체예에서, 영역 F의 2개의 5'에 가장 가까운 뉴클레오시드는 LNA 뉴클레오시드이다. 일부 구체예에서, 영역 F의 2개의 5'에 가장 가까운 뉴클레오시드는 2' 치환된 뉴클레오시드, 예컨대 2개의 3' MOE 뉴클레오시드이다. 일부 구체예에서, 영역 F의 5'에 가장 가까운 뉴클레오시드는 2' 치환된 뉴클레오시드, 예컨대 MOE 뉴클레오시드이다.
영역 F'는 길이에서 2-8개의 연속 뉴클레오티드, 예컨대 길이에서 3-6개, 예컨대 4-5개의 연속 뉴클레오티드이다. 바람직하게는, 구체예에서, 영역 F'의 3'에 가장 가까운 뉴클레오시드는 당 변형된 뉴클레오시드이다. 일부 구체예에서, 영역 F'의 2개의 3'에 가장 가까운 뉴클레오시드는 당 변형된 뉴클레오시드이다. 일부 구체예에서, 영역 F'의 2개의 3'에 가장 가까운 뉴클레오시드는 LNA 뉴클레오시드이다. 일부 구체예에서, 영역 F'의 3'에 가장 가까운 뉴클레오시드는 LNA 뉴클레오시드이다. 일부 구체예에서, 영역 F'의 2개의 3'에 가장 가까운 뉴클레오시드는 2' 치환된 뉴클레오시드, 예컨대 2개의 3' MOE 뉴클레오시드이다. 일부 구체예에서, 영역 F'의 3'에 가장 가까운 뉴클레오시드는 2' 치환된 뉴클레오시드, 예컨대 MOE 뉴클레오시드이다.
영역 F 또는 F'의 길이가 하나일 때, 이것은 바람직하게는 LNA 뉴클레오시드라는 점에 유의한다.
일부 구체예에서, 영역 F 및 F'는 독립적으로 당 변형된 뉴클레오시드의 연속 서열로 구성되거나 또는 이것을 포함한다. 일부 구체예에서, 영역 F의 당 변형된 뉴클레오시드는 2'-O-알킬 -RNA 단위, 2'-O-메틸-RNA, 2'-아미노-DNA 단위, 2'-플루오로-DNA 단위, 2'-알콕시-RNA, MOE 단위, LNA 단위, 아라비노 핵산 (ANA) 단위 및 2'-플루오로-ANA 단위에서 독립적으로 선택될 수 있다.
일부 구체예에서, 영역 F 및 F'는 LNA 및 2' 치환된 변형 뉴클레오시드 둘 모두를 독립적으로 포함한다 (혼합 날개 설계).
일부 구체예에서, 영역 F 및 F'는 단지 한 가지 유형의 당 변형된 뉴클레오시드, 예컨대 단지 MOE 또는 단지 베타-D-옥시 LNA 또는 단지 ScET로만 구성된다. 이런 설계는 또한 균일한 측부 또는 균일한 갭머 설계로 명명된다.
일부 구체예에서, 영역 F 또는 F', 또는 F 및 F'의 모든 뉴클레오시드는 LNA 뉴클레오시드이다, 예컨대 베타-D-옥시 LNA, ENA 또는 ScET 뉴클레오시드에서 독립적으로 선택된다. 일부 구체예에서, 영역 F는 1-5개, 예컨대 2-4개, 예컨대 3-4개, 예컨대 1, 2, 3, 4 또는 5개의 연속 LNA 뉴클레오시드로 구성된다. 일부 구체예에서, 영역 F 및 F'의 모든 뉴클레오시드는 베타-D-옥시 LNA 뉴클레오시드이다.
일부 구체예에서, 영역 F 또는 F', 또는 F 및 F'의 모든 뉴클레오시드는 2' 치환된 뉴클레오시드, 예컨대 OMe 또는 MOE 뉴클레오시드이다. 일부 구체예에서, 영역 F는 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 또는 8개의 연속 OMe 또는 MOE 뉴클레오시드로 구성된다. 일부 구체예에서, 측부 영역 중 한쪽만 2' 치환된 뉴클레오시드, 예컨대 OMe 또는 MOE 뉴클레오시드로 구성될 수 있다. 일부 구체예에서, 5' (F) 측부 영역은 2' 치환된 뉴클레오시드, 예컨대 OMe 또는 MOE 뉴클레오시드로 구성되는 반면, 3' (F') 측부 영역은 적어도 하나의 LNA 뉴클레오시드, 예컨대 베타-D-옥시 LNA 뉴클레오시드 또는 cET 뉴클레오시드를 포함한다. 일부 구체예에서, 3' (F') 측부 영역은 2' 치환된 뉴클레오시드, 예컨대 OMe 또는 MOE 뉴클레오시드로 구성되는 반면, 5' (F) 측부 영역은 적어도 하나의 LNA 뉴클레오시드, 예컨대 베타-D-옥시 LNA 뉴클레오시드 또는 cET 뉴클레오시드를 포함한다.
일부 구체예에서, 영역 F 및 F'의 모든 변형된 뉴클레오시드는 LNA 뉴클레오시드이고, 예컨대 베타-D-옥시 LNA, ENA 또는 ScET 뉴클레오시드에서 독립적으로 선택되고, 여기서 영역 F 또는 F', 또는 F 및 F'는 DNA 뉴클레오시드를 임의적으로 포함할 수 있다 (교대 측부, 이들에 대한 더욱 상세한 내용은 정의를 참조한다). 일부 구체예에서, 영역 F 및 F'의 모든 변형된 뉴클레오시드는 베타-D-옥시 LNA 뉴클레오시드이고, 여기서 영역 F 또는 F', 또는 F 및 F'는 DNA 뉴클레오시드를 임의적으로 포함할 수 있다 (교대 측부, 이들에 대한 더욱 상세한 내용은 정의를 참조한다).
일부 구체예에서, 영역 F 및 F'의 5'에 가장 가까운 뉴클레오시드 및 3'에 가장 가까운 뉴클레오시드는 LNA 뉴클레오시드, 예컨대 베타-D-옥시 LNA 뉴클레오시드 또는 ScET 뉴클레오시드이다.
일부 구체예에서, 영역 F 및 영역 G 사이의 뉴클레오시드간 연쇄는 포스포로티오에이트 뉴클레오시드간 연쇄이다. 일부 구체예에서, 영역 F' 및 영역 G 사이의 뉴클레오시드간 연쇄는 포스포로티오에이트 뉴클레오시드간 연쇄이다. 일부 구체예에서, 영역 F 또는 F', F 및 F'의 뉴클레오시드 사이의 뉴클레오시드간 연쇄는 포스포로티오에이트 뉴클레오시드간 연쇄이다.
LNA 갭머
LNA 갭머는 영역 F 및 F' 중 하나 또는 둘 모두가 LNA 뉴클레오시드를 포함하거나 또는 이들로 구성되는 갭머이다. 베타-D-옥시 갭머는 영역 F 및 F' 중 하나 또는 둘 모두가 베타-D-옥시 LNA 뉴클레오시드를 포함하거나 또는 이들로 구성되는 갭머이다.
일부 구체예에서 LNA 갭머는 하기 화학식을 갖는다: [LNA]1-5-[영역 G] -[LNA]1-5, 여기서 영역 G는 갭머 영역 G 정의에서 규정된 바와 같다.
MOE 갭머
MOE 갭머는 영역 F 및 F'가 MOE 뉴클레오시드로 구성되는 갭머이다. 일부 구체예에서 MOE 갭머는 설계 [MOE]1-8-[영역 G]-[MOE]1-8, 예컨대 [MOE]2-7-[영역 G]5-16-[MOE]2-7, 예컨대 [MOE]3-6-[영역 G]-[MOE]3-6을 갖고, 여기서 영역 G는 갭머 정의에서 규정된 바와 같다. 5-10-5 설계(MOE-DNA-MOE)를 갖는 MOE 갭머가 당해 분야에서 널리 이용되고 있다.
올리고뉴클레오티드 내에 영역 D' 또는 D''
본원 발명의 올리고뉴클레오티드는 일부 구체예에서 표적 핵산에 상보적인 올리고뉴클레오티드의 연속 뉴클레오티드 서열, 예컨대 갭머 F-G-F' 및 추가적인 5' 및/또는 3' 뉴클레오시드를 포함하거나 또는 이들로 구성될 수 있다. 추가적인 5' 및/또는 3' 뉴클레오시드는 표적 핵산에 완전히 상보적이거나 또는 그렇지 않을 수 있다. 이런 추가적인 5' 및/또는 3' 뉴클레오시드는 본원에서 영역 D' 및 D''로 지칭될 수 있다.
영역 D' 또는 D''의 추가는 연속 뉴클레오티드 서열, 예컨대 갭머를 접합 모이어티 또는 다른 기능기에 결합시키기 위한 목적으로 이용될 수 있다. 연속 뉴클레오티드 서열을 접합 모이어티와 결합시키는 데 이용되는 경우, 생체개열가능 링커로서 작용할 수 있다. 대안적으로는, 엑소뉴클레아제 보호 또는 합성 또는 제조의 용이성을 제공하는 데 이용될 수 있다.
영역 D' 및 D''는 영역 F의 5' 단부 또는 영역 F'의 3' 단부에 각각 부착되어, 다음의 화학식 D'-F-G-F', F-G-F'-D'' 또는 D'-F-G-F'-D''의 설계가 산출될 수 있다. 이 경우, F-G-F'는 올리고뉴클레오티드의 갭머 부분이고, 그리고 영역 D' 또는 D''는 올리고뉴클레오티드의 별도의 부분을 구성한다.
영역 D' 또는 D''는 표적 핵산에 상보적이거나 또는 비-상보적일 수 있는 1, 2, 3, 4 또는 5개의 추가적인 뉴클레오티드를 독립적으로 포함하거나 또는 이들로 구성될 수 있다. F 또는 F' 영역에 인접한 뉴클레오티드는 당-변형된 뉴클레오티드, 예컨대 DNA 또는 RNA 또는 이들의 염기 변형된 버전이 아니다. D' 또는 D' 영역은 뉴클레아제에 민감한 생체개열가능 링커로서 작용할 수 있다 (링커의 정의 참조). 일부 구체예에서, 추가적인 5' 및/또는 3' 단부 뉴클레오티드는 포스포디에스테르 연쇄로 결합되고, 그리고 DNA 또는 RNA이다. 영역 D' 또는 D''로서 이용하기에 적합한 뉴클레오티드 기반 생체개열가능 링커는 WO2014/076195에 개시되는데, 이들은 예로서 포스포디에스테르 결합된 DNA 디뉴클레오티드를 포함한다. 폴리-올리고뉴클레오티드 작제물에서 생체개열가능 링커의 이용은 WO2015/113922에 개시되는데, 여기서 이들은 단일 올리고뉴클레오티드 내에서 복수의 안티센스 작제물 (예를 들면, 갭머 영역)을 연결하는 데 이용된다.
한 구체예에서, 본원 발명의 올리고뉴클레오티드는 갭머를 구성하는 연속 뉴클레오티드 서열 이외에 영역 D' 및/또는 D''를 포함한다.
일부 구체예에서, 본원 발명의 올리고뉴클레오티드는 하기 화학식으로 나타낼 수 있다:
F-G-F'; 특히 F1-8-G5-16-F'2-8
D'-F-G-F', 특히 D'1-3-F1-8-G5-16-F'2-8
F-G-F'-D'', 특히 F1-8-G5-16-F'2-8-D''1-3
D'-F-G-F'-D'', 특히 D'1-3- F1-8-G5-16-F'2-8-D''1-3
일부 구체예에서, 영역 D' 및 영역 F 사이에 위치하는 뉴클레오시드간 연쇄는 포스포디에스테르 연쇄이다. 일부 구체예에서, 영역 F' 및 영역 D'' 사이에 위치하는 뉴클레오시드간 연쇄는 포스포디에스테르 연쇄이다.
접합체
본원에서 이용된 용어 접합체는 비-뉴클레오티드 모이어티 (접합 모이어티 또는 영역 C 또는 제3 영역)에 공유 결합된 올리고뉴클레오티드를 지칭한다.
본원 발명의 올리고뉴클레오티드의 하나 또는 그 이상의 비-뉴클레오티드 모이어티로의 접합은, 예를 들면 올리고뉴클레오티드의 활성, 세포 분포, 세포 흡수 또는 안정성에 영향을 줌으로써 올리고뉴클레오티드의 약리학을 개선할 수 있다. 일부 구체예에서, 접합 모이어티는 올리고뉴클레오티드의 세포 분포, 생체이용률, 대사, 배설, 투과성 및/또는 세포 흡수를 개선함으로써 올리고뉴클레오티드의 약동학적 특성을 변경하거나 향상시킨다. 특히, 접합체는 올리고뉴클레오티드를 특정 기관, 조직 또는 세포 유형에 표적화함으로써 상기 기관, 조직 또는 세포 유형에서 올리고뉴클레오티드의 효과를 향상시킬 수 있다. 이와 동시에, 접합체는 비-표적 세포 유형, 조직 또는 기관에서 올리고뉴클레오티드의 활성, 예를 들면 표적 이탈 활성, 또는 비-표적 세포 유형, 조직 또는 기관에서 활성을 감소시키는 역할을 할 수 있다.
WO 93/07883 및 WO2013/033230은 적합한 접합 모이어티를 제공하고, 이들은 본원에서 참조로서 편입된다. 더욱 적합한 접합 모이어티는 아시알로당단백질 수용체 (ASGPR)에 결합할 수 있는 것들이다. 특히, 삼가 N-아세틸갈락토사민 접합 모이어티가 ASGPR에 결합하는 데 적합하며, 예를 들면 WO 2014/076196, WO 2014/207232 및 WO 2014/179620 (본원에서 참조로서 편입됨)을 참조한다. 이런 접합체는 올리고뉴클레오티드의 간으로의 흡수를 향상시키면서, 신장에서 이의 존재를 감소시켜 접합되지 않은 버전의 동일한 올리고뉴클레오티드와 비교하여 접합된 올리고뉴클레오티드의 간/신장 비율을 증가시키는 역할을 한다.
올리고뉴클레오티드 접합체 및 이들의 합성은 또한, Manoharan in Antisense Drug Technology, Principles, Strategies, and Applications, S.T. Crooke, ed., Ch. 16, Marcel Dekker, Inc., 2001 및 Manoharan, Antisense and Nucleic Acid Drug Development, 2002, 12, 103에 의한 포괄적인 리뷰에서 보고되었고, 이들은 각각 본원에서 전체적으로 참조로서 편입된다.
한 구체예에서, 비-뉴클레오티드 모이어티 (접합 모이어티)는 탄수화물, 세포 표면 수용체 리간드, 원료의약품, 호르몬, 친유성 물질, 중합체, 단백질, 펩티드, 독소 (예를 들면, 박테리아 독소), 비타민, 바이러스 단백질 (예를 들면, 캡시드) 또는 이들의 조합으로 구성된 군에서 선택된다.
링커
연쇄 또는 링커는 하나 또는 그 이상의 공유 결합을 통해 하나의 화학기 또는 관심 부분을 다른 화학기 또는 관심 부분에 결합하는 두 원자 사이의 연결이다. 접합 모이어티는 직접적으로 또는 연결 모이어티 (예를 들면, 링커 또는 사슬)를 통해 올리고뉴클레오티드에 부착될 수 있다. 링커는 제3 영역, 예를 들면, 접합 모이어티 (영역 C)를 제1 영역, 예를 들면, 표적 핵산에 상보적인 올리고뉴클레오티드 또는 연속 뉴클레오티드 서열 (영역 A)에 공유 연결하는 역할을 한다.
본원 발명의 일부 구체예에서, 본원 발명의 접합체 또는 올리고뉴클레오티드 접합체는 표적 핵산 (영역 A 또는 제1 영역)에 상보적인 올리고뉴클레오티드 또는 연속 뉴클레오티드 서열 및 접합 모이어티 (영역 C 또는 제3 영역) 사이에 위치한 링커 영역 (제2 영역 또는 영역 B 및/또는 영역 Y)을 임의적으로 포함할 수 있다.
영역 B는 포유류 체내에서 정상적으로 접하게 되는 조건 또는 이들과 유사한 조건 하에서 개열될 수 있는 생리학적으로 불안정한 결합을 포함하거나 또는 이것으로 구성되는 생체개열가능 링커를 지칭한다. 생리학적으로 불안정한 링커가 화학적 변환 (예를 들면, 개열)을 겪게 되는 조건은 화학적 조건, 예컨대 pH, 온도, 산화 또는 환원 조건 또는 작용제, 그리고 포유류 세포에서 발견되거나 이와 유사한 염 농도를 포함한다. 포유류 세포내 조건은 또한 포유류 세포 내에 정상적으로 존재하는, 예컨대 단백질 분해 효소 또는 가수 분해 효소 또는 뉴클레아제로부터 효소 활성의 존재의 존재를 포함한다. 한 구체예에서, 생체개열가능 링커는 S1 뉴클레아제 개열에 민감하다. 바람직한 구체예에서 뉴클레아제 민감성 링커는 적어도 2개의 연속 포스포디에스테르 연쇄, 예컨대 적어도 3 또는 4 또는 5개의 연속 포스포디에스테르 연쇄를 포함하는 1 내지 10개의 뉴클레오시드, 예컨대 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 또는 10개의 뉴클레오시드, 더욱 바람직하게는 2 내지 6개의 뉴클레오시드, 그리고 가장 바람직하게는 2 내지 4개의 결합된 뉴클레오시드를 포함한다. 바람직하게는 뉴클레오시드는 DNA 또는 RNA이다. 포스포디에스테르 내포 생체개열가능 링커는 WO 2014/076195 (본원에 참조로서 편입됨)에서 더욱 상세하게 기술된다.
영역 Y는 반드시 생체개열가능할 필요는 없지만, 주로 접합 모이어티 (영역 C 또는 제3 영역)를 올리고뉴클레오티드 (영역 A 또는 제1 영역)에 공유 연결하는 역할을 하는 링커를 지칭한다. 영역 Y 링커는 반복 단위, 예컨대 에틸렌 글리콜, 아미노산 단위 또는 아미노 알킬 기의 사슬 구조 또는 소중합체를 포함할 수 있다. 본원 발명의 올리고뉴클레오티드 접합체는 다음의 영역 요소 A-C, A-B-C, A-B-Y-C, A-Y-B-C 또는 A-Y-C로 작제될 수 있다. 일부 구체예에서, 링커 (영역 Y)는 아미노 알킬, 예컨대, 예를 들면 C6 내지 C12 아미노 알킬기를 비롯한 C2-C36 아미노 알킬기이다. 바람직한 구체예에서, 링커 (영역 Y)는 C6 아미노 알킬기이다.
치료
본원에서 이용된 용어 "치료"는 기존 질환 (예를 들면, 본원에 언급된 질환 또는 장애)의 치료, 또는 질환의 예방, 즉 방지 둘 모두를 지칭한다. 이런 이유로, 본원에서 언급된 치료는, 일부 구체예에서 예방적일 수 있음이 인식될 것이다. 예방적은 HBV 감염이 만성 HBV 감염으로 변하는 것을 예방하거나, 또는 만성 HBV 감염에 의해 유발된 심각한 간 질환, 예컨대 간경화증 및 간세포 암종을 예방하는 것으로 이해될 수 있다.
예방
본원에서 용어 "예방하는", "예방" 또는 "예방한다"는 예방적 처치, 다시 말하면, 질환을 치유하기 보다는 예방을 목적으로 하는 조치 또는 절차에 관계한다. 예방은 질환 또는 이의 증상을 완전하게 또는 부분적으로 예방하는 면에서 예방적인 원하는 약리학적 및/또는 생리학적 효과가 획득된다는 것을 의미한다. 따라서, 본원에서 "HBV 감염을 예방하는"은 HBV 감염이 개체에서 발생하는 것을 예방하고, 그리고 HBV 감염의 증상의 발생을 예방하는 것을 포함한다. 본원 발명에서는 특히, HBV 감염된 어미로부터 소아로의 HBV 감염의 예방이 예기된다. 급성 HBV 감염이 만성 HBV 감염으로 변하는 것의 예방이 또한 예기된다.
환자
본원 발명을 위해 "개체" (또는 "환자")는 척추동물일 수 있다. 본원 발명의 맥락에서, 용어 "개체"는 인간 및 다른 동물, 특히 포유동물, 그리고 다른 생물체 둘 모두를 포함한다. 따라서 본원에서 제공된 수단과 방법은 인간 요법 및 수의학적 적용 둘 모두에 적용가능하다. 따라서, 본원에서 개체는 동물, 예컨대 생쥐, 쥐, 햄스터, 토끼, 기니피그, 흰담비, 고양이, 개, 닭, 양, 소 종, 말, 낙타, 또는 영장류일 수 있다. 바람직하게는, 개체는 포유동물이다. 더욱 바람직하게는 개체는 인간이다.
발명의 상세한 설명
감염된 간세포에서 HBV cccDNA는 지속적인 만성 감염 및 재활성화를 책임지며, 새로 합성된 바이러스 자손 및 세포내 뉴클레오캡시드 재활용을 통한 cccDNA 풀 재보충 둘 모두를 담보하는 모든 바이러스 하위유전체 전사체 및 전유전체 RNA (pgRNA)에 대한 주형이 된다. 본원 발명의 맥락에서 RTEL1이 cccDNA 안정성과 연관되는 것으로 최초로 밝혀졌다. 이러한 지식은 HBV 감염된 개체에서 cccDNA를 불안정하게 만드는 기회를 가능하게 하고, 이것은 차례로, 만성적으로 감염된 HBV 환자의 완전한 치유를 위한 기회를 연다.
본원 발명의 한 가지 양상은 B형 간염 바이러스 (HBV) 감염, 특히 만성 HBV 감염의 치료 및/또는 예방에서 이용을 위한 RTEL1 저해제이다.
RTEL1 저해제는 예를 들면 RTEL1 단백질에 특이적으로 결합하는 소형 분자일 수 있는데, 여기서 상기 저해제는 cccDNA에 대한 RTEL1 단백질의 결합을 예방하거나 또는 감소시킨다.
본원 발명의 구체예는 감염된 세포, 예컨대 HBV 감염된 세포에서 cccDNA 및/또는 pgRNA를 감소시킬 수 있는 RTEL1 저해제이다.
추가 구체예에서, RTEL1 저해제는 HBV 감염된 개체에서 생체내에서 HBsAg 및/또는 HBeAg를 감소시킬 수 있다.
본원 발명의 올리고뉴클레오티드
치료적 올리고뉴클레오티드는 잠재적으로 탁월한 RTEL1 저해제인데, 그 이유는 이들이 RNA 간섭 경로를 통해 또는 RNaseH 개열을 통해 RTEL1 전사체를 표적으로 하고 이의 분해를 증진할 수 있기 때문이다. 대안으로, 올리고뉴클레오티드, 예컨대 앱타머는 또한, RTEL1 단백질 상호작용의 저해제로서 작용할 수 있다.
본원 발명의 한 가지 양상은 B형 간염 바이러스 (HBV) 감염의 치료 및/또는 예방에서 이용을 위한 RTEL1 표적화 올리고뉴클레오티드이다. 이런 올리고뉴클레오티드는 단일 가닥 안티센스 올리고뉴클레오티드; siRNA 분자; 또는 shRNA 분자로 구성된 군에서 선택될 수 있다.
본 섹션은 B형 간염 바이러스 (HBV) 감염의 치료 및/또는 예방에서 이용에 적합한 신규한 올리고뉴클레오티드를 설명한다.
본원 발명의 올리고뉴클레오티드는 시험관내와 생체내에서 RTEL1의 발현을 저해할 수 있다. 저해는 올리고뉴클레오티드를, RTEL1을 인코딩하거나 또는 RTEL1의 조절에 관련되는 표적 핵산에 혼성화함으로써 달성된다. 표적 핵산은 포유류 RTEL1 서열, 예컨대 서열 번호: 1 및/또는 2의 서열일 수 있다.
일부 구체예에서, 본원 발명의 올리고뉴클레오티드는 표적의 발현을 저해 또는 하향 조절함으로써 표적의 발현을 조절할 수 있다. 바람직하게는, 이런 조절은 표적의 정상 발현 수준과 비교하여 적어도 20%, 더욱 바람직하게는 표적의 정상 발현 수준과 비교하여 적어도 30%, 적어도 40%, 적어도 50%, 적어도 60%, 적어도 70%, 적어도 80% 또는 적어도 90%의 발현 저해를 생성한다. 일부 구체예에서, 본원 발명의 올리고뉴클레오티드는 PXB-PHH 세포에서 10 μM을 이용하여 시험관내에서 RTEL1 mRNA의 발현 수준을 적어도 60% 또는 70% 저해할 수도 있다. 일부 구체예에서, 본원 발명의 올리고뉴클레오티드는 PXB-PHH 세포에서 10μM을 이용하여 시험관내에서 RTEL1 단백질의 발현 수준을 적어도 50% 저해할 수도 있으며, 표적 감소의 이러한 범위는 cccDNA 감소와 우수한 상관관계를 갖는 핵산 분자를 선별하는 면에서 유리하다. 적합하게는, 실시예는 RTEL1 RNA 또는 단백질 저해를 계측하는 데 이용될 수 있는 분석법을 제공한다 (예를 들면, 실시예 1). 표적 저해는 올리고뉴클레오티드의 연속 뉴클레오티드 서열 및 표적 핵산 사이의 혼성화에 의해 촉발된다. 일부 구체예에서, 본원 발명의 올리고뉴클레오티드는 올리고뉴클레오티드 및 표적 핵산 사이의 부정합을 포함한다. 부정합에도 불구하고 표적 핵산에 대한 혼성화는 RTEL1 발현의 원하는 저해를 나타내는 데 여전히 충분할 수 있다. 부정합으로 인한 감소된 결합 친화성은 바람직하게는 올리고뉴클레오티드 내에 뉴클레오티드 숫자의 증가 및/또는 올리고뉴클레오티드 서열 내에 존재하는, 표적에 대한 결합 친화성을 증가시킬 수 있는 변형된 뉴클레오시드, 예컨대 LNA를 비롯한 2' 당 변형된 뉴클레오시드 숫자의 증가에 의해 보상될 수 있다.
본원 발명의 한 양상은 포유류 RTEL1 표적 핵산, 특히 인간 RTEL1 핵산에 적어도 95% 상보적인, 예컨대 완전히 상보적인, 길이에서 적어도 10개 뉴클레오티드, 예컨대 길이에서 적어도 12 내지 30개 뉴클레오티드의 연속 뉴클레오티드 서열을 포함하는, 길이에서 12 내지 60개 뉴클레오티드의 올리고뉴클레오티드에 관계한다. 이들 올리고뉴클레오티드는 RTEL1의 발현을 저해할 수 있다.
본원 발명의 한 양상은 포유류 RTEL1에 적어도 90% 상보적인, 예컨대 완전히 상보적인, 길이에서 적어도 10개 뉴클레오티드, 예컨대 10 내지 30개 뉴클레오티드의 연속 뉴클레오티드 서열을 포함하는, 길이에서 12 내지 30개 뉴클레오티드의 안티센스 올리고뉴클레오티드인 본원 발명에 따른 올리고뉴클레오티드에 관계한다.
본원 발명의 추가 양상은 서열 번호: 1의 표적 핵산에 적어도 90% 상보적인, 예컨대 완전히 상보적인, 길이에서 12 내지 20개, 예컨대 15 내지 22개 뉴클레오티드의 연속 뉴클레오티드 서열을 포함하는 본원 발명에 따른 올리고뉴클레오티드에 관계한다.
일부 구체예에서, 올리고뉴클레오티드는 표적 핵산 또는 표적 서열의 영역에 적어도 90% 상보적인, 예컨대 적어도 91%, 예컨대 적어도 92%, 예컨대 적어도 93%, 예컨대 적어도 94%, 예컨대 적어도 95%, 예컨대 적어도 96%, 예컨대 적어도 97%, 예컨대 적어도 98%, 또는 100% 상보적인, 길이에서 10 내지 30개 뉴클레오티드의 연속 서열을 포함한다.
바람직하게는, 본원 발명의 올리고뉴클레오티드 또는 이의 연속 뉴클레오티드 서열은 표적 핵산의 영역에 완전히 상보적 (100% 상보적)이거나, 또는 일부 구체예에서 올리고뉴클레오티드 및 표적 핵산 사이에 하나 또는 두 개의 부정합을 포함할 수 있다.
일부 구체예에서, 안티센스 올리고뉴클레오티드 서열은 서열 번호: 1의 상응하는 표적 핵산에 100% 상보적이다.
일부 구체예에서 본원 발명의 올리고뉴클레오티드 또는 연속 뉴클레오티드 서열은 서열 번호: 1 및 서열 번호: 2의 표적 핵산에 적어도 95% 상보적, 예컨대 완전히 (또는 100%) 상보적이다.
일부 구체예에서, 올리고뉴클레오티드는 서열 번호: 1 내에 존재하는 상응하는 표적 서열에 적어도 90% 상보적, 예컨대 100% 상보적인, 길이에서 15 내지 22개 뉴클레오티드의 연속 뉴클레오티드 서열을 포함하는데, 여기서 상기 표적 서열은 서열 번호: 3 내지 21 (표 4) 또는 표 5A에서 영역 1A 내지 959A로 구성된 군에서 선택된다.
표 5A: 본원 발명의 올리고뉴클레오티드를 이용하여 표적화될 수 있는 서열 번호 1의 영역
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일부 구체예에서, 올리고뉴클레오티드는 서열 번호: 1 내에 존재하는 상응하는 표적 서열에 적어도 90% 상보적, 예컨대 100% 상보적인, 길이에서 16 내지 20개, 예컨대 15 내지 22개 뉴클레오티드의 연속 뉴클레오티드 서열을 포함하는데, 여기서 상기 표적 서열은 서열 번호: 3 내지 21 (표 4) 또는 표 5B에서 영역 B1 내지 B28로 구성된 군에서 선택된다.
표 5B: 본원 발명의 올리고뉴클레오티드를 이용하여 표적화될 수 있는 서열 번호 1의 영역
Figure pct00026
일부 구체예에서, 본원 발명의 올리고뉴클레오티드는 길이에서 12 내지 60개의 뉴클레오티드, 예컨대 길이에서 13 내지 50개, 예컨대 14 내지 35개, 예컨대 15 내지 30개, 예컨대 16 내지 20개의 연속 뉴클레오티드를 포함하거나 또는 이들로 구성된다. 바람직한 구체예에서, 올리고뉴클레오티드는 길이에서 15, 16, 17, 18, 19 또는 20개의 뉴클레오티드를 포함하거나 또는 이들로 구성된다.
일부 구체예에서, 표적 핵산에 상보적인 올리고뉴클레오티드의 연속 뉴클레오티드 서열은 길이에서 12 내지 30개, 예컨대 13 내지 25개, 예컨대 15 내지 23개, 예컨대 16 내지 22개의 연속 뉴클레오티드를 포함하거나 또는 이들로 구성된다.
일부 구체예에서, 표적 핵산에 상보적인 siRNA 또는 shRNA의 연속 뉴클레오티드 서열은 길이에서 18 내지 28개, 예컨대 19 내지 26개, 예컨대 20 내지 24개, 예컨대 21 내지 23개의 연속 뉴클레오티드를 포함하거나 또는 이들로 구성된다.
일부 구체예에서, 표적 핵산에 상보적인 단일 가닥 안티센스 올리고뉴클레오티드의 연속 뉴클레오티드 서열은 길이에서 12 내지 22개, 예컨대 14 내지 20개, 예컨대 16 내지 20개, 예컨대 15 내지 21개, 예컨대 15 내지 18개, 예컨대 16 내지 18개, 예컨대 16 내지 17개의 연속 뉴클레오티드를 포함하거나 또는 이들로 구성된다.
일부 구체예에서, 올리고뉴클레오티드 또는 연속 뉴클레오티드 서열은 표 6 (재료와 방법 섹션)에서 열거된 서열로 구성된 군에서 선택되는 서열을 포함하거나 또는 이것으로 구성된다.
일부 구체예에서, 올리고뉴클레오티드 또는 연속 뉴클레오티드 서열은 서열 번호: 22 내지 237 (표 6에서 열거된 모티프 서열 참조)로 구성된 군에서 선택되는 서열에 적어도 90% 동일성, 바람직하게는 100% 동일성을 갖는, 길이에서 10 내지 30의 뉴클레오티드를 포함하거나 또는 이들로 구성된다. 특정한 구체예에서 올리고뉴클레오티드 또는 연속 뉴클레오티드 서열은 서열 번호: 22; 23; 24; 25; 26; 27; 28; 29; 32; 35; 36; 37; 38; 39; 40; 41; 42; 42; 42; 43; 43; 46; 49; 83; 109; 130; 203; 및 232에서 선택된다.
연속 올리고뉴클레오티드 서열 (모티프 서열)은, 예를 들면 뉴클레아제 내성 및/또는 표적 핵산에 대한 결합 친화성을 증가시키도록 변형될 수 있는 것으로 이해된다.
변형된 뉴클레오시드 (예컨대, 높은 친화성 변형된 뉴클레오시드)가 올리고뉴클레오티드 서열 내로 통합되는 패턴은 일반적으로 올리고뉴클레오티드 설계로 명명된다.
본원 발명의 올리고뉴클레오티드는 변형된 뉴클레오시드 및 RNA 뉴클레오시드 (특히, siRNA 및 shRNA 분자의 경우) 또는 DNA 뉴클레오시드 (특히, 단일 가닥 안티센스 올리고뉴클레오티드의 경우)로 설계될 수 있다. 바람직하게는, 높은 친화성 변형된 뉴클레오시드가 이용된다.
한 구체예에서, 올리고뉴클레오티드는 적어도 1개의 변형된 뉴클레오시드, 예컨대 적어도 2개, 적어도 3개, 적어도 4개, 적어도 5개, 적어도 6개, 적어도 7개, 적어도 8개, 적어도 9개, 적어도 10개, 적어도 11개, 적어도 12개, 적어도 13개, 적어도 14개, 적어도 15개 또는 적어도 16개의 변형된 뉴클레오시드를 포함한다. 한 구체예에서, 올리고뉴클레오티드는 1 내지 10개의 변형된 뉴클레오시드, 예컨대 2 내지 9개의 변형된 뉴클레오시드, 예컨대 3 내지 8개의 변형된 뉴클레오시드, 예컨대 4 내지 7개의 변형된 뉴클레오시드, 예컨대 6 또는 7개의 변형된 뉴클레오시드를 포함한다. 적합한 변형은 "정의" 섹션에서 "변형된 뉴클레오시드", "높은 친화성 변형된 뉴클레오시드", "당 변형", "2' 당 변형" 및 "잠금 핵산 (LNA)" 하에 기술된다.
한 구체예에서, 올리고뉴클레오티드는 하나 또는 그 이상의 당 변형된 뉴클레오시드, 예컨대 2' 당 변형된 뉴클레오시드를 포함한다. 바람직하게는, 본원 발명의 올리고뉴클레오티드는 2'-O-알킬-RNA, 2'-O-메틸-RNA, 2'-알콕시-RNA, 2'-O-메톡시에틸-RNA, 2'-아미노-DNA, 2'-플루오로-DNA, 아라비노 핵산 (ANA), 2'-플루오로-ANA 및 LNA 뉴클레오시드로 구성된 군에서 독립적으로 선택되는 하나 또는 그 이상의 2' 당 변형된 뉴클레오시드를 포함한다. 변형된 뉴클레오시드(들) 중 하나 또는 그 이상이 잠금 핵산 (LNA)인 것이 바람직하다.
추가의 구체예에서, 올리고뉴클레오티드는 적어도 하나의 변형된 뉴클레오시드간 연쇄를 포함한다. 적합한 뉴클레오시드간 변형은 "정의" 섹션에서 "변형된 뉴클레오시드간 연쇄" 하에 기술된다. 올리고뉴클레오티드의 5' 또는 3' 단부에서 적어도 2 내지 3개의 뉴클레오시드간 연쇄가 포스포로티오에이트 뉴클레오시드간 연쇄인 것이 바람직하다. 단일 가닥 안티센스 올리고뉴클레오티드의 경우에, 연속 뉴클레오티드 서열 내에 적어도 75%, 예컨대 모든 뉴클레오시드간 연쇄가 포스포로티오에이트 뉴클레오시드간 연쇄인 것이 바람직하다. 일부 구체예에서, 단일 가닥 안티센스 올리고뉴클레오티드의 연속 서열에서 모든 뉴클레오티드간 연쇄는 포스포로티오에이트 연쇄이다.
일부 구체예에서, 본원 발명의 올리고뉴클레오티드는 적어도 하나의 LNA 뉴클레오시드, 예컨대 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 또는 8개의 LNA 뉴클레오시드, 예컨대 2 내지 6개의 LNA 뉴클레오시드, 예컨대 3 내지 7개의 LNA 뉴클레오시드, 4 내지 8개의 LNA 뉴클레오시드 또는 3, 4, 5, 6, 7 또는 8개의 LNA 뉴클레오시드를 포함한다. 일부 구체예에서, 올리고뉴클레오티드에서 적어도 75%의 변형된 뉴클레오시드는 LNA 뉴클레오시드이다, 예컨대 80%, 예컨대 85%, 예컨대 90%의 변형된 뉴클레오시드는 LNA 뉴클레오시드이다. 또 다른 추가의 구체예에서, 올리고뉴클레오티드에서 모든 변형된 뉴클레오시드는 LNA 뉴클레오시드이다. 추가의 구체예에서, 올리고뉴클레오티드는 베타-D-옥시-LNA, 그리고 하기의 LNA 뉴클레오시드: 베타-D 또는 알파-L 구성에서 티오-LNA, 아미노-LNA, 옥시-LNA, ScET 및/또는 ENA, 또는 이들의 조합 중 하나 또는 그 이상을 포함할 수 있다. 추가의 구체예에서, 모든 LNA 시토신 단위는 5-메틸-시토신이다. 올리고뉴클레오티드 또는 연속 뉴클레오티드 서열의 뉴클레아제 안정성을 위해 뉴클레오티드 서열의 5' 단부에서 적어도 1개의 LNA 뉴클레오시드 및 3' 단부에서 적어도 2개의 LNA 뉴클레오시드를 갖는 것이 바람직하다.
본원 발명의 구체예에서, 본원 발명의 올리고뉴클레오티드는 RNase H를 모집할 수 있다.
본원 발명에서 유리한 구조 설계는 "정의" 섹션에서 예를 들면 "갭머", "LNA 갭머" 및 "MOE 갭머" 하에 기술된 바와 같은 갭머 설계이다. 본원 발명에서, 본원 발명의 안티센스 올리고뉴클레오티드가 F-G-F' 설계를 갖는 갭머인 것이 바람직하다. 일부 구체예에서 갭머는 균일한 측부를 갖는 LNA 갭머이다.
본원 발명의 일부 구체예에서 LNA 갭머는 하기의 균일한 측부 설계에서 선택된다: 2-12-3, 4-14-2, 3-10-3, 3-9-3, 2-15-2, 2-12-4, 1-13-2, 3-13-2, 4-13-2, 2-12-2, 3-12-2, 3-15-2, 3-14-2, 3-13-3, 2-14-4, 3-12-3, 1-14-3, 3-14-3, 2-14-3, 2-15-3, 3-11-3, 1-12-3, 1-11-4, 1-13-2, 2-13-2, 2-16-2, 1-14-2, 1-17-3 및 1-18-2.
표 6 (재료와 방법 섹션)은 각 모티프 서열의 바람직한 설계를 열거한다.
모든 경우에서 F-G-F' 설계는 "정의" 섹션에서 "올리고뉴클레오티드 내에 영역 D' 또는 D''" 하에 기술된 바와 같은 영역 D' 및/또는 D''를 더욱 포함할 수 있다. 일부 구체예에서 본원 발명의 올리고뉴클레오티드는 갭머 영역의 5' 또는 3' 단부에서 1, 2 또는 3개의 포스포디에스테르 결합된 뉴클레오시드 단위, 예컨대 DNA 단위를 갖는다. 일부 구체예에서 본원 발명의 올리고뉴클레오티드는 2개의 5' 포스포디에스테르 결합된 DNA 뉴클레오시드, 그 이후에 "정의" 섹션에서 규정된 바와 같은 F-G-F' 갭머 영역으로 구성된다. 5' 또는 3' 단부에서 포스포디에스테르 결합된 DNA 단위를 내포하는 올리고뉴클레오티드는 접합에 적합하고, 그리고 본원에서 기술된 바와 같은 접합 모이어티를 더욱 포함할 수 있다. 간으로의 전달을 위해, ASGPR 표적화 모이어티가 접합 모이어티로서 특히 바람직하다.
본원 발명의 일부 구체예의 경우에, 올리고뉴클레오티드는 CMP-ID-NO: 22_1; 23_1; 24_1; 25_1; 26_1; 27_1; 28_1; 29_1; 30_1; 31_1; 32_1; 33_1; 34_1; 35_1; 36_1; 37_1; 38_1; 39_1; 40_1; 41_1; 42_1; 42_2; 42_3; 43_1; 43_2; 44_1; 45_1; 46_1; 47_1; 48_1; 49_1; 130_1; 109_1; 83_1; 203_1 및 232_1을 갖는 올리고뉴클레오티드 화합물의 군에서 선택된다 (참조: 표 6).
접합체
HBV 감염이 간에서 간세포에 일차적으로 영향을 주기 때문에, 접합되지 않은 저해제와 비교하여 저해제의 간으로의 전달을 증가시킬 접합 모이어티에 RTEL1 저해제를 접합하는 것이 바람직하다. 한 구체예에서 간 표적화 모이어티는 콜레스테롤 또는 다른 지질을 포함하는 모이어티, 또는 아시알로당단백질 수용체 (ASGPR)에 결합할 수 있는 접합 모이어티에서 선택된다.
일부 구체예에서, 본원 발명은 접합 모이어티에 공유 부착된 본원 발명의 핵산 분자를 포함하는 접합체를 제공한다.
아시알로당단백질 수용체 (ASGPR) 접합 모이어티는 갈락토오스의 친화성과 동등하거나 또는 이보다 큰 친화성으로 아시알로당단백질 수용체에 결합할 수 있는 하나 또는 그 이상의 탄수화물 모이어티 (ASGPR 표적화 모이어티)를 포함한다. 아시알로당단백질 수용체에 대한 다양한 갈락토오스 유도체의 친화성이 연구되었거나 (참조: 예를 들면: Jobst, S.T. and Drickamer, K. JB.C. 1996, 271, 6686) 또는 당해 분야에서 전형적인 방법을 이용하여 쉽게 결정된다.
한 구체예에서 접합 모이어티는 갈락토오스, 갈락토사민, N-포르밀-갈락토사민, N-아세틸갈락토사민, N-프로피오닐-갈락토사민, N-n-부타노일-갈락토사민 및 N-이소부타노일갈락토사민으로 구성된 군에서 선택되는 적어도 하나의 아시알로당단백질 수용체 표적화 모이어티를 포함한다. 유리하게는 아시알로당단백질 수용체 표적화 모이어티는 N-아세틸갈락토사민 (GalNAc)이다.
ASGPR 접합 모이어티를 산출하기 위해, ASGPR 표적화 모이어티 (바람직하게는 GalNAc)는 접합체 골격에 부착될 수 있다. 일반적으로, ASGPR 표적화 모이어티는 골격의 동일한 단부에 있을 수 있다. 한 구체예에서, 접합 모이어티는 안티센스 올리고뉴클레오티드에 접합될 수 있는 가지치기 분자에 각 GalNAc 모이어티를 연결하는 스페이서에 연결된 2 내지 4개의 말단 GalNAc 모이어티로 구성된다.
추가 구체예에서, 접합 모이어티는 아시알로당단백질 수용체 표적화 모이어티에 대하여 일가, 이가, 삼가 또는 사가이다. 유리하게는 아시알로당단백질 수용체 표적화 모이어티는 N-아세틸갈락토사민 (GalNAc) 모이어티를 포함한다.
GalNAc 접합 모이어티는, 예를 들면 WO 2014/179620 및 WO 2016/055601 및 PCT/EP2017/059080 (본원에서 참조로서 편입됨)에서 설명된 것들뿐만 아니라 GalNAc 모이어티가 부착된 작은 펩티드, 예컨대 Tyr-Glu-Glu-(아미노헥실 GalNAc)3 (YEE(ahGalNAc)3; 간세포 상에서 아시알로당단백질 수용체에 결합하는 글리코트리펩티드, 참조: 예를 들면, Duff, et al., Methods Enzymol, 2000, 313, 297); 리신-기초된 갈락토오스 클러스터 (예를 들면, L3G4; Biessen, et al., Cardovasc. Med., 1999, 214); 그리고 콜란-기초된 갈락토오스 클러스터 (예를 들면, 아시알로당단백질 수용체에 대한 탄수화물 인식 모티프)를 포함할 수 있다.
ASGPR 접합 모이어티, 특히 삼가 GalNAc 접합 모이어티는 당해 분야에서 공지된 방법을 이용하여 올리고뉴클레오티드의 3' 또는 5' 단부에 부착될 수 있다. 한 구체예에서 ASGPR 접합 모이어티는 올리고뉴클레오티드의 5' 단부에 결합된다.
한 구체예에서 접합 모이어티는 삼가 N-아세틸갈락토사민 (GalNAc), 예컨대 도 1에서 도시된 것들, 특히 도 1d에서 도시된 것들이다.
제조 방법
추가적인 양상에서, 본원 발명은 뉴클레오티드 단위를 반응시켜 올리고뉴클레오티드 내에 포함되는 공유 결합된 연속 뉴클레오티드 단위를 형성하는 단계를 포함하는, 본원 발명의 올리고뉴클레오티드의 제조 방법을 제공한다. 바람직하게는, 상기 방법은 포스포라미디트 화학 반응을 이용한다 (참조: 예를 들면, Caruthers et al, 1987, Methods in Enzymology vol. 154, 287-313쪽). 추가의 구체예에서, 상기 방법은 연속 뉴클레오티드 서열을 접합 모이어티 (리간드)와 반응시켜 접합 모이어티를 올리고뉴클레오티드에 공유 부착하는 단계를 추가로 포함한다. 추가의 양상에서, 본원 발명의 올리고뉴클레오티드 또는 본원 발명의 접합된 올리고뉴클레오티드를 제약학적으로 허용되는 희석제, 용매, 운반체, 염 및/또는 보조제와 혼합하는 단계를 포함하는, 본원 발명의 조성물을 제조하기 위한 방법이 제공된다.
제약학적 염
본원 발명에 따른 화합물은 그들의 제약학적으로 허용되는 염의 형태로 존재할 수 있다. 용어 "제약학적으로 허용되는 염"은 본원 발명의 화합물의 생물학적 효과와 특성을 유지하고 적합한 비-독성 유기 또는 무기 산 또는 유기 또는 무기 염기로부터 형성되는 전통적인 산-부가 염 또는 염기-부가 염을 지칭한다. 산-부가 염은, 예를 들면, 염산, 브롬화수소산, 요오드화수소산, 황산, 술팜산, 인산 및 질산과 같은 무기산으로부터 유래된 것들, 그리고 p-톨루엔술폰산, 살리실산, 메탄술폰산, 옥살산, 숙신산, 시트르산, 말산, 락트산 및 푸마르산 등과 유기산으로부터 유래된 것들을 포함한다. 염기-부가 염은 암모늄, 칼륨, 나트륨 및 4차 수산화암모늄, 예컨대 예를 들면 수산화테트라메틸암모늄으로부터 유래된 것들을 포함한다. 제약학적 화합물을 염으로 바꾸는 화학적 변형은 화합물의 개선된 물리적 및 화학적 안정성, 흡습성, 유동성 및 용해도를 수득하기 위한 약제사들에게 잘 알려진 기술이다. 예를 들면, Bastin, Organic Process Research & Development 2000, 4, 427-435 또는 Ansel, In: Pharmaceutical Dosage Forms and Drug Delivery Systems, 6th ed. (1995), pp. 196 및 1456-1457에서 기술된다. 예를 들면, 본원에 제공된 화합물의 제약학적으로 허용되는 염은 나트륨 염일 수 있다.
추가의 양상에서, 본원 발명은 안티센스 올리고뉴클레오티드 또는 이의 접합체의 제약학적으로 허용되는 염을 제공한다. 바람직한 구체예에서, 제약학적으로 허용되는 염은 나트륨 또는 칼륨 염이다.
제약학적 조성물
추가의 양상에서, 본원 발명은 전술된 올리고뉴클레오티드 및/또는 올리고뉴클레오티드 접합체 또는 이의 염 중 임의의 것 및 제약학적으로 허용되는 희석제, 운반체, 염 및/또는 보조제를 포함하는 제약학적 조성물을 제공한다. 제약학적으로 허용되는 희석제는 인산염-완충 식염수 (PBS)를 포함하고, 그리고 제약학적으로 허용되는 염은 나트륨 및 칼륨 염을 포함하지만 이들에 한정되지 않는다. 일부 구체예에서, 제약학적으로 허용되는 희석제는 멸균 인산염 완충된 식염수이다. 일부 구체예에서, 올리고뉴클레오티드는 제약학적으로 허용되는 희석제에서 50-300 μM 용액의 농도로 이용된다.
본원 발명에 이용하기에 적합한 제제는 Remington's Pharmaceutical Sciences, Mack Publishing Company, Philadelphia, Pa., 17th ed., 1985에서 발견된다. 약물 전달 방법에 관한 간략한 검토를 위해, 예를 들면 Langer (Science 249: 1527-1533, 1990)를 참조한다. WO 2007/031091은 제약학적으로 허용되는 희석제, 운반체 및 보조제의 적합하고 바람직한 실례를 추가로 제공한다 (본원에 참조로서 편입됨). 적합한 용량, 제제, 투여 경로, 조성물, 약형, 다른 치료제와의 병용, 전구약물 제제 또한 WO2007/031091에서 제공된다.
일부 구체예에서, 본원 발명의 올리고뉴클레오티드 또는 올리고뉴클레오티드 접합체, 또는 이들의 제약학적으로 허용되는 염은 고체 형태, 예컨대 분말, 예컨대 동결 건조된 분말이다.
본원 발명의 화합물, 올리고뉴클레오티드 또는 올리고뉴클레오티드 접합체는 제약학적 조성물 또는 제제의 제조를 위해 제약학적으로 허용되는 활성 또는 비활성 물질과 혼합될 수 있다. 제약학적 조성물의 제제를 위한 조성물 및 방법은 투여 경로, 질환의 정도, 또는 투여되는 용량을 포함하지만 이들에 한정되지 않는 다수의 기준에 의존한다.
이들 조성물은 전통적인 멸균 기술에 의해 멸균될 수 있거나, 또는 멸균 여과될 수 있다. 그 결과로서 생성된 수용액은 그대로 이용하기 위해 포장되거나, 또는 동결 건조될 수 있으며, 동결 건조된 제조물은 투여 전 멸균 수성 운반체와 조합된다. 이들 제조물의 pH는 전형적으로 3 내지 11, 더욱 바람직하게는 5 내지 9 또는 6 내지 8, 그리고 가장 바람직하게는 7 내지 8, 예컨대 7 내지 7.5일 것이다. 그 결과로서 생성된 고체 형태의 조성물은 복수의 단일 투약 단위로 포장될 수 있으며, 각각은 고정된 양의 전술된 작용제 또는 작용제들을, 예컨대 정제 또는 캡슐의 밀봉된 포장물 내에 내포한다. 고체 형태의 조성물은 또한 유연한 양을 위한 용기, 예컨대 국소적으로 적용가능한 크림 또는 연고를 위해 설계된 압착가능 튜브에 포장될 수 있다.
일부 구체예에서, 본원 발명의 올리고뉴클레오티드 또는 올리고뉴클레오티드 접합체는 전구약물이다. 특히, 올리고뉴클레오티드 접합체와 관련하여, 일단 전구약물이 작용 부위, 예를 들면, 표적 세포로 전달되면, 접합 모이어티는 올리고뉴클레오티드로부터 개열된다.
투여
본원 발명의 화합물, 올리고뉴클레오티드, 올리고뉴클레오티드 접합체 또는 제약학적 조성물은 국소 (예컨대, 피부, 흡입, 안과 또는 귀) 또는 경장 (예컨대, 경구 또는 위장관을 통해) 또는 비경구 (예컨대, 정맥내, 피하, 근육내, 뇌내, 뇌실내 또는 척수강내) 투여될 수 있다.
바람직한 구체예에서 본원 발명의 올리고뉴클레오티드 또는 제약학적 조성물은 정맥내, 동맥내, 피하, 복막내 또는 근육내 주사 또는 주입, 척수강내 또는 두개내, 예를 들면, 뇌내 또는 심실내, 유리체내 투여를 비롯한 비경구 경로에 의해 투여된다. 한 구체예에서 활성 올리고뉴클레오티드 또는 올리고뉴클레오티드 접합체는 정맥내 투여된다. 다른 구체예에서 활성 올리고뉴클레오티드 또는 올리고뉴클레오티드 접합체는 피하 투여된다.
일부 구체예에서, 본원 발명의 올리고뉴클레오티드, 올리고뉴클레오티드 접합체 또는 제약학적 조성물은 0.1 - 15 mg/kg, 예컨대 0.2 - 10 mg/kg, 예컨대 0.25 - 5 mg/kg의 용량으로 투여된다. 투여는 주 1회, 2 주마다 1회, 3 주마다 1회 또는 심지어 월 1회일 수 있다.
본원 발명은 또한, 약제의 제조를 위한 전술된 바와 같은 본원 발명의 올리고뉴클레오티드 또는 올리고뉴클레오티드 접합체의 용도를 제공하는데, 여기서 상기 약제는 피하 투여용 약형이다.
병용 요법
일부 구체예에서, 본원 발명의 저해제, 예컨대 본원 발명의 화합물, 올리고뉴클레오티드, 올리고뉴클레오티드 접합체 또는 제약학적 조성물은 다른 치료제와의 병용 치료에서 이용을 위한 것이다. 치료제는 예를 들면 전술된 질환 또는 장애에 대한 관리 기준일 수 있다.
실례로서, 본원 발명의 소중합체 또는 소중합체 접합체는 안티센스 (다른 LNA 소중합체 포함), siRNA (예컨대 ARC520), 앱타머, 모르폴리노 또는 임의의 다른 항바이러스성, 뉴클레오티드 서열-의존성 작용 방식을 통해 작용하는 다른 활성제, 예컨대 올리고뉴클레오티드-기초된 항바이러스제 - 예컨대 서열 특이적 올리고뉴클레오티드-기초된 항바이러스제 -와 병용될 수 있다.
추가 실례로서, 본원 발명의 소중합체 또는 소중합체 접합체는 다른 활성제, 예컨대 면역자극 항바이러스성 화합물, 예컨대 인터페론 (예를 들면, 페길화된 인터페론 알파), TLR7 효현제 (예를 들면, GS-9620), 또는 치료용 백신과 병용될 수 있다.
추가 실례로서, 본원 발명의 소중합체 또는 소중합체 접합체는 항바이러스 활성을 갖는 다른 활성제, 예컨대 소형 분자와 병용될 수 있다. 이들 다른 활성제는, 예를 들면, 뉴클레오시드/뉴클레오티드 저해제 (예를 들면, 엔테카비르 또는 테노포비르 디소프록실 푸마르산염), 캡시드화 저해제, 진입 저해제 (예를 들면, 미르클루덱스 B)일 수 있었다.
일정한 구체예에서, 추가 치료제는 HBV 작용제, C형 간염 바이러스 (HCV) 작용제, 화학요법제, 항생제, 진통제, 비스테로이드성 항염증성 (NSAID) 작용제, 항진균제, 항기생충제, 항메스꺼움 작용제, 항-설사 작용제, 또는 면역억제제일 수 있다.
특정 관련된 구체예에서, 추가 HBV 작용제는 인터페론 알파-2b, 인터페론 알파-2a 및 인터페론 알파콘-1 (페길화된 및 페길화되지 않은), 리바비린; HBV RNA 복제 저해제; 두 번째 안티센스 소중합체; HBV 치료용 백신; HBV 예방용 백신; 라미부딘 (3TC); 엔테카비르 (ETV); 테노포비르 디이소프록실 푸마르산염 (TDF); 텔비부딘 (LdT); 아데포비르; 또는 HBV 항체 요법 (단일클론 또는 다중클론)일 수 있다.
다른 특정 관련된 구체예에서, 추가 HCV 작용제는 인터페론 알파-2b, 인터페론 알파-2a 및 인터페론 알파콘-1 (페길화된 및 페길화되지 않은); 리바비린; 페가시스; HCV RNA 복제 저해제 (예를 들면, ViroPharma의 VP50406 계열); HCV 안티센스 작용제; HCV 치료용 백신; HCV 단백질분해효소 저해제; HCV 헬리카아제 저해제; 또는 HCV 단일클론 또는 다중클론 항체 요법일 수 있다.
적용
본원 발명의 올리고뉴클레오티드는, 예를 들면 진단, 치료 및 예방을 위한 연구용 시약으로서 활용될 수 있다.
연구에서, 이런 올리고뉴클레오티드는 세포 (예를 들면, 시험관내 세포 배양물) 및 실험 동물에서 RTEL1 단백질의 합성을 특이적으로 조절하여 표적의 기능적 분석을 용이하게 하거나 또는 치료적 개입을 위한 표적으로서의 유용성의 평가를 용이하게 할 수 있다. 전형적으로, 표적 조절은 단백질을 생산하는 mRNA를 분해 또는 저해하여 단백질 형성을 방해함으로써 달성되거나, 또는 단백질을 생산하는 유전자 또는 mRNA의 조절제를 분해하거나 저해함으로써 달성된다.
연구 또는 진단에서 본원 발명의 올리고뉴클레오티드를 이용하는 경우, 표적 핵산은 cDNA, 또는 DNA 또는 RNA로부터 유래된 합성 핵산일 수 있다.
또한, RTEL1을 발현하는 표적 세포 내에서 RTEL1 발현을 조절하기 위한 생체내 또는 시험관내 방법이 본원 발명에 의해 포괄되고, 상기 방법은 본원 발명의 올리고뉴클레오티드, 접합 화합물 또는 제약학적 조성물을 효과적인 양으로 상기 세포에 투여하는 단계를 포함한다.
일부 구체예에서, 표적 세포는 포유류 세포, 특히 인간 세포이다. 표적 세포는 포유동물에서 시험관내 세포 배양물 또는 조직의 생체내 세포 형성 부분일 수도 있다. 바람직한 구체예에서 표적 세포는 간 내에 존재한다. 표적 세포는 간세포일 수도 있다.
본원 발명의 한 가지 양상은 약제로서 이용을 위한 본원 발명의 올리고뉴클레오티드, 접합 화합물 또는 제약학적 조성물에 관련된다.
본원 발명의 한 양상에서 본원 발명의 올리고뉴클레오티드, 접합 화합물 또는 제약학적 조성물은 감염된 세포에서 cccDNA 수준을 감소시키고, 그리고 이런 이유로 HBV 감염을 저해할 수 있다. 특히, 안티센스 올리고뉴클레오티드는 감염된 세포에서 하기의 파라미터 중에서 한 가지 또는 그 이상에 영향을 줄 수 있다: i) cccDNA를 감소시키고 및/또는 ii) pgRNA를 감소시키고 및/또는 iii) HBV DNA를 감소시키고 및/또는 iv) HBV 바이러스 항원을 감소시킴.
예를 들면, HBV 감염을 저해하는 핵산 분자는 i) 감염된 세포에서 cccDNA 수준을 대조와 비교하여 적어도 40%, 예컨대 50%, 60%, 70%, 80%, 또는 90% 감소시키거나; 또는 ii) pgRNA의 수준을 대조와 비교하여 적어도 40%, 예컨대 50%, 60%, 70%, 80%, 또는 90% 감소시킬 수 있다. 대조는 처리되지 않은 세포 또는 동물, 또는 적합한 대조로 처리된 세포 또는 동물일 수 있다.
HBV 감염의 저해는 HBV 감염된 일차 인간 간세포를 이용하여 시험관내에서, 또는 인간화 간세포 PXB 생쥐 모형 (PhoenixBio에서 가용, Kakuni et al 2014 Int. J. Mol. Sci. 15:58-74 또한 참조)을 이용하여 생체내에서 계측될 수 있다. HBsAg 및/또는 HBeAg의 분비의 저해는 ELISA에 의해, 예를 들면, 제조업체의 사용설명서에 따라서 CLIA ELISA 키트 (Autobio Diagnostic)를 이용함으로써 계측될 수 있다. 세포내 cccDNA 또는 HBV mRNA 및 pgRNA의 감소는, 예를 들면 재료와 방법 섹션에서 기술된 바와 같이 qPCR에 의해 계측될 수 있다. 검사 화합물이 HBV 감염을 저해하는 지를 평가하기 위한 추가 방법은 예를 들면 WO 2015/173208에서 기술된 바와 같이 qPCR에 의해, 또는 노던 블롯; 원지 혼성화, 또는 면역형광을 이용하여 HBV DNA의 분비를 계측한다.
RTEL1 수준의 감소로 인해, 본원 발명의 올리고뉴클레오티드, 접합 화합물 또는 제약학적 조성물은 HBV 감염의 발달을 저해하거나 또는 이것의 치료에서 이용될 수 있다. 특히, cccDNA의 불안정화 및 감소로 인해, 본원 발명의 올리고뉴클레오티드, 접합 화합물 또는 제약학적 조성물은 단순히 HBsAg의 분비를 감소시키는 화합물과 비교하여 만성 HBV 감염의 발달을 더욱 효율적으로 저해하거나 또는 이것을 더욱 효율적으로 치료한다.
따라서, 본원 발명의 한 가지 양상은 HBV 감염된 개체에서 cccDNA 및/또는 pgRNA를 감소시키기 위한 본원 발명의 올리고뉴클레오티드, 접합 화합물 또는 제약학적 조성물의 용도에 관련된다.
본원 발명의 추가 양상은 만성 HBV 감염의 발달을 저해하거나 또는 이것을 치료하기 위한 본원 발명의 올리고뉴클레오티드, 접합 화합물 또는 제약학적 조성물의 용도에 관계한다.
본원 발명의 추가 양상은 HBV 감염된 개인의 전염력을 감소시키기 위한 본원 발명의 올리고뉴클레오티드, 접합 화합물 또는 제약학적 조성물의 용도에 관계한다. 본원 발명의 특정한 양상에서, 본원 발명의 올리고뉴클레오티드, 접합 화합물 또는 제약학적 조성물은 만성 HBV 감염의 발달을 저해한다.
본원 발명의 올리고뉴클레오티드, 접합 화합물 또는 제약학적 조성물로 치료되는 (또는 본원 발명의 안티센스 올리고뉴클레오티드, 접합 화합물 또는 제약학적 조성물을 예방적으로 제공받는) 개체는 바람직하게는 인간, 더욱 바람직하게는 HBsAg 양성 및/또는 HBeAg 양성인 인간 환자, 이보다 더욱 바람직하게는 HBsAg 양성 및 HBeAg 양성인 인간 환자이다.
따라서, 본원 발명은 HBV 감염을 치료하는 방법에 관계하는데, 여기서 상기 방법은 본원 발명의 올리고뉴클레오티드, 접합 화합물 또는 제약학적 조성물의 효과량을 투여하는 단계를 포함한다. 본원 발명은 만성 HBV 감염에 의해 유발된 간경화증 및 간세포 암종을 예방하는 방법에 더욱 관계한다.
본원 발명은 또한, 약제, 특히 HBV 감염 또는 만성 HBV 감염의 치료 또는 HBV 감염된 개체의 전염력의 감소에서 이용을 위한 약제의 제조를 위한 본원 발명의 올리고뉴클레오티드, 접합 화합물 또는 제약학적 조성물의 용도를 제공한다. 바람직한 구체예에서 약제는 피하 투여용 약형으로 제조된다.
본원 발명은 또한, 정맥내 투여용 약형인 약제의 제조를 위한 본원 발명의 올리고뉴클레오티드, 접합 화합물, 제약학적 조성물의 용도를 제공한다.
본원 발명의 올리고뉴클레오티드, 접합체 또는 제약학적 조성물은 병용 요법에서 이용될 수 있다. 예를 들면, 본원 발명의 올리고뉴클레오티드, 접합체 또는 제약학적 조성물은 다른 항-HBV 작용제, 예컨대 인터페론 알파-2b, 인터페론 알파-2a 및 인터페론 알파콘-1 (페길화된 및 페길화되지 않은), 리바비린, 라미부딘 (3TC), 엔테카비르, 테노포비르, 텔비부딘 (LdT), 아데포비르, 또는 다른 급부상하는 항-HBV 작용제, 예컨대 HBV RNA 복제 저해제, HBsAg 분비 저해제, HBV 캡시드 저해제, 안티센스 소중합체 (예를 들면, WO2012/145697, WO 2014/179629 및 WO2017/216390에서 기술된 바와 같이), siRNA (예를 들면, WO 2005/014806, WO 2012/024170, WO 2012/2055362, WO 2013/003520, WO 2013/159109, WO 2017/027350 및 WO2017/015175에서 기술됨), HBV 치료용 백신, HBV 예방용 백신, HBV 항체 요법 (단일클론 또는 다중클론), 또는 HBV의 치료 및/또는 예방을 위한 TLR 2, 3, 7, 8 또는 9 효현제와 병용될 수 있다.
발명의 구체예
본원 발명의 하기 구체예는 본원에서 설명된 임의의 다른 구체예와 조합으로 이용될 수 있다.
1. B형 간염 바이러스 (HBV) 감염의 치료 및/또는 예방에서 이용을 위한 RTEL1 저해제.
2. 구체예 1의 이용을 위한 RTEL1 저해제, 여기서 RTEL1 저해제는 효과량으로 투여된다.
3. 구체예 1 또는 2의 이용을 위한 RTEL1 저해제, 여기서 HBV 감염은 만성 감염이다.
4. 구체예 1 내지 3의 이용을 위한 RTEL1 저해제, 여기서 RTEL1 저해제는 감염된 세포에서 cccDNA 및/또는 pgRNA를 감소시킬 수 있다.
5. 구체예 1 내지 4 중에서 한 가지의 이용을 위한 RTEL1 저해제, 여기서 RTEL1 저해제는 DNA, 예컨대 cccDNA에 RTEL1의 결합을 예방하거나 또는 감소시킨다.
6. 구체예 5의 이용을 위한 RTEL1 저해제, 여기서 상기 저해제는 RTEL1 단백질에 특이적으로 결합하는 소형 분자이고, 여기서 상기 저해제는 cccDNA에 RTEL1 단백질의 결합을 예방하거나 또는 감소시킨다.
7. 구체예 1 내지 5 중에서 한 가지의 이용을 위한 RTEL1 저해제, 여기서 상기 저해제는 포유류 RTEL1 표적 핵산에 적어도 90% 상보적인, 길이에서 적어도 10개 뉴클레오티드의 연속 뉴클레오티드 서열을 포함하거나 또는 이것으로 구성되는, 길이에서 12-60개 뉴클레오티드의 올리고뉴클레오티드이다.
8. 구체예 7의 이용을 위한 RTEL1 저해제, 이것은 RTEL1 표적 핵산의 수준을 감소시킬 수 있다.
9. 구체예 7 또는 8의 이용을 위한 RTEL1 저해제, 여기서 표적 핵산은 RNA이다.
10. 구체예 9의 이용을 위한 RTEL1 저해제, 여기서 RNA는 프리-mRNA이다.
11. 구체예 7 내지 10 중에서 한 가지의 이용을 위한 RTEL1 저해제, 여기서 올리고뉴클레오티드는 안티센스 올리고뉴클레오티드, siRNA 또는 shRNA에서 선택된다.
12. 구체예 11의 이용을 위한 RTEL1 저해제, 여기서 올리고뉴클레오티드는 단일 가닥 안티센스 올리고뉴클레오티드 또는 이중 가닥 siRNA이다.
13. 구체예 7 내지 12 중에서 한 가지의 이용을 위한 RTEL1 저해제, 여기서 포유류 RTEL1 표적 핵산은 서열 번호: 1 또는 2에서 선택된다.
14. 구체예 7 내지 12 중에서 한 가지의 이용을 위한 RTEL1 저해제, 여기서 올리고뉴클레오티드의 연속 뉴클레오티드 서열은 서열 번호: 1 및 서열 번호: 2의 표적 핵산에 적어도 98% 상보적이다.
15. 구체예 1 내지 14 중에서 한 가지의 이용을 위한 RTEL1 저해제, 여기서 HBV 감염된 세포에서 cccDNA는 대조와 비교할 때 적어도 50%, 예컨대 60%, 예컨대 70%, 예컨대 80%, 예컨대 90%, 예컨대 95%, 예컨대 100% 감소된다.
16. 구체예 7 내지 15 중에서 한 가지의 이용을 위한 올리고뉴클레오티드, 여기서 RTEL1 mRNA는 대조와 비교할 때 적어도 50%, 예컨대 60%, 예컨대 70%, 예컨대 80%, 예컨대 90%, 예컨대 95%, 예컨대 100% 감소된다.
17. 길이에서 12 내지 30개 뉴클레오티드의 연속 뉴클레오티드 서열을 포함하거나 또는 이것으로 구성되는 길이에서 12 내지 60개 뉴클레오티드의 올리고뉴클레오티드, 여기서 상기 연속 뉴클레오티드 서열은 포유류 RTEL1 표적 핵산에 적어도 90% 상보적, 예컨대 95%, 예컨대 98%, 예컨대 완전히 상보적이다.
18. 구체예 17의 올리고뉴클레오티드, 여기서 상기 올리고뉴클레오티드는 화학적으로 생산된다.
19. 구체예 17 또는 18의 올리고뉴클레오티드, 여기서 포유류 RTEL1 표적 핵산은 서열 번호: 1 또는 2에서 선택된다.
20. 구체예 17 또는 18의 올리고뉴클레오티드, 여기서 연속 뉴클레오티드 서열은 서열 번호: 1 및 서열 번호: 2의 표적 핵산에 적어도 98% 상보적이다.
21. 구체예 17 내지 20 중에서 한 가지의 올리고뉴클레오티드, 여기서 상기 올리고뉴클레오티드는 길이에서 12 내지 30개 뉴클레오티드이다.
22. 구체예 17 내지 21 중에서 한 가지의 올리고뉴클레오티드, 여기서 상기 올리고뉴클레오티드는 RNAi 분자, 예컨대 이중 가닥 siRNA 또는 shRNA이다.
23. 구체예 17 내지 21 중에서 한 가지의 올리고뉴클레오티드, 여기서 상기 올리고뉴클레오티드는 단일 가닥 안티센스 올리고뉴클레오티드이다.
24. 구체예 17 내지 23 중에서 한 가지의 올리고뉴클레오티드, 여기서 연속 뉴클레오티드 서열은 서열 번호: 3 내지 21 (표 4)에서 선택되는 표적 서열에 상보적이다.
25. 구체예 17 내지 24의 올리고뉴클레오티드, 이것은 -15 kcal 미만의 △G°로 서열 번호: 1 및 서열 번호: 2의 표적 핵산에 혼성화할 수 있다.
26. 구체예 17 내지 25 중에서 한 가지의 올리고뉴클레오티드, 여기서 연속 뉴클레오티드 서열은 적어도 14개의 연속 뉴클레오티드, 특히 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21 또는 22개의 연속 뉴클레오티드를 포함하거나 또는 이들로 구성된다.
27. 구체예 17 내지 25 중에서 한 가지의 올리고뉴클레오티드, 여기서 연속 뉴클레오티드 서열은 14 내지 22개의 뉴클레오티드를 포함하거나 또는 이들로 구성된다.
28. 구체예 27의 올리고뉴클레오티드, 여기서 연속 뉴클레오티드 서열은 16 내지 20개의 뉴클레오티드를 포함하거나 또는 이들로 구성된다.
29. 구체예 17 내지 28 중에서 한 가지의 올리고뉴클레오티드, 여기서 상기 올리고뉴클레오티드는 길이에서 14 내지 25개의 뉴클레오티드를 포함하거나 또는 이들로 구성된다.
30. 구체예 29의 올리고뉴클레오티드, 여기서 상기 올리고뉴클레오티드는 길이에서 16 내지 22개의 뉴클레오티드를 포함하거나 또는 이들로 구성된다.
31. 구체예 17 내지 30 중에서 한 가지의 올리고뉴클레오티드, 여기서 상기 올리고뉴클레오티드는 서열 번호: 22-237에서 선택되는 서열을 포함한다.
32. 구체예 17 내지 31 중에서 한 가지의 올리고뉴클레오티드, 여기서 연속 뉴클레오티드 서열은 자신이 상보적인 표적 핵산과 비교하여 제로 내지 3개의 부정합을 갖는다.
33. 구체예 32의 올리고뉴클레오티드, 여기서 연속 뉴클레오티드 서열은 표적 핵산과 비교하여 하나의 부정합을 갖는다.
34. 구체예 32의 올리고뉴클레오티드, 여기서 연속 뉴클레오티드 서열은 표적 핵산과 비교하여 2개의 부정합을 갖는다.
35. 구체예 32의 올리고뉴클레오티드, 여기서 연속 뉴클레오티드 서열은 양쪽 표적 핵산 서열에 완전히 상보적이다.
36. 하나 또는 그 이상의 변형된 뉴클레오시드를 포함하는, 구체예 17 내지 35의 올리고뉴클레오티드.
37. 구체예 36의 올리고뉴클레오티드, 여기서 하나 또는 그 이상의 변형된 뉴클레오시드는 높은 친화성 변형된 뉴클레오시드이다.
38. 구체예 36 또는 37의 올리고뉴클레오티드, 여기서 하나 또는 그 이상의 변형된 뉴클레오시드는 2' 당 변형된 뉴클레오시드이다.
39. 구체예 38의 올리고뉴클레오티드, 여기서 하나 또는 그 이상의 2' 당 변형된 뉴클레오시드는 2'-O-알킬-RNA, 2'-O-메틸-RNA, 2'-알콕시-RNA, 2'-O-메톡시에틸-RNA, 2'-아미노-DNA, 2'-플루오로-DNA, 2'-플루오로-ANA 및 LNA 뉴클레오시드로 구성된 군에서 독립적으로 선택된다.
40. 구체예 36-39의 올리고뉴클레오티드, 여기서 하나 또는 그 이상의 변형된 뉴클레오시드는 LNA 뉴클레오시드이다.
41. 구체예 40의 올리고뉴클레오티드, 여기서 변형된 LNA 뉴클레오시드는 옥시-LNA, 아미노-LNA, 티오-LNA, cET 및 ENA에서 선택된다.
42. 구체예 40 또는 41의 올리고뉴클레오티드, 여기서 변형된 LNA 뉴클레오시드는 다음의 2'-4' 브리지 -O-CH2-를 갖는 옥시-LNA이다.
43. 구체예 42의 올리고뉴클레오티드, 여기서 옥시-LNA는 베타-D-옥시-LNA이다.
44. 구체예 40 또는 41의 올리고뉴클레오티드, 여기서 변형된 LNA 뉴클레오시드는 다음의 2'-4' 브리지 -O-CH(CH3)-을 갖는 cET이다.
45. 구체예 44의 올리고뉴클레오티드, 여기서 cET는 (S)cET, 다시 말하면, 6'(S)메틸-베타-D-옥시-LNA이다.
46. 구체예 40 또는 41의 올리고뉴클레오티드, 여기서 LNA는 다음의 2' - 4' 브리지 -O-CH2-CH2-를 갖는 ENA이다.
47. 구체예 17 내지 46 중에서 한 가지의 올리고뉴클레오티드, 여기서 상기 올리고뉴클레오티드는 적어도 하나의 변형된 뉴클레오시드간 연쇄를 포함한다.
48. 구체예 47의 올리고뉴클레오티드, 여기서 변형된 뉴클레오시드간 연쇄는 뉴클레아제 내성이다.
49. 구체예 47 또는 48의 올리고뉴클레오티드, 여기서 변형된 뉴클레오시드간 연쇄는 포스포로티오에이트 뉴클레오시드간 연쇄이다.
50. 구체예 17 내지 49 중에서 한 가지의 올리고뉴클레오티드, 여기서 상기 올리고뉴클레오티드는 RNase H를 모집할 수 있는 안티센스 올리고뉴클레오티드이다.
51. 구체예 50의 안티센스 올리고뉴클레오티드, 여기서 상기 안티센스 올리고뉴클레오티드 또는 연속 뉴클레오티드 서열은 갭머이다.
52. 구체예 51의 안티센스 올리고뉴클레오티드, 여기서 상기 안티센스 올리고뉴클레오티드 또는 이의 연속 뉴클레오티드 서열은 화학식 5'-F-G-F'-3'의 갭머로 구성되거나 또는 이것을 포함하고, 여기서 영역 F 및 F'는 1-4개의 2' 당 변형된 뉴클레오시드를 독립적으로 포함하거나 또는 이들로 구성되고, 그리고 G는 RNaseH를 모집할 수 있는 6 내지 18개 뉴클레오시드의 영역이다.
53. 구체예 52의 안티센스 올리고뉴클레오티드, 여기서 2' 당 변형된 뉴클레오시드는 2'-O-알킬-RNA, 2'-O-메틸-RNA, 2'-알콕시-RNA, 2'-O-메톡시에틸-RNA, 2'-아미노-DNA, 2'-플루오로-DNA, 아라비노 핵산 (ANA), 2'-플루오로-ANA 및 LNA 뉴클레오시드로 구성된 군에서 독립적으로 선택된다.
54. 구체예 52 또는 53의 안티센스 올리고뉴클레오티드, 여기서 영역 F 및 F'에서 2' 당 변형된 뉴클레오시드 중에서 하나 또는 그 이상은 LNA 뉴클레오시드이다.
55. 구체예 54의 안티센스 올리고뉴클레오티드, 여기서 영역 F 및 F'에서 모든 2' 당 변형된 뉴클레오시드는 LNA 뉴클레오시드이다.
56. 구체예 53 내지 55의 올리고뉴클레오티드, 여기서 LNA 뉴클레오시드는 베타-D-옥시-LNA, 알파-L-옥시-LNA, 베타-D-아미노-LNA, 알파-L-아미노-LNA, 베타-D-티오-LNA, 알파-L-티오-LNA, (S)cET, (R)cET 베타-D-ENA 및 알파-L-ENA에서 선택된다.
57. 구체예 53 내지 56의 안티센스 올리고뉴클레오티드, 여기서 영역 F 및 F'는 동일한 LNA 뉴클레오시드로 구성된다.
58. 구체예 53 내지 57의 안티센스 올리고뉴클레오티드, 여기서 영역 F 및 F'에서 모든 2' 당 변형된 뉴클레오시드는 옥시-LNA 뉴클레오시드이다.
59. 구체예 52 내지 58 중에서 한 가지의 안티센스 올리고뉴클레오티드, 여기서 영역 G에서 뉴클레오시드는 DNA 및/또는 알파-L-LNA 뉴클레오시드이다.
60. 구체예 59의 안티센스 올리고뉴클레오티드, 여기서 영역 G는 적어도 75% DNA 뉴클레오시드로 구성된다.
61. 구체예 60의 안티센스 올리고뉴클레오티드, 여기서 영역 G에서 모든 뉴클레오시드는 DNA 뉴클레오시드이다.
62. 구체예 17 내지 62 중에서 한 가지의 올리고뉴클레오티드, 여기서 상기 올리고뉴클레오티드는 CMP 식별 번호: 22_1; 23_1; 24_1; 25_1; 26_1; 27_1; 28_1; 29_1; 30_1; 31_1; 32_1; 33_1; 34_1; 35_1; 36_1; 37_1; 38_1; 39_1; 40_1; 41_1; 42_1; 42_2; 42_3; 43_1; 43_2; 44_1; 45_1; 46_1; 49_1; 130_1; 109_1; 83_1; 203_1 및 232_1, 또는 이들의 제약학적으로 허용되는 염에서 선택된다.
63. 구체예 17 내지 50 중에서 한 가지에 따른 올리고뉴클레오티드 또는 구체예 51 내지 62 중에서 한 가지에 따른 안티센스 올리고뉴클레오티드, 그리고 상기 안티센스 올리고뉴클레오티드에 공유 부착된 적어도 하나의 접합 모이어티를 포함하는 접합 화합물.
64. 구체예 63의 접합 화합물, 여기서 올리고뉴클레오티드는 이중 가닥 siRNA이고, 그리고 접합 모이어티는 상기 siRNA의 센스 가닥에 공유 부착된다.
65. 구체예 63 또는 64의 접합 화합물, 여기서 접합 모이어티는 탄수화물, 세포 표면 수용체 리간드, 원료의약품, 호르몬, 친유성 물질, 중합체, 단백질, 펩티드, 독소, 비타민, 바이러스 단백질 또는 이들의 조합에서 선택된다.
66. 구체예 63 내지 65 중에서 한 가지의 접합 화합물, 여기서 접합 모이어티는 아시알로당단백질 수용체에 결합할 수 있다.
67. 구체예 66의 접합 화합물, 여기서 접합 모이어티는 갈락토오스, 갈락토사민, N-포르밀-갈락토사민, N-아세틸갈락토사민, N-프로피오닐-갈락토사민, N-n-부타노일-갈락토사민 및 N-이소부타노일갈락토사민으로 구성되는 군에서 선택되는 적어도 하나의 아시알로당단백질 수용체 표적화 모이어티를 포함한다.
68. 구체예 67의 접합 화합물, 여기서 아시알로당단백질 수용체 표적화 모이어티는 N-아세틸갈락토사민 (GalNAc)이다.
69. 구체예 67 또는 68의 접합 화합물, 여기서 접합 모이어티는 아시알로당단백질 수용체 표적화 모이어티에 대하여 일가, 이가, 삼가 또는 사가이다.
70. 구체예 69의 접합 화합물, 여기서 접합 모이어티는 2 내지 4개의 말단 GalNAc 모이어티, 그리고 각 GalNAc 모이어티를, 안티센스 화합물에 접합될 수 있는 가지치기 분자에 연결하는 스페이서로 구성된다.
71. 구체예 70의 접합 화합물, 여기서 스페이서는 PEG 스페이서이다.
72. 구체예 66 내지 71의 접합 화합물, 여기서 접합 모이어티는 삼가 N-아세틸갈락토사민 (GalNAc) 모이어티이다.
73. 구체예 66 내지 72의 접합 화합물, 여기서 접합 모이어티는 도 1에서 삼가 GalNAc 모이어티 중 한 가지에서 선택된다.
74. 구체예 73의 접합 화합물, 여기서 접합 모이어티는 도 1d에서 삼가 GalNAc 모이어티이다.
75. 올리고뉴클레오티드 또는 안티센스 올리고뉴클레오티드 및 접합 모이어티 사이에 위치하는 링커를 포함하는, 구체예 63-74의 접합 화합물.
76. 구체예 75의 접합 화합물, 여기서 링커는 생리학적으로 불안정 링커이다.
77. 구체예 76의 접합 화합물, 여기서 생리학적으로 불안정 링커는 뉴클레아제 민감성 링커이다.
78. 구체예 76 또는 77의 올리고뉴클레오티드 접합체, 여기서 생리학적으로 불안정 링커는 2 내지 5개의 연속 포스포디에스테르 연쇄로 구성된다.
79. 구체예 66-78의 접합 화합물, 이것은 접합되지 않은 올리고뉴클레오티드 또는 안티센스 올리고뉴클레오티드와 비교하여, 간 대 신장 사이에 향상된 세포 분포, 또는 접합 화합물의 간 내로 향상된 세포 흡수를 전시한다.
80. 구체예 17 내지 50 중에서 한 가지에 따른 올리고뉴클레오티드 또는 구체예 51 내지 61 중에서 한 가지에 따른 안티센스 올리고뉴클레오티드, 구체예 63 내지 79의 접합 화합물, 또는 이들의 허용가능 염, 그리고 제약학적으로 허용되는 희석제, 운반체, 염 및/또는 보조제를 포함하는 제약학적 조성물.
81. 하기 단계를 포함하는, B형 간염 바이러스 (HBV) 감염을 예방하고, 개선하고 및/또는 저해하는 화합물을 확인하기 위한 방법:
a. 검사 화합물을
i. RTEL1 폴리펩티드; 또는
ii. RTEL1을 발현하는 세포와 접촉시키는 단계;
b. 상기 검사 화합물의 존재와 부재에서 RTEL1의 발현 및/또는 활성을 계측하는 단계; 그리고
c. RTEL1의 발현 및/또는 활성을 감소시키고 cccDNA를 감소시키는 화합물을 확인하는 단계.
82. RTEL1을 발현하는 표적 세포에서 RTEL1 발현을 조절하기 위한 생체내 또는 시험관내 방법, 여기서 상기 방법은 구체예 17 내지 50 중에서 한 가지의 올리고뉴클레오티드 또는 구체예 51 내지 61 중에서 한 가지에 따른 안티센스 올리고뉴클레오티드, 구체예 63 내지 79의 접합 화합물 또는 구체예 80의 제약학적 조성물을 효과량으로 상기 세포에 투여하는 단계를 포함한다.
83. 구체예 82의 방법, 여기서 RTEL1 발현은 어떤 치료도 없거나 또는 대조로 치료될 때 수준과 비교하여, 표적 세포에서 적어도 50%, 또는 적어도 60%, 또는 적어도 70%, 또는 적어도 80%, 또는 적어도 90%, 또는 적어도 95% 감소된다.
84. 구체예 82의 방법, 여기서 표적 세포는 HBV로 감염되고, 그리고 HBV 감염된 세포에서 cccDNA는 어떤 치료도 없거나 또는 대조로 치료될 때 수준과 비교하여, HBV 감염된 표적 세포에서 적어도 50%, 또는 적어도 60%, 또는 적어도 70%, 또는 적어도 80%, 또는 적어도 90%, 또는 적어도 95% 감소된다.
85. 질환을 치료하거나 예방하기 위한 방법, 여기서 상기 방법은 구체예 17 내지 50 중에서 한 가지의 올리고뉴클레오티드 또는 구체예 51 내지 61 중에서 한 가지에 따른 안티센스 올리고뉴클레오티드, 구체예 63 내지 79의 접합 화합물 또는 구체예 80의 제약학적 조성물의 치료 또는 예방 효과량을 상기 질환을 앓거나 또는 이것에 취약한 개체에게 투여하는 단계를 포함한다.
86. 개체에서 질환의 치료 또는 예방을 위한 약제로서 이용을 위한, 구체예 17 내지 50 중에서 한 가지의 올리고뉴클레오티드 또는 구체예 51 내지 61 중에서 한 가지에 따른 안티센스 올리고뉴클레오티드, 또는 구체예 63 내지 79 중에서 한 가지의 접합 화합물 또는 구체예 80의 제약학적 조성물.
87. 개체에서 질환의 치료 또는 예방을 위한 약제의 제조를 위한, 구체예 17 내지 50 중에서 한 가지의 올리고뉴클레오티드 또는 구체예 51 내지 61 중에서 한 가지에 따른 안티센스 올리고뉴클레오티드, 또는 구체예 63 내지 79 중에서 한 가지의 접합 화합물의 용도.
88. 구체예 85 - 87의 방법, 올리고뉴클레오티드, 안티센스 올리고뉴클레오티드, 접합체 또는 용도, 여기서 개체는 포유동물이다.
89. 구체예 88의 방법, 올리고뉴클레오티드, 안티센스 올리고뉴클레오티드, 접합체, 또는 용도, 여기서 포유동물은 인간이다.
본원 발명은 이제, 하기 실시예에 의해 예증될 것인데, 이들은 제한의 성격을 갖지 않는다.
실시예
재료와 방법
올리고뉴클레오티드 모티프 서열 및 올리고뉴클레오티드 화합물
표 6: 올리고뉴클레오티드 모티프 서열 (서열 번호로 표시됨), 이들의 설계, 그리고 모티프 서열에 기초하여 설계된 특정 올리고뉴클레오티드 화합물 (CMP 식별 번호로 표시됨)의 목록.
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모티프 서열은 올리고뉴클레오티드 내에 존재하는 핵염기의 연속 서열을 나타낸다.
설계는 갭머 설계, F-G-F'를 지칭하는데, 여기서 각 숫자는 연속 변형된 뉴클레오시드, 예를 들면 2' 변형된 뉴클레오시드의 숫자 (첫 번째 숫자=5' 측부), 그 이후에 DNA 뉴클레오시드의 숫자 (두 번째 숫자= 갭 영역), 그 이후에 변형된 뉴클레오시드, 예를 들면 2' 변형된 뉴클레오시드의 숫자 (세 번째 숫자=3' 측부)을 나타내고, 임의적으로 표적 핵산에 상보적인 연속 서열의 반드시 일부인 것은 아닌 DNA와 LNA의 추가 반복된 영역이 선행하거나 또는 후행한다.
올리고뉴클레오티드 화합물은 모티프 서열의 특정 설계를 나타낸다. 대문자는 베타-D-옥시 LNA 뉴클레오시드를 나타내고, 소문자는 DNA 뉴클레오시드를 나타내고, 모든 LNA C는 5-메틸 시토신이고, 5-메틸 DNA 시토신은 "e"에 의해 표시되고, 그리고 모든 뉴클레오시드간 연쇄는 포스포로티오에이트 뉴클레오시드간 연쇄이다.
올리고뉴클레오티드 합성
올리고뉴클레오티드 합성은 일반적으로 당해 분야에 공지되어 있다. 다음은 적용될 수 있는 프로토콜이다. 본원 발명의 올리고뉴클레오티드는 이용된 장치, 지지체 및 농도의 면에서 약간씩 변화를 주는 방식으로 생산될 수 있다.
올리고뉴클레오티드는 1 μmol 규모로 Oligomaker 48 상에서 포스포라미디트 접근법을 이용하여 우리딘 범용 지지체 상에서 합성된다. 합성의 종결 시점에, 올리고뉴클레오티드는 60℃에서 5-16 시간 동안 액상 암모니아를 이용하여 고체 지지체로부터 개열된다. 올리고뉴클레오티드는 역상 HPLC (RP-HPLC)에 의해 또는 고체상 추출에 의해 정제되고 UPLC에 의해 특징화되며, 분자 질량은 ESI-MS에 의해 추가로 확증된다.
올리고뉴클레오티드의 신장:
β-시아노에틸-포스포라미디트 (DNA-A(Bz), DNA-G(ibu), DNA-C(Bz), DNA-T, LNA-5-메틸-C(Bz), LNA-A(Bz), LNA-G(dmf) 또는 LNA-T)의 연계는 아세토니트릴에서 0.1 M의 5'-O-DMT-보호된 아미디트 및 아세토니트릴에서 DCI (4,5-디시아노이미다졸) (0.25 M)의 용액을 활성화제로 이용하여 실시된다. 최종 주기 동안, 원하는 변형을 갖는 포스포라미디트, 예를 들면, 접합체 기를 부착하기 위한 C6 링커 또는 접합체 기 자체가 이용될 수 있다. 포스포티오에이트 연쇄의 도입을 위한 티올화는 크산탄 하이드라이드 (아세토니트릴/피리딘 9:1에서 0.01 M)를 이용하여 수행된다. 포스포디에스테르 연쇄는 THF/피리딘/물 7:2:1에서 0.02 M의 요오드를 이용하여 도입될 수 있다. 나머지 시약은 올리고뉴클레오티드 합성에 전형적으로 이용되는 것들이다.
고체상 합성 후 접합을 위해, 상업적으로 이용가능한 C6 아미노링커 포스포라미디트가 고체상 합성의 마지막 주기에서 이용될 수 있고, 그리고 고체 지지체로부터 탈보호 및 개열 후, 아미노연결되고 탈보호된 올리고뉴클레오티드가 단리된다. 접합체는 표준 합성 방법을 이용한 기능기의 활성화를 통해 도입된다.
RP-HPLC에 의한 정제:
미가공 화합물은 Phenomenex Jupiter C18 10μ 150x10 mm 칼럼 상에서 예비 RP-HPLC에 의해 정제된다. 0.1 M의 아세트산암모늄 pH 8 및 아세토니트릴이 5 mL/분의 유속에서 완충제로서 이용된다. 수집된 분획물은 동결 건조되어 정제된 화합물이 전형적으로 백색 고체로서 제공된다.
약어:
DCI: 4,5-디시아노이미다졸
DCM: 디클로로메탄
DMF: 디메틸포름아미드
DMT: 4,4'-디메톡시트리틸
THF: 테트라히드로푸란
Bz: 벤조일
Ibu: 이소부티릴
RP-HPLC: 역상 고성능 액체 크로마토그래피
T m 검정:
올리고뉴클레오티드 및 RNA 표적 (인산염 결합됨, PO) 이중나선은 500 ml의 RNase-없는 물에서 3 mM로 희석되고 500 ml 2x Tm-완충액 (200 mM NaCl, 0.2 mM EDTA, 20 mM 나트륨 포스페이트, pH 7.0)과 혼합된다. 상기 용액을 3분 동안 95℃로 가열한 다음, 실온에서 30분 동안 어닐링 (annealing)한다. 이중나선 용융 온도 (Tm)는 PE Templab 소프트웨어 (Perkin Elmer)를 이용하여 Peltier 온도 프로그래머 PTP6이 장착된 Lambda 40 UV/VIS 분광광도계 상에서 계측된다. 온도를 20℃에서 95℃로 상승시킨 다음, 25℃로 낮춘 후 260 nm에서 흡광도를 기록한다. 용융 및 어닐링 둘 모두의 1차 도함수 및 국소 최대값을 이용하여 이중나선 Tm을 평가한다.
클론 성장 배지 (dHCGM). dHCGM은 100 U/ml 페니실린, 100 μg/ml 스트렙토마이신, 20 mM Hepes, 44 mM NaCO3, 15 μg/ml L-프롤린, 0.25 μg/ml 인슐린, 50 nM 덱사메타존, 5 ng/ml EGF, 0.1 mM Asc-2P, 2% DMSO 및 10% FBS를 내포하는 DMEM 배지이다 (Ishida et al., 2015). 세포는 5% CO2를 포함하는 가습된 대기에서 37℃ 인큐베이터에서 배양되었다. 배양 배지는 도말후 24 시에, 그리고 수확 때까지 2 일마다 교체되었다.
일차 인간 간세포 (PXB-PHH)
인간화 생쥐 (uPA/SCID 생쥐) - 본원에서 PHH로 불림 -로부터 수확된 신선한 일차 인간 간세포 (PXB-PHH)가 PhoenixBio Co., Ltd (Japan)로부터 획득되었다. 세포는 변형된 간세포 클론 성장 배지 (dHCGM)에서 하기의 세포 밀도: 35,000개 세포/웰 (384-웰), 70,000개 세포/웰 (96 웰), 또는 400,000개 세포/웰 (24-웰)로 콜라겐 I-코팅된 평판에 파종되었다. dHCGM은 100 U/ml 페니실린, 100 μg/ml 스트렙토마이신, 20 mM Hepes, 44 mM NaCO3, 15 μg/ml L-프롤린, 0.25 μg/ml 인슐린, 50 nM 덱사메타존, 5 ng/ml EGF, 0.1 mM Asc-2P, 2% DMSO 및 10% FBS를 내포하는 DMEM 배지이다 (Ishida et al., 2015). 세포는 5% CO2를 포함하는 가습된 대기에서 37℃ 인큐베이터에서 배양되었다. 배양 배지는 도말후 24 시에, 그리고 수확 때까지 2 일마다 교체되었다.
HBV 감염 및 올리고뉴클레오티드 처리
PHH는 24 시간 동안 4% PEG와 함께 40의 감염 다중도 (MOI)에서 HBV (CHB 개체로부터 정제됨)와 함께 배양되었다; 바이러스 접종물은 다음 날 제거되었다. cccDNA 확립을 허용하기 위해, PHH에서 화합물 처리가 HBV 감염후 3 일자에 시작되었다. 배지에 용해된 신선한 올리고뉴클레오티드가 2 일마다 보충되거나 (실시예 1), 또는 신선한 올리고뉴클레오티드가 3, 5, 7 및 9 일자에 보충되고, 그 후 세포가 19 일자에서 수확될 때까지 배지가 2 일마다 보충되었다 (실시예 2).
HBV 항원 계측
HBV 항원 발현과 분비에 대한 영향을 평가하기 위해, 상층액이 19 일자에 수집되었다. HBV 증식 파라미터, HBsAg 및 HBeAg 수준이 제조업체의 프로토콜에 따라서, CLIA ELISA 키트 (Autobio Diagnostic #CL0310-2, #CL0312-2)를 이용하여 계측되었다. 간단히 말하면, 웰마다 25μL의 상층액이 개별 항체 코팅된 마이크로역가 평판으로 이전되었고, 그리고 25 μL의 효소 접합체 시약이 첨가되었다. 웰이 자동 세정기를 이용하여 세척 완충액으로 5회 세척되기 전, 평판이 실온에서 셰이커에서 60 분 동안 배양되었다. 25 μL의 기질 A 및 B가 각 웰에 첨가되었다. Envision 발광 판독기 (Perkin Elmer)를 이용하여 발광이 계측되기 전, 평판이 실온에서 10 분 동안 셰이커에서 배양되었다.
CCK8 세포 독성 계측
올리고뉴클레오티드의 처리 시에 세포 독성의 영향을 평가하기 위해, 세포는 HBV 감염 및 올리고뉴클레오티드 처리에서 기술된 바와 같이 처리되었고, 그리고 18 일자에, PHH는 5% CO2를 포함하는 가습된 대기에서 37 ℃ 인큐베이터에서 24 시간 동안 전배양되었다. 10ul의 CCK-8 용액이 96 웰 평판의 각 웰에서 100ul까지 첨가되고 1-4 시간 동안 배양되었다. 마이크로평판 판독기 (Tecan)를 이용한 450nM에서 흡광도가 각 평판에 대해 계측되었고, 그리고 값이 대조 (처리되지 않은 세포)의 %로서 계산된다.
세포내 HBV pgRNA 및 RTEL1 RNA에 대한 실시간 PCR
제조업체의 프로토콜에 따라서, Qiagen BioRobot Universal System 및 RNeasy 96 웰 추출 평판 (RNeasy 96 BioRobot 8000 키트 (12)/ 카탈로그 번호/ID: 967152)을 이용하여, mRNA가 세포로부터 추출되었다. 상대적인 HBV 및 세포 mRNA 발현 수준이 ABI QuantStudio 12k Flex 상에서 실시간 PCR을 이용하여 분석되었다.
기술적으로 삼중으로 수행된 TaqMan Fast Advanced 마스터 믹스 (Life Technologies, 카탈로그 번호 4444558)를 이용한 qPCR에 의해, 베타-액틴 (ACT B) 및 HBV pgRNA가 정량되었다. 결과는 인간 ACT B 내인성 대조에 비하여 정규화되었다. 참조 유전자 ACT B 및 비-형질감염된 세포에 대해 정규화된 비교 주기 역치 2-△△Ct 방법을 이용하여 mRNA 발현이 분석되었다. ACTB RNA 및 HBV pgRNA 정량에 이용된 프라이머는 표 7에서 열거된다.
표 7: ACT B 및 HBV pgRNA qPCR 프라이머
Figure pct00040
HBV cccDNA 정량
DNA가 SDS 용해 완충액을 이용하여 HBV 감염된 일차 인간 간세포로부터 추출되고, 그리고 ZymoResearch 유전체 DNA 클린 & 농축기 키트 (ZymoResearch, 카탈로그 번호 D4067) 프로토콜을 이용하여 정제되었다. 20ul 총 용적에서 37 ℃에서 1 시간 동안, 500ng의 DNA에 대해 10U의 T5를 이용한 T5 엑소뉴클레아제 (New England Biolabs, MA, USA)로 절단 후, cccDNA 수준이 결정되었다. 절단 후, 표본이 50ul로 희석되었고, 이 중에서 4ul가 qPCR 반응에 이용되었다. 참조 유전자 미토콘드리아 DNA 및 비-형질감염된 세포에 대해 정규화된 비교 주기 역치 2-△△Ct 방법을 이용하여 mRNA 발현이 분석되었다. 정량적 실시간 중합효소 연쇄 반응 계측이 QuantStudio 12K Flex PCR 시스템 (Applied Biosystems)에서 수행되었다. qPCR이 Fast SYBR™ Green 마스터 믹스 (Life Technologies, 카탈로그 번호 4385612)로 수행되었다. 프라이머는 표 8에서 도시된다.
표 8: cccDNA qPCR 프라이머.
Figure pct00041
실시예 1: HBV 감염된 PHH에서 HBV 파라미터에 대한 RTEL1을 표적으로 하는 안티센스 올리고뉴클레오티드의 효과
하기 실험에서, HBV 파라미터, HBsAg, HBeAg, HBV pgRNA 및 cccDNA에 대한 RTEL1 녹다운의 효과가 표 6에서 올리고뉴클레오티드 화합물을 이용하여 검사되었다.
PHH가 재료와 방법 섹션에서 기술된 바와 같이 배양되었다. 이들 세포는 100 μl/웰의 최종 배양 용적으로 HBV 감염후 3 일자에 dHCGM 배지에서 용해된 10μM의 최종 올리고뉴클레오티드 농도로 투약되었다. 실험은 생물학적으로 삼중으로 수행되었고, 그리고 올리고뉴클레오티드를 2 일마다 보충하면서, 세포가 HBV 감염후 19 일자에 수확되었다. 재료와 방법에 따라서, 세포 독성이 CCK8을 이용하여 결정되었고, 상층액이 HBsAg 및 HBeAg를 계측하기 위해 수집되었고, 그리고 세포가 2가지 분획물; 한 가지 용해 완충액을 이용한 RTEL1 mRNA 및 pgRNA 계측을 위한 분획물 및 재료와 방법에서 기술된 바와 같은 다른 용해 완충액을 이용한 cccDNA 계측을 위한 분획물에서 수확되었다. 모든 값은 표 9에서 대조 (처리되지 않은 세포)의 %로서 도시된다, 다시 말하면, RTEL1 mRNA, cccDNA 및 pgRNA의 경우에 값이 더욱 작을수록 저해가 더욱 크다.
바이러스 파라미터에서 임의의 감소가 세포 사멸의 원인이 아니고, 값이 100%에 더욱 가까울수록 독성이 더욱 낮다는 것을 확증하기 위해, CCK8 세포 독성이 재료와 방법 섹션에서 기술된 바와 같이 계측되었다. 결과는 표 9에 도시된다.
표 9: 하류 산물의 RTEL1 매개된 cccDNA 분해와 저해
Figure pct00042
*RTEL1 및 HBV pgRNA는 하우스키핑 유전자에 대해 정규화된다.
RTEL1을 표적으로 하는 모든 검사된 안티센스 올리고뉴클레오티드는 파라미터 cccDNA, pgRNA, HBsAg 및 HBeAg 중에서 적어도 한 가지에 대항하여 계측의 단일 시점에서 표적 녹다운 및 HBV 항바이러스 효능을 전시하며, CCK8에 의해 어떤 관찰된 세포 독성도 계측되지 않는다.
실시예 2: 감염된 PHH에서 cccDNA에 대한 효과에 대해 검사된, RTEL1을 표적으로 하는 추가 올리고뉴클레오티드 라이브러리
하기 실험에서 표 6에서 CMP 식별 번호: 50_1 내지 237_1로서 도시된, RTEL1 전사체의 전역을 표적으로 하는 236개 올리고뉴클레오티드의 추가 라이브러리가 산출되었다. RTEL1뿐만 아니라 cccDNA를 감소시키는 능력이 검사되었다.
PHH가 재료와 방법 섹션에서 기술된 바와 같이 배양되었다. 이들 세포는 100 μl/웰의 최종 배양 용적으로 HBV 감염후 3. 5. 7 및 9 일자에 dHCGM 배지에서 용해된 10μM의 최종 올리고뉴클레오티드 농도로 투약되었다. 실험은 생물학적으로 삼중으로 수행되었고, 그리고 배지를 19 일자 때까지 2 일마다 보충하면서, 세포가 HBV 감염후 19 일자에 수확되었다.
재료와 방법에 따라서, 세포가 2가지 분획물; 한 가지 용해 완충액을 이용한 RTEL1 mRNA 계측을 위한 분획물 및 재료와 방법에서 기술된 바와 같은 다른 용해 완충액을 이용한 cccDNA 계측을 위한 분획물에서 수확되었다. 모든 값은 표 10에서 대조 (처리되지 않은 세포)의 %로서 도시된다, 다시 말하면, RTEL1 mRNA 및 cccDNA의 경우에 값이 더욱 작을수록 저해/감소가 더욱 크다.
표 10: 올리고뉴클레오티드 처리 이후에 RTEL1 감소 및 cccDNA 분해
Figure pct00043
Figure pct00044
Figure pct00045
Figure pct00046
Figure pct00047
바이러스 파라미터에서 감소가 세포 사멸에 의해 유발될 수 있고, 값이 100%에 더욱 가까울수록 독성이 더욱 낮은 지를 사정하기 위해, CCK8 세포 독성이 재료와 방법 섹션에서 기술된 바와 같이 계측되었다. 결과는 표 11에서 도시된다. 대조의 80 %를 초과하는 CCK8 값의 경우에는 세포 사멸이 표 10에서 도시된 RTEL1과 cccDNA 감소에 영향을 줄 공산이 있는 것으로 고려되지 않는다.
표 11: CCK8 세포 독성
Figure pct00048
Figure pct00049
Figure pct00050
#NA (해당값 없음)는 CCK8가 지시된 화합물에 대해 계측되지 않았다는 것을 의미한다.
이들 결과는 라이브러리 내에 236개의 올리고뉴클레오티드 중 단지 5 %만 RTEL1 또는 cccDNA 중에서 적어도 어느 한 가지를 대조의 적어도 80%까지 감소시킬 수 없었다는 것을 증명한다. 이것으로부터, RTEL1 및/또는 cccDNA를 감소시킬 수 있는, 전체 RTEL1 전사체의 전역을 표적으로 하는 올리고뉴클레오티드를 생산하는 것이 가능하며, 비록 소수의 화합물의 경우에는 RTEL1 및 cccDNA에서 감소가 세포 사멸에 기인할 수 있지만, 일반적으로는 세포 사멸에 기인하지 않는 것으로 보여질 수 있다.
SEQUENCE LISTING <110> F. Hoffmann-La Roche AG <120> OLIGONUCLEOTIDES FOR MODULATING RTEL1 EXPRESSION <130> P34869-WO <160> 246 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 38444 <212> DNA <213> hsapiens <400> 1 agtcagccct gctgccagcc agtgccgggt gctggggact cagggaggcc cgccgggacc 60 actgcgggac agtgagccga gcagaagctg gaacgcagga gaggaaggag agggggcggt 120 cagggctctc aggagccggg tcctgggcaa ggcgcagccg ttttcaaatt ttcaggaaag 180 cggtcggctc acactcgagc agtaaaaaga tgcctctggg gaggaggccc gtgcagctct 240 ccgggcaatg gtggtggctc ggcctagaga ggcggtagtg gaacgcagac cctggtgggg 300 gaatgacatc aagggaggag acgggcggga ccccagattt ctgcctgtgg gcgatggaag 360 tgaggttcac tggccagcgg agccggacac agaacgcgca aaacgccgtg taggcctgga 420 ggagccgaag agcaggcgga ccccctccgc gggggaacag tttccgccgg gagcacaaag 480 caacggaccg gaagtggggg gcggaagtgc agtgggctca gcgccgactg cgcgcctctg 540 cccgcgaaaa ctctgagctg gctgacagct ggggacgggt ggcggccctc gactggagtc 600 ggttgagttc ctgagggacc ccggttctgg aaggttcgcc gcggagacaa gtgagcagtg 660 agtcgcagtg accctacaag tggttctttt acccgagcgg 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nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn 36000 nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn 36060 nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn 36120 nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn 36180 nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn 36240 nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn 36300 nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnggg 36360 ggcaggggca gggtggggac cgtgccgggt ctgagtgaag ctccccgcag ggttcagcat 36420 gtttgtgcgt ccacaccaca agcagcgctt ctcacagacg tgcacagacc tgaccggcag 36480 accctccctg ggcacggagc caccaggacc ccaggaggag agtcttgccg tgcctcctgt 36540 gctcacccac agggctcccc aaccaggtag ggcgcctgcc tggctgctcc tgacagtgcc 36600 ccaaccgcac gcagccctgg gagtgagcag caaagcccca ggccctgctc agactcagtc 36660 tccgtctcca ggcccctcac ggtccgagaa gcccggaaag acccagagcg agatctcgac 36720 cttccttaga cagaggccag cagggactgt gggggcgggc ggtgaggctg cagggcccag 36780 ccagtcccca ggacctcccc 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<223> Synthetic oligonucleotide <400> 173 gactcgaaga cgcc 14 <210> 174 <211> 17 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic oligonucleotide <400> 174 ggcacaagca gaacgac 17 <210> 175 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic oligonucleotide <400> 175 agtcagaaca aaggaggc 18 <210> 176 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic oligonucleotide <400> 176 gaagtcagaa caaaggag 18 <210> 177 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic oligonucleotide <400> 177 gcagaagtca gaacaaagg 19 <210> 178 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic oligonucleotide <400> 178 gtgcagaagt cagaacaaa 19 <210> 179 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic oligonucleotide <400> 179 gtgcagaagt cagaacaa 18 <210> 180 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic oligonucleotide <400> 180 aaggatgagg gagcggac 18 <210> 181 <211> 16 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic oligonucleotide <400> 181 gtaaggatga gggagc 16 <210> 182 <211> 17 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic oligonucleotide <400> 182 tggtaaggat gagggag 17 <210> 183 <211> 16 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic oligonucleotide <400> 183 cgtacatctg catctc 16 <210> 184 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic oligonucleotide <400> 184 tgtaagataa gaggcaacac t 21 <210> 185 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic oligonucleotide <400> 185 ttgtaagata agaggcaaca c 21 <210> 186 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic oligonucleotide <400> 186 ttgtaagata agaggcaaca 20 <210> 187 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic oligonucleotide <400> 187 tttgtaagat aagaggcaac a 21 <210> 188 <211> 17 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic oligonucleotide <400> 188 tgtaagataa gaggcaa 17 <210> 189 <211> 17 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic oligonucleotide <400> 189 ctggaaggaa agttggt 17 <210> 190 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic oligonucleotide <400> 190 atagtaagca ctgatggtc 19 <210> 191 <211> 16 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic oligonucleotide <400> 191 tagtaagcac tgatgg 16 <210> 192 <211> 17 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic oligonucleotide <400> 192 catagtaagc actgatg 17 <210> 193 <211> 16 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic oligonucleotide <400> 193 ctgtaactca cctggc 16 <210> 194 <211> 15 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic oligonucleotide <400> 194 cggatcactc gcccg 15 <210> 195 <211> 17 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic oligonucleotide <400> 195 acacaggcta ctctcgg 17 <210> 196 <211> 16 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic oligonucleotide <400> 196 acacaggcta ctctcg 16 <210> 197 <211> 17 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic oligonucleotide <400> 197 ccacacacag gctactc 17 <210> 198 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic oligonucleotide <400> 198 atactccaca cacaggct 18 <210> 199 <211> 17 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic oligonucleotide <400> 199 atactccaca cacaggc 17 <210> 200 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic oligonucleotide <400> 200 gctcatactc cacacacag 19 <210> 201 <211> 17 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic oligonucleotide <400> 201 tcatactcca cacacag 17 <210> 202 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic oligonucleotide <400> 202 gctcatactc cacacaca 18 <210> 203 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic oligonucleotide <400> 203 tgctcatact ccacacac 18 <210> 204 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic oligonucleotide <400> 204 agcaggaagc agggagaaa 19 <210> 205 <211> 15 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic oligonucleotide <400> 205 tccgaccaca gcgag 15 <210> 206 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic oligonucleotide <400> 206 cagaagccaa gggacatg 18 <210> 207 <211> 17 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic oligonucleotide <400> 207 cagaagccaa gggacat 17 <210> 208 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic oligonucleotide <400> 208 ccagaccaac acggaaacg 19 <210> 209 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic oligonucleotide <400> 209 ccagaccaac acggaaac 18 <210> 210 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic oligonucleotide <400> 210 gaatgggcaa agggtaga 18 <210> 211 <211> 17 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic oligonucleotide <400> 211 aatgggcaaa gggtaga 17 <210> 212 <211> 17 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic oligonucleotide <400> 212 gaatgggcaa agggtag 17 <210> 213 <211> 17 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic oligonucleotide <400> 213 gaacccttgt agtcctg 17 <210> 214 <211> 15 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic oligonucleotide <400> 214 aacccttgta gtcct 15 <210> 215 <211> 15 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic oligonucleotide <400> 215 ggaacccttg tagtc 15 <210> 216 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic oligonucleotide <400> 216 atcggaaccc ttgtagtc 18 <210> 217 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic oligonucleotide <400> 217 catcggaacc cttgtagtc 19 <210> 218 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic oligonucleotide <400> 218 catcggaacc cttgtagt 18 <210> 219 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic oligonucleotide <400> 219 gatacagacc tcctcaaact 20 <210> 220 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic oligonucleotide <400> 220 gatacagacc tcctcaaac 19 <210> 221 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic oligonucleotide <400> 221 gatacagacc tcctcaaa 18 <210> 222 <211> 17 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic oligonucleotide <400> 222 gatacagacc tcctcaa 17 <210> 223 <211> 16 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic oligonucleotide <400> 223 gccccattta ccagtg 16 <210> 224 <211> 16 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic oligonucleotide <400> 224 cccaacaagt gatgct 16 <210> 225 <211> 15 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic oligonucleotide <400> 225 cccaacaagt gatgc 15 <210> 226 <211> 17 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic oligonucleotide <400> 226 gtaccaagcc cagaagg 17 <210> 227 <211> 16 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic oligonucleotide <400> 227 gtaccaagcc cagaag 16 <210> 228 <211> 17 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic oligonucleotide <400> 228 ttcctgatga agagatg 17 <210> 229 <211> 16 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic oligonucleotide <400> 229 tcctgatgaa gagatg 16 <210> 230 <211> 15 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic oligonucleotide <400> 230 tgggagtagc atggc 15 <210> 231 <211> 17 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic oligonucleotide <400> 231 tgtgggagta gcatggc 17 <210> 232 <211> 16 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic oligonucleotide <400> 232 gtgggagtag catggc 16 <210> 233 <211> 17 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic oligonucleotide <400> 233 aaacatgctg aaccctg 17 <210> 234 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic oligonucleotide <400> 234 acaaacatgc tgaaccct 18 <210> 235 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic oligonucleotide <400> 235 cacaaacatg ctgaaccc 18 <210> 236 <211> 17 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic oligonucleotide <400> 236 cacaaacatg ctgaacc 17 <210> 237 <211> 17 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic oligonucleotide <400> 237 tggacgcaca aacatgc 17 <210> 238 <211> 21 <212> DNA <213> artificial <220> <223> Primer <400> 238 ggagtgtgga ttcgcactcc t 21 <210> 239 <211> 20 <212> DNA <213> artificial <220> <223> Primer <400> 239 agattgagat cttctgcgac 20 <210> 240 <211> 27 <212> DNA <213> artificial <220> <223> probe <400> 240 aggcaggtcc cctagaagaa gaactcc 27 <210> 241 <211> 21 <212> DNA <213> artificial <220> <223> primer <400> 241 ccatcctgga cattgaggac t 21 <210> 242 <211> 21 <212> DNA <213> artificial <220> <223> primer <400> 242 caggttccgg gacaggtagt a 21 <210> 243 <211> 21 <212> DNA <213> artificial <220> <223> primer <400> 243 cgtctgtgcc ttctcatctg c 21 <210> 244 <211> 20 <212> DNA <213> artificial <220> <223> primer <400> 244 gcacagcttg gaggcttgaa 20 <210> 245 <211> 20 <212> DNA <213> artificial <220> <223> primer <400> 245 ccgtctgaac tatcctgccc 20 <210> 246 <211> 20 <212> DNA <213> artificial <220> <223> primer <400> 246 gccgtagtcg gtgtactcgt 20

Claims (31)

  1. B형 간염 바이러스 (HBV) 감염의 치료 및/또는 예방에서 이용을 위한 RTEL1 저해제.
  2. 청구항 제 1항에 있어서, HBV 감염은 만성 감염인, RTEL1 저해제.
  3. 청구항 제 1항 또는 제 2항에 있어서, RTEL1 저해제는 감염된 세포에서 cccDNA를 감소시킬 수 있는, RTEL1 저해제.
  4. 청구항 제 1항 내지 제 3항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 저해제는 포유류 RTEL1 표적 핵산, 특히 인간 RTEL1 핵산에 적어도 95% 상보적인, 길이에서 적어도 10개 뉴클레오티드의 연속 뉴클레오티드 서열을 포함하는, 길이에서 12 내지 60개 뉴클레오티드의 올리고뉴클레오티드이고, 그리고 RTEL1 mRNA를 감소시킬 수 있는, RTEL1 저해제.
  5. 청구항 제 1항 내지 제 4항 중 어느 한 항에 있어서, 단일 가닥 안티센스 올리고뉴클레오티드, siRNA 또는 shRNA 분자에서 선택되는, RTEL 1 저해제.
  6. 청구항 제 1항 내지 제 5항 중 어느 한 항에 있어서, 포유류 RTEL1 표적 핵산은 서열 번호: 1 또는 2에서 선택되는, RTEL 1 저해제.
  7. 청구항 제 4항 내지 제 6항 중 어느 한 항에 있어서, 연속 뉴클레오티드 서열은 서열 번호: 1 및 서열 번호: 2의 표적 핵산에 적어도 98% 상보적인, RTEL 1 저해제.
  8. 청구항 제 3항 내지 제 7항 중 어느 한 항에 있어서, HBV 감염된 세포에서 cccDNA는 대조와 비교할 때 적어도 60% 감소되는, RTEL 1 저해제.
  9. 청구항 제 4항 내지 제 7항 중 어느 한 항에 있어서, RTEL1 mRNA는 대조와 비교할 때 적어도 60% 감소되는, RTEL 1 저해제.
  10. 포유류 RTEL1, 특히 인간 RTEL1에 상보적인 적어도 10개 뉴클레오티드의 연속 뉴클레오티드 서열을 포함하는 길이에서 12-30개 뉴클레오티드의 단일 가닥 안티센스 올리고뉴클레오티드에 있어서, 상기 올리고뉴클레오티드는 RTEL1의 발현을 저해할 수 있는, 단일 가닥 안티센스 올리고뉴클레오티드.
  11. 청구항 제 10항에 있어서, 연속 뉴클레오티드 서열은 서열 번호: 1에 적어도 90% 상보적인, 예컨대 완전히 상보적인, 안티센스 올리고뉴클레오티드.
  12. 청구항 제 10항 또는 제 11항에 있어서, 길이에서 12 내지 25개, 특히 15 내지 21개의 뉴클레오티드의 연속 뉴클레오티드 서열을 포함하는, 안티센스 올리고뉴클레오티드.
  13. 청구항 제 11항 내지 제 12항 중 어느 한 항에 있어서, 연속 뉴클레오티드 서열은 서열 번호: 3-21에서 선택되는 표적 서열에 100% 상보적인, 올리고뉴클레오티드.
  14. 청구항 제 10항 내지 제 13항 중 어느 한 항에 있어서, 올리고뉴클레오티드는 서열 번호: 22-237로 구성된 군에서 선택되는 서열을 포함하는, 올리고뉴클레오티드.
  15. 청구항 제 10항 내지 제 14항 중 어느 한 항에 있어서, 하나 또는 그 이상의 2' 당 변형된 뉴클레오시드를 포함하는, 안티센스 올리고뉴클레오티드.
  16. 청구항 제 15항에 있어서, 하나 또는 그 이상의 2' 당 변형된 뉴클레오시드는 2'-O-알킬-RNA, 2'-O-메틸-RNA, 2'-알콕시-RNA, 2'-O-메톡시에틸-RNA, 2'-아미노-DNA, 2'-플루오로-DNA, 아라비노 핵산 (ANA), 2'-플루오로-ANA 및 LNA 뉴클레오시드로 구성된 군에서 독립적으로 선택되는, 안티센스 올리고뉴클레오티드.
  17. 청구항 제 15항 내지 제 16항 중 어느 한 항에 있어서, 하나 또는 그 이상의 2' 당 변형된 뉴클레오시드는 LNA 뉴클레오시드인, 안티센스 올리고뉴클레오티드.
  18. 청구항 제 10항 내지 제 17항 중 어느 한 항에 있어서, 올리고뉴클레오티드는 적어도 하나의 포스포로티오에이트 뉴클레오시드간 연쇄를 포함하는, 안티센스 올리고뉴클레오티드.
  19. 청구항 제 18항에 있어서, 연속 뉴클레오티드 서열 내에 모든 뉴클레오시드간 연쇄는 포스포로티오에이트 뉴클레오시드간 연쇄인, 안티센스 올리고뉴클레오티드.
  20. 청구항 제 10항 내지 제 19항 중 어느 한 항에 있어서, 올리고뉴클레오티드는 RNase H를 모집할 수 있는, 안티센스 올리고뉴클레오티드.
  21. 청구항 제 10항 내지 제 20항 중 어느 한 항에 있어서, 안티센스 올리고뉴클레오티드 또는 이의 연속 뉴클레오티드 서열은 화학식 5'-F-G-F'-3'의 갭머로 구성되거나 또는 이를 포함하고, 여기서 영역 F 및 F'는 1 - 4개의 2' 당 변형된 뉴클레오시드를 독립적으로 포함하고, 그리고 G는 RNaseH를 모집할 수 있는 6 내지 16개 뉴클레오시드의 영역, 예컨대 6 내지 18개 DNA 뉴클레오시드를 포함하는 영역인, 안티센스 올리고뉴클레오티드.
  22. 청구항 제 10항 내지 제 21항 중 어느 한 항에 따른 올리고뉴클레오티드 및 상기 올리고뉴클레오티드에 공유 부착된 적어도 하나의 접합 모이어티를 포함하는 접합체.
  23. 청구항 제 22항에 있어서, 접합 모이어티는 도 1에서 삼가 GalNAc 모이어티 중 한 가지에서 선택되는, 접합 화합물.
  24. 청구항 제 22항 또는 제 23항에 있어서, 적어도 2개의 연속 포스포디에스테르 연쇄를 포함하는 2 내지 5개의 연결된 뉴클레오시드로 구성되는 생리학적으로 불안정 링커를 포함하고, 여기서 상기 생리학적으로 불안정 링커는 올리고뉴클레오티드 성분의 5' 또는 3' 단부에서 공유 결합된, 접합 화합물.
  25. 청구항 제 10항 내지 제 21항 중 어느 한 항에 따른 올리고뉴클레오티드의 제약학적으로 허용되는 염, 또는 청구항 제 22항 내지 제 24항에 따른 접합체의 제약학적으로 허용되는 염.
  26. 청구항 제 10항 내지 제 21항 중 어느 한 항에 따른 올리고뉴클레오티드, 또는 청구항 제 22항 내지 제 24항에 따른 접합체, 또는 청구항 제 25항에 따른 제약학적으로 허용되는 염, 그리고 제약학적으로 허용되는 부형제를 포함하는 제약학적 조성물.
  27. RTEL1을 발현하는 표적 세포에서 RTEL1 발현을 조절하기 위한 생체내 또는 시험관내 방법에 있어서, 상기 방법은 청구항 제 10항 내지 제 21항 중 어느 한 항에 따른 올리고뉴클레오티드, 또는 청구항 제 22항 내지 제 24항에 따른 접합체, 청구항 제 25항에 따른 제약학적으로 허용되는 염, 또는 청구항 제 26항에 따른 제약학적 조성물을 효과량으로 상기 세포에 투여하는 단계를 포함하는, 생체내 또는 시험관내 방법.
  28. 질환을 치료하거나 예방하기 위한 방법에 있어서, 청구항 제 10항 내지 제 21항 중 어느 한 항에 따른 올리고뉴클레오티드, 또는 청구항 제 22항 내지 제 24항에 따른 접합체, 청구항 제 25항에 따른 제약학적으로 허용되는 염, 또는 청구항 제 26항에 따른 제약학적 조성물의 치료 또는 예방 효과량을, 상기 질환을 앓거나 또는 상기 질환에 취약한 개체에게 투여하는 단계를 포함하는, 방법.
  29. 청구항 제 28항에 있어서, 질환은 B형 간염 바이러스 (HBV)인, 방법.
  30. 의약에서 이용을 위한, 청구항 제 10항 내지 제 21항 중 어느 한 항에 따른 안티센스 올리고뉴클레오티드, 또는 청구항 제 22항 내지 제 24항에 따른 접합체, 청구항 제 25항에 따른 제약학적으로 허용되는 염, 또는 청구항 제 26항에 따른 제약학적 조성물.
  31. B형 간염 바이러스 HBV의 치료 또는 예방을 위한 약제의 제조를 위한, 청구항 제 10항 내지 제 21항 중 어느 한 항에 따른 올리고뉴클레오티드, 또는 청구항 제 22항 내지 제 24항에 따른 접합체, 청구항 제 25항에 따른 제약학적으로 허용되는 염, 또는 청구항 제 26항에 따른 제약학적 조성물의 용도.
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Families Citing this family (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
TW202246500A (zh) * 2021-02-02 2022-12-01 瑞士商赫孚孟拉羅股份公司 用於抑制 ｒｔｅｌ１ 表現之增強型寡核苷酸
WO2023111210A1 (en) 2021-12-17 2023-06-22 F. Hoffmann-La Roche Ag Combination of oligonucleotides for modulating rtel1 and fubp1

Family Cites Families (45)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP0724447B1 (en) 1991-10-24 2003-05-07 Isis Pharmaceuticals, Inc. Derivatized oligonucleotides having improved uptake
JP3756313B2 (ja) 1997-03-07 2006-03-15 武 今西 新規ビシクロヌクレオシド及びオリゴヌクレオチド類縁体
AU9063398A (en) 1997-09-12 1999-04-05 Exiqon A/S Oligonucleotide analogues
NZ513402A (en) 1999-02-12 2003-06-30 Sankyo Co Novel nucleosides and oligonucleotide analogues
CN102180924A (zh) 1999-05-04 2011-09-14 桑塔里斯制药公司 L-核糖-lna类似物
US6617442B1 (en) 1999-09-30 2003-09-09 Isis Pharmaceuticals, Inc. Human Rnase H1 and oligonucleotide compositions thereof
US7393950B2 (en) * 2002-08-29 2008-07-01 Hong Kong University Of Science & Technology Antisense oligonucleotides targeted to human CDC45
ES2607471T3 (es) 2002-11-18 2017-03-31 Roche Innovation Center Copenhagen A/S Diseño antisentido
WO2004083430A2 (en) 2003-03-21 2004-09-30 Santaris Pharma A/S SHORT INTERFERING RNA (siRNA) ANALOGUES
US8350021B2 (en) 2003-06-12 2013-01-08 Alnylam Pharmaceuticals, Inc. Conserved HBV and HCV sequences useful for gene silencing
EP1915181A4 (en) 2005-08-10 2009-07-15 Merck & Co Inc NEW HIV TARGETS
WO2007031091A2 (en) 2005-09-15 2007-03-22 Santaris Pharma A/S Rna antagonist compounds for the modulation of p21 ras expression
ES2516815T3 (es) 2006-01-27 2014-10-31 Isis Pharmaceuticals, Inc. Análogos de ácidos nucleicos bicíclicos modificados en la posición 6
DK1984382T3 (da) 2006-01-27 2012-09-03 Santaris Pharma As LNA modificerede fosforthiolerede oligonukleotider
DK2002004T3 (en) 2006-03-23 2015-11-30 Roche Innovation Ct Copenhagen As LITTLE INTERNAL SEGMENTED INTERFERENCE RNA
US7666854B2 (en) 2006-05-11 2010-02-23 Isis Pharmaceuticals, Inc. Bis-modified bicyclic nucleic acid analogs
AU2007249349B2 (en) 2006-05-11 2012-03-08 Isis Pharmaceuticals, Inc. 5'-Modified bicyclic nucleic acid analogs
AU2008260277C1 (en) 2007-05-30 2014-04-17 Isis Pharmaceuticals, Inc. N-substituted-aminomethylene bridged bicyclic nucleic acid analogs
EP2173760B2 (en) 2007-06-08 2015-11-04 Isis Pharmaceuticals, Inc. Carbocyclic bicyclic nucleic acid analogs
CN101796062B (zh) 2007-07-05 2014-07-30 Isis制药公司 6-双取代双环核酸类似物
US8546556B2 (en) 2007-11-21 2013-10-01 Isis Pharmaceuticals, Inc Carbocyclic alpha-L-bicyclic nucleic acid analogs
EP2356129B1 (en) 2008-09-24 2013-04-03 Isis Pharmaceuticals, Inc. Substituted alpha-l-bicyclic nucleosides
WO2010080129A2 (en) 2008-12-18 2010-07-15 Dicerna Pharmaceuticals, Inc. Extended dicer substrate agents and methods for the specific inhibition of gene expression
WO2010093788A2 (en) 2009-02-11 2010-08-19 Dicerna Pharmaceuticals, Inc. Multiplex dicer substrate rna interference molecules having joining sequences
US9012421B2 (en) 2009-08-06 2015-04-21 Isis Pharmaceuticals, Inc. Bicyclic cyclohexose nucleic acid analogs
EP2580228B1 (en) 2010-06-08 2016-03-23 Ionis Pharmaceuticals, Inc. Substituted 2'-amino and 2'-thio-bicyclic nucleosides and oligomeric compounds prepared therefrom
CA2807307C (en) 2010-08-17 2021-02-09 Merck Sharp & Dohme Corp. Rna interference mediated inhibition of hepatitis b virus (hbv) gene expression using short interfering nucleic acid (sina)
CN103370415B (zh) 2010-10-28 2017-05-31 本尼特生物制药有限公司 Hbv治疗
EP3505528B1 (en) 2011-04-21 2020-11-25 Ionis Pharmaceuticals, Inc. Modulation of hepatitis b virus (hbv) expression
US8809293B2 (en) 2011-06-30 2014-08-19 Arrowhead Madison Inc. Compositions and methods for inhibiting gene expression of hepatitis B virus
WO2013022966A1 (en) 2011-08-11 2013-02-14 Isis Pharmaceuticals, Inc. Linkage modified gapped oligomeric compounds and uses thereof
WO2013033230A1 (en) 2011-08-29 2013-03-07 Isis Pharmaceuticals, Inc. Oligomer-conjugate complexes and their use
WO2013154798A1 (en) 2012-04-09 2013-10-17 Isis Pharmaceuticals, Inc. Tricyclic nucleic acid analogs
WO2013159109A1 (en) 2012-04-20 2013-10-24 Isis Pharmaceuticals, Inc. Modulation of hepatitis b virus (hbv) expression
MX363068B (es) 2012-11-15 2019-03-07 Roche Innovation Ct Copenhagen As Conjugados de oligonucleotido.
PL2992009T3 (pl) 2013-05-01 2020-11-30 Ionis Pharmaceuticals, Inc. Kompozycje i sposoby modulowania ekspresji apolipoproteiny(a)
WO2014205105A1 (en) * 2013-06-19 2014-12-24 The Regents Of The University Of California Biomarkers of response to inhibition of poly-adp ribose polymerase (parp) in cancer
PE20160158A1 (es) 2013-06-27 2016-03-18 Roche Innovation Ct Copenhagen As Oligomeros antisentido y conjugados con diana en pcsk9
CA2935426C (en) 2014-01-30 2023-07-25 F. Hoffmann-La Roche Ag Polyoligomer compound with biocleavable conjugates for reducing or inhibiting expression of a nucleic acid target
GB201408623D0 (en) 2014-05-15 2014-07-02 Santaris Pharma As Oligomers and oligomer conjugates
SG11201702877TA (en) 2014-10-10 2017-05-30 Hoffmann La Roche Galnac phosphoramidites, nucleic acid conjugates thereof and their use
EP3325097B1 (en) 2015-07-17 2021-09-01 Arcturus Therapeutics, Inc. Compositions and agents against hepatitis b virus and uses thereof
CN115957337A (zh) 2015-08-07 2023-04-14 箭头药业股份有限公司 乙型肝炎病毒感染的RNAi疗法
MA45496A (fr) 2016-06-17 2019-04-24 Hoffmann La Roche Molécules d'acide nucléique pour la réduction de l'arnm de padd5 ou pad7 pour le traitement d'une infection par l'hépatite b
US11504391B1 (en) 2016-11-23 2022-11-22 Alnylam Pharmaceuticals, Inc. Modified RNA agents with reduced off-target effect

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