BR112021000538A2

BR112021000538A2 - Oligonucleotídeos para modular a expressão de rtel1

Info

Publication number: BR112021000538A2
Application number: BR112021000538-2A
Authority: BR
Inventors: Marco Berrera; Daniel Jeremy Turley; Angelina Wallier; Jitao David Zhang; Josephine Felber; Jean-Christophe Hoflack; Susanne Kammler; Tony Kam-Thong; Brian Leonard; Lykke Pedersen; Philipp Tropberger; Miriam Triyatni
Original assignee: F. Hoffmann-La Roche Ag
Priority date: 2018-07-13
Filing date: 2019-07-11
Publication date: 2021-04-06
Also published as: TW202020152A; JP2021524277A; CR20210015A; MX2021000404A; AU2019300324A1; TWI791868B; EP3821013A1; KR20210033004A; CA3106288A1; IL279929A; SG11202100348SA; US20210147850A1; CL2021000018A1; WO2020011902A1; PE20211306A1; CN112534055A

Abstract

a presente invenção refere-se a um inibidor de rtel1 para uso no tratamento de uma infecção por hbv, em particular uma infecção crônica por hbv. a invenção, em particular, refere-se ao uso de inibidores de rtel1 para desestabilizar o cccdna, tal como o cccdna de hbv. a invenção também se refere a oligonucleotídeos antissenso e que são complementares a rtel1 e capazes de reduzir um mrna de rtel1. também está incluída na presente invenção uma composição farmacêutica e seu uso no tratamento e/ou prevenção de uma infecção por hbv.

Description

“OLIGONUCLEOTÍDEOS PARA MODULAR A EXPRESSÃO DE RTEL1”

CAMPO DA INVENÇÃO

[0001] A presente invenção refere-se a inibidores de RTEL1, tais como oligonucleotídeos (oligômeros) que são complementares a RTEL1, levando à modulação da expressão de RTEL1 ou modulação da atividade de RTEL1. A invenção, em particular, refere-se ao uso de moléculas de ácido nucleico direcionadas a RTEL1 para uso no tratamento e/ou prevenção de uma infecção pelo vírus da hepatite B (HBV), em particular uma infecção crônica por HBV. A invenção, em particular, refere-se ao uso de inibidores de RTEL1 para desestabilizar o cccDNA, tal como o cccDNA de HBV. Também está incluída na presente invenção uma composição farmacêutica e seu uso no tratamento e/ou prevenção de uma infecção por HBV.

ANTECEDENTES

[0002] A hepatite B é uma doença infecciosa causada pelo vírus da hepatite B (HBV), um pequeno vírus hepatotrópico que se replica por meio da transcrição reversa. A infecção crônica por HBV é um fator chave para doenças hepáticas graves, como cirrose hepática e carcinoma hepatocelular. Os tratamentos atuais para infecção HBV crônica são baseados na administração de interferons peguilados tipo 1 ou análogos de nucleos(t)ídeo, como lamivudina, adefovir, entecavir, tenofovir disoproxil e tenofovir alafenamida, que têm como alvo a polimerase viral, uma transcriptase reversa multifuncional. O sucesso do tratamento é geralmente medido como perda do antígeno de superfície da hepatite B (HBsAg). No entanto, uma eliminação completa de HBsAg raramente é alcançada, pois o

DNA do vírus da hepatite B persiste no corpo após a infecção. A persistência do HBV é mediada por uma forma epissomal do genoma do HBV que é mantida de forma estável no núcleo. Esta forma epissomal é chamada de “DNA circular covalentemente fechado” (cccDNA). O cccDNA serve como um modelo para todos os transcritos de HBV, incluindo RNA pré- genômico (pgRNA), um intermediário replicativo viral. A presença de algumas cópias do cccDNA pode ser suficiente para reiniciar uma infecção completa por HBV. Os tratamentos atuais para o HBV não têm como alvo o cccDNA. A cura da infecção crônica por HBV, entretanto, exigiria a eliminação do cccDNA (revisado por Nassal, Gut. Dezembro 2015; 64 (12): 1972-84. doi: 10,1136-2015-309809).

[0003] Regulador de elongação de telômero helicase 1 (RTEL1) codifica uma helicase de DNA que atua na estabilidade, proteção e alongamento de telômeros e interage com proteínas no complexo shelterin conhecido por proteger telômeros durante a replicação de DNA. Mutações neste gene foram associadas a disqueratose congênita e síndrome de Hoyerall-Hreidarsson (vide, por exemplo, a revisão de Vannier et al 2014 Trends Cell Biol. Vol 24, p.416).

[0004] Localizado no núcleo, o RTEL1 funciona como uma DNA helicase dependente de ATP, implicada na regulação do comprimento dos telômeros, reparo do DNA e manutenção da estabilidade genômica. RTEL1 atua como um anti-recombinase para neutralizar a recombinação tóxica e limitar o cruzamento durante a meiose e regula a recombinação meiótica e a homeostase do cruzamento por dissociação física dos eventos de invasão da fita e, assim,

promove o reparo não cruzado por recozimento da fita dependente da síntese meiótica (SDSA), bem como a desmontagem de intermediários de recombinação de alça D. Em adicional, RTEL1 desmonta alças T e evita a fragilidade do telômero, neutralizando as estruturas teloméricas G4-DNA que, juntas, garantem a dinâmica e estabilidade do telômero.

[0005] RTEL1 foi identificado em uma triagem de siRNA como um estabilizador de epissomas de HPV: (Edwards et al 2013 PLoS One Vol 8, e75406). O siRNA direcionado a RTEL1 também foi usado para identificar interagentes com RTEL1 na síndrome de Hoyeraal-Hreidarsson (Schertzer et al 2015 Nucleic Acid Res Vol 43 p. 1834). Além disso, o RTEL1 foi identificado como um fator de dependência do hospedeiro HIV a partir de uma triagem de siRNA para proteínas essenciais do hospedeiro para fornecer alvos para a inibição da infecção por HIV (WO 2007/094818).

[0006] Até onde sabemos, o RTEL1 nunca foi identificado como um fator de dependência do cccDNA no contexto da estabilidade e manutenção do cccDNA, nem as moléculas que inibem o RTEL1 foram sugeridas como desestabilizantes do cccDNA para o tratamento da infecção por HBV.

OBJETIVO DA INVENÇÃO

[0007] A presente invenção mostra que existe uma correlação entre a inibição de RTEL1 e a redução de cccDNA em uma célula infectada por HBV, o que é relevante no tratamento de indivíduos infectados por HBV. Um objetivo da presente invenção é identificar inibidores RTEL1 que reduzem o cccDNA em uma célula infectada com HBV. Esses inibidores de RTEL1 podem ser usados no tratamento da infecção por HBV.

[0008] A presente invenção identifica ainda novas moléculas de ácido nucleico, que são capazes de inibir a expressão de RTEL1 in vitro e in vivo.

DESCRIÇÃO RESUMIDA DA INVENÇÃO

[0009] A presente invenção refere-se a oligonucleotídeos que tem por alvo um ácido nucleico capaz de modular a expressão de RTEL1 e para tratar ou prevenir doenças relacionadas ao funcionamento da RTEL1.

[00010] Consequentemente, em um primeiro aspecto, a invenção fornece um inibidor de RTEL1 para uso no tratamento e/ou prevenção da infecção pelo vírus da Hepatite B (HBV). Em particular, um inibidor de RTEL1 capaz de reduzir cccDNA e/ou RNA pré-genômico (pgRNA) é útil. Tal inibidor é vantajosamente selecionado a partir de uma molécula de ácido nucleico de 12 a 60 nucleotídeos de comprimento, que é capaz de reduzir o mRNA de RTEL1, tal como um oligonucleotídeo antissenso de fita simples, um siRNA ou um shRNA complementar ao RTEL1 de mamífero

[00011] Em um outro aspecto, a invenção refere- se a um oligonucleotídeo de 12 a 60 nucleotídeos, tal como 12 a 30 nucleotídeos, compreendendo uma sequência de nucleotídeos contígua de pelo menos 10 nucleotídeos, em particular de 16 a 20 nucleotídeos, que é complementar a um RTEL1 de mamífero. Esse oligonucleotídeo é capaz de inibir a expressão de RTEL1. O oligonucleotídeo pode ser um oligonucleotídeo antissenso de fita simples ou uma molécula de ácido nucleico de shRNA.

[00012] O oligonucleotídeo antissenso pode ter um desenho de gapmer. De preferência, o oligonucleotídeo antissenso é capaz de inibir a expressão de RTEL1 por clivagem do ácido nucleico alvo. A clivagem é preferencialmente alcançada por meio do recrutamento de nuclease.

[00013] Em um aspecto adicional, a invenção fornece composições farmacêuticas compreendendo o oligonucleotídeo antissenso da invenção e um excipiente farmaceuticamente.

[00014] Em um aspecto adicional, a invenção fornece métodos para método in vivo ou in vitro para modulação da expressão de RTEL1 em uma célula alvo que está expressando RTEL1, pela administração de um oligonucleotídeo ou composição da invenção em uma quantidade eficaz à referida célula.

[00015] Em um aspecto adicional, a invenção fornece métodos para tratar ou prevenir uma doença, distúrbio ou disfunção associados à atividade in vivo de RTEL1, compreendendo administrar uma quantidade terapeuticamente ou profilaticamente eficaz do oligonucleotídeo antissenso da invenção a um paciente que sofre ou é suscetível à doença, distúrbio ou disfunção.

[00016] Outros aspectos da invenção são conjugados de moléculas de ácido nucleico da invenção e composições farmacêuticas compreendendo as moléculas da invenção. Em particular, os conjugados direcionados ao fígado são de interesse, como os agrupamentos de GalNAc.

BREVE DESCRIÇÃO DAS FIGURAS

[00017] Figura 1: Ilustra conjugados de oligonucleotídeo antissenso exemplares, em que o oligonucleotídeo é representado como uma linha ondulada (A- D) ou como "oligonucleotídeo" (E-H) ou como T2(I) e as frações conjugadas de direcionamento de receptor de asialoglicoproteína são frações de N-acetilgalactosamina trivalente. Os compostos A a D compreendem uma molécula ramificadora de di-lisina, um espaçador PEG3 e três frações de carboidrato GalNAc terminais. No composto A e B, o oligonucleotídeo é ligado diretamente ao receptor da asialoglicoproteína que tem como alvo a fração do conjugado sem um ligante. Nos compostos C e D, o oligonucleotídeo é ligado ao receptor da asialoglicoproteína que tem como alvo a fração do conjugado por meio de um ligante C6. Os compostos E-I compreendem uma molécula de ramificação tripla disponível comercialmente e espaçadores de comprimento e estrutura variados e três frações de carboidrato GalNAc terminais.

DEFINIÇÕES INFECÇÃO POR HBV

[00018] O termo "infecção pelo vírus da hepatite B" ou "infecção por HBV" é comumente conhecido na técnica e se refere a uma doença infecciosa que é causada pelo vírus da hepatite B (HBV) e afeta o fígado. Uma infecção por HBV pode ser aguda ou crônica. A infecção crônica pelo vírus da hepatite B (CHB) é uma doença global que afeta 248 milhões de pessoas em todo o mundo. Aproximadamente 686.000 mortes anualmente são atribuídas a doenças hepáticas em estágio terminal relacionadas ao HBV e carcinoma hepatocelular (HCC) (GBD 2013; Schweitzer et al., 2015). A OMS projetou que, sem intervenção ampliada, o número de pessoas que vivem com infecção por CHB permanecerá nos níveis atuais elevados pelos próximos 40 a 50 anos, com 20 milhões de mortes cumulativas ocorrendo entre 2015 e 2030 (OMS 2016). A infecção por CHB não é uma doença homogênea com apresentação clínica singular.

Os indivíduos infectados progrediram por várias fases da doença hepática associada ao CHB em sua vida; essas fases da doença também são a base para o tratamento com padrão de cuidados (SOC). As diretrizes atuais recomendam tratar apenas indivíduos infectados por CHB selecionados com base em três critérios - nível de ALT no soro, nível de DNA de HBV e gravidade da doença hepática (EASL, 2017). Esta recomendação foi devido ao fato de que SOC, ou seja, análogos de nucleos(t)ídeo (NAs) e interferon-alfa peguilado (PEG-IFN), não são curativos e devem ser administrados por longos períodos de tempo, aumentando assim seus riscos de segurança.

Os NAs suprimem efetivamente a replicação do DNA do HBV; no entanto, eles têm efeito muito limitado/nenhum efeito sobre outros marcadores virais.

Duas marcas da infecção pelo HBV, o antígeno de superfície da hepatite B (HBsAg) e o DNA circular covalentemente fechado (cccDNA), são os principais alvos de novos medicamentos com o objetivo de curar o HBV.

No plasma de indivíduos com CHB, as partículas subvirais (vazias) de HBsAg superam os vírions de HBV por um fator de 103 a 105 (Ganem & Prince, 2014); Acredita-se que seu excesso contribua para a imunopatogênese da doença, incluindo a incapacidade dos indivíduos de desenvolver anticorpos anti-HBs neutralizantes, o marcador sorológico observado após a resolução da infecção aguda por HBV.

CCCDNA (DNA CIRCULAR COVALENTEMENTE FECHADO)

[00019] O cccDNA é o modelo genético viral que reside no núcleo dos hepatócitos infectados, onde dá origem a todos os transcritos de RNA do HBV necessários para a infecção produtiva e é responsável pela persistência viral durante o curso natural da infecção crônica pelo HBV (Locarnini & Zoulim, 2010 Antivir Ther. 15 Suplemento 3: 3-

14. doi: 10,3851 (IMP1619). Atuando como um reservatório viral, o cccDNA é a fonte do rebote viral após a interrupção do tratamento, necessitando de tratamento de longo prazo, muitas vezes para toda a vida. O PEG-IFN só pode ser administrado a um pequeno subconjunto de CHB devido aos seus vários efeitos colaterais.

[00020] Consequentemente, novas terapias que podem fornecer uma cura completa, definida pela degradação ou eliminação do cccDNA do HBV, para a maioria dos pacientes com CHB são altamente necessárias.

COMPOSTO

[00021] Aqui, o termo "composto" significa qualquer molécula capaz de inibir a expressão ou atividade de RTEL1. Os compostos particulares da invenção são moléculas de ácido nucleico, tais como moléculas de RNAi ou oligonucleotídeos antissenso de acordo com a invenção ou qualquer conjugado compreendendo tal molécula de ácido nucleico. Por exemplo, neste documento, o composto pode ser uma molécula de ácido nucleico direcionada a RTEL1, em particular um oligonucleotídeo antissenso ou um siRNA.

OLIGONUCLEOTÍDEO

[00022] O termo "oligonucleotídeo", conforme usado neste documento, é definido como é geralmente entendido pelo técnico no assunto como uma molécula compreendendo dois ou mais nucleosídeos covalentemente ligados. Esses nucleosídeos covalentemente ligados também podem ser referidos como moléculas de ácido nucleico ou oligômeros, que podem ser usados indistintamente.

[00023] Os oligonucleotídeos referidos na descrição e reivindicações são geralmente oligonucleotídeos terapêuticos com menos de 70 nucleotídeos de comprimento. O oligonucleotídeo pode ser ou compreende um oligonucleotídeo antissenso de fita simples, ou pode ser outra molécula de ácido nucleico oligomérica, tal como um RNA CRISPR, um siRNA, shRNA, um aptâmero ou uma ribozima. As moléculas de oligonucleotídeos terapêuticas são comumente produzidas em laboratório por síntese química em fase sólida seguida de purificação e isolamento. No entanto, os shRNAs geralmente são liberados às células usando vetores lentivirais das quais eles são então transcritos para produzir o RNA de cadeia simples que formará uma estrutura de RNA de alça da haste (harpin) que é capaz de interagir com o mecanismo de RNA de interferência (incluindo o complexo de silenciamento induzido por RNA (RISC)). Em uma modalidade da presente invenção, o shRNA é moléculas de shRNA produzidas quimicamente (não contando com a expressão baseada em células de plasmídeos ou vírus).

[00024] Quando faz-se referência a uma sequência do oligonucleotídeo, é feita referência à sequência ou ordem das frações de nucleobase, ou modificações das mesmas, dos nucleotídeos ou nucleosídeos ligados covalentemente. Geralmente, o oligonucleotídeo da invenção é fabricado pelo homem, é quimicamente sintetizado e é normalmente purificado ou isolado. Embora em algumas modalidades o oligonucleotídeo da invenção seja um shRNA transcrito a partir de um vetor após a entrada na célula alvo. O oligonucleotídeo da invenção pode compreender um ou mais nucleotídeos ou nucleosídeos modificados.

[00025] Em algumas modalidades, o oligonucleotídeo da invenção compreende ou consiste em 10 a 70 nucleotídeos de comprimento, tal como 12 a 60, tal como 13 a 50, tal como 14 a 40, tal como 15 a 30, tal como 12 a 25, tal como 16 a 22, tal como de 16 a 20 nucleotídeos contíguos de comprimento. Consequentemente, o oligonucleotídeo da presente invenção, em algumas modalidades, pode ter um comprimento de 12 a 25 nucleotídeos. Alternativamente, o oligonucleotídeo da presente invenção, em algumas modalidades, pode ter um comprimento de 15 a 22 nucleotídeos.

[00026] Em algumas modalidades, o oligonucleotídeo ou sua sequência de nucleotídeo contígua, compreende ou consiste em 24 ou menos nucleotídeos, tal como 22, tal como 20 ou menos nucleotídeos, tal como 18 ou menos nucleotídeos, tal como 14, 15, 16 ou 17 nucleotídeos. Deve ser entendido que qualquer intervalo fornecido no presente documento inclui os resultados do intervalo. Por conseguinte, se uma molécula de ácido nucleico é dita incluir de 12 a 25 nucleotídeos, são incluídos ambos 12 e 25 nucleotídeos.

[00027] Em algumas modalidades, a sequência de nucleotídeo contígua compreende ou consiste em 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21 ou 22 nucleotídeos contíguos de comprimento

[00028] O(s) oligonucleotídeo(s) é/são para modular a expressão de um ácido nucleico alvo em um mamífero. Em algumas modalidades, as moléculas de ácido nucleico, tais como siRNAs, shRNAs ou oligonucleotídeos antissenso, são normalmente para inibir a expressão de um(uns) ácido(s) nucleico(s) alvo.

[00029] Em uma modalidade da invenção, o oligonucleotídeo é selecionado a partir de um agente RNAi, tal como um siRNA ou shRNA. Em outra modalidade, o oligonucleotídeo é um oligonucleotídeo antissenso de fita simples, tal como um oligonucleotídeo antissenso modificado de alta afinidade que interage com a RNaseH.

[00030] Em algumas modalidades, o oligonucleotídeo da invenção pode compreender um ou mais nucleotídeos ou nucleosídeos modificados, tais como nucleosídeos modificados por açúcar em 2'.

[00031] Em algumas modalidades, o oligonucleotídeo compreende ligações internucleosídicas de fosforotioato.

[00032] Em algumas modalidades, o oligonucleotídeo pode ser conjugada com frações não nucleotídicas (frações conjugadas).

[00033] Uma biblioteca de oligonucleotídeos deve ser entendida como uma coleção de oligonucleotídeos variantes. A finalidade da biblioteca de oligonucleotídeos pode variar. Em algumas modalidades, a biblioteca de oligonucleotídeos é composta de oligonucleotídeos com sequência de nucleobase sobreposta direcionada a um ou mais ácidos nucleicos alvo de RTEL1 de mamífero com o objetivo de identificar a sequência mais potente dentro da biblioteca de oligonucleotídeos. Em algumas modalidades, a biblioteca de oligonucleotídeos é uma biblioteca de variantes de desenho de oligonucleotídeo (moléculas de ácido nucleico de criança) de um oligonucleotídeo do progenitor ou ancestral, em que as variantes de desenho de oligonucleotídeo retêm a sequência de nucleobase central da molécula de ácido nucleico progenitora.

OLIGONUCLEOTÍDEOS ANTISSENSO

[00034] O termo "oligonucleotídeo antissenso", como aqui usado, é definido como oligonucleotídeos capazes de modular a expressão de um gene alvo por hibridação a um ácido nucleico alvo, em particular, a uma sequência contígua em um ácido nucleico alvo. Os oligonucleotídeos antissenso deste documento não são essencialmente de fita dupla e, portanto, não são siRNAs ou shRNAs. De preferência, os oligonucleotídeos antissenso da presente invenção são de fita simples. Entende-se que os oligonucleotídeos de fita simples da presente invenção podem formar grampos de cabelo (hairpins) ou estruturas duplex intermoleculares (duplex entre duas moléculas do mesmo oligonucleotídeo), desde que o grau de intra ou inter autocomplementaridade seja menor que 50% em todo o comprimento total do oligonucleotídeo.

[00035] De maneira vantajosa, o oligonucleotídeo antissenso de fita simples da invenção não contém nucleosídeos de RNA, uma vez que isso diminuirá a resistência à nuclease.

[00036] De maneira vantajosa, o oligonucleotídeo da invenção compreende um ou mais nucleosídeos ou nucleotídeos modificados, tais como nucleosídeos modificados por açúcar em 2'. Além disso, é vantajoso que os nucleosídeos que não sejam modificados sejam nucleosídeos de DNA.

MOLÉCULAS DE RNAI

[00037] Aqui, o termo "molécula de interferência de RNA (RNAi)" refere-se a um oligonucleotídeo baseado em RNA de fita dupla curta capaz de induzir o silenciamento de genes dependentes de RNA através do complexo de silenciamento induzido por RNA (RISC) no citoplasma de uma célula, onde eles interagem com a argonauta componente de RISC catalítico. A molécula de iRNA modula, por exemplo, inibe a expressão do ácido nucleico alvo em uma célula, por exemplo, uma célula dentro de um paciente, tal como um paciente mamífero. Um tipo de molécula de RNAi é um RNA interferente pequeno (siRNA), que é uma molécula de RNA de fita dupla composta por dois oligonucleotídeos complementares, em que a ligação de uma fita ao mRNA complementar após a transcrição leva a sua degradação e perda de tradução. Um pequeno RNA hairpin (shRNA) é um oligonucleotídeo baseado em RNA de fita simples que forma uma estrutura de alça da haste (hairpin) que é capaz de reduzir o mRNA por meio do DICER e do complexo de silenciamento redutor de RNA (RISC). As moléculas de RNAi podem ser desenhadas com base na sequência do gene de interesse (ácido nucleico alvo). O RNAi correspondente pode então ser sintetizado quimicamente ou por transcrição in vitro, ou expresso a partir de um vetor ou produto de PCR.

SIRNA

[00038] O termo siRNA refere-se a uma pequena molécula de RNAi de ácido ribonucleico interferente. Isto é uma classe de moléculas de RNA de fita dupla, também conhecidas na técnica como RNA de interferência curto ou RNA de silenciamento. siRNAs normalmente compreendem uma fita senso (também referida como fita passageira) e uma fita antissenso (também referida como fita guia), em que cada fita tem 17 a 30 nucleotídeos de comprimento, normalmente 19 a 25 nucleosídeos de comprimento, em que a fita antissenso é complementar, tal como pelo menos 95% complementar, tal como totalmente complementar, ao ácido nucleico alvo (adequadamente uma sequência de mRNA madura), e a fita senso é complementar à fita antissenso de modo que a fita senso e a fita antissenso formem um duplex ou região duplex. As cadeias de siRNA podem formar um duplex de extremidades cegas ou, vantajosamente, as extremidades em 3' da cadeia senso e antissenso podem formar uma saliência em 3' de, por exemplo, 1, 2 ou 3 nucleosídeos para se assemelhar ao produto produzido por Dicer, que forma o substrato RISC in vivo. Formas estendidas eficazes de substratos de Dicer foram descritas em US 8.349.809 e US

8.513.207, incorporadas no presente documento por referência. Em algumas modalidades, tanto a fita senso quanto a fita antissenso têm uma saliência 2nt em 3'. A região duplex pode portanto ter, por exemplo, 17 a 25 nucleotídeos de comprimento, tal como 21 a 23 nucleotídeos de comprimento.

[00039] Uma vez dentro de uma célula, a fita antissenso é incorporada ao complexo RISC que medeia a degradação do alvo ou a inibição do alvo do ácido nucleico alvo. Os siRNAs normalmente compreendem nucleosídeos modificados além dos nucleosídeos de RNA. Em uma modalidade, a molécula de siRNA pode ser quimicamente modificada usando ligações internucleosídicas modificadas e nucleosídeos modificados por açúcar em 2', tais como nucleosídeos modificados por ribose bicíclica em 2'-4', incluindo modificações substituídas por LNA e cET ou em 2', como 2'-O-alquil-RNA, 2'-O-metil-RNA, 2'-alcóxi-RNA, 2'-O- metoxietil-RNA (MOE), 2'-amino-DNA, 2'-fluoro-DNA, ácido nucleico arabino (ANA) e 2'-fluoro-ANA. Em particular, 2'fluoro, 2'-O-metil ou 2'-O-metoxietila podem ser incorporados em siRNAs.

[00040] Em algumas modalidades, todos os nucleotídeos de uma fita senso (passageiro) de siRNA podem ser modificados com nucleosídeos modificados por açúcar em 2', como LNA (vide WO2004/083430, WO2007/085485 por exemplo). Em algumas modalidades, a fita passageira do siRNA pode ser descontínua (ver WO2007/107162 por exemplo). A incorporação de nucleotídeos termicamente desestabilizadores que ocorrem em uma região de semente da fita antissenso de siRNAs foi relatada como útil na redução da atividade fora do alvo de siRNAs (vide WO2018/098328 por exemplo). Adequadamente, o siRNA compreende um grupo 5' fosfato ou um mimetizador 5'-fosfato na extremidade 5' da fita antissenso. Em algumas modalidades, a extremidade 5' da fita antissenso é um nucleosídeo de RNA.

[00041] Em uma modalidade, a molécula de siRNA compreende ainda pelo menos uma ligação internucleosídica fosforotioato ou metilfosfonato. A ligação internucleosídica fosforotioato ou metilfosfonato pode estar no terminal 3' de uma ou ambas as fitas (por exemplo, a fita antissenso; ou a fita senso); ou a ligação internucleosídica fosforotioato ou metilfosfonato pode estar no terminal 5' de uma ou ambas as fitas (por exemplo, a fita antissenso; ou a fita senso); ou a ligação internucleosídica fosforotioato ou metilfosfonato pode estar no terminal 5' e 3' de uma ou ambas as fitas (por exemplo, a fita antissenso; ou a fita senso). Em algumas modalidades, as ligações internucleosídicas restantes são ligações fosfodiéster. Em algumas modalidades, os oligonucleotídeos de siRNA compreendem uma ou mais ligações internucleosídicas de fosforotioato. Nas moléculas de siRNA, as ligações internucleosídicas de fosforotioato podem reduzir a clivagem da nuclease no RICS, portanto, é vantajoso que nem todas as ligações internucleosídicas sejam modificadas.

[00042] A molécula de siRNA pode compreender ainda um ligante. Em algumas modalidades, o ligante é conjugado à extremidade 3' da fita senso.

[00043] Para distribuição biológica, os siRNAs podem ser conjugados a um ligante de direcionamento e/ou ser formulados em nanopartículas lipídicas, por exemplo.

[00044] Outros aspectos da invenção referem-se a composições farmacêuticas que compreendem estes dsRNA, tais como moléculas de siRNA adequadas para uso terapêutico, e métodos de inibição da expressão do gene alvo pela administração de moléculas de dsRNA, tais como siRNAs da invenção, por exemplo, para o tratamento de várias condições de doença, conforme divulgado aqui.

SHRNA

[00045] As moléculas de shRNA ou RNA hairpin curto têm geralmente entre 40 e 70 nucleotídeos de comprimento, tal como entre 45 e 65 nucleotídeos de comprimento, tal como 50 e 60 nucleotídeos de comprimento, e formam uma estrutura de RNA de alça da haste (hairpin), que interagem com a endonuclease conhecida como Dicer, que se acredita processar dsRNA em RNAs curtos de interferência de 19 a 23 pares de bases com saliências características de duas bases 3' que são então incorporadas a um complexo de silenciamento induzido por RNA (RISC). Após a ligação ao mRNA alvo apropriado, uma ou mais endonucleases dentro do RISC clivam o alvo para induzir o silenciamento. Os oligonucleotídeos de RNAi podem ser quimicamente modificados usando ligações internucleosídicas modificadas e nucleosídeos modificados por açúcar em 2', tais como nucleosídeos modificados por ribose bicíclica em 2'-4', incluindo modificações substituídas por LNA e cET ou em 2', como 2'-O-alquil-RNA, 2'-O-metil-RNA, 2'-alcóxi-RNA, 2'-O- metoxietil-RNA (MOE), 2'-amino-DNA, 2'-fluoro-DNA, ácido nucleico arabino (ANA) e 2'-fluoro-ANA.

[00046] Em algumas modalidades, as moléculas de ácido nucleico shRNA compreendem ligações internucleosídicas de fosforotioato. Nas moléculas de RNAi, as ligações internucleosídicas de fosforotioato podem reduzir ou a clivagem da nuclease no RICS, portanto, é vantajoso que nem todas as ligações internucleosídicas na alça da haste da molécula shRNA sejam modificadas. As ligações internucleosídicas de fosforotioato podem ser, de maneira vantajosa, colocadas na extremidade 3' e/ou 5' da alça da haste da molécula shRNA, em particular, na parte da molécula que não é complementar ao ácido nucleico alvo (por exemplo, a fita senso ou fita passageira em uma molécula de siRNA). A região da molécula de shRNA que é complementar ao ácido nucleico alvo, no entanto, também pode ser modificada nas primeiras 2 a 3 ligações internucleosídicas na parte que se prevê que se torne o terminal 3' e/ou 5' após a clivagem por Dicer.

SEQUÊNCIA DE NUCLEOTÍDEO CONTÍGUA

[00047] O termo "sequência de nucleotídeo contígua" refere-se à região do oligonucleotídeo que é complementar ao ácido nucleico alvo. O termo é usado no presente documento de forma intercambiável com o termo "sequência de nucleobase contígua" e o termo "sequência de motivo de oligonucleotídeo". Em algumas modalidades, todos os nucleotídeos do oligonucleotídeo constituem a sequência de nucleotídeo contígua. Em algumas modalidades, a sequência de nucleotídeos contígua é incluída na fita guia de uma molécula de siRNA. Em algumas modalidades, a sequência de nucleotídeos contígua é a parte de uma molécula de shRNA que é 100% complementar ao ácido nucleico alvo. Em algumas modalidades, o oligonucleotídeo compreende a sequência de nucleotídeo contígua, tal como uma região de gapmer F-G-F', e pode opcionalmente compreender mais nucleotídeo(s), por exemplo, uma região ligante de nucleotídeo que pode ser usada para anexar um grupo funcional (por exemplo, um grupo conjugado para direcionamento) à sequência de nucleotídeo contígua. A região ligante de nucleotídeo pode ou não ser complementar ao ácido nucleico alvo. Em algumas modalidades, todos os nucleotídeos do oligonucleotídeo formam a sequência de nucleotídeo contígua. Em algumas modalidades, a sequência de nucleotídeos contígua é 100% complementar ao ácido nucleico alvo.

NUCLEOTÍDEOS E NUCLEOSÍDEOS

[00048] Os nucleotídeos e nucleosídeos são os blocos de construção de oligonucleotídeos e polinucleotídeos e, para os fins da presente invenção, incluem nucleotídeos e nucleosídeos de ocorrência natural e não natural. Na natureza, nucleotídeos, tais como nucleotídeos de DNA e RNA, compreendem uma fração de açúcar ribose, uma fração de nucleobase e um ou mais grupos fosfato (que estão ausentes nos nucleosídeos). Nucleosídeos e nucleotídeos também podem ser referidos como "unidades" ou "monômeros".

NUCLEOSÍDEO MODIFICADO

[00049] O termo "nucleosídeo modificado" ou "modificação de nucleosídeo", conforme usado neste documento, refere-se a nucleosídeos modificados em comparação com o nucleosídeo equivalente de DNA ou RNA, pela introdução de uma ou mais modificações da fração de açúcar ou da fração de (nucleo)base. Em uma modalidade preferida, o nucleosídeo modificado compreende uma fração de açúcar modificada. O termo nucleosídeo modificado também pode ser usado no presente documento de forma intercambiável com o termo "análogo de nucleosídeo" ou "unidades" modificadas ou "monômeros" modificados. Os nucleosídeos com uma fração de açúcar de DNA ou RNA não modificada são denominados no presente documento como nucleosídeos de DNA ou RNA. Os nucleossídeos com modificações na região de base do nucleosídeo de DNA ou RNA ainda são geralmente denominados DNA ou RNA se permitirem o emparelhamento de bases Watson Crick.

LIGAÇÕES INTERNUCLEOSÍDICAS MODIFICADAS

[00050] O termo "ligação internucleosídica modificada" é definido como geralmente entendido pelo técnico no assunto como ligações diferentes das ligações de fosfodiéster (PO), que covalentemente acoplam juntos dois nucleosídeos. Os oligonucleotídeos da invenção podem, portanto, compreender uma ou mais ligações internucleosídicas modificadas, tais como uma ou mais ligações internucleosídicas fosforotioato ou uma ou mais ligações internucleosídicas fosforoditioato. Em algumas modalidades, a ligação internucleosídica modificada aumenta a resistência à nuclease do oligonucleotídeo em comparação a uma ligação fosfodiéster. Para oligonucleotídeos de ocorrência natural, a ligação internucleosídica inclui grupos fosfato, criando uma ligação fosfodiéster entre nucleosídeos adjacentes. As ligações internucleosídicas modificadas são particularmente úteis na estabilização de oligonucleotídeos para uso in vivo e podem servir para proteger contra a clivagem de nucleases em regiões de nucleosídeos de DNA ou RNA no oligonucleotídeo da invenção, por exemplo, na região gap G de um oligonucleotídeo gapmer, bem como em regiões de nucleosídeos modificados, tais como as regiões F e F'.

[00051] Em uma modalidade, o oligonucleotídeo compreende uma ou mais ligações internucleosídicas modificadas a partir do fosfodiéster natural, tais como uma ou mais ligações internucleosídicas modificadas que são, por exemplo, mais resistentes ao ataque de nuclease. A resistência à nuclease pode ser determinada incubando o oligonucleotídeo em soro sanguíneo ou usando um ensaio de resistência à nuclease (por exemplo, fosfodiesterase do veneno de cobra (SVPD)), ambos bem conhecidos na técnica. As ligações internucleosídicas que são capazes de aumentar a resistência à nuclease de um oligonucleotídeo são referidas como ligações internucleosídicas resistentes à nuclease. Em algumas modalidades, pelo menos 50% das ligações internucleosídicas no oligonucleotídeo, ou sequência de nucleotídeo contígua do mesmo, são modificadas, tal como pelo menos 60%, tal como pelo menos 70%, tal como pelo menos 75%, tal como pelo menos 80% ou tal como pelo menos 90% das ligações internucleosídicas no oligonucleotídeo, ou sequência de nucleotídeo contígua do mesmo, são modificadas. Em algumas modalidades, todas as ligações internucleosídicas do oligonucleotídeo, ou sequência de nucleotídeo contígua do mesmo, são modificadas. Será reconhecido que, em algumas modalidades, os nucleosídeos que ligam o oligonucleotídeo da invenção a um grupo funcional não nucleotídico, tal como um conjugado, podem ser de fosfodiéster. Em algumas modalidades, todas as ligações internucleosídicas do oligonucleotídeo, ou sua sequência de nucleotídeo contígua, são ligações internucleosídicas resistentes à nuclease.

[00052] Com o oligonucleotídeo da invenção é vantajoso usar ligações internucleosídicas de fosforotioato.

[00053] As ligações internucleosídicas de fosforotioato são particularmente úteis devido à resistência às nucleases, farmacocinética benéfica e facilidade de fabricação. Em algumas modalidades, pelo menos 50% das ligações internucleosídicas no oligonucleotídeo, ou sua sequência de nucleotídeo contígua, são fosforotioato, tal como pelo menos 60%, tal como pelo menos 70%, tal como pelo menos 75%, tal como pelo menos 80% ou tal como pelo menos 90% das ligações internucleosídicas no oligonucleotídeo, ou sua sequência de nucleotídeo contígua, são fosforotioato. Em algumas modalidades, todas as ligações internucleosídicas do oligonucleotídeo, ou sua sequência de nucleotídeo contígua, são fosforotioato.

[00054] Ligações resistentes à nucleases, tais como ligações fosforotioato, são particularmente úteis em regiões de oligonucleotídeo capazes de recrutar nucleases quando se forma um duplex com o ácido nucleico alvo, tais como a região G para gapmers. As ligações de fosforotioato podem, no entanto, também ser úteis em regiões que não recrutam nucleases e/ou regiões que aperfeiçoam a afinidade, tais como as regiões F e F' para gapmers. Os oligonucleotídeos gapmer podem, em algumas modalidades compreender uma ou mais ligações fosfodiéster na região F ou F', ou ambas as regiões F e F', nas quais a ligação internucleosídica na região G pode ser totalmente fosforotioato.

[00055] De forma vantajosa, todas as ligações internucleosídicas da sequência de nucleotídeo contígua do oligonucleotídeo são fosforotioato, ou todas as ligações internucleosídicas do oligonucleotídeo são ligações fosforotioato.

[00056] Reconhece-se que, conforme divulgado no documento EP 2 742 135, o oligonucleotídeo antissenso pode compreender outras ligações internucleosídicas (exceto fosfodiéster e fosforotioato), por exemplo,

internucleosídeos de fosfonato de alquil/fosfonato de metila que, de acordo com o documento EP 2 742 135, podem, por exemplo, ser tolerados de outro modo em um fosforotioato de DNA na região do gap.

NUCLEOBASE

[00057] O termo nucleobase inclui as frações purina (por exemplo, adenina e guanina) e pirimidina (por exemplo, uracila, timina e citosina) presentes nos nucleosídeos e nucleotídeos que formam ligações de hidrogênio na hibridação de ácidos nucleicos. No contexto da presente invenção, o termo nucleobase também abrange nucleobases modificadas que podem diferir das nucleobases de ocorrência natural, mas que são funcionais durante a hibridação de ácidos nucleicos. Nesse contexto, "nucleobase" refere-se a nucleobases de ocorrência natural, tais como adenina, guanina, citosina, timidina, uracila, xantina e hipoxantina, bem como variantes de ocorrência não natural. Tais variantes são, por exemplo, descritas em Hirao et al., (2012), Accounts of Chemical Research, vol. 45, página 2055, e Bergstrom, (2009), Current Protocols in Nucleic Acid Chemistry Suppl., 37 1.4.1.

[00058] Em algumas modalidades, a fração de nucleobase é modificada alterando a purina ou pirimidina em uma purina ou pirimidina modificada, tal como purina substituída ou pirimidina substituída, tal como uma nucleobase selecionada a partir de isocitosina, pseudoisocitosina, 5-metil-citosina, 5-tiozolo-citosina, 5- propinil-citosina, 5-propinil-uracila, 5-tiazolo-uracila 5- bromouracila, 2-tio-uracila, 2'tio-timina, inosina, diaminopurina, 6-aminopurina, 2-aminopurina 2,6-

diaminopurina e 2-cloro-6-aminopurina.

[00059] As frações de nucleobase podem ser indicadas pelo código da letra para cada nucleobase correspondente, por exemplo, A, T, G, C ou U, em que cada letra pode opcionalmente incluir nucleobases modificadas de função equivalente. Por exemplo, nos oligonucleotídeos exemplificados, as frações de nucleobase são selecionadas a partir de A, T, G, C e 5-metil-citosina. Opcionalmente, para gapmers de LNA, podem ser usados nucleosídeos de LNA de 5-metil-citosina.

OLIGONUCLEOTÍDEO MODIFICADO

[00060] O termo oligonucleotídeo modificado descreve um oligonucleotídeo compreendendo um ou mais nucleosídeos modificados por açúcar e/ou ligações internucleosídicas modificadas. O termo oligonucleotídeo quimérico é um termo que tem sido usado na literatura para descrever oligonucleotídeos com nucleosídeos modificados e nucleosídeos de DNA. O oligonucleotídeo antissenso da invenção é vantajosamente um oligonucleotídeo quimérico. Complementaridade

[00061] O termo "complementaridade" descreve a capacidade de emparelhamento de bases Watson-Crick de nucleosídeos/nucleotídeos. Os pares de bases Watson-Crick são guanina (G)-citosina (C) e adenina (A)-timina (T)/uracila (U). Será entendido que os oligonucleotídeos podem compreender nucleosídeos com nucleobases modificadas, por exemplo, 5-metil-citosina é frequentemente usada no lugar da citosina e, como tal, o termo complementaridade abrange o pareamento de bases Watson Crick entre nucleobases não modificadas e modificadas (vide, por exemplo, Hirao et al, (2012), Accounts of Chemical Research, vol. 45, página 2055, e Bergstrom, (2009), Current Protocols in Nucleic Acid Chemistry Suppl., 37

1.4.1).

[00062] O termo "% complementar", conforme usado no presente documento, refere-se à proporção de nucleotídeos (em porcentagem) de uma sequência de nucleotídeo contígua em uma molécula de ácido nucleico (por exemplo, oligonucleotídeo) que, ao longo da sequência de nucleotídeo contígua, é complementar a uma sequência de referência (por exemplo, uma sequência alvo ou motivo de sequência). A porcentagem de complementaridade é, assim, calculada contando o número de nucleobases alinhadas que são complementares (do par de bases Watson Crick) entre as duas sequências (quando alinhadas com a sequência alvo de 5' a 3' e a sequência de oligonucleotídeo de 3' a 5'), dividindo esse número pelo número total de nucleotídeos no oligonucleotídeo e multiplicando por 100. Em tal comparação, uma nucleobase/nucleotídeo que não se alinha (forma um par de bases) é denominada incompatibilidade. De preferência, não são permitidas inserções e deleções no cálculo da % de complementaridade de uma sequência de nucleotídeo contígua. Será entendido que na determinação da complementaridade, as modificações químicas das nucleobases são desconsideradas, desde que a capacidade funcional da nucleobase para formar o emparelhamento de bases Watson Crick seja retida (por exemplo, 5'-metil-citosina é considerada idêntica a uma citosina para o propósito de calcular a % da identidade).

[00063] O termo "totalmente complementar"

refere-se a 100% de complementaridade.

[00064] O seguinte é um exemplo de um motivo de oligonucleotídeo (SEQ ID NO: 33) que é totalmente complementar ao ácido nucleico alvo (SEQ ID NO: 11) 5’- CTTTGACCAGAGTATGTAAAATTCTC-3’ (SEQ ID NO: 11) 3’-AAACTGGTCTCATACATTTT -5’ (SEQ ID NO: 33)

IDENTIDADE

[00065] O termo "Identidade", conforme usado neste documento, refere-se à proporção de nucleotídeos (expressa em porcentagem) de uma sequência de nucleotídeo contígua em uma molécula de ácido nucleico (por exemplo, oligonucleotídeo) que, através da sequência de nucleotídeo contígua, são idênticos a uma sequência de referência (por exemplo, um motivo de sequência). A porcentagem de identidade é, assim, calculada contando o número de nucleobases alinhadas que são idênticas (uma Correspondência) entre duas sequências (na sequência de nucleotídeo contígua do composto da invenção e na sequência de referência), dividindo esse número pelo número total de nucleotídeos no oligonucleotídeo e multiplicando por 100. Portanto, porcentagem de identidade = (Correspondências X 100)/comprimento da região alinhada (por exemplo, a sequência de nucleotídeo contígua). Não são permitidas inserções e deleções no cálculo da percentagem da identidade de uma sequência de nucleotídeo contígua. Será entendido que, na determinação da identidade, as modificações químicas das nucleobases são desconsideradas desde que a capacidade funcional da nucleobase para formar o emparelhamento de bases Watson Crick seja mantida (por exemplo, a 5-metil-citosina é considerada idêntica a uma citosina para fins de cálculo da % da identidade).

HIBRIDIZAÇÃO

[00066] O termo "hibridação" ou "hibridização", conforme usado no presente documento, deve ser entendido como duas fitas de ácidos nucleicos (por exemplo, um oligonucleotídeo e um ácido nucleico alvo) formando ligações de hidrogênio entre pares de bases em fitas opostas, formando assim um duplex. A afinidade da ligação entre duas fitas de ácidos nucleicos é a força da hibridação. Ela é frequentemente descrita em termos da temperatura de fusão (Tm) definida como a temperatura à qual metade dos oligonucleotídeos são duplicados (duplexed) com o ácido nucleico alvo. Em condições fisiológicas, a Tm não é estritamente proporcional à afinidade (Mergny e Lacroix, 2003, Oligonucleotides, 13:515-537). A energia livre de Gibbs de estado padrão ΔG° é uma representação mais precisa da afinidade de ligação e está relacionada à constante de dissociação (Kd) da reação por ΔG°=-RTln(Kd), em que R é a constante de gás e T é a temperatura absoluta. Por conseguinte, um ΔG° muito baixo da reação entre um oligonucleotídeo e o ácido nucleico alvo reflete uma forte hibridação entre o oligonucleotídeo e o ácido nucleico alvo. A ΔG° é a energia associada a uma reação em que as concentrações aquosas são 1M, o pH é 7 e a temperatura é 37°C. A hibridação de oligonucleotídeos a um ácido nucleico alvo é uma reação espontânea e, para reações espontâneas, ΔG° é menor que zero. A ΔG° pode ser medida experimentalmente, por exemplo, usando o método de calorimetria de titulação isotérmica (ITC), como descrito em Hansen et al., 1965, Chem. Comm. 36–38 e Holdgate et al., 2005, Drug Discov Today. O técnico no assunto saberá que o equipamento comercial está disponível para medições de ΔG°. A ΔG ° também pode ser estimada numericamente usando o modelo vizinho mais próximo, conforme descrito por SantaLucia, 1998, Proc Natl Acad Sci USA. 95: 1460–1465 usando parâmetros termodinâmicos apropriadamente derivados descritos por Sugimoto et al., 1995, Biochemistry 34:11211– 11216 e McTigue et al., 2004, Biochemistry 43:5388–5405. A fim de ter a possibilidade de modular seu ácido nucleico alvo pretendido por hibridação, os oligonucleotídeos da presente invenção hibridam a um ácido nucleico alvo com valores estimados de ΔG° abaixo de -10 kcal para oligonucleotídeos com 10 a 30 nucleotídeos de comprimento. Em algumas modalidades, o grau ou a força da hibridação é medido pela energia livre de Gibbs de estado padrão ΔG°. Os oligonucleotídeos podem hibridar a um ácido nucleico alvo com valores estimados de ΔG° abaixo da faixa de -10 kcal, tal como abaixo de -15 kcal, tal como abaixo de -20 kcal e tal como abaixo de -25 kcal para oligonucleotídeos com 8 a 30 nucleotídeos de comprimento. Em algumas modalidades, os oligonucleotídeos hibridizam a um ácido nucleico alvo com um valor de ΔG° estimado de -10 a -60 kcal, tal como -12 a -40, tal como de -15 a -30 kcal ou -16 a -27 kcal, tal como -18 a -25 kcal.

ÁCIDO NUCLEICO ALVO

[00067] De acordo com a presente invenção, o ácido nucleico alvo é um ácido nucleico que codifica RTEL1 de mamíferos e pode, por exemplo, ser um gene, um RNA, um mRNA, um pré-mRNA, um mRNA maduro ou uma sequência de cDNA. O alvo pode, portanto, ser referido como um ácido nucleico alvo de RTEL1.

[00068] O oligonucleotídeo da invenção pode, por exemplo, direcionar regiões de exon de um RTEL1 de mamífero (em particular regiões de exon alvo de siRNA e shRNA, mas também oligonucleotídeos antissenso), ou pode, por exemplo, ter como alvo a região de íntron no pré-mRNA de RTEL1 (em particular, oligonucleotídeos antissenso que tem por alvo regiões de íntron). O gene RTEL1 humano codifica 15 transcritos destes 7 são codificadores de proteínas e, portanto, potenciais alvos de ácido nucleico. A Tabela 1 lista as regiões de exon e íntron previstas dos 7 transcritos, conforme posicionados no pré-mRNA de RTEL1 humano da SEQ ID NO: 1. Entende-se que os oligonucleotídeos da invenção podem ter como alvo a sequência de mRNA madura de um ou mais dos transcritos listados na tabela 1.

TABELA 1. REGIÕES TRANSCRITAS, EXÔNICAS E INTRÔNICAS NO PRÉ- MRNA DE RTEL1 HUMANO (SEQ ID NO: 1) PARA AS DIFERENTES PROTEÍNAS QUE CODIFICAM OS TRANSCRITOS DE MRNA RTEL1 Região de ID de transcrição Regiões exônicas Regiões de íntron transcrição início fim Exon início fim íntron início fim RTEL1-205 1 38444 1 1 657 1 657 1424 ENST00000370018 2 1424 1695 2 1695 3489 3 3489 3687 3 3687 4041 4 4041 4134 4 4134 4737 5 4737 4818 5 4818 5020 6 5020 5080 6 5080 8195 7 8195 8270 7 8270 9660 8 9660 9744 8 9744 14747

Região de ID de transcrição Regiões exônicas Regiões de íntron transcrição início fim Exon início fim íntron início fim 9 14747 14812 9 14812 16131 10 16131 16284 10 16284 20336 11 20336 20374 11 20374 20459 12 20459 20537 12 20537 22040 13 22040 22137 13 22137 22855 14 22855 22910 14 22910 27714 15 27714 27788 15 27788 27982 16 27982 28063 16 28063 29829 17 29829 29961 17 29961 30128 18 30128 30241 18 30241 30330 19 30330 30370 19 30370 30492 20 30492 30577 20 30577 30719 21 30719 30796 21 30796 31246 22 31246 31323 22 31323 31693 23 31693 31839 23 31839 31941 24 31941 32056 24 32056 32278 25 32278 32401 25 32401 32485 26 32485 32632 26 32632 32996 27 32996 33138 27 33138 33933 28 33933 34028 28 34028 34996 29 34996 35194 29 35194 35334 30 35334 35474 30 35474 36563 31 36563 36679 31 36679 36932 32 36932 37165 32 37165 37257 33 37257 37412 33 37412 37519 34 37519 37671 34 37671 37969 35 37969 38444 RTEL1-203 485 38433 1 485 657 1 657 1424 ENST00000360203 2 1424 1695 2 1695 3489 3 3489 3687 3 3687 4041 4 4041 4134 4 4134 4737 5 4737 4818 5 4818 5020 6 5020 5080 6 5080 8195 7 8195 8270 7 8270 9660 8 9660 9744 8 9744 14747

Região de ID de transcrição Regiões exônicas Regiões de íntron transcrição início fim Exon início fim íntron início fim 9 14747 14812 9 14812 16131 10 16131 16284 10 16284 20336 11 20336 20374 11 20374 20459 12 20459 20537 12 20537 22040 13 22040 22137 13 22137 22855 14 22855 22910 14 22910 27714 15 27714 27788 15 27788 27982 16 27982 28063 16 28063 29829 17 29829 29961 17 29961 30128 18 30128 30241 18 30241 30330 19 30330 30370 19 30370 30492 20 30492 30577 20 30577 30719 21 30719 30796 21 30796 31246 22 31246 31323 22 31323 31693 23 31693 31839 23 31839 31941 24 31941 32056 24 32056 32278 25 32278 32401 25 32401 32485 26 32485 32632 26 32632 32996 27 32996 33138 27 33138 33933 28 33933 34028 28 34028 34996 29 34996 35194 29 35194 35334 30 35334 35474 30 35474 36563 31 36563 36679 31 36679 36932 32 36932 37165 32 37165 37257 33 37257 37412 33 37412 37519 34 37519 37841 34 37841 37969 35 37969 38433 RTEL1-212 482 38171 1 482 657 1 657 1424 ENST00000508582 2 1424 1695 2 1695 3489 3 3489 3687 3 3687 4041 4 4041 4134 4 4134 4665 5 4665 4818 5 4818 5020 6 5020 5080 6 5080 8195 7 8195 8270 7 8270 9660 8 9660 9744 8 9744 14747

Região de ID de transcrição Regiões exônicas Regiões de íntron transcrição início fim Exon início fim íntron início fim 9 14747 14812 9 14812 16131 10 16131 16284 10 16284 20336 11 20336 20374 11 20374 20459 12 20459 20537 12 20537 22040 13 22040 22137 13 22137 22855 14 22855 22910 14 22910 27714 15 27714 27788 15 27788 27982 16 27982 28063 16 28063 29829 17 29829 29961 17 29961 30128 18 30128 30241 18 30241 30330 19 30330 30370 19 30370 30492 20 30492 30577 20 30577 30719 21 30719 30796 21 30796 31246 22 31246 31323 22 31323 31693 23 31693 31839 23 31839 31941 24 31941 32056 24 32056 32278 25 32278 32401 25 32401 32485 26 32485 32632 26 32632 32996 27 32996 33138 27 33138 33933 28 33933 34028 28 34028 34996 29 34996 35194 29 35194 35334 30 35334 35474 30 35474 36563 31 36563 36679 31 36679 36932 32 36932 37165 32 37165 37257 33 37257 37412 33 37412 37519 34 37519 37671 34 37671 37969 35 37969 38171 RTEL1-201 505 38434 1 505 650 1 650 3489 ENST00000318100 2 3489 3687 2 3687 4041 3 4041 4134 3 4134 4737 4 4737 4818 4 4818 5020 5 5020 5080 5 5080 8195 6 8195 8270 6 8270 9660 7 9660 9744 7 9744 14747 8 14747 14812 8 14812 16131

Região de ID de transcrição Regiões exônicas Regiões de íntron transcrição início fim Exon início fim íntron início fim 9 16131 16284 9 16284 20336 10 20336 20374 10 20374 20459 11 20459 20537 11 20537 22040 12 22040 22137 12 22137 22855 13 22855 22910 13 22910 27714 14 27714 27788 14 27788 27982 15 27982 28063 15 28063 29829 16 29829 29961 16 29961 30128 17 30128 30241 17 30241 30330 18 30330 30370 18 30370 30492 19 30492 30577 19 30577 30719 20 30719 30796 20 30796 31246 21 31246 31323 21 31323 31693 22 31693 31839 22 31839 31941 23 31941 32056 23 32056 32278 24 32278 32401 24 32401 32485 25 32485 32632 25 32632 32996 26 32996 33138 26 33138 33933 27 33933 34028 27 34028 34996 28 34996 35194 28 35194 35334 29 35334 35474 29 35474 36563 30 36563 36679 30 36679 36932 31 36932 37165 31 37165 37257 32 37257 37412 32 37412 37519 33 37519 37671 33 37671 37969 34 37969 38434 RTEL1-202 551 16284 1 551 650 1 650 1424 ENST00000356810 2 1424 1695 2 1695 3489 3 3489 3687 3 3687 4041 4 4041 4134 4 4134 4587 5 4587 4818 5 4818 5020 6 5020 5080 6 5080 8195 7 8195 8270 7 8270 9660 8 9660 9744 8 9744 14747 9 14747 14812 9 14812 16131

Região de ID de transcrição Regiões exônicas Regiões de íntron transcrição início fim Exon início fim íntron início fim 10 16131 16284 RTEL1-206 30530 33067 1 30530 30577 1 30577 30719 ENST00000425905 2 30719 30796 2 30796 31246 3 31246 31323 3 31323 31941 4 31941 32056 4 32056 32278 5 32278 32401 5 32401 32485 6 32485 32632 6 32632 32996 7 32996 33067 RTEL1-214 811 3653 1 811 943 1 943 1424 ENST00000646389 2 1424 1695 2 1695 3489 3 3489 3653

[00069] Adequadamente, o ácido nucleico alvo codifica uma proteína RTEL1, em particular, RTEL1 de mamífero, tal como RTEL1 humano (vide, por exemplo, as Tabelas 2 e 3), que fornece as sequências de pré-mRNA para RTEL1 de humano e macaco.

[00070] Em algumas modalidades, o ácido nucleico alvo é selecionado de SEQ ID NO: 1 e/ou 2 ou suas variantes de ocorrência natural (por exemplo, sequências que codificam uma proteína RTEL1 de mamífero na tabela 1).

[00071] Se empregar o oligonucleotídeo da invenção em pesquisa ou diagnóstico, o ácido nucleico alvo pode ser um cDNA ou um ácido nucleico sintético derivado de DNA ou RNA.

[00072] Para aplicação in vivo ou in vitro, o oligonucleotídeo da invenção é normalmente capaz de inibir a expressão do ácido nucleico alvo RTEL1 em uma célula que está expressando o ácido nucleico alvo RTEL1. A sequência contígua de nucleobases do oligonucleotídeo da invenção é normalmente complementar ao ácido nucleico alvo de RTEL1,

medido ao longo do comprimento do oligonucleotídeo, opcionalmente com exceção de uma ou duas incompatibilidades, e opcionalmente excluindo regiões ligantes baseadas em nucleotídeos, que podem ligar o oligonucleotídeo a um grupo funcional opcional, tal como um conjugado, ou outros nucleotídeos terminais não complementares (por exemplo, região D' ou D''). O ácido nucleico alvo pode, em algumas modalidades, ser um RNA ou DNA, como um RNA mensageiro, como um mRNA maduro (por exemplo, as regiões exônicas dos transcritos listados na tabela 1) ou um pré-mRNA.

[00073] Em algumas modalidades, o ácido nucleico alvo é um RNA ou DNA que codifica a proteína RTEL1 de mamífero, tal como a RTEL1 de humanos, por exemplo, a sequência de pré-mRNA de RTEL1 de humanos, tal como a divulgada conforme a SEQ ID NO: 1. Informações adicionais sobre ácidos nucleicos alvo exemplares são fornecidas nas Tabelas 2 e 3. TABELA 2. INFORMAÇÕES SOBRE GENOMA E MONTAGEM DE RTEL1 ENTRE ESPÉCIES.

Espécies Crom. Fita Coordenadas Montagem conjunto genômicas gene_id Início Fim Humano 20 dire 636578 636962 GRCh38.p ENSG000002583 ta 10 53 12 66 Macaco 10 dire 958537 958909 Macaca_f ENSMFAG000000 Cynomolgus ta 26 39 ascicula 43680 ris_5.0

[00074] direta = fita direta. As coordenadas do genoma fornecem a sequência pré-mRNA (sequência genômica).

A referência NCBI fornece a sequência de mRNA (sequência de cDNA). TABELA 3. DETALHES DA SEQUÊNCIA PARA RTEL1 ENTRE ESPÉCIES.

Espécies Tipo de Comprimento SEQ ID NO RNA (nt) Humano pré- 38444 1 mRNA Macaco pré- 37214 2 mRNA

[00075] Observe que a SEQ ID NO 2 compreende regiões de múltiplos NNNNs, em que o sequenciamento não foi capaz de refinar com precisão a sequência e, portanto, uma sequência degenerada está incluída. Para evitar dúvidas, os compostos da invenção são complementares à sequência alvo real e não são, portanto, compostos degenerados.

[00076] Em algumas modalidades, o ácido nucleico alvo é a SEQ ID NO 1.

[00077] Em algumas modalidades, o ácido nucleico alvo é a SEQ ID NO 2.

SEQUÊNCIA ALVO

[00078] O termo "sequência alvo", conforme usado no presente documento, refere-se a uma sequência de nucleotídeo presente no ácido nucleico alvo que compreende a sequência de nucleobase que é complementar ao oligonucleotídeo da invenção. Em algumas modalidades, a sequência alvo consiste em uma região no ácido nucleico alvo com uma sequência de nucleobase que é complementar à sequência de nucleotídeo contígua do oligonucleotídeo da invenção. Esta região do ácido nucleico alvo pode ser referida, de forma intercambiável, como a sequência de nucleotídeo alvo, sequência alvo ou região alvo. Em algumas modalidades, a sequência alvo é mais longa do que a sequência complementar de um único oligonucleotídeo e pode, por exemplo, representar uma região preferida do ácido nucleico alvo que pode ser direcionada por vários oligonucleotídeos da invenção.

[00079] Em algumas modalidades, a sequência alvo é uma sequência selecionada a partir do grupo que consiste em um éxon de mRNA de RTEL1 de humano, tal como um éxon de mRNA de RTEL1 de humano selecionado a partir da lista na tabela 1, mencionada acima.

[00080] Em algumas modalidades, a sequência alvo é uma sequência selecionada a partir do grupo que consiste em um íntron de mRNA RTEL1 humano, tal como um íntron de mRNA RTEL1 humano selecionado a partir da lista na tabela 1, mencionada acima.

[00081] O oligonucleotídeo da invenção compreende uma sequência de nucleotídeo contígua que é complementar a ou hibridiza ao ácido nucleico alvo, tal como uma sequência alvo descrita no presente documento.

[00082] A sequência alvo à qual o oligonucleotídeo é complementar ou hibridiza a geralmente compreende uma sequência de nucleobase contígua de pelo menos 10 nucleotídeos. A sequência de nucleotídeos contígua está entre 10 a 35 nucleotídeos, tal como 12 a 30, tal como 14 a 20, tal como 16 a 20 nucleotídeos contíguos. Em uma modalidade da invenção, a sequência alvo é selecionada a partir do grupo que consiste em

[00083] SEQ ID NO: 3-21 conforme mostrado na tabela 4.

TABELA 4: SEQUÊNCIAS ALVO NO PRÉ-MRNA DE RTEL1 HUMANO (SEQ ID NO: 1) SEQ Início Final ID Sequência Alvo na SEQ na SEQ NO ID 1 ID 1 3 gaccactgtccttccatg 8294 8311 ttcagagattcaagttataataaagctcttcttatattgag 4 gggga 8677 8722 5 aggaatagggttggtttt 9377 9394 6 ccttactacctgtcccg 9667 9683 7 acaattacttgttggatgcc 9722 9741 8 agcttctaacccaaccag 10921 10938 9 tataaacctaaatgtaaaagc 11482 11502 10 ttcaccaaaatttaaagctt 11622 11641 11 ctttgaccagagtatgtaaaattctc 11752 11777 12 aagacgtgttcaaagatt 12868 12885 13 ggacctactgttttttg 13234 13250 14 ggacctactgttttattcc 13550 13568 15 gtcccttctcttcctcctgtag 14725 14746 16 cgtgatctttgacgaagct 14785 14803 17 cgcaaacctttctgga 14874 14889 18 agcctgtgtgtggagtatgagca 33025 33047 19 cgtttccgtgttggtctggg 34571 34590 20 gactacaagggttccgatg 35104 35122 21 agtttgaggaggtctgtatc 35370 35389

[00084] Em algumas modalidades, a sequência alvo é selecionada de uma região mostrada na Tabela 5A ou 5B.

CÉLULA ALVO

[00085] O termo uma "célula alvo", conforme usado no presente documento, refere-se a uma célula que está expressando o ácido nucleico alvo. Para o uso terapêutico da presente invenção, é vantajoso se a célula alvo estiver infectada com HBV. Em algumas modalidades, a célula alvo pode ser in vivo ou in vitro. Em algumas modalidades, a célula alvo é uma célula de mamífero, tal como uma célula de roedores, tal como uma célula de camundongo ou uma célula de rato, ou uma célula de marmota, ou uma célula de primata, tal como uma célula de macaco (por exemplo, uma célula de macaco cynomolgus), ou uma célula humana.

[00086] Em algumas modalidades, a célula alvo expressa o mRNA de RTEL1, tal como o pré-mRNA de RTEL1 ou o mRNA maduro de RTEL1. A cauda poli A do mRNA de RTEL1 é normalmente desconsiderada para ter por alvo oligonucleotídeo antissenso.

[00087] Além disso, a célula alvo pode ser um hepatócito. Em uma modalidade, a célula alvo é hepatócitos humanos primários infectados com HBV, derivados de indivíduos infectados com HBV ou de um camundongo infectado com HBV com um fígado humanizado (PhoenixBio, PXB- camundongo).

[00088] De acordo com a presente invenção, a célula alvo pode ser infectada com HBV. Além disso, a célula alvo pode compreender cccDNA de HBV. Assim, a célula alvo compreende preferencialmente mRNA de RTEL1, tal como o pré-mRNA de RTEL1 ou mRNA maduro de RTEL1 e cccDNA de HBV.

VARIANTE DE OCORRÊNCIA NATURAL

[00089] O termo "variante de ocorrência natural" refere-se a variantes do gene RTEL1 ou transcritos que se originam dos mesmos loci genéticos que o ácido nucleico alvo, mas podem diferir, por exemplo, em virtude da degenerescência do código genético causando uma multiplicidade de códons que codificam o mesmo aminoácido, ou devido ao splicing alternativo de pré-mRNA, ou a presença de polimorfismos, tais como polimorfismos de nucleotídeo único (SNPs) e variantes alélicas. Com base na presença da sequência complementar suficiente ao oligonucleotídeo, o oligonucleotídeo da invenção pode, portanto, ter como alvo o ácido nucleico alvo e variantes de ocorrência natural deste.

[00090] Em algumas modalidades, as variantes de ocorrência natural têm pelo menos 95%, tal como pelo menos 98% ou pelo menos 99% de homologia com um ácido nucleico alvo de RTEL1 de mamífero, tal como um ácido nucleico alvo da SEQ ID NO 1 e/ou 2. Em algumas modalidades, as variantes de ocorrência natural têm pelo menos 99% de homologia ao ácido nucleico alvo de RTEL1 de humanos da SEQ ID NO: 1. Em algumas das variantes que ocorrem naturalmente são conhecidos polimorfismos.

MODULAÇÃO DA EXPRESSÃO

[00091] O termo "modulação da expressão", conforme usado no presente documento, deve ser entendido como um termo geral para a capacidade de um oligonucleotídeo de alterar a quantidade de RTEL1 quando comparado com a quantidade de RTEL1 antes da administração do oligonucleotídeo. Alternativamente, a modulação da expressão pode ser determinada por referência a uma experiência de controle. É geralmente entendido que o controle é uma célula individual ou alvo tratada com uma composição salina ou uma célula individual ou alvo tratada com um oligonucleotídeo não direcionado a alvos (simulação).

[00092] Um tipo de modulação é a capacidade de um oligonucleotídeo de inibir, regular negativamente, reduzir, suprimir, remover, parar, bloquear, impedir, diminuir, evitar ou terminar a expressão de RTEL1, por exemplo, pela degradação do mRNA ou bloqueio da transcrição. Outro tipo de modulação é a capacidade de um oligonucleotídeo de restaurar, aumentar ou aperfeiçoar a expressão de RTEL1, por exemplo, por reparo de locais de splicing ou prevenção de splicing, remoção ou bloqueio de mecanismos inibitórios, tais como a repressão de microRNA.

MODIFICAÇÕES POR AÇÚCAR

[00093] O oligonucleotídeo da invenção pode compreender um ou mais nucleosídeos que têm uma fração de açúcar modificada, ou seja, uma modificação da fração de açúcar quando comparada à fração de açúcar ribose encontrada no DNA e no RNA.

[00094] Numerosos nucleosídeos com modificação da fração de açúcar ribose foram feitos, principalmente com o objetivo de aprimorar certas propriedades dos oligonucleotídeos, tais como afinidade e/ou resistência à nuclease.

[00095] Tais modificações incluem aquelas em que a estrutura no anel ribose é modificada, por exemplo, por substituição por um anel hexose (HNA) ou um anel bicíclico, que normalmente tem uma ponte birradical entre os carbonos C2 e C4 no anel ribose (LNA), ou um anel ribose não ligado, que normalmente não tem uma ligação entre os carbonos C2 e C3 (por exemplo, UNA). Outros nucleosídeos modificados com açúcar incluem, por exemplo, ácidos nucleicos de biciclo-hexose (WO2011/017521) ou ácidos nucleicos tricíclicos (WO2013/154798). Os nucleosídeos modificados também incluem nucleosídeos onde a fração de açúcar é substituída por uma fração que não seja de açúcar, por exemplo, no caso de ácidos nucleicos de peptídeo (PNA) ou ácidos nucleicos de morfolino.

[00096] As modificações por açúcar também incluem modificações feitas através da alteração dos grupos substituintes no anel ribose para outros grupos diferentes do hidrogênio, ou o grupo 2'-OH encontrado naturalmente nos nucleosídeos de DNA e RNA. Os substituintes podem, por exemplo, ser introduzidos nas posições 2', 3', 4' ou 5'.

NUCLEOSÍDEOS MODIFICADOS DE ALTA AFINIDADE

[00097] Um nucleosídeo modificado de alta afinidade é um nucleotídeo modificado que, quando incorporado no oligonucleotídeo, aperfeiçoa a afinidade do oligonucleotídeo para seu alvo complementar, por exemplo, conforme medido pela temperatura de fusão (Tm). Um nucleosídeo modificado de alta afinidade da presente invenção resulta preferencialmente em um aumento na o temperatura de fusão entre +0,5 a +12 C, mais o preferencialmente, entre +1,5 a +10 C e, mais preferencialmente, entre +3 a +8oC por nucleosídeo modificado. Numerosos nucleosídeos modificados de alta afinidade são conhecidos na técnica e incluem, por exemplo, muitos nucleosídeos substituídos em 2', bem como ácidos nucleicos bloqueados (LNA) (vide, por exemplo, Freier &

Altmann; Nucl. Acid Res., 1997, 25, 4429-4443 e Uhlmann; Curr. Opinion in Drug Development, 2000, 3(2), 293-213). NUCLEOSÍDEOS MODIFICADOS POR AÇÚCAR EM 2'

[00098] Um nucleosídeo modificado por açúcar em 2' é um nucleosídeo que tem um substituinte diferente de H ou -OH na posição 2' (nucleosídeo substituído em 2') ou compreende um birradical ligado a 2' capaz de formar uma ponte entre o carbono em 2' e um segundo carbono no anel de ribose, tal como os nucleosídeos de LNA (ponte birradical 2' – 4').

[00099] De fato, muito foco foi gasto no desenvolvimento de nucleosídeos substituídos em 2' e vários nucleosídeos substituídos em 2' foram encontrados ter propriedades benéficas quando incorporados em oligonucleotídeos. Por exemplo, o açúcar modificado em 2' pode fornecer afinidade de ligação aperfeiçoada e/ou resistência à nuclease aumentada ao oligonucleotídeo. Exemplos de nucleosídeos modificados substituídos em 2' são nucleosídeos de 2'-O-alquil-RNA, 2'-O-metil-RNA, 2'-alcóxi- RNA, 2'-O-metoxietil-RNA (MOE), 2'-amino-DNA, 2'-Fluoro-RNA e 2'-F-ANA. Para mais exemplos, vide, por exemplo, Freier e Altmann; Nucl. Acid Res., 1997, 25, 4429-4443, e Uhlmann; Curr. Opinion in Drug Development, 2000, 3(2), 293-213 e Deleavey e Damha, Chemistry and Biology 2012, 19, 937. Abaixo estão ilustrações de alguns nucleosídeos modificados substituídos em 2'.

2'-O-Alila 2'-O-Etilamina

[000100] Em relação à presente invenção, os nucleosídeos modificados substituídos em 2' não incluem moléculas em ponte 2' como LNA. NUCLEOSÍDEOS DE ÁCIDO NUCLEICO BLOQUEADO (NUCLEOSÍDEO DE LNA)

[000101] Um "nucleosídeo de LNA" é um nucleosídeo modificado em 2' que compreende uma birradical ligando C2' e C4' do anel de açúcar ribose do referido nucleosídeo (também conhecido como "ponte 2' - 4"), que restringe ou bloqueia a conformação do anel de ribose. Estes nucleosídeos são também denominados como ácido nucleico em ponte ou ácido nucleico bicíclico (BNA) na literatura. O bloqueio da conformação da ribose está associado a uma afinidade aperfeiçoada de hibridação (estabilização do duplex) quando o LNA é incorporado em um oligonucleotídeo para uma molécula de RNA ou DNA complementar. Isto pode ser determinado rotineiramente medindo a temperatura de fusão do duplex de complemento/oligonucleotídeo.

[000102] Os nucleosídeos de LNA exemplares não limitantes são divulgados em WO 99/014226, WO 00/66604, WO 98/039352, WO 2004/046160, WO 00/047599, WO 2007/134181, WO 2010/077578, WO 2010/036698, WO 2007/090071, WO 2009/006478, WO 2011/156202, WO 2008/154401, WO 2009/067647, WO 2008/150729, Morita et al., Bioorganic & Med.Chem. Lett. 12, 73-76, Seth et al. J. Org. Chem. 2010, vol. 75(5), pp. 1569-81, e Mitsuoka et al., Nucleic Acids Research 2009, 37(4), 1225-1238, e Wan e Seth, J. Medical Chemistry, 2016, 59, 9645-9667.

[000103] Exemplos particulares de nucleosídeos de LNA da invenção são apresentados no Esquema 1 (em que B é conforme definido acima). Esquema 1

Z B Z Z Z

B B B O NH S NORa Z* Z* Z* Z* β-D-oxi LNA -D-oxy LNA -D-amino LNA -D-thio β-D-tio β-D-tio LNA

LNA LNA -D-amino LNA substitutída por β-D-amino substituted LNA

B B B Z* O Z* O Z* O

Z Z Z -L-oxy LNA -L-amino LNA α-L-tio α-L-tio LNA -L-thio LNA

LNA α-L-oxi LNA

Z B Z Z Z B B B

O O O O Z* Z* Z* Z* 5'-metil-6'-dimetil-β-D-oxi LNA 6'-metil-β-D-oxi LNA 6'-methyl--D-oxy 6'-dimethyl--D-oxy LNA 6'-dimetil-β-D-oxi LNALNA 5'-methyl--D-oxyLNA 5'-metil-β-D-oxi LNA 5'-methyl-6'-dimethyl--D-oxy LNA

Z Z B

Z B B B Z* O S NRa Z Z* Z* Z* carbocíclico(vinil) LNAcarbocíclico(vinil) -β-D-oxi LNA carbocyclic(vinyl)--D-oxy -α-L-oxi carbocyclic(vinyl)--L-oxy carbocíclico(vinil) LNALNA6'-methyl--D-thio

LNA -α-L-oxi -D-amino

LNALNA 6'-dimetil-β-D-tio LNAsubstituted substitutída por

LNA β-D-amino

Z B Z Z B B

O O O Z* Z* Z* ENA COC (S)-cET

[000104] Os nucleosídeos de LNA particulares são beta-D-oxi-LNA, LNA 6'-metil-beta-D-oxi, tal como (S)-6'- metil-beta-D-oxi-LNA (ScET) e ENA.

SAIS FARMACEUTICAMENTE ACEITÁVEIS

[000105] O termo "sais farmaceuticamente aceitáveis" refere-se aos sais que retêm a eficácia biológica e as propriedades das bases livres ou ácidos livres, que não são biológicos ou indesejáveis.

Os sais são formados com ácidos inorgânicos, tais como ácido clorídrico, ácido bromídrico, ácido sulfúrico, ácido nítrico, ácido fosfórico, particularmente, ácido clorídrico e ácidos orgânicos, tais como ácido acético, ácido propiônico, ácido glicólico, ácido pirúvico, ácido oxálico, ácido maleico, ácido malônico, ácido succínico, ácido fumárico, ácido tartárico, ácido cítrico, ácido benzóico, ácido cinâmico, ácido mandélico, ácido metanossulfônico, ácido etanossulfônico, ácido p-toluenossulfônico, ácido salicílico e N-acetilcisteína.

Além disso, esses sais podem ser preparados a partir da adição de uma base inorgânica ou de uma base orgânica ao ácido livre.

Os sais derivados de uma base inorgânica incluem, entre outros, os sais de sódio, potássio, lítio, amônio, cálcio, magnésio.

Os sais derivados de bases orgânicas incluem, mas não estão limitados a, sais de aminas primárias, secundárias e terciárias, aminas substituídas, incluindo aminas substituídas de ocorrência natural, aminas cíclicas e resinas básicas de troca iônica, tais como resinas de isopropilamina, trimetilamina, dietilamina, trietilamina, tripropilamina, etanolamina, lisina, arginina, N- etilpiperidina, piperidina e poliamina.

O composto de fórmula (I) também pode estar presente na forma de zwitterions.

Os sais farmaceuticamente aceitáveis particularmente preferidos dos compostos da fórmula (I) são os sais de ácido clorídrico, ácido bromídrico, ácido sulfúrico, ácido fosfórico e ácido metanossulfônico.

ATIVIDADE DA RNASE H E RECRUTAMENTO

[000106] A atividade da RNase H de um oligonucleotídeo antissenso refere-se à sua capacidade de recrutar a RNase H quando está em um duplex com uma molécula de RNA complementar. O documento WO01/23613 fornece métodos in vitro para determinar a atividade da RNaseH, que pode ser usada para determinar a capacidade de recrutar a RNaseH. Normalmente, um oligonucleotídeo é considerado capaz de recrutar RNaseH se, quando fornecido com uma sequência complementar de ácido nucleico alvo, tiver uma taxa inicial, conforme medida em pmol/l/min, de pelo menos 5%, tal como pelo menos 10% ou mais de 20% da taxa inicial determinada ao usar um oligonucleotídeo tendo a mesma sequência de base que o oligonucleotídeo modificado sendo testado, mas contendo somente monômeros de DNA com ligações fosforotioato entre todos os monômeros no oligonucleotídeo e usando a metodologia fornecida pelos Exemplos 91 a 95 de WO01/23613 (incorporado neste documento por referência). Para uso na determinação da atividade de RNase H, a RNase H1 humana recombinante está disponível na Creative Biomart® (RNASEH1 Humana Recombinante fundida com a marca His expressa em E. coli).

GAPMER

[000107] O oligonucleotídeo antissenso da invenção, ou sequência de nucleotídeos contígua deste, pode ser um gapmer, também denominado oligonucleotídeo de gapmer ou desenhos de gapmer. Os gapmers antissenso são comumente usados para inibir um ácido nucleico alvo por meio de degradação mediada pela RNase H. Um oligonucleotídeo gapmer compreende pelo menos três regiões estruturais distintas,

um flanco em 5', um gap e um flanco em 3', F-G-F' na orientação ‘5 -> 3’. A região “gap” (G) compreende um trecho de nucleotídeos de DNA contíguos que permitem ao oligonucleotídeo recrutar a RNase H. A região gap é flanqueada por uma região flanqueadora 5' (F) compreendendo um ou mais nucleosídeos modificados por açúcar, de maneira vantajosa, nucleosídeos modificados por açúcar de alta afinidade, e por uma região flanqueadora 3' (F') compreendendo um ou mais nucleosídeos modificados por açúcar, de maneira vantajosa, nucleosídeos modificados por açúcar de alta afinidade. Os um ou mais nucleosídeos modificados por açúcar nas regiões F e F' aperfeiçoam a afinidade do oligonucleotídeo para o ácido nucleico alvo (ou seja, são nucleosídeos modificados por açúcar que aperfeiçoam a afinidade). Em algumas modalidades, os um ou mais nucleosídeos modificados por açúcar nas regiões F e F' são nucleosídeos modificados por açúcar em 2', tais como modificações por açúcar em 2' de alta afinidade, tais como selecionadas independentemente de LNA e 2'-MOE.

[000108] Em um desenho de gapmer, os nucleosídeos de 5' e 3' da região gap são nucleosídeos de DNA e estão posicionados adjacentes a um nucleosídeo modificado por açúcar da região 5' (F) ou 3' (F'), respectivamente. Os flancos podem ainda ser definidos por terem pelo menos um nucleosídeo modificado por açúcar na extremidade mais distante da região gap, ou seja, na extremidade 5' do flanco 5' e na extremidade 3' do flanco 3'.

[000109] As regiões F-G-F' formam uma sequência de nucleotídeo contígua. Os oligonucleotídeos antissenso da invenção, ou a sua sequência de nucleotídeo contígua, podem compreender uma região do gapmer de fórmula F-G-F'.

[000110] O comprimento total do desenho de gapmer F-G-F' pode ser, por exemplo, de 12 a 32 nucleosídeos, tal como 13 a 24 nucleosídeos, tal como 14 a 22 nucleosídeos, tal como de 14 a 17 nucleosídeos, tal como 16 a 18 nucleosídeos.

[000111] A título de exemplo, o oligonucleotídeo gapmer da presente invenção pode ser representado pelas seguintes fórmulas: F1-8-G5-18-F’1-8, tal como F1-8-G5-16-F’1-8, tal como F1-8-G7-16-F’2-8 com a condição de que o comprimento total das regiões do gapmer F-G-F' seja pelo menos 12, tal como pelo menos 14 nucleotídeos de comprimento.

[000112] Em um aspecto da invenção, o oligonucleotídeo antissenso, ou a sequência de nucleotídeo contígua do mesmo, consiste em ou compreende um gapmer da fórmula 5'-F-G-F'-3', onde as regiões F e F' independentemente compreendem ou consistem em 1 a 8 nucleosídeos, de em que 1 q 4 são modificados por açúcar em 2' e definem a extremidade 5' e 3' das regiões F e F', e G é uma região entre 6 e 18, como 6 e 16, nucleosídeos que são capazes de recrutar RNaseH. Em algumas modalidades, a região G consiste em nucleosídeos de DNA.

[000113] As regiões F, G e F' são ainda definidas abaixo e podem ser incorporadas na fórmula F-G- F'.

GAPMER - REGIÃO G

[000114] A região G (região gap) do gapmer é uma região de nucleosídeos que permite ao oligonucleotídeo recrutar a RNaseH, tal como a RNase H1 humana, normalmente nucleosídeos de DNA. A RNaseH é uma enzima celular que reconhece o duplex entre o DNA e o RNA, e quebra enzimaticamente a molécula de RNA. Adequadamente, os gapmers podem ter uma região gap (G) de pelo menos 5 ou 6 nucleosídeos de DNA contíguos, como 5 a 18 nucleosídeos de DNA contíguos, 5 - 17 nucleosídeos de DNA contíguos, tal como 5 a 16 nucleosídeos de DNA contíguos, tal como 6 a 15 nucleosídeos de DNA contíguos, tal como 7 a 14 nucleosídeos de DNA contíguos, tal como 8 a 12 nucleotídeos de DNA contíguos, tal como 8 a 12 nucleotídeos de DNA contíguos de comprimento. A região gap G pode, em algumas modalidades, consistir em 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17 ou 18 nucleosídeos de DNA contíguos. O DNA de citosina (C) na região de gap pode, em alguns casos, ser metilado, tais resíduos são anotados como 5'-metil-citosina (meC ou com um e em vez de um c). A metilação do DNA de citosina no gap é vantajosa se os dinucleotídeos cg estiverem presentes no gap para reduzir a toxicidade potencial, a modificação não tem impacto significativo na eficácia dos oligonucleotídeos. Nucleosídeos de DNA substituídos em 5', tais como nucleosídeo de metila em 5', foram relatados para uso em regiões de gap de DNA (EP 2 742 136).

[000115] Em algumas modalidades, a região de gap G pode consistir em 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17 ou 18 nucleosídeos de DNA contíguos ligados a fosforotioato. Em algumas modalidades, todas as ligações internucleosídicas no gap são ligações de fosforotioato.

[000116] Embora os gapmers tradicionais tenham uma região gap de DNA, existem numerosos exemplos de nucleosídeos modificados que permitem o recrutamento da RNaseH quando são usados na região gap. Os nucleosídeos modificados que foram relatados como sendo capazes de recrutar a RNaseH quando incluídos em uma região gap incluem, por exemplo, alfa-L-LNA, DNA alquilado em C4' (como descrito em PCT/EP2009/050349 e Vester et al., Bioorg. Med. Chem. Lett. 18 (2008) 2296 – 2300, ambos incorporados neste documento por referência), nucleosídeos derivados de arabinose como ANA e 2'F-ANA (Mangos et al., 2003, J. AM. CHEM. SOC. 125, 654-661), UNA (ácido nucleico desbloqueado) (como descrito em Fluiter et al., Mol. Biosyst., 2009, 10, 1039 incorporado neste documento por referência). O UNA é um ácido nucleico desbloqueado, normalmente onde a ligação entre C2 e C3 da ribose foi removida, formando um resíduo de "açúcar" desbloqueado. Os nucleosídeos modificados usados em tais gapmers podem ser nucleosídeos que adotam uma estrutura 2' endo (semelhante a DNA) quando introduzidos na região gap, ou seja, modificações que permitem o recrutamento da RNaseH). Em algumas modalidades, a região gap (G) de DNA descrita neste documento pode opcionalmente conter 1 a 3 nucleosídeos modificados por açúcar que adotam uma estrutura 2' endo (semelhante a DNA) quando introduzidos na região gap. GAPMER - REGIÕES FLANQUEADORAS, F E F'

[000117] A região F está posicionada imediatamente adjacente ao nucleosídeo de DNA 5' da região G. O nucleosídeo em 3' da região F é um nucleosídeo modificado por açúcar, tal como um nucleosídeo modificado por açúcar de alta afinidade, por exemplo um nucleosídeo substituído em 2', tal como um nucleosídeo de MOE ou um nucleosídeo de LNA.

[000118] A região F' é posicionada imediatamente adjacente ao nucleosídeo de DNA 3' da região G. O nucleosídeo em 5' da região F' é um nucleosídeo modificado por açúcar, tal como um nucleosídeo modificado por açúcar de alta afinidade, por exemplo, um nucleosídeo substituído em 2', tal como um nucleosídeo de MOE ou um nucleosídeo de LNA.

[000119] A região F tem 1 a 8 nucleotídeos contíguos de comprimento, tal como 2 a 6 nucleotídeos, tal como 3 a 4 nucleotídeos contíguos de comprimento. De maneira vantajosa, o nucleosídeo em 5' da região F é um nucleosídeo modificado por açúcar. Em algumas modalidades, os dois nucleosídeos em 5' da região F são nucleosídeos modificados por açúcar. Em algumas modalidades, o nucleosídeo em 5' da região F é um nucleosídeo de LNA. Em algumas modalidades, os dois nucleosídeos em 5' da região F são nucleosídeos de LNA. Em algumas modalidades, os dois nucleosídeos em 5' da região F são nucleosídeos substituídos em 2', como dois nucleosídeos em 3' de MOE. Em algumas modalidades, o nucleosídeo em 5' da região F é um nucleosídeo substituído em 2', tal como um nucleosídeo de MOE.

[000120] A região F' tem 2 a 8 nucleotídeos contíguos de comprimento, tal como 3 a 6 nucleotídeos, tal como 4 a 5 nucleotídeos contíguos de comprimento. De maneira vantajosa, o nucleosídeo em 3' da região F' é um nucleosídeo modificado por açúcar. Em algumas modalidades, os dois nucleosídeos em 3' da região F' são nucleosídeos modificados por açúcar. Em algumas modalidades, os dois nucleosídeos em 3' da região F' são nucleosídeos de LNA. Em algumas modalidades, o nucleosídeo em 3' da região F' é um nucleosídeo de LNA. Em algumas modalidades, os dois nucleosídeos em 3' da região F' são nucleosídeos substituídos em 2', tais como dois nucleosídeos em 3' de MOE. Em algumas modalidades, o nucleosídeo em 3' da região F' é um nucleosídeo substituído em 2', tal como um nucleosídeo de MOE.

[000121] Deve notar-se que quando o comprimento da região F ou F' é um, ele é, de maneira vantajosa, um nucleosídeode de LNA.

[000122] Em algumas modalidades, as regiões F e F' consistem independentemente ou compreendem uma sequência contígua de nucleosídeos modificados por açúcar. Em algumas modalidades, os nucleosídeos modificados por açúcar da região F podem ser independentemente selecionados a partir de unidades de 2'-O-alquil-RNA, unidades de 2'-O-metil-RNA, unidades de 2'-amino-DNA, unidades de 2'-fluoro-DNA, unidades de 2'-alcoxi-RNA, unidades de MOE, unidades de LNA, unidades de ácido nucleico arabino (ANA) e unidades 2'-fluoro-ANA.

[000123] Em algumas modalidades, as regiões F e F' independentemente compreendem ambos LNA e um nucleosídeo modificado substituído em 2' (desenho de asa mista).

[000124] Em algumas modalidades, as regiões F e F' consistem de apenas um tipo de nucleosídeos modificados por açúcar, tais como somente MOE, somente LNA beta-D-oxi ou somente ScET. Tais desenhos também são denominados flancos uniformes ou desenho de gapmer uniforme.

[000125] Em algumas modalidades, todos os nucleosídeos da região F ou F', ou F e F', são nucleosídeos de LNA, tais como independentemente selecionados a partir de nucleosídeos de LNA beta-D-oxi, ENA ou ScET. Em algumas modalidades, a região F consiste em 1-5, tal como 2-4, tal como 3-4, tal como 1, 2, 3, 4 ou 5 nucleosídeos de LNA contíguos. Em algumas modalidades, todos os nucleosídeos das regiões F e F' são nucleosídeos de LNA beta-D-oxi.

[000126] Em algumas modalidades, todos os nucleosídeos da região F ou F', ou F e F' são nucleosídeos substituídos em 2', tais como nucleosídeos de OMe ou MOE. Em algumas modalidades, a região F consiste em 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 ou 8 nucleosídeos contíguos de OMe ou MOE. Em algumas modalidades, apenas uma das regiões flanqueadores pode consistir em nucleosídeos substituídos em 2', tais como nucleosídeos de OMe ou MOE. Em algumas modalidades, a região flanqueadora 5' (F) consiste em nucleosídeos substituídos em 2', tais como nucleosídeos de OMe ou MOE, enquanto a região flanqueadora 3' (F') compreende pelo menos um nucleosídeo de LNA, tal como nucleosídeos de LNA beta-D-oxi ou nucleosídeos de cET. Em algumas modalidades, a região flanqueadora 3' (F') que consiste em nucleosídeos substituídos em 2', tais como nucleosídeos de OMe ou MOE, enquanto a região flanqueadora 5' (F) compreende pelo menos um nucleosídeo de LNA, tal como nucleosídeos de LNA beta-D- oxi ou nucleosídeos de cET.

[000127] Em algumas modalidades, todos os nucleosídeos modificados das regiões F e F' são nucleosídeos de LNA, tais como independentemente selecionados a partir de nucleosídeos de LNA beta-D-oxi, ENA ou ScET, em que as regiões F ou F', ou F e F', podem opcionalmente compreender nucleosídeos de DNA (um flanco alternado, vide a definição destes para mais detalhes). Em algumas modalidades, todos os nucleosídeos modificados das regiões F e F' são nucleosídeos de LNA beta-D-oxi, em que as regiões F ou F', ou F e F', podem opcionalmente compreender nucleosídeos de DNA (um flanco alternado, vide a definição destes para mais detalhes).

[000128] Em algumas modalidades, os nucleosídeos em 5' e 3' das regiões F e F' são nucleosídeos de LNA, tais como nucleosídeos de beta-D-oxi-LNA ou nucleosídeos de ScET.

[000129] Em algumas modalidades, a ligação internucleosídica entre a região F e a região G é uma ligação internucleosídica de fosforotioato. Em algumas modalidades, a ligação internucleosídica entre a região F' e a região G é uma ligação internucleosídica de fosforotioato. Em algumas modalidades, as ligações internucleosídicas entre os nucleosídeos da região F ou F' ou F e F' são ligações internucleosídicas de fosforotioato.

GAPMER DE LNA

[000130] Um gapmer de LNA é um gapmer em que uma ou ambas as regiões F e F' compreendem ou consistem de nucleosídeos de LNA. Um gapmer de beta-D-oxi é um gapmer em que uma ou ambas as regiões F e F' compreendem ou consistem de nucleosídeos de LNA beta-D-oxi.

[000131] Em algumas modalidades, o gapmer de LNA é da fórmula: [LNA]1- 5-[região G] -[LNA]1-5, em que a região

G é tal como definida na definição da região G do gapmer.

GAPMERS DE MOE

[000132] Um gapmers de MOE é um gapmer em que as regiões F e F' consistem de nucleosídeos de MOE. Em algumas modalidades, o gapmer de MOE é do desenho [MOE]1-8-[região G]-[MOE] 1-8, tal como [MOE]2-7-[região G]5-16-[MOE] 2-7, tal como [MOE]3-6-[região G]-[MOE] 3-6, em que a região G é como definida na definição do gapmer. Os gapmers de MOE com um desenho 5-10-5 (MOE-DNA-MOE) têm sido amplamente usados na técnica. REGIÃO D' OU D'' EM UM OLIGONUCLEOTÍDEO

[000133] O oligonucleotídeo da invenção pode, em algumas modalidades, compreender ou consistir na sequência de nucleotídeo contígua do oligonucleotídeo que é complementar ao ácido nucleico alvo, tal como o gapmer F-G- F' e outros nucleosídeos em 5' e/ou 3'. Os outros nucleosídeos em 5' e/ou 3' podem ou não ser totalmente complementares ao ácido nucleico alvo. Tais nucleosídeos em 5' e/ou 3' adicionais podem ser referidos neste documento como regiões D' e D''.

[000134] A adição da região D' ou D'' pode ser usada com a finalidade de unir a sequência de nucleotídeo contígua, tal como o gapmer, a uma fração conjugada ou outro grupo funcional. Quando usada para unir a sequência de nucleotídeo contígua a uma fração conjugada, pode servir como um ligante bioclivável. Alternativamente, pode ser usada para fornecer proteção contra exonuclease ou para facilitar a síntese ou fabricação.

[000135] As regiões D' e D'' podem ser anexadsa à extremidade 5' da região F ou à extremidade 3' da região

F', respectivamente, para gerar desenhos das seguintes fórmulas D’-F-G-F’, F-G-F’-D’’ ou

[000136] D’-F-G-F’-D’’. Neste caso, a F-G-F' é a porção do gapmer do oligonucleotídeo e a região D' ou D'' constitui uma parte separada do oligonucleotídeo.

[000137] A região D' ou D'' pode compreender independentemente ou consistir em 1, 2, 3, 4 ou 5 nucleotídeos adicionais, que podem ser complementares ou não complementares ao ácido nucleico alvo. O nucleotídeo adjacente à região F ou F' não é um nucleotídeo modificado por açúcar, tal como um DNA ou RNA ou versões modificadas em base destes. A região D’ ou D’ pode servir como um ligante bioclivável suscetível à nuclease (vide definição de ligantes). Em algumas modalidades, os nucleotídeos terminais adicionais 5' e/ou 3' estão ligados a ligações fosfodiéster e são DNA ou RNA. Os ligantes biocliváveis à base de nucleotídeos adequados para uso como região D' ou D'' são divulgados no documento WO2014/076195, que inclue a título de exemplo um dinucleotídeo de DNA ligado a fosfodiéster. O uso de ligantes biocliváveis em construções de poli-oligonucleotídeo é divulgado no documento WO2015/113922, onde eles são usados para ligar várias construções antissenso (por exemplo, regiões do gapmer) dentro de um único oligonucleotídeo.

[000138] Numa modalidade, o oligonucleotídeo da invenção compreende uma região D' e/ou D'' além da sequência de nucleotídeo contígua que constitui o gapmer.

[000139] Em algumas modalidades, o oligonucleotídeo da presente invenção pode ser representado pelas seguintes fórmulas:

F-G-F', em particular, F1-8-G5-16-F’2-8 D'-F-G-F', em particular, D’1-3-F1-8-G5-16-F’2-8 F-G-F'-D", em particular, F1-8-G5-16-F’2-8-D’’1-3 D'-F-G-F'-D'', em particular, D’1-3- F1-8-G5-16-F’2- 8-D’’1-3

[000140] Em algumas modalidades, a ligação internucleosídica posicionada entre a região D' e a região F é uma ligação de fosfodiéster. Em algumas modalidades, a ligação internucleosídica posicionada entre a região F' e a região D'' é uma ligação de fosfodiéster.

CONJUGADO

[000141] O termo conjugado, conforme usado neste documento, refere-se a um oligonucleotídeo que está covalentemente ligado a uma fração não nucleotídica (fração conjugada, ou região C ou terceira região).

[000142] A conjugação do oligonucleotídeo da invenção a uma ou mais frações não nucleotídicas pode melhorar a farmacologia do oligonucleotídeo, por exemplo, afetando a atividade, distribuição celular, captação celular ou estabilidade do oligonucleotídeo. Em algumas modalidades, a fração conjugada modifica ou aperfeiçoa as propriedades farmacocinéticas do oligonucleotídeo, aprimorando a distribuição celular, biodisponibilidade, metabolismo, excreção, permeabilidade e/ou captação celular do oligonucleotídeo. Em particular, o conjugado pode direcionar o oligonucleotídeo a um órgão, tecido ou tipo celular específicos e, assim, aperfeiçoar a eficácia do oligonucleotídeo nesse órgão, tecido ou tipo de célula. Ao mesmo tempo, o conjugado pode servir para reduzir a atividade do oligonucleotídeo em tipos de células, tecidos ou órgãos não alvo, por exemplo, atividade fora do alvo ou atividade em tipos de células, tecidos ou órgãos não alvo.

[000143] WO 93/07883 e WO2013/033230 proporcionam frações conjugadas adequadas que são aqui incorporadas por referência. Outras frações de conjugado adequadas são aquelas capazes de se ligar ao receptor de asialoglicoproteína (ASGPR). Em particular, frações de conjugado N-acetilgalactosamina tri-valente são adequadas para ligação ao ASGPR, vide por exemplo WO 2014/076196, WO 2014/207232 e WO 2014/179620 (aqui incorporado por referência). Tais conjugados servem para aumentar a absorção do oligonucleotídeo para o fígado enquanto reduz sua presença no rim, aumentando assim a razão fígado/rim de um oligonucleotídeo conjugado em comparação com a versão não conjugada do mesmo oligonucleotídeo.

[000144] Conjugados de oligonucleotídeos e sua síntese também foram relatados em análises abrangentes por Manoharan em Antisense Drug Technology, Principles, Strategies, and Applications, S.T. Crooke, ed., Ch. 16, Marcel Dekker, Inc., 2001 e Manoharan, Antisense and Nucleic Acid Drug Development, 2002, 12, 103, cada um dos quais é incorporado neste documento por referência na sua totalidade.

[000145] Em uma modalidade, a fração não nucleotídica (fração conjugada) é selecionada a partir do grupo que consiste em carboidratos, ligantes receptores da superfície celular, substâncias de fármacos, hormônios, substâncias lipofílicas, polímeros, proteínas, peptídeos, toxinas (por exemplo, toxinas bacterianas), vitaminas, proteínas virais (por exemplo, capsídeos) ou suas combinações.

LIGANTES

[000146] Uma ligação ou ligante é uma conexão entre dois átomos que liga um grupo químico ou segmento de interesse a outro grupo químico ou segmento de interesse por meio de uma ou mais ligações covalentes. As frações conjugadas podem ser ligadas ao oligonucleotídeo diretamente ou através de uma fração de ligação (por exemplo, ligante ou corrente). Os ligantes servem para covalentemente conectar uma terceira região, por exemplo, uma fração conjugada (Região C), a uma primeira região, por exemplo, um oligonucleotídeo ou sequência de nucleotídeos contígua complementar ao ácido nucleico alvo (região A).

[000147] Em algumas modalidades da invenção, o conjugado ou conjugado de oligonucleotídeo da invenção pode, opcionalmente, compreender uma região ligante (segunda região, região B e/ou região Y) que está posicionada entre o oligonucleotídeo ou a sequência de nucleotídeo contígua complementar ao ácido nucleico alvo (região A ou primeira região) e à fração conjugada (região C ou terceira região).

[000148] A região B refere-se a ligantes biocliváveis que compreendem ou consistem de uma ligação fisiologicamente lábil que é clivável sob condições normalmente encontradas ou análogas às encontradas dentro de um corpo de mamífero. As condições sob as quais os ligantes fisiologicamente lábeis sofrem transformação química (por exemplo, clivagem) incluem condições químicas, tais como pH, temperatura, condições ou agentes oxidativos ou redutores, e concentração de sal encontrada ou análoga à encontrada nas células de mamíferos. As condições intracelulares de mamíferos também incluem a presença de atividade enzimática normalmente presente em uma célula de mamífero, tal como a partir de enzimas proteolíticas ou enzimas hidrolíticas ou nucleases. Em uma modalidade, o ligante bioclivável é suscetível à clivagem da nuclease S1. Em uma modalidade preferida, o ligante suscetível à nuclease compreende entre 1 e 10 nucleosídeos, tal como 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 ou 10 nucleosídeos, mais preferencialmente entre 2 e 6 nucleosídeos e mais preferencialmente entre 2 e 4 nucleosídeos ligados compreendendo pelo menos duas ligações fosfodiéster consecutivas, tais como pelo menos 3 ou 4 ou 5 ligações fosfodiéster consecutivas. De preferência, os nucleosídeos são DNA ou RNA. Fosfodiéster contendo ligantes biocliváveis são descritos em mais detalhes em WO 2014/076195 (incorporado neste documento por referência).

[000149] A região Y refere-se a ligantes que não são necessariamente biocliváveis, mas que servem principalmente para covalentemente conectar uma fração conjugada (região C ou terceira região) a um oligonucleotídeo (região A ou primeira região). Os ligantes da região Y podem compreender uma estrutura de cadeia ou um oligômero de unidades de repetição, tais como etilenoglicol, unidades de aminoácidos ou grupos aminoalquila. Os conjugados de oligonucleotídeo da presente invenção podem ser construídos dos seguintes elementos regionais A-C, A-B-C, A-B-Y-C, A-Y-B-C ou A-Y-C. Em algumas modalidades, o ligante (região Y) é um aminoalquila, tal como um grupo aminoalquila C2 - C36, incluindo, por exemplo, grupos aminoalquila C6 a C12. Em uma modalidade preferida, o ligante (região Y) é um grupo amino alquila C6.

TRATAMENTO

[000150] O termo "tratamento', conforme usado no presente documento, refere-se ao tratamento de uma doença existente (por exemplo, uma doença ou distúrbio como aqui referido) ou à prevenção de uma doença, ou seja, profilaxia. Portanto, será reconhecido que o tratamento referido no presente documento pode, em algumas modalidades, ser profilático. Profilático pode ser entendido como a prevenção de uma infecção HBV de se transformar em uma infecção HBV crônica ou a prevenção de doenças hepáticas graves, como cirrose hepática e carcinoma hepatocelular causado por uma infecção HBV crônica.

PREVENÇÃO

[000151] Aqui, o termo “prevenindo”, “prevenção” ou “prevenir” refere-se a um tratamento profilático, ou seja, a uma medida ou procedimento cujo objetivo é prevenir, ao invés de curar uma doença. Prevenção significa que um efeito farmacológico e/ou fisiológico desejado é obtido que é profilático em termos de prevenção completa ou parcial de uma doença ou seu sintoma. Consequentemente, aqui "prevenir uma infecção por HBV" inclui prevenir a ocorrência de uma infecção por HBV em um paciente e prevenir a ocorrência de sintomas de uma infecção por HBV. Na presente invenção, em particular, a prevenção da infecção por HBV em crianças de mães infectadas por HBV é contemplada. Também é contemplada a prevenção de uma infecção HBV aguda que se transforma em uma infecção HBV crônica.

PACIENTE

[000152] Para os fins da presente invenção, o "paciente" (ou "paciente") pode ser um vertebrado. No contexto da presente invenção, o termo "paciente" inclui humanos e outros animais, particularmente mamíferos e outros organismos. Assim, os meios e métodos aqui fornecidos são aplicáveis tanto à terapia humana quanto às aplicações veterinárias. Consequentemente, aqui o indivíduo pode ser um animal, como um camundongo, rato, hamster, coelho, porquinho da índia, furão, gato, cachorro, galinha, ovelha, espécie bovina, cavalo, camelo ou primata. De preferência, o paciente é um mamífero. Mais preferencialmente, o paciente é humano.

DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO

[000153] O cccDNA do HBV em hepatócitos infectados é responsável pela infecção crônica persistente e reativação, sendo o modelo para todos os transcritos subgenômicos virais e RNA pré-genômico (pgRNA) para garantir a progênie viral recém-sintetizada e a reposição do pool de cccDNA por meio da reciclagem do nucleocapsídeo intracelular. No contexto da presente invenção, foi demonstrado pela primeira vez que RTEL1 está associado à estabilidade do cccDNA. Este conhecimento permite a oportunidade de desestabilizar o cccDNA em pacientes infectados com HBV, o que por sua vez abre a oportunidade para uma cura completa de pacientes com HBV cronicamente infectados.

[000154] Um aspecto da presente invenção é um inibidor de RTEL1 para uso no tratamento e/ou prevenção da infecção pelo vírus da Hepatite B (HBV), em particular uma infecção crônica por HBV.

[000155] O inibidor de RTEL1 pode ser, por exemplo, uma pequena molécula que se liga especificamente à proteína RTEL1, em que o referido inibidor evita ou reduz a ligação da proteína RTEL1 ao cccDNA.

[000156] Uma modalidade da invenção é um inibidor de RTEL1 que é capaz de reduzir cccDNA e/ou pgRNA em uma célula infectada, como uma célula infectada por HBV.

[000157] Em uma outra modalidade, o inibidor de RTEL1 é capaz de reduzir HBsAg e/ou HBeAg in vivo em um indivíduo infectado por HBV.

OS OLIGONUCLEOTÍDEOS DA INVENÇÃO

[000158] Os oligonucleotídeos terapêuticos são inibidores de RTEL1 potencialmente excelentes, uma vez que podem ter como alvo o transcrito de RTEL1 e promover sua degradação por meio da via de interferência de RNA ou por clivagem de RNaseH. Alternativamente, oligonucleotídeos como aptâmeros também podem atuar como inibidores de interações de proteínas RTEL1.

[000159] Um aspecto da presente invenção é um oligonucleotídeo direcionado a RTEL1 para uso no tratamento e/ou prevenção da infecção pelo vírus da Hepatite B (HBV). Esse oligonucleotídeo pode ser selecionado do grupo que consiste em oligonucleotídeo antissenso de fita simples; molécula de siRNA; ou molécula de shRNA.

[000160] A presente seção descreve novos oligonucleotídeos adequados para uso no tratamento e/ou prevenção da infecção pelo vírus da Hepatite B (HBV).

[000161] Os oligonucleotídeos da presente invenção são capazes de inibir a expressão de RTEL1 in vitro e in vivo. A inibição é alcançada por hibridização de um oligonucleotídeo com um ácido nucleico alvo que codifica RTEL1 ou que está envolvido na regulação de RTEL1. O ácido nucleico alvo pode ser uma sequência de RTEL1 de mamífero, tal como a sequência da SEQ ID NO: 1 e/ou 2

[000162] Em algumas modalidades, o oligonucleotídeo da invenção é capaz de modular a expressão do alvo inibindo-o ou regulando-o negativamente. De preferência, tal modulação produz uma inibição da expressão de pelo menos 20% em comparação com o nível de expressão normal do alvo, mais preferencialmente, pelo menos 30%, pelo menos 40%, pelo menos 50%, pelo menos 60%, pelo menos 70%, pelo menos 80% ou pelo menos 90% de inibição em comparação com o nível de expressão normal do alvo. Em algumas modalidades, os oligonucleotídeos da invenção podem ser capazes de inibir os níveis de expressão da proteína RTEL1 mRNA em pelo menos 60% ou 70% in vitro usando usando células PXB-PHH 10 µM. Em algumas modalidades, o oligonucleotídeo da invenção pode ser capaz de inibir os níveis de expressão da proteína RTEL1 em pelo menos 50% in vitro usando células PXB-PHH 10 µM, esta faixa de redução alvo é vantajosa em termos de seleção de moléculas de ácido nucleico com boa correlação para a redução de cccDNA. Adequadamente, os exemplos fornecem ensaios que podem ser usados para medir RTEL1 RNA ou inibição de proteína (por exemplo, exemplo 1). A inibição alvo é desencadeada pela hibridação entre uma sequência de nucleotídeo contígua do oligonucleotídeo e do ácido nucleico alvo. Em algumas modalidades, o oligonucleotídeo da invenção compreende incompatibilidades entre o oligonucleotídeo e o ácido nucleico alvo. Apesar das incompatibilidades, a hibridação ao ácido nucleico alvo ainda pode ser suficiente para mostrar uma inibição desejada da expressão de RTEL1. A afinidade de ligação reduzida resultante das incompatibilidades pode ser, de maneira vantajosa, compensada pelo número aumentado de nucleotídeos no oligonucleotídeo e/ou um número aumentado de nucleosídeos modificados capazes de aumentar a afinidade de ligação ao alvo, tais como nucleosídeos modificados por açúcar em 2', incluindo LNA, presentes dentro da sequência de oligonucleotídeo.

[000163] Um aspecto da presente invenção refere- se a um oligonucleotídeos de 12 a 60 nucleotídeos de comprimento, que compreende uma sequência de nucleotídeos contígua de pelo menos 10 nucleotídeos de comprimento, tal como pelo menos 12 a 30 nucleotídeos de comprimento, que é pelo menos 95% complementar, tal como totalmente complementar, a um ácido nucleico alvo RTEL1 de mamífero, em particular um ácido nucleico RTEL1 humano. Esses oligonucleotídeos são capazes de inibir a expressão de RTEL1.

[000164] Um aspecto da invenção refere-se a um oligonucleotídeo de acordo com a invenção que é um oligonucleotídeo antissenso de 12 a 30 nucleotídeos de comprimento, compreendendo uma sequência de nucleotídeos contígua de pelo menos 10 nucleotídeos, tal como 10 a 30 nucleotídeos de comprimento que é pelo menos 90% complementar, tal como totalmente complementar, a um RTEL1 de mamífero.

[000165] Um outro aspecto da presente invenção refere-se a um oligonucleotídeo de acordo com a invenção compreendendo uma sequência de nucleotídeos contígua de 12 a 20, tal como 15 a 22, nucleotídeos de comprimento com pelo menos 90% de complementaridade, tal como totalmente complementar ao nucleico alvo ácido de SEQ ID NO: 1.

[000166] Em algumas modalidades, o oligonucleotídeo compreende uma sequência contígua de 10 a 30 nucleotídeos de comprimento, que é pelo menos 90% complementar, tal como pelo menos 91%, tal como pelo menos 92%, tal como pelo menos 93%, tal como pelo menos 94%, tal como pelo menos 95%, tal como pelo menos 96%, tal como pelo menos 97%, tal como pelo menos 98% ou 100% complementar a uma região do ácido nucleico alvo ou uma sequência alvo.

[000167] É vantajoso se o oligonucleotídeo da invenção, ou sequência de nucleotídeo contígua do mesmo, for totalmente complementar (100% complementar) a uma região do ácido nucleico alvo, ou em algumas modalidades pode compreender uma ou duas incompatibilidades entre o oligonucleotídeo e o ácido nucleico alvo.

[000168] Em algumas modalidades, a sequência de oligonucleotídeo antissenso é 100% complementar a um ácido nucleico alvo correspondente da SEQ ID NO: 1.

[000169] Em algumas modalidades, o oligonucleotídeo ou a sequência de nucleotídeos contígua da invenção é pelo menos 95% de complementaridade, tal como totalmente (ou 100%) complementar, ao ácido nucleico alvo de SEQ ID NO: 1 e SEQ ID NO: 2.

[000170] Em algumas modalidades, o oligonucleotídeo compreende uma sequência de nucleotídeos contígua de 15 a 22 nucleotídeos de comprimento com pelo menos 90% de complementaridade, tal como 100% de complementaridade, para uma sequência alvo correspondente presente na SEQ ID NO: 1, em que a sequência alvo é selecionada a partir do grupo que consiste em SEQ ID NO: 3 a 21 (tabela 4) ou região 1A a 959A na Tabela 5A.

TABELA 5A: REGIÕES DE SEQ ID NO 1 QUE PODEM SER

DIRECIONADAS USANDO UM OLIGONUCLEOTÍDEO DA INVENÇÃO Reg. Posição C Reg. Posição C Reg Posição C

A A na SEQ o na SEQ ID o A na SEQ ID o ID NO: 1 m NO: 1 m NO: 1 m de para p de para p de para p r r r i i i m m m e e e n n n t t t o o o 159 321 1429 1432 641 2449 2451 1A 4 1623 30 A 5 0 26 A 9 4 16 163 322 1430 1435 642 2456 2457 2A 6 1685 50 A 8 2 45 A 0 5 16 168 323 1432 1435 643 2462 2463 3A 7 1708 22 A 3 2 30 A 1 6 16 177 324 1432 1435 644 2468 2469 4A 3 1794 22 A 6 2 27 A 2 7 16

Reg. Posição C Reg. Posição C Reg Posição C

A A na SEQ o na SEQ ID o A na SEQ ID o ID NO: 1 m NO: 1 m NO: 1 m de para p de para p de para p r r r i i i m m m e e e n n n t t t o o o 181 325 1433 1435 645 2471 2475 5A 0 1824 15 A 4 1 18 A 7 3 37 182 326 1434 1436 646 2484 2485 6A 4 1870 47 A 0 4 25 A 2 7 16 289 327 1434 1435 647 2490 2491 7A 0 2907 18 A 0 9 20 A 2 8 17 293 328 1434 1436 648 2493 2496 8A 1 2952 22 A 8 2 15 A 2 2 31 298 329 1437 1440 649 2501 2505 9A 4 2999 16 A 4 6 33 A 8 6 39 300 330 1441 1444 650 2516 2517 10A 2 3021 20 A 6 6 31 A 0 6 17 302 331 1446 1448 651 2521 2525 11A 6 3081 56 A 2 9 28 A 9 1 33 308 332 1450 1452 652 2525 2527 12A 3 3100 18 A 5 1 17 A 9 8 20 317 333 1452 1454 653 2533 2534 13A 5 3202 28 A 3 1 19 A 2 6 15

Reg. Posição C Reg. Posição C Reg Posição C

A A na SEQ o na SEQ ID o A na SEQ ID o ID NO: 1 m NO: 1 m NO: 1 m de para p de para p de para p r r r i i i m m m e e e n n n t t t o o o 320 334 1457 1459 654 2536 2537 14A 5 3228 24 A 7 8 22 A 3 9 17 325 335 1472 1476 655 2536 2538 15A 3 3270 18 A 5 2 38 A 7 3 17 328 336 1476 1478 656 2540 2543 16A 9 3320 32 A 4 1 18 A 5 5 31 335 337 1478 1480 657 2540 2543 17A 3 3368 16 A 3 8 26 A 5 6 32 337 338 1487 1490 658 2540 2542 18A 4 3388 15 A 4 5 32 A 7 5 19 344 339 1497 1503 659 2541 2543 19A 3 3472 30 A 4 0 57 A 0 6 27 352 340 1503 1505 660 2541 2543 20A 5 3547 23 A 2 9 28 A 8 5 18 354 341 1508 1509 661 2547 2549 21A 9 3581 33 A 4 8 15 A 5 5 21 358 342 1508 1510 662 2550 2551 22A 4 3612 29 A 7 6 20 A 2 8 17

Reg. Posição C Reg. Posição C Reg Posição C

A A na SEQ o na SEQ ID o A na SEQ ID o ID NO: 1 m NO: 1 m NO: 1 m de para p de para p de para p r r r i i i m m m e e e n n n t t t o o o 364 343 1510 1512 663 2555 2558 23A 8 3675 28 A 8 6 19 A 9 2 24 368 344 1514 1518 664 2559 2564 24A 1 3708 28 A 7 0 34 A 6 0 45 371 345 1518 1520 665 2567 2568 25A 6 3731 16 A 3 2 20 A 1 8 18 373 346 1523 1524 666 2579 2581 26A 3 3755 23 A 0 7 18 A 6 6 21 375 347 1525 1527 667 2581 2583 27A 7 3775 19 A 5 0 16 A 8 2 15 379 348 1527 1529 668 2583 2585 28A 7 3811 15 A 2 8 27 A 4 7 24 382 349 1528 1531 669 2586 2588 29A 3 3844 22 A 8 2 25 A 7 1 15 384 350 1531 1534 670 2592 2594 30A 6 3881 36 A 9 9 31 A 8 3 16 392 351 1535 1537 671 2598 2600 31A 2 3955 34 A 9 3 15 A 6 1 16

Reg. Posição C Reg. Posição C Reg Posição C

A A na SEQ o na SEQ ID o A na SEQ ID o ID NO: 1 m NO: 1 m NO: 1 m de para p de para p de para p r r r i i i m m m e e e n n n t t t o o o 395 352 1537 1538 672 2601 2603 32A 7 3975 19 A 0 5 16 A 4 7 24 401 353 1538 1540 673 2618 2621 33A 6 4036 21 A 2 0 19 A 7 0 24 403 354 1538 1540 674 2621 2622 34A 8 4053 16 A 8 8 21 A 2 8 17 406 355 1541 1543 675 2626 2628 35A 7 4098 32 A 0 5 26 A 8 6 19 410 356 1543 1545 676 2630 2631 36A 0 4150 51 A 5 2 18 A 0 9 20 427 357 1545 1549 677 2635 2639 37A 1 4290 20 A 6 8 43 A 9 4 36 431 358 1545 1547 678 2639 2642 38A 2 4330 19 A 9 4 16 A 6 6 31 434 359 1547 1549 679 2646 2648 39A 5 4362 18 A 9 8 20 A 5 2 18 436 360 1548 1550 680 2650 2652 40A 4 4379 16 A 6 2 17 A 5 9 25

Reg. Posição C Reg. Posição C Reg Posição C

A A na SEQ o na SEQ ID o A na SEQ ID o ID NO: 1 m NO: 1 m NO: 1 m de para p de para p de para p r r r i i i m m m e e e n n n t t t o o o 442 361 1552 1554 681 2654 2656 41A 0 4448 29 A 8 3 16 A 7 5 19 448 362 1554 1556 682 2657 2660 42A 0 4512 33 A 3 1 19 A 6 0 25 452 363 1557 1559 683 2658 2660 43A 7 4552 26 A 2 1 20 A 8 3 16 465 364 1562 1564 684 2658 2660 44A 1 4674 24 A 3 2 20 A 8 6 19 473 365 1564 1566 685 2660 2662 45A 3 4784 52 A 6 0 15 A 9 4 16 478 366 1566 1569 686 2661 2663 46A 6 4811 26 A 2 0 29 A 5 8 24 483 367 1570 1574 687 2661 2664 47A 0 4848 19 A 2 0 39 A 5 2 28 485 368 1574 1575 688 2663 2666 48A 7 4874 18 A 0 4 15 A 2 9 38 491 369 1574 1577 689 2664 2666 49A 5 4937 23 A 3 3 31 A 9 9 21

Reg. Posição C Reg. Posição C Reg Posição C

A A na SEQ o na SEQ ID o A na SEQ ID o ID NO: 1 m NO: 1 m NO: 1 m de para p de para p de para p r r r i i i m m m e e e n n n t t t o o o 494 370 1574 1576 690 2665 2667 50A 4 4966 23 A 6 1 16 A 8 2 15 496 371 1576 1578 691 2669 2671 51A 9 4983 15 A 4 9 26 A 5 6 22 499 372 1577 1580 692 2670 2672 52A 5 5015 21 A 7 3 27 A 6 5 20 501 373 1579 1581 693 2671 2673 53A 7 5033 17 A 1 6 26 A 3 5 23 503 374 1583 1584 694 2671 2673 54A 5 5075 41 A 2 8 17 A 5 3 19 510 375 1585 1587 695 2673 2676 55A 9 5136 28 A 5 3 19 A 7 8 32 515 376 1587 1589 696 2675 2677 56A 5 5173 19 A 0 0 21 A 5 0 16 517 377 1587 1590 697 2675 2678 57A 5 5191 17 A 8 8 31 A 6 9 34 520 378 1588 1589 698 2675 2678 58A 9 5225 17 A 0 8 19 A 9 9 31

Reg. Posição C Reg. Posição C Reg Posição C

A A na SEQ o na SEQ ID o A na SEQ ID o ID NO: 1 m NO: 1 m NO: 1 m de para p de para p de para p r r r i i i m m m e e e n n n t t t o o o 524 379 1589 1590 699 2678 2681 59A 1 5261 21 A 1 8 18 A 7 3 27 526 380 1589 1591 700 2679 2681 60A 3 5287 25 A 6 6 21 A 5 2 18 529 381 1591 1592 701 2681 2682 61A 9 5346 48 A 1 9 19 A 5 9 15 539 382 1591 1593 702 2686 2688 62A 4 5409 16 A 1 0 20 A 1 0 20 542 383 1594 1596 703 2686 2688 63A 8 5447 20 A 7 3 17 A 2 2 21 547 384 1602 1605 704 2686 2688 64A 2 5514 43 A 3 6 34 A 5 3 19 557 385 1606 1609 705 2686 2688 65A 9 5606 28 A 8 1 24 A 8 3 16 561 386 1608 1609 706 2687 2688 66A 7 5632 16 A 3 7 15 A 0 5 16 569 387 1612 1615 707 2687 2689 67A 0 5711 22 A 9 0 22 A 1 2 22

Reg. Posição C Reg. Posição C Reg Posição C

A A na SEQ o na SEQ ID o A na SEQ ID o ID NO: 1 m NO: 1 m NO: 1 m de para p de para p de para p r r r i i i m m m e e e n n n t t t o o o 571 388 1617 1622 708 2688 2689 68A 3 5754 42 A 0 9 60 A 0 8 19 572 389 1624 1626 709 2688 2691 69A 7 5741 15 A 5 5 21 A 9 0 22 575 390 1626 1630 710 2690 2692 70A 6 5770 15 A 9 0 32 A 8 4 17 581 391 1630 1633 711 2691 2693 71A 2 5854 43 A 8 4 27 A 7 9 23 587 392 1633 1635 712 2694 2696 72A 1 5886 16 A 6 6 21 A 8 2 15 589 393 1633 1635 713 2695 2697 73A 6 5932 37 A 6 8 23 A 5 3 19 599 394 1636 1639 714 2709 2711 74A 2 6009 18 A 0 1 32 A 7 3 17 601 395 1636 1639 715 2710 2712 75A 1 6038 28 A 0 7 38 A 1 8 28 605 396 1642 1646 716 2711 2712 76A 7 6072 16 A 5 5 41 A 2 7 16

Reg. Posição C Reg. Posição C Reg Posição C

A A na SEQ o na SEQ ID o A na SEQ ID o ID NO: 1 m NO: 1 m NO: 1 m de para p de para p de para p r r r i i i m m m e e e n n n t t t o o o 610 397 1647 1649 717 2711 2718 77A 1 6122 22 A 2 3 22 A 6 3 68 612 398 1649 1651 718 2713 2716 78A 7 6165 39 A 8 5 18 A 3 5 33 618 399 1654 1656 719 2718 2720 79A 7 6203 17 A 5 2 18 A 8 9 22 621 400 1656 1658 720 2721 2723 80A 0 6227 18 A 4 6 23 A 8 2 15 624 401 1658 1661 721 2721 2723 81A 3 6261 19 A 8 3 26 A 8 4 17 627 402 1661 1663 722 2723 2725 82A 1 6299 29 A 5 9 25 A 5 3 19 637 403 1665 1666 723 2723 2725 83A 8 6393 16 A 1 7 17 A 7 3 17 646 404 1666 1669 724 2723 2725 84A 8 6496 29 A 9 5 27 A 7 1 15 649 405 1669 1671 725 2723 2725 85A 8 6526 29 A 6 6 21 A 7 2 16

Reg. Posição C Reg. Posição C Reg Posição C

A A na SEQ o na SEQ ID o A na SEQ ID o ID NO: 1 m NO: 1 m NO: 1 m de para p de para p de para p r r r i i i m m m e e e n n n t t t o o o 655 406 1670 1671 726 2723 2725 86A 8 6574 17 A 4 8 15 A 8 4 17 672 407 1673 1676 727 2723 2725 87A 0 6737 18 A 2 0 29 A 8 2 15 673 408 1673 1676 728 2723 2725 88A 5 6749 15 A 7 0 24 A 8 3 16 678 409 1684 1686 729 2723 2725 89A 5 6825 41 A 9 5 17 A 9 5 17 687 410 1685 1686 730 2723 2725 90A 9 6894 16 A 3 8 16 A 9 3 15 692 411 1685 1686 731 2723 2725 91A 1 6959 39 A 3 7 15 A 9 4 16 699 412 1688 1689 732 2724 2725 92A 5 7060 66 A 2 7 16 A 0 4 15 706 413 1688 1690 733 2724 2725 93A 2 7084 23 A 5 2 18 A 0 5 16 711 414 1691 1693 734 2724 2725 94A 4 7146 33 A 4 8 25 A 1 5 15

Reg. Posição C Reg. Posição C Reg Posição C

A A na SEQ o na SEQ ID o A na SEQ ID o ID NO: 1 m NO: 1 m NO: 1 m de para p de para p de para p r r r i i i m m m e e e n n n t t t o o o 715 415 1694 1695 735 2726 2732 95A 5 7186 32 A 2 6 15 A 9 0 52 718 416 1699 1700 736 2728 2729 96A 8 7203 16 A 0 4 15 A 1 7 17 723 417 1701 1704 737 2728 2730 97A 0 7267 38 A 6 2 27 A 6 7 22 728 418 1709 1711 738 2734 2735 98A 1 7299 19 A 7 5 19 A 0 8 19 729 419 1710 1711 739 2736 2740 99A 1 7316 26 A 5 9 15 A 0 4 45 734 420 1710 1712 740 2741 2743 100A 4 7369 26 A 5 6 22 A 1 8 28 737 421 1711 1712 741 2745 2747 101A 5 7391 17 A 4 8 15 A 8 4 17 740 422 1713 1715 742 2753 2757 102A 0 7414 15 A 3 8 26 A 1 2 42 742 423 1716 1717 743 2757 2760 103A 7 7441 15 A 0 4 15 A 5 0 26

Reg. Posição C Reg. Posição C Reg Posição C

A A na SEQ o na SEQ ID o A na SEQ ID o ID NO: 1 m NO: 1 m NO: 1 m de para p de para p de para p r r r i i i m m m e e e n n n t t t o o o 743 424 1716 1717 744 2760 2761 104A 7 7453 17 A 2 8 17 A 2 6 15 744 425 1716 1718 745 2761 2763 105A 9 7463 15 A 6 3 18 A 8 7 20 746 426 1717 1719 746 2767 2768 106A 7 7481 15 A 8 9 22 A 0 4 15 750 427 1718 1720 747 2770 2772 107A 0 7518 19 A 7 1 15 A 7 1 15 753 428 1720 1722 748 2772 2774 108A 2 7546 15 A 3 3 21 A 3 7 25 757 429 1721 1723 749 2777 2781 109A 3 7587 15 A 3 0 18 A 2 6 45 760 430 1721 1723 750 2777 2779 110A 7 7621 15 A 3 5 23 A 2 0 19 765 431 1723 1725 751 2782 2784 111A 9 7685 27 A 7 9 23 A 9 7 19 773 432 1724 1727 752 2785 2786 112A 2 7767 36 A 9 9 31 A 0 8 19

Reg. Posição C Reg. Posição C Reg Posição C

A A na SEQ o na SEQ ID o A na SEQ ID o ID NO: 1 m NO: 1 m NO: 1 m de para p de para p de para p r r r i i i m m m e e e n n n t t t o o o 777 433 1726 1728 753 2787 2790 113A 9 7793 15 A 7 5 19 A 0 5 36 784 434 1727 1728 754 2792 2794 114A 4 7882 39 A 3 8 16 A 7 2 16 788 435 1729 1731 755 2796 2798 115A 8 7910 23 A 7 5 19 A 3 7 25 796 436 1730 1731 756 2798 2808 116A 6 7980 15 A 0 5 16 A 9 3 95 803 437 1730 1731 757 2808 2810 117A 3 8047 15 A 2 7 16 A 5 3 19 804 438 1730 1732 758 2812 2813 118A 9 8063 15 A 3 4 22 A 0 8 19 816 439 1731 1733 759 2816 2818 119A 0 8178 19 A 2 0 19 A 7 8 22 818 440 1734 1737 760 2819 2820 120A 0 8195 16 A 6 5 30 A 0 7 18 821 441 1734 1737 761 2820 2823 121A 6 8237 22 A 9 5 27 A 9 1 23

Reg. Posição C Reg. Posição C Reg Posição C

A A na SEQ o na SEQ ID o A na SEQ ID o ID NO: 1 m NO: 1 m NO: 1 m de para p de para p de para p r r r i i i m m m e e e n n n t t t o o o 823 10 442 1735 1737 762 2823 2825 122A 9 8341 3 A 7 4 18 A 4 0 17 835 443 1736 1738 763 2826 2830 123A 7 8373 17 A 3 2 20 A 0 3 44 841 444 1737 1738 764 2842 2844 124A 5 8430 16 A 1 5 15 A 7 4 18 844 445 1742 1744 765 2844 2846 125A 9 8465 17 A 0 7 28 A 6 2 17 854 446 1752 1755 766 2846 2848 126A 1 8560 20 A 4 1 28 A 4 4 21 857 447 1756 1758 767 2850 2851 127A 4 8596 23 A 2 0 19 A 3 9 17 867 448 1762 1763 768 2852 2853 128A 7 8703 27 A 2 6 15 A 1 6 16 870 449 1770 1773 769 2853 2856 129A 5 8722 18 A 2 4 33 A 8 5 28 874 450 1773 1774 770 2859 2861 130A 8 8763 16 A 0 5 16 A 5 2 18

Reg. Posição C Reg. Posição C Reg Posição C

A A na SEQ o na SEQ ID o A na SEQ ID o ID NO: 1 m NO: 1 m NO: 1 m de para p de para p de para p r r r i i i m m m e e e n n n t t t o o o 879 451 1773 1775 771 2869 2870 131A 2 8807 16 A 3 5 23 A 4 9 16 879 452 1774 1775 772 2870 2871 132A 6 8811 16 A 3 8 16 A 1 5 15 879 453 1781 1782 773 2871 2875 133A 9 8818 20 A 0 4 15 A 5 1 37 880 454 1790 1794 774 2880 2882 134A 7 8821 15 A 0 0 41 A 1 5 25 881 455 1794 1796 775 2883 2884 135A 4 8828 15 A 2 8 27 A 2 6 15 883 456 1798 1800 776 2884 2887 136A 7 8853 17 A 8 2 15 A 6 0 25 883 457 1800 1802 777 2887 2889 137A 7 8851 15 A 7 4 18 A 8 3 16 884 458 1802 1804 778 2889 2891 138A 1 8858 18 A 6 2 17 A 5 1 17 888 459 1804 1805 779 2893 2896 139A 4 8911 28 A 4 9 16 A 8 1 24

Reg. Posição C Reg. Posição C Reg Posição C

A A na SEQ o na SEQ ID o A na SEQ ID o ID NO: 1 m NO: 1 m NO: 1 m de para p de para p de para p r r r i i i m m m e e e n n n t t t o o o 891 460 1812 1815 780 2901 2902 140A 8 8937 20 A 6 9 34 A 0 5 16 891 461 1817 1820 781 2905 2907 141A 8 8933 16 A 9 5 27 A 7 2 16 896 462 1823 1825 782 2911 2913 142A 9 9005 37 A 7 3 17 A 9 4 16 896 463 1827 1829 783 2917 2919 143A 9 8999 31 A 2 0 19 A 9 3 15 896 464 1829 1831 784 2923 2925 144A 9 9000 32 A 9 4 16 A 5 6 22 897 465 1832 1834 785 2933 2934 145A 1 8989 19 A 8 4 17 A 0 9 20 897 466 1832 1834 786 2936 2938 146A 4 9000 27 A 9 4 16 A 7 1 15 898 467 1834 1836 787 2953 2955 147A 2 8999 18 A 7 1 15 A 0 6 27 902 468 1838 1840 788 2958 2960 148A 4 9042 19 A 0 2 23 A 7 5 19

Reg. Posição C Reg. Posição C Reg Posição C

A A na SEQ o na SEQ ID o A na SEQ ID o ID NO: 1 m NO: 1 m NO: 1 m de para p de para p de para p r r r i i i m m m e e e n n n t t t o o o 902 469 1838 1839 789 2965 2969 149A 6 9042 17 A 5 9 15 A 2 2 41 902 470 1840 1842 790 2969 2971 150A 6 9040 15 A 6 1 16 A 5 0 16 902 471 1844 1847 791 2972 2974 151A 6 9041 16 A 6 3 28 A 2 2 21 902 472 1852 1854 792 2974 2976 152A 7 9043 17 A 7 3 17 A 3 8 26 902 473 1855 1856 793 2977 2979 153A 7 9041 15 A 4 9 16 A 0 7 28 902 474 1863 1864 794 2981 2983 154A 7 9042 16 A 1 5 15 A 8 6 19 902 475 1867 1869 795 2983 2987 155A 8 9044 17 A 3 3 21 A 8 3 36 902 476 1874 1876 796 2987 2994 156A 8 9042 15 A 6 5 20 A 5 6 72 902 477 1879 1882 797 2994 2998 157A 8 9043 16 A 7 4 28 A 8 3 36

Reg. Posição C Reg. Posição C Reg Posição C

A A na SEQ o na SEQ ID o A na SEQ ID o ID NO: 1 m NO: 1 m NO: 1 m de para p de para p de para p r r r i i i m m m e e e n n n t t t o o o 902 478 1884 1886 798 3002 3004 158A 9 9045 17 A 2 0 19 A 8 8 21 902 479 1887 1889 799 3004 3006 159A 9 9043 15 A 2 2 21 A 6 0 15 902 480 1890 1891 800 3005 3006 160A 9 9044 16 A 1 5 15 A 1 7 17 903 481 1890 1894 801 3006 3009 161A 0 9046 17 A 1 0 40 A 9 0 22 903 482 1894 1897 802 3009 3010 162A 0 9044 15 A 2 6 35 A 3 7 15 903 483 1895 1897 803 3011 3013 163A 0 9045 16 A 1 6 26 A 6 6 21 903 484 1897 1899 804 3013 3020 164A 1 9047 17 A 1 4 24 A 8 2 65 903 485 1899 1901 805 3022 3026 165A 1 9045 15 A 8 6 19 A 0 2 43 903 486 1902 1903 806 3030 3032 166A 1 9046 16 A 0 9 20 A 3 0 18

Reg. Posição C Reg. Posição C Reg Posição C

A A na SEQ o na SEQ ID o A na SEQ ID o ID NO: 1 m NO: 1 m NO: 1 m de para p de para p de para p r r r i i i m m m e e e n n n t t t o o o 903 487 1902 1904 807 3034 3037 167A 2 9048 17 A 7 3 17 A 9 2 24 903 488 1902 1905 808 3038 3041 168A 2 9046 15 A 7 0 24 A 7 8 32 903 489 1908 1910 809 3041 3044 169A 2 9047 16 A 8 2 15 A 7 1 25 903 490 1910 1912 810 3047 3051 170A 3 9047 15 A 9 9 21 A 6 6 41 903 491 1912 1914 811 3052 3057 171A 3 9048 16 A 8 5 18 A 4 6 53 903 492 1924 1925 812 3060 3062 172A 4 9048 15 A 0 8 19 A 2 8 27 903 493 1928 1936 813 3065 3068 173A 8 9052 15 A 0 6 87 A 8 0 23 904 494 1937 1938 814 3068 3074 174A 6 9064 19 A 2 7 16 A 2 7 66 906 495 1942 1944 815 3074 3079 175A 9 9090 22 A 2 4 23 A 9 9 51

Reg. Posição C Reg. Posição C Reg Posição C

A A na SEQ o na SEQ ID o A na SEQ ID o ID NO: 1 m NO: 1 m NO: 1 m de para p de para p de para p r r r i i i m m m e e e n n n t t t o o o 907 496 1944 1946 816 3080 3082 176A 4 9089 16 A 6 2 17 A 1 1 21 907 497 1948 1950 817 3082 3084 177A 8 9093 16 A 9 6 18 A 3 4 22 909 498 1954 1957 818 3090 3092 178A 5 9110 16 A 6 1 26 A 8 2 15 910 499 1959 1961 819 3092 3098 179A 1 9124 24 A 7 5 19 A 4 0 57 912 500 1962 1964 820 3102 3104 180A 6 9161 36 A 4 8 25 A 7 5 19 913 501 1968 1969 821 3104 3108 181A 5 9155 21 A 0 5 16 A 7 0 34 914 502 1971 1972 822 3108 3111 182A 7 9162 16 A 3 7 15 A 6 3 28 916 503 1977 1979 823 3112 3114 183A 3 9186 24 A 5 2 18 A 8 6 19 920 504 1978 1980 824 3115 3116 184A 3 9222 20 A 9 3 15 A 0 4 15

Reg. Posição C Reg. Posição C Reg Posição C

A A na SEQ o na SEQ ID o A na SEQ ID o ID NO: 1 m NO: 1 m NO: 1 m de para p de para p de para p r r r i i i m m m e e e n n n t t t o o o 921 505 1981 1982 825 3116 3119 185A 0 9253 44 A 1 5 15 A 6 3 28 921 506 1983 1986 826 3122 3127 186A 0 9230 21 A 8 2 25 A 9 1 43 922 507 2024 2025 827 3127 3131 187A 3 9254 32 A 1 7 17 A 6 0 35 924 508 2025 2029 828 3131 3133 188A 1 9256 16 A 9 0 32 A 2 3 22 925 509 2030 2038 829 3140 3141 189A 8 9272 15 A 9 1 73 A 0 7 18 926 510 2040 2041 830 3141 3143 190A 6 9303 38 A 4 9 16 A 9 3 15 929 511 2047 2049 831 3145 3147 191A 1 9308 18 A 0 2 23 A 6 0 15 931 512 2049 2055 832 3151 3156 192A 1 9329 19 A 5 7 63 A 7 9 53 937 513 2059 2060 833 3157 3159 193A 0 9394 25 A 3 9 17 A 8 9 22

Reg. Posição C Reg. Posição C Reg Posição C

A A na SEQ o na SEQ ID o A na SEQ ID o ID NO: 1 m NO: 1 m NO: 1 m de para p de para p de para p r r r i i i m m m e e e n n n t t t o o o 940 514 2062 2064 834 3166 3168 194A 6 9420 15 A 6 6 21 A 1 9 29 956 515 2064 2066 835 3170 3173 195A 9 9591 23 A 8 9 22 A 6 9 34 965 516 2068 2069 836 3174 3176 196A 3 9708 56 A 3 9 17 A 1 3 23 971 517 2071 2073 837 3176 3180 197A 2 9758 47 A 8 5 18 A 5 5 41 977 518 2074 2076 838 3180 3185 198A 1 9788 18 A 9 5 17 A 7 5 49 981 519 2075 2076 839 3181 3183 199A 2 9829 18 A 1 5 15 A 9 4 16 984 520 2076 2078 840 3185 3186 200A 4 9862 19 A 9 5 17 A 1 6 16 987 521 2077 2079 841 3185 3187 201A 2 9917 46 A 3 1 19 A 7 2 16 995 522 2077 2079 842 3193 3198 202A 8 9983 26 A 7 8 22 A 8 4 47

Reg. Posição C Reg. Posição C Reg Posição C

A A na SEQ o na SEQ ID o A na SEQ ID o ID NO: 1 m NO: 1 m NO: 1 m de para p de para p de para p r r r i i i m m m e e e n n n t t t o o o 998 1000 523 2077 2079 843 3198 3203 203A 5 2 18 A 9 8 20 A 6 2 47 100 1005 524 2077 2079 844 3203 3207 204A 17 4 38 A 9 7 19 A 4 1 38 101 1013 525 2079 2081 845 3208 3209 205A 13 2 20 A 8 9 22 A 2 7 16 101 1013 526 2080 2081 846 3212 3215 206A 13 0 18 A 0 9 20 A 4 1 28 101 1013 527 2080 2081 847 3219 3221 207A 20 7 18 A 0 8 19 A 7 6 20 101 1020 528 2081 2084 848 3223 3226 208A 83 4 22 A 9 0 22 A 3 2 30 101 1020 529 2081 2085 849 3226 3228 209A 85 4 20 A 9 3 35 A 4 9 26 101 1020 530 2082 2084 850 3230 3232 210A 85 2 18 A 1 0 20 A 6 5 20 101 1020 531 2082 2085 851 3235 3240 211A 92 9 18 A 1 3 33 A 7 8 52

Reg. Posição C Reg. Posição C Reg Posição C

A A na SEQ o na SEQ ID o A na SEQ ID o ID NO: 1 m NO: 1 m NO: 1 m de para p de para p de para p r r r i i i m m m e e e n n n t t t o o o 101 1021 532 2082 2083 852 3241 3245 212A 92 0 19 A 1 9 19 A 0 9 50 102 1025 533 2083 2085 853 3247 3249 213A 31 1 21 A 3 1 19 A 4 2 19 102 1025 534 2083 2085 854 3249 3250 214A 36 1 16 A 3 5 23 A 4 8 15 103 1033 535 2084 2086 855 3252 3254 215A 20 7 18 A 1 4 24 A 7 3 17 103 1035 536 2085 2086 856 3254 3256 216A 38 3 16 A 5 9 15 A 5 0 16 103 1041 537 2086 2089 857 3257 3263 217A 97 5 19 A 6 5 30 A 0 6 67 105 1058 538 2088 2090 858 3269 3271 218A 63 4 22 A 1 2 22 A 7 3 17 105 1060 539 2088 2091 859 3274 3276 219A 91 7 17 A 1 5 35 A 4 5 22 107 1072 540 2088 2090 860 3280 3282 220A 03 3 21 A 3 2 20 A 1 3 23

Reg. Posição C Reg. Posição C Reg Posição C

A A na SEQ o na SEQ ID o A na SEQ ID o ID NO: 1 m NO: 1 m NO: 1 m de para p de para p de para p r r r i i i m m m e e e n n n t t t o o o 107 1078 541 2088 2091 861 3286 3289 221A 66 4 19 A 3 5 33 A 5 2 28 108 1082 542 2088 2090 862 3294 3295 222A 05 2 18 A 3 1 19 A 4 9 16 108 1087 543 2089 2091 863 3296 3298 223A 44 0 27 A 5 3 19 A 2 5 24 108 1089 544 2089 2091 864 3299 3310 10 224A 73 3 21 A 5 7 23 A 8 4 7 108 1091 545 2090 2092 865 3312 3314 225A 95 3 19 A 3 6 24 A 6 0 15 109 1094 546 2091 2093 866 3314 3319 226A 15 2 28 A 7 1 15 A 2 4 53 109 1097 547 2092 2094 867 3321 3325 227A 61 5 15 A 8 6 19 A 3 2 40 109 1099 548 2093 2095 868 3327 3329 228A 83 9 17 A 7 1 15 A 7 8 22 110 1101 549 2095 2097 869 3331 3336 229A 01 5 15 A 5 3 19 A 8 5 48

Reg. Posição C Reg. Posição C Reg Posição C

A A na SEQ o na SEQ ID o A na SEQ ID o ID NO: 1 m NO: 1 m NO: 1 m de para p de para p de para p r r r i i i m m m e e e n n n t t t o o o 110 1103 550 2097 2099 870 3337 3339 230A 21 5 15 A 5 3 19 A 5 0 16 110 1105 551 2097 2099 871 3340 3341 231A 33 9 27 A 5 7 23 A 2 7 16 110 1108 552 2098 2100 872 3341 3344 232A 61 2 22 A 3 4 22 A 9 3 25 110 1110 553 2098 2101 873 3345 3348 233A 84 4 21 A 3 7 35 A 6 8 33 111 1115 554 2098 2100 874 3350 3354 234A 24 4 31 A 5 4 20 A 9 2 34 111 1117 555 2098 2101 875 3356 3358 235A 56 0 15 A 5 7 33 A 2 3 22 111 1119 556 2098 2100 876 3360 3362 236A 75 2 18 A 5 3 19 A 7 2 16 112 1126 557 2099 2101 877 3365 3370 237A 27 0 34 A 7 5 19 A 5 0 46 112 1125 558 2099 2101 878 3370 3372 238A 39 4 16 A 7 9 23 A 4 0 17

Reg. Posição C Reg. Posição C Reg Posição C

A A na SEQ o na SEQ ID o A na SEQ ID o ID NO: 1 m NO: 1 m NO: 1 m de para p de para p de para p r r r i i i m m m e e e n n n t t t o o o 112 1130 559 2100 2102 879 3373 3375 239A 74 2 29 A 5 8 24 A 5 3 19 112 1130 560 2101 2103 880 3375 3378 240A 90 5 16 A 9 3 15 A 5 0 26 112 1131 561 2103 2104 881 3380 3382 241A 99 7 19 A 0 8 19 A 6 0 15 113 1132 562 2103 2105 882 3382 3384 242A 05 9 25 A 0 2 23 A 9 5 17 113 1136 563 2105 2107 883 3391 3396 243A 44 1 18 A 7 5 19 A 6 2 47 113 1140 564 2105 2107 884 3396 3398 244A 72 0 29 A 7 9 23 A 4 2 19 114 1141 565 2106 2108 885 3398 3402 245A 02 6 15 A 7 5 19 A 9 6 38 114 1144 566 2108 2111 886 3402 3407 246A 18 5 28 A 8 8 31 A 8 2 45 114 1147 567 2112 2115 887 3408 3410 247A 57 1 15 A 7 3 27 A 9 4 16

Reg. Posição C Reg. Posição C Reg Posição C

A A na SEQ o na SEQ ID o A na SEQ ID o ID NO: 1 m NO: 1 m NO: 1 m de para p de para p de para p r r r i i i m m m e e e n n n t t t o o o 114 1151 568 2115 2116 888 3411 3413 248A 82 1 30 A 5 9 15 A 3 0 18 115 1156 569 2115 2118 889 3414 3415 249A 50 6 17 A 5 0 26 A 1 8 18 116 1164 570 2120 2122 890 3428 3430 250A 22 5 24 A 5 0 16 A 1 9 29 117 1173 571 2122 2128 891 3437 3440 251A 22 7 16 A 2 3 62 A 7 7 31 117 1177 572 2134 2137 892 3442 3449 252A 45 7 33 A 7 0 24 A 3 8 76 118 1184 573 2143 2144 893 3450 3452 253A 24 4 21 A 1 5 15 A 7 1 15 118 1184 574 2146 2148 894 3452 3454 254A 24 0 17 A 3 7 25 A 4 5 22 126 1263 575 2148 2151 895 3455 3459 255A 22 8 17 A 9 8 30 A 2 6 45 126 1269 576 2152 2153 896 3468 3470 256A 73 1 19 A 0 5 16 A 8 3 16

Reg. Posição C Reg. Posição C Reg Posição C

A A na SEQ o na SEQ ID o A na SEQ ID o ID NO: 1 m NO: 1 m NO: 1 m de para p de para p de para p r r r i i i m m m e e e n n n t t t o o o 126 1272 577 2155 2157 897 3474 3475 257A 93 4 32 A 1 3 23 A 2 9 18 127 1276 578 2157 2159 898 3477 3479 258A 47 3 17 A 4 1 18 A 0 8 29 127 1280 579 2159 2161 899 3486 3488 259A 83 6 24 A 5 8 24 A 0 2 23 128 1283 580 2162 2164 900 3491 3493 260A 18 7 20 A 2 1 20 A 9 8 20 128 1288 581 2166 2167 901 3495 3498 261A 56 5 30 A 4 8 15 A 0 8 39 128 1291 582 2175 2178 902 3499 3501 262A 90 2 23 A 8 9 32 A 0 2 23 129 1294 583 2179 2181 903 3502 3504 263A 14 5 32 A 9 6 18 A 2 8 27 129 1301 584 2182 2185 904 3506 3518 12 264A 84 6 33 A 0 2 33 A 3 2 0 130 1301 585 2186 2188 905 3518 3521 265A 01 6 16 A 5 2 18 A 4 0 27

Reg. Posição C Reg. Posição C Reg Posição C

A A na SEQ o na SEQ ID o A na SEQ ID o ID NO: 1 m NO: 1 m NO: 1 m de para p de para p de para p r r r i i i m m m e e e n n n t t t o o o 130 1302 586 2189 2190 906 3522 3524 266A 04 2 19 A 0 5 16 A 2 1 20 130 1302 587 2191 2193 907 3524 3527 267A 04 1 18 A 7 2 16 A 5 5 31 130 1303 588 2195 2197 908 3527 3529 268A 14 4 21 A 6 6 21 A 7 7 21 131 1319 589 2197 2199 909 3531 3535 269A 66 1 26 A 5 3 19 A 9 5 37 132 1325 590 2200 2203 910 3536 3539 270A 28 1 24 A 7 5 29 A 7 7 31 132 1331 591 2201 2203 911 3543 3545 271A 83 9 37 A 4 4 21 A 3 7 25 132 1331 592 2203 2205 912 3546 3548 272A 95 0 16 A 6 1 16 A 1 6 26 133 1333 593 2203 2206 913 3549 3550 273A 17 2 16 A 6 8 33 A 0 9 20 133 1338 594 2207 2213 914 3554 3556 274A 54 1 28 A 0 2 63 A 6 0 15

Reg. Posição C Reg. Posição C Reg Posição C

A A na SEQ o na SEQ ID o A na SEQ ID o ID NO: 1 m NO: 1 m NO: 1 m de para p de para p de para p r r r i i i m m m e e e n n n t t t o o o 133 1343 595 2217 2220 915 3557 3559 275A 83 0 48 A 4 3 30 A 3 3 21 134 1346 596 2220 2221 916 3559 3561 276A 46 8 23 A 5 9 15 A 7 3 17 134 1346 597 2222 2225 917 3596 3599 277A 49 8 20 A 9 4 26 A 8 9 32 134 1348 598 2227 2229 918 3599 3601 278A 71 7 17 A 6 9 24 A 7 1 15 135 1351 599 2230 2235 919 3603 3605 279A 00 8 19 A 9 3 45 A 7 1 15 135 1356 600 2235 2237 920 3609 3611 280A 47 8 22 A 9 3 15 A 7 8 22 136 1365 601 2238 2240 921 3611 3613 281A 31 0 20 A 5 3 19 A 7 2 16 136 1367 602 2244 2246 922 3627 3629 282A 63 9 17 A 3 0 18 A 8 5 18 136 1369 603 2246 2249 923 3635 3636 283A 80 4 15 A 2 0 29 A 0 4 15

Reg. Posição C Reg. Posição C Reg Posição C

A A na SEQ o na SEQ ID o A na SEQ ID o ID NO: 1 m NO: 1 m NO: 1 m de para p de para p de para p r r r i i i m m m e e e n n n t t t o o o 137 1376 604 2249 2252 924 3636 3639 284A 44 4 21 A 9 0 22 A 6 2 27 137 1380 605 2260 2262 925 3643 3645 285A 66 3 38 A 1 3 23 A 3 8 26 137 1380 606 2264 2266 926 3646 3648 286A 68 3 36 A 6 1 16 A 0 3 24 137 1379 607 2266 2268 927 3653 3654 287A 77 7 21 A 3 2 20 A 0 7 18 137 1380 608 2271 2273 928 3654 3656 288A 89 4 16 A 3 5 23 A 9 6 18 138 1382 609 2273 2277 929 3660 3662 289A 04 7 24 A 7 2 36 A 0 5 26 138 1384 610 2279 2282 930 3662 3666 290A 23 4 22 A 3 6 34 A 7 5 39 138 1385 611 2285 2290 931 3675 3677 291A 40 4 15 A 1 3 53 A 9 4 16 138 1385 612 2290 2292 932 3676 3678 292A 40 5 16 A 5 8 24 A 5 2 18

Reg. Posição C Reg. Posição C Reg Posição C

A A na SEQ o na SEQ ID o A na SEQ ID o ID NO: 1 m NO: 1 m NO: 1 m de para p de para p de para p r r r i i i m m m e e e n n n t t t o o o 138 1385 613 2293 2298 933 3681 3685 293A 41 5 15 A 4 5 52 A 5 0 36 138 1387 614 2307 2308 934 3687 3689 294A 51 4 24 A 1 9 19 A 3 1 19 138 1387 615 2309 2312 935 3689 3693 295A 51 3 23 A 4 1 28 A 4 4 41 138 1387 616 2317 2320 936 3696 3699 296A 53 1 19 A 4 8 35 A 9 4 26 138 1387 617 2324 2327 937 3699 3701 297A 55 4 20 A 9 6 28 A 6 6 21 138 1388 618 2327 2331 938 3702 3704 298A 62 2 21 A 9 1 33 A 3 0 18 138 1390 619 2331 2332 939 3709 3711 299A 90 5 16 A 3 8 16 A 3 2 20 138 1392 620 2345 2347 940 3711 3714 300A 97 7 31 A 0 0 21 A 8 2 25 139 1394 621 2348 2350 941 3714 3716 301A 26 0 15 A 8 3 16 A 4 3 20

Reg. Posição C Reg. Posição C Reg Posição C

A A na SEQ o na SEQ ID o A na SEQ ID o ID NO: 1 m NO: 1 m NO: 1 m de para p de para p de para p r r r i i i m m m e e e n n n t t t o o o 139 1397 622 2351 2352 942 3724 3732 302A 57 1 15 A 1 9 19 A 2 4 83 139 1398 623 2355 2357 943 3735 3736 303A 66 0 15 A 5 0 16 A 2 8 17 139 1402 624 2357 2358 944 3737 3738 304A 95 5 31 A 5 9 15 A 0 9 20 140 1404 625 2359 2362 945 3739 3741 305A 27 8 22 A 7 0 24 A 1 9 29 140 1406 626 2363 2364 946 3742 3743 306A 48 7 20 A 2 7 16 A 1 8 18 140 1409 627 2367 2368 947 3744 3749 307A 84 8 15 A 2 7 16 A 4 1 48 141 1413 628 2373 2377 948 3751 3753 308A 18 3 16 A 7 5 39 A 1 8 28 141 1417 629 2374 2376 949 3756 3761 309A 54 1 18 A 6 0 15 A 7 4 48 141 1421 630 2383 2384 950 3763 3768 310A 73 0 38 A 3 7 15 A 6 0 45 311A 14198 14218 21 631A 23872 23911 40 951A 37723 37765 43

Reg. Posição C Reg. Posição C Reg Posição C

A A na SEQ o na SEQ ID o A na SEQ ID o ID NO: 1 m NO: 1 m NO: 1 m de para p de para p de para p r r r i i i m m m e e e n n n t t t o o o 312A 14200 14218 19 632A 23919 23936 18 952A 37773 37801 29 313A 14237 14265 29 633A 24050 24068 19 953A 37803 37822 20 314A 14242 14265 24 634A 24083 24111 29 954A 37824 37853 30 315A 14242 14264 23 635A 24111 24125 15 955A 37855 37887 33 316A 14244 14262 19 636A 24131 24164 34 956A 37889 37908 20 317A 14246 14265 20 637A 24167 24189 23 957A 37920 37939 20 318A 14253 14271 19 638A 24204 24227 24 958A 37988 38020 33 319A 14273 14293 21 639A 24236 24285 50 959A 38022 38049 28 320A 14290 14304 15 640A 24438 24453 16

[000171] Em algumas modalidades, o oligonucleotídeo compreende uma sequência de nucleotídeos contígua de 16 a 20 nucleotídeos, tal como 15 a 22 nucleotídeos de comprimento com pelo menos 90% de complementaridade, tal como 100% de complementaridade, para uma sequência alvo correspondente presente na SEQ ID NO: 1, em que a sequência alvo é selecionada a partir do grupo que consiste em SEQ ID NO: 3 a 21 (tabela 4) ou região B1 a B28 na Tabela 5B. TABELA 5B: REGIÕES DE SEQ ID NO 1 QUE PODEM SER

DIRECIONADAS USANDO UM OLIGONUCLEOTÍDEO DA INVENÇÃO

Reg Posição na Com Reg. Posição na SEQ Co Reg. Posição na Com . B SEQ ID NO: pri B ID NO: 1 mp B SEQ ID NO: 1 pri 1 men ri men de para to de para me de para to nt o 1 8295 8312 17 11 11622 11641 19 21 18085 18101 16 2 8684 8704 20 12 11753 11773 20 22 22425 22441 16 3 9668 9684 16 13 11755 11772 17 23 33030 33048 18 4 9669 9684 15 14 11756 11776 20 24 35103 35123 20 5 9722 9741 19 15 11757 11776 19 25 35371 35390 19 6 9723 9741 18 16 11758 11778 20 26 35636 35655 19 7 9724 9742 18 17 12868 11885 17 27 35638 35654 16 1092 1093 8 1 7 16 18 13234 13252 18 28 36915 36931 16 1148 1150 9 3 3 20 19 13551 13569 18 1151 1153 10 2 1 19 20 14786 14804 18

[000172] Em algumas modalidades, o oligonucleotídeo da invenção compreende ou consiste em 12 a 60 nucleotídeos de comprimento, tal como 13 a 50, tal como 14 a 35, tal como 15 a 30, tal como 16 a 20 nucleotídeos contíguos de comprimento. Em uma modalidade preferida, o oligonucleotídeo compreende ou consiste em 15, 16, 17, 18, 19 ou 20 nucleotídeos de comprimento.

[000173] Em algumas modalidades, a sequência de nucleotídeos contígua do oligonucleotídeo que é complementar aos ácidos nucleicos alvo compreende ou consiste em 12 a 30, tal como de 13 a 25, tal como de 15 a 23, tal como de 16 a 22, nucleotídeos contíguos em comprimento.

[000174] Em algumas modalidades, a sequência de nucleotídeos contígua do siRNA ou shRNA que é complementar aos ácidos nucleicos alvo compreende ou consiste em 18 a 28, tal como 19 a 26, tal como 20 a 24, tal como 21 a 23, nucleotídeos contíguos de comprimento.

[000175] Em algumas modalidades, a sequência de nucleotídeos contígua do oligonucleotídeo antissenso de fita simples que é complementar aos ácidos nucleicos alvo compreende ou consiste em 12 a 22, tal como 14 a 20, tal como 16 a 20, tal como 15 a 21, tal como 15 a 18, tal como 16 a 18, tal como 16 a 17 nucleotídeos contíguos de comprimento.

[000176] Em algumas modalidades, o oligonucleotídeo ou sequência de nucleotídeo contígua do mesmo compreende ou consiste em uma sequência selecionada a partir do grupo que consiste nas sequências listadas na Tabela 6 (seção Materiais e Método).

[000177] Em algumas modalidades, o oligonucleotídeo ou sequência de nucleotídeo contígua do mesmo compreende ou consiste em 10 a 30 nucleotídeos de comprimento com pelo menos 90% de identidade, de preferência 100% de identidade, a uma sequência selecionada a partir do grupo que consiste nas SEQs ID NO: 22 a 237 (vide sequências de motivo listadas na Tabela 6). Em uma modalidade particular, o oligonucleotídeo ou sequência de nucleotídeos contígua é selecionado a partir de SEQ ID NO: 22; 23; 24; 25; 26; 27; 28; 29; 32; 35; 36; 37; 38; 39; 40; 41; 42; 42; 42; 43; 43; 46; 49; 83; 109; 130; 203; e 232.

[000178] Entende-se que as sequências de oligonucleotídeos contíguas (sequência de motivo) podem ser modificadas para, por exemplo, aumentar a resistência à nuclease e/ou a afinidade de ligação ao ácido nucleico alvo.

[000179] O padrão no qual os nucleosídeos modificados (tais como nucleosídeos modificados de alta afinidade) são incorporados na sequência de oligonucleotídeo é geralmente denominado desenho de oligonucleotídeo.

[000180] O oligonucleotídeo da invenção pode ser desenhado com nucleosídeos modificados e nucleosídeos de RNA (em particular para moléculas de siRNA e shRNA) ou nucleosídeos de DNA (em particular para oligonucleotídeos antisenso de fita simples). De maneira vantajosa, são usados nucleosídeos modificados de alta afinidade.

[000181] Em uma modalidade, o oligonucleotídeo compreende pelo menos 1 nucleosídeo modificado, tal como pelo menos 2, pelo menos 3, pelo menos 4, pelo menos 5, pelo menos 6, pelo menos 7, pelo menos 8, pelo menos 9, pelo menos 10, pelo menos 11, pelo menos 12, pelo menos 13, pelo menos 14, pelo menos 15 ou pelo menos 16 nucleosídeos modificados. Em uma modalidade, o oligonucleotídeo compreende de 1 a 10 nucleosídeos modificados, tal como 2 a 9 nucleosídeos modificados, tal como 3 a 8 nucleosídeos modificados, tal como 4 a 7 nucleosídeos modificados, tal como 6 ou 7 nucleosídeos modificados. Modificações adequadas são descritas na seção "Definições" em "nucleosídeo modificado", "nucleosídeos modificados de alta afinidade", "modificações por açúcar", "modificações por açúcar em 2'" e ácidos nucleicos bloqueados (LNA)".

[000182] Em uma modalidade, o oligonucleotídeo compreende um ou mais nucleosídeos modificados por açúcar, tais como nucleosídeos modificados por açúcar em 2'.

Preferencialmente, o oligonucleotídeo da invenção compreende um ou mais nucleosídeos modificados por açúcar em 2', selecionados independentemente do grupo que consiste em 2'-O-alquil-RNA, 2'-O-metil-RNA, 2'-alcóxi-RNA, 2'-O- metoxietil-RNA, 2'-amino-DNA, 2'-fluoro-DNA, ácido nucleico arabino (ANA), 2'-fluoro-ANA e nucleosídeos de LNA. É vantajoso se um ou mais nucleosídeo(s) modificado(s) for(em) um ácido nucleico bloqueado (LNA).

[000183] Em uma outra modalidade, o oligonucleotídeo compreende pelo menos uma ligação internucleosídica modificada. Modificações internucleosídeos adequadas são descritas na seção "Definições" em "ligação internucleosídica modificada". É vantajoso se pelo menos 2 a 3 ligações internucleosídicas na extremidade 5' ou 3' do oligonucleotídeo forem ligações internucleosídicas fosforotioato. Para oligonucleotídeos antisenso de fita simples, é vantajoso se pelo menos 75%, tal como todas as ligações internucleosídicas dentro da sequência de nucleotídeos contígua são ligações internucleosídicas fosforotioato. Em algumas modalidades, todas as ligações internucleotídeo na sequência contígua do oligonucleotídeo antissenso de fita simples são ligações fosforotioato.

[000184] Em algumas modalidades, o oligonucleotídeo da invenção compreende pelo menos um nucleosídeo de LNA, tal como 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 ou 8 nucleosídeos de LNA, tal como 2 a 6 nucleosídeos de LNA, tal como 3 a 7 nucleosídeos de LNA, tal como 4 a 8 nucleosídeos de LNA ou 3, 4, 5, 6, 7 ou 8 nucleosídeos de LNA. Em algumas modalidades, pelo menos 75% dos nucleosídeos modificados no oligonucleotídeo são nucleosídeos de LNA, tais como 80%, tais como 85%, tais como 90% dos nucleosídeos modificados são nucleosídeos de LNA. Ainda em uma outra modalidade, todos os nucleosídeos modificados no oligonucleotídeo são nucleosídeos de LNA. Em uma modalidade adicional, o oligonucleotídeo pode compreender beta-D-oxi-LNA e um ou mais dos seguintes nucleosídeos de LNA: tio-LNA, amino-LNA, oxi-LNA, ScET e/ou ENA nas configurações beta-D ou alfa-L ou suas combinações. Em uma outra modalidade, todas as unidades de citosina de LNA são 5-metil-citosina. É vantajoso que a estabilidade da nuclease do nucleotídeo ou sequência de nucleotídeo contígua tenha pelo menos 1 nucleosídeo de LNA na extremidade 5' e pelo menos 2 nucleosídeos de LNA na extremidade 3' da sequência de nucleotídeo.

[000185] Em uma modalidade da invenção, o oligonucleotídeo da invenção é capaz de recrutar a RNase H.

[000186] Na presente invenção, um desenho estrutural vantajoso é um desenho de gapmer, conforme descrito na seção “Definições”, por exemplo, “Gapmer”, “LNA Gapmer” e “MOE gapmer”. Na presente invenção, é vantajoso se o oligonucleotídeo antissenso da invenção for um gapmer com um desenho F-G-F'. Em algumas modalidades, o gapmer é um gapmer de LNA com flancos uniformes.

[000187] Em algumas modalidades da invenção, o gapmer de LNA é selecionado a partir dos seguintes designs de flanco uniforme: 2-12-3, 4-14-2, 3-10-3, 3-9-3, 2-15-2, 2-12-4, 1-13-2, 3-13-2, 4-13-2, 2-12-2, 3-12-2, 3-15-2, 3- 14-2, 3-13-3, 2-14-4, 3-12-3, 1-14-3, 3-14-3, 2-14-3, 2-15- 3, 3-11-3, 1-12-3, 1-11-4, 1-13-2, 2-13-2, 2-16-2, 1-14-2,

1-17-3 e 1-18-2.

[000188] A Tabela 6 (seção Materiais e Método) lista os desenhos preferidos de cada sequência de motivos.

[000189] Em todos os casos, o desenho F-G-F' pode incluir ainda as regiões D' e/ou D'', conforme descrito na seção "Definições" em "Regiões D' ou D'' em um oligonucleotídeo". Em algumas modalidades, o oligonucleotídeo da invenção tem 1, 2 ou 3 unidades de nucleosídeo ligadas a fosfodiéster, tais como unidades de DNA, na extremidade 5' ou 3' da região de gapmer. Em algumas modalidades, o oligonucleotídeo da invenção consiste em dois nucleosídeos de DNA ligados a fosfodiéster 5' seguidos por uma região de gapmer F-G-F', conforme definido na seção "Definições". Os oligonucleotídeos que contêm unidades de DNA ligadas por fosfodiéster na extremidade 5' ou 3' são adequados para conjugação e podem compreender ainda uma fração de conjugado como aqui descrito. Para liberação ao fígado, as frações de direcionamento de ASGPR são particularmente vantajosas como unidades de conjugado.

[000190] Para algumas modalidades da invenção, o oligonucleotídeo é selecionado a partir do grupo de compostos de oligonucleotídeo com CMP-ID-NO: 22_1; 23_1; 24_1; 25_1; 26_1; 27_1; 28_1; 29_1; 30_1; 31_1; 32_1; 33_1; 34_1; 35_1; 36_1; 37_1; 38_1; 39_1; 40_1; 41_1; 42_1; 42_2; 42_3; 43_1; 43_2; 44_1; 45_1; 46_1; 47_1; 48_1; 49_1; 130_1; 109_1; 83_1; 203_1 e 232_1 (consulte a Tabela 6).

CONJUGADO

[000191] Uma vez que a infecção por HBV afeta principalmente os hepatócitos no fígado, é vantajoso conjugar o inibidor de RTEL1 a uma fração conjugada que aumentará a distribuição do inibidor ao fígado em comparação com o inibidor não conjugado. Em uma modalidade, as frações de direcionamento ao fígado são selecionadas a partir de frações que compreendem colesterol ou outros lipídios ou frações conjugadas capazes de se ligar ao receptor de asialoglicoproteína (ASGPR).

[000192] Em algumas modalidades, a invenção fornece um conjugado que compreende uma molécula de ácido nucleico da invenção covalentemente ligada a uma fração do conjugado.

[000193] A fração do conjugado do receptor de asialoglicoproteína (ASGPR) compreende uma ou mais frações de carboidrato capazes de se ligar ao receptor de asialoglicoproteína (frações de direcionamento ASGPR) com afinidade igual ou superior à da galactose. As afinidades de vários derivados de galactose para o receptor de asialoglicoproteína foram estudadas (vide, por exemplo: Jobst, ST e Drickamer, K. JB.C. 1996, 271, 6686) ou são facilmente determinados usando métodos típicos na técnica.

[000194] Em uma modalidade, a fração conjugada compreende pelo menos uma fração de direcionamento do receptor de asialoglicoproteína selecionada a partir do grupo que consiste em galactose, galactosamina, N-formil- galactosamina, N-acetilgalactosamina, N-propionil- galactosamina, Nn-butanoil-galactosamina e N- isobutanoilgalactosamina. Vantajosamente, a fração de direcionamento do receptor de asialoglicoproteína é N- acetilgalactosamina (GalNAc).

[000195] Para gerar a fração de conjugado ASGPR,

as frações de direcionamento ASGPR (de preferência GalNAc) podem ser anexadas a uma estrutura de conjugado. Geralmente, as frações de direcionamento ASGPR podem estar na mesma extremidade do andaime. Em uma modalidade, a fração conjugada consiste em duas a quatro frações GalNAc terminais ligadas a um espaçador que liga cada fração GalNAc a uma molécula ramificada que pode ser conjugada ao oligonucleotídeo antissenso.

[000196] Em uma outra modalidade, a fração do conjugado é monovalente, di-valente, trivalente ou tetrivalente em relação às frações de direcionamento do receptor de asialoglicoproteína. Vantajosamente, a fração de direcionamento do receptor de asialoglicoproteína compreende frações N-acetilgalactosamina (GalNAc).

[000197] As frações de conjugado GalNAc podem incluir, por exemplo, aqueles descritos em WO 2014/179620 e WO 2016/055601 e PCT/EP2017/059080 (aqui incorporados por referência), bem como pequenos peptídeos com frações GalNAc anexadas, como Tyr-Glu-Glu-(aminohexil GalNAc)3 (YEE(ahGalNAc)3; um glicotripeptídeo que se liga ao receptor de asialoglicoproteína em hepatócitos, vide, por exemplo, Duff, et al., Methods Enzymol, 2000, 313, 297); aglomerados de galactose baseados em lisina (por exemplo, L3G4; Biessen, et al., Cardovasc. Med., 1999, 214); e aglomerados de galactose à base de colano (por exemplo, motivo de reconhecimento de carboidrato para receptor de asialoglicoproteína).

[000198] A fração de conjugado ASGPR, em particular uma fração de conjugado GalNAc trivalente, pode ser ligada à extremidade 3' ou 5' do oligonucleotídeo usando métodos conhecidos na técnica. Em uma modalidade, a fração do conjugado ASGPR está ligada à extremidade 5' do oligonucleotídeo.

[000199] Em uma modalidade, a fração conjugada é uma N-acetilgalactosamina trivalente (GalNAc), tal como aquelas mostradas na Figura 1, em particular como mostrado na Figura 1D.

MÉTODO DE FABRICAÇÃO

[000200] Em um aspecto adicional, a invenção fornece métodos para fabricar os oligonucleotídeos da invenção compreendendo reagir unidades de nucleotídeo e, assim, formar unidades de nucleotídeo contíguas ligadas covalentemente compreendidas no oligonucleotídeo. De preferência, o método usa química de fosforamidita (vide, por exemplo, Caruthers et al., 1987, Methods in Enzymology, vol. 154, páginas 287 a 313). Em uma outra modalidade, o método compreende ainda reagir a sequência de nucleotídeo contígua com uma fração conjugadora (ligante) para covalentemente ligar a fração conjugada ao oligonucleotídeo. Em um aspecto adicional, é fornecido um método para fabricar a composição da invenção, compreendendo misturar o oligonucleotídeo ou oligonucleotídeo conjugado da invenção com um diluente, solvente, transportador, sal e/ou adjuvante farmaceuticamente aceitáveis.

SAL FARMACEUTICAMENTE ACEITÁVEL

[000201] Os compostos de acordo com a presente invenção podem existir na forma de seus sais farmacêutico aceitáveis. O termo "sal farmaceuticamente aceitável" refere-se a sais de adição de ácido convencionais ou sais de adição de base que retêm a eficácia biológica e as propriedades dos compostos da presente invenção e são formados a partir de ácidos orgânicos ou inorgânicos não tóxicos adequados ou bases orgânicas ou inorgânicas. Os sais de adição de ácido incluem, por exemplo, aqueles derivados de ácidos inorgânicos, tais como ácido clorídrico, ácido bromídrico, ácido iodídrico, ácido sulfúrico, ácido sulfâmico, ácido fosfórico e ácido nítrico, e aqueles derivados de ácidos orgânicos, tais como ácido p- toluenossulfônico, ácido salicílico, ácido metanossulfônico, ácido oxálico, ácido succínico, ácido cítrico, ácido málico, ácido lático, ácido fumárico e similares. Os sais de adição de base incluem aqueles derivados de amônio, potássio, sódio e hidróxidos de amônio quaternário, tais como, por exemplo, hidróxido de amônio de tetrametila. A modificação química de um composto farmacêutico em um sal é uma técnica bem conhecida pelos químicos farmacêuticos, a fim de obter melhor estabilidade física e química, higroscopicidade, fluidez e solubilidade dos compostos. É descrito, por exemplo, em Bastin, Organic Process Research & Development 2000, 4, 427-435, ou em Ansel, em: Pharmaceutical Dosage Forms and Drug Delivery Systems, 6ª ed., (1995), pp. 196 e 1456-1457. Por exemplo, o sal farmaceuticamente aceitável dos compostos fornecidos no presente documento pode ser um sal de sódio.

[000202] Em um aspecto adicional, a invenção fornece um sal farmaceuticamente aceitável do oligonucleotídeo antissenso ou um seu conjugado. Em uma modalidade preferida, o sal farmaceuticamente aceitável é um sal de sódio ou potássio.

COMPOSIÇÃO FARMACÊUTICA

[000203] Em um aspecto adicional, a invenção fornece composições farmacêuticas compreendendo qualquer um dos oligonucleotídeos e/ou conjugados de oligonucleotídeos acima mencionados ou sais destes e um diluente, transportador, sal e/ou adjuvante farmaceuticamente aceitáveis. Um diluente farmaceuticamente aceitável inclui solução salina tamponada com fosfato (PBS) e sais farmaceuticamente aceitáveis incluem, mas não estão limitados a, sais de sódio e potássio. Em algumas modalidades, o diluente farmaceuticamente aceitável é solução salina tamponada com fosfato estéril. Em algumas modalidades, o oligonucleotídeo é usado no diluente farmaceuticamente aceitável a uma concentração de solução de 50 a 300 µM.

[000204] As formulações adequadas para usona presente invenção encontram-se em Remington's Pharmaceutical Sciences, Mack Publishing Company, Filadélfia, Pa., 17ª ed., 1985. Para uma breve revisão dos métodos para liberação de fármacos, vide, por exemplo, Langer (Science 249:1527-1533, 1990). O documento WO 2007/031091 fornece outros exemplos adequados e preferidos de diluentes, transportadores adjuvantes farmaceuticamente aceitáveis (aqui incorporados por referência). Dosagens, formulações, vias de administração, composições, formas de dosagem adequadas, combinações com outros agentes terapêuticos, formulações pró-fármaco também são fornecidas no documento WO2007/031091.

[000205] Em algumas modalidades, o oligonucleotídeo ou conjugados de oligonucleotídeo da invenção, ou seu sal farmaceuticamente aceitável, está em uma forma sólida, como um pó, como um pó liofilizado.

[000206] Os oligonucleotídeos ou conjugados de oligonucleotídeos da invenção podem ser misturados com substâncias ativas ou inertes farmaceuticamente aceitáveis para a preparação de composições ou formulações farmacêuticas. As composições e métodos para a formulação de composições farmacêuticas dependem de vários critérios, incluindo, mas não limitados a, via de administração, extensão da doença ou dose a ser administrada.

[000207] Estas composições podem ser esterilizadas por técnicas convencionais de esterilização ou podem ser filtradas esterilmente. As soluções aquosas resultantes podem ser embaladas para uso como são, ou liofilizadas, sendo a preparação liofilizada combinada com um transportador aquoso estéril antes da administração. O pH das preparações estará normalmente entre 3 e 11, mais preferencialmente, entre 5 e 9 ou entre 6 e 8, e mais preferencialmente, entre 7 e 8, tal como 7 a 7,5. As composições resultantes na forma sólida podem ser embaladas em várias unidades de dose única, cada uma contendo uma quantidade fixa do(s) agente(s) acima mencionado(s), tal como em uma embalagem selada de comprimidos ou cápsulas. A composição na forma sólida também pode ser embalada em um recipiente para uma quantidade flexível, tal como em um tubo que pode ser espremido, projetado para um creme ou pomada de aplicação tópica.

[000208] Em algumas modalidades, o oligonucleotídeo ou conjugado de oligonucleotídeo da invenção é um pró-fármaco. Em particular no que diz respeito aos conjugados de oligonucleotídeo, a fração conjugada é clivada do oligonucleotídeo uma vez que o pró- fármaco é liberado no local de ação, por exemplo, na célula alvo.

ADMINISTRAÇÃO

[000209] Os compostos, oligonucleotídeos, conjugados de oligonucleotídeos ou composições farmacêuticas da presente invenção podem ser administrados de forma tópica (como, na pele, inalação, oftálmico ou ótico) ou entéricas (como, oralmente ou através do trato gastrointestinal) ou parenteral (como, intravenosa, subcutânea, intramuscular, intracerebral, intracerebroventricular ou intratecal).

[000210] Em uma modalidade preferida, o oligonucleotídeo ou composições farmacêuticas da presente invenção são administrados por uma via parenteral, incluindo injeção intravenosa, intra-arterial, subcutânea, intraperitoneal ou intramuscular ou infusão, intratecal ou intracraniana, por exemplo, administração intracerebral ou intraventricular, intravítrea. Em uma modalidade, o oligonucleotídeo ativo ou conjugado de oligonucleotídeo é administrado por via intravenosa. Em outra modalidade, o oligonucleotídeo ativo ou conjugado de oligonucleotídeo é administrado por via subcutânea.

[000211] Em algumas modalidades, o oligonucleotídeo, conjugado de oligonucleotídeo ou composição farmacêutica da invenção é administrado em uma dose de 0,1 - 15 mg kg, tal como de 0,2 - 10 mg/kg, tal como de 0,25 - 5 mg/kg. A administração pode ser uma vez 2ª por semana, a cada semana, a cada 3ª semana ou mesmo uma vez por mês.

[000212] A invenção também fornece o uso do oligonucleotídeo ou conjugado de oligonucleotídeo da invenção conforme descrito para a fabricação de um medicamento em que o medicamento está em uma forma de dosagem para administração subcutânea.

TERAPIAS COMBINADAS

[000213] Em algumas modalidades, o oligonucleotídeo, conjugado de oligonucleotídeo ou composição farmacêutica da invenção é para uso em um tratamento combinado com outro agente terapêutico. O agente terapêutico pode, por exemplo, ser o padrão de atendimento para as doenças ou distúrbios descritos acima.

[000214] A título de exemplo, o oligômero ou o conjugado de oligômero da presente invenção pode ser usado em combinação com outros ativos, tais como antivirais baseados em oligonucleotídeos - tais como antivirais baseados em oligonucleotídeos específicos de sequência - atuando através de antissenso (incluindo outros oligômeros de LNA), siRNAs (como ARC520), aptâmeros, morfolinos ou qualquer outro antiviral, modo de ação dependente da sequência de nucleotídeos.

[000215] A título de exemplo adicional, o oligômero ou o conjugado de oligômero da presente invenção podem ser usados em combinação com outros ativos, tais como compostos antivirais imunoestimulantes, tais como interferon (por exemplo, interferon alfa peguilado), agonistas de TLR7 (por exemplo, GS-9620), ou vacinas terapêuticas.

[000216] A título de exemplo adicional, o oligômero ou o conjugado de oligômero da presente invenção podem ser usados em combinação com outros ativos, tais como pequenas moléculas, com atividade antiviral. Esses outros ativos podem ser, por exemplo, inibidores de nucleosídeo/nucleotídeo (por exemplo, entecavir ou tenofovir disoproxil fumarato), inibidores de encapsidação, inibidores de entrada (por exemplo, Myrcludex B).

[000217] Em certas modalidades, o agente terapêutico adicional pode ser um agente de HBV, um agente do vírus da hepatite C (HCV), um agente quimioterápico, um antibiótico, um analgésico, um agente antiinflamatório não esteróide (NSAID), um agente antifúngico, um agente antiparasitário, um agente antináusea, um agente antidiarreico ou um agente imunossupressor.

[000218] Em particular, modalidades relacionadas, o agente de HBV adicional pode ser interferon alfa-2b, interferon alfa-2a e interferon alfacon-1 (peguilado e não peguilado), ribavirina; um inibidor de replicação de RNA de HBV; um segundo oligômero antissenso; uma vacina terapêutica de HBV; uma vacina profilática de HBV; lamivudina (3TC); entecavir (ETV); tenofovir diisoproxil fumarato (TDF); telbivudina (LdT); adefovir; ou uma terapia de anticorpos de HBV (monoclonal ou policlonal).

[000219] Em outras modalidades específicas relacionadas, o agente adicional de HCV pode ser interferon alfa-2b, interferon alfa-2a e interferon alfacon-1 (peguilado e não peguilado); ribavirina; pegasis; um inibidor de replicação de RNA de HCV (por exemplo, ViroPharma's VP50406 series); um agente anti-sentido de

HCV; uma vacina terapêutica de HCV; um inibidor de protease de HCV; um inibidor de helicase de HCV; ou uma terapia de anticorpo monoclonal ou policlonal de HCV.

APLICAÇÕES

[000220] Os oligonucleotídeos da invenção podem ser usados como reagentes de pesquisa para, por exemplo, diagnóstico, terapêutica e profilaxia.

[000221] Na pesquisa, tais oligonucleotídeos podem ser usados para modular especificamente a síntese da proteína RTEL1 em células (por exemplo, culturas de células in vitro) e animais experimentais, facilitando assim a análise funcional do alvo ou uma avaliação de sua utilidade como alvo para intervenção terapêutica. Normalmente, a modulação alvo é alcançada degradando ou inibindo o mRNA que produz a proteína, impedindo assim a formação de proteínas ou degradando ou inibindo um modulador do gene ou mRNA que produz a proteína.

[000222] Se os oligonucleotídeos da invenção forem empregados em pesquisa ou diagnóstico, o ácido nucleico alvo pode ser um cDNA ou um ácido nucleico sintético derivado de DNA ou RNA.

[000223] A presente invenção fornece um método in vivo ou in vitro para modular a expressão de RTEL1 em uma célula alvo que está expressando RTEL1, o referido método compreendendo a administração de um oligonucleotídeo, composto conjugado ou composição farmacêutica da invenção em uma quantidade eficaz à referida célula.

[000224] Em algumas modalidades, a célula hospedeira é uma célula eucariótica, particularmente, uma célula de mamífero. A célula alvo pode ser uma cultura de células in vitro ou uma célula in vivo que faz parte de um tecido em um mamífero. Em modalidades preferidas, a célula alvo está presente no fígado. A célula alvo pode ser um hepatócito.

[000225] Um aspecto da presente invenção está relacionado aos oligonucleotídeos, compostos conjugados ou composições farmacêuticas da invenção para uso como um medicamento.

[000226] Num aspecto da invenção, os oligonucleotídeos, composto conjugado ou composição farmacêutica da invenção são capazes de reduzir o nível de cccDNA nas células infectadas e, portanto, inibir a infecção por HBV. Em particular, o oligonucleotídeo antissenso é capaz de afetar um ou mais dos seguintes parâmetros i) reduzir cccDNA e / ou ii) reduzir pgRNA e/ou iii) reduzir DNA de HBV e/ou iv) reduzir antígenos virais de HBV em uma célula infectada.

[000227] Por exemplo, a molécula de ácido nucleico que inibe a infecção por HBV pode reduzir i) os níveis de cccDNA em uma célula infectada em pelo menos 40%, tal como redução de 50%, 60%, 70%, 80% ou 90% em comparação com os controles; ou ii) o nível de pgRNA em pelo menos 40%, tal como redução de 50%, 60%, 70%, 80% ou 90% em comparação com os controles. Os controles podem ser células ou animais não tratados, ou células ou animais tratados com um controle apropriado.

[000228] A inibição da infecção por HBV pode ser medida in vitro usando hepatócitos humanos primários infectados com HBV ou in vivo usando modelo de camundongo

PXB de hepatócitos humanizados (disponível em PhoenixBio, ver também Kakuni et al 2014 Int. J. Mol. Sci. 15: 58-74). A inibição da secreção de HBsAg e/ou HBeAg pode ser medida por ELISA, por exemplo, usando o kit CLIA ELISA (Autobio Diagnostic) de acordo com as instruções do fabricante. A redução de cccDNA intracelular ou HBV mRNA e pgRNA pode ser medida por qPCR, por exemplo, conforme descrito na seção Materiais e Métodos. Outros métodos para avaliar se um composto de teste inibe a infecção por HBV são medir a secreção de DNA de HBV por qPCR, por exemplo, como descrito em WO 2015/173208 ou usando Northern Blot; hibridização in situ ou imunofluorescência.

[000229] Devido à redução dos níveis de RTEL1, os oligonucleotídeos, compostos conjugados ou composições farmacêuticas da presente invenção podem ser usados para inibir o desenvolvimento de ou no tratamento da infecção por HBV. Em particular, a desestabilização e redução do cccDNA, os oligonucleotídeos, compostos conjugados ou composições farmacêuticas da presente invenção inibe mais eficientemente o desenvolvimento de ou trata uma infecção crônica por HBV em comparação com um composto que apenas reduz a secreção de HBsAg.

[000230] Consequentemente, um aspecto da presente invenção está relacionado ao uso do oligonucleotídeo, compostos conjugados ou composições farmacêuticas da invenção para reduzir o cccDNA e/ou pgRNA em um indivíduo infectado com HBV.

[000231] Um outro aspecto da invenção refere-se ao uso de oligonucleotídeos, compostos conjugados ou composições farmacêuticas da invenção para inibir o desenvolvimento ou tratar uma infecção crônica por HBV.

[000232] Um outro aspecto da invenção refere-se ao uso de oligonucleotídeos, compostos conjugados ou composições farmacêuticas da invenção para reduzir a infecciosidade de uma pessoa infectada com HBV. Em um aspecto particular da invenção, os oligonucleotídeos, compostos conjugados ou composições farmacêuticas da invenção inibem o desenvolvimento de uma infecção crônica por HBV.

[000233] O paciente a ser tratado com os oligonucleotídeos, compostos conjugados ou composições farmacêuticas da invenção (ou que recebe profilaticamente oligonucleotídeos antissenso, compostos conjugados ou composições farmacêuticas da presente invenção) é preferencialmente um humano, mais preferencialmente um paciente humano que é HBsAg positivo e/ou HBeAg positivo, ainda mais preferencialmente um paciente humano que seja HBsAg positivo e HBeAg positivo.

[000234] Consequentemente, a presente invenção refere-se a um método de tratamento de uma infecção por HBV, em que o método compreende a administração de uma quantidade eficaz dos oligonucleotídeos, compostos conjugados ou composições farmacêuticas da invenção. A presente invenção refere-se ainda a um método de prevenção de cirrose hepática e carcinoma hepatocelular causado por uma infecção crônica por HBV.

[000235] A invenção também fornece o uso de um oligonucleotídeo, um composto conjugado ou uma composição farmacêutica da invenção para a fabricação de um medicamento, em particular um medicamento para uso no tratamento de infecção por HBV ou infecção por HBV crônica ou redução da infecciosidade de uma pessoa infectada com HBV. Em modalidades preferidas, o medicamento é fabricado em uma forma de dosagem para administração subcutânea.

[000236] A invenção também fornece o uso do oligonucleotídeo ou conjugado deste, tais como sais farmacêuticos ou composições da invenção, para a fabricação de um medicamento, no qual o medicamento está em uma forma de dosagem para administração subcutânea.

[000237] O oligonucleotídeo, conjugado ou a composição farmacêutica da invenção podem ser usados em uma terapia de combinação. Por exemplo, o oligonucleotídeo, o conjugado ou a composição farmacêutica da invenção podem ser combinados com outros agentes anti-HBV, como interferon alfa-2b, interferon alfa-2a e interferon alfacon-1 (peguilado e não peguilado), ribavirina, lamivudina (3TC), entecavir, tenofovir, telbivudina (LdT), adefovir ou outros agentes anti-HBV emergentes, como um inibidor de replicação de RNA de HBV, um inibidor de secreção de HBsAg, um inibidor de capsídeo de HBV, um oligômero antisenso (por exemplo, conforme descrito em WO2012/145697, WO 2014/179629 e WO2017/216390), um siRNA (por exemplo, descrito em WO 2005/014806, WO 2012/024170, WO 2012/2055362, WO 2013/003520, WO 2013/159109, WO 2017/027350 e WO2017/015175), uma vacina terapêutica de HBV, uma vacina profilática de HBV, uma terapia de anticorpos de HBV (monoclonal ou policlonal) ou agonistas TLR 2, 3, 7, 8 ou 9 para o tratamento e/ou profilaxia de HBV.

MODALIDADES DA INVENÇÃO

[000238] As seguintes modalidades da presente invenção podem ser usadas em combinação com quaisquer outras modalidades descritas no presente documento.

1. Inibidor de RTEL1 para uso no tratamento e/ou prevenção da infecção pelo vírus da Hepatite B (HBV).

2. O inibidor de RTEL1 para o uso da modalidade 1, em que o inibidor de RTEL1 é administrado em uma quantidade eficaz.

3. Inibidor de RTEL1 para o uso, de acordo com a modalidade 1 ou 2, em que a infecção por HBV é uma infecção crônica.

4. Inibidor de RTEL1 para o uso, de acordo com a modalidade 1 a 3, em que o inibidor de RTEL1 é capaz de reduzir o cccDNA e/ou pgRNA em uma célula infectada.

5. Inibidor de RTEL1 para o uso, de acordo com a modalidade 1 a 4, em que o inibidor de RTEL1 evita ou reduz a ligação de RTEL1 ao DNA, como cccDNA.

6. Inibidor de RTEL1 para o uso, de acordo com a modalidade 5, em que o referido inibidor é uma pequena molécula que se liga especificamente à proteína RTEL1, em que o referido inibidor evita ou reduz a ligação da proteína RTEL1 ao cccDNA.

7. Inibidor de RTEL1 para o uso, de acordo com a modalidade 1 a 5, em que o referido inibidor é um oligonucleotídeo de 12 a 60 nucleotídeos de comprimento compreendendo ou consistindo em uma sequência de nucleotídeos contígua de pelo menos 10 nucleotídeos de comprimento que é pelo menos 90% complementar a um ácido nucleico alvo RTEL1 de mamífero.

8. Inibidor de RTEL1 para o uso, de acordo com a modalidade 7, que é capaz de reduzir o nível do ácido nucleico alvo RTEL1.

9. Inibidor de RTEL1 para o uso, de acordo com a modalidade 7 ou 8, em que o ácido nucleico alvo é RNA.

10. Inibidor de RTEL1 para o uso, de acordo com a modalidade 9, em que o RNA é pré-mRNA.

11. Inibidor de RTEL1 para o uso, de acordo com qualquer uma das modalidades7 a 10, em que o oligonucleotídeo é selecionado a partir de um oligonucleotídeo antissenso, siRNA ou shRNA.

12. Inibidor de RTEL1 para o uso, de acordo com a modalidade 11, em que o oligonucleotídeo é um oligonucleotídeo antissenso de fita simples ou um siRNA de fita dupla.

13. Inibidor de RTEL1 para o uso, de acordo com qualquer uma das modalidades 7 a 12, em que o ácido nucleico alvo de RTEL1 de mamífero é selecionado a partir de SEQ ID NO: 1 ou 2.

14. Inibidor de RTEL1 para o uso, de acordo com qualquer uma das modalidades 7 a 12, em que a sequência de nucleotídeos contígua do oligonucleotídeo é pelo menos 98% de complementaridade com o ácido nucleico alvo de SEQ ID NO: 1 e SEQ ID NO: 2.

15. Inibidor de RTEL1 para o uso, de acordo com qualquer uma das modalidades 1 a 14, em que o cccDNA em uma célula infectada por HBV é reduzido em pelo menos 50%, tal como 60%, tal como 70%, tal como 80%, tal como 90%, tal como 95%, tal como 100%, quando comparado a um ao controle.

16. Oligonucleotídeo para o uso, de acordo com qualquer uma das modalidades 7 a15, em que o mRNA de RTEL1 é reduzido em pelo menos 50%, tal como 60%, tal como 70%,

tal como 80%, tal como 90%, tal como 95%, tal como 100%, quando comparado a um controle.

17. Oligonucleotídeo de 12 a 60 nucleotídeos de comprimento que compreende ou consiste em uma sequência de nucleotídeos contígua de 12 a 30 nucleotídeos de comprimento em que a sequência de nucleotídeos contígua é pelo menos 90% complementar, tal como 95%, tal como 98%, tal como totalmente complementaridade, a um ácido nucleico alvo RTEL1 de mamífero.

18. Oligonucleotídeo, de acordo com a modalidade 17, em que o RNA é mRNA.

19. Oligonucleotídeo, de acordo com a modalidade 17 ou18, em que o ácido nucleico alvo de RTEL1 de mamífero é selecionado a partir de SEQ ID NO: 1 ou 2.

20. Oligonucleotídeo, de acordo com a modalidade 17 ou 18, em que a sequência de nucleotídeos contígua é pelo menos 98% de complementaridade com o ácido nucleico alvo de SEQ ID NO: 1 e SEQ ID NO: 2.

21. Oligonucleotídeo, de acordo com qualquer uma das modalidades 17 a 20, em que o oligonucleotídeo tem 12 a 30 nucleotídeos de comprimento.

22. Oligonucleotídeo, de acordo com qualquer uma das modalidades 17 a 21, em que o oligonucleotídeo é uma molécula de RNAi, como um siRNA de fita dupla ou shRNA

23. Oligonucleotídeo, de acordo com qualquer uma das modalidades 17 a 21, em que o oligonucleotídeo é um oligonucleotídeo antissenso de fita simples.

24. Oligonucleotídeo, de acordo com qualquer uma das modalidades 17 a 23, em que a sequência de nucleotídeos contígua é complementar a uma sequência alvo selecionada da

SEQ ID NO: 3 a 21 (tabela 4).

25. Oligonucleotídeo, de acordo com a modalidade 17 a 24, o qual é capaz de hibridizar com um ácido nucleico alvo de SEQ ID NO: 1 e SEQ ID NO: 2 com um ΔG ° abaixo de - 15 kcal.

26. Oligonucleotídeo, de acordo com qualquer uma das modalidades 17 a 25, em que a sequência de nucleotídeo contígua compreende ou consiste em pelo menos 14 nucleotídeos contíguos, particularmente 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21 ou 22 nucleotídeos contíguos.

27. Oligonucleotídeo, de acordo com qualquer uma das modalidades 17 a 25, em que a sequência de nucleotídeo contígua compreende ou consiste em 14 a 22 nucleotídeos.

28. Oligonucleotídeo, de acordo com a modalidade 27, em que a sequência de nucleotídeo contígua compreende ou consiste em 16 a 20 nucleotídeos.

29. Oligonucleotídeo, de acordo com qualquer uma das das modalidades 17 a 28, em que o oligonucleotídeo compreende ou consiste em 14 a 25 nucleotídeos de comprimento.

30. Oligonucleotídeo, de acordo com a modalidade29, em que o oligonucleotídeo compreende ou consiste em 16 a 22 nucleotídeos de comprimento.

31. Oligonucleotídeo, de acordo com qualquer uma das modalidades 17 a 30, em que o oligonucleotídeo compreende uma sequência selecionada de SEQ ID NO: 22-237.

32. Oligonucleotídeo, de acordo com qualquer uma das modalidades 17 a 31, em que a sequência de nucleotídeo contígua tem zero a três incompatibilidades em comparação ao ácido nucleico alvo ao qual ela é complementar.

33. Oligonucleotídeo, de acordo com a modalidade 32, em que a sequência de nucleotídeo contígua tem uma incompatibilidade em comparação ao ácido nucleico alvo.

34. Oligonucleotídeo, de acordo com a modalidade 32, em que a sequência de nucleotídeo contígua tem duas incompatibilidades em comparação ao ácido nucleico alvo.

35. Oligonucleotídeo, de acordo com a modalidade 32, em que a sequência de nucleotídeo contígua é totalmente complementar à sequência de ácido nucleico alvo.

36. Oligonucleotídeo, de acordo com a modalidade 17 a 35, compreendendo um ou mais nucleosídeos modificados.

37. Oligonucleotídeo, de acordo com a modalidade 36, em que o um ou mais nucleosídeos modificados são nucleosídeos modificados de alta afinidade.

38. Oligonucleotídeo, de acordo com a modalidade 36 ou 37, em que um ou mais nucleosídeos modificados são um nucleosídeo modificado por açúcar 2'.

39. Oligonucleotídeo, de acordo com a modalidade 38, em que os um ou mais nucleosídeos modificados por açúcar em 2' são independentemente selecionados a partir do grupo que consiste em 2'-O-alquil-RNA, 2'-O-metil-RNA, 2'- alcóxi-RNA, 2'-O-metoxietil-RNA, 2'-amino-DNA, 2'-fluoro- DNA, 2'-fluoro-ANA e nucleosídeos de LNA.

40. Oligonucleotídeo, de acordo com a modalidade 36 a 39 em que o um ou mais nucleosídeos modificados por açúcar em 2' são um nucleosídeo de LNA.

41. Oligonucleotídeo, de acordo com a modalidade 40, em que o nucleosídeo de LNA modificado é selecionado a partir de oxi-LNA, amino-LNA, tio-LNA, cET e ENA.

42. Oligonucleotídeo, de acordo com a modalidade

40 ou 41, em que o nucleosídeo de LNA modificado é oxi-LNA com a seguinte ponte de 2’-4’ –O-CH2-.

43. Oligonucleotídeo, de acordo com a modalidade 42, em que o oxi-LNA é beta-D-oxi-LNA.

44. Oligonucleotídeo, de acordo com a modalidade 40 ou 41, em que o nucleosídeo de LNA modificado é cET com a seguinte ponte de 2'-4' –O-CH(CH3)-.

45. Oligonucleotídeo, de acordo com a modalidade 44, em que o cET é (S)cET, ou seja, 6'(S)metil-beta-D-oxi- LNA.

46. Oligonucleotídeo, de acordo com a modalidade 40 ou 41, em que o LNA é ENA, com a seguinte ponte 2’ – 4’ de –O-CH2-CH2-.

47. Oligonucleotídeo, de acordo com qualquer uma das modalidades 17 a 46, em que a sequência de nucleotídeo contígua compreende pelo menos uma ligação internucleosídica modificada.

48. Oligonucleotídeo, de acordo com a modalidade 47, em que a ligação internucleosídica modificada é resistente à nuclease.

49. Oligonucleotídeo, de acordo com a modalidade47 ou 48, em que as ligações internucleosídicas modificadas são ligações internucleosídicas fosforotioato..

50. Oligonucleotídeo, de acordo com qualquer uma das modalidades 17 a 49, em que o oligonucleotídeo é capaz de recrutar a RNase H1.

51. Oligonucleotídeo antissenso, de acordo com a modalidade 50, em que o oligonucleotídeo antissenso ou a sequência de nucleotídeo contígua é um gapmer.

52. Oligonucleotídeo antissenso, de acordo com a modalidade 51, em que o oligonucleotídeo antissenso ou a sua sequência de nucleotídeos contígua consiste ou compreende um gapmer de fórmula 5'-F-G-F'-3 ', em que a região F e F' compreende ou consiste independentemente em 1 a 4 nucleosídeos modificados por açúcar em 2' e G é uma região entre 6 e 18 nucleosídeos que são capazes de recrutar RNaseH.

53. Oligonucleotídeo antissenso, de acordo com a modalidade 52, em que o nucleosídeo modificado por açúcar em 2' é selecionado independentemente do grupo que consiste em 2'-O-alquil-RNA, 2'-O-metil-RNA, 2'-alcóxi-RNA, 2'-O- metoxietil-RNA, 2'-amino-DNA, 2'-fluoro-DNA, ácido nucleico arabino (ANA), 2'-fluoro-ANA e nucleosídeos de LNA.

54. Oligonucleotídeo antissenso, de acordo com a modalidade 52 ou 53, em que um ou mais dos nucleosídeos modificados por açúcar em 2' nas regiões F e F' é um nucleosídeo de LNA

55. Oligonucleotídeo antissenso, de acordo com a modalidade 54, em que todos os nucleosídeos modificados por açúcar em 2' nas regiões F e F' são nucleosídeos de oxi- LNA.

56. Oligonucleotídeo antissenso, de acordo com qualquer uma das modalidades 53 ou 55, em que o nucleosídeo de LNA é selecionado a partir de beta-D-oxi-LNA, alfa-L- oxi-LNA, beta-D-amino-LNA, alfa-L-amino-LNA, beta-D-tio- LNA, alfa-L-tio-LNA, (S)cET, (R)cET beta-D-ENA e alfa-L- ENA.

57. Oligonucleotídeo antissenso, de acordo com a modalidade 53 a 56, em que as regiões F e F' consistem de nucleosídeos de LNA idênticos.

58. Oligonucleotídeo antissenso, de acordo com a modalidade 53 a 57, em que todos os nucleosídeos modificados por açúcar em 2' nas regiões F e F' são nucleosídeos de oxi-LNA.

59. Oligonucleotídeo antissenso, de acordo com qualquer uma das modalidades 52 a 58, em que os nucleosídeos na região G são nucleosídeos de alfa-L-LNA e/ou DNA.

60. Oligonucleotídeo antissenso, de acordo com a modalidade 59, em que a região G consiste em pelo menos 75% de nucleosídeos de DNA.

61. Oligonucleotídeo antissenso, de acordo com a modalidade 60, em que todos os nucleosídeos na região G são nucleosídeos de DNA.

62. Oligonucleotídeo, de acordo com qualquer uma das modalidades 17 a 62, em que o oligonucleotídeo é selecionado a partir de CMP ID NO: 22_1; 23_1; 24_1; 25_1; 26_1; 27_1; 28_1; 29_1; 30_1; 31_1; 32_1; 33_1; 34_1; 35_1; 36_1; 37_1; 38_1; 39_1; 40_1; 41_1; 42_1; 42_2; 42_3; 43_1; 43_2; 44_1; 45_1; 46_1; 49_1; 130_1; 109_1; 83_1; 203_1 e 232_1, ou seus sais farmaceuticamente aceitáveis.

63. Composto conjugado compreendendo um oligonucleotídeo de acordo com qualquer uma das modalidades17 para50 ou um oligonucleotídeo antissenso, de acordo com qualquer uma das modalidades51 para62, e pelo menos uma fração conjugada covalentemente ligada ao referido oligonucleotídeo antissenso.

64. Composto conjugado da modalidade 63, em que o oligonucleotídeo é um siRNA de fita dupla e a fração do conjugado está covalentemente ligada à fita senso do siRNA.

65. Composto de conjugado, de acordo com modalidade 63 ou 64, em que a fração conjugada é selecionada a partir de carboidratos, ligantes do receptor da superfície celular, substâncias de farmácos, hormônios, substâncias lipofílicas, polímeros, proteínas, peptídeos, toxinas, vitaminas, proteínas virais ou combinações dos mesmos.

66. Composto conjugado, de acordo com qualquer uma das modalidades 63 a 65, em que a fração conjugada é capaz de se ligar ao receptor de asialoglicoproteína.

67. Composto conjugado, de acordo com a modalidade 66, em que a fração conjugada compreende pelo menos uma fração de direcionamento do receptor de asialoglicoproteína selecionada a partir do grupo que consiste em galactose, galactosamina, N-formil- galactosamina, N-acetilgalactosamina, N-propionil- galactosamina, Nn-butanoil-galactosamina e N- isobutanoilgalactosamina.

68. Composto conjugado, de acordo com a modalidade 67, em que a fração de direcionamento do receptor de asialoglicoproteína é N-acetilgalactosamina (GalNAc).

69. Composto conjugado, de acordo com a modalidade 67 ou 68, em que a fração do conjugado é monovalente, di-valente, trivalente ou tetrivalente em relação às frações de direcionamento do receptor de asialoglicoproteína.

70. Composto conjugado, de acordo com a modalidade 69, em que a fração conjugada consiste em duas a quatro frações GalNAc terminais e um espaçador que liga cada fração GalNAc a uma molécula ramificadora que pode ser conjugada ao composto antissenso.

71. Composto conjugado, de acordo com a modalidade 70, em que o espaçador é um espaçador de PEG.

72. Composto conjugado, de acordo com a modalidade 66 a 71, em que a fração conjugada é uma fração N-acetilgalactosamina (GalNAc) trivalente.

73. Composto conjugado, de acordo com a modalidade 66 a 72, em que fração conjugada ser selecionada a partir de uma das frações GalNAc trivalente na Figura 1.

74. Composto conjugado, de acordo com modalidade 73, em que a fração conjugada é a fração GalNAc trivalente na Figura 1D.

75. Composto conjugado, de acordo com a modalidade 63 a 74, compreendendo um ligante que está posicionado entre o oligonucleotídeo ou o oligonucleotídeo antissenso e a fração conjugada.

76. Composto conjugado, de acordo com a modalidade 75, em que o ligante é um ligante fisiologicamente lábil.

77. Composto conjugado, de acordo com a modalidade 76, em que o ligante fisiologicamente lábil é um ligante suscetível a nuclease.

78. Conjugado de oligonucleotídeo, de acordo com a modalidade 76 ou77, em que o ligante fisiologicamente lábil é composto de 2 a 5 ligações fosfodiéster consecutivas.

79. Composto conjugado. de acordo com a modalidade 66 a 78, que exibem distribuição celular melhorada entre o fígado vsersus rim ou absorção celular melhorada no fígado do composto conjugado em comparação com um oligonucleotídeo não conjugado ou oligonucleotídeo antissenso.

80. Composição farmacêutica que compreende um oligonucleotídeo, de acordo com qualquer uma das modalidades 17 a 50 ou um oligonucleotídeo antissenso, de acordo com qualquer uma das modalidades 51 a61, um composto conjugado da modalidade63 a 79 ou seus sais aceitáveis e um diluente, veículo, sal e/ou adjuvante farmaceuticamente aceitável.

81. Método para identificar um composto que previne, melhora e/ou inibe uma infecção pelo vírus da hepatite B (HBV), compreendendo: a. colocar um composto de teste em contato com i. um polipeptídeo RTEL1; ou ii. uma célula que expressa RTEL1; b. medir a expressão e/ou a atividade de RTEL1 na presença e ausência do referido composto de teste; e c. identificar um composto que reduz a expressão e/ou atividade RTEL1 e reduz o cccDNA.

82. Método in vivo ou in vitro para modular a expressão de RTEL1 em uma célula alvo que expressa RTEL1, o referido método compreendendo a administração do oligonucleotídeo de qualquer uma das modalidades 17 a 50 ou um oligonucleotídeo antissenso de acordo com qualquer uma das modalidades 51 a 61, um composto conjugado da modalidade 63 a 79 ou a composição farmacêutica da modalidade 80 em uma quantidade eficaz para a referida célula.

83. Método, de acordo com modalidades 82, em que a expressão de RTEL1 é reduzida em pelo menos 50%, ou pelo menos 60%, ou pelo menos 70%, ou pelo menos 80%, ou pelo menos 90%, ou pelo menos 95% na célula alvo em comparação com o nível sem qualquer tratamento ou tratado com um controle.

84. Método, de acordo com a modalidade 82, em que a célula alvo é infectada com HBV e o cccDNA em uma célula infectada com HBV é reduzido em pelo menos 50%, ou pelo menos 60%, ou pelo menos 70%, ou pelo menos 80%, ou pelo menos 90%, ou pelo menos 95% na célula alvo infectada com HBV em comparação com o nível sem qualquer tratamento ou tratado com um controle.

85. Método para tratar ou prevenir uma doença, compreendendo a administração de uma quantidade terapeuticamente ou profilaticamente eficaz do oligonucleotídeo de acordo com qualquer uma das modalidades 17 a 50 ou um oligonucleotídeo antissenso de acordo com qualquer uma das modalidades 51 a 61, um composto conjugado de acordo com a modalidade 63 a 79 ou a composição farmacêutica da modalidade 80 a um paciente que sofre ou é suscetível à doença.

86. Oligonucleotídeo, de acordo com qualquer uma das modalidades 17 a 50 ou o oligonucleotídeo antissenso, de acordo com qualquer uma das modalidades 51 a 61, ou o composto conjugado de qualquer uma das modalidades 63 a 79 ou a composição farmacêutica da modalidade 80, para uso como um medicamento para tratamento ou prevenção de uma doença em um paciente.

87. Uso do oligonucleotídeo, de acordo com qualquer uma das modalidades 17 a 50 ou o oligonucleotídeo antissenso de acordo com qualquer uma das modalidades 51 a61, ou o composto conjugado de acordo com qualquer uma das modalidades 63 a 79 para a preparação de um medicamento para o tratamento ou prevenção de uma doença em um paciente.

88. Método, o oligonucleotídeo, o oligonucleotídeo antissenso, o conjugado ou o uso de modalidades 85 a 87 em que o paciente é um mamífero.

89. Método, o oligonucleotídeo, o oligonucleotídeo antissenso, o conjugado ou o uso da modalidade 88, em que o mamífero é humano.

[000239] A invenção será agora ilustrada pelos seguintes exemplos que não têm caráter limitativo.

EXEMPLOS MATERIAIS E MÉTODOS SEQUÊNCIAS DE MOTIVO DE OLIGONUCLEOTÍDEO E COMPOSTOS DE

OLIGONUCLEOTÍDEO TABELA 6: LISTAGEM DE SEQUÊNCIAS DE MOTIVO DE OLIGONUCLEOTÍDICO (INDICADAS POR SEQ ID NO), PROJETOS DAS MESMAS, BEM COMO COMPOSTOS DE OLIGONUCLEOTÍDEO ESPECÍFICOS (INDICADOS POR CMP ID NO) PROJETADOS COM BASE NA SEQUÊNCIA DE MOTIVO. SEQ Sequência de motivo Desenho Composto de CMP Posiç ID oligonucleotídeo ID ão na

NO NO SEQ

ID NO: 1 22 catggaaggacagtggt 2-12-3 CAtggaaggacagtGGT 22_1 8295 agctttattataacttgaa 4-14-2 AGCTttattataacttgaAT 8684 23 t 23_1 24 cgggacaggtagtaag 3-10-3 CGGgacaggtagtAAG 24_1 9668 25 cgggacaggtagtaa 3-9-3 CGGgacaggtagTAA 25_1 9669 26 gcatccaacaagtaattgt 2-15-2 GCatccaacaagtaattGT 26_1 9722

SEQ Sequência de motivo Desenho Composto de CMP Posiç ID oligonucleotídeo ID ão na

NO NO SEQ

ID NO: 1 27 gcatccaacaagtaattg 2-12-4 GCatccaacaagtaATTG 27_1 9723 28 ggcatccaacaagtaatt 3-13-2 GGCatccaacaagtaaTT 28_1 9724 29 ggttgggttagaagct 2-12-2 GGttgggttagaagCT 29_1 10921 gcttttacatttaggttta 3-15-2 GCTtttacatttaggtttAT 11483 30 t 30_1 31 catgttcctttctataact 3-14-2 CATgttcctttctataaCT 31_1 11512 32 agctttaaattttggtgaa 3-13-3 AGCtttaaattttggtGAA 32_1 11622 ttttacatactctggtcaa 2-14-4 TTttacatactctggtCAAA 11753 33 a 33_1 34 ttttacatactctggtca 3-12-3 TTTtacatactctggTCA 34_1 11755 gaattttacatactctggt 3-14-3 GAAttttacatactctgGTC 11756 35 c 35_1 36 gaattttacatactctggt 2-14-3 GAattttacatactctGGT 36_1 11757 gagaattttacatactctg 2-15-3 GAgaattttacatactcTGG 11758 37 g 37_1 38 atctttgaacacgtctt 3-11-3 ATCtttgaacacgtCTT 38_1 12868 39 acaaaaaacagtaggtcc 2-12-4 ACaaaaaacagtagGTCC 39_1 13234 40 ggaataaaacagtaggtc 2-12-4 GGaataaaacagtaGGTC 40_1 13551 41 agcttcgtcaaagatcac 3-13-2 AGCttcgtcaaagatcAC 41_1 14786 42 ggtgggtggatgtttc 1-12-3 GgtgggtggatgtTTC 42_1 18085 42 ggtgggtggatgtttc 1-11-4 GgtgggtggatgTTTC 42_2 18085 42 ggtgggtggatgtttc 1-13-2 GgtgggtggatgttTC 42_3 18085 43 ggtggtgtggagaagc 1-12-3 GgtggtgtggagaAGC 43_1 22425 43 ggtggtgtggagaagc 1-13-2 GgtggtgtggagaaGC 43_2 22425 44 gctcatactccacacac 2-13-2 GCtcatactccacacAC 44_1 33030 catcggaacccttgtagtc 2-16-2 CAtcggaacccttgtagtCC 35103 45 c 45_1 46 gatacagacctcctcaaac 2-15-2 GAtacagacctcctcaaAC 46_1 35371 47 ggtggaggtggtgctgc 1-14-2 GgtggaggtggtgctGC 47_1 35636 48 aggtggaggtggtgct 1-12-3 AggtggaggtggtGCT 48_1 35638 49 tggtgtgggagtagca 2-12-2 TGgtgtgggagtagCA 49_1 36915 50 cgatggcgagaaatta 4-10-2 CGATggegagaaatTA 50_1 3824

NO NO SEQ

ID NO: 1 taattcagcaaaaaagccc 51 a 3-15-2 TAAttcagcaaaaaagccCA 51_1 3858 52 aagaatctgacacccca 2-12-3 AAgaatctgacaccCCA 52_1 3924 agacagccaagaatctgac 53 ac 1-18-2 AgacagccaagaatctgacAC 53_1 3928 54 cagccaagaatctgaca 2-12-3 CAgccaagaatctgACA 54_1 3929 55 acaggaacccgacag 2-10-3 ACaggaaccegaCAG 55_1 4496 gttactctcttgtttcttc 56 ac 1-18-2 GttactctcttgtttcttcAC 56_1 4789 57 ttactctcttgtttcttca 1-16-2 TtactctcttgtttcttCA 57_1 4790 57 ttactctcttgtttcttca 1-14-4 TtactctcttgtttcTTCA 57_2 4790 58 gttactctcttgtttcttc 2-15-2 GTtactctcttgtttctTC 58_1 4791 59 cgtgggtggagaagca 1-13-2 CgtgggtggagaagCA 59_1 5717 60 acgtgggtggagaagc 2-12-2 ACgtgggtggagaaGC 60_1 5718 61 cagaaactgtaagggca 1-13-3 CagaaactgtaaggGCA 61_1 5815 62 agggatagcagggaagg 2-13-2 AGggatagcagggaaGG 62_1 7246 63 gcttaaacacagacaga 2-11-4 GCttaaacacagaCAGA 63_1 7501 64 tgcttaaacacagacag 3-11-3 TGCttaaacacagaCAG 64_1 7502 65 cagggcagggaagaacag 1-14-3 CagggcagggaagaaCAG 65_1 7845 66 catggaaggacagtgg 3-10-3 CATggaaggacagTGG 66_1 8296 66 catggaaggacagtgg 1-12-3 CatggaaggacagTGG 66_2 8296 67 ccccctcaatataagaa 3-12-2 CCCcctcaatataagAA 67_1 8705 68 aaccaaccctattcctgg 2-14-2 AAccaaccctattcctGG 68_1 9375 68 aaccaaccctattcctgg 1-15-2 AaccaaccctattcctGG 68_2 9375 69 accaaccctattcctg 1-12-3 AccaaccctattcCTG 69_1 9376 70 aaccaaccctattcctg 3-12-2 AACcaaccctattccTG 70_1 9376 71 aaaaccaaccctattcct 3-12-3 AAAaccaaccctattCCT 71_1 9377 72 aaaccaaccctattcc 4-10-2 AAACcaaccctattCC 72_1 9378 73 ggtagtaagggcacacc 1-14-2 GgtagtaagggcacaCC 73_1 9660 gacaggtagtaagggcaca 74 c 1-17-2 GacaggtagtaagggcacAC 74_1 9661 75 gtagtaagggcacac 3-9-3 GTAgtaagggcaCAC 75_1 9661 76 gacaggtagtaagggcaca 1-16-2 GacaggtagtaagggcaCA 76_1 9662

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ID NO: 1 77 acaggtagtaagggcaca 2-14-2 ACaggtagtaagggcaCA 77_1 9662 78 gacaggtagtaagggca 2-13-2 GAcaggtagtaagggCA 78_1 9664 79 cgggacaggtagtaaggg 1-15-2 CgggacaggtagtaagGG 79_1 9666 80 catccaacaagtaattgt 3-12-3 CATccaacaagtaatTGT 80_1 9722 80 catccaacaagtaattgt 2-13-3 CAtccaacaagtaatTGT 80_2 9722 ggcatccaacaagtaattg 81 t 1-16-3 GgcatccaacaagtaatTGT 81_1 9722 82 ggcatccaacaagtaattg 3-14-2 GGCatccaacaagtaatTG 82_1 9723 82 ggcatccaacaagtaattg 1-15-3 GgcatccaacaagtaaTTG 82_2 9723 83 ggcatccaacaagtaat 4-11-2 GGCAtccaacaagtaAT 83_1 9725 83 ggcatccaacaagtaat 3-12-2 GGCatccaacaagtaAT 83_2 9725 84 cgtgaaggagagaacct 2-12-3 CGtgaaggagagaaCCT 84_1 10036 85 acgtgaaggagagaacc 3-12-2 ACGtgaaggagagaaCC 85_1 10037 86 gacgtgaaggagagaacc 2-13-3 GAegtgaaggagagaACC 86_1 10037 86 gacgtgaaggagagaacc 2-14-2 GAegtgaaggagagaaCC 86_2 10037 85 acgtgaaggagagaacc 4-11-2 ACGTgaaggagagaaCC 85_2 10037 87 gacgtgaaggagagaac 2-11-4 GAcgtgaaggagaGAAC 87_1 10038 88 cagtcttgctatgcct 2-12-2 CAgtcttgctatgcCT 88_1 10563 89 ctagaatcaaagctcca 2-12-3 CTagaatcaaagctCCA 89_1 10591 90 acatcgcacttgggc 1-12-2 AcategcacttggGC 90_1 10705 91 cacggcaaacctcacc 1-12-3 CaeggcaaacctcACC 91_1 10851 92 aaccacggcaaacctcac 3-13-2 AACcaeggcaaacctcAC 92_1 10852 93 caaagcaccgagtcacc 1-13-3 CaaagcacegagtcACC 93_1 10873 94 tcaaagcaccgagtcac 1-13-3 TcaaagcacegagtCAC 94_1 10874 95 ctggttgggttagaag 2-10-4 CTggttgggttaGAAG 95_1 10923 95 ctggttgggttagaag 2-12-2 CTggttgggttagaAG 95_2 10923 96 tataacttttagtttagc 2-12-4 TAtaacttttagttTAGC 96_1 11501 97 ttcctttctataactttt 4-12-2 TTCCtttctataacttTT 97_1 11509 98 gttcctttctataactttt 4-13-2 GTTCctttctataacttTT 98_1 11509 99 gttcctttctataacttt 4-12-2 GTTCctttctataactTT 99_1 11510 atgttcctttctataactt 100_ 100 t 2-15-3 ATgttcctttctataacTTT 1 11510

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ID NO: 1 101_ 101 atgttcctttctataactt 2-14-3 ATgttcctttctataaCTT 1 11511 102_ 102 atgttcctttctataact 2-14-2 ATgttcctttctataaCT 1 11512 103_ 103 gctttaatctgccttc 1-11-4 GctttaatctgcCTTC 1 12697 104_ 104 ccgtggctttaatctgc 1-14-2 CegtggctttaatctGC 1 12701 105_ 105 ccgtggctttaatctg 2-12-2 CCgtggctttaatcTG 1 12702 105_ 105 ccgtggctttaatctg 3-11-2 CCGtggctttaatcTG 2 12702 106_ 106 caaaaaacagtaggtcc 2-11-4 CAaaaaacagtagGTCC 1 13234 106_ 106 caaaaaacagtaggtcc 3-11-3 CAAaaaacagtaggTCC 2 13234 107_ 107 gaataaaacagtaggtcc 2-12-4 GAataaaacagtagGTCC 1 13550 108_ 108 ggaataaaacagtaggtcc 4-13-2 GGAAtaaaacagtaggtCC 1 13550 108_ 108 ggaataaaacagtaggtcc 2-15-2 GGaataaaacagtaggtCC 2 13550 108_ 108 ggaataaaacagtaggtcc 1-14-4 GgaataaaacagtagGTCC 3 13550 109_ 109 ggaataaaacagtaggt 3-11-3 GGAataaaacagtaGGT 1 13552 109_ 109 ggaataaaacagtaggt 2-11-4 GGaataaaacagtAGGT 2 13552 110_ 110 ggaataaaacagtagg 2-10-4 GGaataaaacagTAGG 1 13553 111_ 111 cacagagtgtcatggg 1-13-2 CacagagtgtcatgGG 1 14032 112_ 112 acagcatggaaaggcacg 1-13-4 AcagcatggaaaggCACG 1 14523

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ID NO: 1 113_ 113 cagcatggaaaggcacg 1-12-4 CagcatggaaaggCACG 1 14523 tacaggaggaagagaaggg 114_ 114 ac 1-18-2 TacaggaggaagagaagggAC 1 14725 115_ 115 acaggaggaagagaaggg 1-13-4 AcaggaggaagagaAGGG 1 14727 116_ 116 tctacaggaggaagagaa 4-12-2 TCTAcaggaggaagagAA 1 14730 116_ 116 tctacaggaggaagagaa 1-13-4 TctacaggaggaagAGAA 2 14730 117_ 117 tctacaggaggaagaga 4-11-2 TCTAcaggaggaagaGA 1 14731 117_ 117 tctacaggaggaagaga 2-12-3 TCtacaggaggaagAGA 2 14731 117_ 117 tctacaggaggaagaga 2-11-4 TCtacaggaggaaGAGA 3 14731 118_ 118 cttcgtcaaagatcacg 2-11-4 CTtcgtcaaagatCACG 1 14785 119_ 119 gcttcgtcaaagatcacg 2-13-3 GCttegtcaaagatcACG 1 14785 120_ 120 gcttcgtcaaagatcac 3-11-3 GCTtegtcaaagatCAC 1 14786 120_ 120 gcttcgtcaaagatcac 2-13-2 GCttegtcaaagatcAC 2 14786 121_ 121 ccagaaaggtttgcg 3-10-2 CCAgaaaggtttgCG 1 14874 122_ 122 tccagaaaggtttgcg 3-11-2 TCCagaaaggtttgCG 1 14874 122_ 122 tccagaaaggtttgcg 1-12-3 TccagaaaggtttGCG 2 14874 123_ 123 cagaggcatcggatcag 2-13-2 CAgaggcateggatcAG 1 14974 124_ 124 cagaggcatcggatca 3-11-2 CAGaggcateggatCA 1 14975

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ID NO: 1 125_ 125 agcagaggcatcggatc 2-13-2 AGcagaggcateggaTC 1 14976 126_ 126 attcttcacacatcttc 2-11-4 ATtcttcacacatCTTC 1 16133 127_ 127 ctatgaacgcacctg 3-9-3 CTAtgaaegcacCTG 1 16282 128_ 128 ggctatgaacgcacctg 1-14-2 GgctatgaaegcaccTG 1 16282 129_ 129 gctgggagaagacatag 1-12-4 GctgggagaagacATAG 1 16593 130_ 130 caaaatgcccttacagtga 4-13-2 CAAAatgcccttacagtGA 1 16919 131_ 131 caaaatgcccttacagt 2-12-3 CAaaatgcccttacAGT 1 16921 tgtgcgattttaaaggaaa 132_ 132 at 3-15-3 TGTgegattttaaaggaaAAT 1 17525 catgtgcgattttaaagga 133_ 133 aa 3-15-3 CATgtgegattttaaaggAAA 1 17527 134_ 134 tgtgcgattttaaaggaa 4-12-2 TGTGegattttaaaggAA 1 17528 135_ 135 catgtgcgattttaaagga 1-15-3 CatgtgegattttaaaGGA 1 17529 136_ 136 atgtgcgattttaaagga 3-13-2 ATGtgegattttaaagGA 1 17529 accctgtcacttaaatata 137_ 137 tg 1-18-2 AccctgtcacttaaatataTG 1 17712 138_ 138 gagggaggtggagcgtt 1-14-2 GagggaggtggagegTT 1 17924 139_ 139 ctgaagagtggagaagg 2-11-4 CTgaagagtggagAAGG 1 18130 139_ 139 ctgaagagtggagaagg 1-13-3 CtgaagagtggagaAGG 2 18130 caataaataaagtgtgagg 140_ 140 a 3-14-3 CAAtaaataaagtgtgaGGA 1 18454

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ID NO: 1 141_ 141 caacccagtaaccatgac 3-13-2 CAAcccagtaaccatgAC 1 19424 142_ 142 caacccagtaaccatga 3-12-2 CAAcccagtaaccatGA 1 19425 143_ 143 accaacccagtaaccatga 1-16-2 AccaacccagtaaccatGA 1 19425 144_ 144 gagcaggtgttttatc 3-11-2 GAGcaggtgttttaTC 1 19825 145_ 145 ggtcgaggaggtgtcac 1-14-2 GgtcgaggaggtgtcAC 1 20437 145_ 145 ggtcgaggaggtgtcac 2-13-2 GGtcgaggaggtgtcAC 2 20437 146_ 146 gtcgaggaggtgtcac 1-11-4 GtcgaggaggtgTCAC 1 20437 147_ 147 ggtcgaggaggtgtca 1-13-2 GgtcgaggaggtgtCA 1 20438 147_ 147 ggtcgaggaggtgtca 1-12-3 GgtcgaggaggtgTCA 2 20438 148_ 148 ggtcgaggaggtgtc 2-11-2 GGtcgaggaggtgTC 1 20439 149_ 149 ccaggtctcaaaaaggg 1-13-3 CcaggtctcaaaaaGGG 1 20653 150_ 150 attacgctgaggaca 1-10-4 AttaegctgagGACA 1 21489 151_ 151 cattacgctgaggac 4-9-2 CATTaegctgaggAC 1 21490 152_ 152 cttgagcattacgc 3-8-3 CTTgagcattaCGC 1 21497 153_ 153 cgaggagaagaaggcag 3-12-2 CGAggagaagaaggcAG 1 22019 153_ 153 cgaggagaagaaggcag 2-11-4 CGaggagaagaagGCAG 2 22019 154_ 154 ccttggtctgaaacgtgat 1-15-3 CcttggtctgaaaegtGAT 1 22071

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ID NO: 1 155_ 155 ctaacgcctccacgc 1-12-2 CtaaegcctccacGC 1 22281 156_ 156 ggacaggctctacgg 1-11-3 GgacaggctctaCGG 1 22312 actaatacagcaggagaag 157_ 157 g 2-16-2 ACtaatacagcaggagaaGG 1 22964 aactaatacagcaggagaa 158_ 158 gg 1-16-4 AactaatacagcaggagAAGG 1 22964 aactaatacagcaggagaa 158_ 158 gg 1-17-3 AactaatacagcaggagaAGG 2 22964 taactaatacagcaggaga 159_ 159 ag 1-16-4 TaactaatacagcaggaGAAG 1 22965 160_ 160 ttgaagagccaaccac 1-11-4 TtgaagagccaaCCAC 1 24131 161_ 161 ccattttcactgtcaag 3-12-2 CCAttttcactgtcaAG 1 25605 162_ 162 gccattttcactgtcaa 2-12-3 GCcattttcactgtCAA 1 25606 163_ 163 agaaatgcggagaagc 2-10-4 AGaaatgeggagAAGC 1 25796 aaatggaaaaaatgaccag 164_ 164 c 2-14-4 AAatggaaaaaatgacCAGC 1 26188 aggacttacgacaaaacca 165_ 165 c 1-15-4 AggacttaegacaaaaCCAC 1 26505 166_ 166 ggacttacgacaaaacca 2-13-3 GGacttaegacaaaaCCA 1 26506 167_ 167 gacttacgacaaaacca 3-11-3 GACttaegacaaaaCCA 1 26506 168_ 168 acaccaggacttacgaca 1-14-3 AcaccaggacttaegACA 1 26512 169_ 169 tagaaattcaacatggc 1-12-4 TagaaattcaacaTGGC 1 27376 169_ 169 tagaaattcaacatggc 4-11-2 TAGAaattcaacatgGC 2 27376

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ID NO: 1 169_ 169 tagaaattcaacatggc 2-12-3 TAgaaattcaacatGGC 3 27376 170_ 170 ctagaaattcaacatggc 2-13-3 CTagaaattcaacatGGC 1 27376 171_ 171 gtcatcggttcacc 1-9-4 GtcateggttCACC 1 27602 172_ 172 actcgaagacgcca 2-8-4 ACtegaagacGCCA 1 28539 173_ 173 gactcgaagacgcc 3-9-2 GACtegaagaegCC 1 28540 174_ 174 ggcacaagcagaacgac 2-13-2 GGcacaagcagaaegAC 1 29235 175_ 175 agtcagaacaaaggaggc 1-15-2 AgtcagaacaaaggagGC 1 29668 176_ 176 gaagtcagaacaaaggag 4-12-2 GAAGtcagaacaaaggAG 1 29670 177_ 177 gcagaagtcagaacaaagg 1-14-4 GcagaagtcagaacaAAGG 1 29672 178_ 178 gtgcagaagtcagaacaaa 3-13-3 GTGcagaagtcagaacAAA 1 29674 178_ 178 gtgcagaagtcagaacaaa 3-14-2 GTGcagaagtcagaacaAA 2 29674 179_ 179 gtgcagaagtcagaacaa 3-13-2 GTGcagaagtcagaacAA 1 29675 180_ 180 aaggatgagggagcggac 1-14-3 AaggatgagggagegGAC 1 29894 181_ 181 gtaaggatgagggagc 2-12-2 GTaaggatgagggaGC 1 29898 182_ 182 tggtaaggatgagggag 1-12-4 TggtaaggatgagGGAG 1 29899 183_ 183 cgtacatctgcatctc 2-10-4 CGtacatctgcaTCTC 1 29951 tgtaagataagaggcaaca 184_ 184 ct 1-18-2 TgtaagataagaggcaacaCT 1 30947

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ID NO: 1 ttgtaagataagaggcaac 185_ 185 ac 1-17-3 TtgtaagataagaggcaaCAC 1 30948 ttgtaagataagaggcaac 186_ 186 a 2-14-4 TTgtaagataagaggcAACA 1 30949 tttgtaagataagaggcaa 187_ 187 ca 2-17-2 TTtgtaagataagaggcaaCA 1 30949 188_ 188 tgtaagataagaggcaa 2-11-4 TGtaagataagagGCAA 1 30951 189_ 189 ctggaaggaaagttggt 2-12-3 CTggaaggaaagttGGT 1 31229 190_ 190 atagtaagcactgatggtc 3-14-2 ATAgtaagcactgatggTC 1 31245 190_ 190 atagtaagcactgatggtc 1-14-4 AtagtaagcactgatGGTC 2 31245 191_ 191 tagtaagcactgatgg 2-11-3 TAgtaagcactgaTGG 1 31247 192_ 192 catagtaagcactgatg 3-12-2 CATagtaagcactgaTG 1 31248 192_ 192 catagtaagcactgatg 2-11-4 CAtagtaagcactGATG 2 31248 193_ 193 ctgtaactcacctggc 1-13-2 CtgtaactcacctgGC 1 31835 193_ 193 ctgtaactcacctggc 2-12-2 CTgtaactcacctgGC 2 31835 194_ 194 cggatcactcgcccg 1-12-2 CggatcactegccCG 1 32000 195_ 195 acacaggctactctcgg 1-14-2 AcacaggctactcteGG 1 33017 196_ 196 acacaggctactctcg 3-10-3 ACAcaggctactcTCG 1 33018 197_ 197 ccacacacaggctactc 1-14-2 CcacacacaggctacTC 1 33021 198_ 198 atactccacacacaggct 1-15-2 AtactccacacacaggCT 1 33025

NO NO SEQ

ID NO: 1 199_ 199 atactccacacacaggc 1-14-2 AtactccacacacagGC 1 33026 200_ 200 gctcatactccacacacag 1-16-2 GctcatactccacacacAG 1 33028 201_ 201 tcatactccacacacag 2-11-4 TCatactccacacACAG 1 33028 201_ 201 tcatactccacacacag 2-13-2 TCatactccacacacAG 2 33028 202_ 202 gctcatactccacacaca 1-14-3 GctcatactccacacACA 1 33029 202_ 202 gctcatactccacacaca 1-15-2 GctcatactccacacaCA 2 33029 203_ 203 tgctcatactccacacac 1-14-3 TgctcatactccacaCAC 1 33030 203_ 203 tgctcatactccacacac 1-15-2 TgctcatactccacacAC 2 33030 203_ 203 tgctcatactccacacac 2-14-2 TGctcatactccacacAC 3 33030 204_ 204 agcaggaagcagggagaaa 2-15-2 AGcaggaagcagggagaAA 1 33562 205_ 205 tccgaccacagcgag 2-11-2 TCegaccacagegAG 1 33681 206_ 206 cagaagccaagggacatg 1-14-3 CagaagccaagggacATG 1 34432 206_ 206 cagaagccaagggacatg 2-14-2 CAgaagccaagggacaTG 2 34432 207_ 207 cagaagccaagggacat 2-12-3 CAgaagccaagggaCAT 1 34433 208_ 208 ccagaccaacacggaaacg 1-14-4 CcagaccaacaeggaAACG 1 34571 209_ 209 ccagaccaacacggaaac 2-12-4 CCagaccaacaeggAAAC 1 34572 210_ 210 gaatgggcaaagggtaga 4-12-2 GAATgggcaaagggtaGA 1 34742

NO NO SEQ

ID NO: 1 211_ 211 aatgggcaaagggtaga 2-12-3 AAtgggcaaagggtAGA 1 34742 210_ 210 gaatgggcaaagggtaga 2-14-2 GAatgggcaaagggtaGA 2 34742 212_ 212 gaatgggcaaagggtag 2-12-3 GAatgggcaaagggTAG 1 34743 213_ 213 gaacccttgtagtcctg 1-14-2 GaacccttgtagtccTG 1 35101 214_ 214 aacccttgtagtcct 4-9-2 AACCcttgtagtcCT 1 35102 215_ 215 ggaacccttgtagtc 2-11-2 GGaacccttgtagTC 1 35104 216_ 216 atcggaacccttgtagtc 2-14-2 ATeggaacccttgtagTC 1 35104 216_ 216 atcggaacccttgtagtc 1-15-2 AteggaacccttgtagTC 2 35104 217_ 217 catcggaacccttgtagtc 1-16-2 CateggaacccttgtagTC 1 35104 218_ 218 catcggaacccttgtagt 2-14-2 CAtcggaacccttgtaGT 1 35105 gatacagacctcctcaaac 219_ 219 t 1-17-2 GatacagacctcctcaaaCT 1 35370 220_ 220 gatacagacctcctcaaac 2-14-3 GAtacagacctcctcaAAC 1 35371 221_ 221 gatacagacctcctcaaa 2-13-3 GAtacagacctcctcAAA 1 35372 221_ 221 gatacagacctcctcaaa 2-12-4 GAtacagacctcctCAAA 2 35372 221_ 221 gatacagacctcctcaaa 1-13-4 GatacagacctcctCAAA 3 35372 222_ 222 gatacagacctcctcaa 2-11-4 GAtacagacctccTCAA 1 35373 222_ 222 gatacagacctcctcaa 1-13-3 GatacagacctcctCAA 2 35373

NO NO SEQ

ID NO: 1 223_ 223 gccccatttaccagtg 1-13-2 GccccatttaccagTG 1 35470 224_ 224 cccaacaagtgatgct 2-12-2 CCcaacaagtgatgCT 1 35965 225_ 225 cccaacaagtgatgc 2-11-2 CCcaacaagtgatGC 1 35966 226_ 226 gtaccaagcccagaagg 1-14-2 GtaccaagcccagaaGG 1 36279 227_ 227 gtaccaagcccagaag 1-11-4 GtaccaagcccaGAAG 1 36280 228_ 228 ttcctgatgaagagatg 4-11-2 TTCCtgatgaagagaTG 1 36549 229_ 229 tcctgatgaagagatg 2-10-4 TCctgatgaagaGATG 1 36549 229_ 229 tcctgatgaagagatg 3-11-2 TCCtgatgaagagaTG 2 36549 230_ 230 tgggagtagcatggc 2-11-2 TGggagtagcatgGC 1 36911 231_ 231 tgtgggagtagcatggc 1-14-2 TgtgggagtagcatgGC 1 36911 232_ 232 gtgggagtagcatggc 1-13-2 GtgggagtagcatgGC 1 36911 230_ 230 tgggagtagcatggc 1-11-3 TgggagtagcatGGC 2 36911 233_ 233 aaacatgctgaaccctg 2-11-4 AAacatgctgaacCCTG 1 37254 234_ 234 acaaacatgctgaaccct 2-13-3 ACaaacatgctgaacCCT 1 37255 234_ 234 acaaacatgctgaaccct 1-14-3 AcaaacatgctgaacCCT 2 37255 234_ 234 acaaacatgctgaaccct 3-13-2 ACAaacatgctgaaccCT 3 37255 235_ 235 cacaaacatgctgaaccc 2-14-2 CAcaaacatgctgaacCC 1 37256

NO NO SEQ

ID NO: 1 236_ 236 cacaaacatgctgaacc 2-12-3 CAcaaacatgctgaACC 1 37257 237 tggacgcacaaacatgc 1-12-4 TggaegcacaaacATGC 237_ 37263 1

[000240] As sequências de motivo representam a sequência contígua de nucleobases presentes no oligonucleotídeo.

[000241] Desenhos referem-se ao projeto gapmer, F-G-F', onde cada número representa o número de nucleosídeos modificados consecutivos, por exemplo, 2' nucleosídeos modificados (primeiro número = 5' flanco), seguido pelo número de nucleosídeos de DNA (segundo número = região de lacuna), seguido pelo número de nucleosídeos modificados, por exemplo, 2' nucleosídeos modificados (terceiro número = 3' flanco), opcionalmente precedido por ou seguido por outras regiões repetidas de DNA e LNA, que não são necessariamente parte da sequência contígua que é complementar para o ácido nucleico alvo.

[000242] Os compostos de oligonucleotídeo representam desenhos específicos de uma sequência de motivo. Letras maiúsculas representam nucleosídeos de LNA beta-D-oxi, letras minúsculas representam nucleosídeos de DNA, todos os LNA C são 5-metil citosina e 5-metil DNA citosinas são apresentadas por "e", etodas as ligações internucleosídicas são ligações internucleosídicas de fosforotioato.

SÍNTESE DE OLIGONUCLEOTÍDEOS

[000243] A síntese de oligonucleotídeos é geralmente conhecida na técnica. Abaixo está um protocolo que pode ser aplicado. Os oligonucleotídeos da presente invenção podem ter sido produzidos por métodos ligeiramente variáveis em termos de aparelho, suporte e concentrações usados.

[000244] Os oligonucleotídeos são sintetizados em suportes universais de uridina usando a abordagem de fosforamidita em um Oligomaker 48 na escala de 1 µmol. No final da síntese, os oligonucleotídeos são clivados do suporte sólido usando amônia aquosa por 5 a 16 horas a 60°C. Os oligonucleotídeos são purificados por HPLC de fase reversa (RP-HPLC) ou por extrações em fase sólida e distinguidos por UPLC, e a massa molecular é ainda confirmada por ESI-MS. ALONGAMENTO DO OLIGONUCLEOTÍDEO:

[000245] O acoplamento de β-cianoetil- fosforamiditos (DNA-A(Bz), DNA- G(ibu), DNA- C(Bz), DNA-T, LNA-5-metil-C(Bz), LNA-A(Bz), LNA- G(dmf), ou LNA-T) é realizado usando uma solução de 0.1 M de amidita protegida com 5'-O-DMT em acetonitrila e DCI (4,5-dicianoimidazol) em acetonitrila (0,25 M) como ativador. Para o ciclo final, pode ser usado um fosforamidito com as modificações desejadas, por exemplo, um ligante C6 para anexar um grupo conjugado ou um grupo conjugado como tal. A tiolação para introdução de ligações de fosforioato é realizada usando hidreto de xantano (0,01 M em acetonitrila/piridina 9:1). As ligações de fosfordiéster podem ser introduzidas usando iodo de 0,02 M em THF/Piridina/água 7:2:1. O restante dos reagentes são os normalmente usados para a síntese de oligonucleotídeos.

[000246] Para conjugação pós-síntese em fase sólida, um forforamidito aminoligante C6 disponível no mercado pode ser usado no último ciclo da síntese em fase sólida e após desproteção e clivagem do suporte sólido, o oligonucleotídeo desprotegido aminoligante é isolado. Os conjugados são introduzidos por meio de ativação do grupo funcional usando métodos de síntese padrão. PURIFICAÇÃO POR RP-HPLC:

[000247] Os compostos brutos são purificados por RP-HPLC preparativa em uma coluna Phenomenex Jupiter C18 10µ 150x10 mm. Usam-se acetato de amônio de 0,1 M, pH 8, e acetonitrilo como tampões, a um quociente de vazão de 5 mL/min. As frações recolhidas são liofilizadas para obter o composto purificado normalmente como um sólido branco. ABREVIAÇÕES:

[000248] DCI: 4,5-Dicianoimidazol

[000249] DCM: Diclorometano

[000250] DMF: Dimetilformamida

[000251] DMT: 4,4'-Dimetoxitritil

[000252] THF: Tetra-hidrofurano

[000253] Bz: Benzoíla

[000254] Ibu: Isobutirila

[000255] RP-HPLC: Cromatografia líquida de alta eficiência em fase reversa ENSAIO DA TM:

[000256] E os duplex de oligonucleotídeos alvo de RNA (fosfato ligados, PO) são diluídos para 3 mM em 500 ml de RNase isenta de água e misturados com 500 ml de tampão de 2x Tm (NaCl de 200 mM, EDTA de 0,2 mM, Nafosfato de 20 mM, pH 7,0). A solução é aquecida a 95ºC por 3 min e depois deixada recozir em temperatura ambiente por 30 min. As temperaturas de fusão do duplex (Tm) são medidas em um espectrofotômetro Lambda 40 UV/VIS equipado com um programador de temperatura PTP6 usando o software PE Templab (Perkin Elmer). A temperatura é aumentada de 20°C para 95°C e depois para 25°C, registrando absorção a 260 nm. A primeira derivada e os máximos locais da fusão e do recozimento são usados para avaliar a Tm do duplex.

[000257] meio de crescimento clonal de hepatócitos modificado (dHCGM). dHCGM é um meio DMEM contendo 100 U/ml de penicilina, 100 µg/ml de estreptomicina, 20 mM de Hepes, 44 mM de NaCO3, 15 µg/ml de L-prolina, 0,25 µg/ml de insulina, 50 nM de Dexametasona, 5 ng/ml de EGF, Asc-2P 0,1 mM, 2% DMSO e 10% FBS (Ishida et al., 2015). As células foram cultivadas em incubadora a 37 °C em atmosfera umidificada com 5% de CO2. O meio de cultura foi substituído 24 horas após o plaqueamento e a cada 2 dias até a colheita. Hepatócitos humanos primários (PXB-PHH)

[000258] Hepatócitos humanos primários frescos (PXB-PHH) colhidos de camundongos humanizados (camundongos uPA/SCID)-aqui chamados de PHH - foram obtidos de PhoenixBio Co., Ltd (Japão). As células foram semeadas em uma placa revestida com colágeno I na seguinte densidade celular: 35.000 células/poço (384 poços), 70.000 células/poço (96 poços), ou 400.000 células/poço (24 poços) em meio de crescimento clonal de hepatócitos modificado (dHCGM). dHCGM é um meio DMEM contendo 100 U/ml de penicilina, 100 µg/ml de estreptomicina, 20 mM de Hepes, 44 mM de NaCO3, 15 µg/ml de L-prolina, 0,25 µg/ml de insulina, 50 nM de Dexametasona, 5 ng/ml de EGF, Asc-2P 0,1 mM, 2% DMSO e 10% FBS (Ishida et al., 2015). As células foram cultivadas em incubadora a 37 °C em atmosfera umidificada com 5% de CO2. O meio de cultura foi substituído 24 horas após o plaqueamento e a cada 2 dias até a colheita.

INFECÇÃO POR HBV E TRATAMENTO COM OLIGONUCLEOTÍDEO

[000259] PHH foram incubados com HBV (purificado de indivíduos CHB) na multiplicidade de infecção (MOI) de 40 juntamente com 4% de PEG por 24 horas; o inóculo de vírus foi removido no dia seguinte. Para permitir o estabelecimento de cccDNA, o tratamento do composto em PHH foi iniciado no dia 3 após a infecção por HBV. O oligonucleotídeo fresco dissolvido no meio foi reabastecido a cada 2 dias (exemplo 1) ou o oligonucleotídeo fresco no dia 3, 5, 7 e 9 e depois que o meio foi reabastecido a cada 2 dias (exemplo 2) até que as células foram colhidas no dia

19.

MEDIÇÕES DE ANTÍGENO DE HBV

[000260] Para avaliar o impacto na expressão e secreção do antígeno de HBV, os sobrenadantes foram coletados no Dia 19. Os parâmetros de propagação do HBV, níveis de HBsAg e HBeAg, foram medidos usando os kits CLIA ELISA (Autobio Diagnostic # CL0310-2, # CL0312-2), de acordo com o protocolo do fabricante. Resumidamente, 25 µl de sobrenadante por poço foram transferidos para a respectiva placa de microtitulação revestida com anticorpo e 25 µl de reagente de conjugado enzimático foram adicionados. A placa foi incubada durante 60 minutos em um agitador em temperatura ambiente antes dos poços serem lavados cinco vezes com tampão de lavagem usando um lavador automático. 25 µL de substrato A e B foram adicionados a cada poço. As placas foram incubadas em um agitador por 10 minutos em temperatura ambiente antes da luminescência ser medida usando um leitor de luminescência Envision (Perkin Elmer). MEDIÇÕES DE TOXICIDADE CELULAR CCK8

[000261] Para avaliar o impacto da toxicidade celular após o tratamento do oligonucleotídeo, as células foram tratadas conforme descrito na infecção por HBV e no tratamento com oligonucleotídeo e no Dia 18, PHH foram pré- incubados por 24 horas em incubadora a 37 ° C em uma atmosfera umidificada com 5% de CO 2. 10 ul de solução de CCK-8 foram adicionados a 100 ul em cada poço de uma placa de 96 poços e incubados por 1 a 4 horas. A absorvância a 450 nM usando um leitor de microplaca (Tecan) foi medida para cada placa e os valores são calculados como% do controle (células não tratadas).

PCR EM TEMPO REAL PARA PGRNA DE HBV INTRACELULAR E RNA DE RTEL1

[000262] O mRNA foi extraído das células usando um Qiagen BioRobot Universal System e as placas de extração de 96 poços RNeasy (RNeasy 96 BioRobot 8000 Kit (12)/Cat No./ID: 967152) de acordo com as instruções do fabricante. Os níveis relativos de expressão de HBV e mRNA celular foram analisados usando PCR em tempo real no ABI QuantStudio 12k Flex.

[000263] Beta-actina (ACT B) e HBV pgRNA foram quantificados por qPCR usando TaqMan Fast Advanced Master Mix (Life Technologies, cat nº 4444558) em triplicatas técnicas. Os resultados foram normalizados sobre o controle endógeno ACT B humano. A expressão de mRNA foi analisada usando o método de limiar de ciclo comparativo 2-ΔΔCt normalizado para o gene de referência ACT B e para células não transfectadas. Os iniciadores usados para a quantificação de ACTB RNA e HBV pgRNA estão listados na tabela 7. TABELA 7: INICIADORES DE ACT B E HBV PGRNA QPCR Seq

ID Parâmetro Direção Sequência de Iniciador No Direto 5′- GGAGTGTGGATTCGCACTCCT-3` 238 Reverso 5′- AGATTGAGATCTTCTGCGAC -3′ 239

HBV [6FAM]- pgRNA AGGCAGGTCCCCTAGAAGAAGAACTCC- Sonda [BHQ1] 240 Direto 5’- CCATCCTGGACATTGAGGACT-3’ 241 RTEL1 Reverso 5’- CAGGTTCCGGGACAGGTAGTA-3’ 242 Iniciadores de gene de manutenção ACT B (VIC): Hs01060665_g1 (Thermo Fisher Scientific)

QUANTIFICAÇÃO DE CCCDNA DE HBV

[000264] O DNA foi extraído de hepatócitos humanos primários infectados com HBV usando um tampão de lise SDS e purificado usando o protocolo do kit ZymoResearch Genomic DNA Clean & Concentrator (ZymoResearch, cat no. D4067). Os níveis de cccDNA foram determinados após digestão com exonuclease T5 (New England Biolabs, MA, EUA) usando 10U de T5 para 500 ng de DNA, 1 hora a 37 °C em um volume total de 20ul. Após a digestão, as amostras foram diluídas para 50ul dos quais 4ul foram usados para a reação qPCR. A expressão de mRNA foi analisada usando o método de limiar de ciclo comparativo 2- ΔΔCt normalizado para o DNA mitocondrial do gene de referência e para células não transfectadas. As medições quantitativas da reação em cadeia da polimerase em tempo real foram realizadas no QuantStudio 12K Flex PCR System (Applied Biosystems). qPCR foi realizada com Fast SYBR ™ Green Master Mix (Life Technologies, Cat.No 4385612). Iniciadores são mostrados na Tabela 8. TABELA 8: INICIADORES DE CCCDNA QPCR.

Parâmetro Direção Sequência de Iniciador Seq ID No 5′- Direto CGTCTGTGCCTTCTCATCTGC-3` 243 cccDNA 5′- GCACAGCTTGGAGGCTTGAA Reverso -3′ 244 5’- DNA Direto CCGTCTGAACTATCCTGCCC -3’ 245 mitocondrial 5’- Reverso GCCGTAGTCGGTGTACTCGT-3’ 246 EXEMPLO 1: EFEITO DE OLIGONUCLEOTÍDEOS ANTISSENSO DIRECIONADOS A RTEL1 EM PARÂMETROS DE HBV EM PHH INFECTADO POR HBV

[000265] No seguinte experimento, o efeito do knockdown de RTEL1 sobre os parâmetros de HBV, HBsAg, HBeAg, HBV pgRNA e cccDNA, foram testados usando os compostos de oligonucleotídeo na tabela 6.

[000266] PHH foram cultivados conforme descrito na seção Materiais e Métodos. As células foram doseadas a uma concentração final de oligonucleótido de 10 µM dissolvido em meio dHCGM no dia 3 após a infecção por HBV com um volume de cultura final de 100 µl/poço. O experimento foi realizado em triplicado biológico e as células foram colhidas no dia 19 após a infecção por HBV, repondo oligonucleotídeos a cada 2 dias. De acordo com Materiais e Métodos, a toxicidade celular foi determinada usando CCK8, o sobrenadante foi coletado para medir HBsAg e HBeAg e as células foram colhidas em duas frações; um para medições de mRNA e pgRNA de RTEL1 usando um tampão de lise e um para medições de cccDNA usando outros tampões de lise conforme descrito em Materiais e Métodos. Todos os valores são mostrados na Tabela 9 como % de controle (células não tratadas), ou seja, para RTEL1 mRNA, cccDNA e pgRNA quanto menor o valor, maior a inibição.

[000267] A toxicidade celular de CCK8 foi medida conforme descrito na seção Materiais e Métodos para confirmar que qualquer redução nos parâmetros virais não é a causa da morte celular; quanto mais próximo o valor estiver de 100%, menor será a toxicidade. Os resultados são mostrados na Tabela 9, abaixo. TABELA 9: DEGRADAÇÃO DE CCCDNA MEDIADA POR RTEL1 E

INIBIÇÃO DE PRODUTOS À JUSANTE Nº % de ID % de % de % de % de % de HBeAg do CCK8 de RTEL1 de cccDNA de pgRNA de HBsAg de de Con- Comp Controle Controle Controle Controle Controle trole Mé- Mé- Mé- dia DP Média DP Média DP Média DP dia DP dia DP 22_1 93 10 68 12 19 4 55 9 60 48 32 28 23_1 98 7 40 1 46 15 57 18 113 5 140 14 24_1 100 2 9 1 37 13 52 12 106 5 110 24 25_1 99 5 14 0 69 15 57 8 99 16 54 10 26_1 95 4 3 1 38 12 44 3 78 2 74 12

Nº % de ID % de % de % de % de % de HBeAg do CCK8 de RTEL1 de cccDNA de pgRNA de HBsAg de de Con- Comp Controle Controle Controle Controle Controle trole Mé- Mé- Mé- dia DP Média DP Média DP Média DP dia DP dia DP 27_1 84 2 4 1 45 16 31 15 106 7 79 8 28_1 92 0 31 14 35 37 7 3 4 0 27 25 29_1 89 7 33 4 24 6 80 15 81 3 54 4 32_1 115 9 25 3 22 3 104 14 100 6 109 14 35_1 97 6 4 1 27 0 115 24 80 5 76 7 36_1 96 7 14 1 43 18 129 35 102 15 91 27 37_1 103 14 8 4 27 11 127 41 91 4 90 9 38_1 107 6 14 3 47 11 129 12 123 5 141 10 39_1 107 13 29 1 26 10 107 61 124 4 112 30 40_1 101 2 48 33 19 5 29 4 94 13 88 19 41_1 112 15 31 9 42 16 129 18 134 31 79 37 42_1 100 1 27 4 17 19 72 13 15 13 22 0 42_2 94 6 23 4 6 4 76 8 30 2 26 1 42_3 100 1 29 5 30 13 78 12 22 5 21 4 43_1 97 1 34 12 8 5 66 3 78 6 49 9 43_2 121 17 48 5 26 4 70 10 95 27 98 36 46_1 124 13 21 4 37 17 130 11 102 3 74 9 49_1 96 9 57 14 36 23 30 10 10 2 15 2

[000268] *RTEL1 e HBV pgRNA é normalizado para gene de manutenção.

[000269] Todos os oligonucleotídeos antissenso testados direcionados a RTEL1 exibem knockdown alvo e eficácia antiviral de HBV em um único ponto de medição contra pelo menos um dos parâmetros cccDNA, pgRNA, HBsAg e HBeAg sem toxicidade celular observada medida por CCK8.

EXEMPLO 2: BIBLIOTECA DE OLIGONUCLEOTÍDEOS ADICIONAIS DIRECIONADOS A RTEL1 TESTADA PARA EFEITO EM CCCDNA EM PHH INFECTADO

[000270] No experimento a seguir, foi gerada uma biblioteca adicional de 236 oligonucleotídeos direcionados ao transcrito RTEL1, mostrado na tabela 6 como CMP ID NO: 50_1 a 237_1. A capacidade de reduzir RTEL1, bem como cccDNA, foi testada.

[000271] PHH foram cultivados conforme descrito na seção Materiais e Métodos. As células foram dosadas a uma concentração final de oligonucleotídeo de 10 µM dissolvido em meio dHCGM no Dia 3. 5. 7 e 9 após a infecção por HBV com um volume final de cultura de 100 µl/poço. O experimento foi realizado em triplicado biológico e as células foram colhidas no Dia 19 após a infecção por HBV com meio de reposição a cada 2 dias até o dia 19.

[000272] De acordo com Materiais e Métodos, as células foram colhidas em duas frações; um para RTEL1 mRNA usando um tampão de lise e um para medições de cccDNA usando outros tampões de lise como descrito em Materiais e Métodos. Todos os valores são mostrados na Tabela 10 como % do controle (células não tratadas), ou seja, para RTEL1 mRNA e cccDNA, quanto menor o valor, maior a inibição/redução. TABELA 10: REDUÇÃO DE RTEL1 E DEGRADAÇÃO DE CCCDNA APÓS

TRATAMENTO COM OLIGONUCLEOTÍDEO Nº ID % de RTEL1 de % de cccDNA de Nº % de RTEL1 de % de cccDNA de do Comp Controle Controle ID Controle Controle do Mé- Com Mé-dia DP dia DP p Média DP Média DP

Nº ID % de RTEL1 de % de cccDNA de Nº % de RTEL1 de % de cccDNA de do Comp Controle Controle ID Controle Controle do Mé- Com Mé-dia DP dia DP p Média DP Média DP 145 50_1 7,01 1,47 91,93 53,33 _2 57,20 14,77 66,82 56,81 146 51_1 23,34 5,14 91,90 100,79 _1 74,65 9,52 58,95 24,13 147 52_1 4,97 3,32 73,18 18,65 _1 109,87 31,74 71,13 40,86 147 53_1 74,82 16,01 52,34 6,08 _2 49,79 11,64 66,49 6,77 148 54_1 23,96 11,87 84,18 48,67 _1 99,53 13,20 82,39 6,25 149 55_1 35,59 7,17 93,69 8,65 _1 63,54 1,61 58,26 12,29 150 56_1 78,85 7,76 79,38 6,37 _1 38,91 3,01 85,40 38,11 151 57_1 43,89 3,45 56,65 21,45 _1 75,08 50,61 99,88 1,35 152 57_2 33,43 20,36 53,42 24,96 _1 36,80 3,08 53,63 9,51 153 58_1 23,10 3,28 55,61 24,65 _1 38,60 2,68 103,42 45,69 153 59_1 84,74 22,73 83,30 8,28 _2 28,05 7,82 74,47 62,74 154 60_1 64,90 34,31 51,76 9,74 _1 41,59 7,01 77,58 12,13 105,5 155 61_1 40,04 6,27 8 36,39 _1 68,84 9,18 56,76 20,70 156 62_1 48,58 7,48 69,29 5,28 _1 58,21 14,18 69,70 8,08 104,6 157 63_1 12,26 1,26 1 34,95 _1 70,14 24,39 58,48 4,65 101,0 158 64_1 9,23 5,14 3 20,54 _1 48,72 1,12 92,78 2,45 101,2 158 65_1 44,85 17,33 7 9,05 _2 96,47 44,09 63,51 2,33

Nº ID % de RTEL1 de % de cccDNA de Nº % de RTEL1 de % de cccDNA de do Comp Controle Controle ID Controle Controle do Mé- Com Mé-dia DP dia DP p Média DP Média DP 159 66_1 69,93 1,72 57,89 17,40 _1 69,81 9,81 63,86 5,72 160 66_2 68,17 6,74 86,07 8,18 _1 18,16 0,57 76,72 8,87 161 67_1 34,99 34,99 56,88 31,24 _1 4,70 1,81 63,24 27,23 108,6 162 68_1 49,49 15,69 8 37,37 _1 1,23 0,24 96,00 1,23 100,9 163 68_2 68,22 14,89 8 74,61 _1 18,96 8,11 107,22 28,58 164 69_1 86,75 3,21 96,31 6,98 _1 20,71 8,98 100,94 10,67 105,6 165 70_1 30,76 11,20 2 22,24 _1 54,95 11,34 79,93 2,08 166 71_1 41,40 9,03 77,41 55,10 _1 83,13 18,00 72,36 39,67 167 72_1 42,31 3,14 84,91 30,20 _1 105,82 73,31 69,39 13,42 168 73_1 56,43 2,53 52,43 7,92 _1 56,30 26,26 61,25 5,61 169 74_1 62,53 11,46 63,20 10,15 _1 68,48 18,97 102,59 5,31 169 75_1 27,73 0,03 54,09 8,64 _2 40,76 10,27 71,29 13,34 169 76_1 68,10 16,93 60,01 41,58 _3 12,35 7,59 103,66 4,18 170 77_1 25,25 8,17 97,07 11,51 _1 62,45 13,28 101,40 4,46 171 78_1 24,30 4,02 57,29 3,26 _1 48,84 14,22 56,66 4,08 172 79_1 34,02 5,55 52,04 8,90 _1 65,73 10,35 86,22 58,44 173 80_1 64,76 6,15 92,09 8,09 _1 74,87 8,18 57,84 1,98

Nº ID % de RTEL1 de % de cccDNA de Nº % de RTEL1 de % de cccDNA de do Comp Controle Controle ID Controle Controle do Mé- Com Mé-dia DP dia DP p Média DP Média DP 174 80_2 100,95 0,38 91,57 16,17 _1 32,77 6,46 65,95 17,39 175 81_1 14,80 0,00 61,33 9,38 _1 14,82 5,49 77,83 11,93 176 82_1 7,11 1,75 54,70 15,77 _1 10,54 4,41 64,33 32,00 177 82_2 9,81 1,64 58,75 1,67 _1 9,41 2,42 60,66 6,42 178 83_1 36,85 0,00 69,70 7,20 _1 2,79 1,65 76,11 8,17 178 83_2 8,21 4,88 66,53 7,60 _2 1,61 1,09 82,07 37,30 179 84_1 62,48 11,67 93,31 8,13 _1 2,40 0,97 100,84 2,49 180 85_1 44,09 9,50 61,00 9,51 _1 28,81 9,47 64,36 9,58 181 85_2 46,72 4,15 97,36 24,50 _1 39,34 6,66 64,81 42,15 182 86_1 80,90 31,21 51,63 23,28 _1 40,14 7,85 50,35 5,83 183 86_2 78,93 4,86 79,87 49,47 _1 27,21 11,98 96,97 14,85 184 87_1 26,46 3,80 58,61 6,02 _1 54,48 12,67 97,69 3,13 185 88_1 19,44 0,42 80,75 14,07 _1 97,74 21,37 57,01 9,95 186 89_1 86,51 25,84 58,06 27,75 _1 13,48 2,66 76,92 17,59 187 90_1 58,49 9,86 97,93 30,79 _1 99,48 9,54 68,99 6,50 188 91_1 90,34 8,97 70,59 11,83 _1 4,89 1,53 75,04 5,16 189 92_1 53,35 13,77 92,14 13,18 _1 62,35 14,74 72,42 7,24

Nº ID % de RTEL1 de % de cccDNA de Nº % de RTEL1 de % de cccDNA de do Comp Controle Controle ID Controle Controle do Mé- Com Mé-dia DP dia DP p Média DP Média DP 190 93_1 86,17 18,80 68,78 12,94 _1 30,13 3,34 53,95 16,62 190 94_1 82,51 34,51 74,00 6,73 _2 70,42 8,41 57,21 7,44 191 95_1 28,32 13,87 81,77 0,96 _1 13,78 2,44 59,40 8,50 192 95_2 31,64 0,23 54,23 0,02 _1 33,66 5,65 54,13 15,57 192 96_1 65,92 43,39 90,65 44,78 _2 52,23 12,88 81,54 6,25 193 97_1 67,17 19,66 91,10 45,98 _1 72,41 7,09 79,15 22,21 193 98_1 20,59 11,95 70,09 7,77 _2 45,71 16,85 54,47 27,40 194 99_1 45,17 11,96 81,29 17,73 _1 27,32 14,47 76,00 7,91 195 100_1 17,96 8,21 72,67 33,48 _1 44,50 2,82 51,02 9,90 196 101_1 17,68 4,56 59,25 15,63 _1 7,35 2,01 62,45 40,44 197 102_1 21,78 7,52 56,99 3,77 _1 60,12 8,74 59,04 23,63 198 103_1 19,65 2,57 97,02 4,67 _1 17,64 9,05 72,08 10,88 199 104_1 46,82 22,92 55,25 3,33 _1 11,67 2,87 71,46 24,06 200 105_1 27,66 3,21 72,99 3,87 _1 22,21 1,07 105,37 3,83 201 105_2 48,60 13,68 83,37 14,25 _1 2,79 2,14 67,89 3,06 102,7 201 106_1 29,66 11,05 7 23,24 _2 2,14 0,14 79,46 18,07 202 106_2 56,28 1,60 50,25 12,84 _1 8,36 1,66 81,72 3,96

Nº ID % de RTEL1 de % de cccDNA de Nº % de RTEL1 de % de cccDNA de do Comp Controle Controle ID Controle Controle do Mé- Com Mé-dia DP dia DP p Média DP Média DP 202 107_1 47,82 18,86 57,44 34,75 _2 17,71 3,55 91,16 6,78 203 108_1 26,06 6,57 53,90 14,97 _1 6,91 1,51 55,95 4,33 203 108_2 9,75 2,24 59,30 0,53 _2 10,41 6,90 75,76 2,97 203 108_3 51,83 0,77 69,13 12,27 _3 41,89 0,58 61,00 6,57 204 109_1 5,91 2,61 52,52 12,19 _1 94,01 4,50 88,29 7,73 205 109_2 6,37 1,45 68,41 17,92 _1 13,51 5,81 109,03 20,51 206 110_1 11,12 1,90 71,58 47,02 _1 89,89 7,82 85,70 3,32 206 111_1 84,19 10,48 55,32 2,17 _2 67,36 7,93 60,55 9,50 207 112_1 41,08 12,50 52,72 6,13 _1 23,15 9,64 60,44 29,16 208 113_1 100,00 0,00 78,91 6,77 _1 92,51 27,58 75,99 10,80 209 114_1 99,08 41,68 57,06 6,19 _1 92,08 9,26 52,56 6,76 210 115_1 25,63 22,23 72,30 60,35 _1 12,27 6,71 76,30 31,02 108,2 210 116_1 87,50 1,46 3 75,62 _2 89,62 18,30 77,25 3,97 105,8 211 116_2 83,18 0,17 8 5,43 _1 39,78 3,92 88,22 14,53 212 117_1 76,07 4,23 67,01 6,43 _1 36,19 2,39 56,65 14,73 108,6 213 117_2 109,05 3,40 7 30,57 _1 26,52 14,58 62,72 7,94 214 117_3 93,69 11,88 76,35 2,30 _1 21,32 6,14 62,15 15,02

Nº ID % de RTEL1 de % de cccDNA de Nº % de RTEL1 de % de cccDNA de do Comp Controle Controle ID Controle Controle do Mé- Com Mé-dia DP dia DP p Média DP Média DP 215 118_1 46,05 10,08 72,32 8,58 _1 22,10 3,45 97,49 19,57 216 119_1 54,19 20,46 90,03 4,64 _1 29,74 1,46 53,53 20,26 216 120_1 29,75 11,69 90,50 26,06 _2 31,17 7,18 100,84 59,55 101,9 217 120_2 47,34 0,97 8 12,10 _1 36,16 21,08 73,76 5,05 103,0 218 121_1 34,63 9,13 4 31,21 _1 26,08 3,63 62,45 6,34 219 122_1 23,84 3,45 60,00 1,08 _1 27,98 0,88 96,57 11,43 220 122_2 49,03 3,58 57,10 15,69 _1 35,67 2,59 103,11 28,19 221 123_1 87,91 14,47 80,61 3,32 _1 21,87 3,53 80,38 6,57 221 124_1 45,34 4,29 97,91 15,74 _2 38,08 4,00 92,15 12,10 221 125_1 65,93 8,36 82,38 1,51 _3 40,64 9,61 107,45 5,84 222 126_1 19,63 1,74 67,12 12,80 _1 19,69 3,07 59,72 7,41 222 127_1 28,07 3,10 59,52 3,75 _2 30,77 10,21 54,26 1,45 223 128_1 46,11 9,85 89,13 11,64 _1 78,85 28,60 90,08 12,56 224 129_1 83,14 23,83 88,56 9,69 _1 26,92 15,16 71,93 15,87 225 130_1 3,01 1,73 51,18 0,78 _1 30,24 6,80 109,61 36,24 106,0 226 131_1 5,14 1,68 8 38,37 _1 35,09 15,62 107,11 10,01 227 132_1 94,17 18,86 85,17 13,15 _1 37,63 12,68 70,20 8,73

Nº ID % de RTEL1 de % de cccDNA de Nº % de RTEL1 de % de cccDNA de do Comp Controle Controle ID Controle Controle do Mé- Com Mé-dia DP dia DP p Média DP Média DP 228 133_1 37,12 8,11 71,11 12,56 _1 87,69 10,70 72,25 4,00 229 134_1 19,28 5,14 68,39 8,54 _1 44,99 22,32 77,03 46,39 229 135_1 17,83 0,86 84,76 4,78 _2 63,89 35,36 51,67 29,57 230 136_1 5,76 3,37 91,47 13,69 _1 73,08 17,58 90,57 53,08 230 137_1 91,76 19,69 89,85 32,57 _2 36,46 5,34 61,99 30,47 231 138_1 73,95 8,38 50,33 10,55 _1 45,85 28,46 67,18 23,44 232 139_1 54,46 1,17 70,90 15,24 _1 15,33 10,56 58,98 30,05 233 139_2 52,71 12,53 52,57 17,88 _1 92,94 7,62 60,18 12,23 234 140_1 53,81 13,82 55,02 39,17 _1 36,40 26,60 60,64 20,11 234 141_1 24,70 4,90 93,03 59,35 _2 36,46 9,00 76,75 15,69 234 142_1 19,89 3,31 54,31 2,48 _3 55,70 17,41 72,99 21,80 235 143_1 31,38 2,16 62,23 54,78 _1 85,79 19,15 69,06 8,99 236 144_1 18,80 15,78 65,31 22,34 _1 50,52 7,64 85,61 8,75 237 145_1 42,42 4,00 65,22 31,76 _1 94,23 25,38 79,07 31,59

[000273] A toxicidade celular de CCK8 foi medida conforme descrito na seção Materiais e Métodos para avaliar se a redução nos parâmetros virais poderia ser causada por morte celular, quanto mais próximo o valor estiver de 100%, menor será a toxicidade. Os resultados são mostrados na

Tabela 11. Para valores de CCK8 acima de 80% do controle, não é considerado provável que a morte celular tenha um impacto na redução de RTEL1 e cccDNA mostrada na tabela 10. TABELA 11: TOXICIDADE CELULAR CCK8 % de Controle Nº % de Controle Nº % de Controle de CCK8 ID de CCK8 ID de CCK8 Nº ID do do do Comp Mé- Mé-dia DP Com DP Com Mé-dia DP dia p p 114 103,4 178 50_1 116,26 8,82 _1 7 7,90 _2 117,93 3,77 115 107,2 179 51_1 105,05 7,05 _1 4 8,20 _1 114,12 5,05 116 180 52_1 82,96 6,08 _1 85,06 7,26 _1 93,24 2,68 116 181 53_1 134,27 5,46 _2 80,29 5,56 _1 98,66 2,53 117 182 54_1 103,38 9,14 _1 #N/A #N/A _1 89,46 7,87 117 183 55_1 71,55 5,78 _2 95,10 2,33 _1 83,55 4,22 117 184 56_1 95,93 20,93 _3 96,89 13,60 _1 70,62 12,67 118 185 57_1 105,94 3,64 _1 #N/A #N/A _1 97,55 10,88 119 186 57_2 111,45 11,03 _1 85,82 4,56 _1 96,65 8,31 120 187 58_1 107,29 9,64 _1 85,68 11,44 _1 54,10 8,19

% de Controle Nº % de Controle Nº % de Controle de CCK8 ID de CCK8 ID de CCK8 Nº ID do do do Comp Mé- Mé-dia DP Com DP Com Mé-dia DP dia p p 120 188 59_1 88,76 7,99 _2 93,79 5,14 _1 101,60 8,41 121 189 60_1 107,26 3,18 _1 #N/A #N/A _1 68,00 10,70 122 144,5 190 61_1 123,93 12,61 _1 8 44,88 _1 141,71 16,49 122 113,1 190 62_1 108,72 7,62 _2 1 8,57 _2 83,85 6,76 123 191 63_1 98,97 11,62 _1 59,62 9,47 _1 148,53 8,91 124 192 64_1 76,87 11,82 _1 52,57 2,90 _1 106,29 5,85 125 101,4 192 65_1 101,36 5,18 _1 7 7,25 _2 85,20 10,09 126 129,3 193 66_1 89,28 6,92 _1 1 9,43 _1 91,71 5,71 127 193 66_2 106,42 0,96 _1 87,40 4,43 _2 73,38 2,71 128 194 67_1 28,82 0,83 _1 80,60 7,16 _1 93,19 4,43 129 195 68_1 118,08 11,35 _1 95,26 0,97 _1 95,70 2,72 130 125,5 196 68_2 125,36 11,78 _1 6 4,29 _1 67,40 8,02

% de Controle Nº % de Controle Nº % de Controle de CCK8 ID de CCK8 ID de CCK8 Nº ID do do do Comp Mé- Mé-dia DP Com DP Com Mé-dia DP dia p p 131 107,1 197 69_1 97,66 16,30 _1 7 5,92 _1 114,76 21,86 132 198 70_1 120,71 12,95 _1 21,86 2,92 _1 85,13 6,45 133 199 71_1 102,41 6,80 _1 77,50 10,35 _1 91,59 3,24 134 106,9 200 72_1 83,17 6,40 _1 1 0,79 _1 87,64 6,54 135 103,3 201 73_1 55,40 2,16 _1 3 1,13 _1 101,76 5,01 136 201 74_1 118,35 4,36 _1 64,06 3,46 _2 110,01 8,04 137 202 75_1 84,55 0,14 _1 70,57 14,52 _1 85,95 4,63 138 202 76_1 102,91 13,06 _1 70,14 17,00 _2 88,94 3,52 139 203 77_1 99,31 8,11 _1 62,23 1,13 _1 92,92 2,20 139 203 78_1 #N/A #N/A _2 59,93 2,52 _2 104,16 3,17 140 203 79_1 55,12 5,20 _1 90,30 7,69 _3 129,86 20,13 141 204 80_1 90,80 2,66 _1 63,42 2,15 _1 112,00 27,06

% de Controle Nº % de Controle Nº % de Controle de CCK8 ID de CCK8 ID de CCK8 Nº ID do do do Comp Mé- Mé-dia DP Com DP Com Mé-dia DP dia p p 142 123,3 205 80_2 98,59 2,30 _1 8 47,71 _1 87,02 9,91 143 206 81_1 67,03 2,60 _1 69,90 3,87 _1 90,88 10,42 144 206 82_1 59,63 2,52 _1 #N/A #N/A _2 67,71 14,83 145 207 82_2 68,54 1,17 _1 #N/A #N/A _1 93,70 3,15 145 208 83_1 64,43 2,61 _2 #N/A #N/A _1 90,05 3,01 146 209 83_2 64,11 0,89 _1 #N/A #N/A _1 69,85 4,14 147 210 84_1 #N/A #N/A _1 #N/A #N/A _1 86,07 4,68 147 210 85_1 96,19 0,06 _2 #N/A #N/A _2 84,28 15,59 148 211 85_2 90,23 8,54 _1 #N/A #N/A _1 101,07 4,83 149 107,3 212 86_1 89,93 1,33 _1 0 13,12 _1 94,44 4,57 150 112,3 213 86_2 106,93 12,98 _1 9 27,25 _1 99,59 14,01 151 214 87_1 #N/A #N/A _1 72,22 6,20 _1 #N/A #N/A

% de Controle Nº % de Controle Nº % de Controle de CCK8 ID de CCK8 ID de CCK8 Nº ID do do do Comp Mé- Mé-dia DP Com DP Com Mé-dia DP dia p p 152 128,6 215 88_1 33,65 2,65 _1 8 44,31 _1 #N/A #N/A 153 148,3 216 89_1 95,60 3,51 _1 8 11,62 _1 96,46 10,44 153 136,7 216 90_1 97,32 6,73 _2 5 4,21 _2 103,47 4,95 154 217 91_1 61,96 5,80 _1 99,55 5,83 _1 104,08 4,88 155 110,7 218 92_1 64,15 10,92 _1 1 8,09 _1 #N/A #N/A 156 116,0 219 93_1 92,01 6,19 _1 6 0,75 _1 112,81 6,71 157 106,1 220 94_1 96,44 10,38 _1 5 16,19 _1 93,55 8,40 158 221 95_1 80,17 2,61 _1 98,71 16,36 _1 #N/A #N/A 158 221 95_2 77,56 1,32 _2 85,55 5,15 _2 93,70 5,32 159 118,3 221 96_1 #N/A #N/A _1 5 1,48 _3 106,21 8,49 160 165,7 222 97_1 #N/A #N/A _1 5 9,61 _1 97,90 13,52 161 158,9 222 98_1 107,81 13,88 _1 0 0,88 _2 103,67 13,27

% de Controle Nº % de Controle Nº % de Controle de CCK8 ID de CCK8 ID de CCK8 Nº ID do do do Comp Mé- Mé-dia DP Com DP Com Mé-dia DP dia p p 162 104,9 223 99_1 #N/A #N/A _1 7 1,85 _1 78,11 5,49 163 133,8 224 100_1 #N/A #N/A _1 3 9,44 _1 #N/A #N/A 164 225 101_1 #N/A #N/A _1 84,46 17,61 _1 #N/A #N/A 165 226 102_1 #N/A #N/A _1 95,10 11,69 _1 98,77 6,85 166 227 103_1 114,99 24,45 _1 74,96 8,17 _1 132,53 18,49 167 228 104_1 103,45 5,92 _1 68,09 11,24 _1 90,41 3,32 168 229 105_1 75,27 1,94 _1 90,07 16,56 _1 107,49 3,69 169 229 105_2 61,11 2,24 _1 92,53 8,41 _2 92,21 3,07 169 102,9 230 106_1 101,58 1,06 _2 5 9,23 _1 93,65 2,24 169 100,2 230 106_2 101,83 5,69 _3 3 4,07 _2 105,60 5,47 170 100,7 231 107_1 #N/A #N/A _1 1 10,54 _1 97,51 5,97 171 120,5 232 108_1 103,24 5,94 _1 8 39,11 _1 111,24 3,86

% de Controle Nº % de Controle Nº % de Controle de CCK8 ID de CCK8 ID de CCK8 Nº ID do do do Comp Mé- Mé-dia DP Com DP Com Mé-dia DP dia p p 172 113,4 233 108_2 101,74 5,49 _1 7 9,82 _1 119,06 18,13 173 102,2 234 108_3 90,13 13,66 _1 8 2,81 _1 85,73 12,74 174 234 109_1 100,11 4,80 _1 87,69 3,76 _2 101,48 9,74 175 122,1 234 109_2 113,58 2,84 _1 1 5,30 _3 91,68 23,71 176 235 110_1 #N/A #N/A _1 69,43 2,44 _1 93,48 9,09 177 108,3 236 111_1 92,73 1,91 _1 7 7,16 _1 95,73 8,67 178 107,2 237 112_1 105,20 2,71 _1 7 9,14 _1 87,22 5,14 113_1 103,59 5,78

[000274] #NA significa que o CCK8 não foi medido para o composto indicado.

[000275] Os resultados mostram que dos 236 oligonucleotídeos na biblioteca, apenas 5% não foram capazes de reduzir pelo menos RTEL1 ou cccDNA a pelo menos 80% do controle. A partir disso, pode ser visto que é possível produzir oligonucleotídeos direcionados em todo o transcrito RTEL1 que são capazes de reduzir RTEL1 e/ou cccDNA, geralmente a redução em RTEL1 e cccDNA não é devido à morte celular, embora possa ser o caso para alguns dos compostos.

Claims

REIVINDICAÇÕES

1. Inibidor de RTEL1 caracterizado por ser para uso no tratamento e/ou prevenção de infecção pelo vírus da Hepatite B (HBV).

2. Inibidor de RTEL1 para uso, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por a infecção por HBV ser uma infecção crônica.

3. Inibidor de RTEL1 para uso, de acordo com a reivindicação 1 ou 2, caracterizado por o inibidor de RTEL1 ser capaz de reduzir cccDNA em uma célula infectada.

4. Inibidor de RTEL1 para uso, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 3, caracterizado por o referido inibidor ser um oligonucleotídeo de 12 a 60 nucleotídeos de comprimento, compreendendo uma sequência de nucleotídeos contígua de pelo menos 10 nucleotídeos de comprimento, que é pelo menos 95% complementar a um ácido nucleico alvo RTEL1 de mamífero, em particular um ácido nucleico RTEL1 humano, e ser capaz de reduzir o mRNA de RTEL1.

5. Inibidor de RTEL 1 para uso, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 4, caracterizado por ser selecionado a partir de um oligonucleotídeo antissenso de fita simples, siRNA ou uma molécula de shRNA.

6. Inibidor de RTEL 1 para uso, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 5, caracterizado por o ácido nucleico alvo de RTEL1 de mamífero ser selecionado a partir da SEQ ID NO: 1 ou 2.

7. Inibidor de RTEL 1 para uso, de acordo com qualquer uma das reivindicações 4 a 6, caracterizado por a sequência de nucleotídeos contígua ser pelo menos 98%

complementar ao ácido nucleico alvo da SEQ ID NO: 1 e SEQ ID NO: 2.

8. Inibidor de RTEL 1 para uso, de acordo com qualquer uma das reivindicações 3 a 7, caracterizado por o cccDNA em uma célula infectada com HBV ser reduzido em pelo menos 60% quando comparado a um controle.

9. Inibidor de RTEL 1 para uso, de acordo com qualquer uma das reivindicações 4 a 7, caracterizado por o mRNA de RTEL1 ser reduzido em pelo menos 60% quando comparado a um controle.

10. Oligonucleotídeo antissenso de fita simples caracterizado por ser de 12 a 30 nucleotídeos de comprimento, compreendendo uma sequência de nucleotídeos contígua de pelo menos 10 nucleotídeos, que é complementar a um RTEL1 de mamífero, em particular um RTEL1 humano, em que o oligonucleotídeo é capaz de inibir a expressão de RTEL1.

11. Oligonucleotídeo antissenso, de acordo com a reivindicação 10, caracterizado por a sequência de nucleotídeos contígua ser pelo menos 90% complementar, tal como totalmente complementar à SEQ ID NO: 1.

12. Oligonucleotídeo antissenso, de acordo com a reivindicação 10 ou 11, caracterizado por compreender uma sequência de nucleotídeos contígua de 12 a 25, em particular de 15 a 21 nucleotídeos de comprimento.

13. Oligonucleotídeo, de acordo com qualquer uma das reivindicações 11 a Erro! Fonte de referência não encontrada., caracterizado por a sequência de nucleotídeos contígua ser 100% complementar a uma sequência alvo selecionada da SEQ ID NO: 3 a 21.

14. Oligonucleotídeo, de acordo com qualquer uma das reivindicações 10 a 13, caracterizado por o oligonucleotídeo compreender uma sequência selecionada do grupo que consiste na SEQ ID NO: 22 a 237.

15. Oligonucleotídeo antissenso, de acordo com qualquer uma das reivindicações 10 a 14, caracterizado por compreender um ou mais nucleosídeos modificados por açúcar em 2'.

16. Oligonucleotídeo antissenso, de acordo com a reivindicação 15, caracterizado por o um ou mais nucleosídeos modificados por açúcar em 2' serem selecionados independentemente a partir do grupo que consiste em 2’-O-alquil-RNA, 2’-O-metil-RNA, 2’-alcóxi-RNA, 2’-O-metoxietil-RNA, 2’-amino-DNA, 2’-fluoro-DNA, ácido nucleico arabino (ANA), 2'-fluoro-ANA e nucleosídeos de LNA.

17. Oligonucleotídeo antissenso, de acordo com qualquer uma das reivindicações 15 ou 16, caracterizado por o um ou mais nucleosídeos modificados por açúcar em 2' serem um nucleosídeo de LNA.

18. Oligonucleotídeo antissenso, de acordo com qualquer uma das reivindicações 10 a 17, caracterizado por o oligonucleotídeo compreender pelo menos uma ligação internucleosídica de fosforotioato.

19. Oligonucleotídeo antissenso, de acordo com a reivindicação 18, caracterizado por todas as ligações internucleosídicas dentro da sequência de nucleotídeos contígua serem ligações internucleosídicas de fosforotioato.

20. Oligonucleotídeo antissenso, de acordo com qualquer uma das reivindicações 10 a 19, caracterizado por o oligonucleotídeo ser capaz de recrutar a RNase H.

21. Oligonucleotídeo antissenso, de acordo com qualquer uma das reivindicações 10 a 20, caracterizado por o oligonucleotídeo antissenso, ou sua sequência de nucleotídeo contígua, consistir ou compreender um gapmer de fórmula 5'-F-G-F'-3', em que as regiões F e F' compreendem independentemente 1 a 4 nucleosídeos modificados por açúcar em 2' e G ser uma região entre 6 e 16 nucleosídeos que são capazes de recrutar RNaseH, tal como uma região compreendendo entre 6 e 18 nucleosídeos de DNA.

22. Conjugado caracterizado por compreender um oligonucleotídeo antissenso, conforme definido em qualquer uma das reivindicações 10 a 21, e pelo menos uma fração conjugada covalentemente ligada ao referido oligonucleotídeo.

23. Composto conjugado, de acordo com a reivindicação 22, caracterizado por a fração conjugada ser selecionada a partir de uma das frações GalNAc trivalente na figura 1.

24. Composto conjugado, de acordo com a reivindicação 22 ou 23, caracterizado por compreender um ligante fisiologicamente lábil composto de 2 a 5 nucleosídeos ligados, compreendendo pelo menos duas ligações fosfodiéster consecutivas, em que o ligante fisiologicamente lábil se liga covalentemente no terminal 5' ou 3' do componente oligonucleotídeo.

25. Sal farmaceuticamente aceitável, caracterizado por ser de um oligonucleotídeo, conforme definido em qualquer uma das reivindicações 10 a 21, ou de um conjugado, conforme definido em qualquer uma das reivindicações 22 a 24.

26. Composição farmacêutica caracterizada por compreender um oligonucleotídeo, conforme definido em qualquer uma das reivindicações 10 a 21, ou de um conjugado, conforme definido em qualquer uma das reivindicações 22 a 24, ou um sal farmaceuticamente aceitável, conforme definido na reivindicação 25, e um excipiente farmaceuticamente aceitável.

27. Método in vitro ou in vivo para modular a expressão de rtel1 em uma célula alvo que expressa rtel1, o referido método caracterizado por administrar um oligonucleotídeo, conforme definido em qualquer uma das reivindicações 10 a 21, ou de um conjugado, conforme definido em qualquer uma das reivindicações 22 a 24, um sal farmaceuticamente aceitável, conforme definido na reivindicação 25, ou composição farmacêutica, conforme definida na reivindicação 26, em uma quantidade eficaz para a referida célula.

28. Método para tratar ou prevenir uma doença caracterizado por compreender administrar uma quantidade terapeuticamente ou profilaticamente eficaz de um oligonucleotídeo, conforme definido, conforme definido em qualquer uma das reivindicações 10 a 21, ou de um conjugado, conforme definido em qualquer uma das reivindicações 22 a 24, um sal farmaceuticamente aceitável, conforme definido na reivindicação 25, ou composição farmacêutica, conforme definida na reivindicação 26, a um paciente que sofre ou é suscetível à doença.

29. Método, de acordo com a reivindicação 28,

caracterizado por a doença ser o vírus da hepatite B (HBV).

30. Oligonucleotídeo antissenso, de acordo com qualquer uma das reivindicações 10 a 21, ou de um conjugado, de acordo com qualquer uma das reivindicações 22 a 24, um sal farmaceuticamente aceitável, de acordo com a reivindicação 25, ou uma composição farmacêutica, de acordo com a reivindicação 26, caracterizados por serem para uso na medicina.

31. Uso de um oligonucleotídeo, conforme definido em qualquer uma das reivindicações 10 a 21, ou de um conjugado, conforme definido em qualquer uma das reivindicações 22 a 24, um sal farmaceuticamente aceitável, conforme definido na reivindicação 25, ou uma composição farmacêutica, conforme definida na reivindicação 26, caracterizado por ser para a preparação de um medicamento para o tratamento ou prevenção do vírus da hepatite B HBV.