CN1836042A - 用于基因沉默的hbv和hcv保守序列 - Google Patents

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Abstract

提供了来自已知乙型肝炎病毒株和已知丙型肝炎病毒株保守共有序列，用于抑制病毒在哺乳动物细胞中表达。这些序列适用于沉默HBV和HCV的基因，因此提供了抗HBV和HCV病毒感染人的治疗有效性。

Description

用于基因沉默的HBV和HCV保守序列
相关申请的交叉参考
本申请要求2003年6月12日申请的美国临时申请第60/478,076号的权益，该临时申请通过引用整体结合在本文中。
                    发明领域
本发明涉及通过双链RNA介导的基因沉默技术，包括转录后基因沉默(PTGS)和转录基因沉默(TGS)，用已知的乙型肝炎病毒(HBV)株和丙型肝炎病毒(HCV)株的保守基因序列来调节HBV和/或HCV在哺乳动物细胞中表达的方法和组合物。
                    发明背景
人丙型肝炎(HCV)是一个主要的公共健康问题，估计全球有2亿人被感染。美国2001年新增的感染人数约25,000，由于对供血者的筛选，该数字已比80年代估计的每年新增240,000病例有所下降。然而，估计已有390万(1.8％)美国人感染了HCV，其中270万为慢性感染。在全球人口中，丙型肝炎显示出明显的基因多样性，证明了该病毒的频繁突变和快速进化。HCV有6个基本的基因型，15个有记录的亚型，在世界上的不同地区流行的基因型有所不同。各种主要的基因型可能在生物学效应方面，如复制、突变率、肝脏损坏的类型和严重程度以及检查和治疗的手段上有明显差异，但这种差异还未完全弄清。
目前尚无预防HCV的疫苗，现有治疗药物包括利巴韦林和干扰素只是部分有效。估计约有75-85％的感染者将会发展成慢性感染，70％的慢性感染者将发展为包括肝细胞癌的慢性肝脏疾病。慢性HCV相关肝脏疾病是肝脏移植的主要指征。
虽然人乙型肝炎疫苗在1982年已经问世，估计全球有3.5亿人有HBV慢性感染。虽然美国每年新感染人数已从80年代的平均260,000下降到2001年的78,000，估计仍有125万乙肝病毒携带者，即乙肝病毒表面抗原(HBsAg)阳性持续6个月以上的患者。这种携带者的发展成肝硬化、肝失代偿和肝细胞癌的危险在增多。虽然大多数携带者不会从慢性乙型肝炎病毒感染发展成为肝并发症，但约有15％到40％的人在其一生中会出现严重的后遗症，慢性感染者中死于慢性肝脏疾病的约占15-25％。
因此，需要开发对感染HBV和HCV的患者，特别是慢性感染的患者(二者相加占全球肝脏疾病的75％)更有效的治疗药物。同时极其需要开发预防HCV的方法和药物。
人们已认识到核酸(如DNA、RNA、杂合体、杂合双链和修饰核酸)是有着各种明显生物学活性的极有价值的物质，包括它们作为治疗部分在预防和/或治疗人类和动物疾病方面的用途。例如，通过反义原理设计使寡核苷酸与靶mRNA杂交，从而调节mRNA的活性。另一种用核酸作为治疗物的方法是利用三螺旋或三链的形成，其中设计单链核苷酸(如DNA或RNA)去与双链靶DNA结合而获得需要的结果，如抑制靶DNA的转录。还有一种以核酸作为治疗物的方法是利用核酶，其中设计结构RNA或修饰的核酸与靶RNA或靶双链DNA结合而获得需要的结果，例如，对靶RNA和DNA进行靶向切割从而抑制其表达。核酸也可被用作免疫物质，例如，将DNA分子导入生物体的组织或器官，以表达能够刺激免疫反应的蛋白。还工程改造核酸，使其编码具有反义、核酶或三螺旋活性的RNA，或产生可翻译生成具有生物功能的蛋白质的RNA。
近来，RNAi或双链RNA(dsRNA)介导的基因沉默现象已经被识别，它是通过与细胞或生物体内靶基因区域互补的dsRNA来抑制靶基因的表达(参见例如Fire等公开于1999年6月1日的WO99/32619；和U.S.6,506,559：″Genetic Inhibition by Double-StrandedRNA；″Pachuk和Satishchandran的WO 00/63364：″Methods andCompositions for Inhibiting the Function of Polynucleotide Sequences，″；和2002年10月18日提交的U.S.S.N.60/419,532)。人们期待着dsRNA介导的基因沉默技术使用提供至少部分双链RNA的组合物，以提供极有价值的治疗和/或预防药物来抵抗病毒感染，包括HBV和/或HCV感染，包括极其困难的慢性HBV和/或HCV感染问题。
                     发明概述
本申请人的发明提供了抑制乙型肝炎病毒的多核苷酸序列在体内哺乳动物细胞中表达的方法，包括给予所述细胞双链RNA效应分子，该效应分子含有选自SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：7、SEQ IDNO：8、SEQ ID NO：9和SEQ ID NO：10的序列中至少19个连续碱基对核苷酸序列，其中U取代T。在该方法的优选实施方案中，可将来自不止一种SEQ ID序列的效应序列给予同一细胞，和/或将来自同一SEQ ID序列的不止一种效应序列给予同一细胞。
本申请人的方法进一步提供了抑制丙型肝炎病毒的多核苷酸序列在体内哺乳动物细胞内表达的方法，包括给予所述细胞双链RNA效应分子，该效应分子含选自SEQ ID NO：11和SEQ ID NO：12的序列中至少19个连续碱基对核苷酸序列，其中U取代T。在该方法的此方面的优选实施方案中，来自SEQ ID NO：11和SEQ ID NO：12二者的效应分子可给予同一细胞；和/或来自同一SEQ ID NO中的不止一种效应分子可用于同一细胞。
本申请人的方法进一步提供了抑制乙型肝炎病毒的多核苷酸和丙型肝炎病毒的多核苷酸二者在同一体内哺乳动物细胞内表达的方法，包括给予所述细胞双链RNA效应分子，第一效应分子含选自SEQID NO：1、SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：7、SEQ ID NO：8、SEQ ID NO：9和SEQ IDNO：10的序列中至少19个连续碱基对核苷酸序列，其中U取代T；第二双链RNA效应分子含选自SEQ ID NO：11和SEQ ID NO：12的序列中至少19个连续碱基对核苷酸序列，其中U取代T。在本发明此方面的优选实施方案中，来自不止一种SEQ ID NO：1到SEQ IDNO：10的效应序列可给予同一细胞；和/或来自SEQ ID NO：11和SEQID NO：12二者的效应序列可给予同一细胞；和/或不止一种来自同一SEQ ID NO的效应序列可用于同一细胞。
本发明进一步提供了抑制乙型肝炎多核苷酸序列在体内哺乳动物细胞中表达的组合物，其包含双链RNA效应分子，该效应分子含有选自SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：7、SEQ ID NO：8、SEQ IDNO：9和SEQ ID NO：10的序列中至少19个连续碱基对核苷酸序列，其中U取代T。组合物的优选实施方案包括其中来自不止一种SEQ IDNO：1到SEQ ID NO：10的效应分子存在于组合物中，和/或其中来自同一SEQ ID NO的不止一种效应分子存在于组合物中。
本发明进一步提供了抑制丙型肝炎病毒多核苷酸序列在体内哺乳动物细胞中表达的组合物，其包含双链RNA效应分子，该效应分子含有选自SEQ ID NO：11和SEQ ID NO：12的序列中至少19个连续碱基对核苷酸序列，其中U取代T。该组合物的优选实施方案包括其中来自SEQ ID NO：11和SEQ ID NO：12二者的效应序列存在于组合物中；和/或其中来自同一SEQ ID NO的不止一种效应分子存在于组合物中。
本发明进一步提供了抑制乙型肝炎病毒多核苷酸序列和丙型肝炎病毒多核苷酸序列二者在单个体内哺乳动物细胞内表达的组合物，其包含双链RNA效应分子，第一效应分子含选自SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：5、SEQ IDNO：6、SEQ ID NO：7、SEQ ID NO：8、SEQ ID NO：9和SEQ ID NO：10的序列中至少19个连续碱基对核苷酸序列，其中U取代T；第二效应分子含选自SEQ ID NO：11和SEQ ID NO：12的序列中至少19个连续碱基对核苷酸序列，其中U取代T。该组合物的优选实施方案包括其中来自不止一种SEQ ID NO：1到SEQ ID NO：10的效应分子存在于组合物中；和/或其中来自SEQ ID NO：11和SEQ ID NO：12二者的效应分子存在于组合物中；和/或其中来自同一SEQ ID NO的不止一种效应分子可存在于组合物中。
在本发明上述方法和组合物的特别优选实施方案中，多核苷酸序列为RNA，哺乳动物细胞为人细胞。
本发明进一步提供了抑制乙型肝炎病毒多核苷序列和/或丙型肝炎病毒多核苷酸序列在哺乳动物细胞中表达的组合物，其中所述组合物含有至少19个连续核苷酸序列，其选自SEQ ID NO：1到SEQ IDNO：12、SEQ ID NO：1到SEQ ID NO：12的互补序列和这种序列的混合物。在本发明的这一实施方案中，“至少19个连续核苷酸序列”优选DNA，哺乳动物细胞优选人细胞。此外还提供了含有任何上述任何组合物的表达构建体和含有所述表达构建体的哺乳动物细胞。
本发明的另一方面提供了含有选自SEQ ID NO：14到SEQ IDNO：26的序列的多核苷酸序列。本发明的另一方面提供了包含选自SEQ ID NO：14到SEQ ID NO：26的序列的1-19、1-20、1-21、2-20、2-21或3-21核苷酸的多核苷酸序列。本发明的另一方面提供了含有选自SEQ ID NO：27到SEQ ID NO：44的序列中至少19个连续碱基对核苷酸序列的多核苷酸序列。
本发明的另一方面提供了抑制丙型肝炎病毒的多核苷酸序列在哺乳动物细胞中表达的组合物，该组合物含双链RNA效应分子，其包含SEQ ID NO：27中至少19个连续碱基对核苷酸序列，其中U取代T。
                    序列简述
SEQ ID NO：1到SEQ ID NO：10代表乙型肝炎病毒基因组的保守区域。
SEQ ID NO：11到SEQ ID NO：12代表丙型肝炎病毒基因组的保守区域。
SEQ ID NO：13代表人U6启动子的核苷酸序列。
SEQ ID NO：14和SEQ ID NO：15代表具有定位在SEQ ID NO：5内的HBV序列的eiRNA。
SEQ ID NO：16和SEQ ID NO：17代表具有定位在SEQ ID NO：4内的HBV序列的eiRNA。
SEQ ID NO：18代表具有定位在SEQ ID NO：10内的HBV序列的eiRNA。
SEQ ID NO：19到SEQ ID NO：22代表具有定位在SEQ ID NO：3内的HBV序列的eiRNA。
SEQ ID NO：23和SEQ ID NO：24代表具有定位在SEQ ID NO：2内的HBV序列的eiRNA。
SEQ ID NO：25和SEQ ID NO：26代表具有定位在SEQ ID NO：1内的HBV序列的eiRNA。
SEQ ID NO：27代表HCV 3′UTR的″X″区段。
SEQ ID NO：28到SEQ ID NO：36代表定位于HCV 3′UTR的siRNA。
SEQ ID NO：37到SEQ ID NO：44代表定位于HCV 3′UTR的″X″区段的siRNA。
SEQ ID NO：45代表定位于HCV核心的siRNA。
SEQ ID NO：46代表定位于核纤层蛋白的siRNA。
SEQ ID NO：47代表T7 RNA聚合酶基因。
SEQ ID NO：48代表编码发夹RNA的基于T7的eiRNA载体。
                     附图简述
图1为标明T7 RNA聚合酶启动子和T7 RNA聚合酶位置的载体图解，并显示包含了发夹状eiRNA序列。
图2图示了与表2数据对应的HBsAg抑制。
图3图示了与表3数据对应的HBsAg抑制。
图4图示了与表4数据对应的HBsAg抑制。
图5图示了与表5数据对应的HBsAg抑制。
图6图示了与表6数据对应的HBsAg抑制。
图7图示了与表7数据对应的HBsAg抑制。
图8图示了与表8数据对应的HBsAg抑制。
图9为阐明有效HBV-AYW shRNA插入的图解。
图10图示了与表9数据对应的HBsAg抑制。
图11为通过Nothern印迹分析显示HBV RNA下调的柱图。
图12图示了与表12数据对应的HBsAg抑制。
图13为蛋白质印迹，显示所鉴别的siRNA为0、9和20pmole时HCV NS5A蛋白水平(l到r)，在实施例2的实验1中有更详细描述。
图14为蛋白质印迹，显示所鉴别的siRNA为0、9和20pmole，“核心”阳性对照siRNA为0、3和9pmole时HCV NS5A蛋白水平(l到r)，在实施例2的实验2中有更详细描述。
                   发明详述
RNA干扰(RNAi)是动物和植物体内序列特异性的转录后基因沉默或转录基因沉默的方法，由序列与被沉默基因同源的双链RNA(dsRNA)起始。因为RNA干扰以序列特异的方式发挥作用，所以用作药物的RNAi分子必须具有靶特异性。病毒基因组是可变的，以容纳对环境变化的抗性。虽然HBV和HCV是RNAi理想的病毒目标，但病毒的变异性和突变性以及很高的转录率使HBV和HCV成为任何治疗和/或预防手段的挑战性目标。为了用RNAi来抑制病毒基因组的复制，需要鉴别病毒基因组中保守且独特的区域。同时，为了避免毒性，用于基因沉默的所选序列不存在于人基因组中是非常重要的。
人乙型肝炎病毒(HBV)  人乙型肝炎病毒属于嗜肝病毒家族，HBV基因组为约3200个碱基对的松散环状、部分双链DNA。有4个部分重叠的可读框分别编码包膜蛋白(pre-S/S)、核心蛋白(precore/core)、聚合酶和X蛋白。pre-S/S可读框编码大(L)、中(M)、小(S)表面糖蛋白。precore/core可读框被翻译成前核心多肽，其被修饰为可溶性蛋白即乙肝e抗原(HBeAg)和核壳蛋白即乙肝核心抗原。核心蛋白启动子和前核心蛋白区域的突变已证明可降低或阻断HBeAg的产生。聚合酶蛋白具有逆转录酶和DNA聚合酶的功能。X蛋白是强有力的转录激活子，可能在致肝癌方面有作用。
HBV的复制周期始于病毒颗粒与肝细胞的附着。在肝细胞核内，正链HBV DNA合成完成后，病毒基因组转化成共价闭合环状DNA(cccDNA)，大多数目前已测试过的抗病毒药物对cccDNA无效或几乎无效，这就是在抗病毒治疗停止后血清HBV DNA很快复现的原因。治疗慢性乙肝的目标是要达到对HBV复制和/或HBV抗原表达的稳固抑制和肝脏疾病的缓解。
在GenBank132.0中，共有4500种HBV序列和340种HBV完整基因组序列(317例人分离株、22例其他灵长类分离株，1例土拨鼠HBV分离株)。这样的多变性对序列特异性的药学手段如RNAi构成了严重挑战。为了鉴别出适合于RNAi应用的保守序列，用改进型的ClustalW对所有完整基因组进行了比对。产生了两种多项比对方案，第一包含所有339种HBV完整基因组序列，第二仅限于人HBV分离株。对多项对比的结果进行了比较，且产生了包含HBV基因组中各位点序列保守性得分的表。进行滑动窗搜寻(slidingwindow search)，以鉴别长度大于19nt的最长序列保守区域。鉴别了三个主要保守区域，定位于GenBank检索号AF090840的人HBV分离株。用该HBV保守序列对人基因组和cDNA文库(人染色体数据库)的GenBank序列进行筛选。发现该鉴别的病毒保守序列从21核苷酸向上是独一无二的。对于人体治疗目的，确保同源的人体序列不被不可逆转地沉默与选择用于RNAi的保守病毒序列同样重要。
人丙型肝炎病毒HCV是小包膜单链RNA病毒(直径40-60nm)，属于黄病毒(Flavivirida)科和肝病毒(hepacivirus)属。其基因组接近10000个核苷酸，编码约3000氨基酸的单个多蛋白，该蛋白在转录后被切割成10种多肽，包括3种主要的结构蛋白(C、E1和E2)和多种非结构蛋白([NS]NS2至NS5)。NS蛋白包括蛋白加工(蛋白酶)和病毒复制(RNA聚合酶)必需的酶。因为该病毒快速突变，包膜蛋白的变化有助于其避开免疫系统。已知HCV至少有6种主要基因型和90种亚型。不同的基因型有着不同的地域分布。基因型1a和1b在美国最为常见(占70％)，基因型2a和2b(约15％)和3型(约7％)较少见。
患者感染不同基因型后的病情严重程度和后果几乎没有差异，然而感染2型和3型的患者对干扰素治疗的应答较好。HCV病毒在肝脏中高速复制并且具有明显的序列多样性。治疗慢性HCV的主要目标在于清除血液中可检测的病毒RNA。完成治疗后连续6个月血中无可检出的病毒RNA已知为持续应答。研究提示持续应答等同于良好的预后，可相当于治愈。治疗还可能有其他微妙益处，如减缓不能达到持续应答的患者中肝脏结痂(纤维化)的进程。
在GenBank 134.0中，共有20,000种HCV序列和93种HCV完整基因组序列。用改进型的ClustalW对所有完整基因组进行了比对。对多项对比的结果进行了比较，且产生了包含HCV基因组中各位点序列保守性得分的表。进行滑动窗搜寻，以确定长度大于19nt的最长序列保守区域。鉴别了三个主要的保守区域，定位于GenBankRefSeq(参考序列)检索号：NC_004102，这是GenBank注释HCV完整基因组。用该保守序列对人基因组和cDNA文库(人染色体数据库)的GenBank序列进行筛选，发现这种序列在21个核苷酸上是独一无二的。
                  与人类序列非同源
同样重要的是，确保用作本发明沉默靶目标的保守病毒序列基本上与任何天然产生的、正常行使功能的及基本人多核苷酸序列不同源，这样，当dsRNA用于本发明的方法时，不对任何基本天然哺乳动物多核苷酸序列的功能产生负面影响。这种天然功能性哺乳动物多核苷酸序列包括在健康哺乳动物中编码所需蛋白质的哺乳动物序列和非编码但提供基本调节序列的哺乳动物序列。基本上，本发明中使用的RNA分子序列必须与使用本发明任何方法后其功能不希望被干扰的任何哺乳动物多核苷酸序列有明显不同。计算机算法可以用来确定RNA分子多核苷酸序列与正常哺乳类序列之间的基本缺乏同源性。
由于通常认为能够结合和激活RISC(RNA诱导的沉默复合体)的连续dsRNA序列长度是19-27碱基对，鉴别的HBV和HCV保守序列与人基因组文库相当，或许更重要的是与人cDNA文库相当。由于人cDNA文库代表mRNA形式的表达序列，这种mRNA序列特别容易被导入细胞的同源dsRNA序列沉默。
因此，用该HBV和HCV保守序列与人基因组和cDNA序列进行比对。鉴别没有与人cDNA文库匹配的HBV和HCV保守序列。(虽然有某些匹配其最终鉴别为cDNA文库中的HBV污染)。与人基因组文库序列的比对显示，无任何21个或更多个核苷酸的序列匹配，有一个20个核苷酸的序列和一个19个核苷酸的序列匹配，但它们均在非编码区，且可能不以mRNA的形式出现，因为同源物未在cDNA文库中出现。因此，认为它们可能没有安全风险，但如果需要可排除。
HBV和HCV的保守序列
HBV保守区域1：
          GAACATGGAGA[A(89％)/G(11％)]CA[T(76％)/C(24％)][C(78％)/A(20％)/T(2％)][A(78％)/G(21％)/T(1％)]CATCAGGA[T(65％)/c(35％)]TCCTAGGACCCCTGCTCGTGTTACAGGCGG[G(88％)/t(12％)]GT[T(89％)/G(11％)]TTTCT[T(94％)/C(6％)]GTTGACAA[G(64％)/A(36％)]AATCCTCACAATACC[A(56％)/G(43％)/T(1％)]CAGAGTCTAGACTCGTGGTGGACTTCTCTCAATTTTCTAGGGG[G(92％)[G(5％)/A(3％)]A[A(41％)/G(30％)/T(18％)/C(11％)][C(90％)/T(10％)]
HBV保守区域2：
        TGGATGTGTCT[G(99％)/A(1％)]CGGCGTTTTATCAT
HBV保守区域3：
        AAGGCCTTTCT[A(43％)/G(43％)/C(14％)][T(56％)/A(37％)/C(7％)]GT[A(87％)/C(13％)]AACA[A(57％)/G(43％)]TA[T(59％)/C(41％)][C(59％)/A(41％)]TG[A(92％)/C(8％)][A(93％)/C(7％)]CCTTTACCCCGTTGC[T(54％)/C(46％)][C(92％)/A(8％)]GGCAACGG[C(74％)/T(24％)]C[A(50％)/T(43％)/c(7％)]GG[T(87％)/C(13％)]CT[G(70％)/C(19％)/T(7％)/A(4％)]TGCCAAGTGTTTGCTGACGCAACCCCCACTGG[C(48％)/T(38％)/A(14％)]TGGGGCTTGG[C(84％)/T(16％)][C(84％)/T(12％)/G(4％)]AT[A(47％)/T(23％)/G(17％)/C(13％)]GGCCATC[A(83％)/G(17％)][G(92％)/C(8％)]CGCATGCGTGGAACCTTT[G(84％)/C(13％)/T(3％)][T(92％)/A(4％)/C(3％)/G(1％)]G[G(78％)/T(22％)]CTCCTCTGCCGATCCATACTGCGGAACTCCT[A(88％)/T(9％)/G(1％)/C(1％)]GC[C(57％)/A(35％)/T(6％)/G(2％)]GC[T(92％)/C(7％)/G(1％)]TGTTT[T(88％)/C(12％)]GCTCGCAGC[C(64％)/A(36％)]GGTCTGG[A(87％)/G(13％)]GC
HBV保守区域4：
      [C(62％)/T(38％)]ACTGTTCAAGCCTCAAGCTGTGCCTTGGGTGGCTTT[G(88％)/A(12％)]GG[G(92％)/A(8％)]CATGGACATTGAC[C(92％)/A(8％)]C[T(65％)/G(35％)]TATAAAGAATTTGGAGCT[A(65％)/A(35％)]CTGTGGAGTTACTCTC[G(62％)/T(35％)/A(3％)]TTTTTGCCTTTC[T(92％)/C(8％)]GACTT[C(92％)/T(8％)]TTTCCTTC
HBV保守区域5：
      [C(69％)/del(31％)][G(69％)/del(31％)]A[G(85％)/T(11％)/C(4％)]GCAGGTCCCCTAGAAGAAGAACTCCCTCGCCTCGCAGACG[C(61％)/A(39％)]G[A(62％)/G(38％)]TCTCAATCG[C(88％)/A(12％)]CGCGTCGCAGAAGATCTCAAT[C(92％)/T(8％)]TCGGGAATCT[C(88％)/T(12％)]AATGTTAGTAT
HBV保守区域6：
          TTGG[C(84％)/t(16％)][C(84％)/t(12％)/g(4％)]AT[A(47％)/t(23％)/g(17％)/c(13％)]GGCCATC[A(83％)/g(17％)][G(92％)/c(8％)]CGCATGCGTGGAACCTTT[G(84％)/c(13％)/t(3％)][T(92％)/a(4％)/c(3％)/g(1％)]G[G(78％)/t(22％)]CTCCTCTGCCGATCCATACTGCGGAACTCCT[A(88％)/t(9％)/g(1％)/c(1％)]GC[C(57％)/a(35％)/t(6％)/g(2％)]GC[T(92％)/c(7％)/g(1％)]TGTTT[T(88％)/c(12％)]GCTCGCAGC[C(64％)/a(36％)]GGTCTGG[A(87％)/g(13％)]GC
HBV保守区域7：
          CTGCCAACTGGAT[C(86％)/T(10％)/A(4％)]CT[C(69％)/T(25％)/A(6％)]CGCGGGACGTCCTTTGT[T(75％)/C(25％)]TACGTCCCGTC[G(93％)/A(7％)]GCGCTGAATCC[C(86％)/T(7％)/A(7％)]GCGGACGACCC[C(52％)/G(25％)/T(19％)/A(4％)]
HCV保守区域1：
     [A(74％)/G(19％)/T(7％)][G(82％)/A(15％)/T(3％)]ATCACTCCCCTGTGAGGAACTACTGTCTTCACGCAGAAAGCGTCTAGCCATGGCGTTAGTATGAGTGT[C(92％)/T(7％)]GTGCAGC[C(89％)/T(10％)]TCCAGG[A(76％)/T(14％)/C(8％)/G(1％)]CCCCCCCTCCCGGGAGAGCCATAGTGGTCTGCGGAACCGGTGAGTACACCGGAATTGCC[A(90％)/G(9％)]GGA[C(78％)/T(16％)/A(5％)]GACCGGGTCCTTTCTTGGAT[G(78％)/T(11％)/A(10％)]AACCCGCTC[A(94％)/T(5％)]ATGCC[T(90％)/C(9％)]GGA[G(91％)/C(4％)/A(4％)]ATTTGGGCGTGCCCCCGC[G(85％)/A(14％)]AGAC[T(94％)/C(5％)]GCTAGCCGAGTAG[T(92％)/C(7％)]GTTGGGT[C(94％)/T(5％)]GCGAAAGGCCTTGTGGTACTGCCTGATAGGGTGCTTGCGAGTGCCCCGGGAGGTCTCGTAGACCGTGCA[C(62％)/T(30％)/A(8％)]CATGAGCAC[A(50％)/G(50％)][A(92％)/C(8％)][A(89％)/T(11％)]TCC[T(92％)/A(5％)/C(3％)]AAACC[T(84％)/C(14％)/A(2％)]CAAAGAAAAACCAAA[C(84％)/A(16％)]G[T(84％)/A(16％)]AACACCAACCG[C(77％)/T(23％)]CGCCCACAGGACGT[C(81％)/T(18％)/A(1％)]AAGTTCCCGGG[C(89％)/T(11％)]GG[T(80％)/C(20％)]GG[T(80％)/C(17％)/A(3％)]CAGATCGTTGG[T(91％)/C(8％)/G(1％)]GGAGT[T(87％)/A(11％)/C(2％)]TAC[C(74％)/T(20％)/G(6％)]TGTTGCCGCGCAGGGGCCC[C(87％)/T(8％)/A(4％)/G(1％)][A(92％)/C(8％)][G(92％)/A(5％)/C(2％)][G(87％)/A(12％)/T(1％)]TTGGGTGTGCGCGCGAC[T(78％)/G(13％)/A(7％)/C(2％)]AGGAAGACTTC[C(90％)/G(5％)/T(5％)]GA[G(90％)/A(10％)]CGGTC[G(79％)/C(12％)/A(8％)/T(1％)]CA[A(86％)/G(14％)]CC[T(88％)/A(6％)C(6％)]CG[T(82％)/C(9％)A(9％)]GG[A(87％)/T(8％)/G(3％)/C(2％)]AG
HCV保守区域2：
     ATGGC[T(76％)/A(12％)/C(10％)/G(2％)]TGGGATATGATGATGAACTGG[T(81％)/C(19％)]C
以SEQ ID格式表示的保守共有序列
以下序列以WIPO Standard ST.25(1998)要求的格式表示，使用37 CFR 1.821下规定的代码。SEQ ID NO：1到SEQ ID NO：10来自HBV基因组，SEQ ID NO：11和SEQ ID NO：12来自HCV基因组。
         GAACATGGAGArCAyhdCATCAGGAyTCCTAGGACCCCT
GCTCGTGTTACAGGCGGkGTkTTTCTyGTTGACAArAATCCTCACAATACCdCAGAGTCTAGACTCGTGGTGGACTTCTCTCAATTTTCTAGGGGdAny
    SEQ ID NO：2 HBV
    TGGATGTGTCTrCGGCGTTTTATCAT
    SEQ ID NO：3 HBV
    AAGGCCTTTCTvhGTmAACArTAymTGmmCCTTTACCCCGTTGCymGGCAACGGyChGGyCTnTGCCAAGTGTTTGCTGACGCAACCCCCACTGGhTGGGGCTTGGybATnGGCCATCrsCGCATGCGTGGAACCTTTbnGkCTCCTCTGCCGATCCATACTGCGGAACTCCTnGCnGCbTGTTTyGCTCGCAGCmGGTCTGGrGC
     SEQ ID NO：4 HBV
     yACTGTTCAAGCCTCAAGCTGTGCCTTGGGTGGCTTTrGGrCATGGACATTGACmCkTATAAAGAATTTGGAGCTwCTGTGGAGTTACTCTCdTTTTTGCCTTCyGACTTyTTTCCTTC
    SEQ ID NO：5 HBV
    CGAbGCAGGTCCCCTAGAAGAAGAACTCCCTCGCCTCGCAGACGmGrTCTCAATCGmCGCGTCGCAGAAGATCTCAATyTCGGGAATCTyAATGTTAGTAT
    SEQ ID NO：6 HBV
    AbGCAGGTCCCCTAGAAGAAGAACTCCCTCGCCTCGCAGACGmGrTCTCAATCGmCGCGTCGCAGAAGATCTCAATyTCGGGAATCTyAATGTTAGTAT
     SEQ ID NO：7 HBV
     CAbGCAGGTCCCCTAGAAGAAGAACTCCCTCGCCTCGCAGACGmGrTCTCAATCGmCGCGTCGCAGAAGATCTCAATyTCGGGAATCTyAATGTTAGTAT
     SEQ ID NO：8 HBV
     GAbGCAGGTCCCCTAGAAGAAGAACTCCCTCGCCTCGCAGACGmGrTCTCAATCGmCGCGTCGCAGAAGATCTCAATyTCGGGAATCTyAATGTTAGTAT
     SEQ ID NO：9 HBV
     TTGGybATnGGCCATCrsCGCATGCGTGGAACCTTTbnGkCTCCTCTGCCGATCCATACTGCGGAACTCCTnGCnGCbTGTTTyGCTCGCAGCmGGTCTGGrGC
     SEQ ID NO：10 HBV
     CTGCCAACTGGAThCThCGCGGGACGTCCTTTGTyTACGTCCCGTCrGCGCTGAATCChGCGGACGACCCn
     SEQ ID NO：11 HCV
     DdATCACTCCCCTGTGAGGAACTACTGTCTTCACGCAGAAAGCGTCTAGCCATGGCGTTAGTATGAGTGTyGTGCAGCyTCCAGGnCCCCCCCTCCCGGGAGAGCCATAGTGGTCTGCGGAACCGGTGAGTACACCGGAATTGCCrGGAhGACCGGGTCCTTTCTTGGATdAACCCGCTCwATGCCyGGAvATTTGGGCGTGCCCCCGCrAGACyGCTAGCCGAGTAGyGTTGGGTyGCGAAAGGCCTTGTGGTACTGCCTGATAGGGTGCTTGCGAGTGCCCCGGGAGGTCTCGTAGACCGTGCAhCATGAGCACrmwTCChAAACChCAAAGAAAAACCAAAmGwAACACCAACCGyCGCCCACAGGACGThAAGTTCCCGGGyGGyGGhCAGATCGTTGGbGGAGThTACbTGTTGCCGCGCAGGGGCCCnmvdTTGGGTGTGCGCGCGACnAGGAAGACTTCbGArCGGTCnCArCChCGhGGnAG
        SEQ ID NO：12 HCV
        ATGGCnTGGGATATGATGATGAACTGGyC
*双链RNA基因沉默/RNAi  “核酸组合物”或“核苷酸”组合物指任何一种或多种化合物，其中一种或多种磷酸分子与糖(如戊糖和己糖)结合，继而又与衍生自嘌呤(如腺嘌呤)和嘧啶(胸腺嘧啶)的碱基结合。具体地说，天然核酸分子包括基因组脱氧核糖核酸(DNA)和宿主核糖核酸(RNA)，以及后者的几种不同的形式，如信使RNA(mRNA)、转运RNA(tRNA)和核糖体RNA(rRNA)。DNA也包括与不同RNA分子互补的DNA分子(cDNA)。也可使用合成DNA或它们与天然DNA的杂合体，以及DNA/RNA杂合体和肽核酸分子(PNA)(Gambari，Curr Pharm Des 2001 Nov；7(17)：1839-62)。
当期望的核酸分子为RNA时，预期将本文提供的序列中的T(胸腺嘧啶)被U(尿嘧啶)取代。例如，本文公开的SEQ ID NO：1到SEQ IDNO：44均为DNA序列。对本领域常规技术人员显而易见的是，含有任何上述SEQ ID NO序列的RNA效应分子用U替代T。
核酸典型有两个或更多个以共价键连接的天然或修饰脱氧核糖核苷酸或核糖核苷酸。修饰核酸包括，例如，肽核酸核和含有非天然碱基的核苷酸。
“dsRNA”指含有两个或更多个核苷酸的区段的双链构型核酸。预期本发明的保守病毒序列可用于任何本领域已知的或随后开发的通过dsRNA介导基因沉默或RNAi机理发挥作用的组合物。在各种实施方案里，dsRNA完全由核糖核苷酸组成或由核糖核苷酸与脱氧核糖核苷酸的混合物组成，例如，提交于2000年4月19日的WO00/63364或提交于1999年4月21日的U.S.S.N.60/130,377中公开的RNA/DNA杂合体。dsRNA可以是含有自身互补区段的单分子，即分子一个片段中的核苷酸与分子另一个片段中的核苷酸形成碱基配对。在各种实施方案中，由单个分子组成的dsRNA完全由核糖核苷酸组成或包含与脱氧核糖核苷酸区段互补的核糖核苷酸区段。或者，dsRNA可以包含具有彼此互补区段的两条不同的链。在各种实施方案中，两条链均完全由核糖核苷酸组成；一条链完全由核糖核苷酸组成，另一条链完全由脱氧核糖核苷酸组成；或一条或两条链含核糖核酸和脱氧核糖核酸的混合物。理想的互补区域为至少70、80、90、95、98或100％互补。理想的双链构型dsRNA区段包括至少19、20、21、22、23、24、30、50、75、100、200、500、1000、2000或5000个核苷酸或包括该dsRNA所代表的cDNA中的所有核苷酸。在某些实施方案中，dsRNA不含任何单链区段例如单链末端，或dsRNA为发夹结构。在其他实施方案中，dsRNA有一种或多种单链区段或突出端。理想的RNA/DNA杂合体包括为反义链或区段的DNA链或区段(例如与靶核酸至少70、80、90、95、98或100％互补)和为正义链或区段的RNA链或区段(例如与靶核酸至少70、80、90、95、98或100％同一)。在各种实施方案中，RNA/DNA杂合体在体外用酶或化学合成方法制备，如本文所描述的或2000年4月19日提交的WO 00/63364或1999年4月21日提交的U.S.S.N.60/130,377中所描述的方法。在其他实施方案中，体外合成的DNA链在其转化进入细胞之前、之后或同时与体内或体外合成的RNA链复合。在另一些实施方案中，dsRNA为含有正义和反义区段的单环核酸，或dsRNA包括环状核酸和第二环状或线状核酸(参见，例如，2000年4月19日提交的WO 00/63364或1999年4月21日提交的U.S.S.N.60/130,377)。示例性环状核酸包括套索状结构，其中核苷酸的游离5’磷酰基与另一个核苷酸的2’羟基以环回(loop back)方式连接。
在其他实施方案中，dsRNA包括一种或多种修饰核苷酸，其中糖的2’位含有卤素(如氟基团)或含有烷氧基(如甲氧基)，与2’位含有氢或羟基的对应dsRNA相比，其增加dsRNA在体外和体内的半寿期。在另一些实施方案中，dsRNA除了天然磷酸二酯键外，相邻分子间还有一种或多种其他键。这种键的实例包括磷酰胺键、硫代磷酸酯键和二硫代磷酸酯键。dsRNA也可为化学修饰的核酸分子，如美国专利号6,673,661的教导。在其他实施方案中，dsRNA含一个或两个加帽链，如2000年4月19日提交的WO 00/63364和1999年4月21日提交的U.S.S.N.60/130,377公开的。在其他实施方案中，dsRNA含编码序列或非编码序列，例如，调节序列(如转录因子结合位点、启动子或mRNA的5’或3’非翻译区(UTR))。此外，dsRNA可以是任何2000年4月19日提交的WO 00/63364中公开的至少部分dsRNA分子(参见，例如，8-22页)，和提交于2002年6月31日的美国临时申请60/399,998和提交于2003年7月31日的PCT/US2003/024028；提交于2002年10月18日的美国临时申请60/419,532和提交于2003年10月20日的PCT/US2003/033466中描述的任何dsRNA分子，其教导通过引用结合在本文中。用本文描述的方法或标准方法，如提交于2000年4月19日的WO 00/63364(参见例如16-22页)中描述的方法，可以在体外或体内表达任何dsRNA分子。
dsRNA“发夹”构建体：编码单分子发夹dsRNA的构建体在某些应用中较编码双螺旋dsRNA的构建体(即由一个含有正义区段的RNA分子和一个分开的含有反义区段的RNA分子组成的dsRNA)更为理想，因为带有反向重复序列的单链RNA能更有效的形成dsRNA发夹结构。这种较高的效率部分是由于产生双螺旋dsRNA的含合并(converging)启动子的载体会发生转录干扰。转录干扰导致各RNA链合成不完全，从而降低了可相互碱基配对并形成双螺旋结构的完整正义和反义链的数量。如果需要，可通过下述途径来克服转录干扰(i)使用两个载体系统，一个载体编码正义RNA，另一个载体编码反义RNA；(ii)使用一个双顺反子载体，其中各链由同一质粒编码但使用分开的顺反子，或(iii)使用编码发夹dsRNA，即正义序列和反义序列编码在同一RNA分子中的RNA的单一启动子载体。相对双螺旋载体来说，发夹表达载体具有某些优势。例如，在编码双螺旋RNA的载体中，RNA链在转录完成后需要很快找到其互补配对物并与其形成碱基配对。如果这种杂交未能发生，单链RNA将会从转录模板上扩散开，正义链相对于反义链的局部浓度降低。由于每个细胞中模板水平较低，此效应对细胞内转录的RNA较体外转录的RNA更明显。此外，RNA以毗邻法则折叠，导致RNA分子的折叠与转录同步进行(即边转录边折叠)，这样，一定百分比的完整RNA转录物不能和互补的第二条RNA链形成碱基配对，因为这种分子中的分子内碱基配对。随着转录时间的延长这种不可用分子的百分比将增加。这种分子可再也不形成双螺旋，因为它们已经是稳定的折叠结构。在发夹RNA中，RNA序列总与其互补RNA物理上最近。因为RNA结构是非静态的，当RNA瞬时解折叠时，因为其距离近，互补序列可瞬间获得，可参与碱基配对。发夹结构一旦形成，预期比原非发夹结构稳定许多。尤其理想的是，例如，“强制性”发夹构建体、能够被RNA依赖的RNA聚合酶延伸形成dsRNA发夹的部分发夹结构，如2002年7月31日提交的USSN 60/399,998P、2003年7月31日提交的PCT/US2003/024028，″Double Stranded RNAStructures and Constructs and Methods for Generating and Using theSame，″中所教导的；以及″乳房状″结构的发夹、带有错配区段的发夹和多表位构建体，如提交于2002年10月18日的USSN 60/419,532和提交于2003年10月20日的PCT/US2003/033466，″Double-StrandedRNA Structures and Constructs，and Methods for Generating and Usingthe Same，″中所教导的。
“短dsRNA”指长度为约50、45、40、35、30、27、25、23、21、20或19个连续核苷酸的双链构型dsRNA。理想的短dsRNA长度为至少19个碱基对。在理想实施方案中，双链区长度为19-50、19-40、19-30、19-25、20-25、21-23、25-30或30-40个连续碱基对，包括端点。在某些实施方案中，短dsRNA长度为30-50、50-100、100-200、200-300、400-500、500-700、700-1000、1000-2000或2000-5000个核苷酸，包括端点，并且具有长度为38-60个连续碱基对的双链区段，包括端点。在一个实施方案中，短dsRNA为完整双链。在某些实施方案中，dsRNA长度为11-30个核苷酸，整个RNA为双链。在其他实施方案中，短dsRNA有一个或两个单链区。在某些具体实施方案中，短dsRNA与PKR或dsRNA介导的应激通路中的另一种蛋白结合。理想地，短dsRNA抑制至少20、40、60、80、90或100％的PKR二聚化和激活。在某些理想实施方案中，短dsRNA抑制至少20、40、60、80、90或100％的长RNA与PKR或dsRNA介导的应激通路中的另一种蛋白结合。参见Pachuk，2003年4月28日提交的USSN 10/425,006″Methods of Silencing Genes Without InducingToxicity″的教导，联合使用短dsRNA与其他dsRNA以避免dsRNA介导的毒性。
“至少19个连续碱基对核苷酸序列”指可以从公开序列任何核苷酸起始的核苷酸序列，只要从起始位点可产生至少19个碱基对的多核苷酸。例如，至少19个连续碱基对核苷酸序列可包括核苷酸1-19、核苷酸2-20、核苷酸3-21等，以形成19聚体。因此，20聚体可包括核苷酸1-20、核苷酸2-21、核苷酸3-22等。预想类似的20个以上连续核苷酸的序列。
“表达载体”指任何设计用于转录RNA的双链DNA或双链RNA，例如，含至少一个操作性地连接到下游基因或目的编码区(例如，编码蛋白的cDNA或基因组DNA片段，或任何目的RNA，例如，操作性连接到编码区外序列、反义RNA编码区、dsRNA编码区或编码区外RNA序列)的启动子的构建体。表达载体转染或转化到接受细胞中允许细胞表达该表达载体编码的RNA或蛋白质。表达载体可以是基因工程质粒、病毒或人工染色体物质，衍生自例如噬菌体、腺病毒、逆转录病毒、牛痘病毒或疱疹病毒。
“表达构建体”指任何设计用于转录RNA的双链DNA或双链RNA，例如，含至少一个操作性地连接到下游基因或目标编码区(例如，编码蛋白的cDNA或基因组DNA片段，或任何目的RNA)的启动子的构建体。表达构建体转染或转化到接受细胞中允许细胞表达该表达构建体编码的RNA或蛋白质。表达构建体可以是基因工程质粒、病毒或人工染色体物质，衍生自例如细胞噬菌体、腺病毒、逆转录病毒、牛痘病毒或疱疹病毒。表达构建体不一定要在活细胞中复制，也可合成制得。
“操作性地连接”指核酸分子与一种或多种调节序列(如启动子)以一定方式连接到一起，以致合适的分子连接到调节序列后，允许mRNA的转录或允许核酸分子产物(如多肽)的表达和/或分泌。
“启动子”指足以指导共价连接的核酸分子转录的核酸序列。此定义也包括转录控制元件(如增强子)，这种控制元件足以使启动子依赖的基因表达以细胞类型特异性、组织特异性或时间特异性可控，或可受外部信号和物质诱导；这种技术人员熟知的元件可发现于基因的5’或3’端或内含子中。理想地，启动子以一定方式有效连接到核酸序列，例如，cDNA或基因上，以允许核酸序列表达。
本发明的RNA分子可以作为组合物中的RNA分子、部分双链的RNA序列或RNA/DNA杂合体导入哺乳动物或导入哺乳动物细胞内存在的细胞外病原体内，这种RNA分子可以通过常规酶合成方法，例如，根据Promega Protocols and Applications Guide，(3rd ed.1996)，eds.Doyle，ISBN No.1 57所描述的常规方法，用噬菌体T7、T3或SP6RNA聚合酶在体外制备。或者这种分子也可以在体外通过化学合成方法制得[参见，例如，Xu等.，Nucleic Acids Res.，24(18)：3643-4(Sept.1996)；N.Naryshkin等.，Bioorg.Khim.，22(9)：691-8(Sept.1996)；J.A.Grasby等.，Nucleic Acids Res.，21(19)：4444-50(Sept1993)；C.Chaix et al.，Nucleic Acids Res.17：7381-93(1989)；S.H.Chou等.，Biochem.，28(6)：2422-35(Mar.1989)；0.Odal等.，NucleicAcids Symp.Ser.，21：105-6(1989)；N.A.Naryshkin等.，Bioorg.Khim，22(9)：691-8(Sept.1996)；S.Sun等.，RNA，3(11)：1352-1363(Nov.1997)；X.Zhang等.，Nucleic Acids Res.，25(20)：3980-3(Oct.1997)；S.M.Grvaznov等.，Nucleic Acids Res.，2-6(18)：4160-7(Sept.1998)；M.Kadokura等.，Nucleic Acids Symp.Ser.，37：77-8(1997)；A.Davison等.，Biorned.Pept.Proteins.Nucleic Acids，2(1)：1-6(1996)；和A.V.Mudrakovskaia等.，Bioorg.Khirn.，17(6)：819-22(Jun.1991)]。
还或者，本发明的RNA分子还可在重组微生物，例如细菌和酵母内，或在重组宿主细胞，例如哺乳动物细胞内制备，通过常规方法从它们的培养物中分离而得。参见，例如，Sambrook等的MOLECULAR CLONING，A LABORATORY MANUAL，2nd Ed.；Cold Spring Harbor Laboratory Press，Cold Spring Harbor，New York，1989(其为示例性实验室手册，对该技术有详细描述)和美国专利号5.824,538；5,877,159；和5,643,771中描述的技术，其通过引用结合到本文中。
当在体外制备时，这种在体外制备或合成的RNA分子可以直接导入哺乳动物细胞或哺乳动物。结合本文提供的教导，上述参考书给本领域技术人员提供了产生任何下列具体实施方案的必要技术。因此，在一个实施方案中，组合物的“药物”为双螺旋(即由双链组成)，其为或完整双链或部分双链RNA。
在另一个实施方案中，药物为单链RNA正义链。在另一实施方案中，组合物中的药物为单链RNA反义链。
优选单链RNA正义或反义链在其一边或两边的末端形成发夹结构。理想的单链RNA正义或反义链在其末端之间的某些中间区域形成发夹结构。这种单链RNA正义或反义链也可以被设计为能够自我反向折叠而在体外或体内形成部分双链的结构。还有另一个实施方案，其中组合物中作为有效药物的单链RNA分子含有正义多核苷酸序列和反义多核苷酸序列两者，中间有非配对碱基序列相隔。优选地，一旦进入细胞或在体外合成过程中，这种单链RNA序列有形成双链的能力。
在本发明的另一个实施方案中为以上描述的RNA/DNA杂合体。
在另一实施方案中，合成的RNA分子是一个可以形成杆状结构的或部分双链结构的环状RNA分子，可以通过S.Wang等，NucleicAcids Res.，22(12)：2326-33(June 1994)；Y.Matsumoto等，Proc.Natl.Acad.Sci，USA，87(19)：7628-32(Oct.1990)；E.Ford&M.Ares，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 91(8)：3117-21(Apr.1994)；M.Tsagris等，Nucleic Acids Res.，197)：1605-12(Apr.1991)；S.Braun等，NucleicAcids Res.24(21)：4152-7(Nov.1996)；Z.Pasman等，RNA，2(6)：603-10(Jun.1996)；P.G.Zaphiropoulos，Proc.Natl.Acad.Sci.，USA，93(13)：6536-41(Jun.1996)；D.Beaudry等，Nucleic Acids Res.，23(15)：3064-6(Aug.1995)描述的技术制备(全部通过引用结合于此)。另一种药物为含有DNA和RNA双链分子，其中DNA和RNA为不同的链或DNA、RNA分散在同一条链中。
或者，RNA分子可以在体内形成，由“导入剂”导入，该导入剂被导入哺乳动物细胞或哺乳动物后在体内产生这种部分双链的RNA分子。所以，本发明的一个实施方案中，形成本发明的组合物的剂是双链DNA分子，该双链DNA分子编码以上描述的RNA分子的一种。该DNA组分提供在细胞内经转录而形成双链RNA的核苷酸序列。在一个实施方案中，DNA序列提供的脱氧核糖核苷酸序列在细胞内经转录成为以上描述的正义或反义RNA单链，该RNA链机会性地在一边或两边末端形成发夹样结构或反向自我折叠形成部分双链。作为组合物中导入剂的DNA分子能提供含正义多核苷酸序列和反义多核苷酸序列两者的单链RNA序列、其间有非碱基配对的多核苷酸序列相隔，其中该单链RNA序列有形成双链的能力。或者，作为导入剂的DNA分子在体内经转录提供以上描述的可形成杆状结构或部分双链结构的环状RNA分子。DNA分子也可在体内产生以上描述的RNA/DNA杂合体或含有一条RNA链和一条DNA链的双螺旋。这种不同的DNA分子可以通过以上引用的Sambrook和Promega reference中描述的那些常规方法来设计。
本发明中的能够在哺乳动物细胞中形成任何以上描述的RNA分子的导入剂可以是单链或双链的质粒或载体。设计用于在体外或体内产生本文描述的RNA的表达载体可以含有受任何RNA聚合酶控制的序列，包括线粒体RNA聚合酶、RNA聚合酶I、RNA聚合酶II、RNA聚合酶III、病毒聚合酶和噬菌体聚合酶，如T7和Sp6。根据本发明，这种载体可以用于在细胞内转录需要的RNA分子。可以有意地设计载体利用内源性线粒体RNA聚合酶(例如，人线粒体RNA聚合酶，在此种情况下，载体可用相应的人线粒体启动子)。线粒体聚合酶可以用来在体内产生加帽的(通过capping酶的表达)或非加帽的信使RNA。RNA聚合酶I、RNA聚合酶II和RNA聚合酶III的转录子也可以在体内产生。这种RNA可以被加帽或不加帽。如果需要，胞质加帽可以通过各种方式包括用加帽酶如痘苗加帽酶或α病毒加帽酶来完成。但是，所有聚合酶II的转录子是加帽的。设计的DNA载体可含其中一个启动子或含多个联合启动子(线粒体、RNA聚合酶I、RNA聚合酶II、RNA聚合酶III、病毒、细菌或噬菌体启动子，并与同源聚合酶一起使用)。优选的，当启动子为RNA聚合酶II启动子，编码RNA分子的序列有一个大于300核苷酸的可读框时，必须遵循避免无意义密码子介导的核酸降解的设计规则。这样的质粒或载体可以包含来自细菌、病毒或噬菌体的序列。
这种载体包括染色体、游离体和病毒衍生的载体，例如，衍生自细菌质粒、细菌噬菌体、酵母游离体、酵母染色体原件和病毒以及它们的联合的载体，如那些衍生自质粒和噬菌体基因原件的粘粒和phagemids。
这样，一种示例性载体为单链或双链噬菌体载体。另一种示例性载体是单链或双链RNA或DNA病毒载体。通过已知的将DNA和RNA导入细胞的技术，这种载体可以以多核苷酸，优选DNA的形式导入细胞。对于噬菌体和病毒载体也可以用已知的感染和转导的方式优选以包装好的或带核壳的病毒导入细胞。病毒载体可以是复制型或复制缺陷型，后者只能在其互补宿主细胞中复制。
另一个实施方案导入剂含不止一种的单链DNA或RNA质粒或载体。正如一个例子中第一DNA质粒能提供以上描述的单链RNA正义多核苷酸序列，第二DNA质粒能提供以上描述的单链RNA反义多核苷酸序列，其中正义和反义多核苷酸序列能够进行碱基配对形成双链。这种质粒可含有其他常规的质粒序列，例如，已知的用于构建重组蛋白表达的质粒和载体的细菌序列。然而更理想的质粒是不含这种能够使重组蛋白得以表达的序列，如不含Kozak区域等的质粒。
本发明中用于产生dsRNA的载体设计理想的可设计能产生两个或多个，包括多个与靶序列同源或互补的不同的dsRNA。理想的方式是用一个单一载体产生多个行使独立功能dsRNA，而不是从一个单一转录单位生成一个单一dsRNA，并且，多个不同的dsRNA生成后，可以经过自我选择达到最佳效应。达到此目的方法有许多，包括利用自动催化序列和切割序列来产生随机和/或预期的剪切位点。
其他提供在哺乳动物细胞中形成以上描述的理想RNA分子的必要信息的导入剂包括活的、减毒的、灭活的和失活的重组细菌，它们在设计上含有本发明中所需RNA的必要序列。这种重组细菌细胞、真菌细胞及其类似物可以通过如美国专利号5,824,538；5,877,159；和5,643,771，(以参考的形式结合于此)所描述的常规技术来制备。能够用于制备这种导入剂的微生物包括以上被引用的参考中所列出的那些，包括但不限于，大肠杆菌(Escherichia coli)、枯草杆菌(Bacillussubtilis)、鼠伤寒沙门氏菌(Salmonella typhimurium)和各种假单孢菌(Pseudomonas)、链酶菌(Streptomyces)和葡萄球菌(Staphylococcus)。
另一些在哺乳动物细胞内提供形成以上描述的理想的RNA分子必要信息的导入剂包括活的、减毒的或灭活的、失活的病毒，尤其是携带有以上所述的需要的RNA多核苷酸序列的重组病毒。这种病毒在设计上可以类似目前用于基因治疗或其他方面的将基因导入细胞的重组病毒，但是最好无表达蛋白或蛋白的功能片段的能力。在这种可经操控来给体内哺乳动物细胞提供所需RNA分子的病毒或病毒序列中，包括但不限于α病毒、腺病毒、腺相关病毒、杆状病毒、δ病毒、痘病毒、肝炎病毒、疱疹病毒、乳头多瘤空疱病毒(如SV40)、脊髓灰质炎病毒、假性狂犬病病毒、逆转录病毒、慢性病毒、痘苗病毒、正链和负链RNA病毒、类病毒和拟病毒或其片段。这种不同的病毒导入剂可以应用如M.Di Nocola等在Cancer Gene Ther.，5(6)：350-6(1998)描述的常规技术及其他包括本发明中的描述的技术来设计。
术语“体内”意在涵盖任何含有完整的细胞DNA或RNA复制机制的体系，包括组织培养体系和单细胞或多细胞活生物体。
″多序列表位(multiple sequitope)dsRNA″或″多序列表位(multisequitope)dsRNA″指含有来自多个靶核酸的片段的RNA分子或含有来自同一靶核酸上不连续的片段的RNA分子。例如，多序列表位dsRNA可以含有来自(i)单一生物体的多个基因的序列；(ii)不同生物体的一种或多种基因的序列；和/或(iii)一个特殊基因上不同区域的序列(例如来自启动子的一种或多种序列和来自mRNA的一种或多种序列)的片段。理想状态是，各片段有相当多的序列与靶核酸的对应序列相同。在各种理想实施方案中，与靶核酸有相当多的序列相同的片段的长度为至少19、20、21、22、23、24、30、40、50、100、200、500、750或更多的碱基对。在理想实施方案中，多序列表位dsRNA抑制至少2、4、6、8、10、15、20或更多的基因至少20、40、60、80、90、95或100％的表达。在某些实施方案中，多序列表位dsRNA含有来自同一靶基因的不连续的片段，它们的顺序可以是也可以不是天然发生的5’到3’顺序，并且它们比只含有其中一个片段的dsRNA对核酸表达的抑制至少高出50、100、200、500或1000％。
“序列表位(sequitope)”指与RISC(RNA诱导的沉默复合体)有关并激活RISC的连续的双链多核苷酸序列，通常包括一个长度为19到27个碱基对的序列，含有至少一个来自本文鉴别的一种或多种HBV和/或HCV的保守核苷酸序列的序列表位序列可以用于本文所讲的dsRNA介导的基因沉默。
多表位dsRNA  2002年10月18日提交的USSN 60/419,532和2003年10月10日提交的PCT/US2003/033466中谈到的多表位或多序列表位方法的优势适用于本发明的HBV和/或HCV保守序列。因为一个单一dsRNA可同时沉默许多靶基因(例如来自多个病原体的基因、来自单个病原体的多个基因或序列或与多种疾病有关的基因)，一个多表位dsRNA可用于同一受试者(subject)的许多不同指征或用于一个受试者的一系列指征和另一受试者的另一系列指征。对于这样的应用，以能够表达长dsRNA分子(例如多基因序列的dsRNA分子)而又不引起dsRNA应激反应为最理想。例如，通过使用连续序列，如每个短至19到21个核苷酸，理想情况100到600个核苷酸，或者大至1、2、3、4、5千或更多的核苷酸，使它们的总长度在所选质粒的最大容量(例如容纳20000个碱基的长度)之内，一个单一的这样的药用组合物能够以相对低的价格和相对低的毒性使机体免受病原和/或毒素如HBV、HCV、HIV等的侵害。
应用来自高度变化和快速突变的病原如HBV和/或HCV的一种或多种基因的多表位很有优势。例如，一个单一种的识别和以HBV和/或HCV的不同株和变种为目标的dsRNA可被用作治疗和预防HBV和/或HCV的不同株和变种的通用药物。
沉默特殊病原如HBV和/或HCV的多个基因能够避免HBV和/或HCV逃逸突变株被选择出来。相比之下，典型的只针对一个基因或蛋白的小分子药物治疗或疫苗疗法可导致那些在靶基因或靶蛋白上有持续突变的病原株被选择出来，从而对这种治疗产生抗性。通过应用本发明中同时以病原的多个基因或序列或病原基因的广范区域为靶目标的多表位方法，这样的“逃逸突变株”的出现可被有效排除。
例如，特别具有优势的是用来自HCV SEQ ID NO：11和SEQ IDNO：12二者的序列的混合，即一种或多种来自HCV SEQ ID NO：11的序列与一种或多种来自HCV SEQ ID NO：12的序列，以一个单一的dsRNA构建体给药，或以混合构建体给药，或以伴随给药的方式用于患者，以降低其产生逃逸突变株的能力。类似，使用保守HBV序列的混合也同样具有优势，在某些情况下，还可以与本发明中的一种或多种保守HCV序列联合使用。
同样，将两个或多个来自HBV SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2，和SEQ ID NO：3的序列，以一个单一的dsRNA构建体给药，或以混合构建体给药，或以这种构建体伴随给药的方式用于患者也很理想。SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2，和SEQ ID NO：3定位于表面抗原基因。由于HBVmRNA的重叠性质，一种或多种这种序列将以以下mRNA为靶目标：表面抗原(sAg)、前核心抗原、核心抗原和聚合酶抗原mRNA。由于表面抗原的mRNA存在量最多，如果基因沉默机制可被饱和，其mRNA最有可能成为靶目标，但是其他所列出的mRNA也有成为靶目标的可能。期望降低表面抗原有以下原因：a)表面抗原为包装感染性病毒所必须；b)感染过程中表面抗原的过度表达被认为与慢性感染过程中的免疫耐受有关；c)表面抗原在感染个体的肝内表达(即使无病毒存在，即从整合到宿主细胞的表面抗原序列进行表达)诱发肝炎。所以，降低表面抗原很可能会降低病毒滴度、克服免疫耐受并降低/预防肝炎。
HBV SEQ ID NO：4定位于前核心和核心抗原的独特区域，特异性地以这种mRNA为靶目标，核心蛋白为有活性病毒毒粒所必须，所以下调此mRNA预计能降低病毒滴度。应该不存在这种效应RNA与表面抗原、聚合酶抗原或X蛋白的mRNA的竞争。
HBV SEQ ID NO：5到SEQ ID NO：8定位于聚合酶基因。其效应RNA预计只以前核心/核心抗原和聚合酶转录子为靶目标。应该没有与表面抗原或XmRNA的竞争。聚合酶为病毒基因组合成所必须，因此如果聚合酶减少，病毒滴度也应该减少。
HBV SEQ ID NO：9定位于X基因。由于所有mRNA都存在末端冗余，这种效应RNA有以所有mRNA为靶目标的潜力。X蛋白有许多推测(没有证实)的功能。在慢性活动性肝炎的个体的HBV整合序列中经常可见X基因，下调X基因的表达预期可以减缓疾病。
总的来说，使用的来自不同的鉴别序列的序列越多(例如，SEQID NO：1、SEQ ID NO：2，和/或SEQ ID NO：3的序列加上来自SEQ IDNO：4、SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：7、SEQ ID NO：8、SEQ ID NO：9，和SEQ ID NO：10的序列)，病毒产生有效逃逸突变株的可能性越小。而且，越多的不同mRNA作为靶目标，病毒的滴度降低和病情缓解将会越显著。
多表位构建体、混合构建体或不同dsRNA构建体伴随给药的理想序列组合包括：来自SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2，或SEQ ID NO：3的序列加来自SEQ ID NO：4的序列；来自SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2，或SEQ ID NO：3的序列加来自SEQ ID NO：5的序列；来自SEQ IDNO：1、SEQ ID NO：2，或SEQ ID NO：3的序列加来自SEQ ID NO：6的序列；来自SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2，或SEQ ID NO：3的序列加来自SEQ ID NO：7的序列；来自SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2，或SEQID NO：3的序列加来自SEQ ID NO：8的序列；来自SEQ ID NO：1、SEQID NO：2，或SEQ ID NO：3的序列加来自SEQ ID NO：9的序列；来自SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2，或SEQ ID NO：3的序列加来自SEQ IDNO：10的序列；来自SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2，或SEQ ID NO：3的序列加来自SEQ ID NO：4和SEQ ID NO：5的序列；来自SEQ IDNO：1、SEQ ID NO：2，或SEQ ID NO：3的序列加来自SEQ ID NO：4和SEQ ID NO：6的序列；来自SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2，或SEQ IDNO：3的序列加来自SEQ ID NO：4和SEQ ID NO：7的序列；来自SEQID NO：1、SEQ ID NO：2，或SEQ ID NO：3的序列加来自SEQ ID NO：4和SEQ ID NO：8的序列；来自SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2，或SEQ IDNO：3的序列加来自SEQ ID NO：4和SEQ ID NO：9的序列；来自SEQID NO：1、SEQ ID NO：2，或SEQ ID NO：3的序列加来自SEQ ID NO：4和SEQ ID NO：10的序列；来自SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2，或SEQID NO：3的序列加来自SEQ ID NO：5和SEQ ID NO：6的序列；来自SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2，或SEQ ID NO：3的序列加来自SEQ IDNO：5和SEQ ID NO：7的序列；来自SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2，或SEQ ID NO：3的序列加来自SEQ ID NO：5和SEQ ID NO：8的序列；来自SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2，或SEQ ID NO：3的序列加来自SEQ IDNO：5和SEQ ID NO：9的序列；来自SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2，或SEQ ID NO：3的序列加来自SEQ ID NO：5和SEQ ID NO：10的序列；来自SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2，或SEQ ID NO：3的序列加来自SEQID NO：6和SEQ ID NO：7的序列；来自SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2，或SEQ ID NO：3的序列加来自SEQ ID NO：6和SEQ ID NO：8的序列；来自SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2，或SEQ ID NO：3的序列加来自SEQ ID NO：6和SEQ ID NO：9的序列；来自SEQ ID NO：1、SEQ IDNO：2，或SEQ ID NO：3的序列加来自SEQ ID NO：6和SEQ ID NO：10的序列；来自SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2，或SEQ ID NO：3的序列加来自SEQ ID NO：7和SEQ ID NO：8的序列；来自SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2，或SEQ ID NO：3的序列加来自SEQ ID NO：7和SEQ IDNO：9的序列；来自SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2，或SEQ ID NO：3的序列加来自SEQ ID NO：7和SEQ ID NO：10的序列；来自SEQ IDNO：1、SEQ ID NO：2，或SEQ ID NO：3的序列加来自SEQ ID NO：8和SEQ ID NO：9的序列；来自SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2，或SEQ IDNO：3的序列加来自SEQ ID NO：8和SEQ ID NO：10的序列；来自SEQID NO：1、SEQ ID NO：2，或SEQ ID NO：3的序列加来自SEQ ID NO：9和SEQ ID NO：10的序列；来自SEQ ID NO：4和SEQ ID NO：5的序列；来自SEQ ID NO：4和SEQ ID NO：6的序列；来自SEQ ID NO：4和SEQ ID NO：7的序列；来自SEQ ID NO：4和SEQ ID NO：8的序列；来自SEQ ID NO：4和SEQ ID NO：9的序列；来自SEQ ID NO：4和SEQ ID NO：10的序列；来自SEQ ID NO：5和SEQ ID NO：6的序列；来自SEQ ID NO：5和SEQ ID NO：7的序列；来自SEQ ID NO：5和SEQ ID NO：8的序列；来自SEQ ID NO：5和SEQ ID NO：9的序列；来自SEQ ID NO：5和SEQ ID NO：10的序列；来自SEQ ID NO：6和SEQ ID NO：7的序列；来自SEQ ID NO：6和SEQ ID NO：8的序列；来自SEQ ID NO：6和SEQ ID NO：9的序列；来自SEQ ID NO：6和SEQID NO：10的序列；来自SEQ ID NO：7和SEQ ID NO：8的序列；来自SEQ ID NO：7和SEQ ID NO：9的序列；来自SEQ ID NO：7和SEQ IDNO：10的序列；来自SEQ ID NO：8和SEQ ID NO：9的序列；来自SEQID NO：8和SEQ ID NO：10的序列；来自SEQ ID NO：9和SEQ IDNO：10的序列；来自SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：5；和SEQ ID NO：6的序列；来自SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：5和SEQ ID NO：7的序列；来自SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：5和SEQ ID NO：8的序列；来自SEQID NO：4、SEQ ID NO：5和SEQ ID NO：9的序列；来自SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：5和SEQ ID NO：10的序列；来自SEQ ID NO：4、SEQ IDNO：6和SEQ ID NO：7的序列；来自SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：6和SEQ ID NO：8的序列；来自SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：6和SEQ IDNO：9的序列；来自SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：6和SEQ ID NO：10的序列；
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在另一个实施方案中，来自任何以上提到的序列的序列表位和较长序列的联合(如SEQ ID NO：1到SEQ ID NO：12)可以以单一dsRNA构建体给药、混合构建体给药，或通过伴随给药用于患者。
正如本文其他部分讨论过的那样，本发明特别优选的实施方案应用dsRNA表达构建体或载体内源性导入本发明的dsRNA，尤其是以上描述的多个不同的序列。这种dsRNA可以在表达载体，如质粒，的同一顺反子之内，也可在表达载体的不同顺反子之内，或者在不同的表达构建体或质粒上，例如，一种或多种质粒和/或一种或多种载体，包括病毒载体。这样的多个不同序列也能以一种或多种dsRNA结构，双螺旋和/或发夹结构外源性提供，和/或与一种或多种内源性表达的dsRNA联合使用。
核酸给药的理想方式  本发明的DNA和/或RNA构建体可以以“裸”DNA、RNA或DNA/RNA的形式与不含任何促转染剂的药用载体一起用于宿主细胞/组织/生物体，正如那些DNA和RNA导入领域的技术人员所知，更有效的导入可以通过使用，例如，多核苷酸促转染剂来达到。以下是示例性促转染剂：阳离子双性分子，包括局部麻醉药如布比卡因(bupivacaine)、阳离子脂、脂质体或脂质颗粒、多价阳离子如多溶素、分枝三维多价阳离子如树状聚合物、碳水化合物、清洁剂或表面活性剂，包括苯甲基胺盐表面活性剂，如苯扎氯。适用于本发明的这种促进剂或协同剂的非独占性例子在美国专利号5,593,972；5,703,055；5,739,118；5,837,533；5,962,482；6,127,170；6,379,965；6,482,804和国际专利申请号PCT/US98/22841中有描述，这种教导通过引用结合到本文中。美国专利号5,824,538；5,643,771；和5,877,159(据此被引为参考)描述了不同于多核苷酸组合物的组合物的导入，例如，经过转染的供者细胞或含有本发明的dsRNA-编码组合物的细菌的导入。
在某些实施方案中，dsRNA或dsRNA表达载体与一种或多种阳离子脂或阳离子双性分子组成复合体，如US 4,897,355(Eppstein等1 987年10月29日提交)，US 5,264,61 8(Felgner等1991年4月16日提交)或US 5,459,127(Felgner等1993年9月16日提交)公开的组合物。在另一个实施方案中，dsRNA或dsRNA表达载体与脂质体或脂质体组合物，包括阳离子脂，可选性地包括另一种成分如中性脂，形成复合物(参见，例如，US 5,279,833(Rose)，US 5,283,185(Epand)，and US 5,932,241)。
特别理想的药学适用的本发明多核苷酸组合物的导入方法，包括对肝细胞的靶向性导入，在2003年5月6日提交的PCT/US03/14288上有描述，其教导通过引用结合到本文中。
研究和其他非治疗目的细胞转化/转染可以通过各种方式来进行，包括但不限于，脂染、DEAE葡聚糖介导的转染、显微注射、磷酸钙沉淀、病毒或逆转录病毒导入、电穿孔或基因枪转染。RNA或RNA表达载体(DNA)可以是裸RNA或DNA或与局麻药复合的RNA或DNA(参见，美国专利号6,217,900和6,383,512，″VesicularComplexes and Methods of Making and Using the Same，Pachuk等.，supra)。
另一理想的适于药用的导入本发明的dsRNA或dsRNA表达构建体的技术是基于含环糊精的多价阳离子的自我装配(self-assembling)的CyclosertTM双成分核酸导入系统，该系统可以从Insert Therapeutics，Pasadena，CA获得(参见，Bioconjug Chem 2003 May-Jun；14(3)：672-8；Popielarski等；″Structural effects of carbohydrate-containingpolycations on gene delivery.3.Cyclodextrin type and functionalization″；和Bioconjug Chem 2003 Jan-Feb；14(1)：247-54 and 255-61)。第一成分为一种线状、含环糊精的阳离子多聚体，当与DNA混合后，与核酸的磷酸盐“骨架”结合，引起DNA凝聚并自我装配成均匀一致的胶体纳米粒子，保护DNA不被血清中的核酸酶降；第二成分为一种带有末端金刚硼(amamantine)-PEG分子的表面修饰剂，当与环糊精多聚体结合后，形成表面带有环糊精的包络物，预防聚合、增强稳定性，使系统给药能够进行。另外，可以将细胞表面受体的靶配体与改性剂(the modifier)附着直接将DNA靶向性导入目标细胞。因为肝细胞对HBV和HCV易感，用这种方法将本发明中的dsRNA表达构建体靶向性导入肝细胞被认为特别有优势，例如，可以通过带有半乳糖或乳糖残基，如半乳糖多聚体的合成配体来针对哺乳动物肝细胞上的去唾液酸糖蛋白受体(ASGP-R)靶。
总的来说，将本发明中的dsRNA构建体有选择的靶向性导入肝细胞为优选，靶向性导入肝细胞可以通过连接肝细胞特异性的受体的配体来实现，例如，脱唾液酸血清类粘蛋白(多聚)，L-赖氨酸脱-唾液酸血清类粘蛋白，或任何其他唾液酸糖蛋白受体的配体(Spiess，Biochemistry 29(43)：10009-10018，1990；Wu等.，J.Biol.Chem.267(18)：12436-12439，1992；Wu et al.，Biotherapy 3：87-95，1991)。同样，多核苷酸可以通过与抗肝细胞特异性受体的单克隆抗体连接来靶向性导入肝细胞，多核苷酸也可通过以下描述的特异性载体来导入肝细胞。
导入本发明的dsRNA或dsRNA表达构建体的特别优选的组合物是2003年5月6日提交的PCT/US03/14288中所描述的多功能组合物，其中包括三乳糖(trilactosyl)精胺作为肝细胞ASG受体的配体。可以制备三乳糖胆甾醇精胺与本发明中的多核苷酸形成复合物用于所描述的体内肝细胞转染。
本发明中的dsRNA多核苷酸可以外源性地提供给肝细胞。可选性地，dsRNA也可在靶细胞内通过转录含有被操作性地连接到编码dsRNA的序列的启动子的核酸序列产生。在这种方法中，核酸分子含于非复制的线状或环状DNA或RNA分子中，或者含于自主复制的质粒或病毒载体中，或整合于宿主基因组中。任何能够转染肝细胞的载体都可用于本发明。优选载体为病毒载体，包括那些衍生至复制缺陷型肝炎病毒(例如，HBV和HCV)、逆转录病毒(参见，例如W089/07136；Rosenberg等.，N.Eng.J.Med.323(9)：570-578，1990)、腺病毒(参见，例如.，Morsey等.，J.Cell.Biochem.，Supp.17E，1993；Graham等.，in Murray，ed.，Methods in Molecular Biology：GeneTransfer and Expression Protocols.Vol.7，Clifton，N.J.：the HumanPress 1991：109-128)、腺相关病毒(Kotin等.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 87：2211-2215，1990)、复制缺陷型单纯疱疹病毒(HSV；Lu等.，Abstract，page 66，Abstracts of the Meeting on Gene Therapy，Sep.22-26，1992，Cold Spring Harbor Laboraory，Cold Spring Harbor，N.Y.)及任何这种载体的改良型。构建这种表达载体的方法在本领域已人尽皆知(参见，如.，Molecular Cloning：A Laboraory Manual，Sambrook等.，eds.，Cold Spring Harbor Laboratory，2nd Edition，Cold SpringHarbor，N.Y.，1989).。
合适的调节序列可以通过本领人员所知的方法插入到本发明的载体中，例如，同源重组的方法(Graham等.，J.Gen.Virol.36：59-72，1977)，或其他适宜的方法(Molecular Cloning：A Laboratory Manual，Sambrook等.，eds.，Cold Spring Harbor Laboraory，2nd Edition，ColdSpring Harbor，N.Y.，1989)。
启动子  启动子插入载体时，典型情况是被操作性地连接到编码dsRNA多核苷酸的5’端，但也不是一成不变。任何能够在真核细胞中指引转录的起始的启动子都可用于本发明。例如，非组织特异性启动子，如巨细胞病毒(DeBernardi等.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 88：9257-9261，1991，and references therein)、小鼠金属硫蛋白基因(Hammer，等.，J.Mol.Appl.Gen.1：273-288，1982)、HSV胸苷激酶(McKnight，Cell 31：355-365 1982)、SV40早期基因(Benoist等.，Nature290：304-310，1981)可被使用。非组织特异性启动子能够用于本发明，是由于非组织特异性启动子在非肝脏细胞中引起的HBV和/或HCVdsRNA的表达对非肝脏细胞无害，因为本发明中的HBV和HCVdsRNA为病毒特异。然而，本发明中优选使用的启动子为肝细胞特异的启动子，这种启动子的使用确保了本发明的RNA主要在肝细胞中表达。优选的肝细胞特异性启动子包括，但不限于血清白蛋白、甲胎蛋白、α-1-抗胰蛋白酶、视黄醇结合蛋白质、脱唾液酸糖蛋白受体启动子。病毒启动子和增强子，如那些来自巨细胞病毒、单纯疱疹病毒(I和II型)、肝炎病毒(A、B、C)和Rous肉瘤病毒(RSV；Fang等.，Hepatology 10：781-787，1989)的启动子和增强子也可用于本发明。
dsRNA表达载体可以包含RNA聚合酶I、RNA聚合酶II启动子，包括但不限于HCMV、SCMV、MCMV、RSV、EF2a、TK和其他HSV启动子如ICP6、ICP4和ICPO启动子、HBV前基因组启动子，RNA聚合酶III启动子包括但不限于U6和tRNA启动子、线粒体轻链和重链启动子。理想情况下，dsRNA表达载体包含至少一个RNA聚合酶II启动子，例如人CMV介导的早期启动子(HCMV-IE)或猿CMV(SCMV)启动子、至少一个RNA聚合酶I启动子或至少一个RNA聚合酶III启动子。启动子也可是T7启动子，在此情况下，细胞另外含有T7RNA聚合酶。可选性的，启动子可以是SP6启动子，在此种情况，细胞进一步含有SP6RNA聚合酶。启动子可以是一个趋同T7启动子和趋同SP6启动子(？)，可以通过用含有T7或SP6聚合酶的表达质粒转染细胞而使细胞分别含有T7聚合酶和SP6聚合酶。在某一实施方案中，T7启动子或RNA聚合酶III启动子被操作性地连接到编码一个短dsRNA(如，一个长度短于200、150、100、75、50、或25碱基对)上。在另一个实施方案中，启动子为允许载体上的核酸在胞质转录的线粒体启动子(参见，例如，2000年4月19日提交的WO 00/63364和2001年1月9日提交的WO/US2002/00543上描述的线粒体质粒。可选性的，启动子为可诱导型启动子，如lac(Cronin等.Genes & Development 15：1506-1517，2001)、ara(Khlebnikov等.，J Bacteriol.2000 Dec；182(24)：7029-34)、ecdysone(Rheogene website)、RU48(mefepristone)(类固醇拮抗剂)(Wang XJ，Liefer KM，Tsai S，O′Malley BW，Roop DR，ProcNatl Acad Sci U S A.1999 Jul 20；96(1 5)：8483-8)，或tet启动子(Rendal等，Hum Gene Ther.2002；13(2)：335-42和Larnartina等.，Hum Gene Ther.2002；13(2)：199-210)或提交于2000年4月19日的WO 00/63364中所公开的启动子。在本发明的方法和组合物中还可用2003年4月22日提交的USSN 60/464中描述的结构嵌合的启动子。另外，参见Pachuk，C.，and Satishchandran，C.提交于2003年8月22日提交的美国临床申请号60/497,304″Multiple-CompartmentEurkaryotic Expression Systems，″中描述的启动子系统，该系统被认为是对本发明的方法和组合物特别理想的系统。
用于本发明的dsRNA表达构建体的肝特异性启动子包括血清白蛋白启动子、甲胎蛋白启动子(尤其在肝癌细胞)、甲一型抗胰蛋白酶启动子、乙肝启动子，例如，包括抗原基因，如核心抗原、e抗原、聚合酶和X蛋白的启动子。
T7启动子/T7聚合酶表达系统  本发明中的一个理想方法是用T7dsRNA表达系统实现在脊椎动物细胞(例如，哺乳动物细胞)胞质中表达dsRNA(长或短的dsRNA分子)。该T7表达系统利用T7启动子表达需要的dsRNA，转录由T7 RNA聚合酶驱动，该T7 RNA聚合酶可以在另一个质粒上或在同一个质粒上。细胞噬菌体T7 RNA聚合酶(T7 Pol)是T7基因1的产物，它可以特异性地识别对应的启动子序列并有很高的转录活性。完整的T7基因组序列，含关于该细菌噬菌体的不同区域的详细信息，包括启动子序列公开在Dunn &Studier，1983，J.Mol.Biol.166(4)，477-535上(也见NCBI′Genome′database，Accession No.NC 00 1 604)，T7启动子不能被T7噬菌体聚合酶(有极严格的启动子特异性)以外的其他聚合酶利用(Chamberlin等.，1970，Nature 228：227-231)。当用T7表达系统表达dsRNA时，例如，第一质粒构建体可用T7启动子控制下的表达正义和反义链二者的质粒，第二质粒可用RSV启动子控制下表达T7RNA聚合酶的质粒。dsRNA和T7RNA聚合酶也可更方便地用具有双顺反子的单一质粒构建体来表达，尤其是当dsRNA由含有能够形成至少部分双链区的茎环或发夹结构的自我互补的反向重复序列或区域的单链RNA形成时。自我装配形成dsRNA的各正义和反义链可以由一个单一的质粒构建体合成，例如，趋同启动子如T7启动子分别被插入到所选被转录的序列的互补链的5′和3′端。也见，例如，WO 0063364中有关T7RNA表达系统的讲述，和提交于2002年7月31日的USSN 60/399,998P及提交于2002年10月18日的USSN 60/399,998P中的内容。
本发明的治疗组合物  本发明中的dsRNA和含有编码该核酸序列的重组载体可以用于治疗性组合物以预防和治疗HCV和/或HBV感染。本发明中的组合物可以单独使用或混合使用，或与一种或多种物质，包括其他抗病毒剂联合使用。目前，拉米呋啶、阿的福韦和α-干扰素被证明对治疗肝炎有效，预期本发明的组合物能与这种或其他抗HBV药物包括，恩曲他滨(FTC)和恩替韦联合使用。因为dsRNA通过一个全新的机理(dsRNA介导的基因沉默/RNAi)抑制HBV和/或HCV，本发明中的药物与其他抗病毒制剂的联合疗法有望显著提高治疗的有效性，同时明显减少药物抗性的产生，例如，拉米呋啶抗性的产生，该问题是长期使用拉米呋啶中的主要问题。目前，干扰素和利巴韦林已获准用于HCV的治疗，正如用于HBV的治疗一样。预期本发明中的组合物可以与它们和其他抗HCV药物联合使用。涉及到这种多因子治疗的剂量实施方案，那些有临床医药基本技术的人员可以通过常规实验来确定。
理想的制剂配方将包括能增加多核苷酸和重组载体稳定性的物质，或增加治疗性组合物选择性穿透肝细胞的能力。本发明中的治疗性组合物可以与药学上可接受的载体(如生理盐水)一起给药，载体的选择依据给药的方式和途径和药学标准而定。一个掌握了本领域基本技术的人员能够很容易地配制出含有多核苷酸或基因构建体的药用组合物。在某些情况下，使用等渗制剂。一般来讲，等渗添加剂可以包括氯化钠、葡聚糖、苷露醇、山梨醇和乳糖。在一些情况下，优选磷酸盐缓冲液这样的等渗溶液。稳定剂包括明胶和白蛋白。在某些实施方案中，在制剂中加入了血管收缩剂。本发明中的药用制剂为无菌无热原的制剂。用于药学制剂的合适药用载体和药用必需品在Mack Publishing Co.出版的本领域和USP/NF标准参考书，Remington：The Science and Practice of Pharmacy(formerlyRemington′s Pharmaceutical Sciences)上有描述。
给药途经包括但不限于，肌肉内、腹腔内、皮内、皮下、静脉内、intraoccularly、口服、透皮、吸入或栓剂给药。优选的给药途经包括静脉内、肌肉内、口服、腹腔内、皮内、动脉内和皮下注射。dsRNA或dsRNA表达构建体给药可通过，包括但不限于注射器、无针注射装置、或“微发射轰击基因枪”来实现。可选性地，dsRNA和/或dsRNA表达构建体可通过各种途径导入从个体取出的细胞中，这种途径包括，例如，体外转染、电穿孔、微发射和微发射轰击。当基因构建体进入细胞后，将细胞重新植入个体。预期含有基因构建体的其他非免疫细胞可以被植入个体即使该宿主细胞是从另外一个个体取出的。
对于HBV感染的个体，预期本发明的dsRNA组合物可以与刺激机体针对病毒的免疫反应的治疗性疫苗接种措施联合使用作为预治疗。本发明中的dsRNA组合物也可作为预防药物周期性地给予那些因为职业关系或其他潜在因素被认为暴露于HBV和/或HCV的高危人群，例如，救火、急救和医护人员。这样的有效预防实施方案可以包括，例如，每周、每两周、每月、每两月、每3月、每4月、每半年或每年给予本发明中的HBV和/或HCV dsRNA组合物，具体情况可由那些精于临床医药技术的人员通过常规实验来决定。dsRNA载体，如质粒或病毒载体有较长时间表达本发明中的dsRNA的能力，预计可达数周或数月的时间，这一特点被认为是此方面和其他方面应用的优势所在。
dsRNA的剂量  dsRNA直接用于动物(例如，短dsRNA抑制毒性，或短或长dsRNA沉默一个基因)，典型用药量为10mg到100mg，1mg到10mg，500μg到1mg，5μg到500μgdsRNA用于一个体重90-150磅的人/动物(次序越后越优选)。以编码dsRNA的载体给药(例如，短dsRNA抑制毒性，或短或长dsRNA沉默基因)给动物体，典型用药量为100mg到300mg，10mg到100mg，1mg到10mg，500μg到1mg，或50μg到500μg dsRNA表达载体或构建体用于一个体重90-150磅的人/动物(次序越后越优选)。这种剂量可以根据动物的体重来调整。在某些实施方案中，给药量大约为10mg/kg或2 to 2.5mg/kg。也可使用其他剂量，具体情况可由那些精于临床医药的技术人员通过常规实验来决定。
如给动物用药，典型的用药量为10ng和50μg之间，50ng和100ng之间，或100ng和5μg之间的dsRNA或编码dsRNA的DNA。在理想实施方案中，大约10μg的DNA或5μg的dsRNA用于动物。本发明中的方法无意将dsRNA或编码dsRNA的DNA用于细胞或动物时的给药、剂量、用药频度局限于一个特殊的模式，本发明接纳所有足以提供抑制基因表达、预防或治疗疾病的剂量的用药模式。
如果需要，短dsRNA可以在外源性导入可能引起细胞毒性的dsRNA(例如，较长的dsRNA)之前、之中或之后导入，见Pachuk 2003年4月28日提交的USSN 10/425,006″Methods of Silencing GenesWithout Inducing Toxicity″上的讨论。
申请者特意将引用的所有参考的完整内容包含在本公开文本中。此外，当以一个范围、优选范围或优选上限值和优选下限值的列表给出量、浓度、其他值或参数时，应该认为是对所有源自任何一对范围上限或优选值和任何范围下限或优选值的范围的特意公开，无论它们是否是分开公开的。本文给出的范围数字值，除非特别指明，应该包括其端点值和所有该范围内的整数和分数。定义范围时，无意将本发明中的范围限于的特殊数值。
                      实施例
以下实施例只用于说明。所有本公开文本中提到的参考文献通过整体引用特别结合到本文中。
                      实施例1
沉默复制型细胞培养模型中的HBV复制和表达
细胞培养模型简述：人肝来源的细胞系，如Huh7细胞系用HBV感染性分子克隆转染，该分子克隆含具末端冗余的能够转录所有HBV病毒RNA并产生感染性病毒的病毒基因组[1-3]。用于本研究的复制子的序列来自Gen Bank Accession V01460的病毒序列。在被内吞进入细胞并在核内定位后，从数个病毒启动子开始的感染性HBV质粒的转录启动了反映HBV复制的级联事件，这种事件包括转录的病毒mRNA的翻译、将转录的前基因组RNA包装进核心颗粒、前基因组RNA的逆转录、病毒颗粒和HBsAg(乙肝表面抗原)颗粒的组装和分泌进入被转染细胞的培养基中。该转染模型模拟了HBV在感染的肝细胞内复制的大多数环节，因此是一个很好的观察沉默HBV的表达和复制的模型。
利用这个模型，细胞被感染性HBV克隆和各种eiRNA构建体共转染。然后如以下描述的那样监测HBV表达和复制的降低。有关本实验中载体和编码RNA的详细情况在本实施例的末尾有描述。
实验1：
以下是一个用编码来自GenBank检索号V01460的序列的eiRNA载体进行实验的实施例。本文所描述的eiRNA载体上的HBV序列，正如本文其他处所鉴别的那样，是高度保守的，并且呈现siRNA活性(参见，Pachuk，C.提交于2004年二月25日的PCT/US2004/005065，″Methods and Constructs for Evaluation of RNAitargets and Effector Molecules，″)。用于本实验的特殊eiRNA骨架载体是一个含有驱动表达编码RNA的U6启动子的有专利保护的载体。每个载体只编码一个短发夹样RNA(shRNA)。shRNA的编码序列后是一个RNA聚合酶III的终止序列。U6启动子、RNA聚合酶III终止子和编码shRNA的序列在本实施例的末尾列出。含有U6启动子和聚合酶III终止信号的其他类似载体可以在市场上买到，如Promega，Inc.，Madison，Wis.公司的“siLentGene-2 Cloning Systems”。本领域的普通技术人员也可根据本文提供的信息自己构建载体。预期使用其他表达和启动子系统，尤其是那些含有RNA聚合酶III启动子而不是U6启动子的载体，如含H1启动子或75K启动子，能够获得类似的结果。
实验步骤：转染
在RPMI-1640培养基中培养的Huh7细胞被接种到6孔板中，接种密度为3×105细胞/孔。在细胞接种一天后根据说明书用LipofectamineTM(In Vitrogen，Carlsbad，Cal.)进行转染。在本实验中，用500ng ayw亚型的感染性HBV质粒(″pHBV2″)(GenBankAccession#V01460)和500ng、300ng、250ng、120ng、100ng50ng或10ng eiRNA构建体转染细胞。转染时利用一个惰性DNA质粒pGL3-Basic(Promega，Madison Wis.)将转染的DNA总量调到2.5μg以保持DNA 2.5μg/转染恒定。例如，转染中用500ng HBV DNA和500ng eiRNA构建体，则需加入1.5μg pGL3。转染开始前，去除细胞培养基，用Opti-MEME(InVitrogen Life Technologies，Carlsbad，Cal.)洗细胞。然后在各孔中加入800μl Opti-MEMO，继之加入转染混合液。转染后的17到19小时，弃掉转染混合液和Opti-MEMO，每孔替换入2ml培养基。在转染后的3、6和10天，分别移出细胞培养基冻存于-70℃。在第3天和第6天用2ml新鲜培养基换液。所有转染都做复孔。两套对照转染也同时进行：单一HBV DNA(500ng HBV DNA加2μg pGL3)和HBV DNA和对照eiRNA构建体(500ng HBV DNA，1μg对照eiRNA构建体和1.0μg pGL3 DNA)。
监测细胞中HBV表达的丧失
转染之后，通过测定HBsAg的分泌来监测细胞中HBV表达和复制的丧失或降低。测定转染后3、6和10天转染细胞的培养基(和对照培养基)来监测细胞。根据厂商说明书用Abbott Labs(Abbott Park，III.)公司生产的AuszymeELISA试剂盒来检测表面抗原(sAg)。检测表面抗原是因为表面抗原不仅与病毒复制有关，而且与启动感染性HBV克隆上表面抗原顺反子和体内感染过程中产生的HBVcccDNA转录的RNA聚合酶II有关。因为在无HBV复制时，表面抗原能够继续合成并产生不良作用，所以，不仅下调病毒复制是重要的，而且下调非复制依赖的表面抗原合成也很重要。
结果：
所有细胞在转染了本实施例末尾描述的HBV特异性eiRNA构建体后，与对照组相比，都出现了表面抗原水平的降低。抑制的水平见根据表2-8数据绘制的图2-8。注意被鉴别为788-808和807-827的序列在500ng剂量时只分别降低表面抗原水平的30％和50％。这两个序列是唯一的两个不以表面抗原mRNA为靶目标的序列；它们的靶序列是3.1Kb HBV mRNA，因此它们降低表面抗原水平的作用是间接的。当其他HBV RNA被作为靶目标时仍能观察到表面抗原水平有30％到50％的降低，强烈提示这种eiRNA构建体是有效的。
本实验所用的HBV特异的eiRNA
编码HBV序列的eiRNA载体列于表1中。列出了该序列及其GenBank检索号V01460上的图谱坐标(map coordinates)。表1的最右边是这些序列定位的SEQ ID NO。编码RNA的序列是5′GGTCGAC(一个不重要的序列，但来自所用特殊载体的多接头序列)紧接着第一正义或反义HBV序列，继后是环状序列(表1中有下划线者)，再继后是与第一HBV序列互补的第二HBV序列。注意环状结构不必有固定的序列和长度，我们用过几个不同的环状序列，没有发现其对eiRNA构建体的功能有明显影响。第二HBV序列后紧接着一串T残基，例如1、2、3或更多T，用作RNA聚合酶III的终止信号。
表1
  HBV-AYW坐标*  SEQ IDNO   序列(正义段-环-反义段)   定位于SEQ ID NO
  788-808    14   CGTCTGCGAGGCGAGGGAGTT AGAGAACTTAACTCCCTCGCCTCGCAGACG   5，6，7，or 8
  807-827    15   TTCTTCTTCTAGGGGACCTGC AGAGAACTTGCAGGTCCCCTAGAAGAAGAA   5，6，7，or 8
  1291-1311    16   AAGCCACCCAAGGCACAGCTT AGAGAACTTAAGCTGTGCCTTGGGTGGCTT   4
  1299-1319    17   CAAGGCACAGCTTGGAGGCTT AGAGAACTTAAGCCTCCAAGCTGTGCCTTG   4
  1737-1757    18   GGATTCAGCGCCGACGGGACG AGAGAACTTCGTCCCGTCGGCGCTGAATCC   10
  1907-1927    19   TTCCGCAGTATGGATCGGCAG AGAGAACTTCTGCCGATCCATACTGCGGAA   3
  1912-1932    20   CAGTATGGATCGGCAGAGGAG AGAGAACTTCTCCTCTGCCGATCCATACTG   3
  1943-1963    21   TCCACGCATGCGCTGATGGCC AGAGAACTTGGCCATCAGCGCATGCGTGGA   3
  1991-2011    22   TGCGTCAGCAAACACTTGGCA AGAGAACTTTGCCAAGTGTTTGCTGACGCA   3
  2791-2811    23   AAAACGCCGCAGACACATCCA AGAGAACTTTGGATGTGTCTGCGGCGTTTT   2
  2791-2811mut    24   AAAACACCACACACGCATCCA AGAGAACTTTGGATGCGTGTGTGGTGTTTT   2
  2912-2932    25   TTGAGAGAAGTCCACCACGAG AGAGAACTTCTCGTGGTGGACTTCTCTCAA   1
  2919-2939    26   AAGTCCACCACGAGTCTAGAC AGAGAACTTGTCTAGACTCGTGGTGGACTT   1
                                 *核苷酸坐标指Genbank检索号V01460
图9为转录的RNA结构图。
SEQ ID NO：13为U6启动子的核苷酸序列
RNA聚合酶III终止子核苷酸序列：5′-TTTTT-3′
表和图
HbsAg用以上所述方法测定并根据表2-8的数据绘制成2-8图。eiRNA构建体用量在eiRNA构建体名称后的括号内，以μg量表示。例如，2791(0.5)意味着0.5μg或500ng 2791-2811eiRNA构建体(见表1)用于转染。与对照相比的抑制百分率也显示在下表中，为第10天的测定结果。注意这个实施例的第4套数据中1299 500ng剂量组的评价只有两个时间点，第3天和第6天，因为第10天未做。这组实验的抑制百分比显示的是第6天的数据。数据为原始OD数据，数据的收集根据用于检测表面抗原的Auszyme ELISA检测试剂盒厂家所描述的进行。2791-2811组50ng的数据和1907-1927组10ng的数据没有显示。与对照相比，各剂量抑制HBsAg表达大约为50％。
表2
第3天 第6天 第10天   相对于对照抑制率％
  pHBV2   0.339   1.88   3.268   ------
  2791(0.5)   0.101   0.263   0.333   89.8
表3
第3天 第6天 第10天   相对于对照抑制率％
  pHBV2   1.169   4.445   10.18   ------
  2791(0.5)   0.442   0.743   1.3   87.2
  2791Mut(0.5)   1.136   4.305   10.595   ------
表4
第3天 第6天 第10天   相对于对照抑制率％
  pHBV2   0.375   1.952   4.005   ------
  2791mut(1)   0.421   1.847   4.753   ------
  HCV(1)   0.445   1.805   3.933   ------
  788(0.5)   0.255   1.195   2.778   30.6
  807(0.5)   0.254   1.326   2.015   49.7
  1907(0.25)   0.052   0.113   0.365   90.9
  1912(0.25)   0.138   0.208   0.517   87.1
  1943(0.25)   0.099   0.233   0.506   87.4
  1991(0.25)   0.075   0.152   0.291   92.7
  2912(0.25)   0.095   0.183   0.331   91.7
表5
第3天 第6天   相对于对照抑制率％
  pHBV2     0.474     1.513   ------
  1299(0.5)     0.439     0.699   53.8
表6
第3天 第6天 第10天   相对于对照抑制率％
  pHBC2     0.33     1.617     2.88   ------
  2791(0.3)     0.103     0.192     0.349   87.9
  1737(0.3)     0.051     0.094     0.232   91.9
  1291(0.12)     0.239     0.587     1.195   58.5
  1907(0.12)     0.043     0.086     0.356   87.6
  2919(0.12)     0.218     0.565     1.09   62.2
表7
第3天 第6天 第10天   相对于对照抑制率％
  pHBV2     0.741     2.53     5.383   ------
  2791(0.3)     0.223     0.256     0.458   91.5
  1737(0.1)     0.212     0.351     0.549   89.8
  1907(0.1)     0.067     0.149     0.468   91.3
  1991(0.1)     0.067     0.16     0.345   93.6
表8
第3天 第6天 第10天   相对于对照抑制率％
  pHBV2   0.864   4.414   8.344   ------
  1907(0.05)   0.17   0.538   1.396   83.3
  2919(0.1)   0.368   1.044   1.908   77.1
  1291(0.2)   0.573   1.654   1.896   77.3
实验2：
背景：小细胞培养模型用于评估加入两个eiRNA构建体的相加效果。在这一实验中，2791-2811和2919-2939被评估。分别在两个剂量水平对它们进行了评价：10ng和25ng，和联合应用10ng剂量(5ng 2791-2811和5ng 2919-2939)和25ng剂量(12.5ng 2791-2811和12.5ng 2919-2939)。实验观察到相加效应，例如，25ng2791-2811的一半抑制效果加上25ng 2919-2939的一半抑制效果差不多等于25ng二者联合用药的效果。这一点很重要，因为当用一个25ng单一eiRNA构建体不能获得抑制效果时，使用两个或更多的eiRNA序列对于避免病毒逃逸突变株的产生是十分重要的。
实验过程：转染
以3×105细胞/孔的细胞密度将Huh7细胞接种于6孔板中，在细胞接种一天后根据说明书用LipofectamineTM(InVitrogen，Carlsbad，Cal.)进行转染。在本实验中，用500ng ayw亚型的感染性HBV质粒(GenBank检索号：V01460)与25ng或10ng单独的两个构建体或总量为25ng或10ng这两个构建体联合对细胞进行转染。转染时利用一个惰性的DNA质粒pGL3-Basic将转染的DNA总量调到2.5μg以保持恒定的DNA2.5μg/转染。例如，转染中用500ng HBV DNA和10ng eiRNA构建体，则需加入1.99μg pLUC。转染前，弃去细胞培养基，用Opti-MEMO(InVitrogen Life Technologies)洗涤细胞。在各孔中加入800μl Opti-MEME，然后加入转染混合物。转染后17到19小时，弃去转染混合物和Opti-MEMS，每孔换上2ml培养基。在转染后4、8和11天时，收集细胞培养基并冻存于-70℃。第4天和第8天用2ml新鲜培养基换液。所有转染均做复孔。两套对照转染也同时进行：单一HBV DNA(500ng HBV DNA加2μg pGL3)和HBV DNA与对照eiRNA构建体(500ng HBV DNA，500ng对照eiRNA构建体和1.5μg pGL3 DNA)。
结果：
结果见表9和图10中的图形。2791-2811和2919-2939联合使用显示出至少与2791-2811或2919-2939单用时的效果相等。预期两个或更多针对来自同一HBV基因和/或不同HBV基因的不同HBV序列的dsRNA联合使用也应有类似的优势。
表9
    第4天     第8天
   pHBV2     3.74     15.03
   2791@25ng     2.49     9.63
   2919@25ng     2.55     10.07
   2791+2919@25ng     2.73     10.91
实验3和4
HBV在小鼠模型中的沉默
概述：在小鼠模型中测试验证性实验1中的两个eiRNA载体沉默HBV复制的能力。这两个载体是2791-2811和1907-1927载体。两个载体都显示能在小鼠模型中以它们在细胞模型中类似的程度沉默HBV。其他治疗剂在小鼠体内沉默HBV复制子的能力被证明可以用来预测其在人体的效果[4]。
动物模型背景：
黑猩猩是用于人HBV感染研究的唯一动物模型。但是，一个体内有HBV表达和复制发生的小鼠模型也可被利用。这种小鼠模型对于评估针对病毒复制和针对非RT依赖的抗原表达的抗HBV药物都很有价值。在此模型中，复制型的HBV从一个附加体上的HBVDNA瞬时表达。将复制型的HBV DNA通过流体动力学法导入到小鼠的肝中而创建此模型[1]。
以下实验的目的是要在小鼠模型中检测在实验1中进行过有效性评价的两个编码HBV特异性序列的载体的有效性，虽然没有期望这种HBV序列相关的效果在细胞培养物与小鼠模型中有什么不同。本实验使用流体动力学法同时导入复制型ayw亚型HBV质粒(例1，验证性实验1)和HBV特异的eiRNA表达载体。流体动力学导入法对这种初步研究是很理想的方法，因为它能将核酸有效地导入肝中[5]。
实验
流体动力学导入研究：实验3
所有动物用流体动力学法导入7.5μg的感染性HBVayw质粒(验证性实施例1所描述)。继内化进入细胞和核内定位后，从数个病毒启动子的感染性HBV质粒的转录启动反映HBV复制的级联事件，这种事件包括翻译转录的病毒的mRNA、将转录的前基因组RNA包装进核心颗粒、前基因组RNA的逆转录、将病毒颗粒和HBsAg颗粒(乙肝表面抗原)组装并分泌进入被注射的动物血清中。实验动物同时注射10μg的2791-2811。第二组对照动物被注射了10μg无关eiRNA构建体。所有动物同时都注射了GFP报告质粒(Clontech，PaloAlto，Cal.)。GFPmRNA在注射小鼠肝中的表达作为小鼠模型的转染效率对照以规化实验结果。通过引入惰性填充DNA pGL3将每只动物的DNA注射量保持在20μg(Promega，Madison，Wis.)。所有DNA依据Yang等描述的方法进行制备和注射[1]。每组5只动物。DNA和DNA注射量见表10。
表10
    组   HBV DNA   GFP DNA   eiRNA     pGL3
    1   7.5μg   2.5μg   10μg 2791     0μg
    2   7.5μg   2.5μg   10μg对照     0μg
    3   7.5μg   2.5μg   0μg     10μg
时间点的选择以Dr.Chisari的实验室发表的结果为依据[1]，它反映了继流体动力学法导入后，HBVayw质粒在小鼠中的复制动态。测定注射后的第1、2、3和4天的血清中HbsAg的存在。检测按照HBV复制的细胞培养模型所描述方法进行。注射两天后的肝脏样本中HBV RNA的存在用Dr.Chisari′s实验室研发的Northern印迹分析法确定[1]，并用常规技术以内源性GAPDH RNA水平和GFPmRNA水平进行规化；或用标准技术以定量RT-PCR检测测定含表面抗原编码序列的HBV RNA。RT-PCR检测法较Northern印迹分析法定量效果更好并且较Northern印迹分析法有较大的动态窗口(dynamic window)。
在注射了2791-2811的小鼠中，HBV RNA和HBsAg二者都有下调，参见图11。定量RT-PCR证明，对照小鼠的肝脏中有867个HBV RNA分子存在，而2791-2811处理组中只有57个分子存在，下调了15倍(资料未出示)。
表11
  组平均  标准偏差
  组   小鼠     3.5kb     2.1kb     GFP     总HBV   HBV/GFP
10μg2791   12345     182360392294268673394799362182     14406143161703311434739090964439430     40443449954889153172751680628518306755     16229743553997338302043038954801612   4.03.62.22.62.6 3.0 0.76
仅HBV   2122232425     24125622170741271321319243731464641     872096479583881206085572430245726217     386008261107449633404110429153968243     11133526101291291477406891673977190858   28.816.615.38.318.1 17.4 7.40
表12
 NUC5_HBsAg            HBsAg(ng/ml)
  d1   d2   d3   d4
HBV     234529   28102344168423181066   67938332878893785038   84228089906485975153   85178743887684805925
 组平均＝>标准偏差＝>   2044678   76661754   78651556   81081231
eiHCV     691030   2554226717041362   8048842082584171   9233953587615406   8870833878404920
 组平均＝>标准偏差′＝>   1972538   72242041   82341912   74921765
2791    1112141527   1262122210561275779   28232549193383204771   22762858114319203782   2080159379220681252
 组平均＝>标准偏差＝>   1119209   40792598   2396993   1557551
流体动力学导入研究：实验4
本实验类似实施例1中的实验3，但被评估的两个eiRNA构建体为2791-2811和1907-1927。在本实验中用本文已经描述过的方法来测定第1天和第4天的HBsAg。
表13
  NUC6_HBsAg      HBsAg(ng/ml)
  d1   d4
HBV    2345   6147^6234^46585077^   36,953^42,542^33,061^29,389^
  组平均＝>标准偏差′＝>   5529784   354865627
eiHCV    678   19016286^1023   11,23629,637^6,345
  组平均＝>标准偏差＝>   30702820   1573912282
2791    11131415   3966470522892427   50097347^45384217
  组平均＝>标准偏差＇＝>   33471182   52781417
1907    16181920    4954298234362246   7203^6917^7568^5135^
  组平均＝>标准偏差＝>    34051143   67061081
实施例2
为RNAi治疗研发的丙型肝炎病毒序列
实验1
简介：
丙型肝炎病毒(HCV)是输血相关的非甲非乙型肝炎的主要原因，全球约有两亿患者。HCV基因组有很高的序列多变性。已知HCV有6个主要的基因型包括50个以上的亚型，其显著异质性还特征性地表现为患者体内存在的准种。通过重组聚合酶技术或基于细胞的亚基因组复制子系统的应用，对HCV的复制的理解已取得了长足的进展。通过应用复制子细胞系统，HCV特异性的siRNA被证实能够抑制HCV蛋白的表达和RNA的复制。5′NTR及结构或非结构基因的序列都曾被成功地用作靶目标。3′NTR序列的高度保守性使它成为了siRNA类治疗的很具吸引力的靶目标。然而，对应用3′NTR的可行性还没人进行过研究。本文我们报道几个在亚基因组复制子系统中能抑制HCV蛋白表达的siRNA的设计和测试。外源性合成的HCV特异性siRNA按以下描述的方法转染HCV复制子细胞系。
细胞培养和培养基：
肝细胞瘤Huh7细胞中的HCV复制子在含有10％胎牛血清(Invitrogen)、1％青链霉素、1％的非必须氨基酸和0.5mg/mL G418的Dulbecco′s Modified Eagle Media(″DMEM″)(Invitrogen)中培养。当细胞生长到75％融汇度时分传。
Western印迹分析：
从1×LDS缓冲液(Invitrogen)中收集复制子细胞的总细胞裂解液。在β-巯基乙醇存在下将细胞裂解液90℃加热5分钟，然后在10％Tris-甘氨酸聚丙烯酰胺凝胶(Invitrogen)上电泳。将蛋白转移到PVDF膜上(Invitrogen)。继膜转移后，用含0.5％Tween-20(PBS-Tween)的PBS将膜冲洗一次，再用含5％无脂牛奶的PBS-Tween封闭一小时。用PBS-Tween洗膜后，膜与1∶1500倍稀释的第一α-NS5A抗体(Dr.Chen Liu馈赠)室温下孵育一小时。用PBS-Tween 20洗膜后，与1∶5000倍稀释的HRP缀合的α-小鼠IgG第二抗体孵育，继与第二抗体孵育完毕后，再次洗印迹并根据厂家提供的方法用ECL(Amersham)对膜进行处理。
Norther印迹：
用Rneasykit(Qiagen)提取细胞总RNA。Nothern印迹分析根据Guo等的方法进行。简短地讲，取5μg总RNA用含有2.2M福尔马林的1.0％的琼脂糖凝胶进行电泳后，转移到尼龙膜上用紫外交联(Stratagene)固定。然后在含50％去离子化甲酰胺、5×SSC(750mM氯化钠，750mM柠檬酸钠)、Denhardt′s溶液、0.02M磷酸钠(pH 6.8)、0.2％十二烷基磺酸钠(″SDS″)、100μg/ml碎裂失活的鲑精DNA和100μg/ml酵母RNA的杂交液中用[32P]CTP-标记的新霉素RNA在58℃杂交16小时。在室温下用2xSSC/0.1％SDS洗膜一次30分钟，再在68℃下用0.1xSSC/0.1％SDS洗膜两次共30分钟。用X光曝光膜。
将siRNA转染进复制子细胞：
用Lipofectamine2000试剂(Invitrogen)按使用者手册上的方法将siRNA转染入复制子细胞，简单地讲，转染前一天，用含2×104细胞的0.5mL DMEM培养基接种24孔板。用50μl OptiMEM稀释指定量的siRNA，然后与稀释后的Lipofectamine2000试剂(1μl加入50μl Optimem)混合，将该混合物室温放置20分钟后，加入单层细胞中进行转染。转染后48到72小时，细胞用PBS洗涤并用100μlSDS样品缓冲液裂解。
表14
    siRNA号 SEQ ID NO  HCV序列
    #12     28  GCTAAACACTCCAGGCCAATACCTGTCTC
    #22     29  TCCTTTGGTGGCTCCATCTTACCTGTCTC
    #32     30  GCTCCATCTTAGCCCTAGTCACCTGTCTC
    #42     31  TCTTAGCCCTAGTCACGGCTACCTGTCTC
    #52     32  CCTAGTCACGGCTAGCTGTGACCTGTCTC
    #62     33  CTAGTCACGGCTAGCTGTGAACCTGTCTC
    #72     34  CGTGAGCCGCTTGACTGCAGACCTGTCTC
    #82     35  GCTGATACTGGCCTCTCTGCACCTGTCTC
    #102     36  ACTGGCCTCTCTGCAGATCAACCTGTCTC
几个含有表14中鉴别的以HCV序列3′UTR为靶目标的siRNA；以HCV NS5B基因为靶目标的siRNA #12(阳性对照)；鉴别的HCV核心抗原siRNA(阳性对照)和鉴别的核纤层蛋白siRNA(阴性对照)用Silencer siRNA construction kit，目录#1620(Ambion Inc.，Austin，Tex.)合成。DNA寡核苷酸由IDT(Coralville，lowa)合成。
对照siRNA：
1.HCV核心抗原(阳性对照)：SEQ ID NO：45；
2.表14中的#12，靶向HCV NS5B基因，也为阳性对照；
3.核纤层蛋白序列(阴性对照)：SEQ ID NO：46。
三个siRNA用作对照：以细胞基因核纤层蛋白为靶目标的siRNA为阴性对照；以HCV核心序列为靶目标的siRNA为阳性对照；以HCV NS5B基因为靶目标的siRNA为阳性对照。各siRNA使用两个浓度(9和20pmole)，结果与未转染siRNA组进行比较。对应的图13的Western印迹代表0、9和20pmole鉴别的siRNA。siRNA#22、32、42、62和72可明显抑制HCV NS5A蛋白的表达。根据先前用以核心序列为靶目标的阳性对照siRNA的结果，推测HCV RNA水平也有下降。另几种siRNA在所测浓度时的作用十分有限，需在较高浓度进行评估。它们包括#12(靶目标NS5B)、#102、#52and#82。
实验2
实验2按照“用于RNAi治疗研发的HCV序列”的实验1中描述的方法进行，但用含有表15中的序列(及其互补序列)的siRNAR1-R8进行转染。Western印迹按实验1中实施例2的方法进行。用作阳性对照的HCV核心siRNA为前述HCV实验1中的siRNA。除对照“核心”siRNA用0、3和9pmole进行转染外，所有siRNA使用0、9和20pmole三个转染浓度。正如图14的Western印迹结果所示，R1、R2、R3、R5、R7和R8都对HCV表现出明显抑制作用。
表15
  siRNA   SEQ ID NO   HCV序列
  R1   37   CTGGCCTCTCTGCAGATCAAG
  R2   38   TGCAGAGAGTGCTGATACTGG
  R3   39   TGAGCCGCTTGACTGCAGAGA
  R4   40   GAAAGGTCCGTGAGCCGCTT
  R5   41   TAGCTGTGAAAGGTCCGTGAG
  R6   42   TTAGCCCTAGTCACGGCTAGC
  R7   43   TCCATCTTAGCCCTAGTCACG
  R8   44   TTGGTGGCTCCATCTTAGCCC
所有被评估的siRNA都定位于HCV基因组的3′UTR上，并且在不同HCV基因型和准种间是保守的。SEQ ID NO：27代表HCV3′UTR的101个核苷酸序列，有时也被称为“X”区域。
                     实施例3
    沉默复制型细胞培养模型中HBV的复制和表达
细胞培养模型简述：
人肝来源的细胞系，如Huh7细胞系经一个HBV感染性分子克隆转染，该分子克隆含有具有末端冗余的能够转录所有HBV病毒RNA并产生病毒颗粒的病毒基因组[1-3]。用于本研究的复制子病毒序列来自Gen Bank Accession V01460和J02203的序列。在被内吞进入细胞并在核内定位后，从数个病毒启动子开始的感染性HBV质粒的转录启动反映HBV复制的级联事件，这种事件包括翻译转录的病毒mRNA、将转录的前基因组RNA包装进核心颗粒、前基因组RNA的逆转录、病毒和HBsAg(乙肝表面抗原)的组装和分泌进入被转染细胞的培养基。该细胞模型反映了HBV在被其感染的肝细胞中复制的大多数环节，因此是一个很好的用于观察沉默HBV的表达和复制的模型。
利用这一模型，用HBV的感染性分子克隆和各个效应RNA构建体共转染细胞，然后按以下所描述的方法监测HBV表达和复制的丧失。
以下是一个用编码来自SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：5序列的eiRNA载体进行实验的实施例。该特殊的eiRNA载体是以T7 RNA聚合酶为基础的载体，(参见，例如，WO 0063364和提交于2002年7月31日的USSN 60/399,998P、提交于2002年10月18日的USSN60/419,532中关于T7 dsRNA表达系统的教导)并且编码发夹状RNA结构(特别理想的是，例如，提交于2002年7月31日的USSN60/399,998P和提交于2003年7月31日的PCT/US2003/024028中描述的“强制性”发夹构建体，能够通过RNA依赖的RNA聚合酶延伸而形成dsRNA发夹的部分发夹结构，和提交于2002年10月18日的USSN 60/419,532和提交于2003年10月20日的PCT/US2003/033466中描述的“牛乳”样发夹结构(例如多-发夹长dsRNA载体和多-短发夹结构)、带有错误配对区域的发夹和多表位构建体)。可以预期的是，使用其他如上所描述的表达和启动子系统，和/或编码备选的dsRNA结构(即双螺旋)的载体也会有类似结果。
实验步骤：转染
将Huh7接种于6孔板，使转染时细胞生长到80-90％融汇度。所有转染根据使用说明用LipofectamineTM(Invitrogen)进行。在本实验中，细胞被50ng感染性HBV质粒、1μg T7 RNA聚合酶表达质粒(描述见下)、600ng编码来自SEQ ID NO：1序列的发夹状RNA的eiRNA载体(描述见下)和600ng编码来自SEQ ID NO：5序列的发夹状RNA的eiRNA载体(描述见下)转染。对照细胞用50ng感染性HBV质粒和1μg T7 RNA聚合酶表达质粒转染。惰性填充DNApGL3-basic(Promega，Madison WI)被加入转染物中，使总DNA/转染达2.5μg DNA。
监测细胞HBV表达的丧失
继转染之后，通过测定HbsAg分泌和含DNA的病毒颗粒的分泌来监测HBV表达和复制的丧失或降低。从给予dsRNA两天后开始对被转染细胞的培养基进行测试，以后每隔一天测试一次共三周，以此监测细胞。购自Abbott Labs(Abbott Park，IL)的Auszyme ELISA试剂盒用于检测乙肝表面抗原(HBsAg)。检测HBsAg不仅因为其与病毒复制有关，而且它与转染的感染性HBV克隆上RNA聚合酶II启动的表面抗原顺反子的转录有关。因为HbsAg的合成在无HBV复制的情况下能继续进行，所以，不仅下调病毒的复制是重要的，而且下调非复制依赖的HBsAg合成也同样重要。含有包裹着的HBV基因组DNA的病毒颗粒的分泌也被监测。含有核壳包裹着的DNA的病毒颗粒的丧失提示病毒复制的停止。分析病毒颗粒的分泌涉及到区分裸露未成熟的核颗粒和有包膜的感染性病毒粒的技术[6]。简短地说，从细胞培养基得到的沉淀的病毒颗粒用蛋白酶k消化，降解其核心蛋白。灭活蛋白酶K后，在样品中加入RQ1 DNase(Promega，Madison，WI)以降解从核颗粒中释放出的DNA。在SDS存在下用蛋白酶K再次消化样品，以失活Dnase并破裂和降解感染性的有包膜的病毒颗粒，然后DNA用酚/氯仿抽提纯化并用乙醇沉淀。经电泳后用Southern印迹法检测HBV特异性DNA。
相对只转染了HBV质粒和T7 RNA聚合酶表达质粒的细胞来说，转染有HBV质粒、T7 RNA聚合酶表达质粒和eiRNA构建体的细胞培养基中，HBsAg和病毒颗粒的分泌理想地将有70-95％的降低。
实验中所用的载体
T7 RNA聚合酶基因序列
T7 RNA聚合酶基因SEQ ID NO：47代表克隆进哺乳动物表达载体如pCEP4(Invitrogen，Carlsbad，CA)的T7 RNA聚合酶基因。对本领域的技术人员来说，克隆是件容易的事情。本领域的技术人员也应该知道，带有Kozak序列的前导序列需要被直接克隆到T7 RNA聚合酶基因的上游。
编码来自SEO ID NO：1的RNA发夹的eiRNA载体
该载体为以上描述的以T7为基础的载体，其编码单分子发夹的插入片段含有定位于GenBank检索号为V01460和J02203上的坐标(coordinate)3004-2950(大约55bp)位的片段。该发夹的一个区域编码该序列的正义型，另一个区域编码该序列的反义型。本领域的技术人员能够很容易地设计和制备出发夹结构来。
编码来自SEQ ID NO：5的RNA发夹的eiRNA载体
该载体为以上描述的基于T7的载体，其编码单分子发夹的插入片段含有定位于GenBank检索号V01460和J02203上的坐标730-786位的片段。发夹设计与所述的编码来自SEQ ID NO：1序列的发夹设计相同。
实验1
小鼠模型的原理：
黑猩猩是研究人HBV感染的唯一动物模型。然而体内有HBV表达和复制发生的小鼠模型也可得到。这种模型对于评价抗HBV治疗药物有着无法估量的价值并且可以用于预测这种药物在人体的有效性[4]。这种模型中的第一是转基因鼠模型，其中表达HBV的基因组或经选择的HBV基因[7，8]。因为HBV整合入了小鼠染色体基因组，这种动物不仅能够作为病毒复制的模型而且能够作为RT-非依赖的抗原表达模型。一个类似的模型为其中具有复制能力的HBV从一个HBV DNA游离体上瞬时表达，该模型是将具有复制能力的HBV DNA通过流体动力学导入法导入小鼠肝脏而得[1]。与转基因鼠不同，这种模型对H3V抗原是无免疫耐受的并且可以用于免疫介导的HBV转染肝细胞的清除的研究。
虽然分别有用于土拔鼠肝炎(WHBV)和鸭肝炎(DHBV)研究的土拔鼠和鸭模型存在，有几个原因让我们决定不用这种模型，1)人HBV不能在这种模型中研究，因为我们最终感兴趣的是下调人HBV的表达，使用这种模型在某些情况下必须重新设计和评价人HBV特异的载体和/或RNA。2)小鼠是等基因的，所以在该系统中不会有基因变化产生的噪音。3)不像人HBV，没有可以与其相应的动物模型进行平行研究的确定的WHBV/DHBV细胞培养模型。
以下描述的实验用流体动力学导入法作为方法将具有复制能力的ayw亚型的HBV质粒和各种效应dsRNA(eiRNA)表达载体共导入。流体动力学导入法对于本实验是很理想的因为它能够将核酸有效地导入肝脏[5]。dsRNA效应质粒和具有复制能力的HBV质粒制成同一制剂增加了两个质粒被同一细胞吸收的可能性。因为表达的效应dsRNA在大多数含有复制性HBV质粒的细胞中存在，观察到的结果可以归咎于效应质粒的作用而不是导入效率的差异。本实验显示只有特殊的eiRNA在感染的肝中有效。导入方法和制剂不是本实施例要回答的问题。eiRNA载体的配制、给药和导入在应用转基因鼠的实施例中有研究。
实验步骤：
对照B10.D2小鼠用流体动力学导入法注射含有末端冗余的能够转录所有病毒RNA并且产生感染性病毒的HBV感染性克隆(ayw亚型)[1，2，3]。继内化进入细胞并在核内定位后，从数个病毒启动子开始的感染性HBV质粒的转录启动了反映HBV复制的级联事件，这种事件包括翻译转录的病毒mRNA、将转录的前基因组RNA包装进核心颗粒、前基因组RNA的逆转录、病毒和HBsAg(乙肝表面抗原)的组装和分泌进入被转染动物的血清中。动物被注射4个剂量的HBV复制型质粒(1μg、3μg、5μg和10μg)。选择这种剂量是因为它们代表了流体动力学导入后能够激起报告基因可测出的表达的非饱和剂量。动物同时用效应dsRNA表达载体(eiRNA)进行转染，使各组动物接受10-19μg剂量的特殊效应构建体，以使总DNA剂量达20μg。例如，接受3μg剂量的HBV复制子的小鼠，再注射17μg的eiRNA载体，使注射的总DNA达20pg。这种剂量的大小因此取决于所用HBV质粒的剂量。对照动物注射HBV复制子但无eiRNA载体。对照小鼠转而用惰性填充DNA pGL3-basic(Promega，Madison，WI)共注射，以使制剂中的总DNA量达到20μg。本研究中的eiRNA载体为基于U6的表达载体，例如，Ambion，Inc.，Austin，TX，USA。这种载体编码来自SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：4.的短发夹RNA。这种载体编码的精确序列在以下描述。这种载体共注射的量相同(重量)。预期用本文其他处所描述的其他的表达和启动子系统和/或编码其他结构(即双螺旋)的载体也会得到类似结果。
编码来自SEQ ID NO：1的基于U6的eiRNA载体的描述：编码含有定位于检索号V01460和J02203的坐标2905-2929位序列的发夹的载体(即含有该序列的正义型和反义型，被一个TTCAAAAGA环状结构隔开的发夹)。有关基于U6的载体的序列可在Lee等文献中找到[9]。本实验使用的第二eiRNA载体编码来自序列SEQ ID NO：4的发夹并编码定位于检索号V01460和J02203的坐标1215-1239位的序列。
注射一天后，取被注射动物的肝脏样品并分析HBV RNA的存在。时间点的选择依据Dr.Chisari的实验室所发表的结果，该结果详述了ayw亚型HBV质粒继流体动力学导入后在鼠体的复制动力学并且显示肝中的RNA表达高峰出现在流体动力学导入一天后[1]。肝脏样品中的HBV RNA的存在由Northern杂交分析确定。将评估肝组织中HBV RNA表达的下调。另外，将从第4天开始收集小鼠血清测定HBV表面抗原和含DNA的病毒颗粒。测试将与细胞复制子实验(实施例3)和Yang[1]等描述的相同。各载体和对照组将包括两组动物，每组对应于一个采样时间点，每组5只动物。
结果：
相对对照动物，注射了HBV复制子和eiRNA构建体的小鼠将有HBV特异的RNA和HBV病毒颗粒的下降，个别动物下降的范围将在约70％到接近100％的范围。
实验2
转基因鼠研究：背景
我们将使用Dr.Chisari实验室[8]开发的转基因小鼠，这种小鼠复制可观的HBV DNA并且显示了它们作为预测人体有效性的抗病毒筛选的用途[4]。这种动物作为HBV整合介导的抗原表达模型也很理想，因而不仅可作为病毒复制的模型，而且可作为非RT-依赖的抗原表达模型。这一点非常重要，因为我们不仅有兴趣以病毒复制为靶目标，而且有兴趣以整合介导的抗原表达为靶目标。
这种实验与流体动力学导入实验不同，流体动力学导入法效应质粒是通过临床相关的核酸导入方法用药的。在这种模型上有效证明效应质粒被有效地导入了小鼠肝细胞。
实验
参考文献[8]中的小鼠静脉注射含有流体动力学导入实施例中描述的eiRNA载体的制剂。它们是基于U6的编码含有来自SEQ IDNO：1和SEQ ID NO：4序列的发夹eiRNA的载体。
注射用DNA制剂
如Satishchandran提交于2003年5月6日的PCT/US03/14288，″Methods for Delivery of Nucleic Acids″中所描述，将DNA与三乳糖(trilactosyl)精胺和胆固醇精胺制成制剂。制备三种制剂，其电荷比均为1.2(正电比负电)。然而，应该注意电荷比为0.8到1.2的制剂都应该有效。各质粒的DNA起始母液为4mg/ml，两种质粒的母液等量混合使各质粒为2mg/ml。这一质粒混合物用于最后配制制剂。制剂如PCT/US03/14288中所述(以上)：制剂A)35％三乳糖精胺、65％胆固醇酯精胺，制剂B)50％三乳糖精胺、50％胆固醇酯精胺，制剂C)80％三乳糖精胺、20％胆固醇酯精胺。所有配好的制剂含有1mg/ml的各质粒。
小鼠静脉注射100μlDNA制剂。一组小鼠接受制剂A，第二组接受制剂B，第三组接受制剂C。三组对照鼠相似地注射含有对照DNA pGL3Basic(Promega，Madison WI)的制剂D，E和F。每天注射一次连续4天。注射1-3天已有效，但4天注射的方案有更强的效果。
继用药后，在第一次注射后的第5天和第9天对HBV DNA和HBsAg及含DNA的病毒颗粒进行定量检测。所有分析与流体动力学导入研究中所描述的一样。
结果：A、B和C制剂组的HBV特异的RNA水平、HBsAg和含DNA的颗粒的病毒相对对照来讲将减低。
实施例4
沉默具有复制能力的细胞模型中HBV的复制和表达。
细胞培养模型简述：
人肝来源的细胞系如Huh7细胞用含有末端冗余的能够转录所有病毒RNA和产生感染性病毒的病毒基因组的HBV感染性分子克隆转染。本研究所用的复制子来自Gen Bank检索号AF090840的病毒序列。在内化进入细胞并在核内定位后，从数个病毒启动子开始的感染性HBV质粒的转录启动反映HBV复制的级联事件，这种事件包括翻译转录的病毒mRNA、将转录的前基因组RNA包装进核心颗粒、前基因组RNA的逆转录、病毒和HBsAg(乙肝表面抗原)的组装和分泌进入被转染细胞的培养基。该细胞模型再现了HBV在被其感染的肝细胞中复制的大多数环节，因此是一个很好的用于观察失活HBV的表达和复制的模型。
在本模型中，细胞用HBV感染性分子克隆和eiRNA构建体共转染，然后如以下所述的那样观察HBV表达和复制的降低。
以下是用编码来自SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2.序列的eiRNA载体进行的实验实施例。用于本实验的特殊载体为编码约650bp的RNA双螺旋的RNA T7聚合酶载体(参见，例如，提交于2000年4月19日的WO 00/63364)。预期使用本文其他处所描述的其他表达和启动子系统和/或编码其他结构(即，双螺旋)的载体也能得到类似的结果。
实验步骤：转染
接种Huh7细胞到6孔板中，使其在转染时融汇度达到80-90％。所有转染根据厂家提供的说明书用Lipofectamine(InVitrogen)进行。在本实验中，细胞按以下方式转染：A)50ng感染性HBV adw亚型质粒，1μg T7 RNA聚合酶表达质粒(实施例3中描述的质粒)，和1.5μgHBV特异性eiRNA载体(以下描述)；B)50ng感染性HBV质粒，1μg T7 RNA聚合酶表达质粒和1.5μg非相关dsRNA表达质粒；C)125ng感染性HBV质粒，1μg T7 RNA聚合酶表达质粒和1.4μgHBV特异性eiRNA载体；D)125ng感染性HBV质粒，1μg T7 RNA聚合酶表达质粒和1.4μg非相关dsRNA表达载体。所有转染均做复孔。在此实验中，B和D为对照。转染4天后取转染细胞的培养基检测其中HbsAg的存在(见下)。未转染细胞的培养基作为背景对照也被检测。
监测细胞中HBV表达的丧失
继转染后，通过测定HbsAg的分泌监测细胞中HBV表达和复制的丧失和减低。在使用dsRNA后4天，通过检测被转染细胞的培养基(和培养基对照)来监测细胞。购自Abbott Labs(Abbott Park，IL)的Auszyme ELISA试剂盒用于检测乙肝表面抗原(HBsAg)，测定表面抗原不仅因为它与病毒复制有关，而且与RNA聚合酶在转染的感染性克隆上启动的表面抗原顺反子的转录有关。因为在无HBV复制的情况下表面抗原能继续合成，所以不仅下调病毒复制是重要的，而且下调非复制依赖的表面抗原合成也很重要。
结果：
相对对照转染，在第4天的时间点上，用HBV特异性eiRNA构建体转染的细胞显示HbsAg下降了82-93％。
本实验所用HBV特异性eiRNA
该eiRNA载体编码定位于GenBank检索号#AF090840的坐标2027-2674位的dsRNA，所以序列包括来自SEQ ID NO：1和SEQ IDNO：2.的序列。更具体的讲，该序列包括所有SEQ ID NO：2和来自SEQID NO：1的134bp。
实施例5
在细胞复制子模型中下调HCV
简述
本实验中，一个表达功能性HCV复制子的细胞系被构建，该细胞系的构建如Lohmann等所详述[10]。在本实验中，Huh7细胞被用作母细胞系，但理论上讲，任何人肝细胞来源的细胞系均适用。该细胞被HCV特异的eiRNA载体转染。eiRNA转染后的3-7天，HCV特异性RNA的存在用Lohmann等描述的Northern印迹分析来确定。
实验方案：转染
用表达HCV复制子的Huh7细胞接种6孔板使转染时细胞融汇度达80-90％。所有转染根据厂家提供的说明书用Lipofectamine TM(InVitrogen)进行。在本实验中，细胞用1μg T7 RNA聚合酶表达质粒(实施例3中所描述的质粒)和1.5μg基于T7的编码含有来自SEQID NO：11序列的发夹RNA的eiRNA载体(实施例的末尾描述的载体)转染。对照细胞用1μg T7 RNA聚合酶表达质粒和1.5μg实施例3中描述的基于T7的HBV特异的(SEQ ID NO：1特异)eiRNA载体转染。未转染表达复制子的HuH 7细胞被用作第二对照。制备各转染混合物使各混合物的量足够进行10次转染，总量可进行20次转染(每个混合物10次)。在3、4、5、6和7天从各转染组取两孔细胞进行裂解，并用标准方法提取RNA。如Lohmann等所述，样品同时用Northern印迹法分析HCV特异性RNA的存在[10]。
结果：
相对对照细胞，转染了HCV特异性eiRNA载体的细胞将显示HCV特异性RNA水平在每个被分析的时间点都有下降。
HCV特异性eiRNA载体
该eiRNA载体为基于T7且编码发夹RNA的载体，发夹的一边含有SEQ ID NO：48。
该序列后是一个9Ts的环状结构。发夹的第二边含有与发夹的第一边互补的序列。本领域的技术人员能够很容易地设计和构建发夹构建体。注意：预期由其他启动子驱动的和编码其他类型的RNA结构的其他类型eiRNA载体将有同样的效果。
实施例6
HBV/HCV共感染的治疗
简述
在本实施例中，复制HBV和HCV复制子的细胞用编码HBV和HCV特异的eiRNA的eiRNA载体转染。
实验方案：
含有HBV和HCV复制子的细胞系的构建
HuH 7首先被改造来表达功能性HCV复制子。细胞系的构建细见Lohmann等[10]。细胞系建立后，用例3和以下“细胞转染”章节中的感染性HBV复制子质粒转染细胞系。在本实施例中，复制子来自Gen Bank检索号V01460和J02203的病毒序列。理论上讲，可以首先构建一个稳定表达HBV复制子的细胞系，再用该细胞系来构建一个也表达HCV复制子的细胞系。也可以同时用HBV和HCV的复制子共转染细胞，然后筛选并扩增出表达HBV和HCV两种复制子的细胞来。
细胞转染
在本实施例中，HBV和HCV eiRNA由同一载体的不同的顺反子编码。然而，预期该eiRNA由同一顺反子编码或由不同的载体提供都应获得类似的结果。在本实施例中，各顺反子的转录由T7 RNA聚合酶启动子和T7 RNA聚合酶驱动。各启动子后面是发夹eiRNA，紧随发夹eiRNA的是T7终止子(图1)。本例中的顺反子是连续的，但也可用不连续的顺反子。应该知道也可用其他表达系统(包括病毒)来产生这种RNA，也可用如本文其他处所描述的其他启动子来驱动这种RNA的表达而不会对效果有明显影响。选择合适的表达系统和启动子属本领域的技术范围，人们也可以表达其他eiRNA结构，例如，本文其他处所描述的和本领域的其他文献中所描述的其他结构。在本例中，HBV eiRNA载体编码来自SEQ ID NO：1的序列，HCVeiRNA载体编码来自SEQ ID NO：11.的序列。有关载体插入的描述在实施例的末尾。
用Huh7细胞接种6孔板使转染时细胞融汇度达80-90％。所有转染根据厂家提供的说明书用Lipofectamine(InVitrogen)进行。在本实验中，用50ng感染性HBV质粒、1μgT7 RNA聚合酶表达质粒(实施例3中所描述的质粒)、600ng编码来自SEQ ID NO：1序列的发夹RNA的eiRNA载体(以下及实施例3有描述)和600ng编码来自SEQID NO：11序列的发夹RNA的eiRNA载体(以下描述)转染细胞。对照细胞用50ng感染性HBV质粒和1μgT7 RNA聚合酶表达质粒转染。用惰性填充DNA，pGL3-basic(Promega，Madison WI)将DNA/转染补足到2.5μg。制备时使每种转染混合物量足以进行10次转染，总量为20次转染(每种10次)。
分析
继转染后，通过测定HbsAg和含DNA病毒颗粒的分泌来监测细胞HBV表达和复制的丧失。用检测被转染细胞的培养基来监测细胞，从使用dsRNA的两天后开始，以后每隔一天检测一次直到3个星期。用从Abbott Labs(Abbott Park，IL)购得的Auszyme ELISA试剂盒检测乙肝表面抗原(HBsAg)，测定HbsAg是因为它不仅与病毒复制有关，而且与RNA聚合酶II启动的被转染的感染性克隆上表面抗原顺反子的转录有关。由于HbsAg在无HBV复制的情况下能够继续合成，所以不仅下调病毒的复制是重要的，而且下调非复制依赖的HbsAg合成也很重要。含核壳蛋白包裹的HBV基因组DNA的病毒颗粒的分泌也被测定，含有核壳蛋白包裹的HBV基因组DNA的病毒颗粒的丧失提示HBV复制的丧失。病毒毒粒的分析涉及到区别裸露的不成熟的核心颗粒和包装好的感染性HBV病毒毒粒[6]。简单地讲，从细胞培养基中得到的病毒沉淀物用蛋白酶K消化以降解核心蛋白，继失活蛋白酶k后，样品与RQ1 DNase(Promega，Madison，WI)共孵育，降解从核心颗粒中释放出来的DNA。样品在有SDS以失活Dnase的条件下再次用蛋白酶K消化，以破碎和降解感染性的有包膜病毒颗粒。然后用酚/氯仿抽提并纯化DNA。HBV特异性DNA经电泳检测后用Southern印迹分析。
在第3、4、5、6、和7天，各转染组(实验组和对照组)的两孔细胞被裂解并用标准方法提取RNA。样品用Lohmann等[10]描述的Northern分析法分析HCV特异性RNA的存在。
结果：
转染了HBV-HCV特异性eiRNA载体的细胞相对对照细胞来说，在每个被分析的时间点上HCV特异的RNA水平将降低，另外，相对对照来讲，HbsAg和HBV病毒颗粒也会降低。
HCV特异的eiRNA序列
该eiRNA载体为基于T7并编码发夹RNA的载体。该发夹的一边含有SEQ ID NO：48。
该序列之后紧随着一个9Ts的环状结构。该发夹的第二边含有与发夹的第一边互补的序列。本领域的技术人员能够很容易地设计和构建反夹结构。注意：预期由其他启动子驱动和编码其他类型的RNA结构的其他类型的eiRNA载体也会有类似作用。特别理想的是，例如，  “强制性”发夹、能够通过RNA依赖的聚合酶延伸形成发夹的部分发夹，正如提交于2002年7月31日的USSN 60/399,998P和提交于2003年7月31日的PCT/US2003/024028中所描述，和提交于2002年10月18日的USSN 60/419,532和提交于2003年10月20日的PCT/US2003/033466中描述的“牛乳”样结构发夹(例如多-发夹长dsRNA载体和多-短发夹结构)、带有错误配对区域的发夹和多表位构建体，还有其他本领域技术人员所知的dsRNA结构。
HBV特异的eiRNA-SEQ ID NO：1
该载体为以上描述的基于T7的载体，其插入片段编码含有定位于GenBank检索号460和J02203的坐标3004-2950位(约55bp)的单分子发夹。发夹的一个区域为该序列的正义型，发夹的另一个区域为该序列的反义型。本领域的技术人员能很容易地设计和制备发夹结构。
参考文献
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9.Lee，NS，Dohjima，T.，Bauer G.，Li，H.Li，M.J.，Ehsani，A.，Salvaterra，P.and Rossi，J.Expression of small interfering RNAs targetedagainst HIV-1 rev transcripts in human cells.Nature Biotechnology，2002，p.500-505.
10.Lohmann，V.，Korner，F.，Koch，J.-O.，Herian，U.，Theilmann，L.and Bartenschlager.R.Replication of Subgenomic Hepatits C VirusRNAs in a Hepatoma Cell Line.Science.1999.285：110-113.
                                  序列表
<110>原子核物理公司(Nucleonics，Inc.)
     C.J.帕楚克(Pachuk，Catherine)
     C.萨蒂什钱德兰(Satishchandran，C.)
     V.R.小祖劳斯基(Zurawski，Vincent)
     L.明茨(Mintz，Liat)
<120>用于基因沉默的HBV和HCV保守序列
<130>26788-002
<150>60/478,076
<151>2003-06-12
<160>48
<170>PatentIn version 3.2
<210>1
<211>138
<212>DNA
<213>乙型肝炎病毒(Hepatitis B Virus)
<220>
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<222>(137)..(137)
<223>n为a、c、g或t
<400>1
gaacatggag arcayhdcat caggaytcct aggacccctg ctcgtgttac aggcggkgtk    60
tttctygttg acaaraatcc tcacaatacc dcagagtcta gactcgtggt ggacttctct   120
caattttcta ggggdany                                                 138
<210>2
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<212>DNA
<213>乙型肝炎病毒(Hepatitis B Virus)
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tggatgtgtc trcggcgttt tatcat                                         26
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aaggcctttc tvhgtmaaca rtaymtgmmc ctttaccccg ttgcymggca acggychggy    60
ctntgccaag tgtttgctga cgcaaccccc actgghtggg gcttggybat nggccatcrs   120
cgcatgcgtg gaacctttbn gkctcctctg ccgatccata ctgcggaact cctngcngcb   180
tgtttygctc gcagcmggtc tggrgc                                        206
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<213>乙型肝炎病毒(Hepatitis B Virus)
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yactgttcaa gcctcaagct gtgccttggg tggctttrgg rcatggacat tgacmcktat    60
aaagaatttg gagctwctgt ggagttactc tcdtttttgc cttcygactt ytttccttc    119
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<213>乙型肝炎病毒(Hepatitis B Virus)
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cgabgcaggt cccctagaag aagaactccc tcgcctcgca gacgmgrtct caatcgmcgc    60
gtcgcagaag atctcaatyt cgggaatcty aatgttagta t                       101
<210>6
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<212>DNA
<213>乙型肝炎病毒(Hepatitis B Virus)
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abgcaggtcc cctagaagaa gaactccctc gcctcgcaga cgmgrtctca atcgmcgcgt    60
cgcagaagat ctcaatytcg ggaatctyaa tgttagtat                           99
<210>7
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<213>乙型肝炎病毒(Hepatitis B Virus)
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cabgcaggtc ccctagaaga agaactccct cgcctcgcag acgmgrtctc aatcgmcgcg    60
tcgcagaaga tctcaatytc gggaatctya atgttagtat                         100
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<213>乙型肝炎病毒(Hepatitis B Virus)
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gabgcaggtc ccctagaaga agaactccct cgcctcgcag acgmgrtctc aatcgmcgcg    60
tcgcagaaga tctcaatytc gggaatctya atgttagtat                         100
<210>9
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<223>n为a、c、g或t
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ttggybatng gccatcrscg catgcgtgga acctttbngk ctcctctgcc gatccatact    60
gcggaactcc tngcngcbtg tttygctcgc agcmggtctg grgc                    104
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ctgccaactg gathcthcgc gggacgtcct ttgtytacgt cccgtcrgcg ctgaatcchg    60
cggacgaccc n                                                         71
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<212>DNA
<213>丙型肝炎病毒(Hepatitis C Virus)
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<400>11
ddatcactcc cctgtgagga actactgtct tcacgcagaa agcgtctagc catggcgtta    60
gtatgagtgt ygtgcagcyt ccaggncccc ccctcccggg agagccatag tggtctgcgg   120
aaccggtgag tacaccggaa ttgccrggah gaccgggtcc tttcttggat daacccgctc   180
watgccygga vatttgggcg tgcccccgcr agacygctag ccgagtagyg ttgggtygcg   240
aaaggccttg tggtactgcc tgatagggtg cttgcgagtg ccccgggagg tctcgtagac   300
cgtgcahcat gagcacrmwt cchaaacchc aaagaaaaac caaamgwaac accaaccgyc   360
gcccacagga cgthaagttc ccgggyggyg ghcagatcgt tggbggagth tacbtgttgc   420
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chcghggnag                                                          490
<210>12
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<212>DNA
<213>丙型肝炎病毒(Hepatitis C Virus)
<220>
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<222>(6)..(6)
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atggcntggg atatgatgat gaactggyc                                      29
<210>13
<211>265
<212>DNA
<213>人(Homo sapiens)
<400>13
aaggtcgggc aggaagaggg cctatttccc atgattcctt catatttgca tatacgatac    60
aaggctgtta gagagataat tagaattaat ttgactgtaa acacaaagat attagtacaa   120
aatacgtgac gtagaaagta ataatttctt gggtagtttg cagttttaaa attatgtttt   180
aaaatggact atcatatgct taccgtaact tgaaagtatt tcgatttctt ggctttatat   240
atcttgtgga aaggacgaaa caccg                                         265
<210>14
<211>51
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>eiRNA编码序列，定位于Genebank检索号#V01460中的HBV-AYW坐标788-808
<400>14
cgtctgcgag gcgagggagt tagagaactt aactccctcg cctcgcagac g             51
<210>15
<211>51
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>eiRNA编码序列，定位于Genebank检索号#V01460中的HBV-AYW坐标807-827
<400>15
ttcttcttct aggggacctg cagagaactt gcaggtcccc tagaagaaga a             51
<210>16
<211>51
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>eiRNA编码序列，定位于Genebank检索号#V01460中的HBV-AYW坐标1291-1311
<400>16
aagccaccca aggcacagct tagagaactt aagctgtgcc ttgggtggct t             51
<210>17
<211>51
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>eiRNA编码序列，定位于Genebank检索号#V01460中的HBV-AYW坐标1299-1319
<400>17
caaggcacag cttggaggct tagagaactt aagcctccaa gctgtgcctt g             51
<210>18
<211>51
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>eiRNA编码序列，定位于Genebank检索号#V01460中的HBV-AYW坐标1737-1757
<400>18
ggattcagcg ccgacgggac gagagaactt cgtcccgtcg gcgctgaatc c             51
<210>19
<211>51
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>eiRNA编码序列，定位于Genebank检索号#V01460中的HBV-AYW坐标1907-1927
<400>19
ttccgcagta tggatcggca gagagaactt ctgccgatcc atactgcgga a             51
<210>20
<211>51
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>eiRNA编码序列，定位于Genebank检索号#V01460中的HBV-AYW坐标1912-1932
<400>20
cagtatggat cggcagagga gagagaactt ctcctctgcc gatccatact g             51
<210>21
<211>51
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>eiRNA编码序列，定位于Genebank检索号#V01460中的HBV-AYW坐标1943-1963
<400>21
tccacgcatg cgctgatggc cagagaactt ggccatcagc gcatgcgtgg a             51
<210>22
<211>51
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>eiRNA编码序列，定位于Genebank检索号#V01460中的HBV-AYW坐标1991-2011
<400>22
tgcgtcagca aacacttggc aagagaactt tgccaagtgt ttgctgacgc a             51
<210>23
<211>51
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>eiRNA编码序列，定位于Genebank检索号#V01460中的HBV-AYW坐标2791-2811
<400>23
aaaacgccgc agacacatcc aagagaactt tggatgtgtc tgcggcgttt t             51
<210>24
<211>51
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>eiRNA编码序列，定位于Genebank检索号#V01460中的HBV-AYW坐标2791-2811mut
<400>24
aaaacaccac acacgcatcc aagagaactt tggatgcgtg tgtggtgttt t             51
<210>25
<211>51
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>eiRNA编码序列，定位于Genebank检索号#V01460中的HBV-AYW坐标2912-2932
<400>25
ttgagagaag tccaccacga gagagaactt ctcgtggtgg acttctctca a             51
<210>26
<211>51
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>eiRNA编码序列，定位于Genebank检索号#V01460中的HBV-AYW坐标2919-2939
<400>26
aagtccacca cgagtctaga cagagaactt gtctagactc gtggtggact t             51
<210>27
<211>101
<212>DNA
<213>丙型肝炎病毒(Hepatitis C Virus)
<400>27
tttggtggct ccatcttagc cctagtcacg gctagctgtg aaaggtccgt gagccgcttg    60
actgcagaga gtgctgatac tggcctctct gcagatcaag t                       101
<210>28
<211>29
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>siRNA编码序列，定位于丙型肝炎病毒的X区
<400>28
gctaaacact ccaggccaat acctgtctc                                      29
<210>29
<211>29
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>siRNA编码序列，定位于丙型肝炎病毒的X区
<400>29
tcctttggtg gctccatctt acctgtctc                                      29
<210>30
<211>29
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>siRNA编码序列，定位于丙型肝炎病毒的X区
<400>30
gctccatctt agccctagtc acctgtctc                                      29
<210>31
<211>29
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>siRNA编码序列，定位于丙型肝炎病毒的X区
<400>31
tcttagccct agtcacggct acctgtctc                                      29
<210>32
<211>29
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>siRNA编码序列，定位于丙型肝炎病毒的X区
<400>32
cctagtcacg gctagctgtg acctgtctc                                      29
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<211>29
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>siRNA编码序列，定位于丙型肝炎病毒的X区
<400>33
ctagtcacgg ctagctgtga acctgtctc                                      29
<210>34
<211>29
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>siRNA编码序列，定位于丙型肝炎病毒的X区
<400>34
cgtgagccgc ttgactgcag acctgtctc                                      29
<210>35
<211>29
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>siRNA编码序列，定位于丙型肝炎病毒的X区
<400>35
gctgatactg gcctctctgc acctgtctc                                      29
<210>36
<211>29
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>siRNA编码序列，定位于丙型肝炎病毒的X区
<400>36
actggcctct ctgcagatca acctgtctc                                      29
<210>37
<211>21
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>siRNA编码序列，定位于丙型肝炎病毒的X区
<400>37
ctggcctctc tgcagatcaa g                                              21
<210>38
<211>21
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>siRNA编码序列，定位于丙型肝炎病毒的X区
<400>38
tgcagagagt gctgatactg g                                              21
<210>39
<211>21
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>siRNA编码序列，定位于丙型肝炎病毒的X区
<400>39
tgagccgctt gactgcagag a                                              21
<210>40
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>siRNA编码序列，定位于丙型肝炎病毒的X区
<400>40
gaaaggtccg tgagccgctt                                                20
<210>41
<211>21
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>siRNA编码序列，定位于丙型肝炎病毒的X区
<400>41
tagctgtgaa aggtccgtga g                                              21
<210>42
<211>21
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>siRNA编码序列，定位于丙型肝炎病毒的X区
<400>42
ttagccctag tcacggctag c                                              21
<210>43
<211>21
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>siRNA编码序列，定位于丙型肝炎病毒的X区
<400>43
tccatcttag ccctagtcac g                                              21
<210>44
<211>21
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>siRNA编码序列，定位于丙型肝炎病毒的X区
<400>44
ttggtggctc catcttagcc c                                              21
<210>45
<211>21
<212>RNA
<213>丙型肝炎病毒(Hepatitis C Virus)
<400>45
aaccucaaag aaaaaccaa c                                               21
<210>46
<211>21
<212>RNA
<213>人工序列
<220>
<223>lamin siRNA
<400>46
aacuggacuu ccagaagaac a                                              21
<210>47
<211>2652
<212>DNA
<213>噬菌体T7
<400>47
atgaacacga ttaacatcgc taagaacgac ttctctgaca tcgaactggc tgctatcccg    60
ttcaacactc tggctgacca ttacggtgag cgtttagctc gcgaacagtt ggcccttgag   120
catgagtctt acgagatggg tgaagcacgc ttccgcaaga tgtttgagcg tcaacttaaa   180
gctggtgagg ttgcggataa cgctgccgcc aagcctctca tcactaccct actccctaag   240
atgattgcac gcatcaacga ctggtttgag gaagtgaaag ctaagcgcgg caagcgcccg   300
acagccttcc agttcctgca agaaatcaag ccggaagccg tagcgtacat caccattaag   360
accactctgg cttgcctaac cagtgctgac aatacaaccg ttcaggctgt agcaagcgca   420
atcggtcggg ccattgagga cgaggctcgc ttcggtcgta tccgtgacct tgaagctaag   480
cacttcaaga aaaacgttga ggaacaactc aacaagcgcg tagggcacgt ctacaagaaa   540
gcatttatgc aagttgtcga ggctgacatg ctctctaagg gtctactcgg tggcgaggcg   600
tggtcttcgt ggcataagga agactctatt catgtaggag tacgctgcat cgagatgctc   660
attgagtcaa ccggaatggt tagcttacac cgccaaaatg ctggcgtagt aggtcaagac   720
tctgagacta tcgaactcgc acctgaatac gctgaggcta tcgcaacccg tgcaggtgcg   780
ctggctggca tctctccgat gttccaacct tgcgtagttc ctcctaagcc gtggactggc   840
attactggtg gtggctattg ggctaacggt cgtcgtcctc tggcgctggt gcgtactcac   900
agtaagaaag cactgatgcg ctacgaagac gtttacatgc ctgaggtgta caaagcgatt   960
aacattgcgc aaaacaccgc atggaaaatc aacaagaaag tcctagcggt cgccaacgta  1020
atcaccaagt ggaagcattg tccggtcgag gacatccctg cgattgagcg tgaagaactc  1080
ccgatgaaac cggaagacat cgacatgaat cctgaggctc tcaccgcgtg gaaacgtgct  1140
gccgctgctg tgtaccgcaa ggacagggct cgcaagtctc gccgtatcag ccttgagttc  1200
atgcttgagc aagccaataa gtttgctaac cataaggcca tctggttccc ttacaacatg  1260
gactggcgcg gtcgtgttta cgctgtgtca atgttcaacc cgcaaggtaa cgatatgacc  1320
aaaggactgc ttacgctggc gaaaggtaaa ccaatcggta aggaaggtta ctactggctg  1380
aaaatccacg gtgcaaactg tgcgggtgtc gataaggttc cgttccctga gcgcatcaag  1440
ttcattgagg aaaaccacga gaacatcatg gcttgcgcta agtctccact ggagaacact  1500
tggtgggctg agcaagattc tccgttctgc ttccttgcgt tctgctttga gtacgctggg  1560
gtacagcacc acggcctgag ctataactgc tcccttccgc tggcgtttga cgggtcttgc  1620
tctggcatcc agcacttctc cgcgatgctc cgagatgagg taggtggtcg cgcggttaac  1680
ttgcttccta gtgaaaccgt tcaggacatc tacgggattg ttgctaagaa agtcaacgag  1740
attctacaag cagacgcaat caatgggacc gataacgaag tagttaccgt gaccgatgag  1800
aacactggtg aaatctctga gaaagtcaag ctgggcacta aggcactggc tggtcaatgg  1860
ctggcttacg gtgttactcg cagtgtgact aagcgttcag tcatgacgct ggcttacggg  1920
tccaaagagt tcggcttccg tcaacaagtg ctggaagata ttattcagcc agctattgat  1980
tccggcaagg gtctgatgtt cactcagccg aatcaggctg ctggatacat ggctaagctg  2040
atttgggaat ctgtgagcgt gacggtggta gctgcggttg aagcaatgaa ctggcttaag  2100
tctgctgcta agctgctggc tgctgaggtc aaagataaga agactggaga gattcttcgc  2160
aagcgttgcg ctgtgcattg ggtaactcct gatggtttcc ctgtgtggca ggaatacaag  2220
aagcctattc agacgcgctt gaacctgatg ttcctcggtc agttccgctt acagcctacc  2280
attaacacca acaaagatag cgagattgat gcacacaaac aggagtctgg tatcgctcct  2340
aactttgtac acagccaaga cggtagccac cttcgtaaga ctgtagtgtg ggcacacgag  2400
aagtacggaa tcgaatcttt tgcactgatt cacgactcct tcggtaccat tccggctgac  2460
gctgcgaacc tgttcaaagc agtgcgcgaa actatggttg acacatatga gtcttgtgat  2520
gtactggctg atttctacga ccagttcgct gaccagttgc acgagtctca attggacaaa  2580
atgccagcac ttccggctaa aggtaacttg aacctccgtg acatcttaga gtcggacttc  2640
gcgttcgcgt aa                                                      2652
<210>48
<211>323
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>基于T7聚合酶的eiRNA
<400>48
atcactcccc tgtgaggaac tactgtcttc acgcagaaag cgtctagcca tggcgttagt    60
atgagtgtcg tgcagcctcc aggacccccc ctcccgggag agccatagtg gtctgcggaa   120
ccggtgagta caccggaatt gccaggacga ccgggtcctt tcttggatga acccgctcaa   180
tgcctggaga tttgggcgtg cccccgcgag actgctagcc gagtagtgtt gggtcgcgaa   240
aggccttgtg gtactgcctg atagggtgct tgcgagtgcc ccgggaggtc tcgtagaccg   300
tgcaccatga gcacaaatcc taa                                           323

Claims (31)

1.一种抑制乙型肝炎病毒的多核苷酸序列在体内哺乳动物细胞内表达的方法，该方法包括给予所述细胞含有选自SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：5、SEQ IDNO：6、SEQ ID NO：7、SEQ ID NO：8、SEQ ID NO：9和SEQ ID NO：10的序列中的至少19个连续碱基对核苷酸序列的双链RNA效应分子；其中U取代T。
2.权利要求1的方法，该方法进一步包括将其中含有来自不止一种SEQ ID NO：1到SEQ ID NO：10中的至少19个连续碱基对核苷酸序列的效应分子给予同一细胞。
3.权利要求1的方法，其中所述给予通过提供一种或多种含有能够使所述哺乳动物细胞内产生双链RNA效应分子的表达构建体的表达载体来完成，该双链RNA效应分子含有选自SEQ ID NO：1、SEQID NO：2、SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：7、SEQ ID NO：8、SEQ ID NO：9和SEQ ID NO：10的序列中的至少19个连续碱基对核苷酸序列；其中U取代T。
4.权利要求3的方法，其中所述一种或多种表达载体进一步含有选自T7聚合酶启动子、SP6聚合酶启动子和RNA聚合酶III启动子的启动子，所述启动子被操作性地连接到所述至少19个连续碱基对核苷酸序列上。
5.一种抑制丙型肝炎病毒的多核苷酸序列在体内哺乳动物细胞内表达的方法，该方法包括给予所述细胞含有选自SEQ ID NO：11和SEQ ID NO：12的序列中至少19个连续碱基对核苷酸序列的双链RNA效应分子；其中U取代T。
6.权利要求5的方法，该方法进一步包括将其中含有来自不止一种SEQ ID NO：11和SEQ ID NO：12中的至少19个连续碱基对核苷酸序列的效应分子给予同一细胞。
7.权利要求5的方法，其中所述给予通过提供一种或多种含有能够使所述哺乳动物细胞内产生双链RNA效应分子的表达构建体的表达载体来完成，该双链RNA效应分子含有选自SEQ ID NO：11和SEQ ID NO：12的序列中至少19个连续碱基对核苷酸序列；其中U取代T。
8.权利要求7的方法，其中所述一种或多种表达载体进一步含有选自T7聚合酶启动子、SP6聚合酶启动子和RNA聚合酶III启动子的启动子，所述启动子被操作性地连接到所述至少19个连续碱基对核苷酸序列上。
9.一种抑制乙性肝炎病毒的多核苷酸序列和丙型肝炎病毒的多核苷酸序列二者在同一体内哺乳动物细胞内表达的方法，所述方法包括给予所述细胞含有选自SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2、SEQ IDNO：3、SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：7、SEQ ID NO：8、SEQ ID NO：9和SEQ ID NO：10的序列中第一至少19个连续碱基对核苷酸序列的双链RNA效应分子；其中U取代T；和给予含有选自SEQ ID NO：11和SEQ ID NO：12的序列中第二至少19个连续碱基对核苷酸序列的双链RNA效应分子；其中U取代T。
10.权利要求9的方法，该方法进一步包括将其中含有来自两种以上SEQ ID NO：1到SEQ ID NO：12中的至少19个连续碱基对核苷酸序列的效应分子给予同一细胞。
11.权利要求9的方法，其中所述给予通过提供一种或多种含有能够使所述哺乳动物细胞内产生以下双链RNA效应分子的表达构建体的表达载体来完成：含有选自SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2、SEQID NO：3、SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：7、SEQ ID NO：8、SEQ ID NO：9和SEQ ID NO：10的序列中第一至少19个连续碱基对核苷酸序列的双链RNA效应分子；其中U取代T；和含有选自SEQ ID NO：11和SEQ ID NO：12的序列中第二至少19个连续碱基对核苷酸序列的双链RNA效应分子；其中U取代T。
12.权利要求11的方法，其中所述一种或多种表达载体进一步包含：选自T7聚合酶启动子、SP6聚合酶启动子和RNA聚合酶III启动子的第一启动子，所述第一启动子被操作性地连接到所述第一至少19个连续碱基对核苷酸序列上；和选自T7聚合酶启动子、SP6聚合酶启动子和RNA聚合酶III启动子的第二启动子，所述第二启动子被操作性地连接到所述第二至少19个连续碱基对核苷酸序列上。
13.权利要求1、5或9中任一项的方法，其中所述哺乳动物细胞为人细胞。
14.一种抑制乙肝病毒的多核苷酸序列在体内哺乳动物细胞内表达的组合物，该组合物包括含有选自SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：7、SEQ ID NO：8、SEQ ID NO：9和SEQ ID NO：10的序列中至少19个连续碱基对核苷酸序列的双链RNA效应分子；其中U取代T。
15.权利要求14的组合物，进一步包含其中含有来自不止一种SEQ ID NO：1到SEQ ID NO：10序列中的至少19个连续碱基对核苷酸序列的效应分子存在于所述组合物中。
16.一种抑制丙型肝炎病毒的多核苷酸序列在体内哺乳动物细胞内表达的组合物，该组合物包括含有选自SEQ ID NO：11和SEQ IDNO：12的序列中至少19个连续碱基对核苷酸序列的双链RNA效应分子；其中U取代T。
17.权利要求16的组合物，进一步包含其中含有来自不止一种SEQ ID NO：11和SEQ ID NO：12的至少19个连续碱基对核苷酸序列的效应分子存在于所述组合物中。
18.一种抑制乙型肝炎病毒的多核苷酸序列和丙型肝炎病毒的多核苷酸序列二者在单个体内哺乳动物细胞内表达的组合物，该组合物包括含有选自SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：3、SEQID NO：4、SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：7、SEQ ID NO：8、SEQ ID NO：9和SEQ ID NO：10的序列中的第一至少19个连续碱基对核苷酸序列的双链RNA效应分子；其中U取代T；和含有选自SEQ ID NO：11和SEQ ID NO：12的序列中的第二至少19个连续碱基对核苷酸序列的双链RNA效应分子；其中U取代T。
19.权利要求18的组合物，进一步包括其中含有来自两种以上SEQ ID NO：1到SEQ ID NO：12中的至少19个连续碱基对核苷酸序列的效应分子存在于所述组合物中。
20.权利要求14、16或18中任一项的组合物，其中所述哺乳动物细胞为人细胞。
21.一种抑制乙型肝炎病毒的多核苷酸序列在哺乳动物细胞内表达的组合物，该组合物含有选自以下的序列中的至少19个连续碱基对核苷酸序列：
a)SEQ ID NO：1；
b)SEQ ID NO：2；
c)SEQ ID NO：3；
d)SEQ ID NO：4；
e)SEQ ID NO：5；
f)SEQ ID NO：6；
g)SEQ ID NO：7；
h)SEQ ID NO：8；
i)SEQ ID NO：9；
j)SEQ ID NO：10；
k)(a)到(j)的互补序列；和
l)(a)到(k)的混合物。
22.一种抑制丙型肝炎病毒的多核苷酸序列在哺乳动物细胞中表达的组合物，该组合物含有选自以下序列中的至少19个连续碱基对核苷酸序列：
a)SEQ ID NO：11；
b)SEQ ID NO：12；
c)(a)或(b)的互补序列；
d)(a)到(c)的混合物。
23.一种抑制乙型肝炎病毒的多核苷酸序列和丙型肝炎病毒的多核苷酸序列在同一哺乳动物细胞中表达的组合物，该组合物含有选自以下的序列中的至少19个连续碱基对核苷酸序列：
a)SEQ ID NO：1；
b)SEQ ID NO：2；
c)SEQ ID NO：3；
d)SEQ ID NO：4；
e)SEQ ID NO：5；
f)SEQ ID NO：6；
g)SEQ ID NO：7；
h)SEQ ID NO：8；
i)SEQ ID NO：9；
j)SEQ ID NO：10；
k)SEQ ID NO：11；
l)SEQ ID NO：12
m)(a)到(l)的互补序列；和
n)(a)到(m)的混合物；
其中所述组合物包含至少一种来自组(a)到(j)的以及一种来自组(k)和(l)的序列。
24.权利要求21、22或23中任一项的组合物，其中所述至少19个连续核苷酸序列包含DNA并且哺乳动物细胞为人细胞。
25.权利要求21、22或23中任一项的组合物，其中所述至少19个连续核苷酸序列包含RNA并且哺乳动物细胞为人细胞；此外其中U取代T。
26.一段多核苷酸序列，该多核苷酸序列包含选自SEQ ID NO：14到SEQ ID NO：26的序列。
27.一段多核苷酸序列，该多核苷酸序列包含选自SEQ ID NO：14到SEQ ID NO：26的序列的1-19、1-20、1-21、2-20、2-21或3-21位核苷酸。
28.一段多核苷酸序列，该多核苷酸序列包含选自SEQ ID NO：27到SEQ ID NO：44的序列中的至少19个连续碱基对多核苷酸序列。
29.一种抑制丙型肝炎病毒的多核苷酸序列在哺乳动物细胞内表达的组合物，该组合物含有来自SEQ ID NO：27序列中的至少19个连续碱基对核苷酸序列的双链RNA效应分子；其中U取代T。
30.一种表达构建体，该表达构建体包含权利要求14、16、18、21、22、23或29的组合物。
31.一种哺乳动物细胞，该细胞包含权利要求30的表达构建体。
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