CN101031579A - 胰岛小rna及抑制其的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及独立的DNA或RNA胰岛小RNA分子。本发明还涉及修饰的单链胰岛小RNA分子或独立的单链抗胰岛小RNA分子。本发明还提供了用于抑制细胞中小RNP活性的方法。

Description

胰岛小RNA及抑制其的方法
背景技术
通常小RNA(microRNA)是长度一般为约19到25个核苷酸的小RNA分子。这些小RNA为从发夹前体切下的非编码RNA。已经在广大范围的多细胞生命体的基因组中鉴定出若干个小RNA。
许多小RNA保存在关系遥远的生物体之间的序列中，并且表现出组织特异性或发育阶段特异性表达。生物体之间的序列的保守性(保留，conservation)表明小RNA可能在生物过程中扮演重要的角色。
已报道小RNA分子在部分杂交到靶基因的mRNA的非编码3’区后通过阻断翻译在多种生物体中以序列特异性方式控制基因表达。被小RNA靶向的基因大部分仍需表征。
然而，有越来越多的证据表明小RNA涉及多种疾病和病症。例如，已表明果蝇小RNA靶向涉及细胞凋亡的基因。此外，B细胞慢性淋巴细胞性白血病与两种小RNA的缺失(去除)有关。
胰岛细胞(也称作郎格罕氏岛)是形成和分泌激素的特化细胞群。据报道在胰岛内存在5种类型的细胞：α、β、δ、PP以及D1细胞。
已报道这些细胞中的一些涉及葡萄糖的调节。例如，α细胞分泌胰高血糖素，其是涉及提高血中葡萄糖水平的激素。此外，β细胞分泌胰岛素，一种帮助身体利用葡萄糖供能的激素。
葡萄糖利用的调节中的干预，尤其是分泌胰岛素的β细胞的干预，可以导致疾病和病症，如糖尿病。因此，阐明涉及调节在葡萄糖体内稳态的调节中扮演重要角色的基因的机制非常重要。例如，在现有技术中还不知道是否小RNA(如果存在)调节葡萄糖利用。
因此，需要能够帮助阐明调节基因(如胰岛细胞的小RNA)的功能的材料和方法。
此外，由于小RNA具有导致RNA降解或抑制mRNA(其编码重要蛋白)翻译的能力，因此还需要可抑制胰腺小RNA导致的剪切或靶mRNA的翻译抑制的新分子。
发明内容
在一种实施方式中，本发明涉及独立的DNA或RNA分子。这些分子包括具有SEQ ID NO：1-20中所示的胰岛小RNA中的序列的至少10个相邻碱基，除了达到30％的这些碱基可以是摆动碱基，达到10％的这些相邻碱基可以是非互补的。
在另一实施方式中，本发明涉及修饰的单链胰岛小RNA分子。这些分子包括分子主链上的最少10个部分(moiety)和最多50个部分，该分子主链包括主链单元，每个部分包括连接到主链单元的碱基，其中至少10个相邻碱基具有与SEQ ID NO：1-20中所示的胰岛小RNA分子中的碱基的相邻序列相同的序列，除了达到30％的这些碱基对可以是摆动碱基对，达到10％的这些相邻碱基可以是添加、缺失、错配、或其组合；不超过50％的这些相邻部分包含脱氧核糖核苷酸主链单元，并且至少一部分不是未修饰的脱氧核糖核苷酸部分或未修饰的核糖核苷酸部分。
在另一实施方式中，本发明涉及独立的单链抗-胰岛小RNA分子。该分子包括分子主链上的最少10个部分和最多个50部分，该分子主链包括主链单元，每个部分包括连接到主链单元的碱基，每个碱基与互补碱基形成沃森-克里克碱基对，其中至少10个相邻碱基具有与SEQ ID NO：1-20中所示的胰岛小RNA分子的任何一个中的碱基的相邻序列互补的序列，除了达到30％的这些碱基对可以是摆动碱基对，达到10％的这些相邻碱基可以是添加、缺失、错配、或其组合；不超过50％的这些相邻部分包含脱氧核糖核苷酸主链单元；并且该分子能够抑制小RNP活性。
在另一实施方式中，本发明涉及用于抑制细胞中小RNP活性的方法。小RNP包括胰岛小RNA分子。该方法包括将单链抗胰岛小RNA分子引入细胞中，其中抗胰岛小RNA互补于胰岛小RNA分子。
在另一实施方式中，本发明涉及用于治疗需要的哺乳动物中的糖尿病的方法。该方法包括将有效量的抗胰岛小RNA分子引入哺乳动物中，其中该抗胰岛小RNA分子含有具有SEQ ID NO：41或51中所示的序列的至少十个相邻碱基。
在另一实施方式中，本发明涉及包括根据本发明的独立的DNA或RNA分子的独立的小RNP。
在又一实施方式中，本发明涉及包括根据本发明的独立的单链胰岛小RNA分子的独立的小RNP。
附图说明
图1：示出了在说明书中所述的经修饰的核苷酸单元。B代表以下核酸碱基中的任何一种：腺苷、胞啶、鸟苷、胸腺嘧啶、或尿啶。
图2：预测的小鼠miR-375的前体结构和组织表达。(A)利用Mfold 3.1版本进行的RNA二级结构预测。miRNA序列被加了下划线。在鼠和人序列之间有完全同源性。(B)miR-375和miR-376的组织表达。全部RNA(30μg)分离自小鼠组织用于RNA印迹(Northern blot)并用于探测所述miRNA。(C)分离自提纯的胰岛、MIN6细胞和总胰腺的总RNA(10μg)的RNA印迹。在小鼠的胰腺岛内检测到较高的表达水平。tRNA探针被用作加载对照。
图3：miR-375对分泌的抑制作用。(A)除了用miRNA-375、葡萄糖激酶或荧光素酶(分别为si-375、siRNA-Gck和siRNA-luc)的同源序列的合成siRNA，MIN6细胞用100ng编码CMV-hGH和β-gal的质粒DNA瞬间共转染，或(B)用与miR-375(2′-O-甲基-375)互补的2′-O-甲基-寡核糖核苷酸或对照2′-O-寡核糖核苷酸(2′-O-甲基-GFP)共转染。48h后，细胞在葡萄糖的低浓度(2.8mM)和刺激浓度(25mM)下孵育。在这些条件下释放的hGH的量通过ELISA进行测量并对β-gal活性进行标准化(*：P≤0.05，**：P≤0.01)。
图4，miR-375靶基因的鉴定。(A)用Ad-miR-375感染MIN6细胞48h。根据细胞溶解，样品通过SDS-PAGE分离，并用α-Mtpn、α-Vti1a、或α-TATA盒结合蛋白(Tbp)免疫印迹(加载对照)。(B)使用N2A细胞重复实验。(C)MIN6细胞用相对于Mtpn(siRNA-Mtpn)或Vti1a设计的siRNA瞬间转染48h并溶解。在通过SDS-PAGE分析之后，将样品对于Mtpn或Vti1a免疫印迹。(D)MIN6细胞用si-375、si-Mtpn、或si-Vti1a瞬间转染。48h后，细胞在葡萄糖的低浓度(2.8mM)和刺激浓度(25mM)下孵育。在这些条件下释放的hGH的量通过ELISA进行测量并对β-gal活性进行标准化(*：P≤0.05，**：P≤0.01)。
图5：Mtpn的3’UTR中的miR-375靶位点负责抑制由miR-375的基因表达。(A)插入在水母(Renilla)荧光酶的3’UTR内的肌营养素的3’UTR中的靶位点序列。除了破坏miR-375的5’末端处的碱基配对的5个点突变(粗体)，突变构造(Mtpn-MUT)与WT构造(Mtpn-WT)相同。(B)除了与miR-375(2′-O-甲基-375)互补的2′-O-甲基-寡核糖核苷酸或对照2′-O-寡核糖核苷酸(2′-O-甲基-GFP)，MIN6细胞用任一报道物构造进行瞬间转染。
具体实施方式
胰岛小RNA分子
本发明已经披露了新的胰岛小RNA分子。这些分子具有SEQID NO：1-20。因此，在一种实施方式中，本发明涉及独立的单链胰岛小RNA分子。
小RNA分子在本领域是已知的(参见，例如，Bartel，Cell，2004，116，281-297对小RNA分子的评论)。在Bartel的文章中所述的小RNA分子的定义和特征以引用方式并入本文中。这样的分子衍生自染色体组的基因座并产生自特异性小RNA基因。
成熟的小RNA分子由形成局部发夹(发卡)结构的前体转录产物加工而来。该发夹结构通常由称为Dicer的酶剪切，由此产生一个小RNA双链体。参见Bartel的上述参考文献。
通常，小RNA双链体的双链之一被包装在小RNA核糖核蛋白复合体(小RNP)中。例如，人类的小RNP还包括蛋白eIF2C2、解旋酶Gemin3、和Gemin4。
在一种实施方式中，本发明涉及包括具有SEQ ID NO：1-20所示的序列的至少10个相邻碱基的独立的DNA或RNA分子，以及其等效物。优选地，该独立的DNA或RNA分子包括具有SEQ IDNO：1-20中所示的胰岛小RNA中的碱基序列的至少13个、更优选至少15个、甚至更优选至少20个相邻碱基。
表A胰岛小RNA和发卡前体序列。具有“hsa”前缀的小RNA的名称表明为人类序列，具有前缀“mmu”的小RNA的名称表明为小鼠序列。发卡前体中胰岛小RNA序列部分用粗体表示。
  名称   小RNA(5′到3′)   发卡前体(5′到3′)
  hsa-miR-375(Isl-1)hsa-miR-376(Isl-2)hsa-miR-377hsa-miR-378hsa-miR-379hsa-miR-380hsa-miR-381hsa-miR-382hsa-miR-383hsa-miR-384   UUUGUUCGUUCGGCUCGCGUGA(SEQ ID NO：1)AUCAUAGAGGAAAAUCCACGU(SEQ ID NO：2)AUCACACAAAGGCAACUUUUGU(SEQ ID NO：3)CUCCUGACUCCAGGUCCUGUGU(SEQ ID NO：4)UGGUAGACUAUGGAACGUA(SEQ ID NO：5)UGGUUGACCAUAGAACAUG(SEQ ID NO：6)UAUACAAGGGCAAGCUCUCUGU(SEQ ID NO：7)GAAGUUGUUCGUGGUGGAUUCG(SEQ ID NO：8)AGAUCAGAAGGUGACUGUGGCU(SEQ ID NO：9)AUUCCUAGAAAUUGUUCAUA(SEQ ID NO：10)   CCCCGCGACGAGCCCCUCGCACAAACCGGACCUGAGCGUUUUGUUCGUUCGGCUCGCGUGAGGC(SEQ ID NO：21)UAAAAGGUAGAUUCUCCUUCUAUGAGUACAUUAUUUAUGAUUAAUCAUAGAGGAAAAUCCACGUUUUC(SEQ ID NO：22)UUGAGCAGAGGUUGCCCUUGGUGAAUUCGCUUUAUUUAUGUUGAAUCACACAAAGGCAACUUUUGUUUG(SEQ ID NO：23)GGGGCUCCUGACUCCAGGUCCUGUGUGUUACCUCGAAAUAGCACUGGACUUGGAGUCAGAAGGCCU(SEQ ID NO：24)AGAGAUGGUAGACUAUGGAACGUAGGCGUUAUGAUUUCUGACCUAUGUAACAUGGUCCACUAACUCU(SEQ ID NO：25)AAGAUGGUUGACCAUAGAACAUGCGCUAUCUCUGUGUCGUAUGUAAUAUGGUCCACAUCUU(SEQ ID NO：26)UACUUAAAGCGAGGUUGCCCUUUGUAUAUUCGGUUUAUUGACAUGGAAUAUACAAGGGCAAGCUCUCUGUGAGUA(SEQ IDNO：27)UACUUGAAGAGAAGUUGUUCGUGGUGGAUUCGCUUUACUUAUGACGAAUCAUUCACGGACAACACUUUUUUCAGUA(SEQ IDNO：28)CUCCUCAGAUCAGAAGGUGAUUGUGGCUUUGGGUGGAUAUUAAUCAGCCACAGCACUGCCUGGUCAGAAAGAG(SEQ ID NO：29)UGUUAAAUCAGGAAUUUUAAACAAUUCCUAGACAAUAUGUAUAAUGUUCAUAAGUCAUUCCUAGAAAUUGUUCAUAAUGCCUGUAACA(SEQ ID NO：30)
  名称   成熟miRNA(5′到3′)   发卡前体(5′到3′)
  mmu-miR-375(Isl-1)mmu-miR-376(Isl-2)mmu-miR-377mmu-miR-378mmu-miR-379mmu-miR-380mmu-miR-381mmu-miR-382mmu-miR-383mmu-miR-384   UUUGUUCGUUCGGCUCGCGUGA(SEQ ID NO：11)AUCGUAGAGGAAAAUCCACGU(SEQ ID NO：12)AUCACACAAAGGCAACUUUUGU(SEQ ID NO：13)CUCCUGACUCCAGGUCCUGUGU(SEQ ID NO：14)UGGUAGACUAUGGAACGUA(SEQ ID NO：15)UGGUUGACCAUAGAACAUG(SEQ ID NO：16)UAUACAAGGGCAAGCUCUCUGU(SEQ ID NO：17)GAAGUUGUUCGUGGUGGAUUCG(SEQ ID NO：18)AGAUCAGAAGGUGACUGUGGCU(SEQ ID NO：19)AUUCCUAGAAAUUGUUCACA(SEQ ID NO：20)   CCCCGCGACGAGCCCCUCGCACAAACCGGACCUGAGCGUUUUGUUCGUUCGGCUCGCGUGAGGC(SEQ ID NO：31)UAAAAGGUAGAUUCUCCUUCUAUGAGUACAAUAUUAAUGACUAAUCGUAGAGGAAAAUCCACGUUUUC  (SEQ ID NO：32)UGAGCAGAGGUUGCCCUUGGUGAAUUCGCUUUAUUGAUGUUGAAUCACACAAAGGCAACUUUUGUUUG(SEQ ID NO：33)GGGGCUCCUGACUCCAGGUCCUGUGUGUUACCUCGAAAUAGCACUGGACUUGGAGUCAGAAGGCCU(SEQ ID NO：34)AGAGAUGGUAGACUAUGGAACGUAGGCGUUAUGUUUUUGACCUAUGUAACAUGGUCCACUAACUCU(SEQ ID NO：35)AAGAUGGUUGACCAUAGAACAUGCGCUACUUCUGUGUCGUAUGUAGUAUGGUCCACAUCUU(SEQ ID NO：36)UACUUAAAGCGAGGUUGCCCUUUGUAUAUUCGGUUUAUUGACAUGGAAUAUACAAGGGCAAGCUCUCUGUGAGUA(SEQ ID NO：37)UACUUGAAGAGAAGUUGUUCGUGGUGGAUUCGCUUUACUUGUGACGAAUCAUUCACGGACAACACUUUUUUCAGUA(SEQ ID NO：38)CUCAGAUCAGAAGGUGACUGUGGCUUUGGGUGGAUAUUAAUCAGCCACAGCACUGCCUGGUCAGAAAGAG(SEQ ID NO：39)UGUUAAAUCAGGAAUUGUAAACAAUUCCUAGGCAAUGUGUAUAAUGUUGGUAAGUCAUUCCUAGAAAUUGUUCACAAUGCCUGUAACA(SEQID NO：40)
在本说明书中，碱基指的是通常存在于天然存在的DNA或RNA中的核苷酸碱基中的任何一个。该碱基可以是嘌呤或嘧啶。嘌呤碱基的实例包括腺嘌呤(A)和鸟嘌呤(G)。嘧啶碱基的实例包括胸腺嘧啶(T)、胞嘧啶(C)和尿嘧啶(U)。腺嘌呤可以用2，6-二氨基嘌呤置换。
本说明书中披露的未修饰的核酸分子的序列显示具有尿嘧啶碱基。尿嘧啶碱基存在于未修饰的RNA分子中。本发明还包括未修饰的DNA分子。未修饰的DNA分子的碱基序列与未修饰的RNA分子的相同，除了未修饰的DNA分子中，尿嘧啶碱基被胸腺嘧啶碱基置换。
该序列中的每个碱基可以与互补碱基形成沃森-克里克(Watson-Crick)碱基对。本文中所用的沃森-克里克碱基对指的是例如，下列碱基：腺嘌呤和胸腺嘧啶(A-T)；腺嘌呤和尿嘧啶(A-U)；以及胞嘧啶和鸟嘌呤(C-G)之间的氢键相互作用。
等效物指的是这样的分子，其中达到30％的该至少十个相邻碱基是摆动碱基，并且达到10％，优选达到5％的该相邻碱基是非互补的。
在本文中使用时，摆动碱基指的是在该分子的序列中：1)用尿嘧啶置换胞嘧啶，或者2)用鸟嘌呤置换腺嘌呤。这些摆动碱基置换通常称为UG或GU摆动。表B示出了该分子中相邻碱基的数目和摆动碱基的最大数目。
表B相邻碱基的数目和摆动碱基的最大数目
  相邻碱基的数目   10   11   12   13   14   15   16   17   18
  摆动碱基对的最大数目   3   3   3   3   4   4   4   5   5
  相邻碱基的数目   19   20   21   22   23
  摆动碱基对的最大数目   5   6   6   6   6
本文所用的术语“非互补的”指的是添加、缺失、错配或其组合。添加指的是在上述任何碱基在相邻序列中的插入。缺失指的是在相邻序列中去除存在的任何部分。错配指的是相邻序列中的碱基之一被不同的碱基置换。
添加、缺失、或错配可以发生在相邻序列中的任何地方，例如，在该分子的相邻序列的任何一端或相邻序列之内。通常，如果相邻序列相对较短，如，长度为约10到约15个碱基，那么添加、缺失或错配发生在相邻序列的末端。如果相邻序列相对较长，例如，最少16个相邻序列，那么添加、缺失或错配可以发生在相邻序列中的任何地方。
例如，当相邻碱基的数目为10到19时，相邻碱基中没有或其一个可以为添加、缺失或错配；当相邻碱基的数目为20到23时，最多有一个或两个添加、缺失或错配是允许的。
除了胰岛小RNA的至少10个相邻核苷酸，独立的DNA或RNA分子还可以具有一个或多个另外的核苷酸。对于另外的核苷酸的数目没有上限。通常，不超过约500个核苷酸，优选不超过约300个核苷酸被加入到胰岛小RNA的至少10个相邻碱基中。
可以加入任何核苷酸。另外的核苷酸可以包括上述任何碱基。因此，例如，另外的核苷酸可以是A、G、C、T、或U中的任何一个或多个。
在一种实施方式中，胰岛小RNA是发夹前体序列的部分或其片段。例如，合适的发夹前体序列示于SEQ ID NO：21-40中。该片段可以是在5’端和/或在3’端包含至少10个、优选至少15个、更优选至少20个核苷酸的发夹前体序列的任何片段。优选核苷酸序列在其中胰岛小RNA存在的发夹前体中。
胰岛小RNA或发夹前体可以插入到载体(如重组载体)中。通常，为了构建包含胰岛小RNA的重组载体，包含胰岛小RNA序列的发夹前体序列被并入载体中。参见，例如，Chen et al.Science2004，303：83-86。
该重组载体可以是任何重组载体，例如质粒、粘粒、或噬菌体。重组载体通常具有复制起始。该载体可以是，例如，病毒载体，如腺病毒载体或腺伴随病毒(AAV)载体。参见，例如：Ledley 1996，Pharmaceutical Research 13：1595-1614和Verma et al.Nature 1997，387：239-242。
该载体可以进一步包括可选择的标记物。合适的可选标记物包括药物抗性标记物，如四环素或庆大霉素，或可检测的基因标记物，如β-半乳糖苷酶或萤光素酶。
在优选的实施方式中，独立的DNA或RNA分子基本上包括SEQ ID NO：1-40中所示的胰岛小RNA序列或发夹前体序列的任何一个。
在本说明书中，“独立的”(isolated)指的是该分子基本上不含有其它核酸。基本上不含有其它核酸指的是该分子至少约90％、优选至少约95％、以及更优选至少约98％不含有其它核酸。
优选地，该分子基本上是纯的，这意味着该分子不仅不含有其它核酸，而且不含有在该分子的合成和分离中所用的其它材料。合成中所用的材料包括，例如酶。分离中所用的材料包括，例如，凝胶，如SDS-PAGE。该分子至少约90％不含这样的材料，优选至少约95％不含这样的材料，更优选至少约98％不含有这样的材料。
胰岛细胞可以是本领域已知的任何胰岛细胞。胰岛细胞的实例包括α细胞、β细胞、δ细胞、PP细胞、以及D1细胞。优选地，该细胞为β细胞。
小RNA或发夹前体中的碱基序列是高度保守的。由于高度保守，该序列可以来自任何哺乳动物的胰岛细胞。哺乳动物的实例包括宠物动物(如狗和猫)、家畜(如牛、马和羊)、试验动物(如大鼠、小鼠和兔子)、以及灵长类(如猴子和人类)。优选地，该哺乳动物为人类或小鼠。
修饰的单链胰岛小RNA分子
在另一实施方式中，本发明涉及修饰的单链胰岛小RNA分子。该修饰的单链小RNA分子可以为如上所述的任何胰腺小RNA分子、发夹前体分子、或其等效物，除了该修饰的分子包括至少一个修饰的部分(即，至少一个部分不是未修饰的脱氧核糖核苷酸部分或未修饰的核糖核苷酸部分)。在本实施方式中，修饰的胰岛小RNA分子包括最少10个部分的数目，优选最少13，更优选最少15，甚至更优选最少18，最优选最少21个部分。
该修饰的胰岛小RNA分子包括最多50个部分的数目，优选最多40，更优选最多30，甚至更优选最多25，最优选最多23个部分。部分的最少和最多数目的合适范围可以通过组合上述最少的任何一个和上述最多的任何一个来获得。
每个修饰的部分包括连接至主链单元的碱基。该主链单元可以为任何能够稳定的连接到碱基并形成寡聚链的分子单元。在本说明书中，修饰的部分的主链单元不包括通常在天然存在的DNA或RNA分子中存在的主链单元。
这样的修饰的胰岛小RNA分子具有增加的核酸酶抗性。因此，该分子的核酸酶抗性比仅包含未修饰的核糖核苷酸部分、未修饰的脱氧核糖核苷酸部分或两者的序列高。这样的修饰的部分在本领域是熟知的，并且在例如，Kurreck，Eur.J.Biochem.270，1628-1644(2003)中评论。
被对抗的核酸酶可以是核酸外切酶、核酸内切酶或两者。核酸外切酶可以是3’-5’核酸外切酶或5’-3’核酸外切酶。3’-5’人类核酸外切酶的实例包括PNPT1，Werner综合征解旋酶、RRP40、RRP41、RRP42、RRP45、以及RRP46。5’-3’核酸外切酶的实例包括XRN2、和FEN1。核酸内切酶的实例包括Dicer、Drosha、核糖核酸酶4、核糖核酸酶P、核糖核酸酶H1、DHP1、ERCC-1、以及OGG1。既具有核酸外切酶功能又具有核酸内切酶功能的核酸酶的实例包括APE1和EXO1。
修饰的部分可以存在于胰岛小RNA分子中的任何位置。例如，为了防止胰岛小RNA分子受到3’-5’核酸外切酶的作用，该分子可以在该分子的3’端具有至少一个修饰的部分并优选在3’端具有至少两个修饰的部分。如果希望防止该分子受到5’-3’核酸外切酶的作用，该胰岛小RNA分子在该分子的5’端具有至少一个修饰的部分并优选具有至少两个修饰的部分。该胰岛小RNA分子还可以在该分子的5’端和3’端之间具有至少一个，优选至少两个修饰的部分，以提高该分子对核酸内切酶的抗性。优选地，至少约10％、更优选至少约25％、甚至更优选至少约50％、进一步更优选至少约75％、最优选至少约95％的该部分是修饰的。在一种实施方式中，所有的这些部分是修饰的(如核酸酶抵抗的)。
在修饰的胰岛小RNA分子的一个实例中，该分子包括至少一个修饰的脱氧核糖核苷酸部分。合适的修饰的脱氧核糖核苷酸部分在本领域是已知的。这样的修饰的脱氧核糖核苷酸部分包括，例如，作为主链单元的硫代磷酸酯脱氧核糖(phosphorothioatedeoxyribose)组。参见图1中的结构1。包括硫代磷酸酯脱氧核糖核苷酸部分的修饰的胰岛小RNA分子通常称作硫代磷酸酯(PS)DNA。参见，例如，Eckstein，Antisense Nuclei Acids DrugDev.10，117-121(2000)。
修饰的脱氧核糖核苷酸部分的其它合适的实例是N’3-N’5氨基磷酸酯(phosphoroamidate)脱氧核糖核苷酸部分，其包括作为主链单元的N’3-N’5氨基磷酸酯脱氧核糖组。参见图1中的结构2。包括氨基磷酸酯脱氧核糖核苷酸部分的寡核苷酸分子通常称作氨基磷酸酯(NP)DNA。参见，例如，Gryaznov et al.，J.Am.Chem.Soc.116，3143-3144(1994)。
在修饰的胰岛小RNA分子的另一实例中，该分子包括至少一个修饰的核糖核苷酸部分。修饰的核糖核苷酸部分的合适实例为在2’位被取代的核糖核苷酸部分。在2’位的取代基可以为例如，C1～C4烷基基团。该C1～C4烷基基团可以是饱和或不饱和的、直链或支链的。C1～C4烷基基团的部分实例包括乙基、异丙基、和烯丙基。优选的C1～C4烷基基团为甲基。参见图1中的结构3。包含在2’位用C1～C4烷基基团取代的核糖核苷酸部分的寡核糖核苷酸分子通常称作2’-O-(C1-C4烷基)RNA，例如，2’-O-甲基RNA(OMe RNA)。
在修饰的核糖核苷酸部分的2’位的取代基的另一合适实例是C1～C4烷氧基-C1～C4烷基基团。该C1～C4烷氧基和C1～C4烷基基团可以包括上述烷基基团中的任何一个。优选的C1～C4烷氧基-C1～C4烷基基团是甲氧基乙基。参见图1中的结构4。包含多于一个核糖核苷酸部分(其在2’位被C1～C4烷氧基-C1～C4烷基基团取代)的寡核苷酸分子称作2’-O-(C1～C4烷氧基-C1～C4烷基)RNA，例如，2’-O-甲氧基乙基RNA(MOE RNA)。
修饰的核糖核苷酸部分的另一合适实例是在2’-氧原子和4’-碳原子之间具有亚甲桥的核糖核苷酸。参见图1中的结构5。包含在2’-氧原子和4’-碳原子之间具有亚甲桥的核糖核苷酸部分的寡核糖核苷酸分子通常称作锁核酸(locked nucleic acid，LNA)。参见，例如，Kurreck et al.，Nucleic Acid Res.30.1911-1918(2002)；Elayadi et al.，Curr.Opinion Invest.Drugs 2，558-561(2001)；Φrum et al.，Curr.Opinion Mol.Ther.3，239-243(2001)；Koshkin et al.，Tetrahedron 54，3607-3630(1998)；Obika et al.，Tetrahedron Lett.39，5401-5404(1998).锁核酸可从Proligo(Paris，France and Boulder，Colorado，USA)商业上获得。
修饰核糖核苷酸部分的另一合适实例是在2’位被氟基团取代的核糖核苷酸。这样的2’-氟代核糖核苷酸部分在本领域是已知的。包含2’-氟代核糖核苷酸部分的分子在本文中通常称作2’-氟代核糖核酸(FANA)。参见图1中的结构7。Damha et al.，J.Am.Chem.Soc.120，12976-12977(1998)。
在修饰的胰岛小RNA分子的另一实例中，分子包括至少一个包含连接到作为主链单元的氨基酸残基上的碱基的修饰部分。具有至少一个连接到氨基酸残基上的碱基的修饰部分在本文中称作肽核酸(PNA)部分。这样的部分是耐核酸酶的，并且在本领域是已知的。具有PNA部分的分子通常称作肽核酸。参见图1中的结构6。Nielson，Methods Enzymol.313，156-164(1999)；Elayadi，et al，id.；Braasch et al.，Biochemistry 41，4503-4509(2002)，Nielsen etal，.Science 254，1497-1500(1991)。
氨基酸可以是任何氨基酸，包括天然或非天然的氨基酸。天然存在的氨基酸包括，例如，通常在蛋白质中发现的二十种最常见的氨基酸，即，丙氨酸(Ala)、精氨酸(Arg)、天冬酰胺(Asn)、天冬氨酸(Asp)、半胱氨酸(Cys)、谷氨酰胺(Gln)、谷氨酸(Glu)、甘氨酸(Gly)、组氨酸(His)、异亮氨酸(Ileu)、亮氨酸(Leu)、赖氨酸(Lys)、蛋氨酸(Met)、苯丙氨酸(Phe)、脯氨酸(Pro)、丝氨酸(Ser)、苏氨酸(Thr)、色氨酸(Trp)、酪氨酸(Tyr)、以及缬氨酸。
非天然氨基酸可以包含例如烷基、芳基、或烷芳基基团。烷基氨基酸的部分实例包括α-氨基丁酸、β-氨基丁酸、γ-氨基丁酸、δ-氨基戊酸、和ε-氨基己酸。芳基氨基酸的部分实例包括邻-、间-、和对-氨基苯甲酸。烷芳基氨基酸的部分实例包括邻-、间-、和对-氨基苯乙酸、以及γ-苯基-β-氨基丁酸。
非天然存在的氨基酸还包括天然存在的氨基酸的衍生物。天然存在的氨基酸的衍生物可以包括，例如，将一个或多个化学基团添加到天然存在的氨基酸上。
例如，一个或多个化学基团可以被添加到苯丙氨酸或酪氨酸残基的芳香环的2’、3’、4’、5’、或6’位中的一个或多个位置上、或添加到色氨酸残基的苯环的4’、5’、6’、或7’位中的一个或多个位置上。该基团可以是能够被添加到芳香环上的任何化学基团。这样的基团的一些实例包括：羟基，C1-C4烷氧基，氨基，甲氨基，二甲氨基，硝基，卤代(即，氟代、氯代、溴代、或碘代)，或支链或直链的C1-C4烷基如甲基、乙基、正丙基、异丙基、丁基、异丁基、或叔丁基。
作为天然存在的氨基酸的衍生物的非天然存在的氨基酸的其它实例包括：正缬氨酸(Nva)、正亮氨酸(NIe)、以及羟基脯氨酸(Hyp)。
这些氨基酸可以相互是相同或不同的。碱基通过分子键被连接到氨基酸单元上。键的实例有：亚甲基羰基、亚乙基羰基和乙基键(Nielsen et al.，Peptide Nucleic Acids-Protocols and Applications，Horizon Scientific Press，pages  1-19；Nielsen et al.，Science 254：1497-1500.)。PNA部分的氨基酸残基的一个实例是N-(2-氨基乙基)-甘氨酸。
PNA部分的另外的实例包括环己基PNA、逆反式PNA、膦基PNA、丙酰PNA以及氨基脯氨酸PNA部分。为了描述这些PNA部分，参见Nielsen et al.，Peptide Nucleic Acids-Protocols andApplications，Horizon Scientific Press，pages 1-19的图5。Nielsen et al.的第7页的图5以引用方式并入本文中。
PNA可以通过本领域已知的方法化学合成，例如，通过修饰的Fmoc或tBoc肽合成方案合成。PNA具有许多理想的性质，包括高解链温度(Tm)、与核酸的高度碱基配对特异性以及不带电荷的分子主链。另外，PNA在靶RNA上不提供RNA酶H敏感性，并且通常具有良好的代谢稳定性。
肽核酸还可以从Applied Biosystems(Foster City，California，USA)商购获得。
在修饰的胰岛小RNA分子的另一实例中，分子包括至少一个吗啉代氨基磷酸酯核苷酸部分。包括吗啉代氨基磷酸酯核苷酸部分的分子通常称作吗啉代(MF)核酸。参见图1中的结构8。Heasman，Dev.Biol.243，209-214(2002)。吗啉代寡核苷酸可以从Gene Tools LLC(Corvallis，Oregon，USA)商购获得。
在修饰的胰岛小RNA分子的其它实例中，分子包括至少一个环己烯核苷酸部分。包含环己烯核苷酸部分的分子通常称作环己烯核酸(CeNA)。参见图1中的结构10。Wang et al.，J.Am.Chem.Soc.122，8595-8602(2000)，Verbeure et al.，Nucleic Acids Res.29，4941-4947(2001)。
在修饰的胰岛小RNA分子的最后的实例中，该分子包括至少一个三环核苷酸部分。包括三环核苷酸部分的分子通常称作三环核酸(tcDNA)。参见图1中的结构9。Steffens et al.，J.Am.Chem.Soc.119，11548-11549(1997)，Renneberg et al.，J.Am.Chem.Soc.124，5993-6002(2002)。
分子可以是嵌合修饰的胰岛小RNA分子。含有任何上述部分的混合物的嵌合分子也是已知的，并可以通过本领域已知的方法制成。参见，例如上面引用的参考文献，以及Wang et al，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 96，13989-13994(1999)，Liang et al.，Eur.J.Biochem.269，5753-5758(2002)，Lok et al.，Biochemistry 41，3457-3467(2002)，以及Damha et al.，J.Am.Chem.Soc.120，12976-12977(2002)。
本发明的修饰的胰岛小RNA分子包括至少10个、优选至少13个、更优选至少15个、甚至更优选至少20个邻接碱基，该碱基具有任何在SEQ ID NO：1-20中所示的天然存在的胰岛小RNA分子的相邻(邻接)碱基序列的。在优选的实施方式中，修饰的胰岛小RNA分子包括任何在SEQ ID NO：1-20中所示的胰岛小RNA分子的全部序列。
具有任何碱基序列的任何数目的另外部分(最大达到40个部分)可以添加到包含该相邻碱基序列的部分，只要分子中的部分的总数目不超过50。另外的部分可以添加到相邻序列的5’端、3’端、或两端。另外的部分可以包括在5’端以发夹前体(胰岛小RNA衍生自其)存在的碱基序列和/或在3’端以发夹前体存在的碱基序列或其任何片段。该分子中的另外的部分(如果有)，可以是上述的任何修饰或未修饰的部分。
修饰的胰岛小RNA分子包括其等效物。等效物包括如上所述的摆动碱基和非互补碱基。
此外，不超过50％，优选不超过30％的相邻部分包含脱氧核糖核苷酸主链单元。表C和表D示出了对于各个数目的相邻碱基的脱氧核糖核苷酸主链单元的最大数目。
在另一实施方式中，除了上述摆动碱基对和非互补碱基，相应于天然存在的胰岛小RNA序列中的位置11的部分可以添加、缺失或错配。
如上所述，修饰的胰岛小RNA分子优选是独立的，更优选是纯化的。
表C 50％含有脱氧核糖核苷酸主链单元的相邻部分
相邻碱基的数目   10   11   12   13   14   15   16   17   18
  脱氧核糖核苷酸主链单元的最大数目   5   5   6   6   7   7   8   8   9
相邻碱基的数目   19   20   21   22   23
  脱氧核糖核苷酸主链单元的最大数目   9   10   10   11   11
表E 30％含有脱氧核糖核苷酸主链单元的相邻部分
相邻碱基的数目   10   11   12   13   14   15   16   17   18
  脱氧核糖核苷酸主链单元的最大数目   3   3   3   3   4   4   4   5   5
  相邻碱基的数目   19   20   21   22   23
  脱氧核糖核苷酸主链单元的最大数目   5   6   6   6   6
在又一具体实施方式中，帽可以连接到该分子的一端、两端、和/或两端之间，以增大上述本发明的修饰胰岛小RNA分子或未修饰分离的DNA或RNA分子的核酸酶的抗性。增大对例如核酸外切酶和/或核酸内切酶的抗性是理想的。可以利用本领域技术人员已知的用于增大核酸酶抗性的任何帽。
这样的帽的实例包括倒置(反向的)核苷酸帽和化学帽。倒置核苷酸帽可以连接到5’和/或3’端。化学帽可以连接到该分子的一端、两端、和/或两端之间。
倒置核酸帽指的是在5’和/或3’端连接到修饰的胰岛小RNA分子或未修饰的DNA或RNA分子的核酸的3’→5’序列。对倒置帽的核苷酸的最大数目没有限制，只要它不干预胰岛小RNA分子或独立的DNA或RNA分子结合到其靶mRNA。任何核苷酸可以用于倒置核苷酸帽。通常，核苷酸帽的长度少于约40个核苷酸、优选少于约30个核苷酸、更优选少于约20个核苷酸、甚至更优选少于约10个核苷酸。典型地，倒置核苷酸帽长度为1个核苷酸。用于倒置帽的核苷酸通常为胸腺嘧啶，但是可以是任何核苷酸如腺苷、鸟苷、尿啶、或胞啶。
化学帽指的是本领域技术人员已知的用于增大核酸的核酸酶抗性的任何化学基团。这样的化学帽的实例包括羟烷基基团(烷基氢氧化物)或氨基烷基基团(烷基胺)。羟烷基有时称作烷基二醇基团(如乙二醇)。氨基烷基有时称作氨基连接物。
羟基烷基基团或氨基烷基基团中的烷基链可以是直链或支链。存在于烷基链中的碳原子的最小数目是1个，优选至少2个，更优选至少约3个碳原子。
存在于烷基链中的碳原子的最大数目为约18个、优选约16个、更优选约12个。通常烷基包括甲基、乙基、和丙基。烷基可以进一步被一个或多个羟基和/或氨基基团取代。
表E中示出了氨基连接物的一些实例。列于表E中的氨基连接物可以从加拿大圣地亚哥的TriLink Biotechnologies商购获得。
独立的小RNP
在另一方面，本发明提供了独立的小RNP，其包括上述任何独立的DNA或RNA分子或上述的修饰的胰岛小RNA分子。
抗胰岛小RNA分子
在另一方面，本发明提供了抗胰岛小RNA分子。除了抗胰岛小RNA分子的碱基序列与独立的DNA或RNA分子或修饰的胰岛小RNA分子的碱基序列是互补的之外，该抗胰岛小RNA分子可以是任何上述的独立DNA或RNA分子或上述的修饰的胰岛小RNA分子。
抗胰岛小RNA分子的序列的实例在表F中示出。
表E来自TriLink Biotechnologies的氨基连接物
  2′-脱氧胞苷-5-C6氨基连接物(3′末端)
  2′-脱氧胞苷-5-C6氨基连接物(5′或内部)
  3′C3氨基连接物
  3′C6氨基连接物
  3′C7氨基连接物
  5′C12氨基连接物
  5′C3氨基连接物
  5′C6氨基连接物
  C7内部氨基连接物
  胸腺嘧啶-5-C2氨基连接物(5′或内部)
  胸腺嘧啶-5-C6氨基连接物(3′末端)
  胸腺嘧啶-5-C6氨基连接物(内部)
表F抗胰岛小RNA序列
  小RNA   抗小RNA序列(5′→3′)
hsa-miR-375(Isl-1)hsa-miR-376(Isl-2)hsa-miR-377hsa-miR-378hsa-miR-379hsa-miR-380hsa-miR-381hsa-miR-382hsa-miR-383hsa-miR-384mmu-miR-375(Isl-1)mmu-miR-376(Isl-2)mmu-miR-377mmu-miR-378mmu-miR-379mmu-miR-380   UCACGCGAGCCGAACGAACAAA(SEQ ID NO：41)ACGUGGAUUUUCCUCUAUGAU(SEQ ID NO：42)ACAAAAGUUGCCUUUGUGUGAU(SEQ ID NO：43)ACACAGGACCUGGAGUCAGGAG(SEQ ID NO：44)UACGUUCCAUAGUCUACCA(SEQ ID NO：45)CAUGUUCUAUGGUCAACCA(SEQ ID NO：46)ACAGAGAGCUUGCCCUUGUAUA(SEQ ID NO：47)CGAAUCCACCACGAACAACUUC(SEQ ID NO：48)AGCCACAAUCACCUUCUGAUCU(SEQ ID NO：49)UAUGAACAAUUUCUAGGAAU(SEQ ID NO：50)UCACGCGAGCCGAACGAACAAA(SEQ ID NO：51)ACGUGGAUUUUCCUCUACGAU(SEQ ID NO：52)ACAAA GUUGCCUUUGUGUGAU(SEQ ID NO：53)ACACAGGACCUGGAGUCAGGAG(SEQ ID NO：54)UACGUUCCAUAGUCUACCA(SEQ ID NO：55)CAUGUUCUAUGGUCAACCA(SEQ ID NO：56)
  小RNA   抗小RNA序列(5′→3′)
mmu-miR-381mmu-miR-382mmu-miR-383mmu-miR-384   ACAGAGAGCUUGCCCUUGUAUA(SEQ ID NO：57)CGAAUCCACCACGAACAACUUC(SEQ ID NO：58)AGCCACAGUCACCUUCUGAUCU(SEQ ID NO：59)UGUGAACAAUUUCUAGGAAU(SEQ ID NO：60)
抗胰岛小RNA分子可以如上所述被修饰用于修饰的胰岛小RNA分子。在一种实施方式中，抗胰岛小RNA分子中相邻部分与相应的胰岛小RNA分子互补。抗胰岛小RNA分子的互补程度受到与上述对于修饰的胰岛小RNA分子的相同的限制，包括涉及摆动碱基对的限制、以及涉及添加、缺失和错配的限制。
在优选的实施方式中，如果抗胰腺小RNA分子仅包括未修饰的部分，那么抗胰岛小RNA分子包括在至少十个相邻碱基中的至少一个碱基(其与胰岛小RNA不互补)和/或包括化学帽。
在另一优选的实施方式中，如果抗胰岛小RNA分子中的至少十个相邻碱基完全(即，100％)互补于胰岛小RNA分子，那么抗胰岛小RNA分子包含在至少10个相邻碱基中的至少一个修饰的部分和/或包括化学帽。
在又一实施方式中，在抗胰岛小RNA分子中的对应于天然存在的胰岛小RNA的位置11的位置处的部分是非互补的。在抗胰岛小RNA分子中的相应于天然存在的胰岛小RNA的位置11的部分可以通过引入如上所述的添加、缺失、或错配来使得是非互补的。
应用
本发明的胰岛小RNA分子和抗胰岛小RNA分子在体外、离体、和体内具有大量的应用。
例如，本发明的小RNA分子和/或抗小RNA分子可以引入细胞中以研究小RNA的功能。上述的任何胰岛小RNA分子和/或抗胰岛小RNA可以被引入到细胞中以研究它们的功能。
在一种实施方式中，细胞中的小RNA用合适的抗胰岛小RNA分子进行抑制。可替换地，细胞中胰岛小RNA分子的活性可以通过将一个或多个另外的小RNA分子引入细胞来提高。可以通过观察与抑制和/或提高细胞内小RNA的活性相关的变化来推知小RNA的功能。
在本发明的一方面，本发明涉及用于抑制细胞中小RNP活性的方法。用于抑制细胞中小RNP活性的方法包括将单链抗胰岛小RNA分子引入细胞内。该小RNP包括胰腺小RNA分子。任何抗胰岛小RNA分子可以用于抑制细胞中小RNP活性的方法，只要该抗胰岛小RNA分子与存在于小RNP中的胰岛小RNA是互补的(受上述限制)。
本发明的抗胰岛小RNA分子能够通过结合到宿主细胞小RNP中的胰岛小RNA来抑制小RNP的活性。小RNP活性指的是靶序列的切割或翻译抑制。靶序列可以是任何部分或完全与胰岛小RNA中的碱基序列互补的序列。靶序列可以为例如控制葡萄糖利用的基因。
例如，胰岛细胞可以产生小RNA，该小RNA互补于涉及葡萄糖诱导的胰岛素分泌的基因。该小RNA分子(其装配在小RNP中)将抑制葡萄糖诱导的胰岛素分泌的有利效应。因此，抗小RNA分子的引入抑制了小RNP活性，从而通过恢复该基因的功能而减少损害。
可替换地，不引入上述的抗小RNA分子，而是将另外的小RNA分子引入胰岛细胞中。因此，用于葡萄糖诱导的胰岛素分泌的基因将被抑制，从而降低该细胞应答葡萄糖而分泌胰岛素的能力。
小RNA分子和/或抗小RNA分子可以通过本领域技术人员已知的任何方法被引入细胞中。例如，小RNA分子和/或抗小RNA分子可以通过如显微注射直接注入细胞中。可替换地，该分子与细胞接触，优选借助于递送系统。
有用的递送系统包括，例如脂质体和带电荷的脂质。脂质体通常将寡核苷酸分子封装在它们的水性中心。带电荷的脂质一般由于相反电荷形成脂质-寡核苷酸分子复合物。
这些脂质体-寡核苷酸分子复合物或脂质-寡核苷酸分子复合物通常通过胞吞作用而在细胞中内在化。这些脂质体或带电荷的脂质通常包括辅助脂质，其破坏内体膜并释放寡核苷酸分子。
用于将小RNA分子或抗小RNA引入细胞中的其它方法包括利用递送载体，如树形化合物、可生物降解的聚合物、氨基酸的聚合物、糖的聚合物、以及寡核苷酸结合的纳米颗粒。此外，作为储存库(depot reservoir)的普郎尼克酸凝胶(pluoronic gel)可以用于长期递送抗小RNA寡核苷酸分子。上述方法描述在，例如，Hughes etal.，Drug Discovery Today 6，303-315(2001)；Liang et al.Eur.J.Biochem.269 5753-5758(2002)；and Becker et al.，In AntisenseTechnology in the Central Nervous System(Leslie，R.A.，Hunter，A.J.&Robertson，H.A.，eds)，pp.147-157，Oxford University Press.
将小RNA分子或抗小RNA分子靶向特定的细胞可以通过本领域技术人员已知的任何方法进行。例如，小RNA分子或抗小RNA分子可以轭合至由细胞上的受体特异性识别的抗体或配体。例如，该配体可以为GLP-1(胰高血糖素类肽)，其结合在胰腺β细胞上表达的GLP受体。可替换地，可以采用GLP-1的抗体。
在另一实施方式中，本发明提供了用于治疗需要其的哺乳动物中的糖尿病的方法。该方法包括将有效量的抗胰岛小RNA分子引入哺乳动物中，其中抗胰岛小RNA分子具有在SEQ ID NO：41或51中所示序列的至少十个相邻碱基。有效量可以通过内科医师和临床医师熟悉的方法在临床前试验和临床试验期间加以确定。
抗胰岛小RNA分子可以通过本领域已知的任何方法引入哺乳动物中。例如，上述用于将抗胰岛分子引入细胞的方法也可以用于将该分子引入哺乳动物中。
该分子可以通过本领域技术人员已知的任何方法给予哺乳动物。合适的给予方式的一些实例包括口服和系统给予。系统给予可以是经肠的或肠道外的。可以使用液体或固体(如片、明胶胶囊)制剂。
该分子的肠道外给予包括例如静脉内、肌肉内、和皮下注射。例如，本领域已知的，分子可以通过缓释方式给予哺乳动物。缓释给予一种使药物在一定时间内达到一定水平的药物递送方法。
其它给予途径包括口服、局部、支气管内、或鼻内给予。对于口服给药，可以使用液体或固体制剂。适用于口服给药剂型的一些实例包括片剂、明胶胶囊、丸剂、锭剂、酏剂、混悬剂、糖浆剂、和糯米纸囊剂(wafer)。支气管内给药可以包括吸入器喷雾。对于鼻内给药，本发明分子的给予可以通过喷雾器或液体喷雾来实现。
本发明的分子可以处于合适的药物载体中。在本说明书中，药物载体被认为与本领域的实践者理解的载体(媒介物)或赋形剂同义。载体的实例包括淀粉、奶、糖、某些类型的粘土、明胶、硬脂酸或其盐、硬脂酸镁或硬脂酸钙、滑石、植物油脂或油、树胶以及二醇。
药物载体还可以包括下述物质中的一种或多种：稳定剂、表面活性剂、优选非离子型表面活性剂、以及可选的盐和/或缓冲剂。
稳定剂可以为例如氨基酸，如甘氨酸；或寡糖，如蔗糖、四糖、乳糖或葡聚糖。可替换地，稳定剂可以是糖醇，如甘露醇；或其组合。优选地，稳定剂或稳定剂的组合占该分子重量的约0.1％到约10％的重量。
表面活性剂优选非离子型表面活性剂，如聚山梨醇酯。合适的表面活性剂的一些实例包括：吐温20，吐温80；聚乙二醇或聚氧乙烯聚氧丙烯二醇，如为约从0.001％(w/v)到约10％(w/v)的Pluronic F-68。
盐或缓冲剂可以分别为任何盐或缓冲剂，例如分别是氯化钠或磷酸钠/磷酸钾。优选地，缓冲剂将本发明分子的pH维持在约5.5到约7.5的范围内。盐和/或缓冲剂也可以用于将摩尔渗透压浓度维持在适于给于至哺乳动物的水平。优选地，盐或缓冲剂以粗略地约150mM到约300mM的等渗浓度存在。
药物载体还可以另外地包含一种或多种常规的添加剂。这样的添加剂的一些实例包括：增溶剂，如甘油；抗氧化剂，如杀藻胺(季铵化合物的混合物，称为“quart”)、苯甲醇、氯惹酮或氯代丁醇；麻醉剂，如吗啡衍生物；或等渗剂等，如上面所述的。作为针对氧化或其它酸败的进一步的防范，可以将该分子储存在氮气氛下的用非渗透性的塞子密封的小瓶中。
                        实施例
实施例1：材料和方法
小RNA克隆和RNA印迹分析：利用TRIZOL试剂(Invitrogen)从MIN6细胞培养物中分离600μg的全部RNA并根据前述(Lagos-Quintana，Current Biol.)进行小RNA克隆化。设计反义探针以补充克隆的小RNA序列并根据前述(Lagos-Quintana，CurrentBiol.)将该反义探针用于RNA印迹分析。
细胞培养：用含有25mM葡萄糖、15％胎牛血清、以及5.5μM2-巯基乙醇的DMEM培养基培养MIN6细胞。用含有25mM葡萄糖和10％胎牛血清的DMEM培养基培养N2A细胞。
胰岛素分泌研究：在进行测定前，将MIN6细胞在24孔板中培养2天，并且用改性的Krebs-Ringer缓冲液(KRBH)(0.9mMCaCl2、2.68mM KCl、1.46Mm KH2PO4、0.5mM MgCl2·6H2O、135mMNaCl、8mM Na2HPO4×7H2O、20mM Hepes、以及0.2％BSA)冲洗。在用含有5.5mM的葡萄糖的KRBH预先孵育30分钟，漂洗细胞并将细胞在具有或者2.8mM葡萄糖、25mM葡萄糖、30mM KCl、500mM甲苯磺丁脲、或5mM丙酮酸甲酯的KRBH孵育60分钟。利用RIA(Linco Research)测量上清液中胰岛素的浓度。
重组腺病毒的产生：用于过度表达miR-375的重组腺病毒通过利用引物：5’-CCCCAAGGCTGATGCTGAGAAGCCGCCCC-3’和5’-GCCGCCCGGCCCCGGGTCTTC-3’扩增miRNA前体序列的PCR产生。该片段被亚克隆入pcDNA 3(Invitrogen)中，用HindIII和Xbal切除并插入Ad5CMV-K NpA穿梭载体。通过Viraquest Inc.(North Liberty，IA)进行腺病毒的扩增。Ad-GFP(ViraQuest Inc.)不含有转基因并用作对照。
电生理学和Ca2+测量：利用膜片钳技术的标准全细胞构造在感染包含对照-GFP或miRNA208-GFP的腺病毒后，在单分散的B细胞上进行≥24小时的胞吐和向内Ca2+电流的测量。利用基于软件的锁定脉冲实现(lock-in implementation of Pulse)(Heka Electronics.Lamprecht/Pfalz，Germany)，以细胞电容的变化检测胞吐作用。所施加的正弦波的频率为500Hz，峰值振幅为20mV。在利用a-p/4方案数字地除去漏电流和电容瞬态(capacitive transient)后测量Ca2+电流。胞外溶液包含(以mM计)118NaCl、20mM氯化四乙铵(TEA-Cl)、5.6KCl、2.6CaCl2、1.2MgCl2、5HEPES(pH＝7.4)和5葡萄糖。在胞吐被电压钳去极化引发的试验中，胞内溶液(以mM计)由125Cs-谷氨酸盐、10CsCl、10NaCl、1MgCl2、5HEPES(pH＝7.15，用CsOH)、0.05EGTA、3Mg-ATP和0.1环状AMP组成。在一系列试验中，用(以mM计)由125Cs-谷氨酸盐、10KCl、10NaCl、1MgCl2、3Mg-ATP、0.1cAMP、10HEPES、10EGTA和9CaCl2构成的培养基渗析细胞内部引起胞吐。估计该溶液的游离Ca2+浓度为1.5μM。该试验在功能性鉴定的α-和β-细胞上进行。细胞的鉴定如前所述完成。
游离细胞内Ca2+浓度([Ca2+]i)通过别处所述的双重激发波长荧光光谱法进行测量。在存在0.007％w/v普卢兰尼克酸(pluronicacid)(分子探针)下，转染的(胰)岛用3μM fura-2在37℃加载40分钟。染料在350nm和365nm被激发。后一波长用于替换380nm以便避免GFP的激发。在510nm处收集发射光。在这些试验期间，(胰)岛通过固定吸液管而保持在原位并用含有(以mM计)140NaCl、3.6KCl、2NaHCO3、0.5NaH2PO4、0.5MgSO4、2.6CaCl2、5HEPES(pH＝0.74，mM，用NaOH)和5mM葡萄糖的培养基连续倾注。葡萄糖浓度增加到15mM并且根据指示加入浓度为0.1mM磺脲甲苯磺丁脲。当(胰)岛用高细胞外K+(加入30mM KCl)去极化时，NaCl浓度也相应降低以维持等摩尔渗透压浓度。所有的电生理学试验和Ca2+测量都在32-34℃下进行。
利用共焦显微镜并利用fluo-3而不是fura-2来评估(胰)岛的感染和Ca2+指示剂加载。利用Zeiss LSM510显微镜(Carl Zeiss，Jena，Germany)的488nm光线来进行eGFP和fluo-3的激发。通过利用共焦显微镜的META装置分离发射光并利用40×水物镜观察发射光。
荧光素酶活性的测定：利用以下引物：5’TCCATCATTTCATATGCACTGTATC3’和5’TCATATCGTTAAGGACGTCTGGAAA3’对野生型小鼠肌营养素(myotrophin)3’UTR靶位点进行PCR扩增并亚克隆入pCR 2.1 TOPO(Invitrogen)。用SpeI和XbaI去除该片段并随后亚克隆入pRL-TK(Promega)中紧接终止密码子下游的XbaI位点。该构造用于根据方案(Stratagene)，利用引物：5’AAGTTTCGTGTTGCAAG
Figure A20058001915400391
C
Figure A20058001915400392
TGGAATAAACTTGAATTGTGC3’和5’GCACAATTCAAGTTTATTCCA
Figure A20058001915400393
G
Figure A20058001915400394
CTTGCAA CACGAA ACTT3’产生突变小鼠肌营养素质粒；粗体和下划线的表示突变的核苷酸。MIN6细胞在24孔板中培养2天并用0.4μg编码Rr-luc的pRL-TK报道载体和0.1μg编码Pp-luc的pGL3对照载体加以转染(Promega)。转染后30-36小时收集细胞并进行测定。
miR-375靶的鉴定：为了鉴定miR-375靶，我们采用了最近开发的算法[N.Rajewsky and N.D.Socci，Developmental Biology 267，529-535(2004)]。该算法由两个步骤组成：(a)寻找在小RNA和mRNA的3’UTR中的公认靶序列之间的连续互补碱基的富GC串(核)和(b)预测的小RNA：mRNA双链体的自由能的硅评估。我们对Refseq数据集采用该算法。从Refseq注解提取3’UTR。该数据集包括18199人和13371小鼠的长度为至少30个核苷酸的3’UTR。根据[Lewis BP，Shih 1H，Jones-Rhoades MW，Bartel DP，Burge CB，Prediction of mammalian microRNA targets.Cell 787-98(2003)]，我们限制该核的位置在从小RNA的5’端的2个碱基范围内。设定了核划线的捷径以便保留顶端8％的采样数。然后这些采样数借助于MFOLD通过其预测的mRNA：miRNA双链体自由能进行划线(Zuker，NAR 3406-15，2003：详细参见Rajewsky and Socci)。
siRNA和2’-O-甲基寡核糖核苷酸：由Dharmacon Research(Lafayette，Co)合成了合成的小RNA和siRNA。从小鼠肌营养素(NM_008098)和小鼠Vti1A(NM_016862)序列设计siRNASMARTPOOL。如前所述(Meister et al.，RNA)合成所有的2’-O-甲基寡核糖核苷酸。利用Lipofectamine 2000(Invitrogen)以200nM的浓度将所有的试剂转染到MIN6细胞中。
抗体：用于蛋白质印迹法(Western blotting)的抗体从多种不同来源获得：α-肌营养素(由Masato Taoka捐赠)、α-Vtila(BDTransduction Laboratoties)、α-p38 MAPK(Cell Signaling)、α-MCT8(由Andrew Halestrap捐赠)、α-TATA盒结合蛋白(由R.Roeder捐赠)。
RNA印迹分析：利用TRIZOL试剂(Invitrogen)提取全部RNA并加载到15％聚丙烯胺或琼脂糖凝胶上。在电泳后，将RNA转移到Hybond膜(Amersham)并探测。用于小鼠肌营养素的DNA探针利用引物：5’GTGGGCCCTGAAAAACGGAGACTTG3’和5’CCCTTTGACAGAAGCAATTTCACGC3’生成。
实施例2：胰岛小RNA
来自MIN6细胞的小RNA，葡萄糖应答鼠胰腺β-细胞系被克隆。我们获得了全部301个小RNA克隆体，其含有55种不同的小RNA。在55种不同的小RNA中，92％为先前鉴定的小RNA而8％为至今还未鉴定的小RNA。通过Blast序列分析鉴定了在各种基因组数据库中的已知和新的miRNA，并通过交叉物种同源性(cross-species homology)和它们形成典型的发夹前体结构的能力被证实。
全部9种新的小RNA被鉴定并且单一小RNA(miR-375)占＞50％的全部新的克隆体(图2a)。接下来我们通过RNA印记分析考查了新型小RNA的表达。通过RNA印记分析仅小RNA375和376可以从MIN6细胞和胰岛中检测到(图2b)。这两种小RNA的表达限于MIN6细胞和胰岛，并且没有在其它组织(包括肝、肺、肠、脑、肾和睾丸)中发现(图2b、c)。这些数据表明我们已经鉴定了新的胰岛小RNA。
实施例3：miR-375对分泌的抑制作用
为了分析具有高表达水平和对胰腺β细胞的相对组织特异性的小RNA的作用，我们检测了具有与小RNA-375和-376同源序列的合成siRNA在转染后对MIN6细胞中的葡萄糖诱导的胰岛素分泌的作用。除了这些siRNA，我们在CMV启动子控制下共转染了表达人生长激素(hGH)的载体(CMV-hGH)。先前已表明异源表达的hGH靶向胰腺β-细胞系的分泌颗粒并且在胞外分泌(胞吐作用)启动后与胰岛素共同释放。这种方法允许我们选择性地监测来自瞬变(过渡)转染的MIN6细胞(转染效率20-30％)的胞外释放。作为正和负对照，将靶向葡糖激酶基因(Gck)或载酯蛋白M(apoM)(一种在胰腺β细胞中不表达的基因)的siRNA用CMV-hGH共转染入MIN6细胞。
在转染有si-Gck和si-375的细胞中，响应25mM葡萄糖刺激的生长激素分泌显著降低(图3)。针对apoM的合成siRNA或与若干其它小RNA(包括miR-376、miR-124、-129、-130、和-210)同源的siRNA的转染对基本的或葡萄糖刺激的胰岛素分泌没有影响(图3，数据未示出)。
基于反义的方案目前已显示出特异性地抑制在培养细胞中的miRNA的功能。我们用载体CMV-hGH共转染了对miR-375的核酸酶抗性的2’-O-甲基反义寡核糖核苷酸并测量了响应葡萄糖刺激的胰岛素分泌。我们注意到与对照抗-GFP 2’-O-甲基寡核糖核苷酸相比，转染有抗-miR-375的细胞在葡萄糖刺激的胰岛素分泌方面增加(图3b)。综合起来，这些数据表明miR-375是胰岛素分泌的抑制剂。
随后我们在CMV5启动子的控制下，通过克隆含有前体序列的123bp片段生成了表达miR-375的重组腺病毒。HEK细胞感染有表达eGFP的对照腺病毒(Ad-GFP)或表现出miR-375表达剂量依赖性增加的增大浓度的Ad-375颗粒。我们还利用腺病毒感染在MIN6细胞中表达了miR-375。与感染有对照腺病毒的细胞相比，表达miR-375的MIN6细胞在葡萄糖诱导的胰岛素分泌上表现出40％的减少(图4)。胰岛素分泌的缺陷似乎不是由缺陷性胰岛素产生所引起，因为在Ad-375和Ad-eGFP感染的MIN6细胞和胰岛中的胰岛素含量等价。
实施例4：细胞内钙信号化和全细胞钙电流
需要糖解流量(glycolytic flux)和线粒体氧化磷酸化的增加以通过借助于胞质ATP/ADP比率的增加而诱导ATP敏感的K+通道(KATP)的关闭来产生用于葡萄糖所致的胰岛素分泌的第二信号。这导致膜去极化和Ca++通过电压依赖性Ca++通道的流量。[Ca++]I的升高是胰岛素颗粒胞外分泌的必要先决条件。磺脲药物(如格列本脲(glibenclamide))通过直接阻断KATP而刺激胰岛素分泌。KCl导致胰腺β细胞的直接去极化并且导致竞争性胰岛素颗粒的最大脱粒。在甲苯磺丁脲和KCl刺激的Ad-375感染的MIN6细胞中，我们测量了胰岛素分泌。与Ad-eGFP感染的细胞相比，用这些促分泌素对胰腺β细胞的刺激表明Ad-375感染的细胞中的胰岛素分泌受损。此外，与Ad-eGFP感染的MIN6细胞相比，Ad-375表达也损害响应GLP-1(一种有效的通过活化camp的葡萄糖依赖性胰岛素分泌的刺激剂)的胰岛素分泌。这些数据表明miR-375的过度表达导致涉及胰岛素分泌的末端步骤(distal steps)的缺陷，可能影响胰腺β细胞中胞质Ca++的增加或干预胞外分泌。
为了检测是否miR-375损害了对于触发胰岛素胞外分泌所需的第二信号的产生，我们测量了在感染有Ad-375或对照Ad-eGFP的胰岛中的细胞内Ca++浓度[Ca2+]i。通过三种不同的刺激物刺激每个胰岛以提高细胞内Ca2+浓度。在对照和Ad-375表达胰岛中，葡萄糖浓度从5mM增加到15mM产生了Ca2+浓度的振荡。用甲苯磺丁脲刺激时也可以观察到同样的振荡。在对照和Ad-375表达胰岛中，静止[Ca2+]i分别平均为0.13±0.01μM和0.12±0.01μM。在存在15mM葡萄糖的情况下，时间平均[Ca2+]i在对照胰岛中总计达0.42±0.12μM而在表达Ad-375的胰岛中总计达0.39±0.05μM。在存在甲苯磺丁脲的情况下，相应的值在对照胰岛中为0.53±0.11μM而在Ad-375感染的胰岛中为0.55±0.11μM。最后，用高细胞外K+去极化增加对照和Ad-375-感染的胰岛中的[Ca2+]i至同样程度，并且峰[Ca+]i平均值分别为0.85±0.24μM和1.01±0.31μM(数据未示出)。利用非比率计染料fluo-3(参见上述)获得定性的类似观察结果。此外，当在eGFP表达的孤立细胞上进行测定时，除了更深的非感染细胞层的贡献，在葡萄糖响应方面同样没有观察到区别(数据未示出)。胰岛周围富集了非β细胞。然而，在5mM葡萄糖处没有观察到震荡以及升高至15mM时增加了[Ca2+]i的事实表明我们已选择了β细胞富集区，因为δ细胞在低浓度下已经有活性和α细胞在高浓度下应被抑制。
调节从MIN6细胞和孤立胰岛的胰岛素分泌的的表征表明，miR-375表达可能影响胰岛素分泌下游的[Ca2+]i信号化，可能在胞外分泌的水平上。为了说明这种假设，我们采用容量测量以功能性地鉴定β细胞。胞外分泌通过一连串的10个在1Hz施加的从-70mV至0mV的500ms去极化加以诱导(图3A)。在β细胞中，该一连串去极化在对照条件下诱导了膜容量增加837±244fF(n＝9)。在用Ad-375感染的细胞中，相应的增加限于94±27fF(n＝10；P＜0.01)，少了85％。一旦通过用1.5μM的游离Ca2+浓度代替Ca2+/EGTA缓冲液来诱导胞外分泌，也可以获得类似的结果(图2D-E)，并且这些实验中，与对照细胞相比，在Ad-375感染的细胞中容量增加的比率减少63％(P＜0.01；n＝15-17)。
实施例5：靶基因的鉴定
我们采用了将RNA：RNA双链体相互作用的基于热动力学的模式与比较序列分析组合的算法以预测跨越多个基因组保存的小RNA靶。根据64个推定的miR-375靶基因的编译列表，我们基于其在胰岛素分泌/岛差异化方面的可能作用选择6个基因用于确认研究。
这些基因包括卷曲的同族体-4(Fzd4)，通过与t-SNARE酵母同族体1A(Vti-1a)相互作用传输的泡囊、V-1/肌营养素(V-1/Mtpn)、p38有丝分裂原活化的蛋白质激酶(Mapk11)、一元羧酸传输膜8(Slc16A2)和配对的盒蛋白质Pax-6。这些基因的表达通过在用Ad-375或Ad-eGFP感染的MIN6和N2A细胞中进行的免疫印迹技术进行研究。miR-375在N2A细胞内的表达(其不表达内源性miR-375)导致Mtpn和Vti-1a的表达水平降低(图4A、5B)。
相反，Fzd4、Mapk11和Slc16A2的基因表达在Ad-375和Ad-eGFP感染的细胞中相当。利用重组腺病毒Ad-375在MIN6细胞中过度表达miR-375还降低了Mtpn的蛋白水平，但对Vti-1a、Fzd4、Mapk11和Slc16A2的表达没有作用。
为了考查在Mtpn mRNA的3’UTR中的预测miR-375靶位点是否负责由miR-375表达的Mtpn的噪声抑制，我们克隆了包括推定的3’UTR靶位点下游的水母荧光酶ORF(pRL-Mtpn)的289nt3’UTR片段，并将这种报道载体用对照反义2′-O-甲基寡核糖核苷酸或miR-375反义2′-O-甲基寡核糖核苷酸(2′-O-miR-375)共转染入MIN6细胞内。与用对照2′-O-miRNA和pRL-Mtpn共转染的细胞相比，用2′-O-miR-375感染的细胞的荧光素酶活性增加了约2倍。此外，在miR-375靶位点的核内形成点突变，从而降低在同源性miR-375和V-1/肌营养素靶位点之间的互补性，消除2′-O-miR-375对荧光素酶活性的刺激作用(图5)。因此，Mtpn是胰腺β细胞内miR-375的靶并且Mtpn基因表达的抑制是通过在Mtpn基因的3’UTR中的单个miR-375靶位点来调节的。
为了检测在MIN6细胞中Mtpn表达的降低是否可以有助于在Ad-375感染细胞中观察到的葡萄糖诱导胰岛素分泌的缺陷，将MIN6细胞用靶向阿朴脂蛋白M(对照)和Mtpn的siRNA转染，并且将蛋白质表达水平用蛋白质印迹法进行测定。靶向Mtpn和Vti-1a的siRNA降低了这些基因的＞50％的表达(图4c)。这些基因的基因噪声抑制对葡萄糖诱导的胰岛素分泌的作用通过siRNA和质粒pCMV-hGH各自的共转染来研究。响应于25mM葡萄糖刺激的胰岛素分泌在转染2天后进行测量。与用对照siRNA转染的细胞相比，在用靶向Mtpn的siRNA转染的细胞中胰岛素分泌降低了约30％(图4d)。Vti-1a的RNA噪声抑制对葡萄糖诱导的胰岛素分泌没有作用。
                                  序列表
<110>洛克菲勒大学
<120>胰岛小RNA及抑制其的方法
<130>1119-14
<140>10/824,633
<141>2004-04-13
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<170>PatentIn version 3.1
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<212>RNA
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uuuguucguu cggcucgcgu ga                                            22
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aucauagagg aaaauccacg u                                             21
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<213>鼠
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uuuguucguu cggcucgcgu ga                                            22
<210>12
<211>21
<212>RNA
<213>鼠
<400>12
aucguagagg aaaauccacg u                                             21
<210>13
<211>22
<212>RNA
<213>鼠
<400>13
aucacacaaa ggcaacuuuu gu                                            22
<210>14
<211>22
<212>RNA
<213>鼠
<400>14
cuccugacuc cagguccugu gu                                            22
<210>15
<211>19
<212>RNA
<213>鼠
<400>15
ugguagacua uggaacgua                                                19
<210>16
<211>19
<212>RNA
<213>鼠
<400>16
ugguugacca uagaacaug                                                 19
<210>17
<211>22
<212>RNA
<213>鼠
<400>17
uauacaaggg caagcucucu gu                                             22
<210>18
<211>22
<212>RNA
<213>鼠
<400>18
gaaguuguuc gugguggauu cg                                             22
<210>19
<211>22
<212>RNA
<213>鼠
<400>19
agaucagaag gugacugugg cu                                             22
<210>20
<211>20
<212>RNA
<213>鼠
<400>20
auuccuagaa auuguucaca                                                20
<210>21
<211>64
<212>RNA
<213>智人
<400>21
ccccgcgacg agccccucgc acaaaccgga ccugagcguu uuguucguuc ggcucgcgug    60
aggc                                                                 64
<210>22
<211>68
<212>RNA
<213>智人
<400>22
uaaaagguag auucuccuuc uaugaguaca uuauuuauga uuaaucauag aggaaaaucc    60
acguuuuc                                                             68
<210>23
<211>69
<212>RNA
<213>智人
<400>23
uugagcagag guugcccuug gugaauucgc uuuauuuaug uugaaucaca caaaggcaac    60
uuuuguuug                                                            69
<210>24
<211>66
<212>RNA
<213>智人
<400>24
ggggcuccug acuccagguc cuguguguua ccucgaaaua gcacuggacu uggagucaga    60
aggccu                                                               66
<210>25
<211>67
<212>RNA
<213>智人
<400>25
agagauggua gacuauggaa cguaggcguu augauuucug accuauguaa caugguccac    60
uaacucu                                                              67
<210>26
<211>61
<212>RNA
<213>智人
<400>26
aagaugguug accauagaac augcgcuauc ucugugucgu auguaauaug guccacaucu    60
u                                                                    61
<210>27
<211>75
<212>RNA
<213>智人
<400>27
uacuuaaagc gagguugccc uuuguauauu cgguuuauug acauggaaua uacaagggca    60
agcucucugu gagua                                                     75
<210>28
<211>76
<212>RNA
<213>智人
<400>28
uacuugaaga gaaguuguuc gugguggauu cgcuuuacuu augacgaauc auucacggac    60
aacacuuuuu ucagua                                                    76
<210>29
<211>73
<212>RNA
<213>智人
<400>29
cuccucagau cagaagguga uuguggcuuu ggguggauau uaaucagcca cagcacugcc    60
uggucagaaa gag                                                       73
<210>30
<211>88
<212>RNA
<213>智人
<400>30
uguuaaauca ggaauuuuaa acaauuccua gacaauaugu  auaauguuca uaagucauuc    60
cuagaaauug uucauaaugc cuguaaca                                        88
<210>31
<211>64
<212>RNA
<213>鼠
<400>31
ccccgcgacg agccccucgc acaaaccgga ccugagcguu uuguucguuc ggcucgcgug    60
aggc                                                                 64
<210>32
<211>68
<212>RNA
<213>鼠
<400>32
uaaaagguag auucuccuuc uaugaguaca auauuaauga cuaaucguag aggaaaaucc    60
acguuuuc                                                             68
<210>33
<211>68
<212>RNA
<213>鼠
<400>33
ugagcagagg uugcccuugg ugaauucgcu uuauugaugu ugaaucacac aaaggcaacu    60
uuuguuug                                                             68
<210>34
<211>66
<212>RNA
<213>鼠
<400>34
ggggcuccug acuccagguc cuguguguua ccucgaaaua gcacuggacu uggagucaga    60
aggccu                                                               66
<210>35
<211>66
<212>RNA
<213>鼠
<400>35
agagauggua gacuauggaa cguaggcguu auguuuuuga ccuauguaac augguccacu    60
aacucu                                                               66
<210>36
<211>61
<212>RNA
<213>鼠
<400>36
aagaugguug accauagaac augcgcuacu ucugugucgu auguaguaug guccacaucu    60
u                                                                    61
<210>37
<211>75
<212>RNA
<213>鼠
<400>37
uacuuaaagc gagguugccc uuuguauauu cgguuuauug acauggaaua uacaagggca    60
agcucucugu gagua                                                     75
<210>38
<211>76
<212>RNA
<213>鼠
<400>38
uacuugaaga gaaguuguuc gugguggauu cgcuuuacuu gugacgaauc auucacggac    60
aacacuuuuu ucagua                                                    76
<210>39
<211>70
<212>RNA
<213>鼠
<400>39
cucagaucag aaggugacug uggcuuuggg uggauauuaa ucagccacag cacugccugg    60
ucagaaagag                                                           70
<210>40
<211>88
<212>RNA
<213>鼠
<400>40
uguuaaauca ggaauuguaa acaauuccua ggcaaugugu auaauguugg uaagucauuc    60
cuagaaauug uucacaaugc cuguaaca                                       88
<210>41
<211>22
<212>RNA
<213>人工序列
<220>
<223>抗胰岛小RNA分子
<400>41
ucacgcgagc cgaacgaaca aa                                            22
<210>42
<211>21
<212>RNA
<213>人工序列
<220>
<223>抗胰岛小RNA分子
<400>42
acguggauuu uccucuauga u                                              21
<210>43
<211>22
<212>RNA
<213>人工序列
<220>
<223>抗胰岛小RNA分子
<400>43
acaaaaguug ccuuugugug au                                            22
<210>44
<211>22
<212>RNA
<213>人工序列
<220>
<223>抗胰岛小RNA分子
<400>44
acacaggacc uggagucagg ag                                            22
<210>45
<211>19
<212>RNA
<213>人工序列
<220>
<223>抗胰岛小RNA分子
<400>45
uacguuccau agucuacca                                                19
<210>46
<211>19
<212>RNA
<213>人工序列
<220>
<223>抗胰岛小RNA分子
<400>46
cauguucuau ggucaacca                                                19
<210>47
<211>22
<212>RNA
<213>人工序列
<220>
<223>抗胰岛小RNA分子
<400>47
acagagagcu ugcccuugua ua                                            22
<210>48
<211>22
<212>RNA
<213>人工序列
<220>
<223>抗胰岛小RNA分子
<400>48
cgaauccacc acgaacaacu uc                                            22
<210>49
<211>22
<212>RNA
<213>人工序列
<220>
<223>抗胰岛小RNA分子
<400>49
agccacaauc accuucugau cu                                            22
<210>50
<211>20
<212>RNA
<213>人工序列
<220>
<223>抗胰岛小RNA分子
<400>50
uaugaacaau uucuaggaau                                                20
<210>51
<211>22
<212>RNA
<213>人工序列
<220>
<223>抗胰岛小RNA分子
<400>51
ucacgcgagc cgaacgaaca aa                                             22
<210>52
<211>21
<212>RNA
<213>人工序列
<220>
<223>抗胰岛小RNA序列
<400>52
acguggauuu uccucuacga u                                              21
<210>53
<211>22
<212>RNA
<213>人工序列
<220>
<223>抗胰岛小RNA分子
<400>53
acaaaaguug ccuuugugug au                                             22
<210>54
<211>22
<212>RNA
<213>人工序列
<220>
<223>抗胰岛小RNA分子
<400>54
acacaggacc uggagucagg ag                                             22
<210>55
<211>19
<212>RNA
<213>人工序列
<220>
<223>抗胰岛小RNA分子
<400>55
uacguuccau agucuacca                                                 19
<210>56
<211>19
<212>RNA
<213>人工序列
<220>
<223>抗胰岛小RNA分子
<400>56
cauguucuau ggucaacca                                                19
<210>57
<211>22
<212>RNA
<213>人工序列
<220>
<223>抗胰岛小RNA分子
<400>57
acagagagcu ugcccuugua ua                                            22
<210>58
<211>22
<212>RNA
<213>人工序列
<220>
<223>抗胰岛小RNA序列
<400>58
cgaauccacc acgaacaacu uc                                            22
<210>59
<211>22
<212>RNA
<213>人工序列
<220>
<223>抗胰岛小RNA分子
<400>59
agccacaguc accuucugau cu                                            22
<210>60
<211>20
<212>RNA
<213>人工序列
<220>
<223>抗胰岛小RNA分子
<400>60
ugugaacaau uucuaggaau                                               20
<210>61
<211>25
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物
<400>61
tccatcattt catatgcact gtatc                                         25
<210>62
<211>25
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物
<400>62
tcatatcgtt aaggacgtct ggaaa                                         25
<210>63
<211>44
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物
<400>63
aagtttcgtg ttgcaagccc ccctggaata aacttgaatt gtgc                    44
<210>64
<211>44
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物
<400>64
gcacaattca agtttattcc aggggggctt gcaacacgaa actt                    44
<210>65
<211>25
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物
<400>65
gtgggccctg aaaaacggag acttg                                         25
<210>66
<211>25
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物
<400>66
ccctttgaca gaagcaattt cacgc                                         25
<210>67
<211>29
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物
<400>67
ccccaaggct gatgctgaga agccgcccc                                     29
<210>68
<211>21
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物
<400>68
gccgcccggc cccgggtctt c                                             21

Claims (61)

1.一种独立的DNA或RNA分子，包括具有在SEQ ID NO：1-20中示出的胰岛小RNA中的序列的至少十个相邻碱基，除了达到30％的所述碱基可以是摆动碱基，达到10％的所述相邻碱基可以是非互补的。
2.根据权利要求1所述的独立分子，进一步包括在SEQ IDNO：21-40中示出的发夹前体序列的任何一个中存在的位于5’端的碱基序列和/或位于3’端的碱基序列。
3.根据权利要求2所述的独立分子，其中所述发夹前体序列为其中存在胰岛小RNA的序列。
4.根据权利要求1所述的独立分子，其中所述胰岛小RNA被并入载体中。
5.根据权利要求1所述的独立分子，其中所述独立分子为DNA分子。
6.根据权利要求1所述的独立分子，其中所述独立分子为RNA分子。
7.根据权利要求1所述的独立分子，其中所述独立分子进一步包括帽。
8.根据权利要求7所述的独立分子，其中所述帽是倒置核苷酸帽。
9.根据权利要求7所述的独立分子，其中所述帽是化学帽。
10.根据权利要求1所述的独立分子，其中所述独立分子基本上由SEQ ID NO：1-20中示出的胰岛小RNA的任何一个序列组成。
11.根据权利要求1所述的独立分子，其中所述独立分子基本上由SEQ ID NO：21-40中示出的任何一个序列组成。
12.一种修饰的单链胰岛小RNA分子，包括在分子主链上的最少10个部分和最多50个部分，所述分子主链包括主链单元，每个所述部分包括结合到所述主链单元的碱基，其中：
至少10个所述相邻碱基具有与在SEQ ID NO：1-20中示出的胰岛小RNA分子中的碱基的相邻序列相同的序列，除了达到30％的所述碱基对可以是摆动碱基对，达到10％的所述相邻碱基可以为添加、缺失、错配、或其组合；
不超过50％的所述连续部分含有脱氧核糖核苷酸主链单元，以及
至少一个部分不是未修饰的脱氧核糖核苷酸部分或未修饰的核糖核苷酸部分。
13.根据权利要求12所述的分子，进一步包括在SEQ ID NO：21-40中示出的任何一个发夹前体序列中存在的位于5’端的碱基系列和/或位于3’端的碱基序列或其任何片段。
14.根据权利要求13所述的分子，其中所述发夹前体序列为其中存在胰岛小RNA的序列。
15.根据权利要求12所述的分子，其中所述胰岛是哺乳动物的胰岛。
16.根据权利要求15所述的分子，其中所述哺乳动物是人。
17.根据权利要求12所述的分子，其中所述分子被修饰以增大核酸酶抗性。
18.一种独立的单链抗-胰岛小RNA分子，包括在分子主链上的最少10个部分和最多50个部分，所述分子主链包括主链单元，每个所述部分包括结合到主链单元的碱基，每个所述碱基与互补碱基形成沃森-克里克碱基对，其中：
至少10个所述相邻碱基具有与在SEQ ID NO：1-20中示出的任何一个胰岛小RNA分子中的碱基的相邻序列互补的序列，除了达到30％的所述碱基对可以是摆动碱基对，达到10％的所述相邻碱基可以为添加、缺失、错配、或其组合；
不超过50％的所述相邻部分含有脱氧核糖核苷酸主链单元；以及
所述分子能够抑制小RNP活性。
19.根据权利要求18所述的分子，其中在对应于所述小RNA的位置11的位置处的所述部分是非互补的。
20.根据权利要求18所述的分子，其中达到5％的所述相邻部分与所述胰岛小RNA中的碱基的相邻序列可以是非互补的。
21.根据权利要求20所述的分子，其中所述非互补的部分为添加、缺失、错配、或其组合。
22.根据权利要求18所述的分子，具有在SEQ ID NO：41-60中示出的任何一个抗胰岛小RNA序列。
23.根据权利要求18所述的分子，其中所述部分的至少一个是修饰的脱氧核糖核苷酸部分。
24.根据权利要求23所述的分子，其中所述修饰的脱氧核糖核苷酸是硫代磷酸酯脱氧核糖核苷酸部分。
25.根据权利要求23所述的分子，其中所述修饰的脱氧核糖核苷酸是N’3-N’5氨基磷酸酯脱氧核糖核苷酸部分。
26.根据权利要求18所述的分子，其中所述部分的至少一个为修饰的核糖核苷酸部分。
27.根据权利要求26所述的分子，其中所述修饰的核糖核苷酸在2’位被取代。
28.根据权利要求27所述的分子，其中在2’位的所述取代基是C1～C4烷基基团。
29.根据权利要求28所述的分子，其中所述烷基基团是甲基。
30.根据权利要求28所述的分子，其中所述烷基基团是烯丙基。
31.根据权利要求27所述的分子，其中在2’位的所述取代基是C1～C4烷氧基-C1～C4烷基。
32.根据权利要求31所述的分子，其中所述C1～C4烷氧基-C1～C4烷基是甲氧基乙基。
33.根据权利要求26所述的分子，其中所述修饰的核糖核苷酸在2’-氧原子和4’-碳原子之间具有亚甲桥。
34.根据权利要求18所述的分子，其中所述部分的至少一个是肽核酸部分。
35.根据权利要求18所述的分子，其中所述部分的至少一个是2’-氟代核糖核苷酸部分。
36.根据权利要求18所述的分子，其中所述部分的至少一个是吗啉代氨基磷酸酯核苷酸部分。
37.根据权利要求18所述的分子，其中所述部分的至少一个是三环核苷酸部分。
38.根据权利要求18所述的分子，其中所述部分的至少一个是环己烯核苷酸部分。
39.根据权利要求18所述的分子，其中所述分子为嵌合分子。
40.根据权利要求18所述的分子，其中所述分子包括至少一个用于提高核酸酶抗性的修饰的部分。
41.根据权利要求40所述的分子，其中所述核酸酶是核酸外切酶。
42.根据权利要求41所述的分子，其中所述分子包括在5’端的至少一个修饰的部分。
43.根据权利要求41所述的分子，其中所述分子包括在5’端的至少两个修饰的部分。
44.根据权利要求41所述的分子，其中所述分子包括在3’端的至少一个修饰的部分。
45.根据权利要求41所述的分子，其中所述分子包括在3’端的至少两个修饰的部分。
46.根据权利要求41所述的分子，其中所述分子包括在5’端的至少一个修饰的部分和在3’端的至少一个修饰的部分。
47.根据权利要求41所述的分子，其中所述分子包括在5’端的至少两个修饰的部分和在3’端的至少两个修饰的部分。
48.根据权利要求41所述的分子，其中所述分子包括在所述分子的5’端、3’端、或两端的帽。
49.根据权利要求48所述的分子，其中所述分子包括化学帽。
50.根据权利要求48所述的分子，其中所述分子包括倒置核苷酸帽。
51.根据权利要求18所述的分子，其中所述核酸酶是核酸内切酶。
52.根据权利要求51所述的分子，其中所述分子包括在5’端和3’端之间的至少一个修饰的部分。
53.根据权利要求51所述的分子，其中所述分子包括5’端和3’端之间的化学帽。
54.根据权利要求18所述的分子，其中所述部分的全部是核酸酶抗性的。
55.一种用于抑制细胞中小RNP活性的方法，所述小RNP包括胰岛小RNA分子，所述方法包括将根据权利要求18所述的单链抗胰岛小RNA分子引入所述细胞中，其中所述抗胰岛小RNA对胰岛小RNA分子是互补的。
56.根据权利要求55所述的方法，其中在对应于所述小RNA的位置11的位置处的所述抗胰岛小RNA分子中的所述部分是非互补的。
57.根据权利要求55所述的方法，其中所述胰岛是哺乳动物的胰岛。
58.根据权利要求57所述的方法，其中所述哺乳动物是人。
59.一种用于治疗需要其的哺乳动物的糖尿病的方法，所述方法包括将有效量的具有至少十个相邻碱基的抗胰岛小RNA分子引入所述哺乳动物，其中所述相邻碱基具有在SEQ ID NO：41或51中示出的序列。
60.一种独立的小RNP，包括根据权利要求1所述的独立DNA或RNA分子。
61.一种独立的小RNP，包括根据权利要求12所述的独立的单链胰岛小RNA分子。
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