JP2007532130A - マイクロrna及びそれを阻害する方法 - Google Patents
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Abstract
【解決手段】本発明は、単離されたDNA又はRNA膵島マイクロRNA分子、更に本発明は、修飾された一本鎖膵島マイクロRNA分子又は単離された一本鎖アンチ−膵島マイクロRNA分子に関する。また本発明は、細胞のマイクロRNP活性を阻害するための手段を提供する。
【選択図】図1
Description
発明者は、新規な膵島マイクロRNA分子を発見した。これらの分子は、配列番号:1から20を有する。したがって、一つの実施態様において、本発明は、単離された一本鎖膵島マイクロRNA分子に関する。
1)ウラシルによるシトシンの置換、又は
2)グアニンによるアデニンの置換
のいずれの場合も含まれる。これらのゆらぎ塩基置換は一般に、UG又はGUゆらぎと呼ばれる。表3は、隣接する塩基の数及び分子のゆらぎ塩基の最大数を示す。
他の実施態様において、本発明は、修飾された一本鎖膵島マイクロRNA分子に関する。修飾された一本鎖マイクロRNA分子は、上記の膵臓マイクロRNA分子、ヘアピン前駆体分子又は、それの均等物のいずれかである。但し、修飾された分子が少なくとも一つの修飾された部分(すなわち、少なくとも一つの部分が修飾されていないデオキシリボヌクレオチド部分又は修飾されていないリボヌクレオチド部分でない)を含まない場合を除く。この実施態様において、前記の修飾された膵島マイクロRNA分子は、少なくとも10、好ましくは少なくとも13、より好ましくは少なくとも15、更により好ましくは少なくとも18、最も好ましくは少なくとも21の部分を含む。
別の態様において、本発明は、上記の単離されたDNA又はRNA分子、又は上記の修飾された膵島マイクロRNA分子のいずれかを含む、単離されたマイクロRNPを提供する。
別の態様において、本発明は、アンチ−膵島マイクロRNA分子を提供する。アンチ−膵島マイクロRNA分子は、上記の単離されたDNA又はRNA分子、又は上記の修飾された膵島マイクロRNA分子のいずれかであってよい。ただし、アンチ−膵島マイクロRNA分子の塩基配列が、単離されたDNA若しくはRNA分子、又は修飾された膵島マイクロRNA分子の塩基配列と相補的である場合を除く。
本発明の膵島マイクロRNA分子及びアンチ−膵島マイクロRNA分子は、非常に多くのin vitro、in vivo、ex vivoの用途に使用可能である。
マイクロRNAのクローニング及びノーザンブロッティング分析:
MIN6細胞培養から600μgの全RNAを、TRIZOL試薬(Invitrogen社)を使用して抽出し、前述した方法(ラゴス−キンタナ(Current Biol.))によりmiRNAクローニングを行った。アンチセンスプローブを、クローニングされたmiRNA配列と相補的になるように設計し、前述(ラゴス−キンタナ(Current Biol.))のとおり、ノーザンブロット分析に使用した。
MIN6細胞を、25mMのグルコース、15%の胎児のウシ血清及び5.5のμM 2−メルカプトエタノールを含むDMEM培地で培養した。N2A細胞を、25mMのグルコース及び10%の胎児のウシ血清を含むDMEM培地で培養した。
MIN6細胞を、2日間24−ウェルプレートで培養し、分析の前に修飾されたクレブス−リンゲル緩衝液(KRBH)(0.9mMのCaCl2、2.68mMのKCl、1.46mMのKH2PO4、0.5mMのMgCl2 6H2O、135mMのNaCl、8mMのNa2HPO4x7H2O、20mMのHepes及び0.2%のBSA)で洗浄した。5.5mMのグルコースを含むKRBHにて30分予備培養の後、細胞をリンスし、2.8mMのグルコース、25mMのグルコース、30mMのKCl、500mMのトルブタミド又は5mMのメチルピルビン酸塩を含有するKRBHにて60分間インキュベートした。上澄み中のインスリン濃度は、RIA(Linco Research)を用いて測定した。
miR−375の過剰発現に使用する組換えアデノウイルスを、次のプライマーを用いたmiRNA前駆体配列のPCRにより増幅した:5’−CCCCAAGGCTGATGCTGAGAAGCCGCCCC−3’及び5−GCCGCCCGGCCCCGGGTCTTC−3’。得られた断片をpcDNA3(Invitrogen社)にサブクローニングし、HindIII及びXbaI処理の後、Ad5CMV−K NpAシャトルベクターに挿入した。アデノウイルスの増幅は、Viraquest社(North Liberty、IA)にて行われた。トランス遺伝子を含まないAd−GFP(ViraQuest社)をコントロールとして使用した。
エキソサイトーシス及び内部のCa2+電流の測定は、単層状に分散した、コントロールGFP−又はmiRNA208−GFPを含むアデノウイルスへの感染後24時間経過したB細胞を用い、標準のパッチクランプ法により行われた。エキソサイトーシスを、Pulse(Heka Electronics、Lamprecht/Pfalz(ドイツ))のソフトウェアに基づくlock−inの実施により、細胞静電容量の変化として検出した。印加正弦波は、500Hzの周波数及び20mVのピーク振幅であった。Ca2+電流は、p4のプロトコルに基づき、電流リーク及び容量過渡をデジタル的に除去した後の数値を測定した。細胞外溶液は、118mMのNaCl、20mMのテトラエチルアンモニウム塩酸塩(TEACl)、5.6mMのKCl、2.6mMのCaCl2、1.2mMのMgCl2、5mMのグルコースを有する5mMのHEPES(pH=7.4)を含有する溶液とした。電位固定脱分極によってエキソサイトーシスを生じさせる実験において、細胞内液は、125mMのCs−グルタミン酸塩、10mMの塩化セシウム、10mMのNaCl、1mMのMgCl2、5mMのHEPES(CsOHを有するpH=7.15)、0.05mMのEGTA、3mMのマグネシウム−ATP及び0.1mMのサイクリックAMPを含有する溶液とした。一連の実験において、エキソサイトーシスは、125mMのCs−グルタミン酸塩、10mMのKCl、10mMのNaCl、1mMのMgCl2、3mMのマグネシウム−ATP、0.1mMのcAMP、10mMのHEPES、10mMのEGTA及び9mMのCaCl2を含有する溶媒により細胞内部を透析して行った。細胞フリーな溶液のCa2+濃度を1.5μM.と推定した。機能的にα−及びβ−細胞と識別され多細胞にて実験を行った。その細胞の識別は、公知の方法により決定した。
野生型マウスのミオトロフィンの3’UTR標的部位を、以下のプライマー:
5’TCCATCATTTCATATGCACTGTATC3’及び
5’TCATATCGTTAAGGACGTCTGGAAA3’
を使用してPCR増幅し、pCR2.1TOPO(Invitrogen社)にサブクローニングした。得られた断片をSpeI及びXbaI処理により単離し、pRL−TK(プロメガ社)の停止コドンのすぐ下流にサブクローニングした。このコンストラクトは、プロトコル(Stratagene)に従い、以下のプライマー:
5’AAGTTTCGTGTTGCAAGCCCCCCTGGAATAAACTTGAATTGTGC3’、及び
5’GCACAATTCAAGTTTATTCCAGGGGGGCTTGCAACACGAAACTT3’
を使用した、変異体マウスミオトロフィンプラスミドの調製に使用した。下線は、突然変異するヌクレオチドを示す。MIN6細胞を2日間、24ウェルプレートで培養し、Rr−hxcをコードしているpRL−TKリポーターベクター0.4μg、及び0.1μgのPp−luc(プロメガ社)をコードしているpGL3コントロールベクターによってトランスフェクションした。細胞をトランスフェクション後30−36時間にて回収し、試験に使用した。
miR−375の標的を同定するために、最近開発されたアルゴリズム(N.Rajewsky及びN.D.Socci、Developmental Biology 267、529−535の(2004))を使用した。前記アルゴリズムは以下の二つのステップを含む。
(a)mRNAの3’UTRにおける、マイクロRNA及び推定の標的配列の間で保存されているGCリッチな連続的な相補的基礎配列(「核」)の検索、及び
(b)予測されたマイクロRNA:mRNAデュプレックスの自由エネルギーのin silicoによる評価。
アルゴリズムをRefseqデータセットに適用した。3’UTRは、Refseqアノテーションから抽出した。このデータセットは、18199のヒト、及び13371のマウスの3’UTRであり、少なくとも30のヌクレオチド長を有するものを含む。「Jackson lab orthology table of 9612 human/mouse orthologs」を使用し、一組のオルトログの3’UTRを構築した。Lewis BP,Shih IH,Jones−Rhoades MW,Barrel DP,Burge CB,Prediction of mammalian microRNA targets.Cell 787−98(2003)に従い、核の位置を、マイクロRNAの5’末端から2塩基内部に制限した。ヒットした上位8%を保持しながら、上記(a)による核スコアを決定した。これらのヒットは、その後MFOLD(Zuker,NAR 3406−15,2003、Rajewsky and Socci for details)を用い、予測されたmRNA:miRNAデュプレックスの自由エネルギーによって記録された。
合成マイクロRNA及びsiRNAは、Dharmacon Research(Lafayette社)によって合成された。siRNA SMARPOOLsは、マウスミオトロフィン(NM_008098)及びマウスVti1A(NM_016862)の配列から設計した。全ての2’−O−メチルオリゴリボヌクレオチドは、公知技術(Meisterら、RNA)の方法により合成した。全ての試薬は、200nMの濃度でLipofectamine 2000(Invitrogen社)を使用してMIN6細胞にトランスフェクションした。
ウエスタンブロット法のための抗体を、幾つかの異なる供給源から得た:α−myotrophin(マサト・タオカ氏による寄付)、α−Vti1(BD Transduction Laboratoriesより)、α−p38 MAPK(Cell Signalingより)、α−MCT8(Andrew Halestrapによる寄付)、α−TATAボックス結合タンパク質(R.Roeder氏による寄付)。
全RNAは、TRIZOL試薬(Invitrogen社)を使用して抽出され、15%のポリアクリルアミン又はアガロースゲルにローディングされた。電気泳動後、RNAをHybond膜(アマシャム社)に転写し、プローブと反応させた。マウスミオトロフィンと反応するDNAプローブは、以下のプライマー:
5’GTGGGCCCTGAAAAACGGAGACTTG3’、及び
5’CCCTTTGACAGAAGCAATTTCACGC3’
を使用して調製した。
マイクロRNAを、MIN6細胞(グルコース応答性ネズミ膵臓β細胞系)からクローニングした。合計301のマイクロRNAクローンを得たが、そのうち55は異なるマイクロRNAであった。前記の55の異なるマイクロRNAの中で、既に公表されているマイクロRNAは92%を占め、残りの8%は未確認のマイクロRNAであった。公知の及び新規のmiRNAは、Blast配列分析によってさまざまなゲノム・データベースにおいて同定され、種間ホモロジー及び典型的ヘアピン前駆体構造を形成する能力によって確認された。
高い表現レベル及び膵臓β−細胞における組織特異性を有するマイクロRNAの機能を解析するため、マイクロRNA−375及び−376に相同な配列を有する合成siRNAを用いて、MIN6細胞をトランスフェクションした後の、グルコース誘導によるインスリン分泌を解析した。siRNAに加えて、CMVプロモータの制御下でヒト成長ホルモン(hGH)遺伝子を発現するベクター(CMV−hGH)をコトランスフェクションした。追加的に発現したhGHは、膵臓β−細胞系の分泌顆粒の標的とされ、エキソサイトーシスの起動後にインスリンと共放出されることが開示されている。この方法によって、一過性にトランスフェクションするMIN6細胞(トランスフェクション効率20−30%)から選択的にエキソサイトーシスをモニターすることが可能となる。ポジティブ及びネガティブのコントロールとして、グルコキナーゼ遺伝子(Gck)又はアポリポタンパク質M(apoM)(膵臓β−細胞において発現しない遺伝子)を標的とするsiRNAを、MIN6細胞にCMV−hGHによってコトランスフェクションした。
解糖系の流れ及びミトコンドリア酸化的リン酸化の増加は、サイトゾル中のATP/ADP比率の増加を経たATP−感受性カリウムチャネル(KATP)の遮断を誘導し、グルコース誘発によるインスリン分泌への第2のシグナルを発生させるために必要となる。これにより、膜脱分極及び電位依存的なCa2+チャネルを通したCa2+の流入が生じる。[Ca2+]の上昇が、インスリン顆粒エキソサイトーシスには必要である。グリベンクラミドのようなスルフォニルウレアは、直接KATPを遮断することによって、インスリン分泌を促進する。KClにより膵臓β−細胞の直接的な脱分極が生じ、インスリン顆粒の脱顆粒が最大となる。トルブタミド及びKClの刺激による、Ad−375感染MIN6細胞のインスリン分泌を測定した。これらの分泌促進物質を用いた膵臓β−細胞の刺激は、Ad−eGFP感染細胞と比較したAd−375感染細胞におけるインスリン分泌の障害を示した。更にAd−375の発現により、Ad−eGFP感染MIN6細胞と比較した、GLP−1(キャンプの起動によるインスリン分泌の強力なグルコースに依存する刺激)に応答したインスリン分泌が阻害されることが確認された。これらのデータは、miR−375の過剰発現がインスリン分泌の末梢部のステップを含む欠陥につながることを示唆するものである。そこにおいて、膵臓β−細胞の細胞質のCa2+濃度の上昇に影響を及ぼすか、エキソサイトーシスに対して干渉することが考えられる。
多数のゲノム全体に保存されているマイクロRNAの標的を予測するために、RNA:RNAデュプレックス相互作用の熱力学に基づくモデリングを、配列の比較分析と結合するアルゴリズムを適用した。miR−375標的遺伝子の64の推定のリストの中から、インスリン分泌/膵島分化におけるそれらの潜在的役割に基づいて6つの遺伝子を選択し、試験に用いた。
Claims (61)
- 配列番号:1から20のいずれかに示される膵島マイクロRNAの塩基配列(ただし、塩基の30%までがゆらぎ塩基であり、塩基の10%までが非相補的である場合を除く)を有する、少なくとも10の隣接する塩基を含む、単離されたDNA又はRNA分子。
- 更に5’末端に及び/又は3’末端に、配列番号:21から40に示されるヘアピン前駆体配列のいずれか一つ又はそのフラグメントに存在する塩基配列を含む、請求項1に記載の単離された分子。
- ヘアピン前駆体の配列が、膵島マイクロRNAに存在する配列である、請求項2に記載の単離された分子。
- 膵島マイクロRNAがベクターに組み込まれている、請求項3に記載の単離された分子。
- 単離された分子がDNA分子である、請求項1に記載の単離された分子。
- 単離された分子がRNA分子である、請求項1に記載の単離された分子。
- 単離された分子が更にキャップを含む、請求項1に記載の単離された分子。
- キャップが逆向きのヌクレオチドキャップである請求項7に記載の単離された分子。
- キャップが化学キャップである請求項7に記載の単離された分子。
- 単離された分子が実質的に、配列番号:1から20に示される膵島マイクロRNAの配列のいずれか一つを含む、請求項1に記載の単離された分子。
- 単離された分子が実質的に、配列番号:21から40に示される膵島マイクロRNAの配列のいずれか一つを含む、請求項1に記載の単離された分子。
- 修飾された一本鎖膵島マイクロRNA分子であり、その基本分子上に最低10の部分、最高50の部分が含まれ、前記基本分子が基本単位を含み、各々の部分が基本単位に結合した塩基を含み、そこにおいて:
少なくとも10の隣接する塩基は、配列番号:1から20に示される膵島マイクロRNA分子の塩基の隣接する配列と同じ配列(ただし塩基対の最高30%がゆらぎ塩基対で、また隣接する塩基の最高10%はそれについて付加、欠失、変異又はその組合せであってもよい)を有し、
デオキシリボヌクレオチド基本単位を含む部分が隣接する部分の50%を越えず、
少なくとも一つの部分が修飾されていないデオキシリボヌクレオチド部分又は修飾されていないリボヌクレオチド部分でない、
修飾された一本鎖膵島マイクロRNA分子。 - 更に、配列番号:21から40に示されるヘアピン前駆体配列のいずれか一つ又はそのフラグメントに存在する塩基配列を、その5’末端及び/又は3’末端に含む、請求項12に記載の分子。
- ヘアピン前駆体配列が膵島マイクロRNAがある配列である、請求項13に記載の分子。
- 膵島が哺乳類の膵島である、請求項12に記載の分子。
- 哺乳類がヒトである、請求項15に記載の分子。
- ヌクレアーゼ耐性を増加させるために分子が修飾された、請求項12に記載の分子。
- 修飾された一本鎖アンチ−膵島マイクロRNA分子であり、その基本分子上に最低10の部分、最高50の部分が含まれ、前記基本分子が基本単位を含み、各々の部分が基本単位に結合した塩基を含み、各塩基が相補的な塩基とワトソン−クリック塩基対を形成し、そこにおいて:
少なくとも10の隣接する塩基は、配列番号:1から20に示される膵島マイクロRNA分子の塩基の隣接する配列と相補的な配列(ただし塩基対の最高30%がゆらぎ塩基対で、また隣接する塩基の最高10%はそれについて付加、欠失、変異又はその組合せであってもよい)を有し、
デオキシリボヌクレオチド基本単位を含む部分が隣接する部分の50%を越えず、
マイクロRNP活性を阻害することができる、
修飾された一本鎖アンチ−膵島マイクロRNA分子。 - マイクロRNAの位置11に対応する位置の部分が非相補的である、請求項18に記載の分子。
- 隣接する部分の最高5%が膵島マイクロRNAの塩基の隣接する配列と非相補的でもよい、請求項18に記載の分子。
- 非相補的な部分が付加、欠失、変異又はそれらの組合せである、請求項20に記載の分子。
- 配列番号:41から60に示されるアンチ−膵島マイクロRNA配列のいずれか一つを有する、請求項18に記載の分子。
- 部分のうちの少なくとも一つが、修飾されたデオキシリボヌクレオチド部分である、請求項18に記載の分子。
- 修飾されたデオキシリボヌクレオチドが、ホスホロチオネートデオキシリボヌクレオチド部分である、請求項23に記載の分子。
- 修飾されたデオキシリボヌクレオチドが、N’3−N’5ホスホロアミダートデオキシリボヌクレオチド部分である、請求項23に記載の分子。
- 部分のうちの少なくとも一つが、修飾されたリボヌクレオチド部分である、請求項18に記載の分子。
- 前記修飾されたリボヌクレオチドが2’の位置で置換されている、請求項26に記載の分子。
- 2’の位置の置換基が、炭素数1から4のアルキル基である、請求項27に記載の分子。
- アルキル基がメチル基である、請求項28に記載の分子。
- アルキル基がアリル基である、請求項28に記載の分子。
- 2’の位置の置換基が、(炭素数1から4のアルコキシ基)−(炭素数1から4のアルキル)基である、請求項27に記載の分子。
- 前記(炭素数1から4のアルコキシ基)−(炭素数1から4のアルキル)基が、メトキシエチル基である、請求項31に記載の分子。
- 修飾されたリボヌクレオチドが、2’−酸素原子及び4’−炭素原子の間のメチレン架橋を有する、請求項26に記載の分子。
- 部分のうちの少なくとも一つが、ペプチド核酸部分である、請求項18に記載の分子。
- 部分のうちの少なくとも一つが、2’−フルオロリボヌクレオチド部分である、請求項18に記載の分子。
- 部分のうちの少なくとも一つが、モルフォリノホスホロアミダートヌクレオチド部分である、請求項18に記載の分子。
- 部分のうちの少なくとも一つが、トリシクロヌクレオチド部分である、請求項18に記載の分子。
- 部分のうちの少なくとも一つが、シクロヘキセンヌクレオチド部分である、請求項18に記載の分子。
- 分子がキメラ分子である、請求項18に記載の分子。
- 分子が、ヌクレアーゼ耐性を増加させるために少なくとも一つの修飾された部分を含む、請求項18に記載の分子。
- ヌクレアーゼがエキソヌクレアーゼである、請求項40に記載の分子。
- 分子が5’末端に少なくとも一つの修飾された部分を含む、請求項41に記載の分子。
- 分子が5’末端に少なくとも二つの修飾された部分を含む、請求項41に記載の分子。
- 分子が3’末端に少なくとも一つの修飾された部分を含む、請求項41に記載の分子。
- 分子が3’末端に少なくとも二つの修飾された部分を含む、請求項41に記載の分子。
- 分子が5’末端に少なくとも一つの修飾された部分、及び3’末端に少なくとも一つの修飾された部分を含む、請求項41に記載の分子。
- 分子が5’末端に少なくとも二つの修飾された部分、及び3’末端に少なくとも二つの修飾された部分を含む、請求項41に記載の分子。
- 分子が5’末端、3’末端又はその両末端にキャップを含む、請求項41に記載の分子。
- 分子が化学キャップを含む、請求項48に記載の分子。
- 分子が逆向きのヌクレオチドキャップを含む、請求項48に記載の分子。
- ヌクレアーゼがエンドヌクレアーゼである、請求項18に記載の分子。
- 分子が5’末端と3’末端の間に少なくとも一つの修飾された部分を含む、請求項51に記載の分子。
- 分子が5’末端と3’末端の間に化学キャップを含む、請求項51に記載の分子。
- 部分の全てがヌクレアーゼ耐性である、請求項18に記載の分子。
- 細胞内で膵島マイクロRNAの活性を阻害する方法であり、前記膵島マイクロRNAは膵島マイクロRNA分子を含み、前記方法は請求項18の一本鎖のアンチ−膵島マイクロRNA分子を細胞に導入する工程を含み、前記アンチ−膵島マイクロRNAが前記膵島マイクロRNAと相補的である、方法。
- マイクロRNAの位置11に対応する位置のアンチ−膵島マイクロRNA分子の部分が非相補的である、請求項55に記載の方法。
- 膵島が哺乳類の膵島である、請求項55に記載の方法。
- 哺乳類がヒトである、請求項57に記載の方法。
- 配列番号:41又は51に示される配列を有する、少なくとも10の隣接する塩基を有するアンチ−膵島マイクロRNA分子の有効量を、哺乳類に導入する工程を含む、哺乳類の患者の糖尿病を治療する方法。
- 請求項1に記載の単離されたDNA又はRNA分子を含む、単離されたマイクロRNP。
- 請求項12に記載の単離された一本鎖膵島マイクロRNA分子を含む、単離されたマイクロRNP。
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