CN107519489A - miR‑375抑制剂在制备抗血管衰老药物中的应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种miR‑375抑制剂在制备抗血管衰老药物中的应用，属于生物医药领域。本发明通过系统筛选促进血管细胞衰老的miRNA，发现miR‑375对血管细胞，尤其是血管内皮衰老具有明显的促进作用。然后通过在其他类型的血管相关细胞模型中验证miR‑375，通过所得到的过表达miR‑375时其他衰老相关分子或表型的改变结果，确定了miR‑375具有促进血管细胞衰老的作用。在此基础上，进一步通过实验确定了miR‑375抑制剂有助于细胞抵抗氧化压力诱导的内皮细胞衰老，miR‑375抑制剂能够有效减缓血管细胞衰老。本发明为研发针对性的血管衰老预防及治疗方法提供新的科学依据，为发展新的抗血管衰老药物，尤其是抗血管细胞衰老药物及新的血管衰老分子机制提供了新线索。

Description

miR-375抑制剂在制备抗血管衰老药物中的应用
技术领域
本发明涉及生物医药领域，特别涉及miR-375抑制剂在制备抗血管衰老药物中的应用。
背景技术
衰老是生命的基本特征，衰老可以发生在个体、组织器官和细胞等不同层次，是由内在编程决定并受环境因素影响的过程。威廉·奥斯勒(William Osler)在完成大量人体解剖后指出“血管衰老，人即衰老”，说明了血管衰老在衰老中的重要作用。血管衰老与增龄相关的各类血管性疾病，例如高血压、冠心病、脑卒中、血管性老年痴呆、动脉粥样硬化和中风的发生密切相关。上述这些疾病严重影响着老年人的健康和生活质量，给患者和社会带来沉重的负担。所以，研究血管衰老是解析个体衰老以及衰老相关疾病发生发展机制的一个重要突破口，是通过延缓衰老控制衰老相关疾病的发生，提供康复、干预与保护措施及解决我国人口老龄化和衰老相关疾病所带来的一系列社会问题的重要基础和有效切入点。
研究发现，大部分引起衰老表型改变的分子能调节细胞衰老，这意味着细胞衰老与衰老之间紧密相关。而且，以衰老血管细胞为衰老模型，对血管衰老有关的重要分子信号通路的研究也验证了血管细胞衰老与上述与增龄相关的各类血管性疾病密切相关。
组织学上，血管包括内皮细胞、平滑肌细胞和成纤维细胞。内皮细胞是血管的屏障，负责对外来刺激的应答，对平滑肌具有重要的调节作用；平滑肌是动脉的主要结构细胞，维持血管的收缩和张力；而成纤维细胞主要位于血管结缔组织中，对细胞外基质和损伤修复有重要作用。血管衰老是血管组成细胞衰老的综合效应。与其他细胞的衰老一样，血管组成细胞的衰老也是一个程序化的过程。随着时间的进行，细胞中的一组“衰老相关基因”有序启闭导致衰老的发生。目前已经发现多个衰老相关基因，其中包括非编码的microRNA(简称miRNA)基因。
miRNA是一类内源性非编码单链RNA，长度为21-25个核苷酸，在进化上具有高度保守性、时序性和组织特异性，几乎存在于所有多细胞生物体中。到目前为止，专门收录miRNA序列的数据库miRBase涵盖了包括植物、动物和病毒在内的超过8000种miRNA，其中，有超过800个人类miRNA存在于miRBase数据库中。据推测miRNA调节着人类三分之一的基因，参与机体诸多生理病理过程。miRNA主要作用于靶基因的3′非翻译区直接引起靶基因mRNA的降解或者抑制靶基因mRNA的翻译。可见miRNA能够参与调节细胞功能，在人类疾病的调控过程中具有重要的作用。
目前已有多篇文章报道了miRNA参与了多种细胞的衰老调控，例如人间质干细胞的复制型衰老、肺癌细胞的诱导型衰老等。然而，由于miRNA的调控具有细胞特异性。发明人发现系统评价miRNA在血管相关细胞，特别是血管内皮细胞衰老过程中的调控作用的报道较少。
发明内容
本发明实施例所要解决的技术问题在于，提供了一种miR-375抑制剂(即miRNA-375抑制剂)在制备抗血管衰老药物中的应用。具体技术方案如下：
一方面，本发明实施例提供了一种miR-375抑制剂在制备抗血管衰老药物中的应用。
具体地，作为优选，所述miR-375抑制剂为miR-375的反义核酸。
具体地，作为优选，所述miR-375抑制剂为特异性结合miR-375的蛋白。
具体地，作为优选，所述miR-375抑制剂为特异性干扰miR-375基因表达及加工的siRNA。
具体地，作为优选，所述miR-375抑制剂为特异性干扰miR-375基因表达及加工的miRNA。
具体地，所述miR-375的核苷酸序列如序列表SEQ ID NO：1所示。
另一方面，本发明实施例提供了一种用于抗血管衰老的药物组合物，所述药物组合物包括有效量的miR-375抑制剂。
作为优选，所述药物组合物还包括与所述miR-375抑制剂配伍的其他药类以及药学上可接受的载体和/或辅料。
本发明实施例提供的技术方案带来的有益效果是：
本发明实施例提供的miR-375抑制剂在制备抗血管衰老药物中的应用，通过系统筛选促进血管细胞衰老的miRNA，发现miR-375对血管细胞，尤其是血管内皮衰老具有明显的促进作用。然后通过在其他类型的血管相关细胞模型中验证miR-375，获取过表达miR-375时其他衰老相关分子或表型的改变现象，确定了miR-375具有促进血管细胞衰老的作用。在此基础上，进一步通过实验确定了miR-375抑制剂有助于细胞抵抗氧化压力诱导的内皮细胞衰老，miR-375抑制剂能够有效减缓血管细胞衰老。可见，本发明为研发针对性的血管衰老预防及治疗提供新的科学依据，为发展新的抗血管衰老药物，尤其是抗血管细胞衰老药物及新的血管衰老分子机制提供了新线索。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例中的技术方案，下面将对实施例描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1是本发明实施例1提供的转染scramble的HUVEC细胞、转染miR-34a的HUVEC细胞以及转染miR-375的HUVEC细胞中的β-gal染色结果示意图；
图2是本发明实施例2提供的转染scramble的HCAEC细胞、转染miR-34a的HCAEC细胞以及转染miR-375的HCAEC细胞中的β-gal染色结果示意图；
图3是本发明实施例2提供的转染scramble的HASMC细胞、转染miR-34a的HASMC细胞以及转染miR-375的HASMC细胞中的β-gal染色结果示意图；
图4是本发明实施例3提供的转染scramble的HUVEC细胞以及转染miR-375的HUVEC细胞中的p21和p16蛋白的表达示意图；
图5是本发明实施例3提供的转染scramble的HUVEC细胞以及转染miR-375的HUVEC细胞中G2/M阻滞示意图；
图6是本发明实施例3提供的转染scramble的HUVEC细胞以及转染miR-375的HUVEC细胞中G2/M检验点关键的调节因子表达示意图；
图7是本发明实施例3提供的转染scramble的HUVEC细胞、转染miR-375的HUVEC细胞以及仅用Lipo2000处理的HUVEC细胞的倍增水平示意图；
图8是本发明实施例4提供的利用不同浓度的H2O2处理过的HUVEC细胞中miR-375的表达示意图；
图9是本发明实施例4提供的转染scramble的HUVEC细胞、H2O2处理并转染scramble的HUVEC细胞以及用H2O2处理和转染miR-375抑制剂的HUVEC细胞中的β-gal染色结果示意图；
图10是本发明实施例4提供的转染scramble的HUVEC细胞、H2O2处理并转染scramble的HUVEC细胞以及用H2O2处理和转染miR-375抑制剂处理的HUVEC细胞中G2/M阻滞示意图；
图11是本发明实施例4提供的转染scramble的HUVEC细胞、H2O2处理并转染scramble的HUVEC细胞以及用H2O2处理和转染miR-375抑制剂处理的HUVEC细胞中G2/M检验点关键的调节因子表达示意图。
具体实施方式
为使本发明的技术方案和优点更加清楚，下面将结合附图对本发明实施方式作进一步地详细描述。
一方面，本发明实施例提供了一种miR-375抑制剂在制备抗血管衰老药物中的应用。
本发明实施例提供的miR-375抑制剂在制备抗血管衰老药物中的应用，通过系统筛选促进血管细胞衰老的miRNA，发现miR-375对血管细胞，尤其是血管内皮衰老具有明显的促进作用。然后通过在其他类型的血管相关细胞模型中验证miR-375，获取过表达miR-375时其他衰老相关分子或表型的改变现象，确认了miR-375具有促进血管细胞衰老的作用。在此基础上，进一步通过实验确定了miR-375抑制剂有助于细胞抵抗氧化压力诱导的内皮细胞衰老，miR-375抑制剂能够有效减缓血管细胞衰老。可见，本发明为研发针对性的血管衰老预防及治疗方法提供新的科学依据，为发展新的抗衰老药物及新的血管衰老分子机制提供了新线索。
可以理解的是，miR-375抑制剂具有本领域公知含义。miR-375抑制剂的设计和制备方法也为本领域所公知。miR-375抑制剂可以包括拮抗剂、下调剂、阻滞剂、阻断剂等。任何可降低miR-375的活性及稳定性、(在细胞中)特异性抑制miR-375的表达、抑制miR-375对靶基因的调控作用、减少miR-375的有效作用时间或者特异性抑制miR-375的转录和加工的物质均可以用于本发明，作为用于抗血管衰老，尤其是抗血管的内皮细胞衰老的有效物质。
举例来说，本领域技术可以根据miR-375设计其反义RNA，即获取miR-375的反义核酸，亦即该miR-375抑制剂可以为miR-375的反义核酸，该miR-375的反义核酸能够有效抑制miR-375的表达。或者，本领域技术人员可以将miR-375与特定的物质接触，检测miR-375的表达，并选择特异抑制miR-375表达的候选物质，以得到miR-375抑制剂，亦即该miR-375抑制剂可以为特异性结合miR-375的蛋白。或者，该miR-375抑制剂可以为特异性干扰miR-375基因表达、加工的小干扰分子，例如为特异性干扰miR-375基因表达及加工的siRNA或者特异性干扰miR-375基因表达及加工的miRNA。
进一步地，上述miR-375抑制剂优选为miR-375的反义核酸，或者是其序列与该miR-375的反义核酸的序列具有80％，优选85％以上的相同性的反义核酸，该类反义核酸均具有与miR-375的反义核酸相同的功能。
更进一步地，第一方面，上述“反义核酸”还包括经修饰的反义核酸，该修饰基本不改变反义核酸的活性，更佳地，该修饰可以提高该反义核酸的活性、稳定性和治疗效果。上述对反义核酸的修饰至少包括甲氧基化修饰、锁核酸修饰、肽核酸修饰、硫代修饰等。第二方面，上述“反义核酸”还包括其所含有的核苷酸被部分地替换或增减后的反义核酸，该部分地替换或增减基本不改变反义核酸的活性，更佳地，该部分地替换或增减可以提高该反义核酸的活性、稳定性和治疗效果。
具体地，上述miR-375的核苷酸序列如序列表SEQ ID NO：1所示。miR-375为本领域公知的miRNA小分子，其对于调控RNA是有用的。miR-375具有如序列表SEQ ID NO：1所示的序列：uuuguucguucggcucgcguga，其可以来自被分离细胞或者通过人工合成的方式获得。
可以理解的是，在得知了miR-375的序列后，本领域技术人员可以容易地获得miR-375的反义互补序列，该miR-375的反义互补序列如下所示：ucacgcgagccgaacgaacaaa。亦即，根据miR-375的特性，本领域技术人员可以容易地获得miR-375及多种miR-375抑制剂。
另一方面，提供了一种用于抗血管衰老的药物组合物，该药物组合物包括有效量的miR-375抑制剂。
本发明实施例提供的药物组合物以miR-375抑制剂作为活性物质，该药物组合物同样具有miR-375抑制剂的特异性作用，即能够有效预防并减缓血管细胞，尤其是血管内皮细胞衰老。
其中，上述“有效量”是指对人或动物体产生功能或活性，且可被人或动物所接受的量。
作为优选，该药物组合物还包括与miR-375抑制剂配伍的其他药类以及药学上可接受的载体和/或辅料。
当miR-375抑制剂用于制备抗衰老药物时，其可以单独使用，也可以与其他可配伍的药类以及药学上可接受的载体和/或辅料配合使用。其中，“药学上可接受的载体和/或辅料”指的是适用于人活动物而无过度不良副反应(如毒性、刺激和变态反应)的，即具有合理的效益/风险比的载体和/或辅料。具体地，该载体可以为纳米颗粒、脂质体、胆固醇、壳聚糖及病毒等。
进一步地，该药物组合物的剂型可以选自溶液剂、悬液剂、干粉剂、乳剂、控制释放剂或持续释放制剂。该药物组合物的给药方式可以选自注射给药(例如，静脉注射、关节腔局部注射或肌肉注射等)或经口给药。
以下将通过具体的实施例进一步地描述本发明。
在以下具体实施例中未注明条件者，均按照常规条件或者制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商及规格者均为可以通过市购获得的常规产品。
在以下各实施例中，各阴性对照组中的HUVEC细胞均为转染scramble的HUVEC细胞，其中，该scramble为市购产品，具体来说，针对MicroRNA时，其所对应的scramble(即microRNA mimics N.C)的序列为UUGUACUACACAAAAGUACUG；而针对MicroRNA的抑制剂时，其所对应的scramble(即MircoRNA inhibitor N.C)的序列为CAGUACUUUUGUGUAGUACAA。
实施例1 系统筛选促进血管内皮细胞衰老的miRNA
1、本实施例中所使用的材料如下所示：
1.1 细胞
用于本实施例的人脐静脉内皮细胞(Human Umbilical Vein EndothelialCells，HUVEC)均为发明人实验室内自行分离。
1.2 主要试剂
1.2.1 细胞分离培养
内皮细胞培养基(Endothelial Cell Medium，ECM)(Sciencell公司)
胰酶(Amresco公司)
EDTANa2(北京化工厂)
1.2.2 细胞转染
Lipo2000脂质体转染试剂(Invitrogen公司)
1.2.3 β-半乳糖苷酶(β-galactosidase，β-gal)检测
衰老相关β-gal检测试剂盒(碧云天生物技术研究所)
2、本实施例的具体操作步骤如下：
2.1 HUVEC分离培养
1)将取来的实验用脐带迅速移入洁净操作台内，无菌条件下将其放入提前盛有预热D-hanks液的培养皿中，洗净。
2)剪去有钳夹痕及血肿的部分，挤出脐带中的血，用剪刀修齐两断面，分成20cm的一段。
3)找出脐静脉，用带平针头的注射器分别从两端插入脐静脉，血管钳固定。
4)再用预热的D-hanks液冲洗3次，将血迹完全冲洗干净。
5)从冲洗的针头中注入0.2％胶原酶II(在磷酸盐缓冲液(Phosphate BufferedSaline，PBS)中)使其充盈。取出针头，用止血钳夹住注入端，移入无菌烧杯中，置于37℃培养箱中孵育13min。
6)取出，松开注入端的血管钳，收集脐静脉内的消化液于离心管中，然后注入D-hanks液，再次冲洗管腔，将消化液与冲洗液一并收集于离心管，1000r/min，离心5min。
7)弃上清，加入ECM培养基(含5％胎牛血清)置于5％CO2，37℃培养箱中培养，24h后更换培养基中的培养液去除未贴壁的细胞，然后每隔24h半定量换液1次至细胞生长铺满瓶底。
2.2 lipo2000转染HUVEC
从现有的miRNA库中挑选约210条在人和大鼠中保守的miRNA，利用高通量的筛选系统，按照lipo2000转染试剂说明书，分别将上述miRNA转染HUVEC，转染后5天，对HUVEC细胞进行衰老相关的β-gal检测。
2.3 β-gal染色检测
1)吸除细胞培养液，用PBS或Hank′s平衡盐溶液(Hank′s Balanced SaltSolution，HBSS)洗涤1次，加入1毫升β-半乳糖苷酶染色固定液，室温固定15分钟。
2)吸除细胞固定液，用PBS洗涤细胞3次，每次3分钟。
3)按照说明书配置染色工作液。
4)吸除PBS，每孔加入1毫升染色工作液，放于37度进行β-gal染色。其中，β-gal染色越深，说明HUVEC细胞衰老程度越大。本实施例以miR-34a(促进内皮细胞衰老的已知miRNA)作为阳性对照。
3、实验结果
如附图1所示，转染miR-375后的HUVEC，即miR-375转染组与阴性对照组(转染scramble的HUVEC细胞)相比，β-gal染色阳性细胞(见图1中的蓝色点状物)的比例明显增加，具有明显的β-gal深染；miR-375转染组与阳性对照组(即miR-34a转染组)相比，同样具有了类似的较深的β-gal染色。另外，由于高通量的筛选可能会有较高的假阳性，发明人在上述HUVEC模型中单独进行了miR-375的转染，结果发现转染miR-375后的HUVEC同样具有与前述实验一致的β-gal深染。可见，miR-375对HUVEC的衰老具有明显的促进作用。
实施例2 在其他类型的血管相关细胞模型中验证mir-375
由于内皮细胞具有很强的异质性，不同血管的内皮细胞特性可能完全不同。因此，发明人又选择了人冠状动脉内皮细胞(Human Coronary Artery Endothelial Cells，HCAEC)和人主动脉平滑肌细胞(Human Aortic Smooth Muscle Cells，HASMC)重复了上述如实施例1所述的实验。
除了所使用的HCAEC和HASMC细胞均购于美国ScienCell公司之外，本实施例中所使用的主要实验试剂和试验方法均与实施例1中相同。在此不再赘述。
实验结果如下：
如图2所示，转染miR-375后的HCAEC，即miR-375转染组与阴性对照组(即转染scamble的HUVEC细胞)相比，β-gal染色阳性细胞(见图2中的蓝色点状物)的比例明显增加，具有明显的β-gal深染；miR-375转染组与阳性对照组(即miR-34a转染组)相比，同样具有了类似的较深的β-gal染色。可见，miR-375对HCAEC的衰老具有明显的促进作用。
如图3所示，转染miR-375后的HASMC，即miR-375转染组与阴性对照组相比，β-gal染色阳性细胞(见图3中的蓝色点状物)的比例明显增加，具有明显的β-gal深染；miR-375转染组与阳性对照组(即miR-34a转染组)相比，同样具有了类似的较深的β-gal染色。可见，miR-375对HASMC的衰老具有明显的促进作用。
实施例3 过表达miR-375时其他衰老相关分子或表型的改变
由于β-gal染色只是衰老细胞的特征之一。为了进一步确认miR-375与血管衰老相关，发明人在HUVEC模型上检测了mir-375对于其他衰老相关分子或表型的影响。
本实施例中所使用的HUVEC细胞与主要试剂与实施例1相同。具体操作步骤如下：
1、蛋白质印迹法(Western blot)
1)HUVEC细胞转染后48小时裂解细胞，提取细胞总蛋白。
2)将总蛋白进行聚丙烯酰胺凝胶变性电泳。
3)蛋白转膜，5％的BSA封闭。
4)孵育p16和p21蛋白抗体。
5)二抗孵育。
6)洗脱，显带，其中以甘油醛-3-磷酸脱氢酶(glyceraldehyde-3-phosphatedehydrogenase，GAPDH)作为内参。
2、流式细胞术检测细胞周期
1)HUVEC细胞转染后48小时胰酶消化细胞。
2)收集消化过的细胞，用PBS清洗。
3)用碘化丙啶(PI)对细胞进行避光染色20分钟。
4)流式细胞仪检测各期DNA含量(激发波长：488nm，发射波长：610nm)，分析各样品细胞周期的分布。
5)结果分析。
3、实时PCR(real-time PCR，RT-PCR)检测细胞周期相关蛋白表达水平
1)细胞转染后48小时提取HUVEC细胞总RNA。
2)逆转录总RNA。
3)以逆转录的cDNA为模板，用目的基因的引物进行RT-PCR。
4、结果分析之细胞复制潜力检测
1)取30代的HUVEC细胞，分别转染目的miRNA。
2)此后每24小时对细胞进行一次计数，共计10天。
实验结果如下所示：
实验结果1：如图4所示，与阴性对照组(转染scramble的HUVEC细胞)相比，过表达miR-375的miR-375组HUVEC内皮细胞中的p21和p16蛋白水平明显升高，这表明了miR-375上调p21和p16这两个衰老标志分子的表达，提示miR-375有促进HUVEC细胞衰老的作用。
实验结果2：
通过使用流式细胞仪检测处在不同细胞周期的细胞数量，重复三次，取平均值。可以发现，与阴性对照组(转染scramble的HUVEC细胞)相比，在细胞周期上，过表达miR-375后的miR-375组使HUVEC内皮细胞产生G2/M阻滞现象。如图5所示，过表达miR-375后的miR-375组使HUVEC内皮细胞出现G2/M期阻滞。如图6所示，过表达miR-375后的miR-375组使HUVEC内皮细胞G2/M检验点关键的调节因子(cycliB1、CDC2、cyclinA2)表达下调。以上结果表明miR-375使内皮细胞阻滞于G2/M期。细胞周期阻滞是细胞衰老的前提，因此提示miR-375有促进HUVEC细胞衰老的作用。其中，图5和图6中的星号“★”表示t检验P值小于0.05，图5中的纵轴表示G2/M期细胞占细胞总数的百分比。
实验结果3：
如图7所示，与阴性对照组(转染scramble的HUVEC细胞)和Lipo组(仅用Lipo2000脂质体转染试剂处理)相比，过表达miR-375后的miR-375组中的HUVEC内皮细胞的复制潜力下降，这进一步说明了miR-375能够抑制HUVEC内皮细胞的生长，促进HUVEC内皮细胞的衰老。其中，图7中，纵轴表示HUVEC内皮细胞的倍增水平。
实施例4 miR-375抑制剂进行抗血管内皮细胞衰老的验证
根据实施例1-3的实验结果，发明人确认了miR-375具有促进血管细胞，尤其是血管内皮细胞衰老的作用。所以，本实施例在此基础上进一步验证了miR-375抑制剂是否具有延缓血管细胞衰老的作用。
本实施例中，除了miR-375抑制剂为miR-375的反义核酸(其序列为ucacgcgagccgaacgaacaaa)之外，本实施例以下步骤所使用的HUVEC内皮细胞和主要试剂与上述各实施例相同。
本实施例将转染scramble的HUVEC内皮细胞作为阴性对照组；将用双氧水(H2O2)处理并转染scramble的HUVEC内皮细胞作为阳性对照组；将给予miR-375抑制剂后，再用双氧水(H2O2)处理后的HUVEC内皮细胞作为miR-375抑制剂组。
其中，本实施例用到以下操作：
1、β-gal染色检测
具体操作步骤与实施例1中的β-gal染色检测一致。
2、流式细胞仪检测细胞周期
具体操作步骤与实施例3中的流式细胞仪检测细胞周期一致。
3、RT-PCR检测细胞周期相关蛋白表达水平
具体操作步骤与实施例3中的流式细胞仪检测细胞周期一致。
实验结果如下所示：
如图8所示，利用不同浓度(0μM(即μmol/L)、60μM、120μM)的H2O2处理过的HUVEC内皮细胞中，miR-375的表达均明显上升。其中，图8中，18h处的不同的柱按由左自右的顺序分表代表此处所使用的H2O2浓度分别为0μM、60μM和120μM，且0h、6h、12h、24h、36h、48h处的不同的柱按由左自右的顺序也分别代表此处所使用的H2O2浓度分别为0μM、60μM和120μM。
如图9所示，与阴性对照组(转染scramble)相比，阳性对照组(用H2O2处理并转染scramble)中HUVEC内皮细胞具有了明显的较深的β-gal染色，可见，H2O2加速了HUVEC内皮细胞的衰老；与阳性对照组相比，尽管miR-375抑制剂组也使用H2O2对HUVEC内皮细胞进行了处理，但是由于miR-375抑制剂组同时对该HUVEC内皮细胞给予了miR-375抑制剂，该miR-375抑制剂组的HUVEC内皮细胞仅仅具有非常浅的β-gal染色，即miR-375抑制剂组中的β-gal染色的HUVEC内皮细胞非常少，基本可与阴性对照组媲美。由此可见，过表达mir-375抑制剂能够抑制H2O2诱导的HUVEC内皮细胞衰老进程。
如图10所示，与阳性对照组(H2O2处理并转染scramble)相比，过表达miR-375抑制剂的miR-375抑制剂组能明显抑制H2O2诱导的HUVEC内皮细胞G2/M期细胞数量的增加；如图11所示，与阳性对照组(H2O2处理并转染scramble)相比，过表达miR-375抑制剂的miR-375抑制剂组能明显抑制H2O2诱导的HUVEC内皮细胞G2/M检验点关键的调节因子(cycliB1、CDC2、cyclinA2)表达下调。这表明了miR-375抑制剂具有明显的减缓HUVEC内皮细胞衰老的作用。
其中，图10和图11中的星号“★”表示t检验P值小于0.05；图10中的纵轴表示G2/M期细胞占总细胞数的百分比；图11中cycliB1处的不同的柱按由左自右的顺序分表代表阴性对照组、阳性对照组和miR-375抑制剂组的cycliB1的表达，相应地，CDC2和cyclinA2处的不同的柱按由左自右的顺序也分表代表阴性对照组、阳性对照组和miR-375抑制剂组的CDC2及cyclinA2的表达。
以上所述仅为本发明的较佳实施例，并不用以限制本发明的保护范围，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (8)

1.miR-375抑制剂在制备抗血管衰老药物中的应用。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述miR-375抑制剂为miR-375的反义核酸。
3.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述miR-375抑制剂为特异性结合miR-375的蛋白。
4.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述miR-375抑制剂为特异性干扰miR-375基因表达及加工的siRNA。
5.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述miR-375抑制剂为特异性干扰miR-375基因表达及加工的miRNA。
6.根据权利要求1-5任一项所述的应用，其特征在于，所述miR-375的核苷酸序列如序列表SEQ ID NO：1所示。
7.一种用于抗血管衰老的药物组合物，所述药物组合物包括有效量的miR-375抑制剂。
8.根据权利要求7所述的药物组合物，其特征在于，所述药物组合物还包括与所述miR-375抑制剂配伍的其他药类以及药学上可接受的载体和/或辅料。
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