CN109195637A - 用于治疗由高血糖引起的纤维化疾病的包含miRNA的药物载体 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及包含miR222的可药用载体的新治疗应用。具体地，本发明涉及包含微RNA miR222的细胞外囊泡(EV)在治疗由高血糖引起的纤维化疾病(例如糖尿病性肾病和/或肾纤维化)中的用途。

Description

用于治疗由高血糖引起的纤维化疾病的包含miRNA的药物 载体
本发明涉及纤维化疾病(fibrotic disease)的新治疗方法。更具体地，本发明涉及药物载体如来源于干细胞的细胞外囊泡(extracellular vesicle，EV)在治疗由高血糖引起的纤维化疾病中的用途。重点在于纤维化肾病，例如糖尿病性肾病。
在组织损伤后经常观察到纤维化。由高血糖诱发的纤维化是糖尿病患者中发现的一种特殊类型的纤维化。肾经常受到这种纤维化疾病的影响。
糖尿病是西方世界中慢性肾病(chronic kidney disease，CKD)的主要驱动因素，约占新病例的50％。接近40％的糖尿病患者患有糖尿病性肾病(diabetic nephropathy，DN)，其因此成为城市化国家中终末期肾病(end stage renal disease，ESRD)的主要原因。患有CKD的患者不仅患终末期肾病的风险提高，而且患心血管疾病和死亡的风险提高。即便进行严格的血糖控制和应用多种治疗方法，ESRD也可能出现，因此迫切地需要确定用于更好的DN管理的新靶标。
早期DN关键病理特征包括足细胞损伤/损失和系膜细胞(mesangial cell，MC)肥大。随后肾基质内肌成纤维细胞祖细胞群的扩增和提高的细胞外基质(extracellularmatrix，ECM)蛋白质合成导致肾小球基底膜增厚和肾小管-间质纤维化。
DN中的肾结构改变的特征在于早期肾小球细胞和肾小管细胞两者的增殖速率和晚期细胞外基质蛋白的积累，如胶原蛋白IV和纤连蛋白，导致肾小球膜质量的逐渐提高。
已经报道了miR的作用参与在包括DN在内的不同病理环境中的纤维化过程。miR21在系膜细胞扩增中得到了特别的关注。最近已经报道了2型糖尿病患者的尿液中的miR21也增加。已经报道了不同的miR21靶标参与胶原产生和纤维化。引起Akt-mTOR途径激活的PTEN上调看起来主要参与该过程。事实上，在现有技术中显示，用miR21干扰逆转了DN的临床前模型中的肾组织学异常。与其他基因类似，miR基因可以受转录因子的调控。在这方面，miR-21已被描述为Jurkat细胞以及响应于催乳素的乳腺细胞中的STAT5靶基因。另一方面，STAT5本身可以由不同的miR控制，包括miR222和miR223，这表明情况非常复杂。
临床和实验肾病学家正在不同的领域工作以改善CDK结果。特别地，使用体内和体外模型的基本研究目前正期望定义CKD进展为ESRD中所涉及的主要途径的分子基础并期望寻找抑制肾纤维化的新治疗方法。
不同来源的MSC是目前再生医学中研究最广泛的干细胞。尽管最初MSC被认为导向并植入受伤组织，在那里分化并替换受损细胞，但是目前，MSC移植的积极效果被证明是由于其释放营养介质的能力。一些研究已经专注于细胞外RNA(exRNA)转运蛋白，表明其可以以囊泡(包括外来体和微泡)的形式存在于生物体液中。由于这些囊泡具有不同的生物发生但共享重叠的特征和生物活性，因此已经建议使用包含性术语“细胞外囊泡”(EV)。由于保存良好的进化性细胞间通信机制，EV最近已经得到越来越多的关注。特别地，已经发现，当在再生医学中全身或局部施用时，干细胞来源的EV可以通过功能性RNA、miR、脂质和蛋白质的水平转移来模拟细胞的作用。从不同干细胞来源回收的EV可以完全或部分地共享其荷载物。此外，可以根据其来源检测miR或蛋白质的富集。
尽管一般性干细胞来源的EV功能已成为在多种病理环境中的最近研究的主题，但仅部分地研究了其如何机械地保护细胞免于破坏性信号，例如对高葡萄糖的响应。
WO2011/143499描述了肾干细胞及其细胞外囊泡(EV)在治疗纤维化中有效。
WO2015/052526描述了来自神经干细胞的微米粒(即细胞外囊泡，EV)用于治疗纤维化的作用。
为了寻找由高血糖引起的纤维化的新治疗方法，本发明人已经分析了从不同干细胞来源释放的EV对HG诱导的胶原产生的作用(其中“HG”代表“高葡萄糖(high glucose)”)，特别注意其对STAT5A miR21、miR222、miR100和TGFβ表达的作用。特别地，已经分析了糖尿病性肾病和肾纤维化的治疗。
如将在本说明书的实验部分中详细说明的，他们的研究结果显示从多种类型的干细胞中释放的EV保护系膜细胞免于HG诱导的胶原产生。特别地，本发明人注意到，EV通过转移被称为miR222的微RNA调节STAT5的表达，STAT5进而控制miR21、TGFb1表达和基质蛋白质合成。此外，本发明人发现，通过驱动受体细胞中miR21和miR100之间平衡的变化，EV也可以间接地有助于抑制胶原产生。这些结果表明，从多种干细胞释放的EV可以转移相关机械以保护系膜细胞免于HG介导的损伤。
因此，本发明的第一方面是携带miR222的可药用载体，其用于治疗由高血糖引起的纤维化疾病，特别是糖尿病性肾病和/或肾纤维化。还设想了治疗由高血糖引起的其他纤维化疾病，例如心肌病、非酒精性脂肪肝(Ban和Twigg，2009)特别是NASH(非酒精性脂肪性肝炎(non-alcoholic steatohepatitis))和糖尿病性视网膜病变。
根据本发明的一个优选实施方案，可药用载体还包含微RNA“miR100”。
miR222和miR100是本身已知的微RNA(miRNA)；它们的特征和序列可以在被称为miRBase的数据库中分别根据登记号MI0000299和MI0000102找到。
药物效果可归因于药物载体中包含的miRNA。设想用miRNA对靶细胞的任何有效转染有效的用于治疗由高血糖引起的纤维化疾病。miRNA的有效转染需要合适的药物载体，优选以微米粒或纳米粒的形式。这样的载体可商购获得，包括基于藻酸盐的微载体(GEM，Global Cell Solutions)、基于右旋糖酐的微载体(Cytodex，GE Healthcare)，基于胶原的微载体(Cultispher，Percell)和基于聚苯乙烯的微载体(SoloHill Engineering)。
作为替选方案，miRNA的药物载体可以是病毒载体。如例如在Ningning Yang.Anoverview of viral and nonviral delivery systems for microRNA.Int J PharmInvestig.2015十月至十二月；5(4)：179-181中所公开的，基于病毒的系统通常使用逆转录病毒、慢病毒、腺病毒或腺相关病毒(AVV)作为递送载体。因此，miRNA的合适载体的选择和使用完全在本领域技术人员的能力范围内。
miRNA的更优选的药物载体是囊泡，例如脂质体或细胞外囊泡(EV)。细胞外囊泡(例如来源于细胞的微泡或外来体)是最优选的药物载体。
因此，根据本发明的另一个优选实施方案，可药用载体是细胞外囊泡(EV)，其来源于干细胞，优选来源于成体干细胞，更优选来源于间充质干细胞(mesenchymal stem cell，MSC)，例如如骨髓基质干细胞、或脂肪干细胞(adipose stem cell，ASC)、或非卵圆形人肝祖细胞(human liver progenitor cell，HLSC)。HLSC和获得其的方法在作为WO2006126219公开的国际专利申请中公开。
本发明的另一方面是分离自干细胞的条件培养基的细胞外囊泡的组合物，所述条件培养基分离自优选成体干细胞的条件培养基，更优选间充质干细胞(MSC)或人肝干细胞(HLSC)的条件培养基，以用于治疗由高血糖引起的纤维化疾病，优选糖尿病性肾病、肾纤维化、心肌病或非酒精性脂肪肝特别是NASH、或糖尿病性视网膜病变。要求保护的组合物的细胞外囊泡优选地包含微RNA miR222和任选的微RNA miRNA100。
根据本发明使用的细胞外囊泡(EV)是天然存在的EV，或者作为替选，是经改造的EV，所述经改造的与天然存在的细胞外囊泡(EV)相比包含显著更高量的miR222或miR100，并且可通过将miR222或miR100离体负载至分离的细胞外囊泡获得。
作为EP 2010663公开的欧洲专利申请向本领域技术人员提供了关于如何用特定miRNA改造EV的说明。技术人员已知的将RNA引入囊泡或外来体中的技术是转染或共孵育。已知的转染方法是例如电穿孔、脂质转染、显微注射、通过病毒和非病毒载体转染、磁辅助转染和声致穿孔。因此，将离体引入miR222或miR100的经改造的EV是本发明的另一方面。
如在随后的实验部分中进一步详细说明的，评价与天然存在的细胞外囊泡(EV)相比显著更高量的miR222或miR100的合适方法是qPCR数据分析的ΔΔCT方法。
表示为相对值的负载效率(即存在于本发明的经改造的EV中的靶分子(即miR222或miR100)的量)与天然量相比为至少2倍。或者，负载效率可以以绝对值表示为每个EV负载的靶分子数。设想该值可以比天然量高约1×103至约1×105个靶分子/EV。
公开了本发明人用来源于MSC和HLSC的EV进行之实验的以下实验部分仅以说明的方式提供，并不意图限制由所附权利要求所确定的本发明的范围。
本发明人获得的结果证明了在系膜细胞中，HG通过STAT5A介导的途径驱动TGFβ的表达和胶原的产生。通过在HG中培养的系膜细胞中表达ΔNSTAT5构建体，本发明人证明STAT5A的激活控制miR21的表达。本发明人还示出，从MSC和HLSC释放的EV保护系膜细胞免于HG诱导的胶原产生。特别地，他们已经注意到，通过将miR222转移到系膜细胞，EV调节STAT5A的表达，STAT5A进而控制miR21含量、TGFβ表达和基质蛋白质合成。通过在HG条件下培养的系膜细胞中过表达miR222进一步证实了这些结果。此外，通过过表达miR100，本发明人证明了由于EV荷载物的转移引起的受体细胞中miR21和miR100之间的平衡的变化，从而导致mTOR下调和对TGFβ表达和胶原产生两者的损害。有趣的是，这些作用仅在HG培养的细胞中检测到。
实施例1
材料和方法
细胞培养
将人系膜细胞(MC)在含有1.0g/l D-葡萄糖(低葡萄糖，LG)的DMEM或含有25mM D-葡萄糖(高葡萄糖，HG)的DMEM中培养。MC还在存在MSC或HLSC来源的EV的情况下在不含胎牛血清(FBS)的DMEM LG和HG中培养24小时。在所有实验条件下使用相同数量的EV刺激MC(7000个EV/靶细胞)。
MSC和HLSC来源的EV的分离和定量
将MSC和HLSC在不含胎牛血清的EndoGRO培养基中培养24小时以从上清液中收集EV。在以3000g离心30分钟以除去碎片后，将无细胞上清液在4℃下以10000和100000g进行差异超速离心(Beckman Coulter Optima L-90K超速离心机；Beckman Coulter，Fullerton，CA，USA)3小时。EV新鲜使用或在重悬于补充有1％DMSO的DMEM后在-80℃下储存。在细胞实验之前，将冷冻的EV洗涤并通过100k g超速离心沉淀以除去DMSO。在新鲜的和经储存的EV之间没有观察到生物活性的差异。使用Bradford方法(Bio-Rad，Hercules，CA，USA)对EV的蛋白质含量进行定量。使用鲎变形细胞测定法(浓度＜0.1ng/ml)(CharlesRiver Laboratories，Inc.，Wilmington，MA，USA)测试任何可能的污染。使用NanoSightLM10(NanoSight Ltd，Minton Park UK)进行EV尺寸分布分析。使用激光光源照亮样品中的颗粒，并通过照相机捕获散射光并使用纳米粒跟踪分析(Nanoparticle TrackingAnalysis，NTA)进行分析。NTA根据布朗运动和扩散系数(Dt)自动跟踪颗粒并按颗粒大小进行分类。
细胞增殖
由三个不同操作者通过直接细胞计数来测定在有或无EV的情况下LG和HG条件两者下的细胞增殖。
Western印迹分析
如先前所述(Olgasi，2014)裂解MC并获得蛋白质浓度。对50μg蛋白质进行SDS-PAGE，将其转移到硝酸纤维素膜中并如先前所述(Olgasi，2014)进行处理。使用光密度分析来计算相对于肌动蛋白归一化的蛋白质水平的倍数诱导的差异。值被报告为相对量。
RNA分离和定量实时PCR(qRT-PCR)
根据制造商的说明使用TRIzol试剂(Invitrogen)从MC中分离总RNA。采用分光光度法(Nanodrop ND-1000，Wilmington，DE，USA)定量RNA。然后使用对miR-222具有特异性的TaqMan微RNA RT试剂盒或对miR-21和miR-100具有特异性的Syber Green微RNA RT试剂盒逆转录来自细胞的RNA。因此，使用TaqMan/Syber微RNA测定试剂盒和ABI PRISM 7700序列检测系统(Applied Biosystems，Foster City，CA，USA)对RNA进行qRT-PCR。将MiR表达相对于小核RNA RNU6B归一化。
用premiR-100和premiR-222转染MC
根据制造商的说明，在用pre-miR阴性对照或pre-miR100和premiR-222前体(Applied Biosystem)转染的系膜细胞中进行功能获得实验。然后对从这些样品的细胞裂解中提取的所有蛋白质进行western印迹，并用RT-PCR分析所有RNA。
miR从EV转移至MC
为了分析miR-222从EV至MC的转移，如先前由Yuan(Yuan，2009)所述进行miR转移实验。在不存在或存在用RNA酶预处理或不用RNA酶预处理的EV的情况下，将5×105个细胞/孔的MC与转录抑制剂α-鹅膏蕈碱(α-amanitin)(Lee，2004)一起孵育。将来自如上处理的MC的总RNA进行用于miR表达的qRT-PCR。作为miR转移的间接量度，本发明人确定了在不存在或存在用RNA酶预处理或不用RNA酶预处理的EV的情况下，α-鹅膏蕈碱处理的细胞之间Ct值的差异；阳性值表明miR转移至靶细胞内。如果未检测到信号，则将样品的Ct值指定为40。
显性阴性(ΔN)STAT5A构建体的转染。
在所选择的实验中，将在存在或不存在HG的情况下培养48小时的MC用ΔNSTAT5构建体瞬时转染(Defilippi，2005，Zeoli，2008)。然后处理细胞以获得细胞提取物用于Western印迹分析，或总RNA分离以评价miR21表达。
衰老测定
如先前所述(Togliatto，2010)，通过测量不同培养的N-ASC的酸性β-半乳糖苷酶活性来评价衰老。
统计分析
所有数据均表示为平均值或百分比±s.e.m。D’Agostino-Pearson检验用于测试正常性。对于患者和对照的生物计量测量、体外血管生成、迁移、黏附和衰老测定、miR表达、细胞增殖，功能丧失和功能获得实验以及最后用于western印迹的光密度分析的数据，对于两组比较使用Student’s t-检验进行分析，对于三个组，使用单因素方差分析然后进行Tukey’s多重比较检验。一式三份进行的三个实验是确保实验组之间90％的统计功效的最小样本大小，概率水平为0.05，双尾假设。统计显著性的截止值设定为P＜0.05(*P＜0.05，**P＜0.01，***P＜0.001)。使用GraphPad Prism version 5.04(GraphPadSoftware，Inc.，La Jolla，CA，USA)进行所有统计学分析。
结果
短期高葡萄糖刺激诱导系膜细胞(MC)增殖、IV型胶原产生和miR21表达。
为了模拟急性高血糖介导的系膜细胞损伤，将MC在高葡萄糖培养基(25mM)中培养48小时。分析增殖和衰老。如图1A所示，HG促进MC增殖的显著提高，如通过细胞数和细胞周期蛋白D1含量所示(图1B)。没有检测到衰老MC数量的变化(图1C)。MC胶原的产生是肾小球损伤的标志。因此，在用HG攻击的MC中评价胶原产生。对细胞总裂解物和上清液两者的western印迹分析显示与低葡萄糖处理的细胞相比，IV型胶原产生显著提高(图1D和E)。胶原产生的提高表明MC转变为纤维化分泌性表型。通过HG处理进一步提高了几乎不由MC产生的TGFβ(图1F)。miR 21是参与糖尿病性肾病的公知的miRNA，已知其诱导系膜细胞基质扩张。一致地是，发现HG处理诱导miR21表达(图1G)。研究了该信号传导途径的参与。本发明人发现，即使在用HG处理的MC中，也可以检测到高水平的mTOR(图1H)。
来自MSC和HLSC的EV抑制MC中的胶原产生和miR21表达
从MSC和HLSC中回收EV，并测定MC增殖和胶原产生。因此，将在LG或HG浓度中培养48小时的MC血清饥饿并进行EV处理18小时。如图2A所示，EV不干扰MC增殖。然而，当评价胶原产生时，从MSC和HLSC中回收的EV显著降低了胶原产生(图2B和C)。一致地，检测到miR21(图2D)、mTOR(图2E-F)和TGFβ表达(图2G-H)的下调。
MSC和HLSC来源的EV调节经受HG的MC中的STAT5A表达
来源于MSC和HLSC的EV影响miR21表达的观察结果使本发明人研究STAT5A是否可能参与其调节。为此，分析在存在或不存在EV的情况下用HG处理MC的STAT5A的激活。如图3A所示，STAT5A响应于HG处理而经历激活，其作用受到EV处理的抑制(图3B-C)。在这些实验条件下检测到STAT5A表达降低的观察结果强烈表明EV荷载物可调节其表达的可能性。为了研究这种可能性，向MC中转染ΔNSTAT5A构建体(图3D)并分析miR21表达。如图3E中所报告的，STAT5A激活的抑制引起HG处理的MC中miR21的下调。一致地，当在这些实验条件下分析胶原产生时，发现其表达几乎完全被抑制。有趣的是，还示出了STAT5A信号传导途径的抑制也阻止HG介导的TGFβ表达(图3F)。
EV miR荷载物调节STAT5A表达
先前已经报道了(Collino 2010)MSC和HLSC EV mimomic。本发明人研究了在来自这样的细胞来源的EV中表达的miR是否与凋节由HG激活的信号传导途径有关。其中包括miR222。据报道，miR222是STAT5A的直接转录后调节因子。因此，在用EV处理的HG培养的MC中评价miR222的表达。如图4A所示，miR222在HG处理后下调，而在EV处理后提高。这一取决于EV-miR222含量释放到MC中的效果通过在存在鹅膏蕈碱和用RNA酶处理或不用RNA酶处理的EV的情况下进行的实验证明。为了进一步证实这些结果，使用以premiR222转染并在HG条件下培养的MC进行功能获得实验。如所预期的，在HG处理的MC中，miR222的过表达导致STAT5A含量以及miR21细胞含量、TGFβ表达和胶原产生的急剧降低(图4D-F)。更重要的是，这样的事件没有在LG培养的MC中发生，表明特异性信号传导途径是由高血糖环境诱导的。
EV介导的miR21下调可以促进miR100转录后活性，这有助于抑制胶原产生
本发明人研究了miR100是否也可以参与EV介导的作用。首先，在进行EV处理的MC中评价miR100表达。如图5A所示，尽管在HG处理后miR100MC含量提高，但在EV处理后未检测到其含量的变化。然而，由于细胞内miR的平衡可以指导特定的生物反应，本发明人假设与EV处理相关的miR21细胞内含量降低可能对miR100转录后活性有益。为了验证该假设，在HG处理的MC中进行使用premiR100的功能获得实验。实际上，图5B中报道的数据表明，当miR100表达相对于miR21有利时，其可以驱动由mTOR下调介导的信号，引起对MC TGFβ表达和胶原产生的抑制(图5C-D)。此外，miR100过表达对LG培养的MC没有影响(图5C-D)。总的来说，这些数据表明，与EV处理相关的进入受体细胞内的miR含量的微调也可能参与其愈合特性。
实施例2
糖尿病性肾病的体内模型：用EV来源的干细胞(SC-EV)处理
进行了一项实验研究，以研究从不同干细胞来源或血清中释放的EV是否可能干扰实验性糖尿病性肾病的损害。为此，对小鼠进行链脲霉素(STZ)处理(35mg/kg，连续4天，腹膜内)以产生高血糖的动物模型。在零时间(T0)糖尿病发作后，对糖尿病小鼠进行5次EV处理(每次1×1010)，每周进行一次(T7、T14、T21和T28)。在糖尿病发作1个月后(T30，终点)测量以下参数：血糖、体重、尿白蛋白/肌酸酐比、尿pH、血浆肌酸酐(CREA)。另外，对肾进行以下组织学分析：肾小球和间质纤维化、肾小球面积、肾小囊腔(Bowman’s space)、肾小管损伤。所得结果如图6-8所示，其显示了对于以下每组小鼠获得的结果：10只健康小鼠；15只糖尿病小鼠(DN)；10只MSC-EV处理的小鼠；10只血清EV处理的小鼠；10只ASC-EV处理的小鼠和6只HLSC-EV处理的小鼠。
图6显示糖尿病小鼠中血浆肌酸酐提高，并且用所有EV源处理的小鼠中血浆肌酸酐显著降低。图7显示在用EV处理的糖尿病小鼠中，在肾小球内和间质空间中胶原沉积降低方面的显著改善。图8显示，与糖尿病小鼠相比，用所有受测EV处理引起肾小管损伤的相关改善。所有数据均表示为平均值±SEM。*：与DN相比，p＜0.05；**：与DN相比p＜0.001。此外，对于所有EV源，显示出ACR的显著降低和pH值的显著恢复。
实施例3
通过转染干细胞使细胞外囊泡富集miRNA：EV改造方法
为了在干细胞来源的EV中使miRNA含量富集，根据制造商的说明使用Neon转染系统(Invitrogen)通过电穿孔转染间充质干细胞(MSC)。将600pmol不存在于天然存在的MSC中的模拟物(即cel-miR-39)用于富集1×106个MSC，所述MSC接种在补充有胎牛血清(FCS)且不含抗生素的完全培养基中。使用乱序(scramble)模拟物作为阴性对照(SCR)。
第二天更换培养基，将转染的细胞用不含FCS的RPMI孵育过夜。收集上清液并以2,000g离心15分钟以除去细胞碎片和凋亡小体，然后使用截留分子量为3kDa的超滤单元(Amicon Ultra-PL 3，Millipore)在4℃下进行浓缩。含有EV的浓缩培养基(CM)补充有1％二甲基亚砜并保持在-80℃直至使用。
使用PEG在4℃下将含有EV的浓缩培养基沉淀过夜来进行RNA分析。EV沉淀用PBS1X洗涤两次，并使用RNA/DNA/蛋白质纯化plus试剂盒(Norgen Biotek)提取RNA。对RNA样品进行逆转录并用miScript PCR系统(Qiagen)进行定量实时PCR。使用RNU6B或RNU48作为管家对照(CTL)。来自用无靶标(cel-miR-39)和无乱序进行电穿孔之MSC的EV也用作另外的对照(EP)。
图9显示了通过应用qPCR数据分析的比较或ΔΔCT方法计算负载效率获得的结果，其用RQ(相对量)和倍数变化表示。
在qPCR数据分析的比较或ΔΔCT方法中，将从两个不同的实验RNA样品中获得的CT值直接相对于管家基因归一化，然后进行比较。首先，计算每个实验样品的目的基因和管家基因的CT值(ΔCT)之间的差异。然后，计算实验和对照样品ΔΔCT(即校准器)之间的ΔCT值的差异。
然后，两个样品之间目的基因表达的倍数变化为
RQ＝2-ΔΔCt
在所讨论的实验中，RQ计算如下：
ΔCT＝C伸标-CT参照(CT＝循环阈值)
其中靶标是cel-miR-39，参照是管家对照(RNU6B或RNU48)。
ΔΔCT＝ΔCT试验样品-ΔCT校准样品，其中校准样品是来源于未处理细胞的EV，试验样品是来自处理细胞的EV。
图9示出MSC可以通过电穿孔有效地负载miRNA分子，并且靶miRNA分子存在于MSC自身和来源于所负载MSC的EV两者中。负载至EV的靶miRNA的量比负载至MSC的靶miRNA的量低约100倍。
因此，表示为负载的靶分子数/EV的负载效率的合理估计值包含在1×103至1×105的范围内。
该范围的上限基于Fuhrmann等(2014)的图5a，其显示约104至105的负载效率，以及基于在用不同类型的miRNA转染MSC后获得的EV颗粒的NTA计数。
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Claims (20)

1.携带微RNA miR222的可药用载体，其用于治疗由高血糖引起的纤维化疾病。
2.根据权利要求1使用的所述可药用载体，其还携带微RNA miR100。
3.根据权利要求1或2使用的所述可药用载体，其中所述可药用载体是微米粒或纳米粒，并且其中所述微RNA包含在所述微米粒或纳米粒内或附着于所述微米粒或纳米粒的表面。
4.根据权利要求1至3中任一项使用的所述可药用载体，其中所述可药用载体是细胞外囊泡(EV)。
5.根据权利要求1至5中任一项使用的所述可药用载体，其中所述可药用载体是来源于干细胞的细胞外囊泡(EV)。
6.根据权利要求5使用的所述可药用载体，其中所述细胞外囊泡(EV)来源于成体干细胞。
7.根据权利要求6使用的所述可药用载体，其中所述细胞外囊泡(EV)来源于间充质干细胞(MSC)、非卵圆人肝祖细胞(HLSC)或脂肪干细胞(ASC)。
8.根据权利要求4至7中任一项使用的所述可药用载体，其中所述细胞外囊泡(EV)是天然存在的EV或经改造以包含miR222和任选的miR100的EV。
9.根据权利要求8使用的所述可药用载体，其中所述细胞外囊泡(EV)经改造以包含miR222和miR100。
10.根据权利要求1至9中任一项使用的所述可药用载体，其中所述纤维化疾病选自糖尿病性肾病、肾纤维化、心肌病、非酒精性脂肪肝特别是NASH、以及糖尿病性视网膜病变。
11.经改造的细胞外囊泡(EV)，其与天然存在的细胞外囊泡(EV)相比包含显著更高量的miR222或miR100，所述经改造的细胞外囊泡(EV)可通过离体地将miR222或miR100负载至分离的细胞外囊泡获得。
12.根据权利要求11所述的经改造的细胞外囊泡(EV)，其包含的miR222或miR100的量比存在于天然存在的细胞外囊泡(EV)中的量高1×103至1×105个分子/EV。
13.根据权利要求11所述的经改造的细胞外囊泡(EV)，其包含的miR222或miR100的量为存在于天然存在的细胞外囊泡(EV)中的量的至少2倍，如通过qPCR数据分析的ΔΔCT方法所测量的。
14.根据权利要求11至13中任一项所述的经改造的细胞外囊泡(EV)，其中所述细胞外囊泡已经从干细胞或体液中分离。
15.根据权利要求14所述的经改造的细胞外囊泡(EV)，其中所述干细胞是成体干细胞。
16.根据权利要求11至15中任一项的经改造的细胞外囊泡(EV)，其中已通过选自以下的转染方法将miR222或miR100引入到所述EV内：电穿孔、脂质转染、显微注射、通过病毒和非病毒载体转染、磁辅助转染、共孵育和声致穿孔。
17.组合物，其包含分离自干细胞的条件培养基的细胞外囊泡(EV)的混合物，其用于治疗由高血糖引起的纤维化疾病。
18.根据权利要求17所述的组合物，其中所述干细胞是成体干细胞。
19.根据权利要求18所述的组合物，其中所述成体干细胞是间充质干细胞(MSC)、非卵圆人肝祖细胞(HLSC)或脂肪干细胞(ASC)。
20.根据权利要求17至19中任一项所述的组合物，其中所述纤维化疾病选自糖尿病性肾病、肾纤维化、心肌病和非酒精性脂肪肝。
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