ES2861650T3

ES2861650T3 - Portadores farmacéuticos que contienen miARN para su uso en el tratamiento de enfermedades fibróticas provocadas por hiperglucemia

Info

Publication number: ES2861650T3
Application number: ES17725186T
Authority: ES
Inventors: Maria Felice Brizzi; Giovanni Camussi
Original assignee: Unicyte EV AG
Current assignee: Unicyte EV AG
Priority date: 2016-05-06
Filing date: 2017-05-04
Publication date: 2021-10-06
Anticipated expiration: 2037-05-04
Also published as: EP3777897A2; PL3452100T3; KR102467150B1; AU2017260660A1; US20190209619A1; EP3452100B1; US10716813B2; BR112018072797A2; DK3452100T3; JP7011605B2; EP3452100A1; KR20190005209A; EP3777897A3; EA201892536A1; WO2017191234A1; AU2017260660B2; EA037967B1; CN109195637A; CN109195637B; US20200222467A1

Abstract

Portador farmacéuticamente aceptable, que porta el microARN miR222, para su uso en el tratamiento de una enfermedad fibrótica provocada por hiperglucemia.

Description

DESCRIPCIÓN

Portadores farmacéuticos que contienen miARN para su uso en el tratamiento de enfermedades fibróticas provocadas por hiperglucemia

La presente invención se refiere a un nuevo tratamiento terapéutico de enfermedades fibróticas. Más en particular, la presente invención se refiere al uso de portadores farmacéuticos, tales como vesículas extracelulares (EV) derivadas de células madre, en el tratamiento de enfermedades fibróticas provocadas por hiperglucemia. Un enfoque se centra en enfermedades renales fibróticas tales como nefropatía diabética.

La fibrosis se observa con frecuencia después de lesión tisular. La fibrosis inducida por hiperglucemia es un tipo especial de fibrosis encontrado en pacientes diabéticos. El riñón se ve con frecuencia afectado por tales enfermedades fibróticas.

La diabetes es el factor impulsor principal de la enfermedad renal crónica (CKD) en los países occidentales, representando aproximadamente el 50% de los nuevos casos. Casi el 40% de los pacientes que padecen diabetes desarrollan nefropatía diabética (DN), que se ha convertido por tanto en la causa principal de enfermedad renal en estadio terminal (ESRD) en países urbanizados. Los pacientes con CKD corren un riesgo aumentado no solo de enfermedad renal en estadio terminal, sino también de enfermedad cardiovascular y muerte. Se necesita urgentemente identificar dianas novedosas para un mejor tratamiento de DN, dado que ESRD puede manifestarse a pesar de un control glucémico estricto y la aplicación de diversos enfoques terapéuticos.

Las características patológicas clave de DN en estadio inicial incluyen daño/pérdida de podocitos e hipertrofia de células mesangiales (MC). La posterior expansión de la población de progenitores de miofibroblastos dentro del estroma renal y el aumento de síntesis de proteínas de la matriz extracelular (ECM) conducen a engrosamiento de la membrana basal glomerular y a la fibrosis tubulointersticial.

La alteración de la estructura renal en DN se caracteriza por una tasa de proliferación temprana de células tanto glomerulares como tubulares y una acumulación tardía de proteínas de la matriz extracelular, tales como colágeno IV y fibronectina, que conduce a un aumento progresivo de la masa mesangial.

Se ha notificado que el papel de los miR contribuye al proceso fibrótico en diferentes contextos patológicos incluyendo DN. miR21 ha obtenido un interés particular en la expansión de células mesangiales. Recientemente se ha notificado que miR21 también está aumentado en la orina de pacientes con diabetes tipo 2. Se ha notificado que diferentes dianas de miR21 contribuyen a la producción de colágeno y a la fibrosis. La regulación por incremento de PTEN que da como resultado la activación de la ruta de Akt-mTOR parece contribuir principalmente a este proceso. De hecho, en la técnica anterior se mostró que la interferencia con miR21 revierte las anomalías histológicas del riñón en un modelo preclínico de DN. Los genes de miR, como otros genes, pueden regularse mediante factores de transcripción. Con respecto a esto, se ha descrito miR-21 como un gen diana de STAT5 en células Jurkat así como en células de mama en respuesta a prolactina. Por otro lado, el propio STAT5 puede controlarse mediante diferentes miR, incluyendo miR222 y miR223, lo cual sugiere que la situación es extremadamente compleja.

Nefrólogos clínicos y experimentales están trabajando en diferentes campos para mejorar los desenlaces de CDK. En particular, la investigación esencial, usando modelos in vivo e in vitro, está actualmente intentando definir la base molecular para las rutas principales implicadas en la progresión de CKD para dar ESRD y encontrar nuevos enfoques terapéuticos para inhibir la fibrosis renal.

MSC de diferentes orígenes son actualmente las células madre más ampliamente estudiadas en medicina regenerativa. Aunque originalmente se pensó que las MSC se dirigían a, y se injertaban en, tejidos lesionados, en los que se diferencian y sustituyen a células dañadas, actualmente se demostró que los efectos positivos del trasplante de MSC resultan de su capacidad para liberar mediadores tróficos. Varios estudios se han centrado en transportadores de ARN extracelular (ARNex), indicando que pueden estar presentes en líquidos biológicos en forma de vesículas incluyendo exosomas y microvesículas. Dado que estas vesículas tienen una biogénesis distinta pero comparten actividades biológicas y características solapantes, se ha sugerido el uso del término inclusivo “vesículas extracelulares” (EV). Las EV han obtenido recientemente una atención aumentada como mecanismos de comunicación entre células conservados de manera evolutiva. En particular, se ha encontrado que las EV derivadas de células madre pueden imitar el efecto de las células mediante la transferencia horizontal de ARN funcionales, miR, lípidos y proteínas cuando se administran de manera sistémica o local en medicina regenerativa. Las EV recuperadas a partir de diferentes fuentes de células madre pueden compartir completa o parcialmente su carga útil. Además, el enriquecimiento de miR o proteínas puede detectarse dependiendo de su origen. Aunque las funciones de EV derivadas de células madre generales ha sido objeto de recientes estudios en diversos entornos patológicos, solo se ha investigado parcialmente cómo protegen de manera mecanística las células frente a señales dañinas, tal como en respuesta a un alto contenido en glucosa.

El documento WO2011/143499 describe que células madre renales y las vesículas extracelulares (EV) de las mismas son eficaces en el tratamiento de fibrosis.

El documento WO2015/052526 describe el efecto de micropartículas (es decir vesículas extracelulares, EV) a partir de células madre neuronales para el tratamiento de fibrosis.

YAN WANG et al., Stem Cell Research & Therapy, vol. 45, n.° 1, 22 de diciembre de 2015, página 256, dan a conocer que las microvesículas derivadas de células madre mesenquimatosas de médula ósea tratadas con eritropoyetina reducen la fibrosis en células epiteliales de túbulos proximales renales humanas HK2 y en el riñón de ratones que padecen enfermedad renal crónica inducida por obstrucción uretral unilateral.

JUAN HE et al., Nephrology, vol. 17, n.° 5, 24 de julio de 2012, páginas 493-500, dan a conocer que las microvesículas derivadas de MSC pueden prevenir la fibrosis renal en un modelo de ratón de nefrectomía.

Con el fin de buscar un nuevo enfoque terapéutico para la fibrosis provocada por hiperglucemia, los presentes inventores han analizado los efectos de EV liberadas a partir de diferentes fuentes de células madre sobre la producción de colágeno inducida por HG (donde “HG” significa “alto contenido en glucosa”), prestando particular atención a sus efectos sobre la expresión de miR21, miR222, miR100 y TGFp de STAT5A. En particular, se ha analizado el tratamiento de nefropatía diabética y fibrosis renal.

Tal como se ilustrará en detalle en la sección experimental de la presente descripción, los resultados de sus estudios mostraron que las EV liberadas a partir de diversos tipos de células madre protegen a las células mesangiales frente a la producción de colágeno inducida por HG. En particular, los inventores constataron que las EV, mediante transferencia del microARN denominado miR222, regulan la expresión de STAT5 que a su vez controla la expresión de miR21, TGFb1 y la síntesis de proteínas de la matriz. Además, los inventores encontraron que las EV, mediante impulso de cambios en el equilibrio entre miR21 y miR100 en la célula receptora, también pueden contribuir indirectamente a la inhibición de la producción de colágeno. Estos resultados indican que las EV liberadas a partir de diversas células madre pueden transferir la maquinaria relevante para proteger a células mesangiales frente al daño mediado pro HG.

Por tanto, un primer aspecto de la presente invención es un portador farmacéuticamente aceptable que porta miR222, para su uso en el tratamiento de una enfermedad fibrótica provocada por hiperglucemia, en particular nefropatía diabética y/o fibrosis renal. También se prevé el tratamiento de otras enfermedades fibróticas provocadas por hiperglucemia, tales como miocardiopatía, hígado graso no alcohólico (Ban y Twigg, 2009), en particular NASH (esteatohepatitis no alcohólica), y retinopatía diabética.

Según una realización preferida de la invención, el portador farmacéuticamente aceptable comprende además el microARN “miR100”.

miR222 y miR100 son microARN (miARN) conocidos en sí mismos; sus características y secuencias pueden encontrarse, por ejemplo, en la base de datos denominada miRBase, con los números de registro MI0000299 y MI0000102, respectivamente.

El efecto farmacéutico puede atribuirse a los miARN contenidos en el portador farmacéutico. Se prevé cualquier transfección eficiente de la célula diana con miARN para su uso eficaz en el tratamiento de enfermedades fibróticas provocadas por hiperglucemia. Una transfección eficiente de miARN requiere un portador farmacéutico apropiado, preferiblemente en forma de una micro o nanopartícula. Tales portadores están comercialmente disponibles, incluyendo microportadores basados en alginato (GEM, Global Cell Solutions), basados en dextrano (Cytodex, GE Healthcare), basados en colágeno (Cultispher, Percell) y basados en poliestireno (SoloHill Engineering).

Como alternativa, un portador farmacéutico para miARN puede ser un vector viral. Los sistemas basados en virus usan habitualmente retrovirus, lentivirus, adenovirus o virus adenoasociados (AVV) como vectores de suministro, tal como se da a conocer, por ejemplo, en Ningning Yang. An overview of viral and nonviral delivery systems for microRNA. Int J Pharm Investig. octubre-diciembre de 2015; 5(4): 179-181. Por tanto, la selección y el uso de un portador adecuado para el miARN se encuentran dentro de las capacidades del experto en la técnica.

Un incluso portador farmacéutico más preferido para los miARN es una vesícula, tal como un liposoma o una vesícula extracelular (EV). Las vesículas extracelulares, tales como microvesículas o exosomas derivados de células, son los portadores farmacéuticos más preferidos.

Por tanto, según otra realización preferida de la invención, el portador farmacéuticamente aceptable es una vesícula extracelular (EV) derivada de una célula madre, preferiblemente de una célula madre adulta, más preferiblemente de una célula madre mesenquimatosa (MSC), tal como por ejemplo una célula madre estromal de médula ósea, o una célula madre adiposa (ASC), o una célula progenitora hepática humana no ovalada (HLSC). HLSC y un método de obtención de las mismas se dan a conocer en la solicitud de patente internacional publicada como documento WO2006126219.

Un aspecto adicional de la descripción, que no se encuentra dentro del alcance de la invención, es una composición de vesículas extracelulares aisladas a partir del medio acondicionado de una célula madre, preferiblemente del medio acondicionado de una célula madre adulta, más preferiblemente del medio acondicionado de una célula madre mesenquimatosa (MSC) o una célula madre hepática humana (HLSC), para su uso en el tratamiento de una enfermedad fibrótica provocada por hiperglucemia, preferiblemente nefropatía diabética, fibrosis renal, miocardiopatía o hígado graso no alcohólico en particular NASH, o retinopatía diabética. Las vesículas extracelulares de la composición dada a conocer contienen preferiblemente el microARN miR222 y opcionalmente el microARN miRNA100.

La vesícula extracelular (EV) es una EV que se produce de manera natural o, alternativamente, una EV que se ha modificado por ingeniería para contener una cantidad significativamente superior de miR222 o miR100 en comparación con la vesícula extracelular (EV) que se produce de manera natural, y que puede obtenerse cargando miR222 o miR100 en una vesícula extracelular aislada ex vivo.

La solicitud de patente europea publicada como documento EP 2010663 proporciona al experto en la técnica instrucciones sobre cómo modificar por ingeniería las EV con miARN específicos. Técnicas conocidas por el experto que introduce ARN en vesículas o exosomas son la transfección o la incubación conjunta. Métodos de transfección conocidos son, por ejemplo, electroporación, lipofección, microinyección, transfección mediante vectores virales y no virales, transfección asistida por imanes y sonoporación. Por consiguiente, una EV modificada por ingeniería en la que se ha introducido miR222 o miR100 ex vivo es otro aspecto de la invención.

Tal como se ilustra en más detalle en la siguiente parte experimental, un método adecuado para evaluar la cantidad significativamente superior de miR222 o miR100 en comparación con la vesícula extracelular (EV) que se produce de manera natural es el método de AACT de análisis de datos por qPCR.

Expresada como valor relativo, la eficiencia de carga, es decir, la cantidad de molécula diana (es decir, o bien miR222 o bien miR100) que está presente en la EV modificada por ingeniería de la invención en comparación con la cantidad natural es de al menos 2 veces. Alternativamente, la eficiencia de carga puede expresarse en términos absolutos como el número de moléculas diana cargadas por EV. Se prevé que este valor puede oscilar entre aproximadamente 1x103 y aproximadamente 1x105 moléculas diana/EV, superior a la cantidad natural.

La siguiente parte experimental, que da a conocer los experimentos llevados a cabo por los inventores con EV derivadas de MSC y HLSC, se proporciona únicamente a modo de ilustración y no se pretende que limite el alcance de la invención tal como se determina por las reivindicaciones adjuntas.

Los resultados obtenidos por los inventores demostraron que, en células mesangiales, HG impulsa la expresión de TGFp y la producción de colágeno mediante una ruta mediada por STAT5A. Expresando un constructo de ANSTAT5 en células mesangiales cultivadas en HG, los inventores demostraron que la activación de STAT5A controla la expresión de miR21. Los inventores también han mostrado que las EV liberadas a partir de MSC y HLSC protegen a las células mesangiales frente a la producción de colágeno inducida por HG. En particular, han constatado que las EV, mediante transferencia de miR222 a células mesangiales, regulan la expresión de STAT5A que a su vez controla el contenido en miR21, la expresión de TGFp y la síntesis de proteínas de la matriz. Estos resultados se confirmaron adicionalmente mediante sobreexpresión de miR222 en células mesangiales cultivadas en condiciones de HG. Además, mediante sobreexpresión de miR100, los inventores demostraron que cambios en el equilibrio entre miR21 y miR100 en la célula receptora, resultantes de la transferencia de carga útil de EV, conducen a la regulación por disminución de mTOR y a la alteración tanto de la expresión de TGFp como de la producción de colágeno. De manera interesante, estos efectos solo se detectaron en células cultivadas con HG.

EJEMPLO 1

MATERIALES Y MÉTODOS

Cultivos celulares

Se cultivaron células mesangiales (MC) humanas en DMEM con D-glucosa 1,0 g/l (bajo contenido en glucosa, LG) o DMEM con D-glucosa 25 mM (alto contenido en glucosa, HG). También se cultivaron MC en DMEM LG y HG sin suero bovino fetal (FBS) durante 24 horas en presencia de EV derivadas de MSC o HLSC. Se usó el mismo número de EV para estimular las MC en todas las condiciones experimentales (7000 EV/ célula diana).

Aislamiento y cuantificación de EV derivadas de MSC y HLSC

Se cultivaron MSC y HLSC en medio EndoGRO, sin suero bovino fetal, durante 24 h con el fin de recoger EV a partir de los sobrenadantes. Después de centrifugarse a 3000 g durante 30 min para eliminar residuos, se sometieron sobrenadantes libres de células a ultracentrifugación diferencial a 10.000 y 100.000 g (ultracentrífuga Beckman Coulter Optima L-90K; Beckman Coulter, Fullerton, CA, EE. UU.) durante 3 h a 4°C. O bien se usaron EV recién preparadas o bien se almacenaron a -80°C después de su resuspensión en DMEM que se suministró con DMSO al 1% (Deregibus 2007). Se lavaron las EV congeladas y se sedimentaron mediante ultracentrifugación a 100.000 g para eliminar DMSO antes de los experimentos celulares. No se observó ninguna diferencia en la actividad biológica entre EV recién preparadas y almacenadas. El contenido en proteínas de las EV se cuantificó usando el método de Bradford (Bio-Rad, Hercules, CA, EE. UU.). Se sometió a prueba cualquier posible contaminación usando un ensayo de amebocitos de Limulus (concentración <0,1 ng/ml) (Charles River Laboratories, Inc., Wilmington, MA, EE. UU.). Se realizó un análisis de distribución de tamaño de EV usando un dispositivo NanoSight LM10 (NanoSight Ltd, Minton Park, RU). Se iluminaron las partículas en las muestras usando una fuente de luz de láser y se captó la luz dispersada mediante cámara y se analizó usando un análisis de seguimiento de nanopartículas (NTA). El NTA realizó un seguimiento y dimensionamiento automático de partículas según el movimiento browniano y el coeficiente de difusión (Dt).

Proliferación celular

Se sometió a ensayo la proliferación celular en condiciones tanto de LG como de HG con o sin EV mediante recuento de células directo por tres operarios diferentes.

Análisis de inmunotransferencia de tipo Western

Se sometieron las MC a lisis y se obtuvieron las concentraciones de proteínas tal como se describió anteriormente (Olgasi, 2014). Se sometieron 50 |ig de proteínas a SDS-PAGE, se transfirieron a membranas de nitrocelulosa y se procesaron tal como se describió anteriormente (Olgasi, 2014). Se usó un análisis densitométrico para calcular las diferencias en la inducción en veces de niveles de proteínas que se normalizaron con respecto a actina. Los valores se notifican como cantidades relativas.

Aislamiento de ARN y PCR en tiempo real cuantitativa (qRT-PCR)

Se aisló ARN total a partir de MC usando el reactivo TRIzol (Invitrogen) según las instrucciones del fabricante. Se cuantificó el ARN de manera espectrofotométrica (dispositivo Nanodrop ND-1000, Wilmington, DE, EE. UU.). Después se sometió ARN procedente de células a transcripción inversa usando el kit de RT de microARN de TaqMan específico para miR-222, o kit de RT de microARN de Syber Green específico para miR-21 y miR-100. Por tanto, se sometió ARN a qRT-PCR usando un kit de ensayo de microARN de TaqMan/Syber y el sistema de detección de secuencias ABI PRISm 7700 (Applied Biosystems, Foster City, CA, EE. UU.). Se normalizó la expresión de miR con respecto al ARN nuclear pequeño, RNU6B.

Transfección de MC con pre-miR-100 y pre-miR-222

Se realizaron experimentos de ganancia de función en células mesangiales transfectadas o bien con el control negativo de pre-miR o bien con el precursor pre-miR100 y pre-miR-222 (Applied Biosystem), según las instrucciones del fabricante. Después se sometieron todas las proteínas extraídas a partir de la lisis celular de estas muestras a inmunotransferencia de tipo Western y se analizaron todos los ARN con RT-PCR.

Transferencia de miR desde EV hasta MC

Con el fin de analizar la transferencia de miR-222 desde EV hasta MC, se llevaron a cabo experimentos de transferencia de miR tal como se describió anteriormente por Yuan (Yuan, 2009). Se incubaron 5*105 células/pocillo de MC con un inhibidor transcripcional, a-amanitina, (Lee, 2004) en ausencia o en presencia de EV previamente tratadas o no con ARNasa. Se sometió el ARN total procedente de MC, tratadas como anteriormente, a qRT-PCR para determinar la expresión de miR. Como medida indirecta de la transferencia de miR, los inventores determinaron la diferencia en los valores de Ct entre células tratadas con a-amanitina en ausencia o en presencia de EV previamente tratadas o no con ARNasa; un valor positivo indicó la transferencia de miR al interior de células diana. Si no se detectó ninguna señal, se asignó un valor de Ct de 40 a la muestra.

Transfección de constructo dominante negativo (AN) STAT5A.

En experimentos seleccionados, MC cultivadas durante 48 horas en presencia o ausencia de HG se transfectaron transitoriamente con el constructo ANSTAT5 (Defilippi, 2005, Zeoli, 2008). Después se procesaron las células para obtener extractos celulares para el análisis por inmunotransferencia de tipo Western o aislamiento de ARN total para evaluar la expresión de miR21.

Ensayo de senescencia

La senescencia del ensayo de senescencia se evaluó midiendo la actividad de p-galactosidasa ácida de N-ASC que se cultivaron de manera diferente, tal como se describió anteriormente (Togliatto, 2010).

Análisis estadístico

Todos los datos se presentan como media o porcentaje ± e.e.m. Se usó la prueba de D'Agostino-Pearson para someter a prueba la normalidad. Los datos sobre medidas biométricas de pacientes y controles, sobre los ensayos in vitro angiogénico, de migración, adhesión y senescencia, sobre los experimentos de expresión de miR, proliferación celular, pérdida y ganancia de función y finalmente sobre el análisis densitométrico para inmunotransferencias de tipo Western, se analizaron usando pruebas de la t de Student para comparaciones de dos grupos y usando análisis de varianza de un factor, seguido por la prueba de comparaciones múltiples de Tukey, para 3 grupos. Tres experimentos realizados por triplicado fueron el tamaño de muestra mínimo que garantizó una potencia estadística del 90% entre grupos experimentales, con un nivel de probabilidad de 0,05, hipótesis de dos colas. El punto de corte para la significación estadística se estableció a P<0,05 (*P<0,05, **P<0,01, ***P<0,001). Todos los análisis estadísticos se llevaron a cabo usando GraphPad Prism, versión 5.04 (GraphPad Software, Inc., La Jolla, CA, EE. UU.).

RESULTADOS

La estimulación con alto contenido en glucosa a corto plazo induce la proliferación de células mesangiales (MC), la producción de colágeno tipo IV y la expresión de miR21.

Para imitar el daño de células mesangiales mediado por hiperglucemia aguda, se cultivaron MC en medio con alto contenido en glucosa (25 mM) durante 48 horas. Se analizaron la proliferación y la senescencia. Tal como se muestra en la figura 1A, HG fomenta un aumento significativo en la proliferación de MC tal como se muestra mediante el número de células y mediante el contenido en ciclina D1 (figura 1B). No se detectó ningún cambio en el número de MC senescentes (figura 1C). La producción de colágeno de MC es un rasgo distintivo del daño glomerular. Por tanto, se evaluó la producción de colágeno en MC expuestas a HG. Los análisis por inmunotransferencia de tipo Western tanto en lisados totales de células como en sobrenadantes mostraron un aumento significativo en la producción de colágeno tipo IV en comparación con células tratadas con bajo contenido en glucosa (figuras 1D y E). El aumento en la producción de colágeno indica un desplazamiento de MC hacia un fenotipo secretante fibrótico. El TGFp, ya apenas producido por MC, se aumentó adicionalmente mediante el tratamiento con HG (figura 1F). Se sabe que miR 21, un miARN bien conocido implicado en la nefropatía diabética, induce expansión de la matriz de células mesangiales. De manera compatible, se encontró que el tratamiento con HG induce la expresión de miR21 (figura 1G). Se investigó la implicación de esta ruta de señalización. Los inventores encontraron que, incluso en MC tratadas con HG, podía detectarse un alto nivel de mTOR (figura 1H).

Las EV procedentes de MSC y HLSC inhiben la producción de colágeno y la expresión de miR21 en las MC

Se recuperaron EV a partir de MSC y HLSC y se sometieron a ensayo con la proliferación de MC y la producción de colágeno. Por tanto, se cultivaron MC en concentración LG o HG durante 48 horas, se sometieron a privación de suero y se sometieron a tratamiento de EV durante 18 horas. Tal como se muestra en la figura 2A, las EV no interfirieron con la proliferación de MC. Sin embargo, cuando se evaluó la producción de colágeno, las EV recuperadas a partir de MSC y HLSC redujeron significativamente la producción de colágeno (figuras 2B y C). De manera compatible, se detectó la regulación por disminución de la expresión de miR21 (figura 2D), mTOR (figuras 2E-F) y TGFp (figuras 2G-H).

Las EV derivadas de MSC y HLSC regulan la expresión de STAT5A en MC sometidas a HG

La observación de que las EV derivadas de MSC y HLSC afectan a la expresión de miR21 condujo a los inventores a investigar si STAT5A podía estar implicado en su regulación. Para ello, se analizaron MC tratadas con HG en presencia o en ausencia de EV para detectar la activación de STAT5A. Tal como se muestra en la figura 3A, STAT5A experimentó activación en respuesta al tratamiento con HG, efecto que se inhibió mediante tratamiento con EV (figuras 3B-C). La observación de que se detectó una expresión de STAT5A reducida en estas condiciones experimentales sugiere fuertemente la posibilidad de que la carga útil de EV puede regular su expresión. Para investigar esta posibilidad, se transfectó un constructo de ANSTAT5A en MC (figura 3D) y se analizó la expresión de miR21. Tal como se notifica en la figura 3E, la inhibición de la activación de STAT5A condujo a la regulación por disminución de miR21 en MC tratadas con HG. De manera compatible, cuando se analizó la producción de colágeno en estas condiciones experimentales, se encontró que su expresión se había suprimido casi completamente. De manera interesante, también se demostró que la inhibición de la ruta de señalización de STAT5A también previene la expresión de TGFp mediada por HG (figura 3F).

La carga útil de miR de EV regula la expresión de STAT5A

Anteriormente se ha notificado sobre la mirnómica de EV de MSC y HLSC (Collino 2010). Los inventores investigaron si los miR expresados en EV procedentes de tales fuentes celulares pueden resultar relevantes en la regulación de la ruta de señalización activada por HG. Entre ellos se incluye miR222. Se ha notificado que miR222 es un regulador postranscripcional directo de STAT5A. Por tanto, se evaluó la expresión de miR222 en MC cultivadas con HG tratadas con EV. Tal como se muestra en la figura 4A, miR222 está regulado por disminución tras el tratamiento con HG, mientras que aumenta tras el tratamiento con EV. El hecho de que este efecto dependía de la liberación del contenido de EV-miR222 al interior de MC se demostró mediante experimentos realizados en presencia de amanitina y EV previamente tratadas o no con ARNasa (figura 4B). Para confirmar adicionalmente estos resultados, se realizaron experimentos de ganancia de función usando MC transfectadas con pre-miR222 y cultivadas en condiciones de HG. Tal como se esperaba, la sobreexpresión de miR222 condujo a una drástica reducción del contenido de STAT5A así como del contenido celular de miR21, la expresión de TGFp y la producción de colágeno en MC tratadas con HG (figuras 4D-F). De manera más importante, tal acontecimiento no se produjo en MC cultivadas con LG, indicando que se induce una ruta de señalización específica mediante el medio hiperglucémico.

La regulación por disminución de miR21 mediada por EV puede fomentar la actividad postranscripcional de miR100, lo cual contribuye a la inhibición de la producción de colágeno

Los inventores investigaron si miR100 también podía contribuir a efectos mediados por EV. En primer lugar, se evaluó la expresión de miR100 en MC sometidas a tratamiento con EV. Tal como se muestra en la figura 5A, aunque el contenido en MC de miR100 aumentó tras el tratamiento con HG, no pudo detectarse ningún cambio en su contenido después del tratamiento con EV. Sin embargo, dado que el equilibrio de miR intracelulares puede dirigir respuestas biológicas específicas, los inventores plantearon la hipótesis de que el contenido intracelular en miR21 reducido asociado con el tratamiento con EV podía beneficiar a la actividad postranscripcional de miR100. Para validar esta hipótesis se realizaron experimentos de ganancia de función usando pre-miR100 en MC tratadas con HG. De hecho, los datos notificados en la figura 5B demuestran que, cuando se favorece la expresión de miR100 con respecto a miR21, esto puede impulsar señales, mediadas mediante regulación por disminución de mTOR, que dan como resultado la inhibición de la expresión de TGFp y la producción de colágeno en MC (figuras 5C-D). De nuevo, la sobreexpresión de miR100 no tuvo ningún impacto sobre MC cultivadas con LG (figuras 5C-D). De manera colectiva, estos datos indican que el ajuste fino del contenido en miR en células receptoras, asociado con el tratamiento con EV, también puede contribuir a sus propiedades de curación.

EJEMPLO 2

Modelo in vivo de nefropatía diabética: tratamiento con EV derivadas de células madre (SC-EV)

Se llevó a cabo un estudio experimental con el fin de investigar si las EV liberadas a partir de diferentes fuentes de células madres o suero pueden interferir con el daño en una nefropatía diabética experimental. Para ello, se sometieron ratones a tratamiento con estreptozocina (STZ) (35 mg/kg durante 4 días consecutivos, i.p.) para producir un modelo de animal de hiperglucemia. Después de la aparición de diabetes en el tiempo cero (T0), se sometieron los ratones diabéticos a 5 tratamientos con EV (1x1010 cada uno) una vez por semana (T7, T14, T21 y T28). Se midieron los siguientes parámetros después de 1 mes desde la aparición de la diabetes (T30, punto final): glucemia, peso, razón de albúmina/creatinina en orina, pH en orina, creatinina en plasma (CREA). Adicionalmente, se sometieron los riñones a los siguientes análisis histológicos: fibrosis glomerular e intersticial, área glomerular, espacio de Bowman, daño tubular. Los resultados obtenidos se ilustran en las figuras 6-8, que muestran los resultados obtenidos para cada uno de los siguientes grupos de ratones: 10 ratones sanos; 15 ratones diabéticos (DN); 10 ratones tratados con MSC-EV; 10 ratones tratados con EV de suero; 10 ratones tratados con ASC-EV y 6 ratones tratados con HLSC-EV.

La figura 6 muestra que la creatinina en plasma aumentó en ratones diabéticos y que se produjo una reducción significativa en la creatinina en plasma en ratones tratados con todas las fuentes de EV. La figura 7 muestra que se produjo una mejora significativa en cuanto a la reducción de la deposición de colágeno dentro de los glomérulos y en el espacio intersticial en ratones diabéticos tratados con EV. La figura 8 muestra que el tratamiento con todas las EV sometidas a prueba condujo a una mejora relevante del daño tubular en comparación con ratones diabéticos. Todos los datos se expresan como media ± EEM. * p < 0,05, frente a DN, **p < 0,001 frente a DN. Además, para todas las fuentes de EV se mostró una reducción significativa de ACR y una restauración significativa de los valores de pH.

EJEMPLO 3

Enriquecimiento de vesículas extracelulares con miARN mediante transfección de células madre: método para la modificación por ingeniería de EV

Con el fin de enriquecer el contenido de miARN en EV derivadas de células madre, se transfectaron células madre mesenquimatosas (MSC) mediante electroporación usando el sistema de transfección Neon (Invitrogen) según las instrucciones del fabricante. Se usaron 600 pmol de un agente mimético que no está presente en MSC que se producen de manera natural, es decir cel-miR-39, para enriquecer 1 x 106 MSC que se sembraron en medio completo complementado con suero de ternero fetal (FCS) y sin antibióticos. Se usó un agente mimético reorganizado al azar como control negativo (SCR).

Al día siguiente se remplazó el medio y se incubaron las células transfectadas durante la noche con RPMI sin FCS. Se recogió el sobrenadante y se centrifugó a 2.000 g durante 15 minutos para eliminar el residuo celular y los cuerpos apoptóticos y después se concentró a 4°C usando unidades de ultrafiltración (Amicon Ultra-PL 3, Millipore) con un punto de corte de peso molecular de 3 kDa. Se complementó un medio concentrado (CM) que contenía EV con dimetilsulfóxido al 1% y se mantuvo a -80°C hasta su uso.

Se llevó a cabo el análisis de ARN mediante precipitación del medio concentrado que contenía EV usando PEG a 4°C durante la noche. Se lavó el sedimento de EV dos veces con PBS 1X y se extrajo el ARN usando el kit RNA/DNA/Protein Purification Plus (Norgen Biotek). Se sometieron muestras de ARN a retrotranscripción y se realizó PCR en tiempo real cuantitativa con el sistema de PCR miScript (Qiagen). Se usaron RNU6B o RNU48 como controles de mantenimiento (CTL). También se usaron como control adicional (EP) EV procedentes de MSC sometidas a electroporación sin diana (cel-miR-39) y sin reorganización al azar.

La figura 9 muestra los resultados obtenidos, expresados en cuanto a RQ (cantidad relativa) y cambio en veces, obtenidos aplicando el método comparativo o de AACT de análisis de datos de qPCR para calcular la eficiencia de carga.

En el método comparativo o de AACT de análisis de datos de qPCR, se normalizan directamente los valores de CT obtenidos a partir de dos muestras de ARN experimentales diferentes con respecto a un gen de mantenimiento y después se comparan. En primer lugar, se calcula la diferencia entre los valores de CT (ACT) del gen de interés y el gen de mantenimiento para cada muestra experimental. Después, se calcula la diferencia en los valores de ACT entre las muestras experimental y de control AACT (es decir, calibradores).

Entonces, el cambio en veces en la expresión del gen de interés entre las dos muestras es RQ = 2'AACt.

En el experimento en cuestión, se calculó la RQ de la siguiente manera:

ACt = CTdiana - CT referencia (CT = umbral de ciclo) donde la diana es cel-miR-39 y la referencia es el control de mantenimiento (RNU6B o RNU48).

AACT = ACT de muestra de prueba - ACT de muestra de calibrador, donde la muestra de calibrador son EV derivados a partir de células sin tratar y la muestra de prueba son las EV derivadas a partir de células tratadas.

La figura 9 muestra que pueden cargarse eficazmente MSC con moléculas de miARN mediante electroporación y que las moléculas de miARN diana están presentes tanto en las propias MSC como en las EV derivadas a partir de las MSC cargadas. La cantidad de miARN diana cargado en las EV es aproximadamente 100 veces inferior a la cantidad de miARN diana cargado en las MSC.

Por tanto, una estimación razonable de la eficiencia de carga expresada como el número de moléculas diana cargadas/EV está comprendida dentro del intervalo de desde 1x103 hasta 1x105

El límite superior de este intervalo se basa en la figura 5a de Fuhrmann et al. (2014), que muestra una eficiencia de carga que oscila aproximadamente entre 104 y 105, y en el recuento de NTA de las partículas de EV obtenidas tras la transfección de MSC con diversos tipos de miARN.

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Fuhrmann G. et al. J Control Release. 10 de mayo de 2015; 205:35-44. doi: 10.1016/jJconrel.2014.11.029. Publicación electrónica el 4 de diciembre de 2014.

Claims

REIVINDICACIONES

1. Portador farmacéuticamente aceptable, que porta el microARN miR222, para su uso en el tratamiento de una enfermedad fibrótica provocada por hiperglucemia.

2. Portador farmacéuticamente aceptable para su uso según la reivindicación 1, que porta además el microARN miR100.

3. Portador farmacéuticamente aceptable para su uso según la reivindicación 1 o 2, en el que el portador farmacéuticamente aceptable es una micro o nanopartícula y en el que el microARN o los microARN están contenidos dentro de la micro o nanopartícula o unidos a la superficie de la micro o nanopartícula.

4. Portador farmacéuticamente aceptable para su uso según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en el que el portador farmacéuticamente aceptable es una vesícula extracelular (EV).

5. Portador farmacéuticamente aceptable para su uso según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, en el que el portador farmacéuticamente aceptable es una vesícula extracelular (EV) derivada de una célula madre.

6. Portador farmacéuticamente aceptable para su uso según la reivindicación 5, en el que la vesícula extracelular (EV) se deriva de una célula madre adulta.

7. Portador farmacéuticamente aceptable para su uso según la reivindicación 6, en el que la vesícula extracelular (EV) se deriva de una célula madre mesenquimatosa (MSC), una célula progenitora hepática humana (HLSC) no ovalada o una célula madre adiposa (ASC).

8. Portador farmacéuticamente aceptable para su uso según cualquiera de las reivindicaciones 4 a 7, en el que la vesícula extracelular (EV) es una EV que se produce de manera natural o una EV modificada por ingeniería para contener miR222 y opcionalmente miR100.

9. Portador farmacéuticamente aceptable para su uso según la reivindicación 8, en el que la vesícula extracelular (EV) está modificada por ingeniería para contener miR222 y miR100.

10. Portador farmacéuticamente aceptable para su uso según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9, en el que la enfermedad fibrótica se selecciona del grupo que consiste en nefropatía diabética, fibrosis renal, miocardiopatía, hígado graso no alcohólico en particular NASH, y retinopatía diabética.