CN116042624A - 敲低或抑制环状RNA circ0030586的医药用途 - Google Patents

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Abstract

本申请提供了敲低或抑制环状RNA circ0030586的医药用途，具体来说是敲除或敲低circ0030586的物质，或，抑制circ0030586表达的物质在如下(A1)‑(A2)中的应用：(A1)制备治疗或辅助治疗内皮功能紊乱所致心血管疾病的药物；(A2)制备预防或辅助预防内皮功能紊乱所致心血管疾病的药物。本发明在内损伤所致的动脉粥样硬化患者及动脉粥样硬化相关的细胞和动物模型中，发现抑制circ0030586，可以延缓动脉粥样硬化的进程；本申请为衰老所致动脉粥样硬化相关血管疾病的诊断及治疗提供了新的靶点，开拓了防治药物制备的新方向。

Description

敲低或抑制环状RNA circ0030586的医药用途
技术领域
本发明属于生物医药技术领域，具体涉及敲低或抑制环状RNA circ0030586的医药用途。
背景技术
随着人口老龄化不断加重，心血管疾病的发生率和病死率也在不断上升，在世界范围内给人类带来了巨大的健康威胁和经济负担。动脉粥样硬化(Atherosclerosis，AS)是动脉血管壁慢性炎症性病变，它会引起多种心血管疾病，严重危害人类的健康与安全。AS病理是多因素的，而不是由单一过程驱动的。主动脉血管由内膜、中膜以及外膜共同组成，其中内膜主要是由内皮细胞形成的单层细胞构成，覆盖在血管内壁，调节血液和组织之间的营养物质、氧气的交换。作为一种慢性炎症性疾病，AS病变的首要步骤是内皮细胞的激活和损伤，进而诱导黏附分子分泌增加并募集单核细胞到内膜，促使趋化因子沉积和炎症因子释放，最终导致斑块的形成。内皮功能紊乱的重要标志是产生炎症反应，它是多种心血管疾病的病理基础，主要发生在动脉血管中的易损伤区域。内皮细胞功能紊乱在AS相关的心血管疾病中发挥重要作用。因此，确定炎症性内皮功能紊乱的分子机制是开发AS预防和治疗新策略的关键。
越来越多的研究发现非编码RNA具有重要的调节功能，能够参与转录、翻译、蛋白质降解等多种生物合成过程，并且与心血管疾病的发生发展密切相关。近年来随着对非编码RNA研究的深入，发现非编码RNA在AS的脂质代谢、内皮细胞激活、增殖和功能异常、炎性相关的细胞募集和活化、平滑肌细胞增殖和转分化等一系列病理生理过程中，均发挥着重要的调控作用。其中，CircRNA是一类具有共价闭合环状结构的非编码内源性RNA，大量存在于真核细胞转录组中，具有多种生物学功能。CircRNA具有很强的进化保守特性，且比较稳定，不易被外切核糖核酸酶降解，半衰期较长，可在血浆中长期稳定存在，因此，可作为多种疾病的诊断标志物。CircRNA能够充当miRNA的海绵，作为竞争性内源RNA结合miRNA，导致miRNA无法调控其靶基因，使得被miRNA抑制的mRNA得以翻译，促进mRNA表达，从而发挥生物学功能。CircRNA还能够与RNA结合蛋白(RNA binding protein，RBP)结合调节相关蛋白的功能。例如：CircRNA通过与小核糖核蛋白U1相互作用调节RNA聚合酶II活性，进而发挥调控亲本基因转录以及编码蛋白质的功能。CircRNA还被发现具有选择性剪切、蛋白质翻译等功能，这些功能使其能够在心血管疾病的病理进程中发挥重要的调控作用。根据文献报道，CircRNA可以通过调节血管内皮细胞、平滑肌细胞和巨噬细胞的活化，参与AS的病理过程，但是CircRNA数量巨大，特定序列的CircRNA，作为内皮功能紊乱所致心血管疾病的治疗靶点，仍是本领域的研究热点。
发明内容
针对上述问题，本申请提供一种敲低或抑制环状RNA circ0030586的医药用途。本申请研究发现，在氧化性低密度脂蛋白(ox-LDL)诱导的内皮模型中，circ0030586表达显著升高，本发明为血管内皮功能紊乱和动脉粥样硬化药物提供新的治疗思路和靶点。
本发明的目的可通过一下技术方案实现：
第一方面，本发明首先保护敲除或敲低circ0030586的物质，或，抑制circ0030586表达的物质在如下(A1)-(A2)中的应用：
(A1)制备治疗或辅助治疗内皮功能紊乱所致心血管疾病的药物；
(A2)制备预防或辅助预防内皮功能紊乱所致心血管疾病的药物。
在具体的实施方案中，所述防治内皮功能紊乱所致心血管疾病的药物包括防治动脉粥样硬化的药物。
第二方面，本发明保护一种产品，其活性成分为敲除或敲低circ0030586的物质，或，抑制circ0030586表达的物质；
所述产品的功能为如下(B1)-(B2)中任一种：
(B1)治疗或辅助治疗内皮功能紊乱所致心血管疾病；
(B2)预防或辅助预防内皮功能紊乱所致心血管疾病。
在具体的实施方案中，所述敲低circ0030586的物质为敲低circ0030586的小干扰RNA；优选的，敲低circ0030586的小干扰RNA序列选自如下(C1)和/或(C2)：
(C1)UAGAAAUCCAAUAGGCAUCTT，如SEQ ID NO.1所示；
(C2)GAUGCCUAUUGGAUUUCUATT，如SEQ ID NO.2所示。
第三方面，本发明还保护circ0030586作为靶点在如下(D1)-(D4)中的应用：
(D1)制备治疗或辅助治疗内皮功能紊乱所致心血管疾病的药物；
(D2)制备预防或辅助预防内皮功能紊乱所致心血管疾病的药物；
(D3)制备内皮功能紊乱所致动脉粥样硬化的辅助检测试剂；
(D4)开发/设计/筛选防治内皮功能紊乱所致心血管疾病的候选药物。
第四方面，本发明保护一种筛选防治内皮功能紊乱所致心血管疾病药物的方法，包括如下步骤：向用100μg/mL ox-LDL处理24h诱导损伤的HCAECs给予候选药物，检测circ0030586的表达量，如果circ0030586得到抑制，这说明该候选药物具有防治内皮功能紊乱所致心血管疾病的体外活性；或者对内皮功能紊乱所致心血管疾病动物模型给予候选药物，检测circ0030586表达量，如果circ0030586得到抑制，这说明该候选药物具有防治内皮功能紊乱所致心血管疾病的体内活性。
第五方面，本发明保护检测circ0030586的物质在制备内皮功能紊乱所致动脉粥样硬化的辅助检测试剂中的应用；
优选的，所述的检测circ0030586的物质为定量检测circ0030586的物质；
更优选的，所述的定量检测circ0030586的物质为circ0030586的特异性引物对。
进一步优选的，所述引物对如下：
上游引物:TCAATTCTGAAAGCTCCGGTA，如SEQ ID NO.3所示；
下游引物:CAGTGATGACTTCCCTGCTC，如SEQ ID NO.4所示。
有益结果
本申请通过RT-qPCR、Western Blot、细胞免疫荧光等方法研究内皮功能紊乱所致Apoe-/-小鼠主动脉组织以及人血管内皮细胞中circ0030586的表达；构建并合成内皮特异性敲除circ0030586腺相关病毒，8周龄小鼠喂养高脂饮食(HFD)12周以构建AS小鼠模型。本发明首次明确circ0030586对HCAECs的调节机制，敲除circ0030586可有效减少HCAECs炎症反应，及其导致的AS发生，为AS的诊断及治疗提供新的防治药物研发途径和药物作用靶点，具有十分重要的药用价值。
附图说明
图1为正常和ox-LDL诱导的HCAECs中circ0030586的表达水平示意图；
检测方法为通过实时定量PCR(RT-qPCR)检测它们在正常和ox-LDL诱导的HCAECs中circ0030586表达水平。
图2为AS患者和对照组的血管组织中circ0030586的表达水平示意图；
检测方法：收集AS患者与对照组血管组织，提取RNA，qRT-PCR验证circ0030586表达水平。
图3为分别敲除和过表达circ0030586，再给予HCAECs ox-LDL刺激，检测细胞迁移能力示意图。
检测方法为：将敲除或过表达HCAECs circ0030586，再给予HCAECs ox-LDL刺激，种入小室，12h后，取出小室，甲醇固定，结晶紫染色后拍照，并量化统计出敲低或者过表达circ0030586对ox-LDL诱导的细胞迁移能力的影响。
图4分别敲除和过表达circ0030586，再给予HCAECs ox-LDL刺激，RT-qPCR检测IL-6、IL-1β、CCL-2、ICAM-1、VCAM-1、SELE等炎症基因表达水平示意图；
检测方法为:敲除或过表达HCAECs circ0030586，再给予ox-LDL刺激24h，提取细胞RNA，用qRT-PCR检测IL-6、IL-1β、CCL-2、ICAM-1、VCAM-1、SELE等炎症基因表达水平。
图5为分离主动脉树，油红O染色检测小鼠AS斑块的形成示意图；
检测方法为：构建并合成了AAVendo腺相关病毒(AAVendo-shcirc0030586)，并进一步构建Apoe-/-小鼠背景下内皮特异性敲circ0030586小鼠模型(Apoe-/-AAVendo-shcirc0030586)。选择4周龄的Apoe-/-雌雄各半小鼠，通过尾静脉注射病毒，稳定表达4周后，喂养高脂饮食12周，以构建AS模型。随后收取其主动脉血管，通过油红O染色检测斑块的大小。
图6为血管冰冻切片免疫荧光染色检测ICAM-1的表达示意图；
检测方法为：构建并合成了AAVendo腺相关病毒(AAVendo-shcirc0030586)，并进一步构建Apoe-/-小鼠背景下内皮特异性敲circ0030586小鼠模型(Apoe-/-AAVendo-shcirc0030586)。选择4周龄的Apoe-/-雌雄各半小鼠，通过尾静脉注射病毒，稳定表达4周后，喂养高脂饮食12周，以构建AS模型。选取小鼠血管组织通过血管免疫荧光染色红色为ICAM-1，绿色为CD31，蓝色为DAPI。白色箭头所示为红色和绿色的共定位区域。
具体实施方式
下面的实施例可使本专业技术人员全面地理解本发明，但不以任何方式限制本发明。所用试剂或者仪器设备未注明生产厂商的，均视为可以通过市场购买的常规产品。
以下实施例涉及的细胞、试剂来源：
人血表皮细胞细胞(HCEACs)：购于ScienCell公司。
Apoe-/-小鼠：购于维通利华实验动物技术有限公司，8周龄雄性小鼠。
以下实施例所涉及的细胞实验均经过南京医科大学伦理委员会的批准。
实施例1circ0030586与内皮功能紊乱所致AS相关性实验
为了探索正常和ox-LDL诱导的内皮功能紊乱的HCEACs中circ0030586的水平，验证circ0030586是否参与了AS，本实施例采用qRT-PCR的方法检测正常和ox-LDL诱导的HCEACs中及AS患者血管组织中的circ0030586表达水平。
构建炎症性内皮功能紊乱的HCEACs实验步骤如下：
(1)使用磷酸盐缓冲液(PBS)进行细胞洗涤，用含10％的胎牛血清(FBS)、青霉素/链霉素(P/S)和生长因子(GF)的ECM培养基进行人冠状动脉内皮细胞(HCAEC)培养，且在37℃、含5％ CO2的湿润环境中培养；
(2)用0.25％胰酶溶液对HCAEC进行消化传代，注意避免过度消化；
(3)按照1：9的比例将DMSO与FBS混匀制备冻存液，用于细胞冻存；
(4)将人冠状动脉内皮细胞(HCAEC)培养种植于孔板中，当细胞密度达80-90％，换成无血清培养基饥饿24h，给予100μg/mL ox-LDL处理24h后收集细胞或进行其他处理；
(5)提取细胞蛋白或RNA检测相应指标，细胞3-6代用于细胞实验。
总RNA的提取实验步骤如下：
(1)收集处理后的样品，按Trizol试剂盒所述，提取总RNA。用去RNA酶枪头、DEPC水、戴口罩(避RNA酶，防止RNA降解)；
(2)用PBS洗涤细胞，每孔中加入1mL Trizol；
(3)10s后，将细胞裂解液转移至EP中，冰上静置10min；
(4)加200μL氯仿，震荡混匀，置于冰上裂解10min；
(5)4℃，12000rpm，离心15min；
(6)小心吸取上清液至新EP管，加入异丙醇，上下颠倒混匀，冰上静置10min；
(7)12000rpm，4℃，离心15min，弃去上清液；
(8)倒置于纸上吸干余液，加入DEPC水稀释的75％乙醇，用枪轻轻吹散，可见白色羽毛状沉淀；
(9)离心：4℃，12000rpm，15min；
(10)弃去上清乙醇，纸吸干，置于细胞房超净台通风孔处风干(5-10min)
(11)加入DEPC水溶解RNA；
(12)NanoDrop测RNA浓度，测完后置于-80℃冰箱储存备用。
逆转录实验步骤如下：
(1)使用
Figure BDA0004057430460000071
II 1st Strand cDNA Synthesis Kit进行逆转录，反应总体积为20μL，具体组成如下所示：
RNase free ddH2O To 20μL
Total RNA 1μg
5×
Figure BDA0004057430460000072
II Buffer plus 4μL
(2)混合均匀后用PCR仪进行逆转录：
25℃5min
42℃30min
85℃5min
(3)逆转录结束后，将cDNA用DEPC水按1：3或1：4比例稀释，-80℃储存备用。
Real-time PCR实验步骤如下：
(1)本实验采
Figure BDA0004057430460000073
qPCR SYBR Green Master Mix对目的基因进行相对定量检测，PCR反应体系如下：
cDNA模板1μL
Figure BDA0004057430460000074
qPCR SYBR Green Master Mix 5μL
上游引物:TCAATTCTGAAAGCTCCGGTA，1μM 1μL
下游引物:CAGTGATGACTTCCCTGCTC，1μM 1μL
超纯水2μL
(2)进行分组，计算体系(最后加cDNA)；
(3)封膜，384孔板离心后放入荧光定量PCR仪中；
(4)反应在Bio-Rad 480ΙΙ型定量PCR仪上进行。
检测结果如图1所示，与正常组相比，ox-LDL诱导的HCEACs中circ0030586表达水平显著升高；如图2所示，与对照组相比，AS患者血管组织中circ0030586表达水平显著升高。
为了进一步明确circ0030586是否参与ox-LDL诱导的内皮损伤，从而导致AS，我们通过敲除和过表达circ0030586，qRT-PCR检测内皮细胞的迁移能力及炎症因子和黏附分子的表达水平。结果如图3所示，敲除circ0030586能够显著改善ox-LDL诱导的内皮细胞迁移能力的降低，而过表达circ0030586则能增强ox-LDL诱导的内皮细胞迁移能力的降低；此外，如图4所示，敲除circ0030586能够显著抑制ox-LDL诱导的内皮细胞炎症因子和黏附分子的表达增加，而过表达circ0030586则能进一步增加ox-LDL诱导的内皮细胞炎症因子和黏附分子的表达增加。
实施例2小鼠模型试验
为了进一步验证circ0030586在内皮功能紊乱所致的AS中的作用，本实施例构建了构建并合成了AAVendo腺相关病毒(AAVendo-shcirc0030586)，并进一步构建Apoe-/-小鼠背景下内皮特异性敲除circ0030586小鼠模型(Apoe-/-AAVendo-shcirc0030586)。选取4周龄的Apoe-/-雌雄各半小鼠，尾静脉注射病毒；4周后，待AAV病毒稳定表达后，高脂饮食喂养12周，构建动脉粥样硬化小鼠模型。提取血管大体血管，进行油红O染色。
主动脉血管油红O染色步骤如下：
(1)主动脉树分离出来后，置于干净的六孔板中，用4％的多聚甲醛固定。
(2)用显微镊取经过多聚甲醛固定好的主动脉于新的六孔板中，用三蒸水漂洗10min左右。
(3)用移液枪吸掉六孔板中的三蒸水，加入60％异丙醇溶液，处理2min。
(4)用移液枪吸掉六孔板中的异丙醇，加入提前滤好的油红O染液，置于水平摇床上染色1h。
(5)用移液枪吸掉六孔板中油红O染液，加入60％异丙醇溶液溶液漂洗1min，如此重复3次，直至血管背景不在是红色。
(6)在显微镜下用显微剪小心去除残余的血管外壁脂肪。
(7)最后将染色好的主动脉树平铺在黑色解剖蜡板上，拍照。
结果如图5所示，内皮特异性敲除circ0030586能明显减少HFD诱导的AS斑块。
进一步进行血管免疫荧光检测，高脂喂养12周提取不同分组小鼠主动脉组织后进行血管免疫荧光光染色，冰冻切片后，免疫荧光检测黏附因子ICAM-1的表达，如图6所示，其红色为ICAM-1，绿色为CD31，蓝色为DAPI。白色箭头所示为红色和绿色的共定位区域。可见，敲除circ0030586明显抑制HFD又到的内皮ICAM-1的表达增加。
由以上实施例可见：在炎症性内皮功能紊乱所致的动脉粥样硬化患者及动脉粥样硬化相关的细胞和动物模型中，抑制或敲除circ0030586，可以抑制炎症性内皮功能紊乱，延缓动脉粥样硬化的进程。因此，抑制或敲除circ0030586的物质能够被用于制备治疗炎症性内皮功能紊乱的药物，尤其是用于制备治疗炎症性内皮功能紊乱所致的动脉粥样硬化的药物。
上述实例只为说明本发明的技术构思及特点，其目的在于让熟悉此项技术的人是能够了解本发明的内容并据以实施，并不能以此限制本发明的保护范围。凡根据本发明精神实质所做的等效变换或修饰，都应涵盖在本发明的保护范围之内。

Claims (9)

1.敲除或敲低circ0030586的物质，或，抑制circ0030586表达的物质在如下(A1)-(A2)中的应用：
(A1)制备治疗或辅助治疗内皮功能紊乱所致心血管疾病的药物；
(A2)制备预防或辅助预防内皮功能紊乱所致心血管疾病的药物。
2.根据权利要求1所述的应用，所述防治内皮功能紊乱所致心血管疾病的药物包括防治动脉粥样硬化的药物。
3.一种产品，其活性成分为敲除或敲低circ0030586的物质，或，抑制circ0030586表达的物质；
所述产品的功能为如下(B1)-(B2)中任一种：
(B1)治疗或辅助治疗内皮功能紊乱所致心血管疾病；
(B2)预防或辅助预防内皮功能紊乱所致心血管疾病。
4.根据权利要求1所述的应用或权利要求3所述的产品，其特征在于，所述敲低circ0030586的物质为敲低circ0030586的小干扰RNA；
优选的，敲低circ0030586的小干扰RNA序列选自如下(C1)和/或(C2)：
(C1)UAGAAAUCCAAUAGGCAUCTT，如SEQ ID NO.1所示；
(C2)GAUGCCUAUUGGAUUUCUATT，如SEQ ID NO.2所示。
5.circ0030586作为靶点在如下(D1)-(D4)中的应用：
(D1)制备治疗或辅助治疗内皮功能紊乱所致心血管疾病的药物；
(D2)制备预防或辅助预防内皮功能紊乱所致心血管疾病的药物；
(D3)制备内皮功能紊乱所致动脉粥样硬化的辅助检测试剂；
(D4)开发/设计/筛选防治内皮功能紊乱所致心血管疾病的候选药物。
6.一种筛选防治内皮功能紊乱所致心血管疾病药物的方法，其特征在于，包括如下步骤：向用100μg/mL ox-LDL处理24h诱导损伤的HCAECs给予候选药物，检测circ0030586的表达量，如果circ0030586得到抑制，这说明该候选药物具有防治内皮功能紊乱所致心血管疾病的体外活性；或者对内皮功能紊乱所致心血管疾病动物模型给予候选药物，检测circ0030586表达量，如果circ0030586得到抑制，这说明该候选药物具有防治内皮功能紊乱所致心血管疾病的体内活性。
7.检测circ0030586的物质在制备内皮功能紊乱所致动脉粥样硬化的辅助检测试剂中的应用；优选的，所述的检测circ0030586的物质为定量检测circ0030586的物质。
8.根据权利要求7所述的应用，其特征在于，所述的定量检测circ0030586的物质为circ0030586的特异性引物对。
9.根据权利要求8所述的应用，其特征在于，所述引物对如下：
上游引物:TCAATTCTGAAAGCTCCGGTA，如SEQ ID NO.3所示；
下游引物:CAGTGATGACTTCCCTGCTC，如SEQ ID NO.4所示。
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