CN109223818A - miR-3158-3p在制备诊断、预防和/或治疗特应性皮炎产品中的应用 - Google Patents
miR-3158-3p在制备诊断、预防和/或治疗特应性皮炎产品中的应用 Download PDFInfo
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Abstract
本发明公开了miR‑3158‑3p在制备诊断、预防和/或治疗特应性皮炎产品中的应用。本发明还提供了用于检测特应性皮炎的诊断试剂盒。本发明还提供了用于预防和/或治疗特应性皮炎的药物组合物,所述药物组合物包含miR‑3158‑3p抑制剂作为活性成分。本发明发现miR‑3158‑3p特异性强,灵敏度高,不仅能够快速有效的做到早期检测,而且为基因治疗、药物治疗等临床应用提供了治疗靶点和重要依据。
Description
技术领域
本发明涉及生物技术领域,具体涉及miR-3158-3p在制备诊断、预防和/或治疗特应性皮炎产品中的应用。
背景技术
特应性皮炎又称异位性皮炎、遗传过敏性皮炎、特应性湿疹或Besnier体质性痒疹,是一种具有家族遗传倾向的,常伴有支气管哮喘、过敏性鼻炎的慢性反复性、瘙痒性、炎症性皮肤疾病。以婴幼儿、青少年为多见,病程长,严重影响着患者的生存质量。临床表现形式很多,根据皮疹发生、发展和分布特点,可将其分为婴儿期、儿童期和青少年成人期三个阶段;婴儿期呈急性或亚急性湿疹状;儿童期及青年期则为亚急性或慢性湿疹状。特应性皮炎多自婴儿期起病,病情迁延反复。其临床表现较复杂,不同临床时期存在不同的皮损。皮疹多形性并具有渗出倾向,常伴有哮喘、过敏性鼻炎及血清IgE增高等症状和体征。急性期皮损多表现为红斑、丘疹及水疱,严重者常可见广泛抓痕、糜烂及渗出;亚急性期皮损多表现为红斑、抓痕及鳞屑;慢性期则多表现为纤维化丘疹、苔藓样变及皮肤增厚性斑块。随着全球化工业化发展,受气候变化、环境污染、饮食卫生文化习惯等多重因素的影响,特应性皮炎的发病率在全球范围内呈逐渐上升趋势,特别是在欧美等西方工业文明发达国家,其发病率甚至多年居高不下;而根据最新流行病数据,从20世纪末到本世纪初20多年时间内,中国特应性皮炎患者的总标化患病率也由0.69%逐渐上升至3.07%,并且处在快速增长期。而我国城市化、工业化程度的不断加深、生态环境的日益恶化、传统饮食结构、生活习惯的转变,则势必更明显地影响儿童特应性皮炎的发病,使我国儿童特应性皮炎的患病率呈现快速增长的趋势。目前对于特应性皮炎的反复发作,仍是一个难以解决的问题。
特应性皮炎为多因素、多环节、多途径共同作用的一种疾病。皮肤功能障碍失调已被认为是特应性皮炎基本的特征。皮肤屏障功能障碍可导致微生物、变应原和其他环境因素的渗入,继而导致包括炎症、变应原的致敏作用及微生物的聚集等后果。皮肤细胞之间的胞间连接蛋白,如丝聚蛋白flaggrin,紧密连接蛋白occludin,在特应性皮炎患者的皮肤中表达量出现明显下降,被认为是皮肤屏障功能障碍的重要原因。
miRNA(microRNA)是一类长度为20~25个核苷酸的非编码小分子RNA,通过影响其靶基因的稳定性或抑制其翻译转录水平来调控细胞的分化、增殖和凋亡。miRNA在细胞中表达失调会导致癌症在内的多种疾病的发生,目前现有的研究资料已证明miRNA在某些皮肤病的发生、发展起着重要作用。最新研究表明,一些miRNA在特应性皮炎中异常表达,但何种miRNA与特应性皮炎的发生、发展有关仍未达成共识。
因此有必要寻找与特应性皮炎发生、发展有关的miRNA,从而为临床上诊断、预防和/或治疗特应性皮炎提供一种有效手段。
发明内容
为了寻找与特应性皮炎发生、发展有关的miRNA,本发明一个目的在于提供miR-3158-3p在制备诊断、预防和/或治疗特应性皮炎产品中的应用。
本发明还一个目的是提供诊断、预防和/或治疗特应性皮炎的产品。
本发明的发明人在对特应性皮炎的相关研究中发现miR-3158-3p在特应性皮炎患者血液中含量显著升高,也即相对于健康人来说特异性皮炎患者血清中miR-3158-3p的相对表达水平上调,同时发现miR-3158-3p能够抑制翻译起始因子eIF4G2的表达,进而抑制丝聚蛋白flaggrin和紧密连接蛋白occludin的表达。因此,特应性皮炎患者血液中miR-3158-3p的含量高低可作为诊断特应性皮炎的依据,即miR-3158-3p可作为诊断特应性皮炎的一个分子标记物。进一步研究发现,miR-3158-3p的模拟物(mimics)能够模拟miR-3158-3p的表达,从而显著降低eIF4G2的表达,进而显著抑制丝聚蛋白flaggrin和紧密连接蛋白occludin的表达。
在本发明中,术语“miR-3158-3p”是指包含SEQ ID No.1所示序列或其同源序列的miRNA,例如本领域中已知各种来源如人、鼠、兔等的miR-3158-3p。
本发明的“miR-3158-3p”还包含上述天然存在的miR-3158-3p序列经取代、缺失或添加一个或几个核苷酸,或经过生物学化学修饰后仍具有miR-3158-3p生物活性的miR-3158-3p衍生物。
本发明的“miR-3158-3p”还包含人工合成的以及可以通过购买市售商品方式获得的具有miR-3158-3p生物学活性的miR-3158-3p模拟物。
此外,本发明所述的miR-3158-3p也可以为前体形式,miR-3158-3p前体是指在被施用对象的细胞内或体内可以被加工成为miR-3158-3p的前体。获得天然存在的miR-3158-3p前体的方法为本领域技术人员所公知。
本领域技术人员公知,miR-3158-3p的初始转录产物经过一系列的加工后,形成成熟的miR-3158-3p。miR-3158-3p前体只有在加工为成熟的miR-3158-3p后才具有相应的生物学功能。
本发明的一个方面提供了用于检测特应性皮炎的诊断试剂盒,所述试剂盒包括特异性扩增特应性皮炎相关的miR-3158-3p的引物和说明书。所述引物包括序列为SEQ IDNO:2的反转录引物,以及序列分别为SEQ ID NO:3和SEQ ID NO:4的cDNA扩增引物对。所述试剂盒还包括10×Buffer、dNTP、MgCl2、Taq酶和SYBR Green荧光染料。
本发明的另一个方面提供了miR-3158-3p抑制剂(inhibitor)在制备预防和/或治疗特应性皮炎的生物制剂中的应用。在本发明的一些实施方案中,所述应用包括将miR-3158-3p抑制剂与载体结合后与抗炎症药物和/或药物可接受的辅料复配制成药物组合物。
进一步地,所述miRNA-3158-3p抑制剂选自:能降低miRNA-3158-3p表达量的siRNA、dsRNA、shRNA、miRNA、反义核苷酸;或者能表达或形成所述siRNA、dsRNA、shRNA、miRNA、反义核苷酸的构建物。
进一步地,所述miRNA-3158-3p抑制剂为由上海吉凯公司合成的产品或具有其抑制剂活性的化学修饰物。
本发明还提供了用于预防和/或治疗特应性皮炎的药物组合物,所述药物组合物含有有效量的miR-3158-3p抑制剂和药物可接受的辅料。
本发明的miR-3158-3p抑制剂的有效剂量可以随给药的模式和待治疗的疾病的严重程度等进行相应的调整。优选的有效量的可以由本领域普通技术人员综合各因素来确定。所述因素包括但不限于:miR-3158-3p抑制剂的药代动力学参数、受治疗的患者的健康状况、体重、给药途径等。
进一步地,所述miRNA-3158-3p抑制剂选自:能降低miRNA-3158-3p表达量的siRNA、dsRNA、shRNA、miRNA、反义核苷酸;或者能表达或形成所述siRNA、dsRNA、shRNA、miRNA、反义核苷酸的构建物。
进一步地,所述miR-3158-3p抑制剂为由上海吉凯公司合成的产品或具有其抑制剂活性的化学修饰物。
在本发明的一些实施方案中,所述药物组合物含有与载体结合的miR-3158-3p抑制剂和药物可接受的辅料,所述载体可以为本领域常用的适于miRNA在宿主细胞中表达的载体种类如脂质体、壳聚糖或慢病毒表达载体,所述辅料包括在药物使用中但不引起明显副作用的各种赋形剂、稀释剂和佐剂,包括但不限于:生理盐水、缓冲液、葡萄糖、水、甘油、乙醇等。所述药物组合物的形式适合于:直接裸miRNA注射法、脂质体包裹RNA直接注射法、繁殖缺陷细菌携带质粒DNA法或复制缺陷腺病毒携带目的DNA法等。
在本发明的一些实施方案中,所述表达载体为慢病毒表达载体,优选地,所述慢病毒表达载体可以为pWPXL、pMD2.G或psPAX2慢病毒表达载体。
在本发明的一些实施方案中,所述药物组合物还任选地包含一种或多种其他对治疗特应性皮炎有效的药物,这些药物是本领域技术人员所熟知的。
本发明中,所述药物组合物的给药途径为静脉内、动脉内灌注或局部注射等,也可以采用本领域技术人员所熟知的其他给药途径进行给药。本发明的药物组合物可以与其他治疗手段联合施用,用于特应性皮炎的预防和/或治疗。
有益效果:
本发明提供的用于检测特应性皮炎的诊断试剂盒,可用于诊断miR-3158-3p相关的特应性皮炎,从而为有针对性地治疗该疾病提供依据。本发明提供一种预防和/或治疗特应性皮炎的药物组合物,所述药物组合物含有有效量miR-3158-3p抑制剂作为活性剂,其中所述miR-3158-3p抑制剂显著增加eIF4G2的表达,从而促进丝聚蛋白flaggrin和紧密连接蛋白occludin的表达,使得能够保持表皮和真皮细胞的紧密连接,从而实现预防和/或治疗特应性皮炎的作用。本发明发现miR-3158-3p特异性强,灵敏度高,不仅能够快速有效的做到早期检测,而且为基因治疗、药物治疗等临床应用提供了治疗靶点和重要依据。
附图说明
图1为miR-3158-3p在健康人群和特应性皮炎患者血清中的含量。
图2所示表明,miR-3158-3p能够抑制丝聚蛋白flaggrin和紧密连接蛋白occludin的表达。
其中,(A)为用miR-3158-3p模拟物(mimics)转染人皮肤成纤维细胞HSAS3细胞后,Q-PCR检测的miR-3158-3p相对表达水平;(B)为miR-3158-3p模拟物转染HSAS3细胞后,检测到丝聚蛋白flaggrin和紧密连接蛋白occludin的mRNA相对表达量相比阴性对照明显降低;(C)为miR-3158-3p模拟物转染HSAS3细胞后,检测到的翻译起始因子eIF4G2、丝聚蛋白flaggrin和紧密连接蛋白occludin以及微管蛋白tubulin的表达。
图3为用miR-3158-3p抑制剂(inhibitor)转染HSAS3细胞后,通过凝胶电泳所检测的翻译起始因子eIF4G2、丝聚蛋白flaggrin和紧密连接蛋白occludin以及微管蛋白tubulin的表达。
具体实施方式
以下实施例用于说明本发明,但不用来限制本发明的范围。若未特别指明,实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段。
下面通过具体实施例对本发明进行详细说明。
实施例1
本实施例证明,miR-3158-3p在特应性皮炎患者血液中的含量明显高于其在健康人群中的含量。
收集健康人群和特应性皮炎患者的血清样本各7例(健康人和病例样本来源于北京市顺义区妇幼保健院),通过miRNA提取试剂盒(生产商:天根生化科技(北京)有限公司;产品批号:DP501)获得血液中的miRNA,利用Q-PCR(按照常规步骤操作,其中反转录引物序列如SEQ ID NO:2所示,cDNA扩增引物对序列分别如SEQ ID NO:3和SEQ ID NO:4所示)的方法检测,并比较血清中miR-3158-3p的相对表达水平。结果如图1所示,特异性皮炎患者血清中miR-3158-3p的相对表达水平显著高于其在健康人群血清中的相对表达水平,并且该差异具有统计学意义。
实施例2
本实施例证明,miR-3158-3p能够抑制丝聚蛋白flaggrin和紧密连接蛋白occludin的表达。
用转染试剂lipofectamine 2000将miR-3158-3p的模拟物(mimics)(miR-3158-3p模拟物由上海吉凯公司合成,主要作用是在细胞内模拟miR-3158的功能,相当于使细胞内miR-3158-3p的浓度上升几百倍)转染人皮肤成纤维细胞HSAS3细胞(该细胞为本实验室保存)48小时后,并用Q-PCR检测(按照常规步骤操作,其中反转录引物序列如SEQ ID NO:2所示,cDNA扩增引物对序列分别如SEQ ID NO:3和SEQ ID NO:4所示)。如图2A所示,结果表明,miR-3158-3p模拟物转染HSAS3后细胞中miR-3158-3p表达量显著性上升,证明该模拟物能够模拟miR-3158-3p的表达。如图2B所示,丝聚蛋白flaggrin和紧密连接蛋白occludin的mRNA相对表达量相比阴性对照明显降低。miR-3158-3p模拟物转染HSAS3细胞48小时后,用免疫印迹的方法(按照常规步骤操作;eIF4G2抗体的生产商:abcam公司,产品批号:ab85963;flaggrin抗体的生产商:abcam公司,产品批号:ab81468;occludin抗体的生产商:abcam公司,产品批号:ab216327;tubulin抗体的生产商:abcam公司,产品批号:ab18207;二抗为羊抗兔或羊抗鼠,生产商:中山金桥公司)检测细胞内翻译起始因子eIF4G2的表达,如图2C所示,miR-3158-3p模拟物显著降低eIF4G2的表达。因eIF4G2可促进flaggrin和occludin的表达,从而推知miR-3158-3p模拟物也能够降低丝聚蛋白flaggrin和紧密连接蛋白occludin的表达。
进一步使用免疫印迹方法发现,如图2C所示,该miR-3158-3p模拟物也能够显著性抑制丝聚蛋白flaggrin和紧密连接蛋白occludin的表达,而与特应性皮炎不相关的微管蛋白tubulin的表达则没有发生明显变化。从而可知,miR-3158-3p模拟物能够显著抑制丝聚蛋白flaggrin和紧密连接蛋白occludin的表达,而丝聚蛋白flaggrin和紧密连接蛋白occludin在特应性皮炎患者的皮肤中表达量出现明显下降,被认为是皮肤屏障功能障碍的重要原因。
实施例3
本实施例证明,抑制miR-3158-3p可促进丝聚蛋白flaggrin和紧密连接蛋白occludin的表达。
用转染试剂lipofectamine 2000将miR-3158-3p的抑制剂(inhibitor)(该抑制剂由上海吉凯公司合成,其与miR-3158-3p结合并抑制其发挥作用,主要作用是通过促进细胞内miR-3158-3p降解,抑制细胞内miR-3158-3p的功能)转染人皮肤成纤维细胞HSAS3细胞48小时后,用免疫印迹的方法(按照常规步骤操作;eIF4G2抗体的生产商:abcam公司,产品批号:ab85963;flaggrin抗体的生产商:abcam公司,产品批号:ab81468;occludin抗体的生产商:abcam公司,产品批号:ab216327;tubulin抗的生产商:abcam公司,产品批号:ab18207;二抗为羊抗兔或羊抗鼠,生产商:中山金桥公司)检测细胞内翻译起始因子eIF4G2的表达,如图3所示,miR-3158-3p抑制剂显著增加eIF4G2的表达。因eIF4G2可促进flaggrin和occludin的表达,从而推知miR-3158-3p抑制剂也能够增加丝聚蛋白flaggrin和紧密连接蛋白occludin的表达。
进一步实验发现,miR-3158-3p抑制剂也能够显著性增加丝聚蛋白flaggrin和紧密连接蛋白occludin的表达,而与特应性皮炎不相关的微管蛋白tubulin的表达则没有发生明显变化。从而证明miR-3158-3p抑制剂能够显著促进丝聚蛋白flaggrin和紧密连接蛋白occludin的表达,保持表皮和真皮细胞的紧密连接,防止特应性皮炎的发生。
虽然,上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述,但在本发明基础上,可以对之作一些修改或改进,这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此,在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进,均属于本发明要求保护的范围。
序列表
<110> 北京市顺义区妇幼保健院(北京儿童医院顺义妇儿医院)
<120> miR-3158-3p在制备诊断、预防和/或治疗特应性皮炎产品中的应用
<130> P18075
<160> 4
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 22
<212> RNA
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 1
aagggcuucc ucucugcagg ac 22
<210> 2
<211> 50
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 2
gtcgtatcca gtgcagggtc cgaggtattc gcactggata cgacgtcctg 50
<210> 3
<211> 16
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 3
aagggcttcc tctctg 16
<210> 4
<211> 16
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 4
cagtgcaggg tccgag 16
Claims (10)
1.miR-3158-3p在制备诊断、预防和/或治疗特应性皮炎产品中的应用。
2.如权利要求1所述的应用,其特征在于,相对于健康人,特异性皮炎患者血清中miR-3158-3p的相对表达水平上调。
3.如权利要求1或2所述的应用,其特征在于,所述miR-3158-3p能够抑制翻译起始因子eIF4G2的表达,进而抑制丝聚蛋白flaggrin和紧密连接蛋白occludin的表达。
4.用于检测特应性皮炎的诊断试剂盒,其特征在于,所述试剂盒包括特异性扩增特应性皮炎相关的miR-3158-3p的引物和说明书。
5.如权利要求4所述的试剂盒,其特征在于,所述引物包括序列为SEQ ID NO:2的反转录引物,以及序列分别为SEQ ID NO:3和SEQ ID NO:4的cDNA扩增引物对。
6.如权利要求4或5所述的试剂盒,其特征在于,所述试剂盒还包括10×Buffer、dNTP、MgCl2、Taq酶和SYBR Green荧光染料。
7.miR-3158-3p抑制剂在制备预防和/或治疗特应性皮炎的生物制剂中的应用。
8.如权利要求7所述的应用,其特征在于,所述miRNA-3158-3p抑制剂选自:能降低miRNA-3158-3p表达量的siRNA、dsRNA、shRNA、miRNA、反义核苷酸;或者能表达或形成所述siRNA、dsRNA、shRNA、miRNA、反义核苷酸的构建物。
9.一种药物组合物,其特征在于,所述药物组合物包含miR-3158-3p抑制剂和药物可接受的辅料。
10.如权利要求9所述的药物组合物,其特征在于,所述药物组合物还任选地包含一种或多种其他对治疗特应性皮炎有效的药物。
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PB01 | Publication | ||
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GR01 | Patent grant | ||
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