CN112094895B - 特应性皮炎诊断和治疗的miRNA - Google Patents

Abstract

本发明公开了miR‑1238抑制剂在制备治疗FLG相关疾病的药物中的应用。所述miR‑1238的靶基因为FLG编码基因，所述miR‑1238抑制剂能促进FLG表达。本发明提供了一种与特应性皮炎相关的miR‑1238，可用于制备检测特应性皮炎的诊断试剂盒，从而为有针对性地治疗该疾病提供依据。本发明还提供一种miR‑1238抑制剂，能促进特应性皮炎的细胞或动物模型中FLG基因或蛋白表达，可用于制备预防和/或治疗特应性皮炎药物组合物。

Description

特应性皮炎诊断和治疗的miRNA

技术领域

本发明涉及生物医药领域，具体涉及特应性皮炎诊断和治疗的miRNA。

背景技术

特应性皮炎是一种慢性反复性、瘙痒性、炎症性皮肤疾病。特应性皮炎多自婴儿期起病，病情迁延反复。其临床表现较复杂，不同临床时期存在不同的皮损。皮疹多形性并具有渗出倾向，常伴有哮喘、过敏性鼻炎及血清IgE增高等症状和体征。急性期皮损多表现为红斑、丘疹及水疱，严重者常可见广泛抓痕、糜烂及渗出；亚急性期皮损多表现为红斑、抓痕及鳞屑；慢性期则多表现为纤维化丘疹、苔藓样变及皮肤增厚性斑块。随着全球化工业化发展，受气候变化、环境污染、饮食卫生文化习惯等多重因素的影响，特应性皮炎的发病率在全球范围内呈逐渐上升趋势，特别是在欧美等西方工业文明发达国家，其发病率甚至多年居高不下；而根据最新流行病数据，从20世纪末到本世纪初20多年时间内，中国特应性皮炎患者的总标化患病率也由0.69％逐渐上升至3.07％，并且处在快速增长期。而我国城市化、工业化程度的不断加深、生态环境的日益恶化、传统饮食结构、生活习惯的转变，则势必更明显地影响儿童特应性皮炎的发病，使我国儿童特应性皮炎的患病率呈现快速增长的趋势。目前对于特应性皮炎的反复发作，仍是一个难以解决的问题。

特应性皮炎为多因素、多环节、多途径共同作用的一种疾病。皮肤功能障碍失调已被认为是特应性皮炎基本的特征。皮肤屏障功能障碍可导致微生物、变应原和其他环境因素的渗入，继而导致包括炎症、变应原的致敏作用及微生物的聚集等后果。丝聚蛋白(Filaggrin，FLG)编码基因拷贝数变异，

导致丝聚蛋白功能缺失进而皮肤屏障发生破坏，与AD的发生密切相关。因此深入探讨FLG表达量低的原因已成为AD发病机理研究中的热点环节。已知人的FLG基因位于1q21.3，每个等位基因上含有3个外显子，外显子1不编码，外显子2包含起始密码子，外显子3主要由10～12个长度为972～975bp的高度重复序列组成。不同个体基因组中一般共含有20～24个重复序列，称为基因内拷贝数变异(copy number variation，CNV)。每个高度重复序列编码一个丝聚蛋白单体，每个等位基因将编码10～12个单体分子，提示CNV可通过影响FLG在表皮角质层细胞中的表达量，增加AD患病风险。

miRNA是调节基因表达的内源性非编码小分子RNA，在转录后水平对基因表达进行调控，参与细胞周期、凋亡、发育、分化和新陈代谢等生理过程。miRNA在细胞中表达失调会导致癌症在内的多种疾病的发生。最新研究表明，一些miRNA在特应性皮炎中异常表达，但在特应性皮炎中，何种miRNA与FLG基因拷贝数变异相关仍未有相关报道。

因此有必要寻找与FLG基因拷贝数变异相关的miRNA，从而为临床上治疗特应性皮炎提供一种有效手段。

发明内容

本发明的目的之一在于提供一种用于特应性皮炎诊断和治疗的miRNA，该miRNA为miR-1238，所述miR-1238的核苷酸序列为SEQ ID NO:1。

本发明的目的之二在于提供所述miR-1238在制备特应性皮炎诊断试剂盒和治疗药物中的应用。

为了实现上述目的，本发明采用了如下技术方案：

本发明的第一方面提供了一种诊断特应性皮炎的产品，所述产品包括用于检测miR-1238的表达水平的试剂。

在其中一些实施方式中，所述miR-1238在特应性皮炎中表达上调。

在其中一些实施方式中，所述的试剂为特异性扩增miR-1238引物或探针。

在其中一些实施方式中，所述产品还包括10×Buffer、dNTP、MgCl₂、Taq酶和SYBRGreen荧光染料。

本发明的第二方面提供了一种miR-1238抑制剂，所述抑制剂能抑制细胞中miR-1238表达，增加丝聚蛋白Filaggrin的表达，从而保持表皮和真皮细胞的紧密连接，防止特应性皮炎的发生。

在其中一些实施方式中，所述的miR-1238的抑制剂是指任何可降低miR-1238基因水平的物质，这些物质均可用于本发明，作为对于下调miR-1238基因的表达有用的物质，从而可用于治疗特应性皮炎。

举例来说，本发明的抑制剂可以是以miR-1238基因为靶序列、且能够抑制miR-1238基因的干扰分子，包括：shRNA(小发夹RNA)、小干扰RNA(siRNA)、dsRNA、微小RNA、反义核酸，或能表达或形成所述shRNA、小干扰RNA、dsRNA、微小RNA、反义核酸的构建物；本发明的抑制剂也可以是miR-1238拮抗剂(miR-1238antagomir)。

作为本发明的一种优选方式，所述miR-1238抑制剂是miR-1238的反义寡核苷酸，所述的miR-1238的反义寡核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。

本发明的第三方面提供了所述miR-1238抑制剂在制备促进FLG基因或蛋白表达产品中的应用。

本发明的第四方面提供了所述miR-1238抑制剂在制备治疗FLG相关疾病的药物组合物中的应用。

本发明中，所述FLG相关疾病是由于FLG基因拷贝数降低引起的。当FLG基因中如果低于22个拷贝数，有可能因为FLG表达量异常诱发AD。

在其中一些实施方式中，所述FLG基因相关疾病为特应性皮炎。

本发明中的药物组合物还可以包括与所述抑制剂配伍的其他药类以及药学上可接受的载体和/或辅料。

在其中一些实施方式中，所述载体可以为本领域常用的适于miRNA在宿主细胞中表达的载体种类如脂质体、壳聚糖或慢病毒表达载体，所述辅料包括在药物使用中但不引起明显副作用的各种赋形剂、稀释剂和佐剂，包括但不限于：生理盐水、缓冲液、葡萄糖、水、甘油、乙醇等。所述药物组合物的形式适合于：直接裸miRNA注射法、脂质体脂质体包裹RNA直接注射法、繁殖缺陷细菌携带质粒DNA法或复制缺陷腺病毒携带目的DNA法等。

本发明的药物组合物还可与其他治疗特应性皮炎的药物联用，其他治疗性化合物可以与主要的活性成分同时给药，甚至在同一组合物中同时给药。

本发明的药物组合物可根据需要制备成各种剂型。包括但不限于，经皮、粘膜、口颊、舌下或经口使用的片剂、溶液剂、颗粒剂、贴剂、膏剂、胶囊剂、气雾剂或栓剂。

本发明的药物组合物的施用途径不受限制，只要它能发挥期望的治疗效果即可，包括但不限于口服、静脉注射、肌肉注射、皮下注射、舌下含化、直肠灌注、鼻腔喷雾、口腔喷雾、皮肤局部或全身经皮用药。

本发明的药物的剂量不受限制，只要其用量足以治疗疾病，以适用于任何医学治疗的合理的利益/风险比率，可以根据受试者的类型、疾病的严重程度、受试者的年龄和性别、药物活性、对药物的敏感性、给药时间，给药途径、排泄率、治疗时间、与组合物联用的药物和医疗领域中其他已知因素来确定。

有益效果

本发明提供了一种与特应性皮炎相关的miR-1238，可用于制备检测特应性皮炎的诊断产品，从而为有针对性地治疗该疾病提供依据。本发明还提供一种miR-1238抑制剂，能促进特应性皮炎的细胞或动物模型中FLG基因或蛋白表达，可用于制备预防和/或治疗特应性皮炎药物组合物。其中所述miR-1238抑制剂促进丝聚蛋白Filaggrin的表达，使得能够保持表皮和真皮细胞的紧密连接，从而实现预防和/或治疗特应性皮炎的作用。本发明发现miR-1238特异性强，灵敏度高，不仅能够快速有效的做到早期检测，而且为基因治疗、药物治疗等临床应用提供了治疗靶点和重要依据。

附图说明

图1为miR-1238在正常小鼠和特应性皮炎小鼠血清中的含量；

图2A为miR-1238抑制剂抑制细胞中miR-1238表达；B为miR-1238抑制剂能够促进丝聚蛋白Filaggrin的表达；

图3为miR-1238拮抗剂(antagomir)能够增加特应性皮炎动物模型的表皮细胞中丝聚蛋白Filaggrin的表达。

具体实施方式

以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段。

实施例1

本实施例证明，miR-1238在特应性皮炎小鼠模型血液中的含量明显高于其在正常小鼠中的含量。

收取10只特应性皮炎小鼠模型的血清样本，10例正常小鼠的血清样本，检测血液中miR-1238的含量。

构建AD模型方法如下：采用八周龄BALB/c小鼠，用理发器去除小鼠背部面积约2cm×4cm的毛发，再用电动剃须刀将剩余毛发剔除干净。24h后，用100μL 0.2％DNFB(对二硝基氟苯)外涂背部，每周2次，间隔2～3天一次，连续五周，成功制备AD模型。

通过miRNA提取试剂盒(生产商：天根生化科技(北京)有限公司；产品批号：DP501)获得血液中的miRNA，利用Q-PCR(按照常规步骤操作，其中反转录引物序列SEQ ID NO:3，cDNA扩增引物对序列分别如SEQ ID NO:4和SEQ ID NO:5所示)的方法检测，并比较血清中的相对表达水平。结果如图1所示，特应性皮炎小鼠模型血清中miR-1238的相对表达水平显著高于其在正常小鼠血清中的相对表达水平，并且该差异具有统计学意义。

实施例2

本实施例证明，miR-1238inhibitor能够增加细胞中FLG的表达。

用转染试剂lipofectamine 2000将miR-1238的抑制剂(inhibitor)(miR-1238抑制剂由上海吉凯公司合成，所述miR-1238抑制剂核苷酸序列GGGGCAGACAGACGAGGAAG(SEQID NO:2))转染人永生化表皮细胞HaCat细胞48小时后，并用Q-PCR检测，按照常规步骤操作，其中反转录引物序列：5’-GTCGTATCCAGTGCAGGGTCCGAGGTATTCGCACTGGATACGACGGGGCA-3’(SEQ ID NO:3)，cDNA扩增引物对序列分别：qPCR引物F：5’-CTTCCTCGTCTGTC-3’(SEQ IDNO:4)和qPCR引物R：5’-GTGCAGGGTCCGAGGT-3’(SEQ ID NO:5)，结果如图2A所示，miR-1238抑制剂转染HaCat后细胞中miR-1238表达量显著性降低，证明该抑制剂能够抑制miR-1238的表达。

miR-1238抑制剂转染HaCat细胞48小时后，用免疫印迹的方法(按照常规步骤操作；Filaggrin抗体的生产商：abcam公司，产品批号：ab81468；tubulin抗体的生产商：abcam公司，产品批号：ab18207；二抗为羊抗兔或羊抗鼠，生产商：中山金桥公司)检测细胞内FLG的表达，如图2B所示，miR-1238抑制剂显著促进FLG的表达。而与特应性皮炎不相关的微管蛋白tubulin的表达则没有发生明显变化。从而可知，miR-1238抑制剂能够显著促进丝聚蛋白Filaggrin的表达，保持表皮和真皮细胞的紧密连接，防止特应性皮炎的发生。

实施例3

本实施例证明，miR-1238拮抗剂(antagomir)能够增加特应性皮炎动物模型的表皮细胞中FLG的表达量。

特应性皮炎小鼠模型的构建方法参照实施例1中所述的步骤。

每周在患病处皮下注射antagomir(广州锐博公司，货号：miR30005593-4-5)，在患病处皮下注射，每只动物每次注射20nm，每周二次，连续两周。最后一次注射后第三天取皮肤组织做WB检测。

结果如图3所示，miR-1238antagomir能够显著促进丝聚蛋白Filaggrin的表达，说明了，miR-1238抑制剂能够显著促进丝聚蛋白Filaggrin的表达，保持表皮和真皮细胞的紧密连接，防止特应性皮炎的发生。

虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。

序列表

<110> 河北仁博科技有限公司

<120> 特应性皮炎诊断和治疗的miRNA

<130> P200239

<141> 2020-08-18

<160> 5

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 20

<212> RNA

<213> miR-1238

<400> 1

cuuccucguc ugucugcccc 20

<210> 2

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial sequence)

<400> 2

ggggcagaca gacgaggaag 20

<210> 3

<211> 50

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial sequence)

<400> 3

gtcgtatcca gtgcagggtc cgaggtattc gcactggata cgacggggca 50

<210> 4

<211> 14

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial sequence)

<400> 4

cttcctcgtc tgtc 14

<210> 5

<211> 16

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial sequence)

<400> 5

gtgcagggtc cgaggt 16

Claims (6)

1.检测miR-1238的表达水平的试剂在制备诊断特应性皮炎的产品中的应用。

2.如权利要求1所述的应用，其特征在于，所述miR-1238在特应性皮炎中表达上调。

3.如权利要求2所述的应用，其特征在于，所述的试剂包括特异性扩增miR-1238引物或探针。

4.miR-1238抑制剂在制备治疗特应性皮炎的药物组合物中的应用。

5.如权利要求4所述的应用，其特征在于，所述miR-1238抑制剂包括miR-1238的反义寡核苷酸和/或miR-1238拮抗剂。

6.如权利要求5所述的应用，其特征在于，所述的miR-1238的反义寡核苷酸序列如SEQID NO.2所示。

Images