KR101611071B1 - 마이크로알엔에이 202를 표적으로 하는 다계통위축증의 치료 또는 예방용 약학 조성물 및 방법 - Google Patents

마이크로알엔에이 202를 표적으로 하는 다계통위축증의 치료 또는 예방용 약학 조성물 및 방법 Download PDF

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Abstract

본원은 마이크로 RNA 202의 조절을 통한 다계통위축증 예방 또는 치료용 약학 조성물을 개시한다. 본원은 또한 다계통위축증의 진단 또는 예후 측정에 사용될 수 있는 마커 및 그 용도를 개시한다. 본원의 조성물은 Oct1의 발현을 증가시켜 산화성 신경손상을 억제하여 다계통위축증의 치료에 유용하게 사용될 수 있다.

Description

마이크로알엔에이 202를 표적으로 하는 다계통위축증의 치료 또는 예방용 약학 조성물 및 방법 {Composition and method for treating or preventing multiple system atrophy targeting miRNA202}
본원은 특정 miRNA를 표적으로 하는 다계통위축증의 치료와 관련된 것이다.
인간의 수명이 길어짐과 동시에 파킨슨 질환, 근위축성측삭경화증, 다발경화증, 헌팅톤 질환, 알츠하이머, 다계통위축증, 다발성경색치매, 원반황반변성 등을 포함하는 신경변성 질환의 발생율도 높아지고 있다. 현재 신경변성 질환 환자는 전세계적으로 2천4백만명인 것으로 추정된다. 또한 다른 형태의 신경변성 질환인 뇌졸중 또는 기타 외상 또는 손상에 의해 야기되는 질환은 해마다 증가추세에 있다.
대한민국에서 2003년 말 기준으로 치매 또는 뇌졸중 등 뇌질환으로 요양이나 부양자의 보호를 받아야 하는 국내 65세 이상 노인은 62만 명에 달해 여기에 소요되는 치료비 등 관리 비용만도 연간 3조 4,000억 원 수준에 이르고 있고, 산술적으로 노인 인구의 비율은 2015년에는 87만 명, 2030년에는 164만 명에 달하게 되고, 이들에 대한 관리 비용 역시 2015년 4조 8천억 원을 넘어 2030년에는 약 9조에 달할 것으로 예상된다.
이 중 특히 다계통 위축증 (Mutiple System Atrophy, MSA)은 희귀 진행성 신경퇴행성 질환으로 여러 가지 다양한 증상들이 결합하여 나타나는 것이 특징이다. 이 질환을 가진 사람들은 소뇌조화운동불능(Cerebellar ataxia)과 심장박동, 혈압, 발한(Sweating), 배변과 방광 조절과 같은 자율신경계의 기능상실(Autonomic failure)과 같은 파킨슨병과 유사한 증상을 가진다. 하지만 다계통 위축증의 정확한 원인은 아직 밝혀지지 않았다. 현재 치료제로 개발된 것은 없으며 단지 증상 조절에 목표를 두고, 파킨슨병환자 치료에 사용되는 시네메트(Sinemet)로 알려진 레보토파/카르비도파(Levodopa/carbidopa) 조합과 같은 약물이 처방되기도 한다. 미국공개특허공보 2010-0168239는 라사길린을 이용한 MSA의 치료용 용도를 개시하고 있다.
하지만 대증적치료에서 벗어나, 보다 근본적 치료를 위한 치료제의 개발이 필요하다. 최근 시도된 것이 마이크로 RNA 억제자를 이용한 치료제의 개발이다. 대한민국 공개특허공보 2012-0088009호는 miR-206을 타겟으로 한 신경퇴행성 질환 치료제 및 진단방법에 대하여 개시하고 있다. WO2013-036936은 다계통위축증의 증상과 유사한 하지만 상이한 질환인 파킨슨 질환의 miRNA 진단용 마커를 개시하고 있다. 다계통위축증의 병인 및 치료와 관련된 miR는 개시된 바 없으며 치료 또는 진단용의 miRNA 표적 개발이 요구된다.
본원은 miR-202 조절을 통한 다계통위축증 질환 관련 질환의 치료 또는 진단 방법을 제공하고자 한다.
한 양태에서 본원은 마이크로알엔에이 (miR)-202의 활성을 억제할 수 있는 물질 및 약학적으로 허용가능한 담체를 포함하는, 다계통위축증 치료 또는 예방용 약학 조성물을 제공한다.
본원에 따른 일 구현예에서, 조성물에 포함되는 활성을 억제할 수 있는 물질은 이의 발현을 억제할 수 있는 물질로 예를 들면 상기 분자의 뉴클레오타이드 서열의 전부 또는 일부에 결합할 수 있는 핵산 분자, 예를 들면, RNA, DNA, 앤타고미어, 안티센스 분자, siRNA, shRNA, 2'-O-변형 올리고뉴클레오타이드, 포스포로티오에이트-백본 디옥시리보뉴클레오타이드, 포스포로티오에이트-백본 리보뉴클레오타이드, 디코이 올리고뉴클레오타이드, PNA(peptide nucleic acid) 올리고뉴클레오타이드 또는 LNA(locked nucleic acid) 올리고뉴클레오타이드를 포함하나 이로 제한하는 것은 아니다.
본원에 따른 약학 조성물의 물질이 결합하는 상기 miR-202는 서열번호 1 내지 3 중 어느 하나로 표시될 수 있으나, 이로 제한하는 것은 아니다.
일 구현예에서, 본원의 조성물에 포함되는 상기 miR-202의 활성을 억제할 수 있는 핵산분자는 상기 서열번호 1의 1 번째 내지 7번째, 서열번호 2의 11 번째 내지 18번째, 또는 서열번호 3의 64번째 내지 71번째 뉴클레오타이드 서열의 전부 또는 일부에 상보적인 서열을 포함하는 안티센스 올리고뉴클레오타이드를 포함하며, 리보핵산 및 핵산을 포함하는 것으로 예를 들면 서열번호 4 (5’-UUCCCAUGCCCUAUACCUCU-3) 또는 서열번호 5 (5’-TTCCCATGCCCTATACCTCT-3')로 표시되나, 이로 제한하는 것은 아니다.
본원에 따른 안티센스 올리고뉴클레오타이드는 이를 구성하는 하나 이상의 뉴클레오타이드가 LNA, 또는 이를 구성하는 하나 이상의 뉴클레오타이드의 당이 2‘-O- 메틸화, 또는 이의 백본에 하나이상의 포스포티오에이트, 또는 이들의 조합을 포함할 수 있으나 이로 제한하는 것은 아니다.
본원에 따른 약학 조성물은 일 구현예에서 다계통위축증의 증상 예를 들면 소뇌조화운동불능 또는 자율신경계의 기능상실 증에 효과가 있다.
본원에 따른 약학 조성물은 다계통위축증에 효과가 있으며, 이러한 조성물은 Oct 1 유전자의 단백질 발현의 억제를 통한 기전을 통해 효과를 나타내나 이로 제한하는 것은 아니다.
본원에 따른 조성물은 비강내 투여, 정맥내 투여, 피하 주사, 뇌척수강내 주사, 흡입투여, 또는 경구 투여용 제형을 통해 목적하는 부위, 예를 들면 뇌로 전달될 수 있다.
다른 양태에서 본원은 또한 miR-202 분자를 시험물질과 접촉시키는 단계; 및 상기 시험물질과 접촉된 분자의 활성을 결정하는 단계를 포함하며, 상기 접촉된 분자 활성이, 상기 시험물질과 접촉되지 않은 대조군의 miR-202 분자의 활성과 비교하여 감소한 경우 이를 후보물질로 선별하는 것인, 다계통위축증 치료 또는 예방용 물질의 스크리닝 방법을 제공한다.
본원에 따른 방법에서 상기 miR-202 분자의 활성은 이의 Oct 1 유전자의 3‘UTR 영역에의 결합여부를 측정하여 결정될 수 있으나, 이로 제한하는 것은 아니다.
또다른 양태에서 본원은 또한 miR-202의 뉴클레오타이드 서열, 그의 상보적 서열 또는 상기 서열의 단편을 포함하는 서열의 검출용 물질을 포함하는 다계통위축증 진단용 키트에 관한 것이다.
또다른 양태에서 본원은 생물학적 시료에서 miR-202의 발현량을 결정하는 단계; 및 상기 검출된 miR-202 농도를 검사 대상자의 다계통위축증 진단 또는 예후와 연관시키는 단계를 포함하는, 다계통위축증의 진단 또는 예후에 필요한 정보를 제공하기 위하여 miR-202를 검출하는 방법 또는 그러한 정보제공 방법을 제공한다.
본원에 따른 마이크로알엔에이 발현 조절이 가능한 조성물은 Oct 1의 억제를 통해 산화로 인한 신경손상에 대한 억제 효과를 나타내어, 다계통위축증 질환 치료, 진단 또는 치료제 개발에 유용하게 사용될 수 있다.
도 1은 인간 MSA 소뇌 시료에서 miR-202의 상향 조절을 관찰한 결과로,
도 1a는 대조군 및 MSA 소뇌에서 차별적으로 발현되는 miRNA를 나타내는 마이크로어레이 분석결과로, 색은 Z-스코어를 나타내며, 적색은 고 발현 (높은 Z-스코어)을 나타내고, 초록색은 저발현을 나타내며, miRNA는 miRNA의 숫자에 따라 위부터 아래까지 나열하였다.
도 1b는 그룹 간 유의한 변화를 나타내는 miRNA의 히트 맵을 나타낸다.
도 1c는 대조군 소뇌와 비교하여 인간 MSA 소뇌에서 miR-202의 상향 발현을 실시간 PCR로 확인한 결과로, sno202 RNA를 내부 대조군으로 사용하였다. 그룹당 n=4이고, **P < 0.01, 바(Bar)는 ± s.e.m이다.
도 2는 miR-202의 표적 유전자를 조사한 결과로,
도 2a는 TargetScan, PicTar, 및 microT를 이용하여 인간 Oct1의 (두 개 부위, Oct1 #1 및 #2; gene name=Pou2f1), Foxp2, Acvr2a (두 개 부위, Acvr2a #1 및 #2), 및 Gad1의 3'UTR을 인간 (hsa)-miR-202의 가능한 표적으로 선별하였으며, 밑줄친 서열을 시드서열을 나타낸다.
도 2b는 Hela 세포에 miR-202를 전달이입한 결과, Oct1, Acvr2a, 및 Gad1의 3‘UTR를 포함하는 벡터의 루시퍼라제 활성이 감소한 것을 나타내는 결과 (그룹당 n=6)로 이는 상기 유전자가 miR-202의 표적임을 나타내는 것이다.
도 2c 및 2d는 Neuro-2a 마우스 뉴로블라스토마 세포에 miR-202를 전달이입한 결과, Oct1의 발현은 감소하였으나, Foxp2, Acvr2a, 및 GAD1 의 발현은 감소하지 않은 것으로 나타내는 결과 (그룹당 n=4)로 이는 Oct1만이 miR-202의 표적임을 나타내는 것이다. Scr은 스크램블된 서열을 나타내고, 바(Bar)는 ± s.e.m이다.
도 3은 인간 소뇌 시료에서 가능한 표적 단백질이 발현을 분석한 결과로,
도 3a는 가능한 표적 단백질의 발현을 대조군 인간 소뇌 및 MSA 소뇌에서 웨스턴 블랏으로 관찰한 결과이다.
도 3b는 Oct1 발현만이 대조군과 비교하여 MSA 소뇌에서 감소된 것을 나타내는 결과이다.
도 3c는 인간 소뇌에서 Oct1 단백질의 발현과 miR-202의 발현이 상관관계가 있음을 나타내는 결과이다 (Pearson’s correlation coefficient=-0.839, P=0.009).
도 3d는 3가지 상이한 농도의 miR-202 (0, 25, 및 100 nM) 를 Neuro-2a 세포에 전달이입한 경우, 농도 의존적으로 Oct1 단백질의 발현이 감소하였음을 나타내는 결과로, 인간 시료에서 관찰된 결과와 일치하는 것이다.
도 4는 miR-202가 산화 스트레스로 인한 세포사멸에 미치는 영향을 관찰한 결과로 Neuro2a 세포를 miR-202 (50nM), AM202 (antagomir for miR-202, 50 nM), 또는 모두로 전달이입한 후 48시간 후에 H2O2를 첨가한 후 4시간 후에 세포 생존을 WST-1로 분석한 것으로,
도 4a는 miR-202로 인해 H2O2 유도된 세포 사멸이 증가되었으며, H2O2 의 존재 중에 AM202의 처리로 인해 miR-202의 나쁜 영향이 감소되었음을 나타낸다 (그룹당 n=6).
도 4b는 결과를 세포 손실(미처리 대조군에 대한 %)로 다시 나타낸 경우, miR-202는 Neuro-2a 세포 사멸을 증가시켰으며, AM202는 이러한 miR-202의 독성을 예방하였음을 나타낸다. **P<0.01이다.
본원은 마이크로알엔에이 202 발현 조절을 통해 다계통위축증의 치료 또는 예방이 가능함을 발견한 것에 근거한 것이다.
따라서 한 양태에서 본원은 miR-202 및 miR-199a-5p 으로 구성되는 군으로부터 선택되는 하나 이상 분자의 활성을 억제할 수 있는 물질 및 약학적으로 허용가능한 담체를 포함하는, 다계통위축증 치료 또는 예방용 약학 조성물에 관한 것이다.
본원에 사용된 용어 "miR" 또는 "마이크로 RNA" 또는 “마이크로알엔에이”는 표적 RNA의 분해(degradation)을 촉진시키거나 또는 그들의 번역을 억제시킴으로써 유전자 발현을 전사 후에 조절하는 21 내지 23개의 비코딩 RNA를 말한다. 본원에 사용된 miRNA의 성숙 서열은 miRNA 데이터베이스 (http://www.mirbase.org)에서 얻을 수 있다. 2012년 8월 현재 miRNA 데이터베이스 (19판, miRBase)에 의하면 193개종에서 유래한 25,141 개의 성숙 miRNA가 등록되어 있다. 일반적으로 마이크로 RNA는 pre-miRNA라 불리는 헤어핀 구조를 갖는 약 70-80 nt (nucleotide) 길이의 전구체로 전사된 후, RNAse III 효소인 Dicer에 의해 잘려 성숙된 형태로 생성된다. 마이크로 RNA는 miRNP라 불리는 리보뉴클레오복합체를 형성하여 표적 부위에 상보적 결합을 통해 표적 유전자를 절단하거나, 번역을 억제한다. 30% 이상의 인간 miRNA는 클러스터로 존재하며, 하나의 전구체로 전사된 후, 절단과정을 거쳐 최종 성숙 miRNA가 형성된다.
본원에서 miR-202은 본 이론으로 한정하는 것은 아니지만 Oct 1을 코딩하는 mRNA의 3’비번역 부위에 결합하여, 이의 발현을 조절한다. 본원의 miR-202의 서열은 인간 유래이며, 성숙된 서열은 5’ UUCCUAU GCAUAUACUUCUUUG-3’(서열번호 1, miR-202-5p) 및 5‘- AGAGGUAU AGGGCAUGGGAA-3’(서열번호 2, miR-202-3p)는 물론 전구 서열 5’- CGCCUCAGAGCCGCCCGCCGUUCCUUUUUCCUAUGCAUAUACUUCUUUGAGGAUCUGGCCUAA AGAGGUAU AGGGCAUGGGAAAACGGGGCGGUCGGGUCCUCCCCAGCG-3’ (서열번호 3)를 포함하는 것이다. 위의 서열에서 굵은 글씨체의 밑줄친 부분은 씨드서열을 나타내며, 서열번호 2에서 씨드서열은 씨드서열은 AGAGGUAU 또는 GAGGUAU이다.
miR-202는 종전 종양 발생과의 관련성이 개시되어 있었으나 (Hoffman AE et al (2013) Cancer Epidemiol Biomarkers Prev 22:327-336), 본원에서 처음으로 Oct 1을 코딩하는 mRNA의 3’비번역 부위에 결합하여 이의 발현을 조절하여 신경퇴행과 연관되어 있음을 규명하였다.
본원의 조성물에 포함되는 miR-202의 활성 억제는 이들의 세포내 작용 또는 기능을 억제 또는 방해하는 것을 의미하는 것으로 전형적으로 상기 마이크로알엔에이가 이의 표적 예를 들면 본원에서 규명된 Oct 1을 코딩하는 mRNA 분자와의 결합을 직접적으로 억제하거나, 또는 저분자 억제제, 항체 또는 항체의 단편을 이용하여 이들 마이크로알엔에이의 기능을 직접적으로 억제하거나, 또는 억제제 또는 소 방해 (small interfereing) RNA 분자를 이용하여 간접적으로 조절하는 것을 포함한다. 나아가 miR-202 활성의 방해 또는 억제는 직접 또는 간접적으로 전구서열 또는 성숙서열의 활성을 억제하는 것을 포함한다. 또한 miR-202의 활성 억제는 이들의 전사(발현)를 억제하여 이의 세포내 농도를 낮추는 것을 포함한다.
본원에서 용어 마이크로알엔에이의 “활성을 억제할 수 물질”은 이의 발현 및/또는 활성을 억제할 수 있는 임의의 물질을 포함한다. 이러한 물질은 예를 들면 앤타고미어, 안티센스 분자, 소헤어핀 RNA 분자 (shRNA), 소방해 RNA 분자 (siRNA), 씨드 표적 LNA (Locked Nucleic Acid) 올리고뉴클레오타이드, 데코이올리고뉴클레오타이드, 앱타머, 리보자임, 또는 DNA:RNA 하이브리드를 인지하는 항체를 포함할 수 있다.
본원에 사용된 용어 "안티센스 올리고뉴클레오타이드"는 표적으로 하는 miRNA, 특히 miRNA의 씨드 서열의 전부 또는 일부와 상보적인 서열을 가지고 있어 miRNA와 이합체(duplex)를 형성할 수 있는 핵산-기반 분자를 포괄하는 것이다. 따라서 본원에 사용된 용어 "안티센스 올리고뉴클레오타이드"는 "상보적 핵산-기반 억제제"로 나타낼 수 있다.
상기 안티센스 올리고뉴클레오타이드에는 다양한 분자가 포함되며, 예를 들면 리보핵산(RNA), 디옥시리보핵산(DNA), 앤타고미어, 2'-O-변형 올리고뉴클레오타이드, 포스포로티오에이트-백본 디옥시리보뉴클레오타이드, 포스포로티오에이트-백본 리보뉴클레오타이드, PNA(peptide nucleic acid) 올리고뉴클레오타이드 또는 LNA(locked nucleic acid) 올리고뉴클레오타이드이다.
바람직하게는 리보핵산이다. 상기 리보핵산은 이중가닥 siRNA(small interfering RNA), shRNA(short hairpin RNA) 및 라이보자임을 포함한다.
LNA는 변형 리보뉴클레오타이드로서 리보오스 당 부위의 2' 내지 4' 탄소 사이에 추가적인 브리지를 포함하여 잠금(locked) 형태를 가지게 되며 이에 LNA가 있는 올리고뉴클레오타이드는 개선된 열 안정성을 가지게 된다.
PNA(peptide nucleic acids)는 폴리뉴클레오타이드에서 당-포스페이트 백본 대신에 펩타이드-기반 백본을 포함한다. 2'-O-변형 올리고뉴클레오타이드는 바람직하게는 2'-O-알킬 올리고뉴클레오타이드이고, 보다 바람직하게는 2'-O-C1-3 알킬 올리고뉴클레오타이드이며, 가장 바람직하게는 2'-O-메틸 올리고뉴클레오타이드이다.
상기 안티센스 올리고뉴클레오타이드는, 좁은 의미의 안티센스 올리고뉴클레오타이드, 앤타고미어 및 억제 RNA 분자를 포함한다.
본원에 사용된 용어 "앤타고미어"는 단일-가닥의 화학적으로 변형된 올리고뉴클레오타이드로서, 내인성 microRNA의 차단 (silence)에 사용된다. 앤타고미어는 Arganoute 2 (Ago 2) 절단 부위에서 상보적이지 않는 서열을 포함하거나, 또는 Ago2 절단이 억제되도록 염기가 예를 들면 2' 메톡시기, 3' 콜레스테롤기, 포스포로씨오에이트로 변형되어 있으며, 표적서열에 상보적 서열을 가진다. 본원에 따른 앤타고미어는 본원에 따른 마이크로알엔에이에 적어도 부분적으로 또는 완전하게 상보적인 서열을 갖는다. 일 구현예에서 앤타고미어는 하나 이상의 변형 (예컨대, 2'-O-메틸-당 변형, 또는 3’ 콜레스테롤 변형)을 포함한다. 다른 구현예에서 앤타고미어는 하나이상의 포스포로씨오에이트 결합을 포함하며, 적어도 부분적으로 포스포로티오에이트 백본을 갖게 된다. 본원에 따른 마이크로알엔에이의 활성을 억제하기 위하여 적합한 앤타고미어의 길이는 7-50 뉴클레오타이드, 특히 10-40 뉴클레오타이드, 더욱 특히 15-30 뉴클레오타이드, 더더욱 특히 15-25 뉴클레오타이드, 특히 16 내지 19nt이나, 이로 제한하는 것은 아니다. 예를 들면 miR-202의 씨드서열 5'-AGAGGUAU-3’ 의 상보서열인 5'-AUACCUCU-3’을 포함하는 마이크로알엔에이 조절 물질을 포함한다.
본원에서 용어 "상보적"은 소정의 혼성화 또는 어닐링 조건, 바람직하게는 생리학적 조건 하에서 안티센스 올리고뉴클레오타이드가 본원에 따른 마이크로알엔에이의 표적에 선택적으로 혼성화 할 정도로 충분히 상보적인 것을 의미하며, 일부 또는 부분적으로 실질적으로 상보적(substantially complementary) 및 완전히 상보적 (perfectly complementary)인 것을 모두 포괄하는 의미를 가지며, 바람직하게는 완전히 상보적인 것을 의미한다. 실질적으로 상보적이란, 완전히 상보적인 것은 아니지만, 표적 서열에 결합하여 본원에 따른 효과 즉 마이크로알엔에이의 활성을 방해하기에 충분한 효과를 낼 정도의 상보성을 의미하는 것이다.
본원에서 용어 "핵산"은 폴리뉴클레오타이드, 올리고뉴클레오타이드, DNA, RNA, 및 그 유사체 및 그 유도체를 포함하는 것으로 예를 들면 펩타이드 핵산 (PNA) 또는 그 혼합물을 포함한다. 또한 핵산은 단일 또는 이중가닥일 수 있으며, 폴리펩타이드, mRNA, microRNA 또는 siRNA 등을 포함하는 분자를 코딩할 수 있다.
본원에 따른 일 구현예에서, 마이크로알엔에이의 활성을 억제할 수 있는 물질은 본원에 따른 마이크로알엔에이의 전구 및/또는 성숙 서열의 전부 또는 일부, 특히 씨드 서열에 상보적으로 결합하여, 이의 활성을 억제할 수 있는 안티센스 올리고뉴클레오타이드이다. 상기 활성의 억제는 본원에 따른 마이크로알엔에이의 전사 및/또는 이의 표적 mRNA와의 결합을 억제하는 것이다. 본원에 따른 안티센스 올리고뉴클레오타이드는 이를 구성하는 뉴클레오타이드 또는 뉴클레오타이드를 연결하는 백본(골격)이 하기 하나 이상의 변형을 포함할 수 있거나, 또는 포함하지 않을 수 있다. 즉 상기 안티센스 올리고뉴클레오타이드는 이를 구성하는 하나 이상의 뉴클레오타이드가 LNA, 또는 이를 구성하는 하나 이상의 뉴클레오타이드의 당이 2‘-O- 메틸화, 또는 이의 백본에 하나이상의 포스포티오에이트를 포함할 수 있다.
본원에 따른 일 구현예에서, 본원의 안티센스 올리고뉴클레오타이드 또는 핵산분자는 본원에 따른 마이크로알엔에이의 씨드서열의 전부 또는 일부에 상보적인 서열을 포함한다. 씨드 서열은 miRNA의 표적분자의 인지에 매우 중요한 다양한 종에서 보존된 서열이다(Krenz, M. et al., J. Am. Coll. Cardiol. 44:2390-2397(2004); H. Kiriazis, et al., Annu. Rev. Physiol.62:321(2000)). miRNA는 씨드서열을 통해 표적과 결합하기 때문에, 씨드서열의 표적과의 상호작용을 억제하는 경우, 표적 mRNA의 번역 등을 효과적으로 억제할 수 있다. 본원에서 miR-202의 씨드서열은 서열번호 1의 뉴클레오타이드 서열 중 1 번째 또는 7 번째까지, 또는 서열번호 2의 1 번째 또는 2번째 내지 8번째까지 뉴클레오타이드 서열, 또는 서열번호 3의 64 번째 내지 71번째까지 뉴클레오타이드 서열이다.
따라서 본원에 따른 일구현예에서 miR-202의 활성을 억제할 수 있는 핵산분자는 상기 서열번호 1의 뉴클레오타이드 서열 중 1 번째 또는 7 번째까지, 또는 서열번호 2의 1 번째 또는 2번째 내지 8번째까지 뉴클레오타이드 서열, 또는 서열번호 3의 64 번째 내지 71번째까지 뉴클레오타이드 서열의 전부 또는 일부에 상보적인 서열을 포함하는 안티센스 올리고뉴클레오타이드일 수 있으며, 예를 들면 본원의 안티센스 올리고뉴클레오타이드는 5’-UUCCCAUGCCCUAUACCUCU-3' (서열번호 4) 또는 5’-TTCCCATGCCCTATACCTCT-3' (서열번호 5)일 수 있다.
상기 올리고뉴클레오타이드를 구성하는 하나 이상의 각 뉴클레오타이드는 2‘-O- 메틸화되거나, 또는 상기 각 하나 이상의 뉴클레오타이드는 LNA이거나, 또는 상기 백본을 구성하는 화학결합 중 하나 이상은 포스포티오에이트일 수 있으나, 상기 변형을 포함하지 않을 수도 있다.
본원에서 miR-202이 Oct 1을 코딩하는 mRNA의 3’비번역 부위에 결합하여, 이의 발현을 조절하는 것을 규명하였다. miR-202는 종전 종양 발생과의 관련성이 개시되어 있었으나 (Hoffman AE et al (2013) Cancer Epidemiol Biomarkers Prev 22:327-336), 본원에서 처음으로 miR-202가 Oct 1을 코딩하는 mRNA의 3’비번역 부위에 결합하여 이의 발현을 조절하여 신경퇴행, 특히 다계통위축증의 소뇌 위축과 연관되어 있음을 규명하였다.
Oct 1 단백질은 150개의 아미노산 잔기를 포함하는 POU 영역을 포함하는 전사인자로서, 세포성 스트레스, 발암 및 스템니스 (stemness) 등과 관련된 다수의 표적 유전자를 조절한다 (Kang J et al. (2009) STrends Biochem Sci 34:491-499). Oct 1이 결여된 세포는 감마선 및 과산화수소에 매우 취약하여, 반응성 산소의 농도를 증가시키는 것으로 알려져 있다 (Tantin D, et al. (2005) Cancer Res 65:10750-10758).
따라서 MSA 소뇌에서 과발현된 miR-202는 Oct 1의 발현을 감소시켜, 뉴론세포가 산화성 스트레스에 취약하게 만들어 뉴론세포의 손상을 가져올 수 있으며, 본원에 따른 조성물을 사용한 miR-202의 발현 저해를 통해 관련 질환을 치료 또는 예방 할 수 있다.
따라서, 본원에 따른 miR-202의 활성을 억제할 수 있는 물질을 포함하는 조성물은 다계통위축증의 질환의 치료, 예방 또는 진단에 유용하게 사용될 수 있다.
다계통 위축증은 희귀한 진행성 신경퇴행성 질환으로 다양한 증상들이 복합적으로 나타나는 것이 특징이며, 예를 들면 소뇌조화운동불능(Cerebellar ataxia)과 심장박동, 혈압, 발한(Sweating), 배변과 방광 조절과 같은 자율신경계의 기능상실(Autonomic failure)과 같은 증상이 동반된다. 이는 파킨슨병과 비슷한 증상이 수반되나 파킨슨병과는 상이한 질환이며, 샤이-드래거증후군(Shy-Drager syndrome), 줄무늬체흑질변성(Striatonigral degeneration), 산발적 올리브다리소뇌위축(Sporadic olivopontocerebellar atrophy)을 포함한다. 다계통 위축증은 뇌의 신경세포(뉴런)의 진행적인 손실에 의해 유발되는데, 줄무늬체흑질변성(Striatonigral degeneration)은 흑색질과 줄무늬체로 알려진 뇌의 두 구조 내의 신경세포 사이의 소통의 파괴가 원인으로 알려져 있으나 정확한 원인은 현재까지 밝혀진 바 없다. 파킨슨병 등을 포함하는 기타 유사 질환들과의 구분이 어려워, 정확한 진단이 어려워, 치료제, 마커 등의 개발이 시급하다.
본원에 따른 조성물은 상술한 질환의 치료 또는 예방을 위해 제공되며, 궁극적으로 상기 질환의 예방 또는 치료가 필요한 대상체에게, 예방 또는 치료적으로 유효한 양으로 투여되어 상기 질환에 대한 예방 또는 치료에 효과적으로 사용될 수 있다.
본원에 사용된 용어 "치료" , "완화" 또는 "개선" 이란 본 조성물의 투여로 관련 질환의 증세를 호전시키거나 이롭게 변경하는 모든 행위를 의미한다. 본원이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자라면, 대한의학협회 등에서 제시된 자료를 참조하여 질환의 정확한 기준을 알고, 개선, 향상 및 치료된 정도를 판단할 수 있을 것이다.
본원에 사용된 용어 "예방"은 관련 질환의 발병을 억제 또는 지연시키는 모든 행위를 의미한다. 본원의 조성물은 초기 증상, 또는 나타나기 전에 투여할 경우 관련 질환을 예방할 수 있다는 것은 당업자에게 자명할 것이다.
본원 조성물은 본원에 따른 마이크로알엔에이의 활성을 억제할 수 있는 물질 이외에 질환의 치료와 관련하여 동일 또는 유사한 기능을 나타내는 유효성분을 1종 이상 또는 유효성분의 용해성 및/또는 흡수성을 유지/증가시키는 화합물을 추가로 함유할 수 있다. 또한 선택적으로, 화학치료제, 항염증제, 항바이러스제 및/또는 면역조절제 등을 추가로 포함할 수 있다.
본원 조성물은 상기 언급한 유효성분 이외에 추가로 약학적으로 허용가능한 희석제, 담체 및/또는 아주번트를 1종 이상 포함할 수 있다. 약학적으로 허용가능한 담체는 식염수, 멸균수, 링거액, 완충 식염수, 덱스트로즈 용액, 말토덱스트린 용액, 글리세롤, 에탄올, 리포좀 및 이들 성분 중 1 성분 이상을 혼합하여 사용할 수 있으며, 필요에 따라 항산화제, 완충액, 정균제 등 다른 통상의 첨가제를 첨가할 수 있다. 또한 희석제, 분산제, 계면활성제, 결합제 및 윤활제를 부가적으로 첨가하여 수용액, 현탁액, 유탁액 등과 같은 주사용 제형, 환약, 캡슐, 과립 또는 정제로 제제화할 수 있으며, 표적 기관에 특이적으로 작용할 수 있도록 표적 기관 특이적 항체 또는 기타 리간드를 상기 담체와 결합시켜 사용할 수 있다. 더 나아가 당해 기술분야의 적정한 방법으로 또는 레밍턴의 문헌(Remington's Pharmaceutical Science(최근판), Mack Publishing Company, Easton PA)에 개시되어 있는 방법을 이용하여 각 질환에 따라 또는 성분에 따라 바람직하게 제형화할 수 있다. 예를 들면 용액, 에멀젼 및 리포좀 제형 등과 같은 다양한 제형 및 투약형태로 제조될 수 있다. 예를 들면 활성성분을 약학적으로 허용가능한 액체 및/또는 미세분말의 고형 담체 또는 부형제와 혼합하여, 정제, 캡슐, 젤, 시럽 또는 좌제로 제조될 수 있다. 또한 본원에 따른 조성물은 수성, 비수성 또는 혼합 매질을 이용한 현탁액으로 제조될 수 있다. 수성 현탁액은 소디움 카르복시메틸셀룰로스, 소르비톨 및/또는 덱스트란과 같은 현탁액의 점도를 높이는 물질을 추가로 포함할 수 있다.
본원에 따른 조성물의 투여방법은 특별히 제한되는 것은 아니며, 공지된 억제제의 투여방법을 적용할 수 있으며, 목적하는 방법에 따라 비경구 투여(예를 들어 비강내, 정맥 내, 피하, 복강 내 또는 국소에 적용)하거나 경구 투여할 수 있으며, 신속한 치료효과를 얻기 위해서는 비강내 주입에 의한 투여가 바람직하다. 본원의 조성물은 또한 다양한 경로로 전달될 수 있으며, 예를 들면 인퓨전 또는 볼러스 주사, 표피 또는 점막 (경구점막, 항문 점막, 장 점막 등)을 통해 투여될 수 있다. 본원의 조성물은 또한 전신 또는 국소투여될 수 있다.
나아가 본원의 조성물은 적절한 경로를 통해 중추신경 또는 말초신경으로 도입하는 것이 바람직하다. 적절한 경로는 뇌실내 (intraventricular) 또는 수막내 (intrathecal) 투여를 포함한다. 이러한 투여는 저장고에 연결된 카테터를 이용하여 달성될 수 있다. 또한 에어로졸로 제형화되어 흡입기 또는 분무기를 통해 폐를 통한 투여가 사용될 수 있다. 본원에 따른 효과가 발생되는 한, 정맥내 투여, 피하 주사, 뇌척수강내 주사, 흡입투여, 또는 경구 투여용 제형을 제외하는 것은 아니다.
본원에 따른 일 구현예에서는 비강 투여된다. 비강투여시, 후각신경경로를 따라 뇌로 전달됨에 따라 본원 조성물의 효과를 높일 수 있다. 비강은 비중격에 의해 좌우로 구분되는 콧 속의 공간을 지칭하며, 비강내 투여는 본원의 조성물을 비강 상피의 어느 조직으로 전달하는 것을 말한다. 본원의 조성물의 비강내 투여를 위해 비강용으로 허용가능한 담체를 포함할 수 있는데, 상기 담체는 포유동물, 바람직하게는 인간의 비강 상피의 어느 부분에 투여하기에 적당한 한 종 이상의 적절한 고상 또는 필러 희석제 또는 캡슐화 물질을 말한다. 대표적으로, 상기 담체는 액체, 용액, 현탁액, 겔, 연고, 로션, 또는 이들의 조합일 수 있다. 바람직하게, 상기 담체는 약학적으로 허용가능한 수성 담체이다. 본 발명의 조성물은 여러 가지 단위 투여 형태로 제조될 수 있다. 이러한 형태로는 점비액(nasal drop), 비강용 스프레이, 비강용 겔, 비강용 연고, 및 비강용 분말이 있으나, 이에 제한되지 않는다.
또한 상기 담체에는 전달 강화제를 포함할 수 있는데, 비강내 전달 강화제에는, 응집 저해제, 투여량 변경제, pH 제어제, 분해 효소 저해제, 점액질 용해 또는 점액 제거제, 섬모안정 시약들, 막투과 촉진제(예를 들면, 계면 활성제, 담즙산염, 인지질 또는 지방산 첨가제, 혼합 미셀(micelle), 리포솜, 또는 담체, 알콜, 에나민(enamine), 산화질소 공여체 혼합물, 긴 사슬(long-chain) 양친매성 분자, 소형 소수성 침투 강화제, 나트륨 또는 살리실산 유도체, 아세토아세트산의 글리세롤 에스테르, 시클로덱스트린 또는 베타-시클로덱스트린 유도체, 중간 사슬 지방산, 킬레이트 시약, 아미노산 또는 그의 염, N-아세틸아미노산 또는 그의 염, 선택된 막 성분에 대한 분해 효소, 지방산 합성 저해제, 콜레스테롤 합성 저해제 또는 산화질소 자극 물질, 키토산, 그리고 키토산 유도체와 같은 상피 접합 생리학의 조절 약제, 혈관 확장제, 선택적 운반 촉진제 그리고 비내 점막 전달을 강화하기 위해, 본원의 조성물이 효과적으로 조합되고, 결합되고, 보관되고, 캡슐화 되거나 활성 약제를 안정시킬 수 있게 해주는, 안정적 운송체, 담체, 지지 물질 또는 착물 생성종(complex-forming species) 등이 포함될 수 있다.
본원에 따른 조성물은 약학적으로 유효한 양으로 투여한다. 본 발명에 있어서, "약학적 또는 치료적으로 유효한 양"은 의학적 치료에 적용 가능한 합리적인 수혜/위험 비율로 질환을 치료하기에 충분한 양을 의미하며, 유효용량 수준은 환자의 질환의 종류, 중증도, 약물의 활성, 약물에 대한 민감도, 투여 시간, 투여 경로 및 배출 비율, 치료기간, 동시 사용되는 약물을 포함한 요소 및 기타 의학 분야에 잘 알려진 요소에 따라 결정될 수 있다. 본 발명의 조성물은 개별 치료제로 투여하거나 다른 치료제와 병용하여 투여될 수 있고 종래의 치료제와는 순차적 또는 동시에 투여될 수 있으며, 단일 또는 다중 투여될 수 있다. 상기한 요소들을 모두 고려하여 부작용 없이 최소한의 양으로 최대 효과를 얻을 수 있는 양을 투여하는 것이 중요하며, 이는 당업자에 의해 용이하게 결정될 수 있다.
투여량은 환자의 체중, 연령, 성별, 건강상태, 식이, 투여시간, 투여방법, 배설률 및 질환의 중증도 등에 따라 그 범위가 매우 다양하며, 적정한 투여량은 예를 들면 환자의 체내에 축적된 약물의 양 및/또는 사용되는 폴리뉴클레오타이드의 구체적 효능정도에 따라 달라질 수 있다. 일반적으로 인비보 동물모델 및 인비트로에서 효과적인 것으로 측정된 EC50을 기초로 계산될 수 있으며, 예를 들면 체중 1kg당 0.01 μg 내지 1 g 일 수 있으며, 일별, 주별, 월별 또는 연별의 단위 기간으로, 단위 기간 당 일회 내지 수회 나누어 투여될 수 있으며, 또는 인퓨전 펌프를 이용하여 장기간 연속적으로 투여될 수 있다. 반복투여 횟수는 약물이 체내 머무는 시간, 체내 약물 농도 등을 고려하여 결정된다. 질환 치료 경과에 따라 치료가 된 후라도, 재발을 위해 조성물이 투여될 수 있다.
본원에 따른 유효성분 예를 들면 안티센스 올리고뉴클레오타이드는 그 자체로 또는 약학적으로 허용가능한 염의 형태로 조성물에 사용될 수 있다. 약학적으로 허용가능한 염이란, 본원에 따른 폴리뉴클레오타이드의 생물학적 활성은 유지하면서, 바람직하지 않는 독성은 최소화된 것이다. 이러한 염은 예를 들면 아연, 칼슘, 비스부스, 바륨, 마그네슘, 알루미늄, 코퍼, 코발트, 니켈, 카드뮴, 소디움, 포타슘 등과 같은 금속 양이온과 형성된 염기 부가염 및 유기 아미노산과 형성된 염, 또는 암모니아, N,N-디벤질에틸렌디아민 (dibenzylethylene-diamine), D-클루코사민 (glucosamine), 테트라에틸암모늄(tetraethylammonium), 또는 에틸렌디아민(ethylenediamine) 유래의 양이온과 형성된 염을 포함 할 수 있으나, 이로 제한하는 것은 아니다.
본원에 따른 일 구현예에서, 본원의 유효성분 예를 들면 안티센스 올리고뉴클레오타이드는 이를 이루는 뉴클레오타이드의 특성상 음으로 하전되어 있다. 세포막은 친지질성 성질로 인해, 안티센스 올리고뉴클레오타이드의 세포막으로의 흡수가 감소될 수 있다. 이러한 극성으로 인한 흡수 방해는 하기에 기재된 전구약물 접근방식을 통해 해결될 수 있다 (Crooke, R. M. (1998) in Crooke, S. T. Antisense research and Application. Springer-Verlag, Berlin, Germany, vol. 131, pp. 103-140).
다른 양태에서 본원은 miR-202의 뉴클레오타이드 서열, 그의 상보적 서열 또는 상기 서열의 단편을 포함하는 발작 질환의 진단용 키트에 관한 것이다. 상기 뉴클레오타이드 서열은 상술한 바와 같으며, 또한 miRBase (http://www.mirbase.org)에서 확인할 수 있다.
본원의 miR-202분자들은 도 1에 나타나있는 바와 같이, MSA 시료에서 차등 발현된(differentially expressed) miRNA이다.
따라서, 본 발명의 진단 키트는 앞서 기술한 바와 같은 다계통위축증의 진단에 이용될 수 있다.
본 발명의 키트는 상기한 성분 이외에도, 다른 성분들을 추가적으로 포함할 수 있다. 예를 들어, 본 발명의 키트가 PCR 증폭 과정에 적용되는 경우에는, 본 발명의 키트는 선택적으로, PCR 증폭에 필요한 시약, 예컨대, 완충액, DNA 중합효소 (예컨대, Thermus aquaticus (Taq), Thermus thermophilus (Tth), Thermus filiformis, Thermis flavus, Thermococcus literalis 또는 Pyrococcus furiosus (Pfu)로부터 수득한 열 안정성 DNA 중합효소), DNA 중합 효소 보조인자 및 dNTP를 포함할 수 있다. 본 발명의 키트는 상기한 시약 성분을 포함하는 다수의 별도 패키징 또는 컴파트먼트로 제작될 수 있다.
본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 본 발명의 키트는 마이크로어레이일 수 있다. 본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 본 발명의 키트는 유전자 증폭 키트이다.
본 발명의 키트가 마이크로어레이인 경우에는, 마이크로어레이의 고상표면에 프로브가 고정화 되어 있다. 본 발명의 키트가 유전자 증폭 키트인 경우에는 프라이머를 포함한다. 프로브 또는 프라이머는 본원에 따른 miR-466 및 miR-let7 중 하나 이상을 특이적으로 인식하는 것으로 상기 서열에 상보적인 서열을 가진다. 본원에 사용된 용어 "상보적(complementary)"은 상기에서 정의된 바와 같이, 소정의 혼성화 또는 어닐링 조건하에서 상기 뉴클레오타이드 서열에 선택적으로 혼성화할 정도의 상보성을 갖는 것을 의미하며, 본 발명의 프로브 또는 프라이머는 완전 상보적인 것 이외에 상기 뉴클레오타이드 서열에 선택적으로 혼성화할 수 있을 정도이면, 하나 또는 그 이상의 미스매치(mismatch) 염기서열을 가질 수 있다.
프라이머 또는 프로브 제작 시 참조하여야 하는 본 발명의 miRNA의 뉴클레오타이드 서열은 miRBase에서 확인할 수 있으며, 이 서열을 참조하여 프라이머 또는 프로브를 디자인할 수 있다.
또 다른 양태에서 본원은 생물학적 시료에서 miR-202의 발현량을 결정하는 단계; 및 상기 검출된 miR-202 농도를 검사 대상자의 다계통위축증 진단 또는 예후와 연관시키는 단계를 포함하는, 다계통위축증의 진단 또는 예후에 필요한 정보를 제공하기 위하여 miR-202를 다계통 위축증에 대한 마커로서 사용하기 위해 이를 검출하는 방법에 관한 것이다.
본원에 따른 방법에서 상기 연관시키는 단계는 miR-202의 발현량을 대조군에서 결정된 miR-202 검출결과와 비교하는 것으로 상기 miR-202는 대조군과 비교하여 그 발현량이 증가한 것이다.
나아가 본원에 따른 방법은 마커의 발현량을 검사 대상자의 다계통위축증의 진단 또는 예후 판별시에 검사 대상자의 비마커 임상정보를 추가로 사용할 수 있다. 이러한 검사 대상자의 비마커 임상정보는 상기 대상자의 나이, 성별, 체중, 식습관, 체질량, 기저질환, 혈액검사, 뇌 MRI, 뇌 CT, 또는 뇌 척수액 검사 중 하나 이상을 포함하나 이로 제한하는 것은 아니다.
본 발명의 키트 또는 방법에 의해 분석된 상기 miRNA의 발현 정도, 예컨대, RT(reverse transcriptase)-PCR 또는 실시간(real-time)-PCR 방법(참조: Sambrook, J. et al., Molecular Cloning. A Laboratory Manual, 3rd ed. Cold Spring Harbor Press(2001))에 의해 측정된 발현 정도가 정상 대조군과 비교하여 1.5배 이상, 바람직하게는 2배이상의 발현도를 나타내는 경우에는 분석 시료를 채취한 대상체의가 다계통위축증을 앓고있거나 발병 위험도가 높은 것으로 판정한다.
다른 양태에서 본원은 본원에 따른 마이크로알엔에이를 시험물질과 접촉시키는 단계; 및 상기 시험물질과 접촉된 마이크로알엔에이의 활성을 결정하는 단계를 포함하며, 상기 접촉된 마이크로알엔에이의 활성이, 상기 시험물질과 접촉되지 않은 대조군의 마이크로알엔에이의 활성과 비교하여 감소한 경우 이를 후보물질로 선별하는 것인, 다계통위축증의 질환 치료 또는 예방용 물질의 스크리닝 방법에 관한 것이다.
본원에 따른 일 구현에서, 본원에 따른 마이크로알엔에이는 인비트로 이를 발현하는 세포의 형태로 제공될 수 있으나, 이로 제한하는 것은 아니다. 상기 활성은 상기 이들 마이크로알엔에이의 발현으로 분석되는 것이다. 예를 들어 본원에 따른 마이크로알엔에이를 발현하는 세포를 시험물질과 접촉시킨 후, 이의 ?현량의 변화를 접촉전 또는 접촉되지 않은 대조군 세포와 비교하여, 발현량에 변동, 특히 감소가 있는 것을 후보물질로 선별한다. 본원에 따른 방법에 사용되는 마이크로알엔에이의 발현량은 노던블롯, RT-PCR, 마이크로어레이를 이용한 혼성화 방법 등과 같은 공지된 방법을 이용하여 수행될 수 있다.
본원에 따른 일 구현예에서 상기 활성은 상기 마이크로알엔에이와 이의 표적, 예를 들면 Oct 1의 3'-UTR 과의 상호작용 분석으로 결정된다. 예를 들어 본원에 따른 마이크로알엔에이를 발현하는 세포를 시험물질과 접촉시킨 후, 표적 유전자의 Oct 1의 3'-UTR과의 상호작용 정도를 접촉전 또는 접촉되지 않은 대조군 세포와 비교하여, 상호작용에 변동, 특히 감소가 있는 것을 후보물질로 선별한다. 본원에 따른 방법에 사용되는 RNA-RNA 상호작용을 검출하는 방법은 당업계의 공지된 것으로 예를 들면 RNA Walk (Lusting et al., Nucleic Acids Res. 2010; 38(1):e5 에 기재된 것 참조) 또는 Yeat two hybrid system (Piganeau et al., RNA 2006; 12: 177-184) 등을 이용하여 검출할 수 있으며, RNA: A Laboratory Manual (Cold Spring Harbor Laboratory Press 2011)를 참조할 수 있다.
본 방법에서 사용되는 세포의 종류 및 시험물질의 양 및 종류 등은 사용하는 구체적인 실험방법 및 시험물질의 종류에 따라 달라지며, 당업자라면 적절한 세포의 종류, 양 및/또는 조건을 선택할 수 있을 것이다. 실험결과 시험물질과 접촉되지 않은 대조군과 비교하여 시험물질의 존재하에서 마이크로알엔에이의 활성의 감소를 가져오는 물질을 후보물질로 선별한다. 대조군과 비교 약 99% 이하 감소, 약 95% 이하 감소, 약 90% 감소, 약 85% 감소, 약 80% 감소, 약 75% 감소, 약 70% 감소, 약 65% 이하 감소, 약 60% 이하 감소, 약 55% 감소, 약 50% 이하 감소, 약 45% 이하 감소, 약 40% 이하 감소, 약 30% 이하 감소, 약 20% 이하 감소를 의미하나, 이를 벗어나는 범위를 제외하는 것은 아니다.
본원의 "시험물질"은 상술한 바와 같은 본원에 따른 마이크로알엔에이의 활성 억제할 것으로 기대되는 물질을 의미하여, 저분자량 화합물, 고분자량 화합물, 화합물들의 혼합물(예컨대, 천연 추출물 또는 세포 또는 조직 배양물), 또는 바이오의약품(예컨대, 단백질, 항체, 펩타이드, DNA, RNA, 안티센스 올리고뉴클레오타이드, RNAi, 앱타머, RNAzyme 및 DNAzyme), 또는 당 및 지질 등을 포함하나 이로 한정하는 것은 아니다. 상기 시험물질은 2개 이상의 아미노산 잔기, 예컨대 6개, 10개, 12개, 20개 이하 또는 20개 초과 예컨대 50개 아미노산 잔기를 갖는 폴리펩타이드일 수 있다. 상기 시험 물질은 합성 또는 천연 화합물의 라이브러리로부터 얻을 수 있으며 이러한 화합물의 라이브러리를 얻는 방법은 당업계에 공지되어 있다. 합성 화합물 라이브러리는 Maybridge Chemical Co.(UK), Comgenex(USA), Brandon Associates(USA), Microsource(USA) 및 Sigma-Aldrich(USA)에서 구입 가능하며, 천연 화합물의 라이브러리는 Pan Laboratories(USA) 및 MycoSearch(USA)에서 구입 가능하다. 시험 물질은 당업계에 공지된 다양한 조합 라이브러리 방법에 의해 얻을 수 있으며, 예를 들어, 생물학적 라이브러리, 공간 어드레서블 패러럴 고상 또는 액상 라이브러리(spatially addressable parallel solid phase or solution phase libraries), 디컨볼루션이 요구되는 합성 라이브러리 방법, “1-비드 1-화합물” 라이브러리 방법, 그리고 친화성 크로마토그래피 선별을 이용하는 합성 라이브러리 방법에 의해 얻을 수 있다. 분자 라이브러리의 합성 방법은, DeWitt et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 90, 6909, 1993; Erb et al. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 91, 11422, 1994; Zuckermann et al., J. Med. Chem. 37, 2678, 1994; Cho et al., Science 261, 1303, 1993; Carell et al., Angew. Chem. Int. Ed. Engl. 33, 2059, 1994; Carell et al., Angew. Chem. Int. Ed. Engl. 33, 2061; Gallop et al., J. Med. Chem. 37, 1233, 1994 등에 개시되어 있다.
본원에 따른 일 구현 예에서 다계통위축증 질환을 치료하는 약물의 스크리닝 목적을 위해서는 화합물은 저분자량의 치료효과를 갖는 것이 사용될 수 있다. 예를 들면 중량이 400 Da, 600 Da 또는 800 Da과 같은 약 1000 Da 내외의 화합물이 사용될 수 있다. 목적에 따라 이러한 화합물은 화합물 라이브러리의 일부를 구성할 수 있으며, 라이브러리를 구성하는 화합물의 숫자도 수십개부터 수백만개까지 다양하다. 이러한 화합물 라이브러리는 펩타이드, 펩토이드 및 기타 환형 또는 선형의 올리고머성 화합물, 및 주형을 기본으로 하는 저분자 화합물, 예컨대 벤조디아제핀, 하이단토인, 바이아릴, 카보사이클 및 폴리사이클 화합물 (예컨대 나프탈렌, 페노티아진, 아크리딘, 스테로이드 등), 카보하이드레이트 및 아미노산 유도체, 디하이드로피리딘, 벤즈하이드릴 및 헤테로사이클 (예컨대 트리아진, 인돌, 티아졸리딘 등)을 포함하는 것일 수 있으나, 이는 단지 예시적인 것으로 이로 한정되는 것은 아니다.
또한 예를 들면 바이올로직스가 스크리닝에 사용될 수 있다. 바이올로직스는 세포 또는 바이오분자를 일컫는 것으로, 바이오분자란, 단백질, 핵산, 탄수화물, 지질 또는 생체내 및 생체외에서 세포 시스템 등을 이용하여 생산된 물질을 일컫는 것이다. 바이오분자를 단독으로 또는 다른 바이오분자 또는 세포와 조합으로 제공될 수 있다. 바이오분자는 예를 들면, 폴리뉴클레오타이드, 펩타이드, 항체, 또는 기타 혈장에서 발견되는 단백질 또는 생물학적 유기물질을 포함하는 것이다.
이하, 본 발명의 이해를 돕기 위해서 실시예를 제시한다. 그러나 하기의 실시예는 본 발명을 보다 쉽게 이해하기 위하여 제공되는 것일 뿐 본 발명이 하기의 실시예에 한정되는 것은 아니다.
실시예
본 실시예에 사용된 실험방법은 다음과 같다.
인간 뇌 시료 동결된 상태의 인간 소뇌 시료는 NICHD Brain and Tissue Bank for Developmental Disorders (Baltimore,MD, USA)에서 수득하였다. MSA 및 대조군 소뇌 (그룹당 n=4)를 사후경과 기간, 나이 및 성별로 매치하였다. 사용된 시료는 소뇌반구 (상면) 유래의 피질을 시료당 1g 사용하였으며, 0.5g은 RNA 추출에 나머지는 단백질 분석에 사용하였다.
miRNA 마이크로어레이 분석 및 표적 유전자 발굴
상기 시료로부터 Trizol(Invitrogen, USA)를 제조자의 방법대로 사용하여 총 miRNA를 추출하였으며, 각 RNA 시료의 농도는 Agilent 2100 Bioanalyzer (Agilent Technologies, Santa Clara, CA, USA)를 사용하여 측정하였다. miRNA 발현 프로파일은 866개의 인간 miRNA을 검출하는 마이크로어레이 8x15K 키트 (Agilent Technologies, Inc)를 제조자의 방법대로 사용하여 분석하였다. 데이터는 GenowizTM(OcimumBiosolutions,Hyderabad,India)를 제조자의 방법대로 사용하여 분석하였다. 총 8 개의 시료 (4개 정상 대조군 및 4개 MSA 소뇌)를 단일 마이크로어레이 칩에서 분석하였다. 상향 발현은 대조군과 비교하여 발현에 있어서 > 2 배 증가한 것으로 정의하였고, P-value vs. 대조군 < 0.05 이었다. 하향 발현은 발현에 있어서 > 2 배 감소한 것으로 정의하였고, P-value vs. 대조군 < 0.05 이었다.
발현이 상승된 miRNA의 성숙서열은 miRBase (http://www.mirbase.org)에서 수득하였다. 발현이 상승된 miRNA의 표적은 miRNA 표적 예측 사이트 TargetScan (www.targetcan.org) Lewis BP, et al, (2005) Cel1 20:15-20; Pictar (http://pictar.mdc-berlin.de/) Krek A, et al (2005) Nat Genet 37:495-500, 및 microT (Kiriakidou M et al (2004) Genes Dev 18:1165-1178)를 이용하여 상승된 miRNA의 가능한 표적을 찾았다. 표적 유전자의 소뇌에서의 발현은 GENSAT Atlas (http://www.gensat.org)를 이용하여 확인하였다.
miRNA의 실시간 PCR
마이크로에레이 분석을 통해 선별된 miRNA를 qRT-PCR(역전사 정량 PCR)을 이용하여 검증하였다. 실시간 PCR은 TaqMan® MicroRNA Assays (Life Technologies, USA)를 이에 포함된 프로브 및 프라이머를 제조자의 방법대로 사용하여 수행하였고 ABI PRISM 7000 sequence detection system (Ambion-Applied Biosystems, USA)를 이용하여 PCR　증폭하여 분석하였다. 조건은 50℃에서 2분 및 95℃에서 10분 열처리 이후에, 95℃ 15초 및 60℃ 60초로 구성된 40 사이클의 열처리를 반복 수행하였다. 모든 반응은 삼중으로 실시되었다. 상대적 발현정도는 비교 역치사이클(comparative threshold cycle, Ct) 2-ΔCt 식을 이용하여 계산하였으며, miRNA 농도는 내인성 snoRNA detection kit (Ambion-Applied Biosystems)를 이용하여 측정된 snoRNA202 농도에 노말라이즈 하였다.
루시퍼라제 분석
루시퍼라제 분석은 종전에 기술된 바와 같이 분석하였다 (Lee ST, et al (2012) Ann Neurol 72:269-277). 요약하면, 인간 표적 유전자의 3' UTR (Untranslated Region, 비번역부위) 서열을 갖는 루시퍼라제 벡터를 사용하였다 (transfection-ready firefly-luciferase reporter construct: Product ID:S803410, S814351, S808010, S808906, SwitchGear Genomics, USA).
Hela 세포를 10% FBS를 포함하는 RPMI 배지에서 5 x 104 세포의 농도로 24웰 플레이트의 각 웰에 시딩하였다. 이어 24시간 후에, 세포를 50 nM의 miRNA-202 duplexes (또는 스크램블도 miRNA duplexes; Bioneer, South Korea), 83 ng/ml의 3’-UTR firefly-luciferase expression vectors, 및 83 ng/ml의 Renilla-luciferase expression empty vectors (SwitchGear Genomics)로 Lipofectamine 2000을 제조자의 방법대로 이용하여 전달이입하였다. 파이어플라이 및 레닐라 루시퍼라제의 활성은 48시간 후에 the Dual-Luciferase(R) Reporter 1000 Assay System (Promega, USA)을 제조자의 방법대로 사용하여 측정하였다. 레닐라 루시퍼라제 활성에 대한 파이어플라이 루시퍼라제 활성의 비를 분석에 사용하였다.
인비트로 전달이입, 웨스턴블랏 및 과산화수소 처리 Neuro-2a 세포 (American Type Culture Collection, USA)에 50 nM의 miR-202 duplex (Guide: 5‘- AGAGGUAUAGGGCAUGGGAA-3’, Passenger: 5‘-UUCCUAUGCAUAUACUUCUUUG3’)
또는 스크램블드 miRNA duplex; Bioneer), 50 nM antagomir-202 (AM202, 2‘-O-methylated-5’-UUC CCA UGC CCU AUA CCU CU-3’), 또는 모두를 Lipofectamine 2000 (Life Technology, USA)를 제조자의 방법대로 이용하여 전달이입하였다. 용량에 따른 효과를 보기위해 상이한 농도의 miR-202 (0, 25, 및 100 nM)를 Neuro-2a 세포에 전달이입하였다. 발현량의 변화를 보기위해, 전달이입 48시간 후에 세포를 수확하여 균질화물을 제조하고 웨스턴 블랏을 수행하였다. 웨스탄블랏에는 다음 단백질에 대한 항체를 사용하였다: Pou2f1 (Oct1; Santa Cruz Biotechnology, USA), Foxp2 (Abcam, UK), Acvr2a (Santa Cruz Biotechnology), 및 Gad1 (Santa Cruz Biotechnology). 상기 항체에 반응하는 단백질은 화학발광시약 (Pierce, USA)을 제조자의 방법대로 사용하여 가시화하고, GS-700 scanner (Bio-Rad, USA)로 스캔하였다. 각 밴드의 강도는 Image-J software (National Institutes of Health, USA)를 이용하여 베타 액틴 밴드에 대한 상대값으로 측정하였다. 인간 소뇌 시료에서의 단백질 발현도 상기와 같은 항체를 이용한 웨스턴 블랏으로 측정하였다.
miRNA 전달이입 후 과산화수소 처리는 다음과 같이 수행되었다. Neuro-2a 세포를 50 nM miR-202 duplex, 50 nM AM202, 또는 모두로 전달이입하고, H2O2 (1 mM) 또는 대조군으로 동량의 멸균수로 4시간 동안 처리하였다. 세포 생존 %는 WST-1 assay kit (Roche, Switzerland)를 제조자의 방법대로 사용하여 분석하였다.
통계 분석
miRNA 발현에 대한 히트 맵(Heat map)은 Z-스코어를 사용하여 생성하였는데, 이는 하기와 같이 계산하였다: Z-스코어 = [(각 miRNA의 발현에 대한 원수치(raw value) - 모든 miRNA 발현에 대한 평균 수치/모든 miRNAS 발현의 표준 편차]. 그룹간 비교는 스튜던트-t 테스트를 사용하여 수행되었다. 투테일드 p-value < 0.05를 통계적으로 유의한 것으로 간주하였다. 단백질 및 miRNA 농도에서 이변수 상관관계는 Pearson 상관계수를 이용하여 분석하였다.
실시예 1 소뇌 퇴행 조직에서 miR-202의 상향 발현
실험방법에 기재된 바와 같이 사후경과 기간, 성별 및 나이에서 매치된 4개의 MSA 시료 및 대조군 시료에서 miRNA 발현 프로파일을 비교하였다. 시료의 특징은 표 1에 기재되어 있으며, 각 그룹은 동일한 수의 남성 및 여성 시료를 포함하였으며, 나이 (control, 59.3±12.6 y; MSA, 60.3±11.6) 및 시료 수득시까지 사후 경과 기간 (control, 4.8±1.3 days; MSA, 4.5±1.7 days)는 유사하였다.
[표 1]
Figure 112014085175601-pat00001
miRNA 분석결과 총 9개의 miRNA (miR-129-3p, miR-129-5p, miR-337-3p, miR-380, miR-433, miR-132, miR-410, miR-206, and miR-409-5p)가 대조군과 비교하여 MSA 시료에서 유의적으로 하향 발현된 것으로 나타났다 (>2 배 감소, P<0.05). 두 개의 miRNA (miR-202, 및 miR-199a-5p)가 대조군과 비교하여 MSA 시료에서 유의적으로 상향 발현된 것으로 나타났다 (>2 배 증가, P<0.0.5, 도 1a 및 1b 참조). 발현 정도에 있어서는 miR-202가 가장 높은 상향 발현되었다.
이어 마이크로어레이 분석의 가양성 결과를 배제하기 위하여, 인간 소뇌 시료에서 miR-202에 대한 실시간 RT-PCR을 수행한 결과, 도 1c에 기재된 바와 같이 정상 대조군 시료와 비교하여 인간 MSA 시료에서 miR-202의 발현이 증가한 것으로 나타났다 (2.68-배 증가, P=0.029, Mann-Whitney U test). 이를 근거로 miR-202를 추가분석에 사용하였다.
실시예 2 miR-202의 표적 규명
실험방법에 기재된 바와 같이 TargetScan, PicTar, 및 microT를 이용하여, miR-202의 3‘ UTR 표적 부위를 규명하였다. 표적 유전자의 발현은 GENSAT Atlas를 이용하여 확인하였다. 그 결과 다음과 같은 6개의 가능한 표적을 규명하였다: Oct1 (Pou2f1; two positions), Foxp2, Acvr2a (two positions), 및 Gad1. 표적 부위는 도 2a에 기재되어 있다.
이어 인실리코 예측 결과를 확인하기 위하여, 상기 규명된 각 유전자의 3‘ UTR을 포함하는 벡터를, miR-202의 존재 또는 부재 중에서 Hela 세포에 전달이입하였다. 그 결과 도 2b에 나타난 바와 같이 miR-202는 Oct1, Acvr2a, 및 GAD1 3‘ UTR의 발현을 감소시켰다.
이어, miR-202가 Oct1, Acvr2a, 및 GAD1의 발현에 미치는 영향을 Neuro-2a 세포에 해당 벡터를 전달이입 한 후 웨스턴블랏으로 조사하였다. 그 결과 도 2c 및 도 2d에 나타난 바와 같이, miR-202의 전달이입으로 인해, 스크램블드 miRNA와 비교하여 Oct 1의 농도가 감소하였으며, 이러한 결과는 miR-202의 표적이 Oct 1임을 나타내는 것이다. 정상 Neuro-2a 세포는 검출가능한 양의 miR-202를 발현하는 것으로 나타났다 (결과는 나타내지 않음).
실시예 3 소뇌 퇴행에서 miR-202 및 Oct 1의 역할
MSA 및 대조군에서 Oct1, Foxp2, Acvr2a, and Gad1 단백질의 농도를 웨스턴블랏으로 분석하였다 (도 3a 참조). Oct1의 농도는 대조군과 비교하여 MSA 소뇌에서 그 발현이 낮은 것으로 나타났다 (도 3b). 또한 Oct 1 단백질의 발현은 miR-202의 농도와 인간 소뇌 시료에서 상관관계가 있는 것으로 나타났다 (Pearson’s correlation coefficient=-0.839, P=0.009) (도 3c 참조). 이러한 결과는 miR-202의 발현 증가에 의해 Oct1 발현이 감소되었음을 나타내는 것이다. 상기 결과는 상이한 농도 (0, 25, 및 100 nM)의 miR-202를 Neuro-2a로 전달이입한 인비트로 실험에서 재확인되었다. miR-202의 농도가 높을수록 (100 > 25 > 0 nM), Oct 1 단백질의 발현이 보다 효율적으로 감소되는 것으로 나타났다 (도 3d 참조).
Oct 1은 GENSAT 아틀라스에 의하면 프루키네 (Purkinje) 세포에서 발현되는 단백질로, 산화성 스트레스에 대한 세포의 반응에서 중요한 기능을 하는 전사인자이다 (Kang J et al (2009) Genes Dev 23:208-222). 산화성 스트레스는 MSA의 병인과 관련되어 있다 (Stefanova N et al (2009) Multiple system atrophy: an update. Lancet Neurol 8:1172-1178; Ahmed Z et al (2012) Neuropathol Appl Neurobiol 38:4-24). 따라서 이를 근거로 miR-202를 Neuro-2a 세포에서 과발현 시킨 결과, 도 4a 및 4b에 나타난 바와 같이 과산화수소에 의해 유발된 신경 손상의 증가를 가져왔다. 반면 안타고미어 (AM202)를 처리한 결과 과산화수소의 존재 중에서도 이러한 효과가 억제되었다. 이러한 결과는 MSA 소뇌에서의 miR-202의 발현 증가는 소뇌 퇴행으로 이어진다는 것을 나타내는 것으로, miR-202이 MSA의 치료 및 진단의 표적 물질이 될 수 있음을 또한 나타내는 것이다.
정리하면, 본원에서는 MSA 환자의 뇌에서 miR-202가 상향 발현되고, 이는 Oct 1 발현을 감소시켜 이로 인해 신경 세포의 산화성 손상이 유발되는 것을 규명하였다. 이러한 결과는 miRNA가 소뇌 퇴행의 한 병인으로 관여하며, 따라서, miRNA MSA의 치료 및 진단의 표적 물질이 될 수 있음을 또한 나타내는 것이다.
이상에서 본원의 예시적인 실시예에 대하여 상세하게 설명하였지만 본원의 권리범위는 이에 한정되는 것은 아니고 다음의 청구범위에서 정의하고 있는 본원의 기본 개념을 이용한 당업자의 여러 변형 및 개량 형태 또한 본원의 권리범위에 속하는 것이다.
본 발명에서 사용되는 모든 기술용어는, 달리 정의되지 않는 이상, 본 발명의 관련 분야에서 통상의 당업자가 일반적으로 이해하는 바와 같은 의미로 사용된다. 본 명세서에 참고문헌으로 기재되는 모든 간행물의 내용은 본 발명에 도입된다.
<110> SNU R&DB Foundation <120> Composition and method for treating or preventing multiple system atrophy targeting miRNA202 <130> DP201407007P <160> 5 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 22 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 1 uuccuaugca uauacuucuu ug 22 <210> 2 <211> 20 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 2 agagguauag ggcaugggaa 20 <210> 3 <211> 110 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 3 cgccucagag ccgcccgccg uuccuuuuuc cuaugcauau acuucuuuga ggaucuggcc 60 uaaagaggua uagggcaugg gaaaacgggg cggucggguc cuccccagcg 110 <210> 4 <211> 20 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> antagomir for miR-202 <400> 4 uucccaugcc cuauaccucu 20 <210> 5 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> DNA corresponding to antagomir for miR-202 <400> 5 ttcccatgcc ctatacctct 20

Claims (19)

  1. 마이크로알엔에이 (miR)-202의 활성을 억제할 수 있는 물질 및 약학적으로 허용가능한 담체를 포함하는, 다계통위축증 치료 또는 예방용 약학 조성물로,
    상기 miR-202의 활성을 억제할 수 있는 물질은
    서열번호 1의 핵산서열로 표시되는 miR-202 핵산분자의 1번째 내지 7번째 핵산서열에 상보적 서열을 포함하는 안티센스 올리고뉴클레오타이드;
    서열번호 2의 핵산서열로 표시되는 miR-202 핵산분자의 1번째 또는 2번째 내지 8번째 핵산서열에 상보적 서열을 포함하는 안티센스 올리고뉴클레오타이드; 또는
    서열번호 3의 핵산서열로 표시되는 miR-202 핵산분자의 64번째 내지 71번째 핵산서열에 상보적 서열을 포함하는 안티센스 올리고뉴클레오타이드인, 다계통위축증 치료 또는 예방용 약학 조성물.
  2. 삭제
  3. 삭제
  4. 삭제
  5. 삭제
  6. 제 1 항에 있어서, 상기 안티센스 올리고뉴클레오타이드는 이를 구성하는 하나 이상의 뉴클레오타이드가 LNA, 또는 이를 구성하는 하나 이상의 뉴클레오타이드의 당이 2'-O- 메틸화, 또는 이를 구성하는 뉴클레오타이드 사이의 결합에 하나이상의 포스포티오에이트, 또는 이들의 조합을 포함하는 것인, 다계통위축증 치료 또는 예방용 약학 조성물.
  7. 제 1 항에 있어서,
    상기 miR-202의 활성을 억제할 수 있는 안티센스 올리고뉴클레오타이드는 서열번호 4 (5’-UUCCCAUGCCCUAUACCUCU-3') 또는 서열번호 5 (5’-TTCCCATGCCCTATACCTCT-3')의 서열로 표시되는 것인, 다계통위축증 치료 또는 예방용 약학 조성물.
  8. 제 1 항에 있어서, 상기 다계통위축증의 증상은 소뇌조화운동불능 또는 자율신경계의 기능상실인 것인, 다계통위축증 치료 또는 예방용 약학 조성물.
  9. 제 1 항에 있어서, 상기 조성물은 Oct 1 유전자의 단백질 발현을 억제하는 것인, 다계통위축증 치료 또는 예방용 약학 조성물.
  10. 제 1 항, 또는 제 6 항 내지 제 9 항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 조성물은 뇌로 전달되는 것인, 다계통위축증 치료 또는 예방용 약학 조성물.
  11. 제 10 항에 있어서,
    상기 조성물은 비강내 투여, 정맥내 투여, 피하 주사, 뇌척수강내 주사, 흡입투여, 또는 경구 투여용 제형인, 다계통위축증 치료 또는 예방용 약학 조성물.
  12. miR-202 핵산분자를 시험물질과 접촉시키는 단계;
    상기 시험물질과 접촉된 분자의 활성을 결정하는 단계; 및
    상기 접촉된 분자 활성이, 상기 시험물질과 접촉되지 않은 대조군의 miR-202 분자의 활성과 비교하여 감소한 경우 이를 후보물질로 선별하는 단계를 포함하며,
    상기 miR-202 분자의 활성은 이의 Oct 1 유전자의 3'UTR 영역에의 결합을 측정하여 결정되는 것인, 다계통위축증 치료 또는 예방용 물질의 스크리닝 방법.
  13. 삭제
  14. 삭제
  15. miR-202의 뉴클레오타이드 서열 또는 그 상보적 서열의 검출용 물질을 포함하며, 상기 서열 검출용 물질은 프로브 또는 프라이머인, 다계통위축증 진단용 키트.
  16. 생물학적 시료에서 miR-202의 발현량을 결정하는 단계; 및
    상기 검출된 miR-202 농도를 검사 대상자의 다계통위축증 진단 또는 예후와 연관시키는 단계를 포함하는, 다계통위축증의 진단 또는 예후에 필요한 정보를 제공하기 위하여 miR-202를 검출하는 방법.
  17. 제 16 항에 있어서,
    상기 연관시키는 단계는 상기 다계통위축증 검사 대상자의 비마커 임상정보를 추가로 사용하는 것인, 방법.
  18. 제 17 항에 있어서,
    상기 검사 대상자의 비마커 임상정보는 상기 대상자의 나이, 성별, 체중, 식습관, 체질량, 기저질환, 혈액검사, 뇌 MRI, 뇌 CT, 또는 뇌 척수액 검사 중 하나 이상인 방법.
  19. 제 16 항에 있어서,
    상기 연관시키는 단계는 상기 miR-202의 발현량을 대조군에서 결정된 miR-202 검출결과와 비교하는 것으로, 상기 miR-202의 발현이 대조군과 비교하여 증가한 것인, 방법.
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