KR101566586B1

KR101566586B1 - miRNA를 표적으로 하는 뇌전증 또는 발작 관련 질환의 예방 또는 치료용 약학 조성물 및 방법

Info

Publication number: KR101566586B1
Application number: KR1020130098853A
Authority: KR
Inventors: 이상건; 노재규; 김만호; 주건; 정근화; 이순태; 전대종
Original assignee: 서울대학교산학협력단
Priority date: 2013-08-21
Filing date: 2013-08-21
Publication date: 2015-11-16
Also published as: KR20150023082A; WO2015025995A1

Abstract

본원은 miR-203를 표적으로 하는 물질을 포함하는 뇌전증 또는 발작과 관련된 질환의 예방 또는 치료용 약학 조성물을 개시한다. 본원은 또한 뇌전증 또는 발작과 관련된 질환의 진단 또는 예후 측정에 사용될 수 있는 마커 및 그 용도를 개시한다. 본원의 조성물은 대증요법에 의존하는 기존의 치료제와는 달리, 글리이신 수용체를 회복시킬 수 있어, 글라이신 수용체의 발현량 저하에 의한 각종 질환 예를 들면 뇌전증 및 발작과 관련된 질환을 근본적으로 치료할 수 있다.

Description

miRNA를 표적으로 하는 뇌전증 또는 발작 관련 질환의 예방 또는 치료용 약학 조성물 및 방법 {Composition and method for preventing or treating epilepsy or diseases related to seizure comprising agent targeting microRNA-203}

본원은 특정 miRNA를 표적으로 하는 뇌전증 또는 발작 질환의 치료와 관련된 것이다.

뇌전증 (epilepsy)은 만성적인 신경 장애의 하나로, 뇌신경 세포의 불규칙한 흥분으로 뇌에 전기가 발생해 발작과 경련을 일으키는 질환이다. 뇌전증은 여러 가지 원인에 의해 발생하며, 역학 연구에서는 환자의 1/3 이상이 뇌에 생긴 병리적 변화나 뇌손상의 과거 병력이 있는 것으로 보고되어 있고, 주요한 원인으로는 뇌졸중, 선천기형, 두부외상, 뇌염, 뇌종양, 퇴행성뇌병증, 유전, 미숙아, 분만 전후의 손상 등을 들 수 있다.

뇌전증은 보통 약물 요법으로 치료되는 것이 아니라 조절에 의존하는 질환이다. 그러나 뇌전증 환자의 30% 이상은 여러가지 작용 기전의 약물을 사용해도 발작이 조절이 되지 않아 새로운 기전에 근거한 조절 및/또는 치료가 가능한 치료제의 개발이 필요하다.

최근 시도된 것이 마이크로 RNA 억제자를 이용한 치료제의 개발이다.

국제특허공보 WO 2013/045652호에는 miR-134의 억제자를 이용한 뇌전증 치료에 대하여 개시하고 있다.

또한 유럽 공개번호 제2436784호에는 miR-203을 이용한 대장암의 진단 및 치료에 대하여 개시하고 있다.

여전히 새로운 기전에 근거한 뇌전증과 같은 발작 질환의 조절 또는 치료제의 개발이 필요하다.

본원은 miRNA를 표적으로 한 miRNA 조절제를 개발하여 뇌전증 또는 발작 관련 질환을 치료하고자 한다.

한 양태에서 본원은 miR-203의 활성을 억제할 수 있는 물질 및 약학적으로 허용가능한 담체를 포함하는, 뇌전증 또는 발작 관련 질환 치료 또는 예방용 약학 조성물을 제공한다.

본원에 따른 일 구현예에서, 본원에 따른 miR-203의 활성의 활성을 억제할 수 있는 물질은 특히 상기 miR-203의 GLRβ 서브유닛 (GLRB, glycine receptor beta subunit)의 3'-UTR 과의 상호작용을 억제할 수 있는 물질이고, 다른 구현예에서, 본원의 miR-203의 활성의 활성을 억제할 수 있는 물질은 이의 발현을 억제할 수 있는 물질이다.

본원에 따른 일 구현예에서, 본원에 따른 miR-203의 활성을 억제할 수 있는 물질은 상기 miR-203의 서열번호 1 또는 서열번호 2의 뉴클레오타이드 서열의 전부 또는 일부에 결합할 수 있는 핵산 분자로, 이러한 핵산분자는 예를 들면 RNA, DNA, 앤타고미어, 안티센스 분자, siRNA, shRNA, 2'-O-변형 올리고뉴클레오타이드, 포스포로티오에이트-백본 디옥시리보뉴클레오타이드, 포스포로티오에이트-백본 리보뉴클레오타이드, 디코이 올리고뉴클레오타이드, PNA(peptide nucleic acid) 올리고뉴클레오타이드 또는 LNA(locked nucleic acid) 올리고뉴클레오타이드를 포함하는 이로 제한하는 것은 아니다. 본원에 따른 일 구현예에서, 본원에 사용될 수 있는 핵산분자는 서열번호 1의 뉴클레오타이드 서열 중 1 번째 또는 2번째부터 7번째 혹은 8 번째까지의 뉴클레오타이드 서열에 일부 또는 전부가 상보적인 서열을 포함하는 안티센스 올리고뉴클레오타이드이다. 본원에 따른 안티센스 올리고뉴클레오타이드는 변형없이 사용될 수 있거나 또는 본원에 따른 효과를 고려하여 하나 이상의 변형을 포함할 수 있으며, 예를 들면 이를 구성하는 하나 이상의 뉴클레오타이드가 LNA, 또는 이를 구성하는 하나 이상의 뉴클레오타이드의 당이 2‘-O- 메틸화, 또는 이의 백본에 하나이상의 포스포티오에이트, 또는 이들의 조합을 포함할 수 있으나 이로 제한하는 것은 아니다. 예를 들면 본원의 일 구현예에 따른 안티센스 올리고뉴클레오타이드는 5‘-CAUUUCAC-3‘ 5‘-AUUUCAC-3‘, 5‘-CAUUUCA-3‘, 5‘-AUUUCA-3‘ 또는 5’-CUAGUGGUCCUAAACAUUUCAC-3' 을 포함한다.

본원에 따른 조성물, 키트 및 방법이 사용될 수 있는 발작을 유발하는, 발작 관련 질환은, 뇌졸중, 해마경화, 뇌선마비, 선천성기형, 중추신경계 감염, 저산소증, 뇌종양, 외상성 뇌손상, 신경퇴행성질환, 대사성 질환, 자가면역질환, 또는 원인 미상으로 인한 발작을 포함하나, 이로 제한하는 것은 아니다.

본원에 따른 조성물은 특히 뇌로 전달되며, 비강내 투여, 정맥내 투여, 피하 주사, 뇌척수강내 주사, 흡입투여, 혹은 경구 투여용으로 제형화 될 수 있으나, 이로 제한하는 것은 아니다.

다른 양태에서 본원은 또한 miR-203 RNA를 시험물질과 접촉시키는 단계; 및

상기 시험물질과 접촉된 miR-203 RNA의 활성을 결정하는 단계를 포함하며, 상기 접촉된 miR-203의 활성이, 상기 시험물질과 접촉되지 않은 대조군의 miR-203 RNA의 활성과 비교하여 감소한 경우 이를 후보물질로 선별하는 것인, 뇌전증 또는 발작 관련 질환 치료 또는 예방용 물질의 스크리닝 방법을 제공한다.

본원에 따른 방법에 사용되는 miR-203 RNA는 이를 발현하는 세포의 형태로 제공되며, 상기 활성은 상기 miR-203 RNA와 이의 표적인 GLRβ 서브유닛 (GLRB, glycine receptor beta subunit)의 3'-UTR 과의 상호작용 분석으로 결정될 수 있다.

다른 양태에서 본원은 또한 miR-21, miR-129-5p, miR-132, miR-142-3p, miR-155, miR-199b*, miR-199b, miR-203, miR-223, miR-451, miR-455, miR-99b*, miR-206, miR-468, miR-574-3p, miR-199a-5p, miR-666-3p, miR-708 및 miR-805로 구성된 군으로부터 선택되는 miRNA의 뉴클레오타이드 서열, 그의 상보적 서열 또는 상기 서열의 단편을 포함하는, 상기 서열 검출용 물질을 포함하는 발작 질환 진단용 키트에 관한 것이다.

또 다른 양태에서 본원은 miR-21, miR-129-5p, miR-132, miR-142-3p, miR-155, miR-199b*, miR-199b, miR-203, miR-223, miR-451, miR-455, miR-99b*, miR-206, miR-468, miR-574-3p, miR-199a-5p, miR-666-3p, miR-708 및 miR-805로 구성된 군으로부터 선택되는 miRNA 마커 중 하나 이상의 발현을 검출하는 단계; 및상기 검출된 마커의 발현량을 검사 대상자의 뇌전증 또는 발작관련 질환의 진단 또는 예후와 연관시키는 단계를 포함하는, 뇌전증 또는 발작 질환의 진단 또는 예후에 필요한 정보를 제공하기 위하여 상기 마커를 검출하는 방법을 제공한다.

본원의 방법에서 상기 연관시키는 단계는 상기 발작 질환 검사 대상자의 비마커 임상정보를 추가로 사용하는 것인, 검사 대상자의 비마커 임상정보는 예를 들면 상기 대상자의 나이, 성별, 체중, 식습관, 체질량, 기저질환, 뇌파검사, 발작 종류, 뇌 MRI, 뇌 CT, 또는 뇌 척수액 검사를 포함하나 이로 제한하는 것은 아니다.

본원에 따른 일 구현예에서 연관시키는 단계는 상기 결정된 마커의 발현량을 정상 대조군에서 결정된 상기 각 마커에 대한 검출결과와 비교하는 것으로, 상기 마커 중 miR-21, miR-129-5p, miR-132, miR-142-3p, miR-155, miR-199b*, miR-199b, miR-203, miR-223, miR-451, miR-455, miR-199a-5p, miR-666-3p, miR-708 및 miR-805의 발현은 대조군과 비교하여 그 발현량이 증가한 것이고, 상기 마커 중 miR-99b, miR-206, miR-468 및 miR-574-3p는 그 발현량이 감소한 것이다.

본원에 따른 miR203을 표적으로 하는 뇌전증 치료용 조성물은 기존의 뇌전증 치료제들과는 다르게 글리이신 수용체를 회복시킬 수 있어 새로운 작용 기전을 갖고 있으며, 글라이신 수용체의 발현량 저하에 의한 각종 질환 예를 들면 뇌전증을 포함하는 발작과 관련된 질환을 근본적으로 치료할 수 있으며, 특히 기존의 뇌전증 치료제로 발작 조절이 어려운 환자이게 유용하게 사용될 수 있다.

도 1a 및 1b는 자발적인 반복 뇌전증 발작 (spontaneous recurrent seizure, SRS)이 있는 만성 뇌전증 마우스에서 miRNA의 발현을 각각 해마(a) 및 피질(b)에서 마이크로어레이로 분석한 결과이다. 2 배이상 발현 변화 및 P-수치 대 대조군이 <0.05의 조건을 만족하는 상향 및 하향 조절된 miRNA만을 표시하였다. 색은 Z-스코어를 나타내는데, 적색은 고발현 (높은 Z-스코어)을, 녹색은 저발현을 나타낸다. miR-203 이 해마 및 피질에서 모두 증가되어 있음을 보여준다.
도 1c는 miR-203의 표적 mRNA를 보여준다. 표적 예측 소프트웨어(TargetScan, PicTar, 및 microT)을 이용하여 마우스 GLRB(Glycine receptor-β)의 3'-비번역 부위(UTR)가 mmu-miR-203의 표적인 것을 확인하였다. miR-203의 5‘ 씨드 서열은 밑줄로 표시되어 있다.
도 1d는 실시간 PCR에 의하여 miR-203이 만성 뇌전증 마우스의 해마에서 유의하게 상향조절되어 있는 것을 보여준다. miR-203의 발현은 GAPDH (글리세알데히드 포스페이트 데히드로제나아제)를 코딩하는 mRNA의 발현량에 대하여 상대적으로 나타내었다. *P<0.05. ns=not significant (유의하지 않음).
도 2a는 miR-203이 GLRB 단백질 발현에 미치는 영향을 확인한 것으로, neuro-2a 세포에 miR-203의 전달이입 후 GLRB 농도가 감소된 것을 웨스턴블랏 (왼쪽) 및 강도를 덴시토미터로 측정한(오른쪽) 결과이다.
도 2b는 miR-203이 다른 측면에서 GLRB 단백질 발현에 미치는 영향을 확인 한 것으로, GLRB의 3'-UTR을 함유하는 루시퍼라아제 리포터 유전자와 miR-203를 HeLa 세포에 함께 전달이입한 경우 루시퍼라제 신호가 감소된 결과를 나타낸다.
도 2c는 neuro-2a 세포에 miR-203와 AM203를 함께 전달이입한 경우, miR-203에 의해 GLRB 농도가 감소되는 것을 상쇄시킬 수 있으며, 이를 웨스턴블랏(왼쪽) 및 덴시토메트리(오른쪽)로 측정한 결과이다. 도 2a 내지 2c에서 모든 측정은 3중으로 수행하였다. *P<0.05, 및 **P<0.01.
도 3a 내지 3d는 비강투여된 AM203의 치료 효과를 나타낸다. 만성 뇌전증 마우스에게 AM203을 비강내 투여 후 대조군 치료(뇌전증-대조군)와 비교하여 해마에서의 GLRB 농도가 증가하였으나, 반면 피질에서의 발현에는 영향이 없는 것을, 웨스턴블랏 (a) 및 해마 덴시토메트리 (b) 및 피질 덴시토메트리(c)로 측정한 결과이다. 뇌파검사결과 AM203을 비강내 투여한 만성 뇌전증 마우스에서 SRS가 감소한 것으로 나타냈다(d). 치료전 14일 동안 및 치료 후 또 다른14일 동안 SRS를 모니터링한 결과, 비강내 AM203 투여하면 SRS 에피소드 수를 71.5% 감소시키는 것으로 나타났다(e). **P<0.01, ns=not significant (유의하지 않음)

본원은 miR-203에 의한 글라이신 수용체의 발현 감소가 발작관련 질환과 연관되어 있음을 규명한 것에 근거한 것이다.

따라서 한 양태에서 본원은 miR-203의 활성을 억제할 수 있는 물질 및 약학적으로 허용가능한 담체를 포함하는, 뇌전증 또는 발작 관련 질환 치료 또는 예방용 약학 조성물에 관한 것이다.

본원에 사용된 용어 "miR" 또는 "마이크로 RNA"는 표적 RNA의 분해(degradation)을 촉진시키거나 또는 그들의 번역을 억제시킴으로써 유전자 발현을 전사 후에 조절하는 21 내지 23개의 비코딩 RNA를 말한다. 본원에 사용된 miRNA의 성숙 서열은 miRNA 데이터베이스 (http://www.mirbase.org)에서 얻을 수 있다. 2012년 8월 현재 miRNA 데이터베이스 (19판, miRBase)에 의하면 193개 종에서 유래한 25,141 개의 성숙 miRNA가 등록되어 있다. 일반적으로 마이크로 RNA는 pre-miRNA라 불리는 헤어핀 구조를 갖는 약 70-80 nt (nucleotide) 길이의 전구체로 전사된 후, RNAse III 효소인 Dicer에 의해 잘려 성숙된 형태로 생성된다. 마이크로 RNA는 miRNP라 불리는 리보뉴클레오복합체를 형성하여 표적 부위에 상보적 결합을 통해 표적 유전자를 절단하거나, 번역을 억제한다. 30% 이상의 인간 miRNA는 클러스터로 존재하며, 하나의 전구체로 전사된 후, 절단과정을 거쳐 최종 성숙 miRNA가 형성된다.

본원에서 miR-203은 본 이론으로 한정하는 것은 아니지만 뇌, 특히 해마 및 피질에서 발현되어, 글라이신 수용체를 코딩하는 mRNA의 3‘ 비번역 부위에 결합하여, 이의 발현을 억제하여, 뇌에서의 글라이신 수용체 농도를 감소시킨다. 본원의 miR-203의 서열은 포유류 유래 예를 들면, 인간, 마우스, 또는 래트 유래이다. 본원에 따른 일 구현예에서는 인간 유래이며, 성숙된 서열은 [5’GUGAAAUGUUUAGGACCACUAG 3' (서열번호 1)]은 물론 전구 서열 ( [5’-GUGUUGGGGACUCGCGCGCUGGGUCCAGUGGUUCUUAACAGUUCAACAGUUCUGUAGCGCAAUUGUGAAAUGUUUAGGACCACUAGACCCGGCGGGCGCGGCGACAGCGA- 3' (서열번호 2)를 포함하는 것이다.

본원에서 miR-203의 활성 억제는 miR-203의 세포내 작용 또는 기능을 억제 또는 방해하는 것을 의미하는 것으로 전형적으로 miR-203가 이의 표적 예를 들면 글라이신 수용체를 코딩하는 mRNA 분자와의 결합을 직접적으로 억제하거나, 또는 저분자 억제제, 항체 또는 항체의 단편을 이용하여 miR-203의 기능을 직접적으로 억제하거나, 또는 억제제 또는 small interfereing RNA분자를 이용하여 간접적으로 조절되는 것을 포함한다. 나아가 miR-203의 활성의 방해 또는 억제는 직접 또는 간접적으로 전구서열(서열번호 2) 및 성숙서열 (서열번호 1)의 활성을 억제하는 것을 포함한다. 또한 miR-203의 활성 억제는 miR-203의 전사를 억제하여 이의 세포내 농도를 낮추는 것을 포함한다.

본원에서 용어 “miR-203의 활성을 억제할 수 물질”은 이의 발현 및/또는 활성을 억제할 수 있는 임의의 물질을 포함한다. 이러한 물질은 예를 들면 앤타고미어, 안티센스 분자, 소헤어핀 RNA 분자 (shRNA), 소방해 RNA 분자 (siRNA), 시드 표적 LNA (Locked Nucleic Acid) 올리고뉴클레오타이드, 데코이올리고뉴클레오타이드, 앱타머, 리보자임, 또는 DNA:RNA 하이브리드를 인지하는 항체를 포함할 수 있다.

본원에 사용된 용어 "안티센스 올리고뉴클레오타이드"는 표적으로 하는 miRNA, 특히 miRNA의 씨드 서열의 전부 또는 일부와 상보적인 서열을 가지고 있어 miRNA와 이합체(duplex)를 형성할 수 있는 핵산-기반 분자를 포괄하는 것이다. 따라서 본원에 사용된 용어 "안티센스 올리고뉴클레오타이드"는 "상보적 핵산-기반 억제제"로 나타낼 수 있다.

상기 안티센스 올리고뉴클레오타이드에는 다양한 분자가 포함되며, 예를 들면 리보핵산(RNA), 디옥시리보핵산(DNA), 앤타고미어, 2'-O-변형 올리고뉴클레오타이드, 포스포로티오에이트-백본 디옥시리보뉴클레오타이드, 포스포로티오에이트-백본 리보뉴클레오타이드, PNA(peptide nucleic acid) 올리고뉴클레오타이드 또는 LNA(locked nucleic acid) 올리고뉴클레오타이드이다. 바람직하게는 리보핵산이다. 상기 리보핵산은 이중가닥 siRNA(small interfering RNA), shRNA(short hairpin RNA) 및 라이보자임을 포함한다.

LNA는 변형 리보뉴클레오타이드로서 리보오스 당 부위의 2' 내지 4' 탄소 사이에 추가적인 브리지를 포함하여 잠금(locked) 형태를 가지게 되며 이에 LNA가 있는 올리고뉴클레오타이드는 개선된 열 안정성을 가지게 된다.

PNA(peptide nucleic acids)는 당-포스페이트 백본 대신에 펩타이드-기반 백본을 포함한다. 2'-O-변형 올리고뉴클레오타이드는 바람직하게는 2'-O-알킬 올리고뉴클레오타이드이고, 보다 바람직하게는 2'-O-C_1-3 알킬 올리고뉴클레오타이드이며, 가장 바람직하게는 2'-O-메틸 올리고뉴클레오타이드이다.

상기 안티센스 올리고뉴클레오타이드는, 좁은 의미의 안티센스 올리고뉴클레오타이드, 앤타고미어 및 억제 RNA 분자를 포함한다.

본원에 사용된 용어 "앤타고미어"는 단일-가닥의 화학적으로 변형된 올리고뉴클레오타이드로서, 내인성 microRNA의 차단 (silence)에 사용된다. 앤타고미어는 Arganoute 2 (Ago 2) 절단 부위에서 상보적이지 않는 서열을 포함하거나, 또는 Ago2 절단이 억제되도록 염기가 예를 들면 2' 메톡시기, 3‘ 콜레스테롤기, 포스포로씨오에이트로 변형되어 있으며, 표적서열에 상보적 서열을 가진다. 본원에 따른 앤타고미어는 miR-203에 적어도 부분적으로 또는 완전하게 상보적인 서열을 갖는다. 일 구현예에서 앤타고미어는 하나 이상의 변형 (예컨대, 2'-O-메틸-당 변형, 또는 3' 콜레스테롤 변형)을 포함한다. 다른 구현예에서 앤타고미어는 하나이상의 포스포로씨오에이트 결합을 포함하며, 적어도 부분적으로 포스포로티오에이트 백본을 갖게 된다. 본원에 따른 miR-203을 억제하기 위하여 적합한 앤타고미어의 길이는 7-50 뉴클레오타이드, 특히 10-40 뉴클레오타이드, 더욱 특히 15-30 뉴클레오타이드, 더더욱 특히 15-25 뉴클레오타이드, 특히 16 내지 19nt이나, 이로 제한하는 것은 아니다.

본원에서 용어 "상보적"은 소정의 혼성화 또는 어닐링 조건, 바람직하게는 생리학적 조건 하에서 안티센스 올리고뉴클레오타이드가 miR-203 표적에 선택적으로 혼성화 할 정도로 충분히 상보적인 것을 의미하며, 일부 또는 부분적으로 실질적으로 상보적(substantially complementary) 및 완전히 상보적 (perfectly complementary)인 것을 모두 포괄하는 의미를 가지며, 바람직하게는 완전히 상보적인 것을 의미한다. 실질적으로 상보적이란, 완전히 상보적인 것은 아니지만, 표적 서열에 결합하여 본원에 따른 효과 즉, miR-203의 활성을 방해하기에 충분한 효과를 낼 정도의 상보성을 의미하는 것이다.

본원에서 용어 "핵산"은 폴리뉴클레오타이드, 올리고뉴클레오타이드, DNA, RNA, 및 그 유사체 및 그 유도체를 포함하는 것으로 예를 들면 펩타이드 핵산 (PNA) 또는 그 혼합물을 포함한다. 또한 핵산은 단일 또는 이중가닥일 수 있으며, 폴리펩타이드, mRNA, microRNA 또는 siRNA 등을 포함하는 분자를 코딩할 수 있다.

본원에 따른 일 구현예에서, miR-203의 활성을 억제할 수 있는 물질은 miR-203의 전구 및/또는 성숙 서열의 전부 또는 일부, 특히 씨드 서열에 상보적으로 결합하여, 이의 활성을 억제할 수 있는 안티센스 올리고뉴클레오타이드이다. 상기 활성의 억제는 miR-203의 전사 및/또는 miR-203의 표적 mRNA와의 결합을 억제하는 것이다. 본원에 따른 안티센스 올리고뉴클레오타이드는 이를 구성하는 뉴클레오타이드 또는 뉴클레오타이드를 연결하는 백본(골격)이 하기 하나 이상의 변형을 포함할 수 있거나, 또는 포함하지 않을 수 있다. 즉 상기 안티센스 올리고뉴클레오타이드는 이를 구성하는 하나 이상의 뉴클레오타이드가 LNA, 또는 이를 구성하는 하나 이상의 뉴클레오타이드의 당이 2‘-O- 메틸화, 또는 이의 백본에 하나이상의 포스포티오에이트를 포함할 수 있다.

본원에 따른 일 구현예에서, 본원의 안티센스 올리고뉴클레오타이드 또는 핵산분자는 miR-203의 씨드서열의 전부 또는 일부에 상보적인 서열을 포함한다. 씨드 서열은 miRNA의 표적분자의 인지에 매우 중요한 다양한 종에서 보존된 서열이다(Krenz, M. et al., J. Am. Coll. Cardiol. 44:2390-2397(2004); H. Kiriazis, et al., Annu. Rev. Physiol.62:321(2000)). miRNA는 씨드서열을 통해 표적과 결합하기 때문에, 씨드서열의 표적과의 상호작용을 억제하는 경우, 표적 mRNA의 번역 등을 효과적으로 억제할 수 있다. 본원에 따른 일 구현예에서 서열번호 1의 뉴클레오타이드 서열 중 1 번째 또는 2 번째부터 7 번째 또는 8 번째까지의 뉴클레오타이드 서열에 전부 또는 부분적으로 상보적인 서열을 포함하며, 예를 들면 본원의 안티센스 올리고뉴클레오타이드는 5'-CAUUUCAC-3' 5'-AUUUCAC-3', 5'-CAUUUCA-3', 5'-AUUUCA-3' 또는 5’-CUAGUGGUCCUAAACAUUUCAC-3'일 수 있으며, 상기 올리고뉴클레오타이드를 구성하는 하나 이상의 각 뉴클레오타이드는 2'-O- 메틸화되거나, 또는 상기 각 하나 이상의 뉴클레오타이드는 LNA이거나, 또는 상기 백본을 구성하는 화학결합 중 하나 이상은 포스포티오에이트일 수 있으나, 상기 변형을 포함하지 않을 수도 있다.

본원은 miRNA-203이 글라이신 수용체 GlyR의 발현을 과도하게 억제하여 뇌전증의 발병에 관여한다는 발견에 근거한 것이다. 뇌전증은 제기능을 하지 않는 억제성 이온 채널 및 신경전달물질에 기인한 일탈적인 흥분성 신경전달과 관련이 있다. γ-아미노부티릭 애시드와 더불어 글라이신은 중추신경계에서 주요한 신경전달물질이지만, 뇌전증에서 글라이신 및 글라이신 수용체(GlyR)의 역할이 확실히 밝혀져있지 않았다. 시냅스후 GlyR에 글라이신이 결합하면 음이온 채널이 열리게 되어 Cl-이온이 유입되고, 이로 인해 시냅스후 막을 과분극(hyperpolarize)시키고 뉴우런 점화(neuronal fire)를 감소시킨다. 이러한 시냅스를 저해하거나 변형시키면 뉴우런이 과-흥분되게 되어, 통증, 크램핑(경련) 및 하이퍼익플렉시아(hyperekplexia)가 발생되는 것이다.

따라서 본원의 miR-203 활성의 억제를 통해, 뇌전증 또는 발작 관련 질환의 치료에 사용될 수 있다.

본원에 따른 일 구현예에서는 뇌전증 (epilepsy)의 치료에 사용된다. 뇌전증은 약 40가지의 임상적으로 상이한 증상을 포괄적으로 나타내는 용어로서, 뇌조직의 병변 또는 기능적인 장애로 인하여 발작적으로 신경기능장애를 일으켜 여러 가지 신경증상, 즉 돌발적인 의식상실, 경련, 정신 또는 감각장애를 일으키는 병으로, 지속적인 재발성의 자극되지 않은 발작을 그 특징으로 한다.

뇌전증은 만성 뇌전증 및 한 번 발생시 30분이상 지속되는 간질지속증 (status epilepticus, SE)을 포함하는 것이다. 뇌전증은 발작을 기준으로 분류할 때 부분성뇌전증 발작을 나타내는 부분성뇌전증과 전반성뇌전증 발작을 나타내는 전반성뇌전증을 포함한다. 그리고 원인을 기준으로 분류할 때, 각기 유전적인 요인 외에는 특별한 원인이 없는 특발성, MRI나 CT와 같은 뇌영상에서 뇌전증의 원인이 되는 병소가 발견되는 증후성, 뇌전증의 원인이 되는 병소가 있을 것으로 추정되나 현재의 뇌영상에서 이상 소견이 발견되지 않는 은닉성뇌전증을 포함한다.

본원에 사용된 용어 "발작 관련 질환"은 발작이 수반되는 뇌 관련 질환을 포함하며, 발작 (seizure) 일으키는, 예를 들면 뇌졸중; 뇌염; 해마경화; 뇌성마비 및 선천성 기형; CNS 감염관련 발작; 저산소증; 뇌종양; 외상성 뇌손상; 혈관기형; 신경퇴행성질환; 저혈당증, 당원축적병 및 파이루베이트탈수소효소 결핍증과 같은 대사성 질환; 다발성경화증; 전신홍반루프스와 같은 자가면역질환을 들 수 있고, 원인을 알지 못하고 발작이 일어나는 질환을 포함한다. 본원의 조성물은 발작 관련 질환으로부터 유래된 발작의 치료에 사용된다.

본원에 사용된 용어 "치료" , "완화" 또는 "개선" 이란 본 조성물의 투여로 관련 질환의 증세를 호전시키거나 이롭게 변경하는 모든 행위를 의미한다. 본원이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자라면, 대한의학협회 등에서 제시된 자료를 참조하여 질환의 정확한 기준을 알고, 개선, 향상 및 치료된 정도를 판단할 수 있을 것이다.

본원에 사용된 용어 "예방"은 관련 질환의 발병을 억제 또는 지연시키는 모든 행위를 의미한다. 본원의 조성물은 초기 증상, 또는 나타나기 전에 투여할 경우 관련 질환을 예방할 수 있다는 것은 당업자에게 자명할 것이다.

본원 조성물은 본원의 miR-203의 활성을 억제할 수 있는 물질 이외에 질환의 치료와 관련하여 동일 또는 유사한 기능을 나타내는 유효성분을 1종 이상 또는 유효성분의 용해성 및/또는 흡수성을 유지/증가시키는 화합물을 추가로 함유할 수 있다. 또한 선택적으로, 화학치료제, 항염증제, 항바이러스제 및/또는 면역조절제 등을 추가로 포함할 수 있다.

본원 조성물은 상기 언급한 유효성분 이외에 추가로 약학적으로 허용가능한 희석제, 담체 및/또는 아주번트를 1종 이상 포함할 수 있다. 약학적으로 허용가능한 담체는 식염수, 멸균수, 링거액, 완충 식염수, 덱스트로즈 용액, 말토덱스트린 용액, 글리세롤, 에탄올, 리포좀 및 이들 성분 중 1 성분 이상을 혼합하여 사용할 수 있으며, 필요에 따라 항산화제, 완충액, 정균제 등 다른 통상의 첨가제를 첨가할 수 있다. 또한 희석제, 분산제, 계면활성제, 결합제 및 윤활제를 부가적으로 첨가하여 수용액, 현탁액, 유탁액 등과 같은 주사용 제형, 환약, 캡슐, 과립 또는 정제로 제제화할 수 있으며, 표적 기관에 특이적으로 작용할 수 있도록 표적 기관 특이적 항체 또는 기타 리간드를 상기 담체와 결합시켜 사용할 수 있다. 더 나아가 당해 기술분야의 적정한 방법으로 또는 레밍턴의 문헌(Remington's Pharmaceutical Science(최근판), Mack Publishing Company, Easton PA)에 개시되어 있는 방법을 이용하여 각 질환에 따라 또는 성분에 따라 바람직하게 제형화할 수 있다. 예를 들면 용액, 에멀젼 및 리포좀 제형 등과 같은 다양한 제형 및 투약형태로 제조될 수 있다. 예를 들면 활성성분을 약학적으로 허용가능한 액체 및/또는 미세분말의 고형 담체 또는 부형제와 혼합하여, 정제, 캡슐, 젤, 시럽 또는 좌제로 제조될 수 있다. 또한 본원에 따른 조성물은 수성, 비수성 또는 혼합 매질을 이용한 현탁액으로 제조될 수 있다. 수성 현탁액은 소디움 카르복시메틸셀룰로스, 소르비톨 및/또는 덱스트란과 같은 현탁액의 점도를 높이는 물질을 추가로 포함할 수 있다.

본원에 따른 조성물의 투여방법은 특별히 제한되는 것은 아니며, 공지된 억제제의 투여방법을 적용할 수 있으며, 목적하는 방법에 따라 비경구 투여(예를 들어 비강내, 정맥 내, 피하, 복강 내 또는 국소에 적용)하거나 경구 투여할 수 있으며, 신속한 치료효과를 얻기 위해서는 비강내 주입에 의한 투여가 바람직하다. 본원의 조성물은 또한 다양한 경로로 전달될 수 있으며, 예를 들면 인퓨전 또는 볼러스 주사, 표피 또는 점막 (경구점막, 항문 점막, 장 점막 등)을 통해 투여될 수 있다. 본원의 조성물은 또한 전신 또는 국소투여될 수 있다.

나아가 본원의 조성물은 적절한 경로를 통해 중추신경 또는 말초신경으로 도입하는 것이 바람직하다. 적절한 경로는 뇌실내 (intraventricular) 또는 수막내 (intrathecal) 투여를 포함한다. 이러한 투여는 저장고에 연결된 카테터를 이용하여 달성될 수 있다. 또한 에어로졸로 제형화되어 흡입기 또는 분무기를 통해 폐를 통한 투여가 사용될 수 있다. 본원에 따른 효과가 발생되는 한, 정맥내 투여, 피하 주사, 뇌척수강내 주사, 흡입투여, 또는 경구 투여용 제형을 제외하는 것은 아니다.

본원에 따른 일 구현예에서는 비강 투여된다. 비강투여시, 후각신경경로를 따라 뇌로 전달됨에 따라 본원 조성물의 효과를 높일 수 있다. 비강은 비중격에 의해 좌우로 구분되는 콧 속의 공간을 지칭하며, 비강내 투여는 본원의 조성물을 비강 상피의 어느 조직으로 전달하는 것을 말한다. 본원의 조성물의 비강내 투여를 위해 비강용으로 허용가능한 담체를 포함할 수 있는데, 상기 담체는 포유동물, 바람직하게는 인간의 비강 상피의 어느 부분에 투여하기에 적당한 한 종 이상의 적절한 고상 또는 필러 희석제 또는 캡슐화 물질을 말한다. 대표적으로, 상기 담체는 액체, 용액, 현탁액, 겔, 연고, 로션, 또는 이들의 조합일 수 있다. 바람직하게, 상기 담체는 약학적으로 허용가능한 수성 담체이다. 본 발명의 조성물은 여러 가지 단위 투여 형태로 제조될 수 있다. 이러한 형태로는 점비액(nasal drop), 비강용 스프레이, 비강용 겔, 비강용 연고, 및 비강용 분말이 있으나, 이에 제한되지 않는다.

또한 상기 담체에는 전달 강화제를 포함할 수 있는데, 비강내 전달 강화제에는, 응집 저해제, 투여량 변경제, pH 제어제, 분해 효소 저해제, 점액질 용해 또는 점액 제거제, 섬모안정 시약들, 막투과 촉진제(예를 들면, 계면 활성제, 담즙산염, 인지질 또는 지방산 첨가제, 혼합 미셀(micelle), 리포솜, 또는 담체, 알콜, 에나민(enamine), 산화질소 공여체 혼합물, 긴 사슬(long-chain) 양친매성 분자, 소형 소수성 침투 강화제, 나트륨 또는 살리실산 유도체, 아세토아세트산의 글리세롤 에스테르, 시클로덱스트린 또는 베타-시클로덱스트린 유도체, 중간 사슬 지방산, 킬레이트 시약, 아미노산 또는 그의 염, N-아세틸아미노산 또는 그의 염, 선택된 막 성분에 대한 분해 효소, 지방산 합성 저해제, 콜레스테롤 합성 저해제 또는 산화질소 자극 물질, 키토산, 그리고 키토산 유도체와 같은 상피 접합 생리학의 조절 약제, 혈관 확장제, 선택적 운반 촉진제 그리고 비내 점막 전달을 강화하기 위해, 본원의 조성물이 효과적으로 조합되고, 결합되고, 보관되고, 캡슐화 되거나 활성 약제를 안정시킬 수 있게 해주는, 안정적 운송체, 담체, 지지 물질 또는 착물 생성종(complex-forming species) 등이 포함될 수 있다.

본원에 따른 조성물은 약학적으로 유효한 양으로 투여한다. 본 발명에 있어서, "약학적 또는 치료적으로 유효한 양"은 의학적 치료에 적용 가능한 합리적인 수혜/위험 비율로 질환을 치료하기에 충분한 양을 의미하며, 유효용량 수준은 환자의 질환의 종류, 중증도, 약물의 활성, 약물에 대한 민감도, 투여 시간, 투여 경로 및 배출 비율, 치료기간, 동시 사용되는 약물을 포함한 요소 및 기타 의학 분야에 잘 알려진 요소에 따라 결정될 수 있다. 본 발명의 조성물은 개별 치료제로 투여하거나 다른 치료제와 병용하여 투여될 수 있고 종래의 치료제와는 순차적 또는 동시에 투여될 수 있으며, 단일 또는 다중 투여될 수 있다. 상기한 요소들을 모두 고려하여 부작용 없이 최소한의 양으로 최대 효과를 얻을 수 있는 양을 투여하는 것이 중요하며, 이는 당업자에 의해 용이하게 결정될 수 있다.

투여량은 환자의 체중, 연령, 성별, 건강상태, 식이, 투여시간, 투여방법, 배설률 및 질환의 중증도 등에 따라 그 범위가 매우 다양하며, 적정한 투여량은 예를 들면 환자의 체내에 축적된 약물의 양 및/또는 사용되는 폴리뉴클레오타이드의 구체적 효능정도에 따라 달라질 수 있다. 일반적으로 인비보 동물모델 및 인비트로에서 효과적인 것으로 측정된 EC₅₀을 기초로 계산될 수 있으며, 예를 들면 체중 1kg당 0.01 μg 내지 1 g 일 수 있으며, 일별, 주별, 월별 또는 연별의 단위 기간으로, 단위 기간 당 일회 내지 수회 나누어 투여될 수 있으며, 또는 인퓨전 펌프를 이용하여 장기간 연속적으로 투여될 수 있다. 반복투여 횟수는 약물이 체내 머무는 시간, 체내 약물 농도 등을 고려하여 결정된다. 질환 치료 경과에 따라 치료가 된 후라도, 재발을 위해 조성물이 투여될 수 있다.

본원에 따른 유효성분 예를 들면 안티센스 올리고뉴클레오타이드는 그 자체로 또는 약학적으로 허용가능한 염의 형태로 조성물에 사용될 수 있다. 약학적으로 허용가능한 염이란, 본원에 따른 폴리뉴클레오타이드의 생물학적 활성은 유지하면서, 바람직하지 않는 독성은 최소화된 것이다. 이러한 염은 예를 들면 아연, 칼슘, 비스부스, 바륨, 마그네슘, 알루미늄, 코퍼, 코발트, 니켈, 카드뮴, 소디움, 포타슘 등과 같은 금속 양이온과 형성된 염기 부가염 및 유기 아미노산과 형성된 염, 또는 암모니아, N,N-디벤질에틸렌디아민 (dibenzylethylene-diamine), D-클루코사민 (glucosamine), 테트라에틸암모늄(tetraethylammonium), 또는 에틸렌디아민(ethylenediamine) 유래의 양이온과 형성된 염을 포함 할 수 있으나, 이로 제한하는 것은 아니다.

본원에 따른 일 구현예에서, 본원의 유효성분 예를 들면 안티센스 올리고뉴클레오타이드는 이를 이루는 뉴클레오타이드의 특성상 음으로 하전되어 있다. 세포막은 친지질성 성질로 인해, 안티센스 올리고뉴클레오타이드의 세포막으로의 흡수가 감소될 수 있다. 이러한 극성으로 인한 흡수 방해는 하기에 기재된 전구약물 접근방식을 통해 해결될 수 있다 (Crooke, R. M. (1998) in Crooke, S. T. Antisense research and Application. Springer-Verlag, Berlin, Germany, vol. 131, pp. 103-140).

다른 양태에서 본원은 miR-21, miR-129-5p, miR-132, miR-142-3p, miR-155, miR-199b*, miR-199b, miR-203, miR-223, miR-451, miR-455, miR-99b*, miR-206, miR-468, miR-574-3p, miR-199a-5p, miR-666-3p, miR-708 및 miR-805로 구성된 군으로부터 선택되는 miRNA의 뉴클레오타이드 서열, 그의 상보적 서열 또는 상기 서열의 단편을 포함하는 발작 질환의 진단용 키트에 관한 것이다.

상기 miRNA 분자들의 뉴클레오타이드 서열은 miRBase (http://www.mirbase.org)에서 확인할 수 있다.

상기 miRNA 분자들은 표 1에 나타나있는 바와 같이, 만성 뇌전증 마우스의 해마에서는 상향 발현 또는 하향 발현되어 차등 발현된(differentially expressed) miRNA들이다. 가장 바람직하게는 상기 miRNA 분자는 miR-203이다.

본 발명의 진단 키트는 뇌전증 또는 발작을 일으키는 졸중; 뇌염; 해마경화; 뇌성마비 및 선천성 기형; CNS 감염관련 발작; 저산소증; 뇌종양; 외상성 뇌손상; 혈관기형; 신경퇴행성질환; 저혈당증, 당원축적병 및 파이루베이트탈수소효소 결핍증을 포함하는 대사성 질환; 다발성경화증; 전신홍반루프스를 포함하는 자가면역질환원; 또는 원인 미상 발작을 포함하는 발작관련 질환의 진단에 사용될 수 있으며, 가장 바람직하게는 뇌전증 질환의 진단에 이용될 수 있다.

본 발명의 키트는 상기한 성분 이외에도, 다른 성분들을 추가적으로 포함할 수 있다. 예를 들어, 본 발명의 키트가 PCR 증폭 과정에 적용되는 경우에는, 본 발명의 키트는 선택적으로, PCR 증폭에 필요한 시약, 예컨대, 완충액, DNA 중합효소 (예컨대, Thermus aquaticus (Taq), Thermus thermophilus (Tth), Thermus filiformis, Thermis flavus, Thermococcus literalis 또는 Pyrococcus furiosus (Pfu)로부터 수득한 열 안정성 DNA 중합효소), DNA 중합 효소 보조인자 및 dNTP를 포함할 수 있다. 본 발명의 키트는 상기한 시약 성분을 포함하는 다수의 별도 패키징 또는 컴파트먼트로 제작될 수 있다.

본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 본 발명의 키트는 마이크로어레이일 수 있다. 본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 본 발명의 키트는 유전자 증폭 키트이다.

본 발명의 키트가 마이크로어레이인 경우에는, 마이크로어레이의 고상표면에 프로브가 고정화 되어 있다. 본 발명의 키트가 유전자 증폭 키트인 경우에는 프라이머를 포함한다. 프로브 또는 프라이머는 본원에 따른 miR-21, miR-129-5p, miR-132, miR-142-3p, miR-155, miR-199b*, miR-199b, miR-203, miR-223, miR-451, miR-455, miR-99b*, miR-206, miR-468, miR-574-3p, miR-199a-5p, miR-666-3p, miR-708 및 miR-805 중 하나 이상을 특이적으로 인식하는 것으로 상기 서열에 상보적인 서열을 가진다. 본원에 사용된 용어 "상보적(complementary)"은 상기에서 정의된 바와 같이, 소정의 혼성화 또는 어닐링 조건하에서 상기 뉴클레오타이드 서열에 선택적으로 혼성화할 정도의 상보성을 갖는 것을 의미하며, 본 발명의 프로브 또는 프라이머는 완전 상보적인 것 이외에 상기 뉴클레오타이드 서열에 선택적으로 혼성화할 수 있을 정도이면, 하나 또는 그 이상의 미스매치(mismatch) 염기서열을 가질 수 있다.

프라이머 또는 프로브 제작 시 참조하여야 하는 본 발명의 miRNA의 뉴클레오타이드 서열은 miRBase에서 확인할 수 있으며, 이 서열을 참조하여 프라이머 또는 프로브를 디자인할 수 있다.

또 다른 양태에서 본원은 검체로부터 miR-21, miR-129-5p, miR-132, miR-142-3p, miR-155, miR-199b*, miR-199b, miR-203, miR-223, miR-451, miR-455, miR-99b*, miR-206, miR-468, miR-574-3p, miR-199a-5p, miR-666-3p, miR-708 및 miR-805로 구성되는 마커 중 하나 이상의 발현을 검출하는 단계; 및 상기 검출된 마커의 발현량을 검사 대상자의 뇌전증 또는 발작관련 질환의 진단 또는 예후와 연관시키는 단계를 포함하는, 뇌전증 또는 발작 질환의 진단 또는 예후에 필요한 정보를 제공하기 위하여 상기 마커를 검출하는 방법에 관한 것이다.

본원에 따른 방법에서 상기 연관시키는 단계는 상기 결정된 마커의 발현량을 정상 대조군에서 결정된 상기 각 마커에 대한 검출결과와 비교하는 것으로, 상기 마커 중 miR-21, miR-129-5p, miR-132, miR-142-3p, miR-155, miR-199b*, miR-199b, miR-203, miR-223, miR-451, miR-455, miR-199a-5p, miR-666-3p, miR-708 및 miR-805는 대조군과 비교하여 그 발현량이 증가한 것이고, 상기 마커 중 miR-99b, miR-206, miR-468 및 miR-574-3p는 그 발현량이 감소한 것이다.

나아가 본원에 따른 방법은 마커의 발현량을 검사 대상자의 뇌전증 또는 발작관련 질환의 진단 또는 예후 판별시에 발작 질환 검사 대상자의 비마커 임상정보를 추가로 사용할 수 있다. 이러한 검사 대상자의 비마커 임상정보는 상기 대상자의 나이, 성별, 체중, 식습관, 체질량, 기저질환 및 뇌파검사, 발작 종류, 뇌 MRI, 뇌 CT, 또는 뇌 척수액 검사을 포함하나 이로 제한하는 것은 아니다.

본 발명의 키트 또는 방법에 의해 분석된 상기 miRNA의 발현 정도, 예컨대, RT(reverse transcriptase)-PCR 또는 실시간(real-time)-PCR 방법(참조: Sambrook, J. et al., Molecular Cloning. A Laboratory Manual, 3rded. Cold Spring Harbor Press(2001))에 의해 측정된 발현 정도가 정상 대조군과 비교하여 1.5배 이상, 바람직하게는 2배이상의 발현도를 나타내는 경우에는 분석 시료를 채취한 대상(subject)이 뇌전증 또는 발작 질환 특히 뇌전증 질환을 가지고 있거나 발병 위험도가 높은 것으로 판정한다.

다른 양태에서 본원은 miR-203 RNA를 시험물질과 접촉시키는 단계; 및 상기 시험물질과 접촉된 miR-203 RNA의 활성을 결정하는 단계를 포함하며, 상기 접촉된 miR-203의 활성이, 상기 시험물질과 접촉되지 않은 대조군의 miR-203 RNA의 활성과 비교하여 감소한 경우 이를 후보물질로 선별하는 것인, 뇌전증 또는 발작 질환 치료 또는 예방용 물질의 스크리닝 방법에 관한 것이다.

본원에 따른 일 구현에서, 상기 miR-203 RNA는 이를 발현하는 세포의 형태로 제공되며, 상기 활성은 상기 miR-203 RNA의 발현으로 분석되는 것이다. 예를 들어 본원에 따른 miR-203을 발현하는 세포를 시험물질과 접촉시킨 후, miR-203의 ?현량의 변화를 접촉전 또는 접촉되지 않은 대조군 세포와 비교하여, 발현량에 변동, 특히 감소가 있는 것을 후보물질로 선별한다. 본원에 따른 방법에 사용되는 miR-203의 발현량은 노던블랏, RT-PCR, 마이크로어레이를 이용한 혼성화 방법 등과 같은 공지된 방법을 이용하여 수행될 수 있다.

또다른 구현예에서 상기 miR-203 RNA는 이를 발현하는 세포의 형태로 제공되며, 상기 활성은 상기 miR-203 RNA와 이의 표적인 GLRβ 서브유닛 (GLRB, glycine receptor beta subunit)의 3'-UTR 과의 상호작용 분석으로 결정된다. 예를 들어 본원에 따른 miR-203을 발현하는 세포를 시험물질과 접촉시킨 후, GLRβ 서브유닛의 3'-UTR과 miR-203의 상호작용 정도를 접촉전 또는 접촉되지 않은 대조군 세포와 비교하여, 상호작용에 변동, 특히 감소가 있는 것을 후보물질로 선별한다. 본원에 따른 방법에 사용되는 RNA-RNA 상호작용을 검출하는 방법은 당업계의 공지된 것으로 예를 들면 RNA Walk (Lusting et al., Nucleic Acids Res. 2010; 38(1):e5 에 기재된 것 참조) 또는 Yeat two hybrid system (Piganeau et al., RNA 2006; 12: 177-184) 등을 이용하여 검출할 수 있으며, RNA: A Laboratory Manual (Cold Spring Harbor Laboratory Press 2011)를 참조할 수 있다.

본 방법에서 사용되는 세포의 종류 및 시험물질의 양 및 종류 등은 사용하는 구체적인 실험방법 및 시험물질의 종류에 따라 달라지며, 당업자라면 적절한 세포의 종류, 양 및/또는 조건을 선택할 수 있을 것이다. 실험결과 시험물질과 접촉되지 않은 대조군과 비교하여 시험물질의 존재하에서 miR-203 RNA의 활성의 감소를 가져오는 물질을 후보물질로 선별한다. 대조군과 비교 약 99% 이하 감소, 약 95% 이하 감소, 약 90% 감소, 약 85% 감소, 약 80% 감소, 약 75% 감소, 약 70% 감소, 약 65% 이하 감소, 약 60% 이하 감소, 약 55% 감소, 약 50% 이하 감소, 약 45% 이하 감소, 약 40% 이하 감소, 약 30% 이하 감소, 약 20% 이하 감소를 의미하나, 이를 벋어나는 범위를 제외하는 것은 아니다.

본원의 "시험물질"은 상술한 바와 같은 miR-203 RNA의 활성 억제할 것으로 기대되는 물질을 의미하여, 저분자량 화합물, 고분자량 화합물, 화합물들의 혼합물(예컨대, 천연 추출물 또는 세포 또는 조직 배양물), 또는 바이오의약품(예컨대, 단백질, 항체, 펩타이드, DNA, RNA, 안티센스 올리고뉴클레오타이드, RNAi, 앱타머, RNAzyme 및 DNAzyme), 또는 당 및 지질 등을 포함하나 이로 한정하는 것은 아니다. 상기 시험물질은 2개 이상의 아미노산 잔기, 예컨대 6개, 10개, 12개, 20개 이하 또는 20개 초과 예컨대 50개 아미노산 잔기를 갖는 폴리펩타이드일 수 있다. 상기 시험 물질은 합성 또는 천연 화합물의 라이브러리로부터 얻을 수 있으며 이러한 화합물의 라이브러리를 얻는 방법은 당업계에 공지되어 있다. 합성 화합물 라이브러리는 Maybridge Chemical Co.(UK), Comgenex(USA), Brandon Associates(USA), Microsource(USA) 및 Sigma-Aldrich(USA)에서 구입 가능하며, 천연 화합물의 라이브러리는 Pan Laboratories(USA) 및 MycoSearch(USA)에서 구입 가능하다. 시험 물질은 당업계에 공지된 다양한 조합 라이브러리 방법에 의해 얻을 수 있으며, 예를 들어, 생물학적 라이브러리, 공간 어드레서블 패러럴 고상 또는 액상 라이브러리(spatially addressable parallel solid phase or solution phase libraries), 디컨볼루션이 요구되는 합성 라이브러리 방법, “1-비드 1-화합물” 라이브러리 방법, 그리고 친화성 크로마토그래피 선별을 이용하는 합성 라이브러리 방법에 의해 얻을 수 있다. 분자 라이브러리의 합성 방법은, DeWitt et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 90, 6909, 1993; Erb et al. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 91, 11422, 1994; Zuckermann et al., J. Med. Chem. 37, 2678, 1994; Cho et al., Science 261, 1303, 1993; Carell et al., Angew. Chem. Int. Ed. Engl. 33, 2059, 1994; Carell et al., Angew. Chem. Int. Ed. Engl. 33, 2061; Gallop et al., J. Med. Chem. 37, 1233, 1994 등에 개시되어 있다.

본원에 따른 일 구현예에서 뇌전증 또는 발작 관련 질환을 치료하는 약물의 스크리닝 목적을 위해서는 화합물은 저분자량의 치료효과를 갖는 것이 사용될 수 있다. 예를 들면 중량이 400 Da, 600 Da 또는 800 Da과 같은 약 1000 Da 내외의 화합물이 사용될 수 있다. 목적에 따라 이러한 화합물은 화합물 라이브러리의 일부를 구성할 수 있으며, 라이브러리를 구성하는 화합물의 숫자도 수십개부터 수백만개까지 다양하다. 이러한 화합물 라이브러리는 펩타이드, 펩토이드 및 기타 환형 또는 선형의 올리고머성 화합물, 및 주형을 기본으로 하는 저분자 화합물, 예컨대 벤조디아제핀, 하이단토인, 바이아릴, 카보사이클 및 폴리사이클 화합물 (예컨대 나프탈렌, 페노티아진, 아크리딘, 스테로이드 등), 카보하이드레이트 및 아미노산 유도체, 디하이드로피리딘, 벤즈하이드릴 및 헤테로사이클 (예컨대 트리아진, 인돌, 티아졸리딘 등)을 포함하는 것일 수 있으나, 이는 단지 예시적인 것으로 이로 한정되는 것은 아니다.

또한 예를 들면 바이올로직스가 스크리닝에 사용될 수 있다. 바이올로직스는 세포 또는 바이오분자를 일컫는 것으로, 바이오분자란, 단백질, 핵산, 탄수화물, 지질 또는 생체내 및 생체외에서 세포 시스템 등을 이용하여 생산된 물질을 일컫는 것이다. 바이오분자를 단독으로 또는 다른 바이오분자 또는 세포와 조합으로 제공될 수 있다. 바이오분자는 예를 들면, 폴리뉴클레오타이드, 펩타이드, 항체, 또는 기타 혈장에서 발견되는 단백질 또는 생물학적 유기물질을 포함하는 것이다.

이하, 본 발명의 이해를 돕기 위해서 실시예를 제시한다. 그러나 하기의 실시예는 본 발명을 보다 쉽게 이해하기 위하여 제공되는 것일 뿐 본 발명이 하기의 실시예에 한정되는 것은 아니다.

실시예

본 실시예에 사용된 실험방법은 하기와 같다.

만성 뇌전증 마우스 모델 제조

본 연구는 한국의 KAIST(Korea Advanced Institute of Science and Technology) 및 서울대학교 병원의 IACUC (Institutional Animal Care and Use Commitee)의 승인하에 실시하였다. 상기 위원회는 AAALAC (Association for the Assessment and Accreditation of Laboratory Animal Care International)에 의해 인가되었다.

수컷 C57BL/6J 마우스(55주령, 22 내지 25g)에게 메틸스코폴아민(1mg/kg i.p., Sigma-Aldrich, USA)을 처치하였다. 30분후, 필로카르핀(330mg kg ^-1, Sigma-Aldrich)을 마우스에게 일회 복강주사하여 SE (status epilepticus)를 유도하였다. SE 시작후 40분에 디아제팜(5mg/kg, 삼진제약, 서울, 한국)을 마우스에게 복강내 주사하여(Racine 스케일 ≥ IV) 지속되던 발작을 중단시켰다. SE 이후, 모든 동물이 정상적인 먹이펠렛을 먹기 시작할 때까지 2일 동안 5% 글루코스 용액을 먹였다. 12시간의 명암주기 및 물과 음식에 무제한으로 접근할 수 있는 곳에서 마우스를 사육하였다. 만성 뇌전증은 SE 후 SRS(Racine 스케일 상 4-5) 60일의 잦은 발생(attack)이 있는 것으로 정의된다.

miRNA 마이크로어레이

필로카르핀으로 유도된 SE 60일 후에 마우스를 깊이 마취시킨 후 단두로 희생시켰다. 뇌를 즉시 적출하였고, 해마 및 전(whole) 피질을 잔류 뇌구조에서 절개하였다. Trizol®(Invitrogen, USA)을 제조자의 방법대로 사용하여 해마 및 피질에서 총 RNA를 분리하였다. 마우스 miRNA 마이크로어레이 8x15K 키트(567 마우스 miRNA를 감지)(Agilent Technilogies, Inc. USA)을 제조자의 방법대로 사용하여 miRNA 발현 프로파일을 조사하였다. GenSpring GX, 버젼 7.3.1(Agilent Technologies)를 제조자의 방법대로 사용하여 데이터를 적정화(normalize)하여 분석하였다. 0.01 이하의 수치는 0.01로 세팅하였다. 7개의 샘플(정상 3개 및 간질성 4개)을 각각의 마이크로어레이 칩 상에서 테스트하였다. 상향조절은 대조군에 대하여 발현이 2배이상 증가하고, 대조군에 대하여 P-수치가 0.05 이하인 것으로 정의되었다. 하향조절(down-regulation)은 대조군에 대하여 발현이 2배 이상 감소하고, 대조군에 대하여 P-수치가 0.05 이하인 것으로 정의되었다.

miRNA의 실시간 PCR

필로카르핀으로 유도된 SE 60일 후에 마우스를 깊이 마취시킨 후 단두로 희생시켰다. 뇌를 즉시 적출하였고, 해마 및 전(whole) 피질을 잔류 뇌구조에서 절개하였다. Trizol®(Invitrogen, USA)을 제조자의 방법대로 사용하여 해마 및 피질에서 총 RNA를 분리하였다. miRNA의 실시간 PCR은 TaqMan® MicroRNA Assay(Life Technologies, USA)를 제조자의 방법대로 사용하여 수행하였다. 조건은 50℃에서 2분 및 95℃에서 10분 열처리 이후에, 95℃ 15초 및 60℃ 60초로 구성된 40 사이클의 열처리를 반복 수행하였다. 모든 실시간 반응은 ABI PRISM 7000 서열 탐지 시스템(Ambion-Applies Biosystem) 상에서 3 배수로 수행되었다. 상대적 발현은 비교 역치 사이클(comparative threshold cycle)을 사용하여 계산하였고, 내인성 snoRNA 탐지 키트(Ambion-Applied Biosystem)를 사용하여 측정된 snoRNA202의 양에 따라 각 miRNA 농도를 적정화하였다.

miRNA 의 표적 유전자 예측

본원에 개시된 miRNA 성숙 서열을 miRBase (http://www.mirbase.org)로부터 얻었다. 마우스 유전자 3'-비해독 부위(UTR)에 있는 잠재적 miRNA 표적 위치를 TargetScan(http://www.targetscan.org), PicTar(http://pictar.mdc-berlin.de/), 및 microT(http://diana.cslab.ece.ntua.gr/microT/)를 사용하여 규명하였다.

인비트로 전달이입

Lipofectamine® 2000 (Life Technologies, USA)을 제조자의 방법대로 사용하여 50 nM의 AM203 및 50 nM miR-203 듀플렉스(또는 스크램블된 miRNA 듀플렉스; Bioneer, 한국)와 함께 Neuro-2a 세포(American Type Culture Collection, USA)를 전달이입하였다. 웨스턴 블랏을 하기 위하여, 전달이입 후48시간에 세포의 균질화물을 수득하였다.

루시퍼라아제 어세이

인간 GLRβ 서브유닛 (GLRB, glycine receptor beta subunit)의 총 3'-UTR 서열을 루시퍼라아제 리포터 컨스트럭트 (SwitchDB, USA)에 클로닝하였다. HeLa 세포를 10% 소태아 혈청을 함유하는 RPMI 배지에서 24-웰 플레이트에 각 웰당 5 x 10⁴ 세포 농도로 분주하였다. 24시간 후, Lipofectamine 2000를 사용하여 83 ng/ml의 루시퍼라아제 발현 벡터 및 50nM의 miRNA-203 듀플렉스(또는 스크램블된 miRNA 듀플렉스; 바이오니어)를 세포에 전달이입하였다. 루시퍼라아제 리포터 1000 어세이 시스템(Promega, USA)를 제조자의 방법대로 사용하여 48시간후에 루시퍼라아제 활성을 측정하였다.

만성 뇌전증 마우스에서 앤타고미어의 처리

앤타고미어의 비강내 투여는 종전에 기재된 바와 같이 수행되었다 (Lee, S.T.,et al. (2012) miR-206 regulates brain-derived neurotrophic factor in Alzheimer disease model. Ann Neurol, 72, 269-277). 요약하면 앤타고미어를 비강내 투여하기 위하여, 마취시킨 마우스의 머리를 똑바로 세운 자세로 하여 앙와위(supine position)로 두었다. AM203 (2'-O-메틸레이티드-5'-cuagugguccuaaacauuucac-3'; 24㎕의 0.1% v/v 디에틸피로카르보네이트-처리된 증류수 내 5nmol; 바이오니어, 한국)을 2분마다 각 콧구멍을 바꿔가며, 피펫으로 4㎕ 씩 투여하였다(총 6 분획). 대조군 마우스에게는 비히클을 동등한 부피만큼 투여하였다.

인비보 모델을 위한 웨스턴 블랏

마취한 마우스를 단두로 희생시키고, 즉시 뇌를 적출하였다. 뇌 부위(해마, 및 피질)의 균질화물을 제조하여 GLRB(Santa Cruz Biotechnology, USA) 항체를 사용하여 순차적으로 웨스턴 블랏을 진행하였다. 면역반응 단백질을 인핸스드 화학발광 시약(Pierce, USA)으로 가시화시키고 GS-700 스캐너를 사용하여 스캐닝하였다.각 밴드의 광학밀도는 Image-J 소프트웨어(National Institute of Health, USA)를 사용하여 측정하였으며, β-액틴 밴드에 상대값으로 나타냈다.

인비보 전기생리학

인 비보 뇌파검사 및 외과수술은 종전에 기술된 바와 같이 수행되었다 (Jeon, D. et al. (2011) A cell-free extract from human adipose stem cells protects mice against epilepsy. Epilepsia, 52, 1617-1626). 요약하면 뇌파검사를 모니터링하기위하여, 필로카르핀을 주입하기 2주전에 마우스에게 뇌파검사 수술을 수행하였다. 수술을 위해 1% 케타민(30 mg/kg) 및 자일라진 히드로클로리드( 4 mg/kg)을 복강내 주사하여 동물들을 마취시켰으며, 입체 정위 기구(stereotaxic apparaqtus)(Kopf Instruments, USA)를 사용하여 수행하였다. 뇌파도(electroencephalogram)는 텅스텐 전극(0.005인치, 2MΩ)을 사용하여 얻었는데, 이는 소뇌 위의 바닥부분을 포함하여 브레그마로부터 AP -1.8mm, L 2.1mm 및 DV 0.8-1.0mm(피질)에 있는 오른쪽 반구 내에 위치하고 있었다. 디지털 뇌파검사 시스템(Comet XL; Astro-Med, Inc. U.S.A)을 사용하여, 전기 활성을 증폭시킨 뒤(x 1200) 기록하고, 0.1 내지 70 Hz에서 대역 필터(bandpass-filtered)에 통과시켜, 400-Hz 샘플링 속도(AS 40)로 디지탈화하였다. 전기생리학적 데이타는 PSG Twin 4.2(Astro-Med, Inc)를 사용하여 오프라인에서 분석하였다. 만성 뇌전증 마우스에서의 뇌파검사 시그널은 SE 후 60일에 시작하여 14일 동안 연속적으로 기록하였다. AM203 또는 비히클을 비강내 처리를 반복한 후(48 시간 간격), 시그날을 또다른 14일동안 연속적으로 기록하였다. 상기 실험의 처리전 및 처리후 부분 사이에서 14일 동안의 데이터는 평균하였다.

통계 분석

miRNA 발현에 대한 히트 맵(Heat map)은 Z-스코어를 사용하여 생성하였는데, 이는 하기와 같이 계산하였다: Z-스코어 = [(각 miRNA의 발현에 대한 원수치(raw value) - 모든 miRNA 발현에 대한 평균 수치/모든 miRNAS 발현의 표준 편차]. Student's-t 테스트를 사용하여 두 그룹을 비교하였고, 분산에 대한 Krushall-Wallis 분석을 사용하여 3개 이상의 그룹을 비교하였다. Krushall-Wallis 테스트에서 얻은 p- 수치가 <0.05 일때, Mann-Whitney U 테스트를 사용하여 그룹 사이 비교의 포스트-훅(post-hoc)을 하였다. 0.05 이하의 양측 검증된(two-tailed) p-수치가 통계적으로 유의한 것으로 하였다.

실시예 1 만성 뇌전증이 있는 마우스의 뇌에서 차별적으로 발현되는 miRNA 규명

마이크로어레이를 사용하여 필로카르핀으로 유도된 SE 이후 60일에 만성 뇌전증 마우스에서의 miRNA 발현을 조사하였다. 정상 마우스와 비교할 때, 만성 뇌전증 마우스의 해마에서는 4개의 miRNA의 발현이 감소되어 있었고, 열한개의 miRNA의 발현이 증가되어 있었다(도 1a, 표 1). 피질에서는 10개의 miRNA가 상향 조절되어 있었으며 하향 조절된 것은 없었다(도 1b, 표 1). 5개(miR-199b, miR-203, miR-223, miR-451, 및 miR-455)는 해마 및 피질 둘 다에서 상향조절되었다(표 1).

차등 발현된 miRNA 중에서, 표적 예측 프로그램을 통해 miR-203이 Glrb(GLRB를 코딩하는 유전자)의 3'-비번역 부위에 결합할 수 있는 것으로 선별하였다(도 1c). 실시간 PCR 분석을 통해 miR-203이 만성 뇌전증 마우스의 해마에서 유의하게 상향조절되는 것을 확인하였다 (1.78 배 vs. 대조군; 도 1D; P=0.041). 상기 차이는 피질에서는 유의한 것으로 나타나지 않았다(도 1d).

만성 뇌전증 마우스에서 상향 또는 하향 조절된 mRNA
발현시 변화	해마	피질	해마 및 피질 모두
상향 조절됨	miR-21	miR-199a-5p	miR-199b
	miR-129-5p	miR-199b	miR-203
	miR-132	miR-199b	miR-223
	miR-142-3p	miR-203	miR-451
	miR-155	miR-223	miR-455
	miR-199b*	miR-451
	miR-199b	miR-455
	miR-203	miR-666-3p
	miR-223	miR-708
	miR-451	miR-805
	miR-455
하향 조절됨	miR-99b*	None	None
	miR-206
	miR-468
	miR-574-3p

실시예 2 miR -203에 의한 GLRB 단백질의 농도 감소

miR-203으로 전달이입 후 48시간에 뉴로(Neuro)-2a 세포에서 GLRB 단백질의 농도가 감소하였다. 나아가 Glrb의 3'UTR을 포함하는 루시퍼라아제 벡터와 miR-203을 함께 전달이입한 HeLa 세포에서는, miR-203은 48시간에서 루시퍼라아제 시그널을 감소시켰는데, 이는 miR-203이 Glrb의 번역을 직접적으로 저해함을 나타낸다(도 2b; P<0.001). 또한 miR-203에 대한 앤타고미어(AM203)를 함께 전달이입한 경우, GLRB 단백질 농도 감소가 억제되는 것으로 나타났다 (도 2c; P=0.024 vs. miR-203 단독).

실시예 3 miR-203 앤타고미어 AM203에 의한 만성 뇌전증이 있는 마우스에서 GLRB 단백질의 농도 증가

만성 뇌전증 마우스에게 5 nmol의 AM203 또는 식염수를 0 일째 및 2 일째에 비강내 처리하였다. 10일째에 수집한 해마 조직에 대해 웨스턴 블랏을 수행한 결과, 정상 마우스에서보다 만성 뇌전증 마우스에게서 GLRB 단백질 농도가 더 낮았으며(P=0.002), AM203이 투여는 GLRB 농도를 증가시키는 것으로 나타났다 (P=0.031)(도 3a 및 b). 반대로, 피질에서는 GLRB의 양이 적었으며, SRS 마우스의 피질에서는 GLRB가 이보다 더 낮았지만, AM203은 피질에서 GLRB의 발현에 영향을 미치지 않는 것으로 나타났다 (도 3a 및 b).

실시예 4 AM203 에 의한 만성 뇌전증이 있는 마우스에서 SRS 의 감소

14일동안 만성 뇌전증 마우스의 뇌파를 모니터링하고, 48시간간격으로 2회 AM203으로 비강내 처리 한 후 추가로 14일 동안 모니터링하였다. 식염수를 투여한 마우스에서 처리 전과 후에 SRS 에피소드의 빈도는 유사하였다(에피소드의 평균 수/14일 ± 표준 편차 = 처리 전 37.8 ± 5.2 vs. 처리 후 32.8 ± 5.4; P=0.69; 도 3e). 반면 AM203을 처리한 후는 유의하게 낮았다(처리 전 36.6 ± 5.9 에피소드/14일 vs. 처리 후 10.4 ± 4.0 에피소드/14일; P=0.003; 도 3e).

miR-203의 앤타고미어인 AM203을 비강내 투여하면, GLRB 발현이 회복되고 만성 뇌전증 마우스에서의 발작 횟수가 감소한다는 것은, miR-203-GLRB의 상호작용이 뇌전증의 발병에 관여하고 있다는 것을 나타낸다.

이상에서 본원의 예시적인 실시예에 대하여 상세하게 설명하였지만 본원의 권리범위는 이에 한정되는 것은 아니고 다음의 청구범위에서 정의하고 있는 본원의 기본 개념을 이용한 당업자의 여러 변형 및 개량 형태 또한 본원의 권리범위에 속하는 것이다.

본 발명에서 사용되는 모든 기술용어는, 달리 정의되지 않는 이상, 본 발명의 관련 분야에서 통상의 당업자가 일반적으로 이해하는 바와 같은 의미로 사용된다. 본 명세서에 참고문헌으로 기재되는 모든 간행물의 내용은 본 발명에 도입된다.

<110> SNU R&DB Foundation <120> Composition and method for preventing or treating epilepsy or diseases related to seizure comprising agent targeting microRNA-203 <130> DP201307009P <160> 2 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 22 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 1 gugaaauguu uaggaccacu ag 22 <210> 2 <211> 110 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 2 guguugggga cucgcgcgcu ggguccagug guucuuaaca guucaacagu ucuguagcgc 60 aauugugaaa uguuuaggac cacuagaccc ggcgggcgcg gcgacagcga 110

Claims

miR-203의 활성을 억제할 수 있는 안티센스 올리고뉴클레오타이드로 5'-CAUUUCAC-3', 5'-AUUUCAC-3', 5'-CAUUUCA-3', 5'-AUUUCA-3' 또는 5’-CUAGUGGUCCUAAACAUUUCAC-3' 중 하나 이상 및 그 약학적으로 허용가능한 담체를 포함하는, 뇌전증 치료 또는 예방용 약학 조성물.
제 1 항에 있어서, 상기 miR-203의 활성의 활성을 억제할 수 있는 안티센스올리고뉴클에오타이드는 상기 miR-203의 GLRβ 서브유닛 (GLRB, glycine receptor beta subunit)의 3'-UTR 과의 상호작용을 억제하는 것인, 뇌전증 치료 또는 예방용 약학 조성물.
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제 1 항에 있어서, 상기 안티센스 올리고뉴클레오타이드는 이를 구성하는 하나 이상의 뉴클레오타이드가 LNA, 또는 이를 구성하는 하나 이상의 뉴클레오타이드의 당이 2‘-O- 메틸화, 또는 이의 백본에 하나이상의 포스포티오에이트, 또는 이들의 조합을 포함하는 것인, 뇌전증 치료 또는 예방용 약학 조성물.
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제 1 항, 제 2 항 또는 제 7 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 조성물은 뇌로 전달되는 것인, 뇌전증 치료 또는 예방용 약학 조성물.
제 10 항에 있어서, 상기 조성물은 비강내 투여, 정맥내 투여, 피하 주사, 뇌척수강내 주사, 흡입투여, 또는 경구 투여용 제형인, 뇌전증 치료 또는 예방용 약학 조성물.
miR-203 RNA를 시험물질과 접촉시키는 단계; 및
상기 시험물질과 접촉된 miR-203 RNA의 활성을 결정하는 단계를 포함하며,
상기 접촉된 miR-203의 활성이, 상기 시험물질과 접촉되지 않은 대조군의 miR-203 RNA의 활성과 비교하여 감소한 경우 이를 후보물질로 선별하는 것인, 뇌전증 치료 또는 예방용 물질의 스크리닝 방법.
제 12 항에 있어서, 상기 miR-203 RNA는 이를 발현하는 세포의 형태로 제공되며, 상기 활성은 상기 miR-203 RNA의 발현 분석으로 결정되는 것인, 방법.
제 12 항에 있어서, 상기 miR-203 RNA는 이를 발현하는 세포의 형태로 제공되며, 상기 활성은 상기 miR-203 RNA와 이의 표적인 GLRβ 서브유닛 (GLRB, glycine receptor beta subunit)의 3'-UTR 과의 상호작용 분석으로 결정되는 것인, 방법.
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miR-21, miR-129-5p, miR-132, miR-142-3p, miR-155, miR-199b*, miR-199b, miR-223, miR-451, miR-455, miR-99b*, miR-206, miR-468, miR-574-3p, miR-199a-5p, miR-666-3p, miR-708 및 miR-805로 구성된 군으로부터 선택되는 miRNA의 뉴클레오타이드 서열 검출용 물질을 포함하는 뇌전증 진단용 키트.
제 16 항에 있어서, 상기 키트는 miR-203 뉴클레오타이드 서열 검출용 물질을 추가로 포함하는 것인, 뇌전증 진단용 키트.
miR-21, miR-129-5p, miR-132, miR-142-3p, miR-155, miR-199b*, miR-199b, miR-223, miR-451, miR-455, miR-99b*, miR-206, miR-468, miR-574-3p, miR-199a-5p, miR-666-3p, miR-708 및 miR-805로 구성된 군으로부터 선택되는 miRNA 마커 중 하나 이상의 발현을 검출하는 단계; 및
상기 검출된 마커의 발현량을 검사 대상자의 뇌전증의 진단 또는 예후와 연관시키는 단계를 포함하는, 뇌전증의 진단 또는 예후에 필요한 정보를 제공하기 위하여 상기 마커를 검출하는 방법.
제 18 항에 있어서, 상기 방법은 miR-203 발현을 검출하는 단계를 추가로 포함하는 것인, 방법.
제 18 항 또는 제 19 항에 있어서, 상기 연관시키는 단계는 상기 검사 대상자의 비마커 임상정보를 추가로 사용하는 것인, 방법.
제 19 항에 있어서, 상기 연관시키는 단계는 상기 결정된 마커의 발현량을 정상 대조군에서 결정된 상기 각 마커에 대한 검출결과와 비교하는 것으로, 상기 마커 중 miR-21, miR-129-5p, miR-132, miR-142-3p, miR-155, miR-199b*, miR-199b, miR-203, miR-223, miR-451, miR-455, miR-199a-5p, miR-666-3p, miR-708 및 miR-805의 발현은 대조군과 비교하여 그 발현량이 증가한 것이고, 상기 마커 중 miR-99b*, miR-206, miR-468 및 miR-574-3p는 그 발현량이 감소한 것인, 방법.