KR101738923B1 - TSC1 및 mTOR 단백질의 발현을 조절하는 miRNA를 표적으로 하는 뇌전증 또는 발작 관련 질환의 예방 또는 치료용 약학 조성물 및 스크리닝 방법 - Google Patents

Abstract

본 발명은 뇌전증 또는 발작 관련 질환의 예방 또는 치료용 약학 조성물 및 스크리닝 방법에 관한 것이며, 보다 상세하게는 miRNA 조절물질이 TSC1의 발현을 증가시키고, mTOR의 발현을 감소시키는 기전을 이용하여, 기존의 뇌전증 치료제들 보다 부작용을 줄일 수 있고, 더 나아가 뇌전증 또는 발작 관련 질환의 근본적인 치료용 약학 조성물을 제공하는 것에 관한 것이다.

Description

TSC1 및 mTOR 단백질의 발현을 조절하는 miRNA를 표적으로 하는 뇌전증 또는 발작 관련 질환의 예방 또는 치료용 약학 조성물 및 스크리닝 방법 {The pharmaceutical composition for the prophylaxis or treatment of epilepsy or seizure-related disease targeting miRNA to regulate the expression of TSC1 and mTOR protein and method for screening}

본 발명의 목적은 TSC1 및 mTOR 단백질의 발현을 조절하는 miRNA를 표적으로 하는 뇌전증 또는 발작 관련 질환의 예방 또는 치료용 조성물 및 스크리닝 방법에 관한 것이다.

뇌전증(epilepsy)은 만성적인 신경 장애의 하나로, 뇌신경 세포의 불규칙한 흥분으로 뇌에 전기가 발생해 발작과 경련을 일으키는 질환이다. 뇌전증은 여러 가지 원인에 의해 발생하며, 역학 연구에서는 환자의 1/3 이상이 뇌에 생긴 병리적 변화나 뇌손상의 과거 병력이 있는 것으로 보고되어 있고, 주요한 원인으로는 뇌졸중, 선천기형, 두부외상, 뇌염, 뇌종양, 퇴행성 뇌병증, 유전, 미숙아, 분만 전후의 손상 등을 들 수 있다.

뇌전증의 평균 유병률은 0.5~1%로, 만성 신경 질환 중에서 가장 유병률이 높은 질환 중 하나이다. 세계 보건 기구(WHO)의 조사에 의하면, 전 세계적으로 약 5천만 명의 뇌전증 환자가 있으며, 이는 전 세계 질병 부담의 약 1%에 해당한다. 뇌전증의 유병률은 연령에 따라 차이가 있는데, 소아와 고령층에서의 유병률이 높은 것이 특징이다. 최근 수명의 연장으로 인한 고령인구의 증가로 고령층에서의 뇌전증 환자가 증가하고 있으며, 전체적인 뇌전증 환자의 증가가 예상된다. 아직까지 뇌전증의 근본적인 치료 방법은 없으며, 항뇌전증 약물의 투여가 주된 치료법이다. 만성 뇌전증 환자의 약 70%는 항뇌전증 약물로써 조절될 수 있지만, 30% 정도는 항뇌전증 약물 복합요법(polytherapy)에도 뇌전증 발작이 조절되지 않는 약물 내성 뇌전증(pharmacoresistant epilepsy)으로 진행한다. 이러한 문제를 해결하기 위해 지난 20년간 새로운 종류의 항뇌전증 약물들이 지속적으로 개발되고 시판되었으나, 여전히 약물 내성 뇌전증 환자들의 비율은 줄어들고 있지 않은 실정이다. 향후 고령인구의 증가로 뇌전증 환자들로 인한 사회적 부담이 크게 증가할 것으로 예상되며, 이를 해결하기 위해 새로운 기전의 항 뇌전증 약물을 개발하는 것이 필요하다.

TSC1 유전자의 이상은 결절성경화증(tuberous sclerosis) 발생에 핵심적인 역할을 하는 것으로 알려져 있다. TSC1 유전자는 정상적으로 hamartin (tuberous sclerosis 1, TSC1)이라고 하는 단백질을 합성하는 기능을 가지고 있으며, hamartin은 TSC2 유전자에 의해 합성되는 tuberin (TSC2)과 결합하여 mTOR(mammalian target of rapamycin)의 활성을 억제하는 역할을 한다. TSC1 혹은 TSC2 유전자에 결함이 생기면, mTOR가 과도하게 활성화되면서 발작, 자폐증, 경도 인지 장애, 피질 결절(cortical tuber), 종양 발생을 특징으로 하는 결절성경화증이 발생하게 된다. 약 90%의 결절성경화증 환자에게서 뇌전증이 발생하게 되는데, 이는 주로 피질 결절(cortical tuber)에 의한 것으로 생각되고 있으나 아직 그 정확한 기전은 알고 있지 못한 상태이다.

뇌전증은 전 세계적으로 약 6500만명이 앓고 있는 흔한 질환이며 (WHO, 2004), 뇌전증 환자들은 병으로 인해 많은 의료비용을 지출하고 있으며, 정상적인 직장생활을 하지 못하여 많은 경제적 손실을 입고 있다. 특히, 전체 뇌전증 환자들의 약 30%에 해당되는 환자들은 약물로 뇌전증 발작이 잘 조절되지 않는 약물 내성 뇌전증으로 인해 더 큰 어려움을 겪고 있다. 이에 새로운 기전의 항뇌전증 약물의 개발이 시급한 실정이다.

본 발명은 상기와 같은 과제를 해결하기 위한 것으로, 효율적으로 뇌전증 또는 발작 관련 질환의 예방 또는 치료용 약학 조성물 및 스크리닝 방법의 제공을 목적으로 하며, 보다 상세하게는 TSC1 및 mTOR 단백질의 발현을 조절하는 miRNA를 표적으로 하는 약학 조성물을 제조함으로써, 뇌전증 또는 발작 관련 질환의 치료용 약학 조성물 및 스크리닝 방법을 제공하는 것을 목적으로 한다.

상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 miR-21, 27 또는 32의 활성을 억제할 수 있는 뇌전증 또는 발작 관련 질환 치료 또는 예방용 약학 조성물을 포함하는 것을 특징으로 한다.

또한, 본 발명에 있어서, 상기 miR-21, 27 또는 32의 활성을 억제할 수 있는 조성물은 TSC1(tuberous sclerosis 1)의 발현을 항진시킬 수 있는 것을 특징으로 한다.

또한, 본 발명에 있어서, 상기 miR-21, 27 또는 32의 활성을 억제할 수 있는 조성물은 mTOR(mammalian target of rapamycin)의 발현을 억제시킬 수 있는 것을 특징으로 한다.

그리고, 본 발명에 있어서, 상기 miR-21, 27 또는 32의 활성을 억제할 수 있는 조성물은 TSC1(tuberous sclerosis 1)의 발현을 항진시키거나 mTOR(mammalian target of rapamycin)의 발현을 억제시킬 수 있는 것을 특징으로 한다.

또한, 본 발명에 있어서, 상기 miR-21의 활성을 억제할 수 있는 물질은 상기 miR-21의 서열번호 1의 뉴클레오타이드 서열의 전부 또는 일부에 결합할 수 있는 핵산 분자를 포함하는 것을 특징으로 한다.

또한, 본 발명에 있어서, 상기 miR-27의 활성을 억제할 수 있는 물질은 상기 miR-27의 서열번호 2의 뉴클레오타이드 서열의 전부 또는 일부에 결합할 수 있는 핵산 분자를 포함하는 것을 특징으로 한다.

또한, 본 발명에 있어서, 상기 miR-32의 활성을 억제할 수 있는 물질은 상기 miR-32의 서열번호 3의 뉴클레오타이드 서열의 전부 또는 일부에 결합할 수 있는 핵산 분자를 포함하는 것을 특징으로 한다.

또한, 본 발명에 있어서, 상기 miR-21, 27 또는 32의 활성을 억제할 수 있는 조성물은 뇌전증 발작 억제 효과가 있는 뇌전증 또는 발작 관련 질환 치료 또는 예방용 약학 조성물을 포함하는 것을 특징으로 한다.

또한, 본 발명에 있어서, 상기 조성물은 질환에 따라 또는 성분에 따라 용액, 현탄액, 에멀젼, 리포좀 제형, 정제, 캡슐, 젤, 시럽 또는 좌제 중 어느 한 가지로 제형화 할 수 있는 것을 특징으로 한다.

또한, 본 발명에 있어서, 상기 조성물은 비강내 투여, 정맥내 투여, 흡입 투여, 경구 투여, 피하 주사 또는 뇌척수강내 주사용 제형을 가지는, 뇌전증 또는 발작 관련 질환 치료 또는 예방용 약학 조성물인 것을 특징으로 한다.

또한, 본 발명에 있어서, 상기 핵산 분자는 RNA, DNA, antagomir, 안티센스 분자, siRNA, shRNA, 2'-O-변형 올리고뉴클레오타이드, 포스포로티오에이트-백본 디옥시리보뉴클레오타이드, 포스포로티오에이트-백본 리보뉴클레오타이드, 디코이 올리고뉴클레오타이드, PNA(peptide nucleic acid) 올리고뉴클레오타이드 또는 LNA(locked nucleic acid) 올리고뉴클레오타이드인 것을 포함하는 것을 특징으로 한다.

또한, 본 발명에 있어서, 상기 발작 관련 질환은, 뇌졸중, 해마경화, 뇌성마비, 선천성기형, 중추신경계 감염, 저산소증, 뇌종양, 외상성 뇌손상, 신경퇴행성질환, 대사성 질환, 자가 면역 질환 또는 원인 미상으로 인한 발작인 것을 특징으로 한다.

또한, 본 발명에 있어서,miR-21, miR-27 또는 miR-32를 시험물질과 접촉시키는 단계 및 상기 시험물질과 접촉된 miR-21, miR-27 또는 miR-32의 활성을 결정하는 단계를 포함하며, 상기 접촉된 miR-21, miR-27 또는 miR-32의 활성이, 상기 시험물질과 접촉되지 않은 대조군의 miR-21, miR-27 또는 miR-32의 활성과 비교하여 감소한 경우 이를 후보물질로 선별하는 것인, 뇌전증 또는 발작 관련 질환 치료 또는 예방용 물질의 스크리닝 방법인 것을 특징으로 한다.

또한, 본 발명에 있어서, 상기 miR-21, miR-27 또는 miR-32는 이를 발현하는 세포의 형태로 제공되며, 상기 활성은 상기 miR-21, miR-27 또는 miR-32의 발현 분석으로 결정되는 스크리닝 방법인 것을 특징으로 한다.

또한, 본 발명에 있어서, 상기 발작 관련 질환은, 뇌졸중, 해마경화, 뇌성마비, 선천성기형, 중추신경계 감염, 저산소증, 뇌종양, 외상성 뇌손상, 신경퇴행성질환, 대사성 질환, 자가 면역 질환 또는 원인 미상으로 인한 발작에 대한 스크리닝 방법인 것을 특징으로 한다.

본 발명에 따른 뇌전증 또는 발작 관련 질환의 예방 또는 치료용 약학 조성물은 TSC1 및 mTOR 단백질의 발현을 조절하는 miRNA를 표적으로 사용함으로써, 새로운 작용 기전을 제공할 수 있으며, 기존의 뇌전증 치료제들과는 달리 부작용을 줄일 수 있고, 더 나아가 뇌전증 또는 발작 관련 질환의 근본적인 치료용 약학 조성물을 제공할 수 있다.

도 1은 miR-21, miR-27, miR-32의 서열을 나타낸 것이다.
도 2는 Neuro-2a 세포에 AM21, 27, 32를 투약하고, 48시간 뒤의 TSC1과 p-S6의 변화 결과를 나타낸 것이다.
도 3은 정상 마우스와 AM21을 투여하고, 6시간 후와 7일 후의 p-mTOR, mTOR, TSC1, p-S6, S6, TSC2의 변화 결과를 나타낸 것이다.
도 4는 마우스 대조군과 kainate만 처리한 군, kainate와 AM-21을 함께 처리한 군에서의 miR-21의 상대적 발현량을 RT-PCR(Real time PCR)을 통해 나타낸 것이다.
도 5는 마우스 대조군과 kainate만 처리한 군, kainate와 AM21을 함께 처리한 군에서의 p-mTOR, mTOR, TSC1, p-S6, S6, TSC2, p-S6K, S6K의 변화 결과를 나타낸 것이다.
도 6은 마우스 Pilocarpine 유도 만성 뇌전증 모델에서 5개의 개체군에 AM32를 지속적으로 투여한 경우, 투약 전 40일부터 투약 후 74일까지의 발작 빈도의 변화를 막대 그래프로 나타낸 것이다.
도 7은 마우스 만성 뇌전증 모델에서 AM32를 지속적으로 투여한 경우, 투약 전 40일부터 투약 후 74일까지의 발작 빈도의 개체별 평균값이 감소하는 것을 막대 그래프로 나타낸 것이다.

이하 본 발명의 바람직한 실시를 보다 상세하게 설명한다. 그러나 본 발명은 다수의 상이한 형태로 구현될 수 있고, 기술된 실시 예에 제한되지 않음을 이해하여야 한다. 하기에 설명되는 본 발명의 실시 예는 당업자에게 본 발명의 사상을 충분하게 전달하기 위한 것임에 유의하여야 한다.

본 발명은 miR-21, 27 또는 32에 의한 TSC1의 발현 증가와 mTOR의 발현 감소가 발작 관련 질환과 연관되어 있음을 규명한 것에 근거한 것이다. 따라서 한 양태에서 본 발명은 miR-21, 27 또는 32의 활성을 억제할 수 있는 물질 및 약학적으로 허용 가능한 담체를 포함하는, 뇌전증 또는 발작 관련 질환 치료 또는 예방용 약학 조성물에 관한 것이다.

본원에 사용된 용어 "miR" 또는 "마이크로 RNA"는 표적 RNA의 분해(degradation)을 촉진시키거나 또는 그들의 번역을 억제시킴으로써 유전자 발현을 전사 후에 조절하는 21 내지 23개의 비코딩 RNA를 말한다. 본원에 사용된 miRNA의 성숙 서열은 miRNA 데이터베이스 (http://www.mirbase.org)에서 얻을 수 있다.

일반적으로 마이크로 RNA는 pre-miRNA라 불리는 헤어핀 구조를 갖는 약 70-80 nt (nucleotide) 길이의 전구체로 전사된 후, RNAse III 효소인 Dicer에 의해 잘려 성숙된 형태로 생성된다. 마이크로 RNA는 miRNP라 불리는 리보뉴클레오복합체를 형성하여 표적 부위에 상보적 결합을 통해 표적 유전자를 절단하거나, 번역을 억제한다. 30% 이상의 인간 miRNA는 클러스터로 존재하며, 하나의 전구체로 전사된 후, 절단과정을 거쳐 최종 성숙 miRNA가 형성된다.

또한, 본 명세서에서 설명되는 Antagomir란 microRNA의 염기서열에 상보적인 염기서열을 가지면서 상기 microRNA에 결합할 수 있도록 제작된 올리고 뉴클레오타이드를 말하며, 상기 microRNA의 기능을 억제함으로서 miRNA의 타겟 단백질 발현이 증가하게 된다. 현재 miRNA 의 연구는 발생학, 종양학에서 주로 연구되고 있으며, 신경과학(neuroscience) 분야에서는 연구 초기 단계이다. 뇌전증에서 miRNA 연구는 현재까지 보고된 바가 거의 없는 블루 오션으로, siRNA 혹은 miRNA/miRNA antagomir를 합성하여 뇌 척수액 공간내 혹은 혈중에 주사할 경우 특정 mRNA, miRNA의 억제가 가능하여, 새로운 치료기술의 개발에 이용할 수 있다.

그리고, miRNA는 체내에 정상적으로 존재하는 물질이므로, 병적인 상황에서 특징적으로 증가하는 miRNA를 감소시키는 방법을 이용한 치료는 심각한 부작용을 유발하지 않을 것으로 기대하고 있다. 따라서, miRNA 조절을 통해 TSC1의 발현을 증가시키고, mTOR의 활성화를 억제할 수 있는 방법을 개발하게 된다면, 기존에 알려져 있는 mTOR 억제제들보다 훨씬 안전하고 효과적인 치료법이 될 수 있을 것이다. 더 나아가, 결절성경화증 환자에서 자폐증, 인지 장애, 종양 등이 발생하는 것에서 확인할 수 있듯이 TSC1과 mTOR는 등 다양한 세포 과정에서 다양한 기능을 수행하는 것으로 여겨지는데, 이를 miRNA라는 정상 생리적인 메커니즘을 이용하여 치료하고자 하는 방법은 더욱 다양한 치료 효과를 기대할 수 있게 한다.

한편, TSC1 단백질은 정상적으로 mTOR를 억제하는 기능을 담당하는데, 결절성경화증에서는 TSC1이 소실되어 mTOR 활성이 증가하면서 여러 가지 증상이 발생하는 것으로 알려져 있다. 평소에 TSC1 발현을 억제하는 기능을 하는 miRNA를 발굴하여, 이에 대한 antagomir를 투여하면 TSC1 발현을 증가시키고, mTOR의 활성화를 억제할 수 있을 것으로 기대한다. 특히, TSC1 조절을 통해 mTOR를 억제하게 되면, 뇌전증 발생 억제 효과(antiepileptogenic effect)가 있을 것으로 예상되며, 후천성 뇌전증(acquired epilepsy)에서 뇌전증 발생을 억제하는 근본적인 치료제가 될 것으로 기대한다.

이에 따른 본 발명의 실시 예에 따르면, miR-21, 27 또는 32의 활성을 억제할 수 있는 뇌전증 또는 발작 관련 질환 치료 또는 예방용 약학 조성물일 수 있다.

본원에서 miR-21, 27 또는 32의 활성 억제는 miR-21, 27 또는 32의 세포내 작용 또는 기능을 억제 또는 방해하는 것을 의미하는 것으로 전형적으로 antagomir가 miR-21, 27 또는 32의 서열에 결합하여 그 활성을 억제하거나, 또는 저분자 억제제, 항체 또는 항체의 단편을 이용하여 miR-21, 27 또는 32의 기능을 직접적으로 억제하거나, 또는 억제제 또는 small interfereing RNA분자를 이용하여 간접적으로 조절되는 것을 포함한다.

나아가 miR-21, 27 또는 32의 활성의 방해 또는 억제는 직접 또는 간접적으로 서열번호 1, 서열번호 2 및 서열번호 3 중 적어도 하나의 활성을 억제하는 것을 포함한다. 또한 miR-21, 27 또는 32의 활성 억제는 miR-21, 27 또는 32의 전사를 억제하여 이의 세포내 농도를 낮추는 것을 포함한다.

본원에서 용어 “miR-21, 27 또는 32의 활성을 억제할 수 물질”은 이의 발현 및/또는 활성을 억제할 수 있는 임의의 물질을 포함한다. 이러한 물질은 예를 들면 antagomir, 안티센스 분자, 소헤어핀 RNA 분자 (shRNA), 소방해 RNA 분자 (siRNA), 시드 표적 LNA (Locked Nucleic Acid) 올리고뉴클레오타이드, 데코이올리고뉴클레오타이드, 앱타머, 리보자임, 또는 DNA:RNA 하이브리드를 인지하는 항체를 포함할 수 있다.

또한, 상기 miR-21, 27 또는 32의 활성을 억제할 수 있는 조성물은 TSC1(tuberous sclerosis 1)의 발현을 항진시킬 수 있는 뇌전증 또는 발작 관련 질환 치료 또는 예방용 약학 조성물일 수 있다.

또한, 상기 miR-21, 27 또는 32의 활성을 억제할 수 있는 조성물은 mTOR(mammalian target of rapamycin)의 발현을 억제시킬 수 있는 뇌전증 또는 발작 관련 질환 치료 또는 예방용 약학 조성물일 수 있다.

또한, 상기 miR-21의 활성을 억제할 수 있는 물질은 상기 miR-21의 서열번호 1의 뉴클레오타이드 서열의 전부 또는 일부에 결합할 수 있는 핵산 분자인, 뇌전증 또는 발작 관련 질환 치료 또는 예방용 약학 조성물일 수 있다.

또한, 상기 miR-27의 활성을 억제할 수 있는 물질은 상기 miR-27의 서열번호 2의 뉴클레오타이드 서열의 전부 또는 일부에 결합할 수 있는 핵산 분자인, 뇌전증 또는 발작 관련 질환 치료 또는 예방용 약학 조성물일 수 있다.

또한, 상기 miR-32의 활성을 억제할 수 있는 물질은 상기 miR-32의 서열번호 3의 뉴클레오타이드 서열의 전부 또는 일부에 결합할 수 있는 핵산 분자인, 뇌전증 또는 발작 관련 질환 치료 또는 예방용 약학 조성물일 수 있다.

또한, 상기 miR-21, 27 또는 32의 활성을 억제할 수 있는 조성물은 뇌전증 발작 억제 효과가 있는 뇌전증 또는 발작 관련 질환 치료 또는 예방용 약학 조성물일 수 있다.

또한, 상기 조성물은 질환에 따라 또는 성분에 따라 용액, 현탄액, 에멀젼, 리포좀 제형, 정제, 캡슐, 젤, 시럽 또는 좌제 중 어느 한 가지로 제형화 할 수 있는 뇌전증 또는 발작 관련 질환 치료 또는 예방용 약학 조성물일 수 있다.

또한, 상기 조성물은 비강내 투여, 정맥내 투여, 흡입 투여, 경구 투여, 피하 주사 또는 뇌척수강내 주사용 제형을 가지는, 뇌전증 또는 발작 관련 질환 치료 또는 예방용 약학 조성물일 수 있다.

또한, 상기 핵산 분자는 RNA, DNA, antagomir, 안티센스 분자, siRNA, shRNA, 2'-O-변형 올리고뉴클레오타이드, 포스포로티오에이트-백본 디옥시리보뉴클레오타이드, 포스포로티오에이트-백본 리보뉴클레오타이드, 디코이 올리고뉴클레오타이드, PNA(peptide nucleic acid) 올리고뉴클레오타이드 또는 LNA(locked nucleic acid) 올리고뉴클레오타이드인, 뇌전증 또는 발작 관련 질환 치료 또는 예방용 약학 조성물일 수 있다.

또한, 상기 발작 관련 질환은, 뇌졸중, 해마경화, 뇌성마비, 선천성기형, 중추신경계 감염, 저산소증, 뇌종양, 외상성 뇌손상, 신경퇴행성질환, 대사성 질환, 자가 면역 질환 또는 원인 미상으로 인한 발작, 뇌전증 또는 발작 관련 질환 치료 또는 예방용 약학 조성물일 수 있다.

또한, 본 발명에 있어서,miR-21, miR-27 또는 miR-32를 시험물질과 접촉시키는 단계 및 상기 시험물질과 접촉된 miR-21, miR-27 또는 miR-32의 활성을 결정하는 단계를 포함하며, 상기 접촉된 miR-21, miR-27 또는 miR-32의 활성이, 상기 시험물질과 접촉되지 않은 대조군의 miR-21, miR-27 또는 miR-32의 활성과 비교하여 감소한 경우 이를 후보물질로 선별하는 것인, 뇌전증 또는 발작 관련 질환 치료 또는 예방용 물질의 스크리닝 방법일 수 있다.

또한, 본 발명에 있어서, 상기 miR-21, miR-27 또는 miR-32는 이를 발현하는 세포의 형태로 제공되며, 상기 활성은 상기 miR-21, miR-27 또는 miR-32의 발현 분석으로 결정되는 스크리닝 방법일 수 있다.

또한, 본 발명에 있어서, 상기 발작 관련 질환은, 뇌졸중, 해마경화, 뇌성마비, 선천성기형, 중추신경계 감염, 저산소증, 뇌종양, 외상성 뇌손상, 신경퇴행성질환, 대사성 질환, 자가 면역 질환 또는 원인 미상으로 인한 발작에 대한 스크리닝 방법일 수 있다.

본원에 사용된 용어 "antagomir"는 단일-가닥의 화학적으로 변형된 올리고뉴클레오타이드로서, 내인성 microRNA의 차단 (silence)에 사용되며, 표적서열에 상보적 서열을 가진다. 본원에 따른 antagomir는 miR-21, 27 또는 32에 적어도 부분적으로 또는 완전하게 상보적인 서열을 갖는다.

일 구현예에서 antagomir는 하나 이상의 변형 (예컨대, 2'-O-메틸-당 변형, 또는 3' 콜레스테롤 변형)을 포함한다. 다른 구현예에서 antagomir는 하나이상의 포스포로씨오에이트 결합을 포함하며, 적어도 부분적으로 포스포로티오에이트 백본을 갖게 된다.

본원에서 용어 "상보적"은 소정의 혼성화 또는 어닐링 조건, 바람직하게는 생리학적 조건 하에서 안티센스 올리고뉴클레오타이드가 miR-21, 27 또는 32 표적에 선택적으로 혼성화 할 정도로 충분히 상보적인 것을 의미하며, 일부 또는 부분적으로 실질적으로 상보적(substantially complementary) 및 완전히 상보적 (perfectly complementary)인 것을 모두 포괄하는 의미를 가지며, 바람직하게는 완전히 상보적인 것을 의미한다. 실질적으로 상보적이란, 완전히 상보적인 것은 아니지만, 표적 서열에 결합하여 본원에 따른 효과 즉, miR-21, 27 또는 32의 활성을 방해하기에 충분한 효과를 낼 정도의 상보성을 의미하는 것이다.

본원에서 용어 "핵산"은 폴리뉴클레오타이드, 올리고뉴클레오타이드, DNA, RNA, 및 그 유사체 및 그 유도체를 포함하는 것으로 예를 들면 펩타이드 핵산 (PNA) 또는 그 혼합물을 포함한다. 또한 핵산은 단일 또는 이중가닥일 수 있으며, 폴리펩타이드, mRNA, microRNA 또는 siRNA 등을 포함하는 분자를 코딩할 수 있다.

본원에 따른 일 구현예에서, miR-21, 27 또는 32의 활성을 억제할 수 있는 물질은 miR-21, 27 또는 32의 성숙 서열의 전부 또는 일부, 특히 씨드 서열에 상보적으로 결합하여, 이의 활성을 억제할 수 있는 안티센스 올리고뉴클레오타이드이다. 상기 활성의 억제는 miR-21, 27 또는 32의 전사 및/또는 miR-21, 27 또는 32의 표적 mRNA와의 결합을 억제하는 것이다. 본원에 따른 안티센스 올리고뉴클레오타이드는 이를 구성하는 뉴클레오타이드 또는 뉴클레오타이드를 연결하는 백본(골격)이 하기 하나 이상의 변형을 포함할 수 있거나, 또는 포함하지 않을 수 있다. 즉 상기 안티센스 올리고뉴클레오타이드는 이를 구성하는 하나 이상의 뉴클레오타이드가 LNA, 또는 이를 구성하는 하나 이상의 뉴클레오타이드의 당이 2‘-O- 메틸화, 또는 이의 백본에 하나 이상의 포스포티오에이트를 포함할 수 있다.

그리고, 본원에 사용된 용어 "치료" , "완화" 또는 "개선" 이란 본 조성물의 투여로 관련 질환의 증세를 호전시키거나 이롭게 변경하는 모든 행위를 의미한다. 본원이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자라면, 대한의학협회 등에서 제시된 자료를 참조하여 질환의 정확한 기준을 알고, 개선, 향상 및 치료된 정도를 판단할 수 있을 것이다.

또한, 본원에 사용된 용어 "예방"은 관련 질환의 발병을 억제 또는 지연시키는 모든 행위를 의미한다. 본원의 조성물은 초기 증상, 또는 나타나기 전에 투여할 경우 관련 질환을 예방할 수 있다는 것은 당업자에게 자명할 것이다.

그리고, 본원 조성물은 본원의 활성을 억제할 수 있는 물질 이외에 질환의 치료와 관련하여 동일 또는 유사한 기능을 나타내는 유효성분을 1종 이상 또는 유효성분의 용해성 및/또는 흡수성을 유지/증가시키는 화합물을 추가로 함유할 수 있다. 또한 선택적으로, 화학치료제, 항염증제, 항바이러스제 및/또는 면역조절제 등을 추가로 포함할 수 있다.

본 발명의 실시예를 위해 사용된 실험 단계는 하기와 같이 설명될 수 있다.

1. 필로카르핀 ( Pilocarpine ) 유도 뇌전증 모델 생성

수컷 C57BL/6J 마우스(22~25g)에게 메틸스코폴아민(1mg/kg i.p., Sigma-Aldrich, USA)을 처치하였다. 30분 후, 필로카르핀(Pilocarpine)(330mg/kg, Sigma-Aldrich)을 주사하여 SE(Status epilepticus)를 유도하였다. SE 시작 후 40분에 디아제팜(Diazepam) (5mg/kg i.p.)을 주사하여 지속되던 발작을 중단시켰다. SE는 수차례의 불연속적인 경련성 발작(Stage 4-6) 후, 연속적인 전신 강직 간대 발작(tonic-clonic behavioral seizures)으로 정의된다. SE 이후, 모든 동물들에게 2일 동안 5% 글루코스 용액을 먹였고, 정상적인 먹이 펠렛을 먹기 시작할 때까지 습식 사료를 먹였다. SRS(spontaneous recurrent seizures)를 보일 때까지, 12시간의 명암주기 및 물과 음식에 무제한으로 접근할 수 있는 곳에서 마우스를 사육하였다.

2. Kainate 유도 뇌전증 모델 생성

Kainate 유도 뇌전증 모델을 생성하기 위하여 수컷 C57BL/6J 마우스(22~25g)를 사용하였다. 뇌파 수술은 Kainate를 주사하기 전에 수행하였다. 마우스의 SE를 유도하기 위하여 kainate(20 mg/kg, i.p., Sigma)를 단일 조직계통 주사하였다. SE 이후, 모든 동물들에게 2일 동안 5% 글루코스 용액을 먹였고, 정상적인 먹이펠렛을 먹기 시작할 때까지 습식 사료를 먹였다. 12시간의 명암주기 및 물과 음식에 무제한으로 접근할 수 있는 곳에서 마우스를 사육하였다.

3. 마이크로 어레이를 이용한 microRNA 발현 분석

만성 뇌전증 모델에서의 muRNA 발현 분석을 위하여 필로카르핀으로 유도된 SE 60일 후에 마우스를 깊이 마취시킨 후 단두로 희생시켰다. 뇌를 즉시 적출하였고, 소뇌에서 샘플을 얻었다. 연령대가 일치하는 정상적인 마우스들은 대조군으로 사용했다. 해마와 피질로부터 별도로 RNA를 수득하고, 분석에 사용하였다. 7개의 샘플(정상 3개, 뇌전증 4개)은 각각의 마이크로어레이 칩 상에서 테스트 하였다. Trizol(Invitrogen, Carlsbad, CA)을 제조자의 방법대로 사용하여 각 마우스의 뇌에서 총 RNA를 분리하였다. 마우스 miRNA 마이크로어레이 8X15K 키트(567 마우스 miRNA를 감지)(Agilent Technilogies, Inc. USA)을 제조자의 방법대로 사용하여 miRNA 발현 프로파일을 조사하였다. 스캐닝 및 분석은 Agilent 하드웨어 플랫폼에서 수행되었고, 얻어진 데이터는 GenSpring GX, 버젼 7.3.1(Agilent Technologies)를 이용하여 평가했다. miRNA 마이크로 어레이의 결과는 평균값의 비율로부터 계산된 표준편차와 배수를 사용하여 분석했다. 60일 시점에서의 miRNA의 상향조절 또는 하향조절은 0.05이하의 P-수치와 대조군과 비교하여 2배 이상 큰 P-수치로 정의된다. SPSS 21.0(SPSS Inc, Chicago, Ill)은 통계 분석에 사용되었고, P-수치는 0.05보다 작은 값을 유의한 것으로 하였다.

4. EEG monitoring(뇌파 검사)와 발작 분석

인 비보 뇌파검사 및 외과수술을 위해 1% 케타민(30 mg/kg) 및 자일라진 히드로클로리드(4 mg/kg)을 복강내 주사하여 동물들을 마취시켰다. 수술은 입체 정위 기구(stereotaxic apparaqtus)(Kopf Instruments, USA)를 사용하여 수행하였고, 전기 활성은 텅스텐 전극(0.005인치, 2MΩ)을 사용하여 얻었는데, 이는 소뇌 위의 바닥부분을 포함하여 브레그마로부터 AP -1.8mm, L 2.1mm 및 DV 0.8-1.0mm(피질)에 있는 오른쪽 반구 내에 위치하고 있었다. 연속적인 뇌파 기록은 비디오 모니터링과 결합되었다. SE로부터 60일 이후부터 실험이 종료될 때까지, 비디오-뇌파 시그널은 하루에 24시간씩 연속적으로 기록되었다. 전기 활성은 디지털 뇌파검사 시스템(Comet XL, Astro-Med, Inc., Warwick, RI)을 사용하여, 전기 활성을 증폭시킨 뒤(×1200) 기록하고, 0.1~70Hz에서 대역 필터(bandpass-filtered)에 통과시켜, 400-Hz 샘플링 속도(AS 40)로 디지털화하였다. 전기 촬영술 발작은 뇌파 시그널이 진폭(>백그라운드의 2배)과 뇌파 활성의 진동수(4-12초의 진동수가 반복적인 스파이크와 함께 적어도 10초 동안 지속됨)가 변화를 보이는 것으로 정의된다. 행동 발작은 Racines scale(Racine 1972)을 따라 동시 비디오-모니터링에 의해 평가되었다. 1 단계 : 움직이지 않고, 강직된 자세를 보임; 2단계 : 입의 움직임과 고개를 끄덕거리며 반복적인 움직임을 보임; 3단계 : 앞다리의 간헐성 경련을 보임; 4단계 : 일어서고 넘어짐과 함께 심한 발작을 보임; 5단계 : 자세가 흐트러지거나 점프함과 함께 심한 발작을 보임; 6단계 : 전신 강직 간대 발작을 보임. 전기 임상적인 자발적 순환 발작(SRS)은 뇌파에 뇌전증 스파이크와 함께 경련성 발작(4~6단계)로 정의된다. 자발적 순환 발작(SRS) 데이터는 평균적인 것이며, 7일간 블락 시킨 상태에서 분석되었다.

5. miRNA의 타겟 유전자 예측과 antagomir 생성

miRNA 성숙 서열을 miRBase (http://www.mirbase.org)로부터 얻었다. (도 1)

마우스 유전자 3'-비해독부위(UTR)에 있는 잠재적 miRNA 표적 위치를 찾기위하여, 3가지의 다른 타겟 예측 프로그램인 TargetScan(http://www.targetscan.org), PicTar(http://pictar.mdc-berlin.de/), 및 microT(http://diana.cslab.ece.ntua.gr/microT/)를 사용하였다.

뇌전증 마우스 모델에서 상향 조절되는 miRNA에 대하여, 뇌전증과 관련된 잠재적인 타겟 유전자, 특이 서열 antagomir, 2'-O-메틸화된 안티센스 올리고 뉴클레오타이드가 생성되었다. 효율을 향상시키기 위하여, 일부 antagomir에 포스포로티오에이트 백본(backbone)을 적용하였다.

6. 체외 치료 가능성 연구

Neuro-2a 마우스 신경모세포종 세포를 10% 소 태아 혈청(Invitrogen)을 포함하는 Dulbecco 변형 Eagle 배지에서 배양했다. 시험관 내에서의 miRNA와 antagomir의 효과를 평가하기 위하여, Neuro-2a 세포를 50 또는 100nM의 miRNA 이중가닥(또는 스크램블 된 miRNA 이중가닥;Bioneer) 또는 리포펙타민 2000(Invitrogen)을 사용한 antagomir로 형질 감염시켰다. 웨스턴 블랏팅을 위해, 형질 감염시킨 후 48시간 뒤에 세포 분쇄액을 얻었다.

7. 정상 마우스와 뇌전증 모델 마우스에게 antagomir를 투여

마취시킨 마우스의 머리를 똑바로 세운 자세로 하여 앙와위(supine position)로 두었다. 처리군에 할당된 마우스들에게는 kainate 주사 1주일 전부터 매주 antagomir(24㎕의 0.1% v/v 디에틸피로카르보네이트-처리된 증류수 내 5nmol)를 파이펫을 이용하여 2분마다 각 콧구멍을 바꿔가며, 4㎕씩 비강내로 투여하였다(총 6 분획). 대조군의 마우스들에게도 같은 부피의 비히클을 같은 일정동안 투여했다.

8. 웨스턴 블랏팅

시험관 내 분석을 위하여, Neuro-2a 세포의 파쇄액을 형질감염 시키고, 48시간 후에 수확하였다. 생체 내 분석을 위하여, 마취한 마우스를 단두로 희생시키고, 즉시 뇌를 적출하였다. 해마와 피질을 분리하고, 뇌의 각 부분의 파쇄액으로 웨스턴 블랏팅을 순서대로 진행하였다. 웨스턴 블랏팅은 tuberous sclerosis complex 1 (TSC1, hamartin; Cell Signaling Technology), tuberous sclerosis complex 2 (TSC2, tuberin; Cell Signaling Technology), mTOR (Cell Signaling Technology), phospho-mTOR (Cell Signaling Technology), p70S6 Kinase (Cell Signaling Technology), phospho-p70S6 Kinase (Cell Signaling Technology), S6 ribosomal protein (Cell Signaling Technology), phospho-S6 ribosomal protein (Cell Signaling Technology) 및 -actin (Santa Cruz Biotechnology)에 대한 항체를 사용하여 수행했다. 면역반응 단백질을 인핸스드 화학발광 시약(Pierce chemical)으로 가시화시키고 GW-700 스캐너(Bio-rad)를 사용하여 스캐닝하였다. 각 밴드의 광학밀도는 Image-J 소프트웨어(National Institute of Health, USA)를 사용하여 측정하였으며, β-액틴 밴드에 상대값으로 나타냈다.

9. miR -21, 27, 32의 RT- PCR

Trizol(Invitrogen)을 사용하여 각 마우스의 뇌로부터 총 RNA를 분리하였다. 실시간 PCR(35주기)은 mirVana qRT-PCR miRNA Detection Kit와 miR-21, 27, 32의 프라이머 세트(Life technologies)를 이용하여 수행하였다. 모든 실시간 반응은 ABI PRISM 7000 서열 탐지 시스템(Ambion-Applies Biosystem) 상에서 3 배수로 수행되었다. 상대적 발현은 비교 역치 사이클(comparative threshold cycle)을 사용하여 계산하였고, 내인성 snoRNA 탐지 키트(Ambion-Applied Biosystem)를 사용하여 측정된 snoRNA202의 양에 따라 각 miRNA 농도를 적정화하였다.

10. 데이터 분석 및 통계

단백질의 발현 정도 또는 miR-21, 27, 32의 발현 정도를 비교하기 위하여, 스튜던트의 T-검정을 이용하였다. 통계 분석에 SPSS 21.0(SPSS Inc, Chicago, Ill)을 사용하였고, P-수치는 0.05보다 작은 값을 유의한 것으로 하였다.

< 실시예 1> AM21, 27, 32 투약 후, Neuro -2a 세포에서의 TSC1의 증가 및 mTOR의 감소

Neuro-2a 세포에 AM21, 27, 32를 투약하고, 48시간 뒤의 TSC1과 p-S6의 변화를 도2에 나타내었다.

도 2의 (A)는 AM21, AM27, AM32는 Neuro-2a 세포에 형질 감염되고, TSC1 단백질(hamartin)과 인산화 된 S6 리보솜 단백질의 변화를 웨스턴 블랏팅으로 측정한 것을 나타내며, AM21의 형질 감염 결과, TSC1의 과발현과 mTOR 발현의 하위 시그널인 p-S6의 활성이 하향조절된 것을 알 수 있었다.

도 2의 (B)는 TSC1 단백질과 p-S6 단백질을 50nM 농도에서의 형질 감염을 시킨 후에, 상대적인 광학적 밀도를 측정한 것이며, 가로축은 TSC1과 p-S6이고, 세로축은 상대적인 광학 밀도를 나타낸다.

도 2의 (C)는 TSC1 단백질과 p-S6 단백질을 100nM 농도에서의 형질 감염을 시킨 후에, 상대적인 광학적 밀도를 측정한 것이며, 가로축은 TSC1과 p-S6이고, 세로축은 상대적인 광학 밀도를 나타낸다.

상기 결과로부터, AM21, 27, 32는 TSC1의 발현을 증가시켜, mTOR 발현의 시그널인 p-S6 단백질을 감소시키고, 나아가 뇌전증을 유발하는 mTOR의 발현을 감소시키는 것을 확인할 수 있다.

< 실시예 2> 정상 마우스에서 AM21을 비강 내로 투여한 후, 뇌 내 mTOR의 감소

정상 마우스에 AM21을 투여하고, 6시간 후와 7일 후의 p-mTOR, mTOR, TSC1, p-S6, S6, TSC2의 변화 결과를 도3에 나타내었다.

도 3의 (A)는 AM21을 정상 마우스에게 비강 내로 투여하고, 타겟 단백질에서의 변화를 투여 6시간 후와 7일 후에 측정한 것이다. 대조군과 비교하였을 때, 6시간 후의 결과보다 7일 후의 결과를 통하여 mTOR의 상위 시그널인 p-mTOR가 하향 조절되는 것을 웨스턴 블랏팅을 통해 확인할 수 있다. 또한, 대조군과 비교하였을 때, 6시간 후의 결과보다 7일 후의 결과에서 mTOR의 하위 시그널인 p-S6이 하향 조절되는 것을 확인할 수 있다.

도 3의 (B)에서 가로축은 p-mTOR/mTOR의 비율과 pS6/S6의 비율을 나타내고, 세로축은 상대적인 발현도를 나타낸다. 도3의 (C)에서 가로축은 TSC1과 TSC2이며, 세로축은 상대적인 광학밀도를 나타낸다. 도 3의 (B)와 (C)의 결과는 통계적으로 유의하지 않았더라도, AM21로 처리한 마우스를 7일 후에 희생시켰을 때, 인산화 된 m-TOR(p-mTOR) 단백질과 mTOR의 활성을 나타내는 인산화 된 S6(p-S6) 단백질의 비율이 감소하는 것을 알 수 있다.(7일 후; p-mTOR와 p-S6의 P 수치는 각각 P = 0.200, P = 0.100) 막대 그래프에서 막대와 수직선은 평균±표준편차를 나타낸다.

< 실시예 3> AM21을 주 1회, 12주간 비강내로 투여한 뒤, Kainate 뇌전증 모델의 뇌 내 miR -21의 감소, TSC1의 증가, mTOR의 감소

Kainate 유도 뇌전증 모델에 AM21을 매주 처치한다. Kainate 유도 만성 뇌전증 모델은 kainate(20mg/kg)를 복강 내로 주사하여 생성한다. 처치군(n=3)은 kainate 주사 1주일 전부터 AM21(5nmol)을 비강 내로 매주 투여 받는다. Kainate만 처리된 군(n=3)은 같은 일정 동안 동일한 부피의 비히클을 받는다. 동물들은 kainate 주사 후, 12주째에 희생되었다. 연령대가 일치하는 정상 마우스는 대조군(n=3)으로 사용했다. SE(Status epilepticus)를 유도하기 위하여 복강 내로 kainate(20mg/kg)을 주사했다. kainate만 처리한 군에는 동일한 부피의 비히클을 투여한 반면, antagomir 군에는 매주 AM21(5nmol/주)을 비강 내로 투여했다. 12주 후에, 마우스들은 희생되었고, 해마의 일부분이 실시간 PCR에 사용되었다.

대조군과 kainate만 처리한 군, kainate와 AM-21을 함께 처리한 군에서의 miR-21의 상대적 발현량을 도 4에 나타내었다. 도 4의 가로축은 해마에서 수득한 샘플을 사용한 것을 뜻하며, 세로축은 마우스에서 miR-21의 상대적 발현량을 뜻한다. PCR 결과 miR-21은 kainate만 처리한 군에서 증가하는 경향을 나타내었고, AM21군에서는 적정화되는 경향을 나타내었다. 막대 그래프에서 막대와 수직선은 평균±표준편차를 나타낸다.

SE(Status epilepticus)를 유도하기 위하여 복강 내로 kainate(20mg/kg)을 주사한다. kainate만 처리한 군에는 동일한 부피의 비히클을 투여한 반면, antagomir 군에는 매주 AM21(5nmol/주)을 비강 내로 투여했다. 12주 후에, 마우스들은 희생되었고, 해마의 일부분이 웨스턴 블랏팅에 사용되었다. 정상적인 마우스들은 대조군으로 사용되었다.

마우스 대조군과 kainate만 처리한 군, kainate와 AM21을 함께 처리한 군에서의 p-mTOR, mTOR, TSC1, p-S6, S6, TSC2, p-S6K, S6K의 변화 결과를 도 5에 나타내었다.

도 5의 (A)에서는 AM21을 함께 처리한 군에서 kainate만 처리한 군에서의 p-mTOR의 비율(p-mTOR/mTOR), p-S6의 비율(p-S6/S6)이 하향 조절되는 것을 웨스턴 블랏팅을 통해 확인할 수 있었다.

도 5의 (B)에서 막대 그래프의 가로축은 p-mTOR/mTOR의 비율, p-S6/S6의 비율, TSC1/β-actin의 비율을 나타내고, 세로축은 상대적인 광학 밀도를 나타낸다. 도 5의 (B)에서 mTOR의 활성을 나타내는 인산화 된 S6 단백질의 비율은 통계적으로 유의하지 않았더라도, kainate만 처리한 군에서는 증가하는 경향을 보이지만, AM21을 함께 처리한 군에서는 반대로 감소하는 경향을 보이는 것을 확인할 수 있었다.(P 수치는 각각 P=0.231, P=0.062). TSC1의 발현은 kainate만 처리한 군(P=0.050)에서 감소하는 경향을 보이지만, AM21을 함께 처리한 군(P=0.018)에서는 반대로 증가하는 경향을 보이는 것을 확인할 수 있었다.

도 5의 (C)에서 막대 그래프의 가로축은 TSC2/β-actin의 비율, p-S6K/S6K의 비율을 나타내며, 세로축은 상대적인 광학 밀도를 나타낸다. 도 5의 (c)에서 TSC2 단백질 및 p-S6K의 비율은 크게 변화하지 않은 것을 확인할 수 있었다. 막대 그래프에서 막대와 수직선은 평균±표준편차를 나타낸다.

< 실시예 4> Pilocarpine 뇌전증 모델에서 AM32를 지속적으로 주1회 지속 투여하였을 경우, 현저한 발작 빈도의 감소

5개의 개체군에서 Pilocarpine 유도 만성 뇌전증 모델에서 투약 전 40일부터 투약 후 74일까지의 비디오 뇌파 모니터링을 실시한다.

Pilocarpine 유도 만성 뇌전증 모델에서 투약 전 40일, 투약 후 74일까지 비디오 뇌파 모니터링을 시행하였다. AM32의 투약은 주 1회, 5nmol/회로 매주 반복하였다. 상기 결과로부터 AM32를 지속적으로 투여한 경우, 발작 빈도가 5개의 개체군에서 모두 감소하는 것을 확인할 수 있었다.

도 6은 마우스 Pilocarpine 유도 만성 뇌전증 모델에서 5개의 개체군에 AM32를 지속적으로 투여한 경우, 투약 전과 후의 발작 빈도의 변화를 막대 그래프로 나타낸 것이다. 막대 그래프의 가로축은 투약 전 40일, 투약 후 40일, 투약 후 58일, 투약 후 74일을 나타내며, 세로축은 발작의 빈도를 나타낸다.

도 7은 만성 SRS 모델에서 AM32를 지속적으로 투여한 경우, 투약 전과 후의 발작 빈도의 변화를 막대 그래프로 나타낸 것이다. 막대 그래프의 가로축은 투약 전 40일, 투약 후 40일, 투약 후 58일, 투약 후 74일을 나타내며, 세로축은 발작 빈도의 개체별 평균값을 나타낸다.

도 6과 도 7에서 알 수 있듯이, Pilocarpine 유도 만성 뇌전증 모델과 만성 SRS 모델에서 AM32를 지속적으로 투여한 경우, 투약 전 40일부터 투약 후 74일까지 발작의 빈도가 감소하는 것을 확인할 수 있다.

또한, 만성 SRS 모델에서 AM32.1을 비강 내로 매주 투약한 결과, 발작 빈도가 2.35(/일)에서 0.62(/일)까지 약 74% 정도 감소하는 것을 확인할 수 있다.

<110> Advanced NT <120> The pharmaceutical composition for the prophylaxis or treatment of epilepsy or seizure-related disease targeting miRNA to regulate the expression of TSC1 and mTOR protein <130> 01-001 <160> 3 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 22 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 1 aguuguaguc agacuauucg au 22 <210> 2 <211> 21 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 2 cgccuugaau cggugacacu u 21 <210> 3 <211> 22 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 3 acguugaauc auuacacguu au 22

Claims (14)

1. miR-21, miR-27 또는 miR-32의 활성을 억제할 수 있는 물질을 유효성분으로 포함하는 것을 특징으로 하는 뇌전증 치료 또는 예방용 약학 조성물.
2. 제 1항에 있어서,
   상기 miR-21, miR-27 또는 miR-32의 활성을 억제할 수 있는 물질은 TSC1(tuberous sclerosis 1)의 발현을 항진시킬 수 있는 물질인 뇌전증 치료 또는 예방용 약학 조성물.
3. 제 1항에 있어서,
   상기 miR-21, miR-27 또는 miR-32의 활성을 억제할 수 있는 물질은 mTOR(mammalian target of rapamycin)의 발현을 억제시킬 수 있는 물질인 뇌전증 치료 또는 예방용 약학 조성물.
4. 제 1항에 있어서,
   상기 miR-21의 활성을 억제할 수 있는 물질은 상기 miR-21의 서열번호 1의 뉴클레오타이드 서열의 전부 또는 일부에 결합할 수 있는 핵산 분자인, 뇌전증 치료 또는 예방용 약학 조성물.
5. 제 1항에 있어서,
   상기 miR-27의 활성을 억제할 수 있는 물질은 상기 miR-27의 서열번호 2의 뉴클레오타이드 서열의 전부 또는 일부에 결합할 수 있는 핵산 분자인, 뇌전증 치료 또는 예방용 약학 조성물.
6. 제 1항에 있어서,
   상기 miR-32의 활성을 억제할 수 있는 물질은 상기 miR-32의 서열번호 3의 뉴클레오타이드 서열의 전부 또는 일부에 결합할 수 있는 핵산 분자인, 뇌전증 치료 또는 예방용 약학 조성물.
7. 제1항에 있어서,
   상기 miR-21, miR-27 또는 miR-32의 활성을 억제할 수 있는 물질은 뇌전증 발작 억제 효과를 갖는 뇌전증 치료 또는 예방용 약학 조성물.
8. 제1항에 있어서,
   상기 조성물은 질환에 따라 또는 성분에 따라 용액, 현탄액, 에멀젼, 리포좀 제형, 정제, 캡슐, 젤, 시럽 또는 좌제 중 어느 한 가지로 제형화 할 수 있는 뇌전증 치료 또는 예방용 약학 조성물.
9. 제1항에 있어서,
   상기 조성물은 비강내 투여, 정맥내 투여, 흡입 투여, 경구 투여, 피하 주사 또는 뇌척수강내 주사용 제형을 가지는, 뇌전증 치료 또는 예방용 약학 조성물.
10. 제4항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 핵산 분자는 RNA, DNA, antagomir, 안티센스 분자, siRNA, shRNA, 2'-O-변형 올리고뉴클레오타이드, 포스포로티오에이트-백본 디옥시리보뉴클레오타이드, 포스포로티오에이트-백본 리보뉴클레오타이드, 디코이 올리고뉴클레오타이드, PNA(peptide nucleic acid) 올리고뉴클레오타이드 또는 LNA(locked nucleic acid) 올리고뉴클레오타이드인, 뇌전증 치료 또는 예방용 약학 조성물.
11. 삭제
12. miR-21, miR-27 또는 miR-32를 시험물질과 접촉시키는 단계;
    상기 시험물질과 접촉된 miR-21, miR-27 또는 miR-32의 활성을 결정하는 단계; 및
    상기 시험물질과 접촉되지 않은 대조군의 miR-21, miR-27 또는 miR-32의 활성을 상기 접촉된 miR-21, miR-27 또는 miR-32의 활성, TSC1의 발현 및 mTOR의 발현과 비교하여,
    상기 접촉된 miR-21, miR-27 또는 miR-32의 활성은 감소하며, 상기 TSC1의 발현은 증가하고, 상기 mTOR의 발현은 감소하는 경우 이를 후보물질로 선별하는 단계;를 포함하는, 뇌전증 치료 또는 예방용 물질의 스크리닝 방법.
13. 제12항에 있어서,
    상기 miR-21, miR-27 또는 miR-32는 이를 발현하는 세포의 형태로 제공되며, 상기 활성은 상기 miR-21, miR-27 또는 miR-32의 발현 분석으로 결정되는 것인 스크리닝 방법.
14. 삭제

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