TW201641691A - Ｔａｕ反義寡聚物及其用途 - Google Patents

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理查Ｅ 歐森
安琪拉Ｍ 卡可瑟
彼得 哈吉朵恩
安賈 荷哈特 霍格
瑪莉安 萊貝克 詹森
尼爾斯 費斯克 尼爾森
東 李
傑佛瑞Ｍ 布朗
史堤芬Ｅ 瑪瑟
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必治妥美雅史谷比公司
羅氏創新中心哥本哈根有限公司
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Abstract

本發明係關於寡聚物化合物(寡聚物)，其靶向細胞中之Tau mRNA，導致Tau蛋白之表現減少。Tau蛋白表現之減少對某些醫學病症(例如神經病症)之治療有益。

Description

TAU反義寡聚物及其用途 先前申請之申請案的參考
本申請案係非臨時申請案，主張2015年2月4日申請之美國臨時申請案第62/112,058號、2015年5月4日申請之美國臨時申請案第62/156,684號、2015年10月6日申請之美國臨時申請案第62/237,922號、2015年10月8日申請之美國臨時申請案第62/238,941號、2016年1月15日申請之美國臨時申請案第62/279,612號、2016年1月15日申請之美國臨時申請案第62/279,614號及2016年1月15日申請之美國臨時申請案第62/279,610號之權益，所有該等案件皆係全文以引用方式併入本文中。
經由EFS-WEB以電子形式所提交序列表之參考
在此申請案中提交之電子提交序列表(名稱：_______，大小：_____位元組；及創建日期：________)之內容係全文以引用方式併入本文中。
本發明係關於靶向細胞中的微管相關蛋白tau(MAPT )轉錄物，導致MAPT mRNA及/或Tau蛋白之表現降低之寡聚化合物(寡聚物)。MAPT mRNA及/或Tau蛋白表現之降低對多種醫學病症有益，例如tau蛋白病變、唐氏症候群(Down syndrome)、抑鬱症、癲癇發作及運動障礙。
Tau蛋白係與微管蛋白相互作用以穩定微管且促進裝配成微管之微管相關蛋白(MAP)。微管係細胞骨架之關鍵結構組份且參與多種細胞過程，包括有絲分裂、細胞質分裂及囊泡運輸。Tau蛋白存於多種細胞及組織類型中，但與非神經元細胞相比在神經元中尤其豐富。
由於Tau在穩定微管中之作用，改變Tau表現程度及/或功能可中斷關鍵細胞過程，業內認為此促進多種神經退化病症，例如tau蛋白病變。舉例而言，已發現，阿茲海默氏病(Alzheimer's disease，AD)中之神經原纖維包裹體含有高度磷酸化Tau蛋白之聚集體。
另外，異常Tau表現及/或功能與其他腦部疾病(亦包括於病理性及遺傳性定義之tau蛋白病變之家族中)相關，包括額顳葉失智症(FTD)、進行性核上性麻痺(PSP)、皮質基底核退化症(CBD)、皮質基底節退化症、拳擊手型失智症、額顳葉失智症伴隨與染色體17相關之帕金森氏症(parkinsonism)(FTDP-17)、李替克-波迪哥病(Lytico-Bodig disease)、纏結為主之失智症(tangle-predominant dementia)、神經節神經膠質瘤、神經節細胞瘤、腦膜血管瘤病、亞急性硬化性泛腦炎、鉛毒腦病、結節性硬化症、哈勒沃登-施帕茨病(Hallervorden-Spatz disease)、匹克氏病(Pick's disease)、嗜銀顆粒病、皮質基底核退化症或額顳葉退化及其他。異常Tau表現及/或功能亦可在其他疾病中發揮作用，例如唐氏症候群、癲癇發作(例如，癲癇)、網絡功能障礙(例如，抑鬱症)及運動障礙(例如，帕金森氏病(Parkinson's disease))。
諸如AD等Tau相關病症係老人失智症之最常見病因，且非常需要用於治療神經退化疾病(包括tau蛋白病變、癲癇發作及運動障礙)之穩定有效藥劑。
在人類治療學發展中已研究可降低蛋白質表現之反義分子。靶向前mRNA或mRNA係反義分子可降低RNA含量，由此降低蛋白質含量。反義分子可經由各種作用機制作用於靶序列：經由RNaseH降解 mRNA、核糖體亞單位結合之立體阻礙、mRNA之改變成熟、剪接活化、5'-帽形成抑制、阻止轉譯及/或雙鏈RNase活化。然而，在一些情形中，已知靶向多聚腺苷酸化位點附近區域之反義分子可提高mRNA穩定性。參見Vickers等人，NAR(2001)29(6)1293-1299。
本發明提供長度為10至50個核苷酸之寡聚物，其包含與微管相關蛋白tau(MAPT)轉錄物內之核酸序列雜交之鄰接核苷酸序列，其中該核酸序列對應於SEQ ID NO：1之核苷酸134,947-138,940。
本發明亦提供長度為10至50個核苷酸之寡聚物，其包含與微管相關蛋白tau(MAPT)轉錄物內之核酸序列雜交之鄰接核苷酸序列，其中該核酸序列對應於SEQ ID NO：1之核苷酸135,050-138,940。
本發明另外提供長度為10至50個核苷酸之寡聚物，其包含與微管相關蛋白tau(MAPT)轉錄物內之核酸序列雜交之鄰接核苷酸序列，其中該核酸序列對應於SEQ ID NO：1之核苷酸72,802-73,072。
本發明亦提供長度為10至50個核苷酸之寡聚物，其包含與微管相關蛋白tau(MAPT)轉錄物內之核酸序列雜交之鄰接核苷酸序列，其中該寡聚物具有至少一種選自以下之性質：(1)與尚未暴露至該寡聚物之對照細胞相比，降低細胞中Tau mRNA之表現；及(2)與尚未暴露至該寡聚物之對照細胞相比，降低細胞中Tau蛋白之表現。
本發明亦提供長度為10至50個核苷酸之寡聚物，其包含與微管相關蛋白tau(MAPT)轉錄物內之核酸序列雜交之鄰接核苷酸序列，其中該寡聚物之活體內耐受性小於或等於4之總分，其中該總分係5個類別之單元評分之和，該5個類別為1)過動；2)活動及喚起減少；3)運動功能障礙及/或共濟失調；4)異常姿勢及呼吸；及5)震顫及/或驚厥，且其中每一類別之單元評分係按0-4之量表來量測。
本發明亦提供偶聯物，其包含長度為10至50個核苷酸之寡聚 物，該寡聚物包含與微管相關蛋白tau(MAPT)轉錄物內之核酸序列雜交之鄰接核苷酸序列，其中該寡聚物共價連接至至少一個非核苷酸或非多核苷酸部分。
本發明亦提供醫藥組合物，其包含長度為10至50個核苷酸且包含與微管相關蛋白tau(MAPT)轉錄物內之核酸序列雜交之鄰接核苷酸序列之寡聚物及醫藥上可接受之載劑。
本發明亦提供套組，其包含長度為10至50個核苷酸且包含與微管相關蛋白tau(MAPT)轉錄物內之核酸序列雜交之鄰接核苷酸序列之寡聚物及使用說明。
本發明另外提供抑制或降低細胞中之Tau蛋白表現之方法，該方法包含將長度為10至50個核苷酸且包含與微管相關蛋白tau(MAPT)轉錄物內之核酸序列雜交之鄰接核苷酸序列之寡聚物投與表現Tau蛋白之細胞，其中該細胞中之該Tau蛋白表現在該投與後被抑制或降低。
本發明另外提供治療有需要之個體之癲癇發作之方法，該方法包含將長度為10至50個核苷酸且包含與微管相關蛋白tau(MAPT)轉錄物內之核酸序列雜交之鄰接核苷酸序列之寡聚物投與該個體中表現Tau蛋白之細胞。
本發明另外提供治療有需要之個體之癲癇發作之方法，該方法包含將長度為10至50個核苷酸且包含與微管相關蛋白tau(MAPT)轉錄物內之核酸序列雜交之鄰接核苷酸序列之寡聚物投與該個體中表現Tau蛋白之細胞。
本發明另外提供長度為10至50個核苷酸且包含與微管相關蛋白tau(MAPT)轉錄物內之核酸序列雜交之鄰接核苷酸序列之寡聚物之用途，其用於製造用於治療以下疾病之藥劑：神經病症，例如tau蛋白病變、伴隨tau蛋白病變之神經退化疾病(涉及Tau蛋白在腦中之累積之神經退化疾病)、伴隨tau蛋白病變之癲癇性病症(涉及Tau蛋白在腦 中之累積之癲癇性病症)、無tau蛋白病變之癲癇性病症(不涉及Tau蛋白在腦中之累積之癲癇性病症)、無tau蛋白病變之特發性成人癲癇性病症(不涉及Tau蛋白在腦中之累積之特發性成人癲癇性病症)、癲癇發作或其任何組合。
實施例
E1.長度為10至50個核苷酸之寡聚物，其包含與微管相關蛋白tau(MAPT)轉錄物內之核酸序列雜交之鄰接核苷酸序列，其中該核酸序列對應於SEQ ID NO：1之核苷酸134,947-138,940。
E2.長度為10至50個核苷酸之寡聚物，其包含與微管相關蛋白tau(MAPT)轉錄物內之核酸序列雜交之鄰接核苷酸序列，其中該核酸序列對應於SEQ ID NO：1之核苷酸135,050-138,940。
E3.長度為10至50個核苷酸之寡聚物，其包含與微管相關蛋白tau(MAPT)轉錄物內之核酸序列雜交之鄰接核苷酸序列，其中該核酸序列對應於SEQ ID NO：1之核苷酸72,802-73,072。
E4.如實施例1或3中任一項之寡聚物，其中該核苷酸序列包含至少一個核苷酸類似物。
E5.如實施例1至4中任一項之寡聚物，其係間隔體(gapmer)、阻斷體(blockmer)、混合體(mixmer)、頭聚物(headmer)、尾聚物(tailmer)或總聚物(totalmer)。
E6.如實施例1至5中任一項之寡聚物，其係間隔體。
E7.如實施例6之寡聚物，其具有式5’-A-B-C-3’(II)，其中(i)B係7至23個DNA單元之鄰接序列；(ii)A係1至10個核苷酸之第一翼序列，其中該第一翼序列包含一或多個核苷酸類似物及視情況一或多個DNA單元且其中該等核苷酸類似物中之至少一者位於A之5’端；且(iii)C係1至10個核苷酸之第二翼序列，其中該第二翼序列包含 一或多個核苷酸類似物及視情況一或多個DNA單元且其中該等核苷酸類似物中之至少一者位於C之3’端。
E8.如實施例7之寡聚物，其中A具有式LmDnLoDpLq(III)且C具有式Lm’Dn’Lo’Dp’Lq’(IV)且其中L係核苷酸類似物；D係DNA單元；m及q’係1至6個單元；n、p、n’及p’係0至2個單元；且o、q、m’及o’係0至5個單元。
E9.如實施例7或8之寡聚物，其中該第一翼序列包含選自以下之核苷酸類似物與DNA單元之組合：(i)1-9個核苷酸類似物及1個DNA單元；(ii)1-8個核苷酸類似物及1-2個DNA單元；(iii)1-7個核苷酸類似物及1-3個DNA單元；(iv)1-6個核苷酸類似物及1-4個DNA單元；(v)1-5個核苷酸類似物及1-5個DNA單元；(vi)1-4個核苷酸類似物及1-6個DNA單元；(vii)1-3個核苷酸類似物及1-7個DNA單元；(viii)1-2個核苷酸類似物及1-8個DNA單元；及(ix)1個核苷酸類似物及1-9個DNA單元。
E10.如實施例7至9中任一項之寡聚物，其中該第二翼序列包含選自以下之核苷酸類似物與DNA單元之組合：(i)1-9個核苷酸類似物及1個DNA單元；(ii)1-8個核苷酸類似物及1-2個DNA單元；(iii)1-7個核苷酸類似物及1-3個DNA單元；(iv)1-6個核苷酸類似物及1-4個DNA單元；(v)1-5個核苷酸類似物及1-5個DNA單元；(vi)1-4個核苷酸類似物及1-6個DNA單元；(vii)1-3個核苷酸類似物及1-7個DNA單元；(viii)1-2個核苷酸類似物及1-8個DNA單元；及(ix)1個核苷酸類似物及1-9個DNA單元。
E11.如實施例8至10中任一項之寡聚物，其中A選自L、LL、 LDL、LLL、LLLL、LLDL、LDLL、LDDL、LLDD、LLLLL、LLLDL、LLDLL、LDLLL、LLDDL、LDDLL、LLDLD、LDLLD、LDLDL、LDDDL、LLLLLL、LLLLDL、LLLDLL、LLDLLL、LDLLLL、LLLDDL、LLDLDL、LLDDLL、LDDLLL、LDLLDL、LDLDLL、LDDDLL、LLDDDL及LDLDLD，且C選自L、LL、LDL、LLL、LLLL、LLDL、LDLL、LDDL、LLDD、LLLLL、LLLDL、LLDLL、LDLLL、LLDDL、LDDLL、LLDLD、LDLLD、LDLDL、LDDDL、LLLLLL、LLLLDL、LLLDLL、LLDLLL、LDLLLL、LLLDDL、LLDLDL、LLDDLL、LDDLLL、LDLLDL、LDLDLL、LDDDLL、LLDDDL及LDLDLD。
E12.如實施例1至11中任一項之寡聚物，其包含至少2個、至少3個、至少4個、至少5個、至少6個、至少7個、至少8個、至少9個或至少10個核苷酸類似物。
E13.如實施例1至12中任一項之寡聚物，其中該或該等核苷酸類似物選自鎖核酸(LNA)；2'-O-烷基-RNA；2'-胺基-DNA；2'-氟-DNA；阿拉伯糖核酸(ANA)；2'-氟-ANA、己糖醇核酸(HNA)、嵌入核酸(INA)、約束之乙基核苷(constrained ethyl nucleoside，cEt)、2'-O-甲基核酸(2'-OMe)、2'-O-甲氧基乙基核酸(2'-MOE)及其任何組合。
E14.如實施例1至13中任一項之寡聚物，其中該或該等核苷酸類似物包含二環糖。
E15.如實施例14之寡聚物，其中該二環糖包含cEt、2',4'-約束2' -O-甲氧基乙基(cMOE)、LNA、α-LNA、β-LNA、2'-O,4'-C-伸乙基-橋接核酸(ENA)、胺基-LNA、氧基-LNA或硫代-LNA。
E16.如實施例1至15中任一項之寡聚物，其中該或該等核苷酸類似物包含LNA。
E17.如實施例16之寡聚物，其包含在寡聚物5'部分上之3至5個 LNA及在寡聚物3'部分上之3至5個LNA。
E18，如實施例1及4-17中任一項之寡聚物，其中該核酸序列對應於SEQ ID NO：1之核苷酸134,947-138,924。
E19.如實施例1至18中任一項之寡聚物，其中MAPT 轉錄物包含SEQ ID NO：1。
E20.如實施例19之寡聚物，其中該核苷酸序列與以下序列內之核酸序列雜交：SEQ ID NO：1之核苷酸135,700-138,940；136,000-138,940；136,620-138,940；136,860-138,940；137,060-138,940；137,300-138,940；137,830-138,940；138,030-138,940；138,350-138,940；134,821-135,020；135,700-135,820；136,000-136,110；136,620-136,760；136,860-136,960；137,060-137,110；137,300-137,400；137,830-137,900；138,030-138,140；138,350-138,450；或138,860-138,940。
E21.如實施例19之寡聚物，其中該核苷酸序列與選自SEQ ID NO：1之核苷酸134,947-138,940之核酸序列之補體內之區域具有至少約80%、至少約90%、至少約95%、至少約96%、至少約97%、至少約98%、至少約99%或100%序列一致性。
E22.如實施例21之寡聚物，其中該核苷酸序列與以下序列之補體內之區域具有至少約80%、至少約90%、至少約95%、至少約96%、至少約97%、至少約98%、至少約99%或100%序列一致性：SEQ ID NO：1之核苷酸135,700-138,940；136,000-138,940；136,620-138,940；136,860-138,940；137,060-138,940；137,300-138,940；137,830-138,940；138,030-138,940；138,350-138,940；134,821-135,020；135,700-135,820；136,000-136,110；136,620-136,760；136,860-136,960；137,060-137,110；137,300-137,400；137,830-137,900；138,030-138,140；138,350-138,450；或138,860-138,940。
E23.如實施例3至17中任一項之寡聚物，其中該核酸序列對應於SEQ ID NO：1之核苷酸72,802-73,072；72,812-73,062；72,822-73,052；72,832-73,042；72,842-73,032；72,852-73,022；72,862-73,012；72,872-73,002；72,882-72,992；72,892-72,982；或72,902-72,972。
E24.如實施例22之寡聚物，其中該核苷酸序列與以下序列內之核酸序列雜交：SEQ ID NO：1之核苷酸72,802-73,072；72,812-73,062；72,822-73,052；72,832-73,042；72,842-73,032；72,852-73,022；72,862-73,012；72,872-73,002；72,882-72,992；72,892-72,982；或72,902-72,972。
E25.如實施例23之寡聚物，其中該核苷酸序列與以下序列之補體內之區域具有至少約80%、至少約90%、至少約95%、至少約96%、至少約97%、至少約98%、至少約99%或100%序列一致性：SEQ ID NO：1之核苷酸72,862-73,012；72,872-73,012；72,882-73,012；72,892-73,012；72,902-73,012；72,862-73,002；72,872-73,002；72,882-73,002；72,892-73,002；72,902-73,002；72,862-72,992；72,872-72,992；72,882-72,992；72,892-72,992；72,902-72,992；72,862-72,982；72,872-72,982；72,882-72,982；72,892-72,982；72,902-72,982；72,862-72,972；72,872-72,972；72,882-72,972；72,892-72,972；或72,902-72,972。
E26.如實施例24之寡聚物，其中該核苷酸序列與以下序列之補體內之區域具有至少約80%、至少約90%、至少約95%、至少約96%、至少約97%、至少約98%、至少約99%或100%序列一致性：SEQ ID NO：1之核苷酸72,862-73,012；72,872-73,012；72,882-73,012；72,892-73,012；72,902-73,012；72,862-73,002；72,872-73,002；72,882-73,002；72,892-73,002；72,902-73,002；72,862- 72,992；72,872-72,992；72,882-72,992；72,892-72,992；72,902-72,992；72,862-72,982；72,872-72,982；72,882-72,982；72,892-72,982；72,902-72,982；72,862-72,972；72,872-72,972；72,882-72,972；72,892-72,972；或72,902-72,972。
E27.如實施例24之寡聚物，其中該核苷酸序列與以下序列之補體內之區域具有至少約80%、至少約90%、至少約95%、至少約96%、至少約97%、至少約98%、至少約99%或100%序列一致性：SEQ ID NO：1之核苷酸72,947-72,960；72,946-72,961；72,907-72,922；72,948-72,963；72,950-72,963；72,945-72,960；72,950-72,965；72,944-72,959；72,947-72,962；72,952-72,965；72,946-72,959；72,949-72,964；72,951-72,964；72,933-72,948；72,934-72,949；72,935-72,950；72,932-72,951；72,933-72,952；72,934-72,953；72,945-72,964；72,944-72,963；72,948-72,967；72,946-72,965；72,935-72,951；72,936-72,953；72,933-72,934；72,933-72,954；72,933-72,950；72,935-72,954；72,934-72,951；72,934-72,950；72,933-72,949；或72,935-72,952。
E28.如實施例1至27中任一項之寡聚物，其中該核苷酸序列不包含與該區域之失配或包含不多於1個或2個失配。
E29.如實施例1、2、4-22及28中任一項之寡聚物，其中該核苷酸序列與SEQ ID NO：1之核苷酸136,000-136,110或138,860-138,940之補體內之區域具有至少約80%、至少約90%、至少約95%、至少約96%、至少約97%、至少約98%、至少約99%或100%序列一致性。
E30.如實施例29之寡聚物，其中該核苷酸序列與SEQ ID NO：1之核苷酸136,053-136,068或138,884-138,908之補體內之區域具有至少約80%、至少約90%、至少約95%、至少約96%、至少約97%、至少約98%、至少約99%或100%序列一致性。
E31.如實施例1、2、4-22及28中任一項之寡聚物，其中該核苷酸序列包含與選自以下之核酸序列具有至少約80%、至少約90%、至少約95%、至少約96%、至少約97%、至少約98%、至少約99%或100%序列一致性之核苷酸序列：SEQ ID NO：4至SEQ ID NO：803。
E32.如實施例1、2、4-22及28中任一項之寡聚物，其中該核苷酸序列與選自圖2、3、6及7中序列之核酸序列具有至少約80%、至少約90%、至少約95%、至少約96%、至少約97%、至少約98%、至少約99%或100%序列一致性，其中大寫字母係LNA且小寫字母係DNA。
E33.如實施例1至17中任一項之寡聚物，其中該核苷酸序列與選自以下之核酸序列具有至少約80%、至少約90%、至少約95%、至少約96%、至少約97%、至少約98%、至少約99%或100%序列一致性：ctttatttccaaattcactt(SEQ ID NO：676)；actttatttccaaattcact(SEQ ID NO：715)；tttatttccaaattcacttt(SEQ ID NO：644)；ttatttccaaattcactttt(SEQ ID NO：799)；atttccaaattcacttttac(SEQ ID NO：466)；atttccaaattcactttta(SEQ ID NO：559)；actttatttccaaattcactt(SEQ ID NO：680)；或atttccaaattcactt(SEQ ID NO：686)。
E34.如實施例32之寡聚物，其中該核苷酸序列與選自以下之核酸序列具有至少約80%、至少約90%、至少約95%、至少約96%、至少約97%、至少約98%、至少約99%或100%序列一致性：tatttccaaattcactttta(SEQ ID NO：526)；aataactttatttcca(SEQ ID NO：773)；agtaataactttatt(SEQ ID NO：782)；tttccaaattcactt(SEQ ID NO：684)；agagtaataactttat(SEQ ID NO：784)；agtaataactttattt(SEQ ID NO：780)；agagtaataacttta(SEQ ID NO：786)；ttaatcagagtaataa(SEQ ID NO：795)；tttaatcagagtaat(SEQ ID NO：798)；aatcagagtaataac(SEQ ID NO：794)；tttaatcagagtaata(SEQ ID NO：797)；taatcagagtaataa(SEQ ID NO：796)；ctttatttccaaattcact(SEQ ID NO：713)；及 ctttatttccaaattcac(SEQ ID NO：739)。
E35.如實施例32之寡聚物，其中該核苷酸序列與選自以下之核酸序列具有至少約80%、至少約90%、至少約95%、至少約96%、至少約97%、至少約98%、至少約99%或100%序列一致性：atttccaaattcacttttac(SEQ ID NO：466至490、513至525、910至918、928、929或932至935)；tatttccaaattcactttta(SEQ ID NO：526至550或573至585)；ttatttccaaattcactttt(SEQ ID NO：586-606、629至642,799至801)；tttatttccaaattcacttt(SEQ ID NO：644至647、657至658、919至921或930)；ctttatttccaaattcactt(SEQ ID NO：、676至679、681至683、685或687至697)；actttatttccaaattcactt(SEQ ID NO：680)；tttccaaattcactt(SEQ ID NO：684)；atttccaaattcactt(SEQ ID NO：686、705、712、936或937、922、924或931)；actttatttccaaattcact(SEQ ID NO：715至717)；ctttatttccaaattcact(SEQ ID NO：713、714或718至731,)；ctttatttccaaattcac(SEQ ID NO：739至748)；aataactttatttcca(SEQ ID NO：773或774)；agtaataactttattt(SEQ ID NO：780)；agtaataactttatt(SEQ ID NO：782)；agagtaataactttat(SEQ ID NO：784)；agagtaataacttta(SEQ ID NO：786)；aatcagagtaataac(SEQ ID NO：794)；ttaatcagagtaataa(SEQ ID NO：795)；taatcagagtaataa(SEQ ID NO：796)；tttaatcagagtaata(SEQ ID NO：797)；及tttaatcagagtaat(SEQ ID NO：798)。
E36.如實施例3至17中任一項之寡聚物，其中該核苷酸序列與選自圖16A及16B中序列之核酸序列具有至少約80%、至少約90%、至少約95%、至少約96%、至少約97%、至少約98%、至少約99%或100%序列一致性，其中大寫字母係LNA且小寫字母係DNA。
E37.如實施例3至17中任一項之寡聚物，其中該核苷酸序列與選自以下之核酸序列具有至少約80%、至少約90%、至少約95%、至少 約96%、至少約97%、至少約98%、至少約99%或100%序列一致性：SEQ ID NO：804至SEQ ID NO：892。
E38.如實施例1至37中任一項之寡聚物，其係單鏈。
E39.如實施例1至38中任一項之寡聚物，其具有至少一種選自以下之性質：(1)與尚未暴露至該寡聚物之對照細胞相比，降低細胞中Tau mRNA之表現；及(2)與尚未暴露至該寡聚物之對照細胞相比，降低細胞中Tau蛋白之表現。
E40.如實施例1至39中任一項之寡聚物，其中該寡聚物之活體內耐受性小於或等於4之總分，其中該總分係5個類別之單元評分之和，該5個類別為1)過動；2)活動及喚起減少；3)運動功能障礙及/或共濟失調；4)異常姿勢及呼吸；及5)震顫及/或驚厥，且其中每一類別之單元評分係按0-4之量表來量測。
E41.如實施例40之寡聚物，其中活體內耐受性小於或等於3之總分、2之總分、1之總分或0之總分。
E42.如實施例1至41中任一項之寡聚物，其中與該寡聚物接觸之神經元細胞之鈣振盪係未與該寡聚物接觸之神經元細胞中之振盪之大於或等於95%、大於或等於90%、大於或等於85%、大於或等於80%、大於或等於75%或大於或等於70%。
E43.如實施例1至42中任一項之寡聚物，與未暴露至該寡聚物之細胞相比，其將細胞中Tau mRNA之表現降低至少約20%、至少約30%、至少約40%、至少約50%、至少約60%、至少約70%、至少約80%、至少約90%或約100%。
E44.如實施例1至43中任一項之寡聚物，與未暴露至該寡聚物之細胞相比，其將細胞中Tau蛋白之表現降低至少約60%、至少約70%、至少約80%、至少約90%或至少約95%。
E45.如實施例1至44中任一項之寡聚物，其包含核苷酸A、T、C 及G及核苷酸A、T、C及G之至少一個類似物，且序列評分大於或等於0.2，其中該序列評分係藉由下式I計算：(I)總核苷酸長度。
E46.如實施例1至45中任一項之寡聚物，其具有10至24個核苷酸之長度或14至21個核苷酸之長度。
E47.如實施例1至46中任一項之寡聚物，其具有14、15、16、17、20或21個核苷酸之長度。
E48.如實施例1、2、4-22及28之寡聚物，其包含選自圖2、3、6及7之核苷酸序列，基本上由其組成，或由其組成，其中大寫字母係LNA且小寫字母係DNA。
E49.如實施例48之寡聚物，其包含以下序列，基本上由其組成，或由其組成：ATTtCcaaattcacTtTtAC(SEQ ID NO：487)；CTTTAtttccaaattCACTT(SEQ ID NO：677)；ACTTTatttccaaattCACT(SEQ ID NO：715)；TTTATttccaaattcACTTT(SEQ ID NO：644)；TTtATttccaaattcACtTT(SEQ ID NO：645)；TTaTTtccaaattcaCTtTT(SEQ ID NO：593)；ATTTccaaattcactTTTAC(SEQ ID NO：474)；ACTTTatttccaaattCACTT(SEQ ID NO：680)；ATTtccaaattcaCTT(SEQ ID NO：686)；TATTTccaaattcactTTTA(SEQ ID NO：532)；AATaactttatttCCA(SEQ ID NO：773)；AGTaataactttATT(SEQ ID NO：782)；TTTccaaattcaCTT(SEQ ID NO：684)；AGAgtaataacttTAT(SEQ ID NO：784)；AGTaataactttaTTT(SEQ ID NO：780)；AGAgtaataactTTA(SEQ ID NO：786)；TTAatcagagtaaTAA(SEQ ID NO：795)；TTTaatcagagtAAT(SEQ ID NO：798)；AATcagagtaatAAC(SEQ ID NO：794)；TTTaatcagagtaATA(SEQ ID NO：797)；TAAtcagagtaaTAA(SEQ ID NO：796)；CTTtatttccaaatTCACT(SEQ ID NO：720)；ATtTCcaaattcactTTtAC(SEQ ID NO：472)；AtTTCcaaattcactTTtAC(SEQ ID NO：473)；ATTtCcaaattcacTtTtAC(SEQ ID NO：487)；或CTTtatttccaaatTcAC(SEQ ID NO：745)，其中大寫字母係LNA且小寫字母係DNA。
E50.如實施例48之寡聚物，其包含以下序列，基本上由其組成，或由其組成：ATtTCcaaattcactTTtAC(SEQ ID NO：472)；AtTTCcaaattcactTTtAC(SEQ ID NO：473)；ATTTccaaattcactTTTAC(SEQ ID NO：474)；ATTTCcaaattcacttTTAC(SEQ ID NO：482)；ATTtCcaaattcacTtTtAC(SEQ ID NO：487)；ATtTCcaaattcactTTtAC(SEQ ID NO：524),AtTTCcaaattcactTTtAC(SEQ ID NO：493),TATTTccaaattcactTTTA(SEQ ID NO：532)；TTaTTtccaaattcaCTtTT(SEQ ID NO：593)；TTTATttccaaattcACTTT(SEQ ID NO：644)；TTtATttccaaattcACtTT(SEQ ID NO：645)；TTTATttccaaattcaCTTT(SEQ ID NO：646),TTTAtttccaaattcACTTT(SEQ ID NO：647)；CTTTAtttccaaattCACTT(SEQ ID NO：677)；CTTTAtttccaaattcACTT(SEQ ID NO：679)；ACTTTatttccaaattCACTT(SEQ ID NO：680)；CTTTatttccaaattCACTT(SEQ ID NO：681)；CTtTAtttccaaattCAcTT(SEQ ID NO：683)；TTTccaaattcaCTT(SEQ ID NO：684)；CtTTAtttccaaattCAcTT(SEQ ID NO：685)；ATTtccaaattcaCTT(SEQ ID NO：686)；CTTtatttccaaatTcACT(SEQ ID NO：714)；ACTTTatttccaaattCACT(SEQ ID NO：715)；ACTTtatttccaaatTCACT(SEQ ID NO：716)；CTTtatttccaaatTCACT(SEQ ID NO：720)；CTTtatttccaaatTCAC(SEQ ID NO：740)；CTTtatttccaaatTcAC(SEQ ID NO：745)；AATaactttatttCCA(SEQ ID NO：773)；AGTaataactttaTTT(SEQ ID NO：780)；AGTaataactttATT(SEQ ID NO：782)；AGAgtaataacttTAT(SEQ ID NO：784)；AGAgtaataactTTA(SEQ ID NO：786)；AATcagagtaatAAC(SEQ ID NO：794)；TTAatcagagtaaTAA(SEQ ID NO：795)；TAAtcagagtaaTAA(SEQ ID NO：796)；TTTaatcagagtaATA(SEQ ID NO：797)；或TTTaatcagagtAAT(SEQ ID NO：798)，其中大寫字母係LNA且小寫字母係DNA。
E51.如實施例48之寡聚物，其包含以下序列，基本上由其組成，或由其組成：CTTTAtttccaaattcACTT(SEQ ID NO：679,ASO-001928)、ATTTCcaaattcacttTTAC(SEQ ID NO：482,ASO-001962)；CTTTatttccaaattCACTT(SEQ ID NO：681,ASO-001921)、TTtATttccaaattcACtTT(SEQ ID NO：645,ASO-001967)；TTTAtttccaaattcACTTT(SEQ ID NO：647,ASO-001948)、TTaTTtccaaattcaCTtTT(SEQ ID NO：593,ASO-001941)、ACTTtatttccaaatTCACT(SEQ ID NO：716,ASO-001956)、CTtTAtttccaaattCAcTT(SEQ ID NO：683,ASO-001942)、TTTATttccaaattcaCTTT(SEQ ID NO：646,ASO-001955)、ACTTTatttccaaattCACTT(SEQ ID NO：680,ASO-001968)；CtTTAtttccaaattCAcTT(SEQ ID NO：685,ASO-001935)、AtTTCcaaattcactTTtAC(SEQ ID NO：473,ASO-001933)、TTtATttccaaattcACtTT(SEQ ID NO：645,ASO-001967)、ATtTCcaaattcactTTtAC(SEQ ID NO：492)、ATTtCcaaattcacTtTtAC(SEQ ID NO：487,ASO-002038)或AtTTCcaaattcactTTtAC(SEQ ID NO：493)，其中大寫字母係LNA且小寫字母係DNA。
E52.如實施例50之寡聚物，其包含以下序列，基本上由其組成，或由其組成：ATtTCcaaattcactTTtAC(SEQ ID NO：472,ASO-001940)；AtTTCcaaattcactTTtAC(SEQ ID NO：473,ASO-001933)、ATTTccaaattcactTTTAC(SEQ ID NO：474；ASO-001919)； ATTTCcaaattcacttTTAC(SEQ ID NO：482,ASO-001962)；ATTtCcaaattcacTtTtAC(SEQ ID NO：487,ASO-002038)、ATtTCcaaattcactTTtAC(SEQ ID NO：524,ASO-002263),,AtTTCcaaattcactTTtAC(SEQ ID NO：493,ASO-002439)、TATTTccaaattcactTTTA(SEQ ID NO：532,ASO-001954)；TTaTTtccaaattcaCTtTT(SEQ ID NO：593,ASO-001941)、TTTATttccaaattcACTTT(SEQ ID NO：644,ASO-000756)；TTtATttccaaattcACtTT(SEQ ID NO：645,ASO-001967)；TTTATttccaaattcaCTTT(SEQ ID NO：646,ASO-001955)、TTTAtttccaaattcACTTT(SEQ ID NO：647,ASO-001948)、CTTTAtttccaaattCACTT(SEQ ID NO：677,ASO-000757)；CTTTAtttccaaattcACTT(SEQ ID NO：679,ASO-001928)、ACTTTatttccaaattCACTT(SEQ ID NO：680,ASO-001968)；CTTTatttccaaattCACTT(SEQ ID NO：681,ASO-001921)、CTtTAtttccaaattCAcTT(SEQ ID NO：683,ASO-001942)、TTTccaaattcaCTT(SEQ ID NO：684,ASO-000128)；CtTTAtttccaaattCAcTT(SEQ ID NO：685,ASO-001935)、ATTtccaaattcaCTT(SEQ ID NO：686,ASO-000013)；CTTtatttccaaatTcACT(SEQ ID NO：714,ASO-002012)；ACTTTatttccaaattCACT(SEQ ID NO：715,ASO-001962)；ACTTtatttccaaatTCACT(SEQ ID NO：716,ASO-001956)、CTTtatttccaaatTCACT(SEQ ID NO：720,ASO-001995)；CTTtatttccaaatTCAC(SEQ ID NO：740,ASO-002007)；CTTtatttccaaatTcAC(SEQ ID NO：745,ASO-001997)；AATaactttatttCCA(SEQ ID NO：773,ASO-000118)；AGTaataactttaTTT(SEQ ID NO：780,ASO-000170)；AGTaataactttATT (SEQ ID NO：782,ASO-000125)；AGAgtaataacttTAT(SEQ ID NO：784,ASO-000134)；AGAgtaataactTTA(SEQ ID NO：786,ASO-000178)；AATcagagtaatAAC(SEQ ID NO：794,ASO-000307)；TTAatcagagtaaTAA(SEQ ID NO：795,ASO-000204)；TAAtcagagtaaTAA(SEQ ID NO：796,ASO-000330)；TTTaatcagagtaATA(SEQ ID NO：797,ASO-000326)；及TTTaatcagagtAAT(SEQ ID NO：798,ASO-000249)。
E53.如實施例1至48之寡聚物，其包含選自圖16A及16B之核苷酸序列，基本上由其組成，或由其組成。
E54.如實施例53之寡聚物，其包含選自圖16A及16B之核苷酸序列，基本上由其組成，或由其組成，其中大寫字母係LNA且小寫字母係DNA。
E55.如實施例1至54中任一項之寡聚物，其包含選自以下之核苷間鍵聯：磷酸二酯鍵聯、磷酸三酯鍵聯、甲基磷酸酯鍵聯、胺基磷酸酯鍵聯、硫代磷酸酯鍵聯及其組合。
E56.如實施例1至55中任一項之寡聚物，其中該寡聚物包含核苷酸類似物。
E57.如實施例56之寡聚物，其中該核苷酸類似物包含5'甲基胞嘧啶。
E58.一種偶聯物，其包含如實施例1至57中任一項之寡聚物，其中該寡聚物共價連接至至少一個非核苷酸或非多核苷酸部分。
E59.如實施例58之偶聯物，其中該非核苷酸或非多核苷酸部分包含蛋白質、脂肪酸鏈、糖殘基、糖蛋白、聚合物或其任何組合。
E60.一種醫藥組合物，其包含如實施例1至57中任一項之寡聚物或如實施例58或59之偶聯物及醫藥上可接受之載劑。
E61如實施例60之組合物，其進一步包含治療劑。
E62.如實施例61之組合物，其中該治療劑係Tau拮抗劑。
E63.如實施例62之組合物，其中該Tau拮抗劑係抗Tau抗體或其片段。
E64.一種套組，其包含如實施例1至57中任一項之寡聚物、如實施例58或59之偶聯物或如實施例60至63中任一項之組合物及使用說明。
E65.一種診斷套組，其包含如實施例1至57中任一項之寡聚物、如實施例58或59之偶聯物或如實施例60至63中任一項之組合物及使用說明。
E66.一種抑制或降低細胞中之Tau蛋白表現之方法，該方法包含將如實施例1至57中任一項之寡聚物、如實施例58或59之偶聯物或如實施例60至63中任一項之組合物投與表現Tau蛋白之細胞，其中該細胞中之該Tau蛋白表現在該投與後被抑制或降低。
E67.如實施例66之方法，其中該寡聚物在該投與後抑制或降低該細胞中Tau mRNA之表現。
E68.如實施例66或67之方法，其中與未暴露至該寡聚物之細胞相比，在該投與後Tau mRNA之表現降低至少約20%、至少約30%、至少約40%、至少約50%、至少約60%、至少約70%、至少約80%、至少約90%或約100%。
E69.如實施例66至68中任一項之方法，其中與未暴露至該寡聚物之細胞相比，該寡聚物在該投與後將該細胞中Tau蛋白之表現降低至少約60%、至少約70%、至少約80%或至少約90%。
E70.如實施例66至69中任一項之方法，其中該細胞係神經元。
E71.一種治療有需要之個體之tau蛋白病變之方法，其包含將有效量之如實施例1至57中任一項之寡聚物、如實施例58或59之偶聯物或如實施例60至63中任一項之組合物投與該個體。
E72.如實施例71之方法，其中該tau蛋白病變係選自以下之疾病：阿茲海默氏病、進行性核上性麻痺、拳擊手型失智症(慢性創傷性腦病)、額顳葉失智症、與染色體17相關之帕金森氏症、李替克-波迪哥病(關島型帕金森失智複合症(Parkinson-dementia complex of Guam))、纏結為主之失智症、神經節神經膠質瘤、神經節細胞瘤、腦膜血管瘤病、亞急性硬化性泛腦炎、鉛毒腦病、結節性硬化症、哈勒沃登-施帕茨病、匹克氏病、皮質基底節退化症、嗜銀顆粒病、皮質基底核退化症、脂褐質沈積症、額顳葉失智症、核上性麻痺、額顳葉退化及其任何組合。
E73.如實施例71之方法，其中該tau蛋白病變係進行性核上性麻痺。
E74.如實施例71之方法，其中該tau蛋白病變係阿茲海默氏病。
E75.如實施例71之方法，其中該tau蛋白病變係額顳葉失智症。
E76.一種調節有需要之個體之神經元超興奮性之方法，其包含將有效量之如實施例1至57中任一項之寡聚物、如實施例58或59之偶聯物或如實施例60至63中任一項之組合物投與該個體。
E77.一種治療有需要之個體之癲癇發作之方法，其包含將有效量之如實施例1至57中任一項之寡聚物、如實施例58或59之偶聯物或如實施例60至61中任一項之組合物投與該個體。
E78.如實施例77之方法，其中該癲癇發作係選自以下之疾病：癲癇、青少年肌陣攣性癲癇、反射性癲癇、良性家族性嬰兒癲癇(BFIE)、小兒驚厥、嬰兒痙攣、舞蹈手足徐動症(ICCA)症候群、傷害相關癲癇發作、腦損傷、腦中風、腦膜炎及熱性癲癇發作。
E79.一種治療或預防神經病症之方法，其包含投與有效量之如實施例1至57中任一項之寡聚物、如實施例58或59之偶聯物或如實施例60至63中任一項之組合物。
E80.如實施例79之方法，其中該神經病症選自進行性核上性麻痺、額顳葉失智症-tau(FTD-tau)、額顳葉失智症及與染色體17相關之帕金森氏症(FTDP-17)、皮質基底核退化症(CBD)、創傷性腦損傷、慢性創傷性腦病、HIV相關神經認知障礙、嗜銀顆粒病、唐氏症候群-阿茲海默氏病、健忘型輕度認知損傷-阿茲海默氏病、帕金森氏病失智症、哈勒沃登-施帕茨病(泛酸鹽激酶相關神經退化症)、C型尼曼匹克症(Niemann Pick disease type C)、肌強直性營養不良、肌肉萎縮性脊髓側索硬化症、帕金森氏病、杭丁頓氏症(Huntington's disease)、半邊巨腦症、結節性硬化複合症、2b型局灶性皮質發育不良或神經節細胞瘤。在某些實施例中，該疾病或病況係無tau蛋白病變之癲癇性病症，例如德拉韋症候群(Dravet Syndrome)(嬰兒嚴重肌陣攣性癲癇)、顳葉癲癇、大田原症候群(Ohtahara syndrome)(早期幼兒癲癇性腦病伴爆發抑制)、拉弗拉體病(Lafora body disease)、全身性癲癇伴熱性癲癇發作、嬰兒痙攣(韋斯特症候群(West syndrome))、雷葛氏症候群(Lennox Gastaut syndrome)、安格曼症候群(Angelman Syndrome)、蕾特氏症候群(Rett Syndrome)、蘭道克雷夫症候群(Landau Kleffner syndrome)、局灶性癲癇發作、單純局灶性癲癇發作(不喪失意識)、局灶性認知障礙性癲癇發作(意識受損)、演變成全身性僵直-陣攣(GTC)驚厥之局灶性癲癇發作、全身性癲癇發作(驚厥性或非驚厥性，伴隨涉及皮質下結構之雙側放電)、失神性癲癇發作、肌陣攣性癲癇發作、陣攣性癲癇發作、強直性癲癇發作、強直陣攣性癲癇發作、失張性癲癇發作、自閉症、自閉症譜系障礙(例如，如在精神疾病診斷與統計手冊V(Diagnostic and Statistical Manual of Mental Disorders V，DSM-V)中所定義)、亞斯伯格症(Asperger’s disorder)、廣泛性發育障礙及其任何組合。.
E81.如實施例71至80中任一項之方法，其中該個體係人類。
E82.一種如實施例1至57中任一項之寡聚物之用途，其用於製造用於治療神經病症之藥劑。
E83.如實施例1至57中任一項之寡聚物，其用於疾病或病況之治療中。
E84.如實施例83使用之寡聚物，其中該疾病或病況係神經病症。
E85.如實施例50之寡聚物，其中該寡聚物係ATtTCcaaattcactTTtAC(SEQ ID NO：472)，其具有化學結構OxyAs OxyTs DNAts OxyTs OxyMCs DNAcs DNAas DNAas DNAas DNAts DNAts DNAcs DNAas DNAcs DNAts OxyTs OxyTs DNAts OxyAs OxyMC(ASO-001940)；AtTTCcaaattcactTTtAC(SEQ ID NO：473)，其具有化學結構OxyAs DNAts OxyTs OxyTs OxyMCs DNAcs DNAas DNAas DNAas DNAts DNAts DNAcs DNAas DNAcs DNAts OxyTs OxyTs DNAts OxyAs OxyMC(ASO-001933)；ATTTccaaattcactTTTAC(SEQ ID NO：474)，其具有化學結構OxyAs OxyTs OxyTs OxyTs DNAcs DNAcs DNAas DNAas DNAas DNAts DNAts DNAcs DNAas DNAcs DNAts OxyTs OxyTs OxyTs OxyAs OxyMC(ASO-001919)；ATTTCcaaattcacttTTAC(SEQ ID NO：482)，其具有化學結構OxyAs OxyTs DNAts OxyTs DNAcs OxyMCs DNAas OxyAs DNAas DNAts DNAts DNAcs DNAas DNAcs DNAts OxyTs DNAts OxyTs OxyAs OxyMC(ASO-001962)；ATTtCcaaattcacTtTtAC(SEQ ID NO：487)，其具有化學結構OxyAs OxyTs OxyTs DNAts OxyMCs DNAcs DNAas DNAas DNAas DNAts DNAts DNAcs DNAas DNAcs OxyTs DNAts OxyTs DNAts OxyAs OxyMC(ASO-002038)；AtTTCcaaattcactTTtAC(SEQ ID NO：493)，其具有化學結構OxyTs OxyMCs OxyMCs OxyAs OxyAs DNAas DNAts DNAts DNAcs DNAas DNAcs DNAts DNAts DNAts OxyTs OxyAs OxyMCs(ASO-002439)；ATtTCcaaattcactTTtAC(SEQ ID NO：524)，其具有化學結構OxyAs OxyTs DNAts OxyTs DNAcs OxyMCs DNAas DNAas DNAas DNAts DNAts DNAcs DNAas DNAcs DNAts OxyTs OxyTs DNAts OxyAs OxyMCs(ASO-002263)；TATTTccaaattcactTTTA(SEQ ID NO：532)，其具有化學結構OxyTs OxyAs OxyTs OxyTs OxyTs DNAcs DNAcs DNAas DNAas DNAas DNAts DNAts DNAcs DNAas DNAcs DNAts OxyTs OxyTs OxyTs OxyA(ASO-001954)；TTaTTtccaaattcaCTtTT(SEQ ID NO：593)，其具有化學結構OxyTs OxyTs DNAas OxyTs OxyTs DNAts DNAcsDNAcs DNAas DNAas DNAas DNAts DNAts DNAcs DNAas OxyMCs OxyTs DNAts OxyTs OxyT(ASO-001941)；TTTATttccaaattcACTTT(SEQ ID NO：644)，其具有化學結構OxyTs OxyTs OxyTs OxyAs OxyTs DNAts DNAts DNAcs DNAcs DNAas DNAas DNAas DNAts DNAts DNAcs OxyAs OxyMCs OxyTs OxyTs OxyT(ASO-000756)；TTtATttccaaattcACtTT(SEQ ID NO：645)，其具有化學結構OxyTs OxyTs DNAts OxyAs OxyTs DNAts DNAts DNAcs DNAcs DNAas DNAas DNAas DNAts DNAts DNAcs OxyAs OxyMCs DNAts OxyTs OxyT(ASO-001967)；TTTATttccaaattcaCTTT(SEQ ID NO：646)，其具有化學結構OxyTs OxyTs OxyTs OxyAs OxyTs DNAts DNAts DNAcs DNAcs DNAas DNAas DNAas DNAts DNAts DNAcs DNAas OxyMCs OxyTs OxyTs OxyT(ASO-001955)；TTTAtttccaaattcACTTT(SEQ ID NO：647)，其具有化學結構OxyTs OxyTs OxyTs OxyAs DNAts DNAts DNAts DNAcs DNAcs DNAas DNAas DNAas DNAts DNAts DNAcs OxyAs OxyMCs OxyTs OxyTs OxyT(ASO-001948)；CTTTAtttccaaattCACTT(SEQ ID NO：677)，其具有化學結構OxyMCs OxyTs OxyTs OxyTs OxyAs DNAts DNAts DNAts DNAcs DNAcs DNAas DNAas DNAas DNAts DNAts OxyMCs OxyAs OxyMCs OxyTs OxyT(ASO-000757)；CTTTAtttccaaattcACTT(SEQ ID NO：679)，其具有化學結構OxyMCs OxyTs OxyTs OxyTs OxyAs DNAts DNAts DNAts DNAcs DNAcs DNAas DNAas DNAas DNAts DNAts DNAcs OxyAs OxyMCs OxyTs OxyT(ASO-001928)；ACTTTatttccaaattCACTT(SEQ ID NO：680)，其具有化學結構OxyAs OxyMCs OxyTs OxyTs OxyTs DNAas DNAts DNAts DNAts DNAcs DNAcs DNAas DNAas DNAas DNAts DNAts OxyMCs OxyAs OxyMCs OxyTs OxyT(ASO-001968)；CTTTatttccaaattCACTT(SEQ ID NO：681)，其具有化學結構OxyMCs OxyTs OxyTs OxyTs DNAas DNAts DNAts DNAts DNAcs DNAcs DNAas DNAas DNAas DNAts DNAts OxyMCs OxyAs OxyMCs OxyTs OxyT(ASO-001921)；CTtTAtttccaaattCAcTT(SEQ ID NO：683)，其具有化學結構OxyMCs OxyTs DNAts OxyTs OxyAs DNAts DNAts DNAts DNAcs DNAcs DNAas DNAas DNAas DNAts DNAts OxyMCs OxyAs DNAcs OxyTs OxyT(ASO-001942)；TTTccaaattcaCTT(SEQ ID NO：684)，其具有化學結構OxyTs OxyTs OxyTs DNAcs DNAcs DNAas DNAas DNAas DNAts DNAts DNAcs DNAas OxyMCs OxyTs OxyT(ASO-000128)；CtTTAtttccaaattCAcTT(SEQ ID NO：685)，其具有化學結構OxyMCs DNAts OxyTs OxyTs OxyAs DNAts DNAts DNAts DNAcs DNAcs DNAas DNAas DNAas DNAts DNAts OxyMCs OxyAs DNAcs OxyTs OxyT(ASO-001935)；ATTtccaaattcaCTT(SEQ ID NO：686)，其具有化學結構OxyAs OxyTs OxyTs DNAts DNAcs DNAcs DNAas DNAas DNAas DNAts DNAts DNAcs DNAas OxyMCs OxyTs OxyT(ASO-000013)；CTTtatttccaaatTcACT(SEQ ID NO：714)，其具有化學結構OxyMCs OxyTs OxyTs DNAts DNAas DNAts DNAts DNAts DNAcs DNAcs DNAas DNAas DNAas DNAts OxyTs DNAcs OxyAs OxyMCs OxyT (ASO-002012)；ACTTTatttccaaattCACT(SEQ ID NO：715)，其具有化學結構OxyAs OxyMCs OxyTs OxyTs OxyTs DNAas DNAts DNAts DNAts DNAcs DNAcs DNAas DNAas DNAas DNAts DNAts OxyMCs OxyAs OxyMCs OxyT(ASO-001962)；ACTTtatttccaaatTCACT(SEQ ID NO：716)，其具有化學結構OxyAs OxyMCs OxyTs OxyTs DNAts DNAas DNAts DNAts DNAts DNAcs DNAcs DNAas DNAas DNAas DNAts OxyTs OxyMCs OxyAs OxyMCs OxyT(ASO-001956)、CTTtatttccaaatTCACT(SEQ ID NO：720)，其具有化學結構OxyMCs OxyTs OxyTs DNAts DNAas DNAts DNAts DNAts DNAcs DNAcs DNAas DNAas DNAas DNAts OxyTs OxyMCs OxyAs OxyMCs OxyT(ASO-1995)；CTTtatttccaaatTCAC(SEQ ID NO：740)，其具有化學結構OxyMCs OxyTs OxyTs DNAts DNAas DNAts DNAts DNAts DNAcs DNAcs DNAas DNAas DNAas DNAts OxyTs OxyMCs OxyAs OxyMC(ASO-002007)；CTTtatttccaaatTcAC(SEQ ID NO：745)，其具有化學結構OxyMCs OxyTs OxyTs DNAts DNAas DNAts DNAts DNAts DNAcs DNAcs DNAas DNAas DNAas DNAts OxyTs DNAcs OxyAs OxyMC(ASO-001997)；AATaactttatttCCA(SEQ ID NO：773)，其具有化學結構OxyAs OxyAs OxyTs DNAas DNAas DNAcs DNAts DNAts DNAts DNAas DNAts DNAts DNAts OxyMCs OxyMCs OxyA(ASO-000118)；AGTaataactttaTTT(SEQ ID NO：780)，其具有化學結構OxyAs OxyGs OxyTs DNAas DNAas DNAts DNAas DNAas DNAcs DNAts DNAts DNAts DNAas OxyTs OxyTs OxyT(ASO-000170)；AGTaataactttATT(SEQ ID NO：782)，其具有化學結構OxyAs OxyGs OxyTs DNAas DNAas DNAts DNAas DNAas DNAcs DNAts DNAts DNAts OxyAs OxyTs OxyT(ASO-000125)；AGAgtaataacttTAT(SEQ ID NO：784)，其具有化學結構OxyAs OxyGs OxyAs DNAgs DNAts DNAas DNAas DNAts DNAas DNAas DNAcs DNAts DNAts OxyTs OxyAs OxyT(ASO-000134)；AGAgtaataactTTA(SEQ ID NO：786)，其具有化學結構OxyAs OxyGs OxyAs DNAgs DNAts DNAas DNAas DNAts DNAas DNAas DNAcs DNAts OxyTs OxyTs OxyA(ASO-000178)；AATcagagtaatAAC(SEQ ID NO：794)，其具有化學結構OxyAs OxyAs OxyTs DNAcs DNAas DNAgs DNAas DNAgs DNAts DNAas DNAas DNAts OxyAs OxyAs OxyMC(ASO-000307)；TTAatcagagtaaTAA(SEQ ID NO：795)，其具有化學結構OxyTs OxyTs OxyAs DNAas DNAts DNAcs DNAas DNAgs DNAas DNAgs DNAts DNAas DNAas OxyTs OxyAs OxyA(ASO-000204)；TAAtcagagtaaTAA(SEQ ID NO：796)，其具有化學結構OxyTs OxyAs OxyAs DNAts DNAcs DNAas DNAgs DNAas DNAgs DNAts DNAas DNAas OxyTs OxyAs OxyA(ASO-000330)；TTTaatcagagtaATA(SEQ ID NO：797)，其具有化學結構OxyTs OxyTs OxyTs DNAas DNAas DNAts DNAcs DNAas DNAgs DNAas DNAgs DNAts DNAas OxyAs OxyTs OxyA(ASO-000326)；或TTTaatcagagtAAT(SEQ ID NO：798)，其具有化學結構OxyTs OxyTs OxyTs DNAas DNAas DNAts DNAcs DNAas DNAgs DNAas DNAgs DNAts OxyAs OxyAs OxyT(ASO-000249)。
圖1A至1C顯示Tau基因體、mRNA及蛋白質序列。圖1A中之SEQ ID NO：1代表MAPT 基因體序列。SEQ ID NO：1與MAPT 前mRNA序列一致，但SEQ ID NO：1中之核苷酸「t」在前mRNA中顯示為「u」。圖1B中之SEQ ID NO：2代表MAPT mRNA序列，但SEQ ID NO：2中之核苷酸「t」在mRNA中顯示為「u」。由MAPT mRNA編碼之Tau蛋白序列在圖1C中顯示為SEQ ID NO：3。
圖2顯示寡聚物之實例性寡聚物、設計(ASO序列)及化學結構。圖2列示唯一寡聚物名稱、唯一反義寡聚物(ASO)識別號、ASO序列、SEQ ID編號、MAPT 前mRNA序列上之靶起點及終點位置及化學結構。具有失配鹼基之寡聚物之實例於圖2中以「mm」提供。具體失配鹼基對加粗，加下劃線，加斜體並突出顯示。
圖3顯示靶向SEQ ID NO：1之核苷酸134,947至138,940之實例性寡聚物。圖3列示SEQ ID編號、唯一寡聚物名稱、唯一ASO識別號、ASO序列、MAPT 前mRNA序列上之靶起點及終點位置、成熟mRNA序列上之靶起點及正規化Tau/Tuj-1及Tuj-1免疫細胞化學值(如下文實例2中所論述)。具有失配鹼基之寡聚物之實例於圖3中以「mm」提供。具體失配鹼基對加粗，加下劃線，加斜體並突出顯示。
圖4係顯示初級神經元自發鈣振盪之圖。初級神經元自發鈣振盪係如先前所述來量測(Murphy等人，1992,J.Neurosci. 12：4834-4845)。添加α-胺基-3-羥基-5-甲基-4-異噁唑丙酸(AMPA)受體拮抗劑6-氰基-7-硝基喹喏啉-2,3-二酮(CNQX；3μM)將分析中代表總AMPA反應之鈣振盪降低20%(顯示AMPA標記棒)。在1mM MgCl2 阻斷N-甲基-D-天冬胺酸鹽(NMDA)受體功能時，鈣振盪進一步降低約80%(顯示NMDA標記棒)。
圖5係顯示反義寡聚物對AMPA介導之鈣振盪之抑制之圖，該抑制指示神經元網絡活性中斷。對NMDA或AMPA介導之自發鈣振盪之反義寡聚物抑制係在1mM MgCl2 存在或不存在下(在每種情形中代表100%對照)評價。添加25μM反義寡聚物(TGTgatgcaggaGTT)(SEQ ID NO：304)(ASO-00007)抑制AMPA受體但不抑制NMDA受體介導之振盪。顯示ASO及其他行為類似之寡聚物對活體內中樞神經系統(CNS)網絡活性及活體外電生理自發神經元活性有負面影響(數據未顯示)。
圖6顯示Tau反義寡核苷酸對初級神經元中之自發鈣振盪之影 響。圖6列示唯一ASO識別號、ASO序列、SEQ ID編號、MAPT 前mRNA序列上之靶起點及終點位置、呈對照之百分比之鈣振盪數據(如下文實例3中所論述)及Tau神經元之IC50 值(如下文實例2中所論述)。具有失配鹼基之寡聚物之實例於圖6以「mm」提供。具體失配鹼基對加粗，加下劃線，加斜體並突出顯示。
圖7顯示實例性寡聚物之活體內耐受性。圖7列示唯一ASO識別號、ASO序列、SEQ ID編號、MAPT 前mRNA序列上之靶起點及終點位置、活體內急性耐受性評分(如下文實例5中所論述)及投與後剩餘腦MAPT mRNA之百分比(亦如下文實例5中所論述)。
圖8A顯示序列評分相對於活體內耐受性評分之相關性分析。每種寡聚物之序列評分係藉由在下式中插如適宜數字來計算：((C核苷酸或其類似物之數目-G核苷酸數目)/核苷酸長度(即，數目))。活體內耐受性評分係基於在小鼠中單一腦室內(ICV)投與100μg寡聚物或在大鼠中鞘內(i.t. )投與900μg或高達1500μg寡聚物後之觀察來計算。齧齒類動物係在5個類別下進行觀察：1)過動；2)活動及喚起減少；3)運動功能障礙及/或共濟失調；4)異常姿勢及呼吸；及5)震顫及/或驚厥。總活體內耐受性評分係5個單元評分之和；每一單元評分係以0-4之量表來量測。因此，活體內耐受性總分可介於0至20範圍內。藉由該式計算之序列評分位於X-軸上，且活體內耐受性評分位於Y-軸上。
圖8B顯示活體外功效(Y-軸)與活體內Tau mRNA減少(X-軸)之相關性。在小鼠中給藥後2週，將活體外功效(IC50 )與投與100μg ASO後之活體內Tau mRNA減少相關聯(r2 =0.54；p<0.001)。正方形代表基於活體外Tau蛋白減少及初級神經元健康進行優先級排序之寡聚物，如藉由微管蛋白及自發鈣振盪所評價(圖3、4、6及7)。
圖9A-9B係顯示在100μg ASO-000013(即，ATTtccaaattcaCTT， 即SEQ ID NO：686，其中大寫字母代表LNA核苷酸，同時小寫字母代表DNA核苷酸)之單一ICV濃注投與至野生型C57小鼠(N=12)後隨時間之腦Tau mRNA(9A)及Tau蛋白(9B)降低之圖。在注射後2、4、8及12週量測Tau mRNA表現(正規化至GAPDH)。在注射後2、4、8及12週量測Tau蛋白(鹽水之%)含量。(*p<0.01,***p<0.001)Tau mRNA及蛋白質二者在給藥後20週返回基線(數據未顯示)。
圖10係顯示在將100μg之單一ICV濃注投與至野生型C57小鼠(N=12)中後最多12週檢測ASO-000013之腦濃度之圖。
圖11係顯示在寡聚物(ASO-000013及ASO-000757(即，CTTTAtttccaaattCACTT(SEQ ID NO：677))於大鼠(N=6)中之300μg單一濃注鞘內(IT)投與後3天或4週後的腦Tau mRNA減少之圖。
圖12顯示所選寡聚物之序列與Rho A序列之比較，該Rho A序列與MAPT 基因體序列之一部分(SEQ ID NO：1)比對。RhoA序列列示為actttatttccaaatacacttcttt(SEQ ID NO：959)。所選寡聚物與Rho A序列之間之失配突出顯示。ASO-000757之序列與相應RhoA序列相比具有1個失配；ASO-0001967、ASO-000755及ASO-001941之序列與相應RhoA序列相比具有2個失配；且ASO-000753、ASO-002038、ASO-001933及ASO-001940之序列與相應RhoA序列相比具有4個失配。圖12顯示，傳統間隔體(即，ASO-000757、ASO-000755及ASO-000753)在單一100μg ICV濃注劑量後超過4週後不耐受，而交替側接間隔體(即，ASO-001941、ASO-002038、ASO-001933及ASO-001940)展現超過4週後之耐受性。在此資料集中，微管蛋白抑制與長期耐受性高度相關。大於25%之Rho A降低(即，ASO-000757、ASO-000755及ASO-000753)亦與缺少長期耐受性(顯示在單一ICV濃注注射100μg之每種ASO後大於4週)相關。
圖13顯示，在hTau小鼠腦中單一ICV注射後，ASO-001933產生 劑量反應性腦hTau蛋白減少。在hTau小鼠(n=10/組)中ICV注射鹽水或50、100、150或200μg之Tau ASO。X-軸顯示ASO-001933之劑量，且Y-軸顯示與鹽水注射後之hTau蛋白表現相比，在ASO注射後之hTau蛋白表現(鹽水之%)。
圖14A及14B顯示，在tau蛋白病變之小鼠模型(Tg4510)中，Tau ASO-000774介導之不溶性及可溶性Tau降低救助過動。在跑輪分析中，Tau降低逆轉Tg4510小鼠之過動。圖14A使用BT-2及HT-7 ELISA顯示，單一100μg ICV濃注降低總Tau蛋白。左圖顯示投與媒劑時(即，100%)之總Tau蛋白表現(對照之%)，且右圖顯示投與ASO-000774時之總Tau蛋白表現。圖14B顯示在跑輪分析中在Tg4510(tau蛋白病變小鼠模型)及雙陰性同窩出生仔畜對照(Dbl Neg)中評價之總輪計數，如實例7中所述。
圖15A及15B分別顯示tau寡聚物(例如，ASO-000762)可在德拉韋症候群之小鼠模型中救助過早死亡及降低強直陣攣性癲癇發作。圖15A顯示經單一ICV投與之20μg或37μg靶向Tau mRNA之3’-UTR區域之Tau ASO-000762治療之德拉韋小鼠及同窩出生仔畜對照之存活曲線。已顯示在出生後10天寡聚物降低20-50%之Tau蛋白(數據未顯示)。圖15A中之上線顯示經單一ICV投與之37μg之Tau ASO-000762治療之德拉韋小鼠之存活百分比。圖15A中之中線顯示經單一ICV投與之20μg之Tau ASO-000762治療之德拉韋小鼠之存活百分比。圖15A中之下線顯示經單一ICV投與之鹽水治療之德拉韋小鼠之存活百分比。圖15B顯示德拉韋小鼠中不具有體溫過高誘導之全身性強直陣攣性癲癇發作(GTCS)之小鼠百分比。GTCS係在以20μg注射ASO-000762後8-9週量測。在投與媒劑後不具有GTCS之小鼠百分比以圓形顯示，且在投與ASO-000762後不具有GTCS之小鼠百分比顯示為正方形。
圖16A及16B顯示實例性寡聚物、設計及其化學結構。圖16A列示唯一反義寡聚物(ASO)識別號、SEQ ID編號、ASO序列、Tau前mRNA序列上之靶起點及終點位置、Tau神經元之IC50 值(如下文實例8中所論述)及Tau抑制百分比(如下文實例8中所論述)。圖16B顯示圖16A中所示寡聚物之具體化學結構且列示唯一反義寡聚物(ASO)識別號、ASO序列、Tau前mRNA序列上之靶起點及終點位置及化學結構。
圖17A係在PSP中顯示病理性Tau累積之腦區域之影像。
圖17B顯示對照猴(左)中或已接受兩次間隔一週之ASO-001933之單一16mg鞘內濃注劑量之猴(右)中之區域性Tau mRNA變化。Tau mRNA變化係在給藥後兩週藉由螢光原位雜交(FISH)使用Tau mRNA特異性探針在黑質、腦橋核及中央小腦齒狀核中評價。Tau mRNA累積顯示為較淺陰影。
圖18A顯示在非人類靈長類動物(NHP)中在ASO-001933之鞘內給藥後腦中之Tau蛋白減少。在給藥後4、8或12週藉由Tau ELISA(BT2/HT7或Tau12/BT2)評價對照猴或已接受兩次間隔兩週之ASO-001933之單一8mg鞘內濃注劑量之猴中之區域性Tau mRNA變化。區域性Tau mRNA變化係在腦橋、小腦(CBL)、頂葉皮質(ParC)、額葉皮質(FrC)、枕葉皮質(OccC)、顳葉皮質(TemC)及海馬體(Hipp)中量測。
圖18B顯示在非人類靈長類動物(NHP)中在ASO-001933之鞘內給藥後腦脊髓液(CSF)中之Tau蛋白減少。Y-軸顯示CSF中Tau蛋白減少之基線百分比，且X-軸顯示最後一次劑量後之週數。
圖19A顯示，在hTau小鼠腦中之單一腦室內(ICV)注射後，ASO-002038(Tau ASO)產生持久之劑量反應性腦hTau mRNA減少。在hTau小鼠(n=10/組)中ICV注射鹽水或25、50、100及150μg之Tau ASO。在給藥後1週解剖額葉皮質區以藉由qRT-PCR測定總Tau mRNA含量。使 用單因子ANOVA分析，***p<0.001。誤差槓代表平均值+/- SEM。
圖19B顯示，在手術腰部置管大鼠中單一鞘內(IT)注射後，ASO-002038(Tau ASO)產生持久之劑量反應性腦hTau mRNA減少。在大鼠(n=10/組)中IT注射鹽水或400、900及1500μg之Tau ASO。在給藥後1週解剖額葉皮質區以藉由qRT-PCR測定總Tau mRNA含量。使用單因子ANOVA分析，***p<0.001。誤差槓代表平均值+/- SEM。
圖20A及20B藉由QUANTIGENE® 分析顯示實例性寡聚物、設計及化學結構。圖20A列示唯一反義寡聚物(ASO)識別號、SEQ ID編號、ASO序列、Tau前mRNA序列上之靶起點及終點位置、成熟mRNA序列上之起點位置及mRNA之QUANTIGENE® 表現(如下文實例10中所論述)。圖20B顯示圖20A中所示寡聚物之具體化學結構且列示唯一反義寡聚物(ASO)識別號、ASO序列、Tau前mRNA序列上之靶起點及終點位置及化學結構。
 I. 定義
應注意，術語「一(a)」或「一(an)」實體係指一或多個該實體；例如，「一個核苷酸序列」理解為代表一或多個核苷酸序列。因此，術語「一(a)」(或「一(an)」)、「一個或多個」及「至少一個」在本文中可互換使用。
此外，「及/或」在本文中使用時應視為具體揭示兩個指定特徵或組份中之每一者具有或不具有另一者。因此，本文中如諸如「A及/或B」等片語中使用之術語「及/或」意欲包括「A及B」、「A或B」、「A」(單獨的)及「B」(單獨的)。同樣，如諸如「A、B及/或C」等片語中使用之術語「及/或」意欲涵蓋以下態樣中之每一者：A、B及C；A、B或C；A或C；A或B；B或C；A及C；A及B；B及C；A(單獨的)；B(單獨的)；及C(單獨的)。
應理解，無論本文中在哪裡以言語「包含」闡述態樣，亦提供以「由……組成」及/或「基本上由……組成」闡述之其他類似態樣。
除非另外定義，否則本文所用所有技術及科學術語皆具有與熟習本揭示內容所屬領域技術者之通常理解相同之意義。舉例而言，生物醫學與分子生物學簡明辭典(Concise Dictionary of Biomedicine and Molecular Biology),Juo,Pei-Show，第2版，2002,CRC Press；細胞與分子生物學辭典(The Dictionary of Cell and Molecular Biology)，第3版，1999,Academic Press；及牛津生物化學與分子生物學辭典(Oxford Dictionary Of Biochemistry And Molecular Biology)，修訂版，2000,Oxford University Press向技術人員提供本揭示中所用多個術語之通用辭典。
單位、前綴及符號係以其國際單位製(Système International de Unites，SI)接受的形式來表示。數字範圍包括界定該範圍之數字。除非另外指示，否則核苷酸序列按5'至3'取向自左至右書寫。胺基酸序列係按胺基至羧基取向自左至右書寫。本文提供之標題並不限制本揭示之各個態樣，該等態樣可參照整體說明書來掌握。因此，下文即將定義之術語係參照說明書全文更全面地定義。
本文所用術語「約」意指大約、大致、左右或在附近。當術語「約」結合一數字範圍使用時，其藉由將邊界延伸至高於及低於所述數值來修改該範圍。一般而言，術語「約」可修改數值為高於及低於所述值，相差例如10%上或下(較高或較低)。舉例而言，若陳述「寡聚物在投與該寡聚物後將細胞中Tau蛋白之表現降低至少約60%」，則其暗示，Tau含量降低50%至70%之範圍。
術語「核酸」或「核苷酸」意欲涵蓋複數個核酸。在一些實施例中，術語「核酸」或「核苷酸」係指活體內或活體外靶序列，例如 前mRNA、mRNA或DNA。在該術語係指靶序列中之核酸或核苷酸時，核酸或核苷酸可為細胞內之天然序列。在其他實施例中，「核酸」或「核苷酸」係指本發明寡聚物中之序列。在該術語係指寡聚物中之序列時，核酸或核苷酸並非天然的。在一個實施例中，寡聚物中之核酸或核苷酸係以合成或重組方式產生，但並非天然序列或其片段。在另一實施例中，寡聚物中之核酸或核苷酸含有至少一種並非天然存於自然界中之核苷酸類似物。術語「核酸」或「核苷」係指存於多核苷酸中之單一核酸區段，例如DNA、RNA或其類似物。「核酸」或「核苷」包括天然核酸或非天然核酸。在一些實施例中，術語「核苷酸」、「單元」及「單體」可互換使用。將認識到，在提及核苷酸或單體之序列時，所提及者係鹼基序列，例如A、T、G、C或U及其類似物之序列。
如本文所用術語「核苷酸」係指糖苷，其包含糖部分、鹼基部分及共價連接部分(鍵聯基團)，例如磷酸酯或硫代磷酸酯核苷酸間鍵聯基團，且涵蓋天然核苷酸(例如DNA或RNA)及包含經修飾糖及/或鹼基部分之非天然核苷酸二者，該等非天然核苷酸在本文中亦稱為「核苷酸類似物」。在本文中，單一核苷酸(單元)亦可稱為單體或核酸單元。在某些實施例中，術語「核苷酸類似物」係指具有經修飾糖部分之核苷酸。具有經修飾糖部分之核苷酸之非限制性實例(例如，LNA)揭示於本文中之別處。在其他實施例中，術語「核苷酸類似物」係指具有經修飾鹼基部分之核苷酸。具有經修飾鹼基部分之核苷酸包括(但不限於)5-甲基胞嘧啶、異胞嘧啶、假異胞嘧啶、5-溴尿嘧啶、5-丙炔基尿嘧啶、6-胺基嘌呤、2-胺基嘌呤、肌苷、二胺基嘌呤及2-氯-6-胺基嘌呤。
如本文所用術語「核苷」用於指包含糖部分及鹼基部分之糖苷，且因此可在提及核苷酸單元時使用，其係藉由寡聚物中核苷酸之 間之核苷酸間鍵聯共價連接。在生物技術領域中，術語「核苷酸」通常用於指核酸單體或單元，且因此在寡核苷酸情況下可係指鹼基，例如「核苷酸序列」通常係指核鹼基序列(即內含糖主鏈及核苷間鍵聯之存在)。同樣，尤其在其中一或多個核苷間鍵聯基團經修飾之寡核苷酸情形中，術語「核苷酸」可係指「核苷」，例如甚至在指定核苷之間鍵聯的存在或性質時亦可使用術語「核苷酸」。
如本文所用術語「核苷酸長度」意指給定序列中核苷酸(單體)之總數。舉例而言，AAAgatgaaatttgctcTTA(SEQ ID NO：4)之序列具有20個核苷酸；因此該序列之核苷酸長度為20。因此，術語「核苷酸長度」在本文中可與「核苷酸數目」互換使用。
如熟習此項技術者將瞭解，寡核苷酸之5'末端核苷酸不包含5'核苷酸間鍵聯基團，但其可包含5'末端基團。
如本文所用「編碼區」或「編碼序列」係由可轉譯成胺基酸之密碼子組成之多核酸部分。儘管「終止密碼子」(TAG、TGA或TAA)通常不轉譯成胺基酸，但可將其視為編碼區之一部分，但任一側接序列(例如啟動子、核糖體結合位點、轉錄終止子、內含子、非轉譯區(「UTR」)及諸如此類)並非編碼區之一部分。編碼區之邊界通常由5'末端編碼所得多肽之胺基末端之起始密碼子及3'末端編碼所得多肽之羧基末端之轉譯終止密碼子來確定。
如本文所用術語「非編碼區」意指並非編碼區之核苷酸序列。非編碼區之實例包括(但不限於)啟動子、核糖體結合位點、轉錄終止子、內含子、非轉譯區(「UTR」)、非編碼外顯子及諸如此類。一些外顯子可為每一轉錄物之5'非轉譯區(5' UTR)或3'非轉譯區(3' UTR)之全部或一部分。非轉譯區對於轉錄物之有效轉譯及控制轉錄物之轉譯速率及半衰期非常重要。
術語「區域」在用於核苷酸序列情況下時係指該序列之一部 分。舉例而言，片語「核苷酸序列內之區域」或「核苷酸序列補體內之區域」分別係指位於特定核苷酸序列內或該核苷酸序列補體內之短於該核苷酸序列但長於至少10個核苷酸之序列。術語「子序列(sub-sequence)」或「子序列(subsequence)」亦可係指核苷酸序列之區域。
術語「下游」在提及核苷酸序列時意指，核酸或核苷酸序列位於參照核苷酸序列之3'。在某些實施例中，下游核苷酸序列係關於在轉錄起點後之序列。舉例而言，基因之轉譯起始密碼子位於轉錄起始位點之下游。
術語「上游」係指位於參照核苷酸序列之5'之核苷酸序列。
如本文所用術語「調節區」係指位於編碼區上游(5'非編碼序列)、編碼區內或編碼區下游(3'非編碼序列)之核苷酸序列，且其影響相關編碼區之轉錄、RNA處理、穩定性或轉譯。調節區可包括啟動子、轉譯前導序列、內含子、多聚腺苷酸化識別序列、RNA處理位點、效應物結合位點、UTR及莖環結構。若意欲在真核細胞中表現編碼區，則多聚腺苷酸化信號及轉錄終止序列通常將位於編碼序列之3'。
如本文所用術語「轉錄物」可係指藉由DNA轉錄合成且在處理後變成信使RNA(mRNA)之初級轉錄物，即前體信使RNA(前mRNA)及經處理mRNA自身。術語「轉錄物」可與「前mRNA」及「mRNA」互換使用。在DNA鏈轉錄為初級轉錄物後，新近合成之初級轉錄物以若干種方式經修飾以轉化為其成熟功能形式，以產生不同蛋白質及RNA，例如mRNA、tRNA、rRNA、lncRNA、miRNA及其他。因此，術語「轉錄物」可包括外顯子、內含子、5' UTR及3' UTR。
如本文所用術語「表現」係指多核苷酸藉由其產生基因產物(例如RNA或多肽)之過程。其包括但不限於多核苷酸轉錄為信使RNA (mRNA)及mRNA轉譯為多肽。表現產生「基因產物」。如本文所用基因產物可為核酸，例如藉由基因轉錄產生之信使RNA，或自轉錄物轉譯之多肽。本文所述基因產物進一步包括具有轉錄後修飾(例如多聚腺苷酸化或剪接)之核酸，或具有轉譯後修飾(例如甲基化、糖基化、脂質加成、與其他蛋白質亞單位連接或溶蛋白性裂解)之多肽。
術語「一致」或「一致性」百分比在兩個或更多個核酸之情況下係指在比較並比對(若需要，引入空位)以獲得最大對應性時，兩個或更多個序列相同或具有指定百分比之相同核苷酸或胺基酸殘基，其中不將任何保守胺基酸取代視為序列一致性之一部分。一致性百分比可使用序列比較軟體或算法或藉由目視檢查來量測。可用於獲得胺基酸或核苷酸序列之比對之各種算法及軟體為業內已知。
序列比對算法之一個所述非限制性實例係闡述於Karlin等人，1990,Proc.Natl.Acad.Sci. ,87：2264-2268中之算法，其如Karlin等人，1993,Proc.Natl.Acad.Sci. ,90：5873-5877中所修改，且納入NBLAST及XBLAST程式中(Altschul等人，1997,Nucleic Acids Res. ,25：3389-3402)。在某些實施例中，可使用Gapped BLAST，如Altschul等人，1997,Nucleic Acids Res. 25：3389-3402中所述。BLAST-2、WU-BLAST-2(Altschul等人，1996,Methods in Enzymology ,266：460-480)、ALIGN、ALIGN-2(Genentech,South San Francisco,California)或Megalign(DNASTAR)係其他可用於比對序列之可公開獲得之軟體程式。在某些實施例中，兩個核苷酸序列之間之一致性百分比係使用GCG軟體包中之GAP程式來測定(例如，使用NWSgapdna.CMP矩陣及40、50、60、70或90之空位權重及1、2、3、4、5或6之長度權重)。在某些替代性實施例中，可使用GCG軟體包中納入Needleman及Wunsch之算法(J.Mol.Biol. (48)：444-453(1970))之GAP程式來測定兩個胺基酸序列之間之一致性百分比(例如，使用BLOSUM 62矩陣或 PAM250矩陣，及16、14、12、10、8、6或4之空位權重及1、2、3、4、5之長度權重)。或者，在某些實施例中，核苷酸或胺基酸序列之間之一致性百分比可使用Myers及Miller之算法(CABIOS,4：11-17(1989))來測定。舉例而言，一致性百分比可使用ALIGN程式(2.0版)及使用PAM120以殘基表、12之空位長度罰分及4之空位罰分來測定。熟習此項技術者可確定用於特定比對軟體之最大比對之適當參數。在某些實施例中，使用比對軟體之默認參數。
在某些實施例中，第一核苷酸序列對第二核苷酸序列之一致性百分比「X」係按100×(Y/Z)來計算，其中Y係在第一與第二序列之比對(如藉由目視檢查或特定序列比對程式來比對)中評為一致匹配之胺基酸殘基數，且Z係第二序列中之殘基總數。若第一序列之長度長於第二序列，則第一序列對第二序列之一致性百分比將高於第二序列對第一序列之一致性百分比。
與多核苷酸參照序列比對之單一多核苷酸靶序列內之不同區域可各自具有其自身的序列一致性百分比。應注意，序列一致性百分比值舍入至小數點後一位。舉例而言，將80.11、80.12、80.13及80.14向下舍入至80.1，而將80.15、80.16、80.17、80.18及80.19向上舍入至80.2。亦應注意，長度值將始終為整數。
如本文所用術語「同源的」及「同源性」可與術語「一致性」及「一致的」互換。
術語「其天然變體」係指天然存在於確定分類群(例如哺乳動物，例如小鼠、猴及人類)內之Tau多肽序列或MAPT 核酸序列(例如，轉錄物)之變體。通常，在提及多核苷酸之「天然變體」時，該術語亦可涵蓋藉由染色體移位或複製在染色體位置17q21發現之MAPT -編碼基因體DNA之任何等位基因變體及自其衍生之RNA，例如mRNA。 「天然變體」亦可包括自MAPT mRNA之選擇式剪接衍生之變體。在 提及具體多肽序列時，例如該術語亦包括蛋白質之天然形式，其可由此藉由例如共轉移修飾或轉譯後修飾(例如信號肽裂解、溶蛋白性裂解、糖基化等)來處理。
在測定本發明寡聚物(或其區域)與編碼哺乳動物Tau之核酸靶區域(例如，MAPT 基因，例如本文所揭示之彼等)之間之「互補性」程度中，「互補性」(亦指「同源性」或「一致性」)程度表示為寡聚物(或其區域)序列及與其最佳比對之靶區域(或靶區域之反向補體)序列之間之一致性百分比(或同源性百分比)。該百分比係藉由以下來計算：計數兩個序列之間一致之比對鹼基數，除以寡聚物中之鄰接單體總數，並乘以100。在此一比較中，若存在空位，則該等空位較佳僅係失配，而非空位內之單體數在本發明寡聚物與靶區域之間不同之區域。
如本文所用術語「補體」指示與參照序列互補之序列。眾所周知，互補性係DNA複製及轉錄之基本原理，此乃因其係兩個DNA或RNA序列之間共享之性質，使得在其彼此反向平行比對時，序列中每一位置之核苷酸鹼基將互補，非常類似於在鏡中觀察且見到事物反轉。因此，例如，5’「ATGC」3’之序列之補體可書寫為3’「TACG」5’或5’「GCAT」3’。如本文所用術語「反向補體」、「反向互補」及「反向互補性」可與術語「補體」、「互補」及「互補性」互換。
術語「對應於(corresponding to)」及「對應於(corresponds to)」在提及兩個單獨的核酸或核苷酸序列時可用於闡明基於同源性及/或功能性彼此對應或類似之序列區域，但具體序列之核苷酸可以不同方式編號。舉例而言，基因轉錄物之不同同種型可具有核苷酸序列之類似或保守部分，其編號可基於選擇式剪接及/或其他修飾而在各別同種型中有所不同。另外認識到，在表徵核酸或核苷酸序列時可採用不同編號系統(例如，基因轉錄物及是否自轉譯起始密碼子開始對序列 編號或是否包括5'UTR)。此外認識到，基因或基因轉錄物之不同變體之核酸或核苷酸序列可變。然而，如本文所用共享核酸或核苷酸序列同源性及/或功能性之變體區域被認為彼此「對應」。舉例而言，對應於SEQ ID NO：1(「參照序列」)中核苷酸X至Y之MAPT 轉錄物之核苷酸序列係指與SEQ ID NO：1之核苷酸X至Y具有一致序列或類似序列之MAPT 轉錄物序列(例如，MAPT 前mRNA或mRNA)。熟習此項技術者可藉由比對MAPT 轉錄物序列與SEQ ID NO：1來鑑別MAPT 轉錄物序列中之對應X及Y殘基。
術語「相應核苷酸類似物」及「相應核苷酸」意欲指示，核苷酸類似物及天然核苷酸中之核鹼基具有相同的配對或雜交能力。舉例而言，在核苷酸之2-去氧核糖單元連接至腺嘌呤時，「相應核苷酸類似物」含有連接至腺嘌呤之戊糖單元(與2-去氧核糖不同)。
如本文所用術語「設計」或「寡聚物設計」或「ASO序列」係指給定序列中之核苷酸(例如，DNA)及核苷酸類似物(例如，LNA)模式。如本文所用寡聚物之設計係藉由大寫字母與小寫字母之組合來顯示。舉例而言，tatttccaaattcactttta(SEQ ID NO：573)之寡聚物序列可具有以下寡聚物設計：ASO-002350(TAtTTccaaattcactTTTA)、ASO-002374(TAtTTccaaattcacTtTTA)、ASO-002386(TATTtccaaattcaCTttTA)、ASO-002227(TATtTccaaattcactTTTA)、ASO-002245(TAttTCcaaattcactTTTA)、ASO-002261(TATtTccaaattcacTTtTA)、ASO-002276(ATttCcaaattcactTTTA)、ASO-002228(TATTtccaaattcaCtTtTA)、ASO-002255(TATTtccaaattcactTTTA)、ASO-002285(TATTtccaaattcacTTtTA)、ASO-002230(TATTtccaaattcacTtTTA)、ASO-002256(TATTtccaaattcAcTttTA)或ASO-002279(TATTtccaaattcActTtTA)，其中大寫字母指示核苷酸類似物(例如，LNA)且小寫字母指示核苷酸(例 如，DNA)。
如本文所用術語寡聚物之「化學結構」係指寡聚物組份(例如核苷酸(例如，DNA)、核苷酸類似物(例如，β-D-氧基-LNA)、核苷酸鹼基(例如，A、T、G、C、U或MC)及主鏈結構(例如，硫代磷酸酯或磷酸二酯))之詳細說明。舉例而言，ASO-002350之化學結構可為OxyTs OxyAs DNAts OxyTs OxyTs DNAcs DNAcs DNAas DNAas DNAas DNAts DNAts DNAcs DNAas DNAcs DNAts OxyTs OxyTs OxyTs OxyAs。圖2、16B及20B列示可適用於本文所揭示寡聚物中之任一者之化學結構之非限制性實例。
除非另外陳述，否則「功效」通常表示為以μM、nM或pM計之IC50 或EC50 值。功效亦可根據抑制百分比來表示。IC50 係治療分子之中值抑制濃度。EC50 係治療分子相對於媒劑或鹽水對照之中值有效濃度。在功能分析中，IC50 係將生物反應(例如mRNA轉錄或蛋白質表現)降低藉由治療分子達成之生物反應之50%之濃度。在功能分析中，EC50 係治療分子產生50%之生物反應(例如mRNA轉錄或蛋白質表現)之濃度。IC50 或EC50 可藉由任一數目之業內已知方式來計算。
「個體(subject)」或「個人(individual)」或「動物」或「患者」或「哺乳動物」意指期望對其診斷、預後或治療之任何個體，尤其哺乳動物個體。哺乳動物個體包括人類、家畜、農場動物、體育動物及動物園動物，包括例如人類、非人類靈長類動物、犬、貓、天竺鼠、兔、大鼠、小鼠、馬、牛、熊等等。
術語「醫藥組合物」係指一種製劑，其呈允許活性成份之生物活性有效之形式，且其不含對投與該組合物之個體具有不可接受毒性的其他組份。該組合物可為無菌的。
如本文所揭示寡聚物之「有效量」係足以實施明確陳述之目的之量。「有效量」可根據所陳述目的，憑經驗及以常規方式確定。
諸如「治療(treating)」或「治療(treatment)」或「欲治療」或「緩和」或「欲緩和」等術語係指(1)治癒、減慢、減輕所診斷病理性病況或病症之症狀及/或停止該所診斷病理性病況或病症之進展之治療措施及(2)預防性或預防性措施預防及/或減慢靶向病理性病況或病症之發展二者。因此，彼等需要治療者包括彼等已患有該病症者；彼等易患該病症者；及彼等欲預防該病症者。在某些實施例中，若患者顯示例如與疾病或病症相關之症狀完全、部分或短暫緩和或消除，則根據本文所提供方法成功「治療」個體之本文其他地方揭示之疾病或病況。
II. 寡聚物
本發明採用寡聚化合物(本文中稱作寡聚物)用於調節編碼哺乳動物Tau之核酸分子(例如MAPT 核酸，例如MAPT 轉錄物，包括MAPT 前mRNA及MAPT mRNA)或該等編碼哺乳動物Tau之核酸分子之天然變體之功能。在本發明情況中之術語「寡聚物」係指藉由兩個或更多個核苷酸之共價鍵聯形成之分子(即，寡核苷酸)。
寡聚物包含約10至約50、例如10-20、16-20、15-25、10-30、10-35、10-40或10-45個核苷酸之長度之鄰接核苷酸序列。如本文所用術語「反義寡聚物」、「反義寡核苷酸」及「ASO」可與術語「寡聚物」互換。
所提及SEQ ID編號包括特定核鹼基序列，但不包括如圖2、3、6、7、16A、16B、20A或20B所示之寡聚物設計。此外，本文圖中所揭示之寡聚物顯示代表性設計，但不限於表中所顯示之具體設計。在本文中，單一核苷酸(單元)亦可稱為單體或單元。在本說明書提及具體ASO編號(或寡聚物名稱)時，所涉及者包括具體寡聚物設計。舉例而言，在一技術方案(或本說明書)列舉SEQ ID NO：803時，其包括核苷酸序列actttatttccaaattcacttttac。在一技術方案(或本說明書)列舉 ASO-002019時，其包括具有圖中所示寡聚物設計(即，ActtTatttccaaattcactTTtaC)之核苷酸序列actttatttccaaattcacttttac。或者，ASO-002019可書寫為ActtTatttccaaattcactTTtaC，其中大寫字母係經修飾核苷酸(例如，LNA)且小寫字母係未經修飾核苷酸(例如，DNA)。ASO-002019亦可書寫為SEQ ID NO：803，其中來自5'端之第一核苷酸、第五核苷酸、第21核苷酸、第22核苷酸及第25核苷酸中之每一者係經修飾核苷酸，例如LNA，且其他核苷酸中之每一者係未經修飾核苷酸(例如，DNA)。本發明寡聚物亦可書寫為具有圖2中所示化學結構之SEQ ID NO：803，即OxyAs OxyMCs DNAts DNAts OxyTs DNAas DNAts DNAts DNAts DNAcs DNAcs DNAas DNAas DNAas DNAts DNAts DNAcs DNAas DNAcs DNAts OxyTs OxyTs DNAts DNAas OxyMC。
在各個實施例中，本發明寡聚物不包含RNA(單元)。在一些實施例中，寡聚物包含一或多個DNA單元。在一個實施例中，本發明寡聚物係線性分子或係作為線性分子合成。在一些實施例中，寡聚物係單鏈分子，且不包含例如至少3、4或5個鄰接核苷酸與相同寡聚物內之等效區域互補之短區域(即雙螺旋體(duplexes))，就此而言，該寡聚物並非(基本上)雙鏈。在一些實施例中，寡聚物基本上並非雙鏈。在一些實施例中，寡聚物並非siRNA。在各個實施例中，本發明寡聚物可完全由鄰接核苷酸區域組成。因此，在一些實施例中，寡聚物實質上並非自補。
在其他實施例中，本發明包括寡聚物之片段。舉例而言，本發明包括本文所揭示寡聚物之至少1個核苷酸、至少2個鄰接核苷酸、至少3個鄰接核苷酸、至少4個鄰接核苷酸、至少5個鄰接核苷酸、至少6個鄰接核苷酸、至少7個鄰接核苷酸、至少8個鄰接核苷酸或至少9個鄰接核苷酸。涵蓋本文所揭示序列中之任一者之片段作為本發明之一 部分。
II.A. 靶
適宜地，本發明寡聚物能下調(例如，降低或移除)MAPT mRNA或蛋白質之表現。就此而言，本發明寡聚物通常可在哺乳動物細胞、例如人類細胞、例如神經元細胞中影響經由降低Tau mRNA含量對Tau蛋白之間接抑制。
處於與疾病相關之病理性狀態下之微管相關蛋白tau(MAPT)亦稱為神經原纖維纏結蛋白或成對螺旋絲-tau(PHF-tau)。已知MAPT之同義詞且包括DDPAC、FTDP-17L、MSTD、MTBT1、MTBT2、PPND、PPP1R103、MAPTL及TAU。MAPT 基因之序列可以可公開獲得之登錄號NC_000017.11發現，且MAPT前mRNA轉錄物之序列可以可公開獲得之登錄號NG_007398(SEQ ID NO：1)發現。Tau蛋白之序列可以以下可公開獲得之登錄號發現：P10636、P18518、Q14799、Q15549、Q15550、Q15551、Q1RMF6、Q53YB1、Q5CZI7、Q5XWF0、Q6QT54、Q9UDJ3、Q9UMH0、Q9UQ96，其各自係全部內容以引用方式併入本文中。MAPT 基因產物之天然變體為人已知。舉例而言，Tau蛋白之天然變體可含有一或多個選自以下之胺基酸取代：R5H、R5L、D285N、V289A、K574T、L583V、G589V、N596K、N613H、P618L、P618S、G620V、S622N、K634M、S637F、V654M、E659V、K686I、G706R、R723W及其任何組合。因此，本發明寡聚物可經設計以降低或抑制Tau蛋白之天然變體之表現。
已知Tau中之突變可引起一或多種病理狀況。本發明寡聚物可用於降低或抑制含有一或多個突變之SNP或選擇式剪接之MAPT 轉錄物之表現並因此降低突變Tau蛋白之形成。Tau蛋白突變體之實例包括但不限於包含一或多個選自以下之突變之Tau蛋白：S515E、S516E、 S519E、S531A、T548A、T548E、S552A、S552E、S579A、S713E、S721E、S726E、S730E、S739E及其任何組合。本發明寡聚物可經設計以降低或抑制Tau蛋白之任何突變體之表現。
寡聚物之靶核酸序列之實例係MAPT 前mRNA或MAPT mRNA。圖1A中之SEQ ID NO：1代表MAPT 基因體序列。SEQ ID NO：1與MAPT 前mRNA序列一致，但SEQ ID NO：1中之核苷酸「t」在前mRNA中顯示為「u」。圖1B中之SEQ ID NO：2代表MAPT mRNA序列，但SEQ ID NO：2中之核苷酸1在mRNA中顯示為「u」。在某些實施例中，「靶核酸」包含編碼Tau蛋白之核酸或其天然變體，以及自其衍生之RNA核酸，例如前mRNA或成熟mRNA。在一些實施例中，例如在用於研究或診斷中時，「靶核酸」可為衍生自上述DNA或RNA核酸靶之cDNA或合成寡核苷酸。在一個實施例中，MAPT 基因體序列顯示為基因庫登錄號NG_007398.1(SEQ ID NO：1)。已知MAPT 前mRNA之3’UTR區域對應於SEQ ID NO：1之核苷酸134,947-140,924。已知MAPT 前mRNA之5’UTR區域對應於SEQ ID NO：1之核苷酸1-72,917。對應於MAPT mRNA之MAPT cDNA以基因庫登錄號NM_016835.3(SEQ ID NO：2)而為人所知。參見圖1B。MAPT mRNA編碼之Tau蛋白序列顯示為SEQ ID NO：3。參見圖1C。
在一些實施例中，本發明寡聚物與MAPT 轉錄物(例如SEQ ID NO：1)之3' UTR內之區域雜交。在一些實施例中，本發明寡聚物與MAPT 轉錄物(例如SEQ ID NO：1)之3' UTR內之區域雜交，其中寡聚物具有如本文中別處所述之根據式5' A-B-C 3'之設計(例如，章節II.G，例如章節II.G.I)或本文中別處顯示之化學結構(例如，圖2、16B及20B)。在某些實施例中，寡聚物與MAPT 轉錄物(例如SEQ ID NO：1)之3' UTR內之區域雜交，且序列評分等於或大於約0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9或1.0。序列評分之計算方法揭示於本文 中之別處。
在一個實施例中，本發明寡聚物包含鄰接核苷酸序列，其與微管相關蛋白MAPT 轉錄物之3' UTR內之區域(例如對應於SEQ ID NO：1之3' UTR之區域)雜交。在另一實施例中，本發明寡聚物包含鄰接核苷酸序列，其與MAPT 轉錄物之核酸序列或該序列內之區域(「靶區域」)雜交，其中該核酸序列對應於SEQ ID NO：1之核苷酸134,947-138,940。在另一實施例中，本發明寡聚物包含鄰接核苷酸序列，其與MAPT 轉錄物之核酸序列或該序列內之區域雜交，其中該核酸序列對應於SEQ ID NO：1之核苷酸134,947-138,940，且其中寡聚物具有本文所述設計中之一者(例如，章節II.G.，例如間隔體設計，例如交替側接間隔體設計)或本文中別處顯示之化學結構(例如，圖2、16B及20B)。在另一實施例中，靶區域對應於SEQ ID NO：1之核苷酸134,947-138,924。在另一實施例中，靶區域對應於SEQ ID NO：1之核苷酸135,050-138,940；135,700-138,940；136,000-138,940；136,620-138,940；136,860-138,940；137,060-138,940；137,300-138,940；137,830-138,940；138,030-138,940；138,350-138,940；134,821-135,020；135,050-135,820；135,700-135,820；136,000-136,110；136,010-136,100；136,020-136,090；136,030-136,080；136,040-136,070；136,620-136,760；136,860-136,960；137,060-137,110；137,300-137,400；137,830-137,900；138,030-138,140；138,350-138,450；138,860-138,940；138,870-138,930；138,880-138,920；或138,890-138,920，其中視情況，寡聚物具有本文所述之設計(例如，章節II.G.I，例如間隔體設計，例如交替側接間隔體設計)或本文中別處顯示之化學結構(例如，圖2、16B及20B)。在另一實施例中，靶區域對應於SEQ ID NO：1之核苷酸135,050-138,940。在另一實施例中，靶區域對應於SEQ ID NO：1之核苷酸135,700-138,940。在另一實施例 中，靶區域對應於SEQ ID NO：1之核苷酸136,000-138,940。在另一實施例中，靶區域對應於SEQ ID NO：1之核苷酸136,620-138,940。在另一實施例中，靶區域對應於SEQ ID NO：1之核苷酸136,860-138,940。在另一實施例中，靶區域對應於SEQ ID NO：1之核苷酸137,060-138,940。在另一實施例中，靶區域對應於SEQ ID NO：1之核苷酸137,300-138,940。在另一實施例中，靶區域對應於SEQ ID NO：1之核苷酸137,830-138,940。在另一實施例中，靶區域對應於SEQ ID NO：1之核苷酸138,030-138,940。在另一實施例中，靶區域對應於SEQ ID NO：1之核苷酸138,350-138,940。在另一實施例中，靶區域對應於SEQ ID NO：1之核苷酸134,821-135,020。在另一實施例中，靶區域對應於SEQ ID NO：1之核苷酸135,050-138,820。在另一實施例中，靶區域對應於SEQ ID NO：1之核苷酸135,700-135,820。在其他實施例中，靶區域對應於SEQ ID NO：1之核苷酸136,620-136,760。在一些實施例中，靶區域對應於SEQ ID NO：1之核苷酸136,860-136,960。在某些實施例中，靶區域對應於SEQ ID NO：1之核苷酸137,060-137,110。在其他實施例中，靶區域對應於SEQ ID NO：1之核苷酸137,300-137,400。在其他實施例中，靶區域對應於SEQ ID NO：1之核苷酸137,830-137,900。在其他實施例中，靶區域對應於SEQ ID NO：1之核苷酸138,030-138,140。在某些實施例中，靶區域對應於SEQ ID NO：1之核苷酸138,350-138,450。在其他實施例中，靶區域對應於SEQ ID NO：1之核苷酸138,860-138,940。
在一些實施例中，靶區域對應於SEQ ID NO：1之核苷酸134,947-134,989、135,533-135,550、135,585-135,605、135,690-135,710、135,739-135,769、135,775-135,792、136,049-136,070、136,053-136,068；136,650-136,667、136,693-136,723、136,896-136,926、137,067-137,089、137,326-137,373、137,851-137,883、138,058- 138,119、138,377-138,394、138,401-138,420、138,884-138,908；138,401-138,908；138,377-138,908；138,058-138,908；137,851-138,908；137,326-138,908；137,067-138,908；136,896-138,908；136,693-138,908；136,650-138,908；136,049-138,908；135,775-138,908；135,739-138,908；或134,947-138,908，其中視情況，寡聚物具有本文中別處所述之設計(例如，章節II.G，例如間隔體設計，例如交替側接間隔體設計)。在另一實施例中，靶區域對應於SEQ ID NO：1之核苷酸134,947-134,989。在另一實施例中，靶區域對應於SEQ ID NO：1之核苷酸135,533-135,550。在另一實施例中，靶區域對應於SEQ ID NO：1之核苷酸135,585-135,605。在另一實施例中，靶區域對應於SEQ ID NO：1之核苷酸135,690-135,710。在另一實施例中，靶區域對應於SEQ ID NO：1之核苷酸135,739-135,769。在另一實施例中，靶區域對應於SEQ ID NO：1之核苷酸135,775-135,792。在另一實施例中，靶區域對應於SEQ ID NO：1之核苷酸136,049-136,070。在另一實施例中，靶區域對應於SEQ ID NO：1之核苷酸136,053-136,068。在另一實施例中，靶區域對應於SEQ ID NO：1之核苷酸136,650-136,667。在另一實施例中，靶區域對應於SEQ ID NO：1之核苷酸136,693-136,723。在另一實施例中，靶區域對應於SEQ ID NO：1之核苷酸136,896-136,926。在另一實施例中，靶區域對應於SEQ ID NO：1之核苷酸137,067-137,089。在另一實施例中，靶區域對應於SEQ ID NO：1之核苷酸137,326-137,373。在另一實施例中，靶區域對應於SEQ ID NO：1之核苷酸137,851-137,883。在另一實施例中，靶區域對應於SEQ ID NO：1之核苷酸138,058-138,119。在另一實施例中，靶區域對應於SEQ ID NO：1之核苷酸138,377-138,394。在另一實施例中，靶區域對應於SEQ ID NO：1之核苷酸138,401-138,420。在另一實施例中，靶區域對應於SEQ ID NO：1之核苷酸138,884-138,908。
在其他實施例中，靶區域對應於SEQ ID NO：1之核苷酸138,401-138,908。在其他實施例中，靶區域對應於SEQ ID NO：1之核苷酸138,377-138,908。在其他實施例中，靶區域對應於SEQ ID NO：1之核苷酸138,058-138,908。在其他實施例中，靶區域對應於SEQ ID NO：1之核苷酸137,851-138,908。在其他實施例中，靶區域對應於SEQ ID NO：1之核苷酸137,326-138,908。在其他實施例中，靶區域對應於SEQ ID NO：1之核苷酸137,067-138,908。在其他實施例中，靶區域對應於SEQ ID NO：1之核苷酸136,896-138,908。在其他實施例中，靶區域對應於SEQ ID NO：1之核苷酸136,693-138,908。在其他實施例中，靶區域對應於SEQ ID NO：1之核苷酸136,650-138,908。在其他實施例中，靶區域對應於SEQ ID NO：1之核苷酸136,049-138,908。在其他實施例中，靶區域對應於SEQ ID NO：1之核苷酸135,775-138,908。在其他實施例中，靶區域對應於SEQ ID NO：1之核苷酸135,739-138,908。
在其他實施例中，靶區域對應於SEQ ID NO：1之核苷酸136,053-136,068且在3'端、5'端或兩端+1、+2、+3、+4、+5、+6、+7、+8、+9、+10、+11、+12、+13、+14、+15、+20、+25、+30、+35、+40、+45或+50個核苷酸。在某些實施例中，靶區域對應於SEQ ID NO：1之核苷酸138,884-138,908且在3'端、5'端或兩端+1、+2、+3、+4、+5、+6、+7、+8、+9、+10、+11、+12、+13、+14、+15、+20、+25、+30、+35、+40、+45或+50個SEQ ID NO：1之核苷酸。
在一些實施例中，本發明寡聚物與MAPT 轉錄物(例如SEQ ID NO：1)之5' UTR內之區域雜交。在一些實施例中，本發明寡聚物與MAPT 轉錄物(例如SEQ ID NO：1)之5' UTR內之區域雜交，其中寡聚物具有如本文中別處所述之根據式5' A-B-C 3'之設計(例如，章節II.G，例如章節II.G.I)或本文中別處顯示之化學結構(例如，圖2、16B及 20B)。在某些實施例中，寡聚物與MAPT 轉錄物(例如SEQ ID NO：1)之5' UTR內之區域雜交，且序列評分等於或大於約0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9或1.0。序列評分之計算方法揭示於本文中之別處。
在一些實施例中，本發明寡聚物與MAPT 轉錄物(例如SEQ ID NO：1)之外顯子2內之區域雜交。在一些實施例中，本發明寡聚物與MAPT 轉錄物(例如SEQ ID NO：1)之外顯子2內之區域雜交，其中寡聚物具有如本文中別處所述之根據式5' A-B-C 3'之設計(例如，章節II.G，例如章節II.G.I)或本文中別處顯示之化學結構(例如，圖2、16B及20B)。在某些實施例中，寡聚物與MAPT 轉錄物(例如SEQ ID NO：1)之外顯子2內之區域雜交，且序列評分等於或大於約0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9或1.0。序列評分之計算方法揭示於本文中之別處。
在一個實施例中，本發明寡聚物包含鄰接核苷酸序列，其與微管相關蛋白MAPT 轉錄物中5' UTR及/或外顯子2內之區域(例如對應於SEQ ID NO：1之5' UTR及/或外顯子2之區域)雜交。在MAPT 轉錄物中，5' UTR及外顯子2重疊但不鄰接。在另一實施例中，本發明寡聚物包含鄰接核苷酸序列，其與MAPT 轉錄物之核酸序列或該序列內之區域(「靶區域」)雜交，其中該核酸序列對應於SEQ ID NO：1之核苷酸72,802-73,072。在另一實施例中，本發明寡聚物包含鄰接核苷酸序列，其與MAPT 轉錄物之核酸序列或該序列內之區域(「靶區域」)雜交，其中該核酸序列對應於SEQ ID NO：1之核苷酸72,802-73,072，且其中寡聚物具有本文所述設計中之一者(例如，章節II.G.，例如間隔體設計，例如交替側接間隔體設計)或本文中別處顯示之化學結構(例如，圖2、16B及20B)。在另一實施例中，靶區域對應於SEQ ID NO：1之核苷酸72,802-73,072；72,812-73,062；72,822-73,052；72,832- 73,042；72,842-73,032；72,852-73,022；72,862-73,012；72,872-73,002；72,882-72,992；72,892-72,982；或72,902-72,972，其中視情況，寡聚物具有本文所述之設計(例如，章節II.G.I，例如間隔體設計，例如交替側接間隔體設計)或本文中別處顯示之化學結構(例如，圖2、16B及20B)。在另一實施例中，靶區域對應於SEQ ID NO：1之核苷酸72,802-73,072。在另一實施例中，靶區域對應於SEQ ID NO：1之核苷酸72,812-73,062。在另一實施例中，靶區域對應於SEQ ID NO：1之核苷酸72,822-73,052。在另一實施例中，靶區域對應於SEQ ID NO：1之核苷酸72,832-73,042。在另一實施例中，靶區域對應於SEQ ID NO：1之核苷酸72,842-73,032。在另一實施例中，靶區域對應於SEQ ID NO：1之核苷酸72,852-73,022。在另一實施例中，靶區域對應於SEQ ID NO：1之核苷酸72,862-73,012。在另一實施例中，靶區域對應於SEQ ID NO：1之核苷酸72,872-73,002。在另一實施例中，靶區域對應於SEQ ID NO：1之核苷酸72,882-72,992。在另一實施例中，靶區域對應於SEQ ID NO：1之核苷酸72,892-72,982。在另一實施例中，靶區域對應於SEQ ID NO：1之核苷酸72,902-72,972。
在一些實施例中，靶區域對應於SEQ ID NO：1之核苷酸72,802-73,072；72,812-73,072；72,822-73,072；72,832-73,072；72,842-73,072；72,852-73,072；72,862-73,072；72,872-73,072；72,882-73,072；72,892-73,072；72,902-73,072；72,802-73,062；72,802-73,052；72,802-73,042；72,802-73,032；72,802-73,022；72,802-73,012；72,802-73,002；72,802-72,992；72,802-73,982；或72,802-73,972，其中視情況，寡聚物具有本文中別處所述之設計(例如，章節II.G，例如間隔體設計，例如交替側接間隔體設計)或本文中別處顯示之化學結構(例如，圖2、16B及20B)。在另一實施例中，靶區域對應於SEQ ID NO：1之核苷酸72,802-73,072。在另一實施例中，靶區域 對應於SEQ ID NO：1之核苷酸72,812-73,072。在另一實施例中，靶區域對應於SEQ ID NO：1之核苷酸72,822-73,072。在另一實施例中，靶區域對應於SEQ ID NO：1之核苷酸72,832-73,072。在另一實施例中，靶區域對應於SEQ ID NO：1之核苷酸72,842-73,072。在另一實施例中，靶區域對應於SEQ ID NO：1之核苷酸72,852-73,072。在另一實施例中，靶區域對應於SEQ ID NO：1之核苷酸72,862-73,072。在另一實施例中，靶區域對應於SEQ ID NO：1之核苷酸72,872-73,072。在另一實施例中，靶區域對應於SEQ ID NO：1之核苷酸72,882-73,072。在另一實施例中，靶區域對應於SEQ ID NO：1之核苷酸72,892-73,072。在另一實施例中，靶區域對應於SEQ ID NO：1之核苷酸72,902-73,072。在另一實施例中，靶區域對應於SEQ ID NO：1之核苷酸72,802-73,062。在另一實施例中，靶區域對應於SEQ ID NO：1之核苷酸72,802-73,052。在另一實施例中，靶區域對應於SEQ ID NO：1之核苷酸72,802-73,042。在另一實施例中，靶區域對應於SEQ ID NO：1之核苷酸72,802-73,032。在另一實施例中，靶區域對應於SEQ ID NO：1之核苷酸72,802-73,022。在另一實施例中，靶區域對應於SEQ ID NO：1之核苷酸72,802-73,012。在另一實施例中，靶區域對應於SEQ ID NO：1之核苷酸72,802-73,002。在另一實施例中，靶區域對應於SEQ ID NO：1之核苷酸72,802-72,992。在另一實施例中，靶區域對應於SEQ ID NO：1之核苷酸72,802-73,982。在另一實施例中，靶區域對應於SEQ ID NO：1之核苷酸72,802-73,972。
在一些實施例中，靶區域對應於SEQ ID NO：1之核苷酸72,862-73,012；72,872-73,012；72,882-73,012；72,892-73,012；72,902-73,012；72,862-73,002；72,872-73,002；72,882-73,002；72,892-73,002；72,902-73,002；72,862-72,992；72,872-72,992；72,882-72,992；72,892-72,992；72,902-72,992；72,862-72,982；72,872- 72,982；72,882-72,982；72,892-72,982；72,902-72,982；72,862-72,972；72,872-72,972；72,882-72,972；72,892-72,972；或72,902-72,972，其中視情況，寡聚物具有本文中別處所述之設計(例如，章節II.G，例如間隔體設計，例如交替側接間隔體設計)或本文中別處顯示之化學結構(例如，圖2、16B及20B)。在另一實施例中，靶區域對應於SEQ ID NO：1之核苷酸72,872-73,012。在另一實施例中，靶區域對應於SEQ ID NO：1之核苷酸72,882-73,012。在另一實施例中，靶區域對應於SEQ ID NO：1之核苷酸72,892-73,012。在另一實施例中，靶區域對應於SEQ ID NO：1之核苷酸72,902-73,012。在另一實施例中，靶區域對應於SEQ ID NO：1之核苷酸72,862-73,002。在另一實施例中，靶區域對應於SEQ ID NO：1之核苷酸72,872-73,002。在另一實施例中，靶區域對應於SEQ ID NO：1之核苷酸72,882-73,002。在另一實施例中，靶區域對應於SEQ ID NO：1之核苷酸72,892-73,002。在另一實施例中，靶區域對應於SEQ ID NO：1之核苷酸72,902-73,002。在另一實施例中，靶區域對應於SEQ ID NO：1之核苷酸72,862-72,992。在另一實施例中，靶區域對應於SEQ ID NO：1之核苷酸72,872-72,992。在另一實施例中，靶區域對應於SEQ ID NO：1之核苷酸72,882-72,992。在另一實施例中，靶區域對應於SEQ ID NO：1之核苷酸72,892-72,992。在另一實施例中，靶區域對應於SEQ ID NO：1之核苷酸72,902-72,992。在另一實施例中，靶區域對應於SEQ ID NO：1之核苷酸72,862-72,982。在另一實施例中，靶區域對應於SEQ ID NO：1之核苷酸72,872-72,982。在另一實施例中，靶區域對應於SEQ ID NO：1之核苷酸72,882-72,982。在另一實施例中，靶區域對應於SEQ ID NO：1之核苷酸72,892-72,982。在另一實施例中，靶區域對應於SEQ ID NO：1之核苷酸72,902-72,982。在另一實施例中，靶區域對應於SEQ ID NO：1之核苷酸72,862-72,972。在另一實施例中，靶區域對應於 SEQ ID NO：1之核苷酸72,872-72,972。在另一實施例中，靶區域對應於SEQ ID NO：1之核苷酸72,882-72,972。在另一實施例中，靶區域對應於SEQ ID NO：1之核苷酸72,892-72,972。在另一實施例中，靶區域對應於SEQ ID NO：1之核苷酸72,902-72,972。
在其他實施例中，靶區域對應於SEQ ID NO：1之核苷酸72,947-72,960。在其他實施例中，靶區域對應於SEQ ID NO：1之核苷酸72,946-72,961。在其他實施例中，靶區域對應於SEQ ID NO：1之核苷酸72,907-72,922。在其他實施例中，靶區域對應於SEQ ID NO：1之核苷酸72,948-72,963。在其他實施例中，靶區域對應於SEQ ID NO：1之核苷酸72,950-72,963。在其他實施例中，靶區域對應於SEQ ID NO：1之核苷酸72,945-72,960。在其他實施例中，靶區域對應於SEQ ID NO：1之核苷酸72,950-72,965。在其他實施例中，靶區域對應於SEQ ID NO：1之核苷酸72,944-72,959。在其他實施例中，靶區域對應於SEQ ID NO：1之核苷酸72,947-72,962。在其他實施例中，靶區域對應於SEQ ID NO：1之核苷酸72,952-72,965。
在其他實施例中，靶區域對應於SEQ ID NO：1之核苷酸72,946-72,959。在其他實施例中，靶區域對應於SEQ ID NO：1之核苷酸72,949-72,964。在其他實施例中，靶區域對應於SEQ ID NO：1之核苷酸72,951-72,964。在其他實施例中，靶區域對應於SEQ ID NO：1之核苷酸72,933-72,948。在其他實施例中，靶區域對應於SEQ ID NO：1之核苷酸72,934-72,949。在其他實施例中，靶區域對應於SEQ ID NO：1之核苷酸72,935-72,950。在其他實施例中，靶區域對應於SEQ ID NO：1之核苷酸72,932-72,951。在其他實施例中，靶區域對應於SEQ ID NO：1之核苷酸72,933-72,952。在其他實施例中，靶區域對應於SEQ ID NO：1之核苷酸72,934-72,953。在其他實施例中，靶區域對應於SEQ ID NO：1之核苷酸72,935-72,954。
在其他實施例中，靶區域對應於SEQ ID NO：1之核苷酸72,944-72,963。在其他實施例中，靶區域對應於SEQ ID NO：1之核苷酸72,945-72,964。在其他實施例中，靶區域對應於SEQ ID NO：1之核苷酸72,946-72,965。
在其他實施例中，靶區域對應於SEQ ID NO：1之核苷酸72,948-72,967。在其他實施例中，靶區域對應於SEQ ID NO：1之核苷酸72,933-72,949。在其他實施例中，靶區域對應於SEQ ID NO：1之核苷酸72,935-72,951。在其他實施例中，靶區域對應於SEQ ID NO：1之核苷酸72,936-72,953。在其他實施例中，靶區域對應於SEQ ID NO：1之核苷酸72,933-72,934。在其他實施例中，靶區域對應於SEQ ID NO：1之核苷酸72,934-72,950。在其他實施例中，靶區域對應於SEQ ID NO：1之核苷酸72,934-72,951。在其他實施例中，靶區域對應於SEQ ID NO：1之核苷酸72,933-72,954。在其他實施例中，靶區域對應於SEQ ID NO：1之核苷酸72,933-72,950。
在其他實施例中，本發明寡聚物包含鄰接核苷酸序列，其與MAPT 轉錄物之核酸序列或該序列內之區域(「靶區域」)雜交，其中該核酸序列對應於SEQ ID NO：1之核苷酸97,648-97,661，且其中寡聚物視情況具有本文所述設計中之一者(例如章節II.G.，例如間隔體設計，例如交替側接間隔體設計)或本文中別處顯示之化學結構(例如圖2、16B及20B)。
在其他實施例中，本發明寡聚物包含鄰接核苷酸序列，其與MAPT 轉錄物之核酸序列或該序列內之區域(「靶區域」)雜交，其中該核酸序列對應於SEQ ID NO：1之核苷酸134,749-134,764，且其中寡聚物視情況具有本文所述設計中之一者(例如章節II.G.，例如間隔體設計，例如交替側接間隔體設計)或本文中別處顯示之化學結構(例如圖2、16B及20B)。
在某些實施例中，本發明寡聚物能在生理條件(即活體內條件)下與靶核酸(例如MAPT 轉錄物)雜交。在一些實施例中，本發明寡聚物能在活體外與靶核酸(例如MAPT 轉錄物)雜交。在一些實施例中，本發明寡聚物能在活體外在嚴格條件下與靶核酸(例如MAPT 轉錄物)雜交。用於活體外雜交之嚴格條件尤其依賴於生產性細胞攝取、RNA可及性、溫度、締合自由能、鹽濃度及時間(參見例如Stanley T Crooks,Antisense Drug Technology：Principles,Strategies and Applications，第2版，CRC Press(2007))。通常，使用高至中等嚴格性條件進行活體外雜交，以使得能在基本上相似之核酸之間，而非不相似核酸之間雜交。嚴格雜交條件之實例包括在40℃下在5×鹽水-檸檬酸鈉(SSC)緩衝液(0.75M氯化鈉/0.075M檸檬酸鈉)中雜交1小時，之後將樣品在40℃下在1×SSC中洗滌10次並在室溫下在1×SSC緩衝液中洗滌5次。活體內雜交條件由控制反義寡核苷酸與靶序列之雜交之細胞內條件(例如，生理pH及細胞內離子條件)組成。可藉由相對低嚴格性條件在活體外模擬活體內條件。舉例而言，雜交可在活體外在2×SSC(0.3M氯化鈉/0.03M檸檬酸鈉)、0.1% SDS中在37℃下實施。可在37℃下使用含有4×SSC、0.1% SDS之洗滌溶液，且在1×SSC中在45℃下最終洗滌。
II.B. 寡聚物序列
本發明寡聚物包含對應於MAPT 轉錄物中區域之補體之鄰接核苷酸序列，例如對應於SEQ ID NO：1之核苷酸序列。
在某些實施例中，本發明提供10-50、例如10-30個核苷酸之長度之寡聚物，其包含總計10-30個核苷酸之鄰接核苷酸序列，其中該鄰接核苷酸序列與哺乳動物微管相關蛋白tau(MAPT )轉錄物(例如SEQ ID NO：1)或其天然變體之補體內之區域具有至少85%、90%、95%、98%或99%序列一致性。因此，例如，寡聚物與具有SEQ ID NO：1之 一部分之序列之單鏈核酸分子雜交。
寡聚物可包含與編碼哺乳動物Tau蛋白之核酸(例如，SEQ ID NO：1)之等效區域完全互補(完美互補)之鄰接核苷酸序列。寡聚物可包含與對應於SEQ ID NO：1之核苷酸134,947-138,940,135,050-138,940；135,700-138,940；136,000-138,940；136,620-138,940；136,860-138,940；137,060-138,940；137,300-138,940；137,830-138,940；138,030-138,940；138,350-138,940；134,821-135,020；135,050-135,820；135,700-135,820；.136,000-136,110；136,620-136,760；136,860-136,960；137,060-137,110；137,300-137,400；137,830-137,900；138,030-138,140；138,350-138,450；或138,860-138,940之核酸序列或該序列內之區域完全互補(完美互補)之鄰接核苷酸序列。此外，寡聚物可具有本文中別處所述之設計(例如，章節II.G.，例如間隔體設計，例如交替側接間隔體設計)或本文中別處顯示之化學結構(例如，圖2、16B及20B)。
寡聚物亦可包含與編碼哺乳動物Tau蛋白之核酸(例如，SEQ ID NO：1)之等效區域完全互補(完美互補)之鄰接核苷酸序列。寡聚物可包含與對應於SEQ ID NO：1之核苷酸72,862-73,012；72,872-73,012；72,882-73,012；72,892-73,012；72,902-73,012；72,862-73,002；72,872-73,002；72,882-73,002；72,892-73,002；72,902-73,002；72,862-72,992；72,872-72,992；72,882-72,992；72,892-72,992；72,902-72,992；72,862-72,982；72,872-72,982；72,882-72,982；72,892-72,982；72,902-72,982；72,862-72,972；72,872-72,972；72,882-72,972；72,892-72,972；或72,902-72,972之核酸序列或該序列內之區域完全互補(完美互補)之鄰接核苷酸序列。此外，寡聚物可具有本文中別處所述之設計(例如，章節II.G.，例如間隔體設計，例如交替側接間隔體設計)或本文中別處顯示之化學結構(例如，圖2、16B 及20B)。
在某些實施例中，本發明寡聚物之核苷酸序列或鄰接核苷酸序列與選自SEQ ID NO：4至803及901至935之序列(即，圖2、3、6及7中之序列)具有至少約80%序列一致性，例如至少85%、至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%序列一致性、至少97%序列一致性、至少98%序列一致性、至少99%序列一致性，例如100%序列一致性(同源)。在一些實施例中，寡聚物具有本文中別處所述之設計(例如，章節II.G.I，例如間隔體設計，例如交替側接間隔體設計)或本文中別處顯示之化學結構(例如，圖2、16B及20B)。
在其他實施例中，本發明寡聚物包含圖2、3、6、7、16A、16B、20A或20B中所揭示之至少一個寡聚物序列(例如，ASO編號)。在一些實施例中，本發明寡聚物包含圖2、3、6、7、16A、16B、20A或20B中所揭示之至少一個寡聚物序列(例如，ASO編號)，其中寡聚物在3'端較圖2、3、6、7、16A、16B、20A或20B中所揭示之ASO短1個核苷酸、2個核苷酸、3個核苷酸、4個核苷酸、5個核苷酸、6個核苷酸、7個核苷酸、8個核苷酸、9個核苷酸、10個核苷酸、11個核苷酸、12個核苷酸、13個核苷酸、14個核苷酸或15個核苷酸。在其他實施例中，本發明寡聚物包含圖2、3、6、7、16A、16B、20A或20B中所揭示之至少一個寡聚物序列(例如，ASO編號)，其中寡聚物在5'端較圖2、3、6、7、16A、16B、20A或20B中所揭示之ASO短1個核苷酸、2個核苷酸、3個核苷酸、4個核苷酸、5個核苷酸、6個核苷酸、7個核苷酸、8個核苷酸、9個核苷酸、10個核苷酸、11個核苷酸、12個核苷酸、13個核苷酸、14個核苷酸或15個核苷酸。在其他實施例中，本發明寡聚物包含圖2、3、6、7、16A、16B、20A或20B中所揭示之至少一個寡聚物序列(例如，ASO編號)，其中寡聚物在5'端及/或3'端 較圖2、3、6、7、16A、16B、20A或20B中所揭示之ASO短1個核苷酸、2個核苷酸、3個核苷酸、4個核苷酸、5個核苷酸、6個核苷酸、7個核苷酸、8個核苷酸、9個核苷酸、10個核苷酸、11個核苷酸、12個核苷酸、13個核苷酸、14個核苷酸或15個核苷酸。
在某些實施例中，本發明寡聚物包含與選自以下之核酸序列之補體內之區域具有至少約60%、至少約70%、至少約80%、至少約90%、至少約95%、至少約96%、至少約97%、至少約98%、至少約99%或100%序列一致性之核苷酸序列：SEQ ID NO：1之核苷酸134,947-134,989、135,739-135,769、135,775-135,792、136,049-136,070、136,053-136,068；136,650-136,667、136,693-136,723、136,896-136,926、137,067-137,089、137,326-137,373、137,851-137,883、138,058-138,119、138,377-138,394、138,401-138,420、138,884-138,924；138,401-138,924；138,377-138,924；138,058-138,924；137,851-138,924；137,326-138,924；137,067-138,924；136,896-138,924；136,693-138,924；136,650-138,924；136,049-138,924；135,775-138,924；135,739-138,924；134,947-138,924；134,947-138,940；134,909-138,924；134,871-138,924；及134,854-138,924。在一些實施例中，寡聚物具有本文中別處所述之設計(例如，章節II.G.，例如間隔體設計，例如交替側接間隔體設計)或本文中別處顯示之化學結構(例如，圖2、16B及20B)。
在某些實施例中，本發明寡聚物之核苷酸序列或鄰接核苷酸序列與選自SEQ ID NO：804至900之序列(即，圖16A或16B中之序列)具有至少約80%序列一致性，例如至少85%、至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%序列一致性、至少97%序列一致性、至少98%序列一致性、至少99%序列一致性，例如100%序列一致性(同源)。在一些實施例中，寡聚物具有本文中別處所 述之設計(例如，章節II.G.I，例如間隔體設計，例如交替側接間隔體設計)或本文中別處顯示之化學結構(例如，圖2、16B及20B)。
在某些實施例中，本發明寡聚物包含與選自以下之核酸序列之補體內之區域具有至少約60%、至少約70%、至少約80%、至少約90%、至少約95%、至少約96%、至少約97%、至少約98%、至少約99%或100%序列一致性之核苷酸序列：SEQ ID NO：1之核苷酸72,862-73,012；72,872-73,012；72,882-73,012；72,892-73,012；72,902-73,012；72,862-73,002；72,872-73,002；72,882-73,002；72,892-73,002；72,902-73,002；72,862-72,992；72,872-72,992；72,882-72,992；72,892-72,992；72,902-72,992；72,862-72,982；72,872-72,982；72,882-72,982；72,892-72,982；72,902-72,982；72,862-72,972；72,872-72,972；72,882-72,972；72,892-72,972；及72,902-72,972。在一些實施例中，寡聚物具有本文中別處所述之設計(例如，章節II.G.，例如間隔體設計，例如交替側接間隔體設計)或本文中別處顯示之化學結構(例如，圖2、16B及20B)。
在某些實施例中，本發明寡聚物包含與SEQ ID NO：1之核苷酸134,947-138,940之補體內之區域具有至少約60%、至少約70%、至少約80%、至少約90%、至少約95%、至少約96%、至少約97%、至少約98%、至少約99%或100%序列一致性之核苷酸序列，其中視情況，寡聚物具有本文所述之設計(例如，章節II.G.，例如間隔體設計，例如交替側接間隔體設計)或本文中別處顯示之化學結構(例如，圖2、16B及20B)。在某些實施例中，本發明寡聚物包含與SEQ ID NO：1之核苷酸135,700-138,940之補體內之區域具有至少約60%、至少約70%、至少約80%、至少約90%、至少約95%、至少約96%、至少約97%、至少約98%、至少約99%或100%序列一致性之核苷酸序列，其中視情況，寡聚物具有本文所述之設計(例如，章節II.G.，例如間隔體設計，例 如交替側接間隔體設計)或本文中別處顯示之化學結構(例如，圖2、16B及20B)。在某些實施例中，本發明寡聚物包含與SEQ ID NO：1之核苷酸136,000-138,940之補體內之區域具有至少約60%、至少約70%、至少約80%、至少約90%、至少約95%、至少約96%、至少約97%、至少約98%、至少約99%或100%序列一致性之核苷酸序列，其中視情況，寡聚物具有本文所述之設計(例如，章節II.G.，例如間隔體設計，例如交替側接間隔體設計)或本文中別處顯示之化學結構(例如，圖2、16B及20B)。在某些實施例中，本發明寡聚物包含與SEQ ID NO：1之核苷酸136,620-138,940之補體內之區域具有至少約60%、至少約70%、至少約80%、至少約90%、至少約95%、至少約96%、至少約97%、至少約98%、至少約99%或100%序列一致性之核苷酸序列，其中視情況，寡聚物具有本文所述之設計(例如，章節II.G.，例如間隔體設計，例如交替側接間隔體設計)或本文中別處顯示之化學結構(例如，圖2、16B及20B)。
在某些實施例中，本發明寡聚物包含與SEQ ID NO：1之核苷酸136,860-138,940之補體內之區域具有至少約60%、至少約70%、至少約80%、至少約90%、至少約95%、至少約96%、至少約97%、至少約98%、至少約99%或100%序列一致性之核苷酸序列，其中視情況，寡聚物具有本文所述之設計(例如，章節II.G.，例如間隔體設計，例如交替側接間隔體設計)或本文中別處顯示之化學結構(例如，圖2、16B及20B)。在某些實施例中，本發明寡聚物包含與SEQ ID NO：1之核苷酸137,060-138,940之補體內之區域具有至少約60%、至少約70%、至少約80%、至少約90%、至少約95%、至少約96%、至少約97%、至少約98%、至少約99%或100%序列一致性之核苷酸序列，其中視情況，寡聚物具有本文所述之設計(例如，章節II.G.，例如間隔體設計，例如交替側接間隔體設計)或本文中別處顯示之化學結構(例如，圖2、 16B及20B)。在某些實施例中，本發明寡聚物包含與SEQ ID NO：1之核苷酸137,300-138,940之補體內之區域具有至少約60%、至少約70%、至少約80%、至少約90%、至少約95%、至少約96%、至少約97%、至少約98%、至少約99%或100%序列一致性之核苷酸序列，其中視情況，寡聚物具有本文所述之設計(例如，章節II.G.，例如間隔體設計，例如交替側接間隔體設計)或本文中別處顯示之化學結構(例如，圖2、16B及20B)。
在某些實施例中，本發明寡聚物包含與SEQ ID NO：1之核苷酸137,830-138,940之補體內之區域具有至少約60%、至少約70%、至少約80%、至少約90%、至少約95%、至少約96%、至少約97%、至少約98%、至少約99%或100%序列一致性之核苷酸序列，其中視情況，寡聚物具有本文所述之設計(例如，章節II.G.，例如間隔體設計，例如交替側接間隔體設計)或本文中別處顯示之化學結構(例如，圖2、16B及20B)。在某些實施例中，本發明寡聚物包含與SEQ ID NO：1之核苷酸138,030-138,940之補體內之區域具有至少約60%、至少約70%、至少約80%、至少約90%、至少約95%、至少約96%、至少約97%、至少約98%、至少約99%或100%序列一致性之核苷酸序列，其中視情況，寡聚物具有本文中別處所述之設計(例如，章節II.G.，例如間隔體設計，例如交替側接間隔體設計)或本文中別處顯示之化學結構(例如，圖2、16B及20B)。在某些實施例中，本發明寡聚物包含與SEQ ID NO：1之核苷酸138,350-138,940之補體內之區域具有至少約60%、至少約70%、至少約80%、至少約90%、至少約95%、至少約96%、至少約97%、至少約98%、至少約99%或100%序列一致性之核苷酸序列，其中視情況，寡聚物具有本文中別處所述之設計(例如，章節II.G.，例如間隔體設計，例如交替側接間隔體設計)或本文中別處顯示之化學結構(例如，圖2、16B及20B)。在某些實施例中，本發明寡聚物包 含與SEQ ID NO：1之核苷酸136,000-136,110之補體內之區域具有至少約60%、至少約70%、至少約80%、至少約90%、至少約95%、至少約96%、至少約97%、至少約98%、至少約99%或100%序列一致性之核苷酸序列，其中視情況，寡聚物具有本文中別處所述之設計(例如，章節II.G.，例如間隔體設計，例如交替側接間隔體設計)或本文中別處顯示之化學結構(例如，圖2、16B及20B)。在其他實施例中，本發明寡聚物包含與SEQ ID NO：1之核苷酸138,860-138,940之補體內之區域具有至少約60%、至少約70%、至少約80%、至少約90%、至少約95%、至少約96%、至少約97%、至少約98%、至少約99%或100%序列一致性之核苷酸序列，其中視情況，寡聚物具有本文中別處所述之設計(例如，章節II.G.，例如間隔體設計，例如交替側接間隔體設計)或本文中別處顯示之化學結構(例如，圖2、16B及20B)。在某些實施例中，本發明寡聚物包含與SEQ ID NO：1之核苷酸138,884-138,908之補體內之區域具有至少約60%、至少約70%、至少約80%、至少約90%、至少約95%、至少約96%、至少約97%、至少約98%、至少約99%或100%序列一致性之核苷酸序列，其中視情況，寡聚物具有本文中別處所述之設計(例如，章節II.G.，例如間隔體設計，例如交替側接間隔體設計)或本文中別處顯示之化學結構(例如，圖2、16B及20B)。
在其他實施例中，本發明寡聚物與SEQ ID NO：1之核苷酸134,854-138,924之補體內之區域具有至少約60%、至少約70%、至少約80%、至少約90%、至少約95%、至少約96%、至少約97%、至少約98%、至少約99%或100%序列一致性，其中視情況，寡聚物具有本文中別處所述之設計(例如，章節II.G.，例如間隔體設計，例如交替側接間隔體設計)或本文中別處顯示之化學結構(例如，圖2、16B及20B)。在一些實施例中，本發明寡聚物與選自以下之核酸序列之補體 內之區域具有至少約60%、至少約70%、至少約80%、至少約90%、至少約95%、至少約96%、至少約97%、至少約98%、至少約99%或100%序列一致性：SEQ ID NO：1之核苷酸134,947-134,989、135,739-135,769、135,775-135,792、136,049-136,070、136,053-136,068；136,650-136,667、136,693-136,723、136,896-136,926、137,067-137,089、137,326-137,373、137,851-137,883、138,058-138,119、138,377-138,394、138,401-138,420、138,884-138,924；138,401-138,924；138,377-138,924；138,058-138,924；137,851-138,924；137,326-138,924；137,067-138,924；136,896-138,924；136,693-138,924；136,650-138,924；136,049-138,924；135,775-138,924；135,739-138,924；及134,947-138,924，其中視情況，寡聚物具有本文中別處所述之設計(例如，章節II.G.，例如間隔體設計，例如交替側接間隔體設計)或本文中別處顯示之化學結構(例如，圖2、16B及20B)。在一些實施例中，該區域位於SEQ ID NO：1之核苷酸134,947-134,989之補體內。在一些實施例中，該區域位於SEQ ID NO：1之核苷酸135,739-135,769之補體內。在一些實施例中，該區域位於SEQ ID NO：1之核苷酸135,775-135,792之補體內。在一些實施例中，該區域位於SEQ ID NO：1之核苷酸136,049-136,070之補體內。在一些實施例中，該區域位於SEQ ID NO：1之核苷酸136,053-136,068之補體內。在一些實施例中，該區域位於SEQ ID NO：1之核苷酸136,650-136,667之補體內。在一些實施例中，該區域位於SEQ ID NO：1之核苷酸136,693-136,723之補體內。在一些實施例中，該區域位於SEQ ID NO：1之核苷酸136,896-136,926之補體內。在一些實施例中，該區域位於SEQ ID NO：1之核苷酸137,067-137,089之補體內。
在其他實施例中，該區域位於SEQ ID NO：1之核苷酸137,326-137,373之補體內。在一些實施例中，該區域位於SEQ ID NO：1之核 苷酸137,851-137,883之補體內。在一些實施例中，該區域位於SEQ ID NO：1之核苷酸138,058-138,119之補體內。在一些實施例中，該區域位於SEQ ID NO：1之核苷酸138,377-138,394之補體內。在一些實施例中，該區域位於SEQ ID NO：1之核苷酸138,401-138,420之補體內。
在一些實施例中，該區域位於SEQ ID NO：1之核苷酸138,884-138,924之補體內。在一些實施例中，該區域位於SEQ ID NO：1之核苷酸138,401-138,924之補體內。在一些實施例中，該區域位於SEQ ID NO：1之核苷酸138,377-138,924之補體內。在一些實施例中，該區域位於SEQ ID NO：1之核苷酸138,058-138,924之補體內。在一些實施例中，該區域位於SEQ ID NO：1之核苷酸137,851-138,924之補體內。在一些實施例中，該區域位於SEQ ID NO：1之核苷酸137,326-138,924之補體內。在一些實施例中，該區域位於SEQ ID NO：1之核苷酸137,067-138,924之補體內。在一些實施例中，該區域位於SEQ ID NO：1之核苷酸136,896-138,924之補體內。在一些實施例中，該區域位於SEQ ID NO：1之核苷酸136,693-138,924之補體內。在一些實施例中，該區域位於SEQ ID NO：1之核苷酸136,650-138,924之補體內。在一些實施例中，該區域位於SEQ ID NO：1之核苷酸136,049-138,924之補體內。在一些實施例中，該區域位於SEQ ID NO：1之核苷酸135,775-138,924之補體內。在一些實施例中，該區域位於SEQ ID NO：1之核苷酸135,739-138,924之補體內。在一些實施例中，該區域位於SEQ ID NO：1之核苷酸134,947-138,924之補體內。
在一些實施例中，寡聚物(或其鄰接核苷酸部分)選自或包含選自由以下組成之群之序列中之一者：SEQ ID NO：4至803、901至953、956至958及960或其至少10個鄰接核苷酸之區域，其中寡聚物(或其鄰接核苷酸部分)與相應MAPT 轉錄物相比可視情況包含1、2、3或4個失配。
在一個實施例中，寡聚物可包含選自由以下組成之群之序列：ctttatttccaaattcactt[138888-138907](SEQ ID NO：676)；actttatttccaaattcact[138889-138908](SEQ ID NO：715)；tttatttccaaattcacttt[138887-138906](SEQ ID NO：644)；ttatttccaaattcactttt[138886-138905](SEQ ID NO：799)；atttccaaattcacttttac[138884-138903](SEQ ID NO：466)；atttccaaattcactttta[138885-138903](SEQ ID NO：559)；actttatttccaaattcactt[138888-138908](SEQ ID NO：680)；atttccaaattcactt[138888-138903](SEQ ID NO：686)；tatttccaaattcactttta[13885-138904](SEQ ID NO：526)；aataactttatttcca[138897-138912](SEQ ID NO：773)；agtaataactttatt[138901-138915](SEQ ID NO：782)；tttccaaattcactt[138888-138902](SEQ ID NO：684)；agagtaataactttat[138902-138917](SEQ ID NO：784)；agtaataactttattt[138900-138915](SEQ ID NO：780)；agagtaataacttta[138903-138917](SEQ ID NO：786)；ttaatcagagtaataa[138908-138923](SEQ ID NO：795)；tttaatcagagtaat[138910-138924](SEQ ID NO：798)；aatcagagtaataac[138907-138921](SEQ ID NO：794)；tttaatcagagtaata[138909-139924](SEQ ID NO：797)；taatcagagtaataa[138908-138922](SEQ ID NO：796)；ctttatttccaaattcact[138889-138907](SEQ ID NO：713)；或ctttatttccaaattcac[138890-138907](SEQ ID NO：739)。在具體實施例中，寡聚物包含atttccaaattcacttttac[138884-138903](SEQ ID NO：466)。在一個實施例中，寡聚物(或其鄰接核苷酸部分)針對所選序列視情況具有1、2、3或4個失配。在另一實施例中，寡聚物視情況包含一或多個核苷酸類似物。在其他實施例中，寡聚物具有本文中別處所述之設計(例如，章節II.G.I，例如間隔體設計，例如交替側接間隔體設計)或本文中別處顯示之化學結構(例如，圖2、16B及20B)。可 用於本發明之核苷酸類似物之非限制性實例揭示於本文中之別處。
在其他實施例中，本發明寡聚物包含一核苷酸序列，基本上由其組成，或由其組成，該核苷酸序列與以下SEQ ID NO具有至少約60%、至少約70%、至少約80%、至少約90%、至少約95%、至少約96%、至少約97%、至少約98%、至少約99%或100%序列一致性：939、940、524、941、942、943、944、945、946、947、948、949、950、956、957、958、951、952或953。在一些實施例中，與SEQ ID NO：939、940、524、941、942、943、944、945、946、947、948、949、950、956、957、958、951、952或953具有序列一致性之寡聚物分別具有以下之設計：ASO-257283、ASO-257284、ASO-002263、ASO-002627、ASO-002677、ASO-002670、ASO-002663、ASO-002635、ASO-002643、ASO-002671、ASO-002664、ASO-002626、ASO-002634、ASO-002678、ASO-002650、ASO-002657、ASO-002642、ASO-002649或ASO-002656。
在某些實施例中，本發明寡聚物包含與SEQ ID NO：1之核苷酸72,802-73,072之補體內之區域具有至少約60%、至少約70%、至少約80%、至少約90%、至少約95%、至少約96%、至少約97%、至少約98%、至少約99%或100%序列一致性之核苷酸序列，其中視情況，寡聚物具有本文所述之設計(例如，章節II.G.，例如間隔體設計，例如交替側接間隔體設計)或本文中別處顯示之化學結構(例如，圖2、16B及20B)。在某些實施例中，本發明寡聚物包含與SEQ ID NO：1之核苷酸72,812-73,062之補體內之區域具有至少約60%、至少約70%、至少約80%、至少約90%、至少約95%、至少約96%、至少約97%、至少約98%、至少約99%或100%序列一致性之核苷酸序列，其中視情況，寡聚物具有本文所述之設計(例如，章節II.G.，例如間隔體設計，例如交替側接間隔體設計)或本文中別處顯示之化學結構(例如，圖2、16B 及20B)。在某些實施例中，本發明寡聚物包含與SEQ ID NO：1之核苷酸72,822-73,052之補體內之區域具有至少約60%、至少約70%、至少約80%、至少約90%、至少約95%、至少約96%、至少約97%、至少約98%、至少約99%或100%序列一致性之核苷酸序列，其中視情況，寡聚物具有本文所述之設計(例如，章節II.G.，例如間隔體設計，例如交替側接間隔體設計)或本文中別處顯示之化學結構(例如，圖2、16B及20B)。在某些實施例中，本發明寡聚物包含與SEQ ID NO：1之核苷酸72,832-73,042之補體內之區域具有至少約60%、至少約70%、至少約80%、至少約90%、至少約95%、至少約96%、至少約97%、至少約98%、至少約99%或100%序列一致性之核苷酸序列，其中視情況，寡聚物具有本文所述之設計(例如，章節II.G.，例如間隔體設計，例如交替側接間隔體設計)或本文中別處顯示之化學結構(例如，圖2、16B及20B)。在某些實施例中，本發明寡聚物包含與SEQ ID NO：1之核苷酸72,842-73,032之補體內之區域具有至少約60%、至少約70%、至少約80%、至少約90%、至少約95%、至少約96%、至少約97%、至少約98%、至少約99%或100%序列一致性之核苷酸序列，其中視情況，寡聚物具有本文所述之設計(例如，章節II.G.，例如間隔體設計，例如交替側接間隔體設計)或本文中別處顯示之化學結構(例如，圖2、16B及20B)。在某些實施例中，本發明寡聚物包含與SEQ ID NO：1之核苷酸72,852-73,022之補體內之區域具有至少約60%、至少約70%、至少約80%、至少約90%、至少約95%、至少約96%、至少約97%、至少約98%、至少約99%或100%序列一致性之核苷酸序列，其中視情況，寡聚物具有本文所述之設計(例如，章節II.G.，例如間隔體設計，例如交替側接間隔體設計)或本文中別處顯示之化學結構(例如，圖2、16B及20B)。在某些實施例中，本發明寡聚物包含與SEQ ID NO：1之核苷酸72,862-73,012之補體內之區域具有至少約60%、至少約70%、至少 約80%、至少約90%、至少約95%、至少約96%、至少約97%、至少約98%、至少約99%或100%序列一致性之核苷酸序列，其中視情況，寡聚物具有本文所述之設計(例如，章節II.G.，例如間隔體設計，例如交替側接間隔體設計)或本文中別處顯示之化學結構(例如，圖2、16B及20B)。在某些實施例中，本發明寡聚物包含與SEQ ID NO：1之核苷酸72,872-73,002之補體內之區域具有至少約60%、至少約70%、至少約80%、至少約90%、至少約95%、至少約96%、至少約97%、至少約98%、至少約99%或100%序列一致性之核苷酸序列，其中視情況，寡聚物具有本文所述之設計(例如，章節II.G.，例如間隔體設計，例如交替側接間隔體設計)或本文中別處顯示之化學結構(例如，圖2、16B及20B)。在某些實施例中，本發明寡聚物包含與SEQ ID NO：1之核苷酸72,882-72,992之補體內之區域具有至少約60%、至少約70%、至少約80%、至少約90%、至少約95%、至少約96%、至少約97%、至少約98%、至少約99%或100%序列一致性之核苷酸序列，其中視情況，寡聚物具有本文所述之設計(例如，章節II.G.，例如間隔體設計，例如交替側接間隔體設計)或本文中別處顯示之化學結構(例如，圖2、16B及20B)。在某些實施例中，本發明寡聚物包含與SEQ ID NO：1之核苷酸72,892-72,982之補體內之區域具有至少約60%、至少約70%、至少約80%、至少約90%、至少約95%、至少約96%、至少約97%、至少約98%、至少約99%或100%序列一致性之核苷酸序列，其中視情況，寡聚物具有本文所述之設計(例如，章節II.G.，例如間隔體設計，例如交替側接間隔體設計)或本文中別處顯示之化學結構(例如，圖2、16B及20B)。在某些實施例中，本發明寡聚物包含與SEQ ID NO：1之核苷酸72,902-72,972之補體內之區域具有至少約60%、至少約70%、至少約80%、至少約90%、至少約95%、至少約96%、至少約97%、至少約98%、至少約99%或100%序列一致性之核苷酸序列，其中視情況，寡 聚物具有本文所述之設計(例如，章節II.G.，例如間隔體設計，例如交替側接間隔體設計)或本文中別處顯示之化學結構(例如，圖2、16B及20B)。
在某些實施例中，本發明寡聚物包含與SEQ ID NO：1之核苷酸72,802-73,072之補體內之區域具有至少約60%、至少約70%、至少約80%、至少約90%、至少約95%、至少約96%、至少約97%、至少約98%、至少約99%或100%序列一致性之核苷酸序列，其中視情況，寡聚物具有本文所述之設計(例如，章節II.G.，例如間隔體設計，例如交替側接間隔體設計)或本文中別處顯示之化學結構(例如，圖2、16B及20B)。在某些實施例中，本發明寡聚物包含與SEQ ID NO：1之核苷酸72,812-73,072之補體內之區域具有至少約60%、至少約70%、至少約80%、至少約90%、至少約95%、至少約96%、至少約97%、至少約98%、至少約99%或100%序列一致性之核苷酸序列，其中視情況，寡聚物具有本文所述之設計(例如，章節II.G.，例如間隔體設計，例如交替側接間隔體設計)或本文中別處顯示之化學結構(例如，圖2、16B及20B)。在某些實施例中，本發明寡聚物包含與SEQ ID NO：1之核苷酸72,822-73,072之補體內之區域具有至少約60%、至少約70%、至少約80%、至少約90%、至少約95%、至少約96%、至少約97%、至少約98%、至少約99%或100%序列一致性之核苷酸序列，其中視情況，寡聚物具有本文所述之設計(例如，章節II.G.，例如間隔體設計，例如交替側接間隔體設計)或本文中別處顯示之化學結構(例如，圖2、16B及20B)。在某些實施例中，本發明寡聚物包含與SEQ ID NO：1之核苷酸72,832-73,072之補體內之區域具有至少約60%、至少約70%、至少約80%、至少約90%、至少約95%、至少約96%、至少約97%、至少約98%、至少約99%或100%序列一致性之核苷酸序列，其中視情況，寡聚物具有本文所述之設計(例如，章節II.G.，例如間隔體設計，例如 交替側接間隔體設計)或本文中別處顯示之化學結構(例如，圖2、16B及20B)。在某些實施例中，本發明寡聚物包含與SEQ ID NO：1之核苷酸72,842-73,072之補體內之區域具有至少約60%、至少約70%、至少約80%、至少約90%、至少約95%、至少約96%、至少約97%、至少約98%、至少約99%或100%序列一致性之核苷酸序列，其中視情況，寡聚物具有本文所述之設計(例如，章節II.G.，例如間隔體設計，例如交替側接間隔體設計)或本文中別處顯示之化學結構(例如，圖2、16B及20B)。在某些實施例中，本發明寡聚物包含與SEQ ID NO：1之核苷酸72,852-73,072之補體內之區域具有至少約60%、至少約70%、至少約80%、至少約90%、至少約95%、至少約96%、至少約97%、至少約98%、至少約99%或100%序列一致性之核苷酸序列，其中視情況，寡聚物具有本文所述之設計(例如，章節II.G.，例如間隔體設計，例如交替側接間隔體設計)或本文中別處顯示之化學結構(例如，圖2、16B及20B)。在某些實施例中，本發明寡聚物包含與SEQ ID NO：1之核苷酸72,862-73,072之補體內之區域具有至少約60%、至少約70%、至少約80%、至少約90%、至少約95%、至少約96%、至少約97%、至少約98%、至少約99%或100%序列一致性之核苷酸序列，其中視情況，寡聚物具有本文所述之設計(例如，章節II.G.，例如間隔體設計，例如交替側接間隔體設計)或本文中別處顯示之化學結構(例如，圖2、16B及20B)。在某些實施例中，本發明寡聚物包含與SEQ ID NO：1之核苷酸72,872-73,072之補體內之區域具有至少約60%、至少約70%、至少約80%、至少約90%、至少約95%、至少約96%、至少約97%、至少約98%、至少約99%或100%序列一致性之核苷酸序列，其中視情況，寡聚物具有本文所述之設計(例如，章節II.G.，例如間隔體設計，例如交替側接間隔體設計)或本文中別處顯示之化學結構(例如，圖2、16B及20B)。在某些實施例中，本發明寡聚物包含與SEQ ID NO：1之核苷 酸72,882-73,072之補體內之區域具有至少約60%、至少約70%、至少約80%、至少約90%、至少約95%、至少約96%、至少約97%、至少約98%、至少約99%或100%序列一致性之核苷酸序列，其中視情況，寡聚物具有本文所述之設計(例如，章節II.G.，例如間隔體設計，例如交替側接間隔體設計)或本文中別處顯示之化學結構(例如，圖2、16B及20B)。在某些實施例中，本發明寡聚物包含與SEQ ID NO：1之核苷酸72,892-73,072之補體內之區域具有至少約60%、至少約70%、至少約80%、至少約90%、至少約95%、至少約96%、至少約97%、至少約98%、至少約99%或100%序列一致性之核苷酸序列，其中視情況，寡聚物具有本文所述之設計(例如，章節II.G.，例如間隔體設計，例如交替側接間隔體設計)或本文中別處顯示之化學結構(例如，圖2、16B及20B)。在某些實施例中，本發明寡聚物包含與SEQ ID NO：1之核苷酸72,902-73,072之補體內之區域具有至少約60%、至少約70%、至少約80%、至少約90%、至少約95%、至少約96%、至少約97%、至少約98%、至少約99%或100%序列一致性之核苷酸序列，其中視情況，寡聚物具有本文所述之設計(例如，章節II.G.，例如間隔體設計，例如交替側接間隔體設計)或本文中別處顯示之化學結構(例如，圖2、16B及20B)。
在某些實施例中，本發明寡聚物包含與SEQ ID NO：1之核苷酸72,802-73,062之補體內之區域具有至少約60%、至少約70%、至少約80%、至少約90%、至少約95%、至少約96%、至少約97%、至少約98%、至少約99%或100%序列一致性之核苷酸序列，其中視情況，寡聚物具有本文所述之設計(例如，章節II.G.，例如間隔體設計，例如交替側接間隔體設計)或本文中別處顯示之化學結構(例如，圖2、16B及20B)。在某些實施例中，本發明寡聚物包含與SEQ ID NO：1之核苷酸72,802-73,052之補體內之區域具有至少約60%、至少約70%、至少 約80%、至少約90%、至少約95%、至少約96%、至少約97%、至少約98%、至少約99%或100%序列一致性之核苷酸序列，其中視情況，寡聚物具有本文所述之設計(例如，章節II.G.，例如間隔體設計，例如交替側接間隔體設計)或本文中別處顯示之化學結構(例如，圖2、16B及20B)。在某些實施例中，本發明寡聚物包含與SEQ ID NO：1之核苷酸72,802-73,042之補體內之區域具有至少約60%、至少約70%、至少約80%、至少約90%、至少約95%、至少約96%、至少約97%、至少約98%、至少約99%或100%序列一致性之核苷酸序列，其中視情況，寡聚物具有本文所述之設計(例如，章節II.G.，例如間隔體設計，例如交替側接間隔體設計)或本文中別處顯示之化學結構(例如，圖2、16B及20B)。在某些實施例中，本發明寡聚物包含與SEQ ID NO：1之核苷酸72,802-73,032之補體內之區域具有至少約60%、至少約70%、至少約80%、至少約90%、至少約95%、至少約96%、至少約97%、至少約98%、至少約99%或100%序列一致性之核苷酸序列，其中視情況，寡聚物具有本文所述之設計(例如，章節II.G.，例如間隔體設計，例如交替側接間隔體設計)或本文中別處顯示之化學結構(例如，圖2、16B及20B)。在某些實施例中，本發明寡聚物包含與SEQ ID NO：1之核苷酸72,802-73,022之補體內之區域具有至少約60%、至少約70%、至少約80%、至少約90%、至少約95%、至少約96%、至少約97%、至少約98%、至少約99%或100%序列一致性之核苷酸序列，其中視情況，寡聚物具有本文所述之設計(例如，章節II.G.，例如間隔體設計，例如交替側接間隔體設計)或本文中別處顯示之化學結構(例如，圖2、16B及20B)。在某些實施例中，本發明寡聚物包含與SEQ ID NO：1之核苷酸72,802-73,012之補體內之區域具有至少約60%、至少約70%、至少約80%、至少約90%、至少約95%、至少約96%、至少約97%、至少約98%、至少約99%或100%序列一致性之核苷酸序列，其中視情況，寡 聚物具有本文所述之設計(例如，章節II.G.，例如間隔體設計，例如交替側接間隔體設計)或本文中別處顯示之化學結構(例如，圖2、16B及20B)。在某些實施例中，本發明寡聚物包含與SEQ ID NO：1之核苷酸72,802-73,002之補體內之區域具有至少約60%、至少約70%、至少約80%、至少約90%、至少約95%、至少約96%、至少約97%、至少約98%、至少約99%或100%序列一致性之核苷酸序列，其中視情況，寡聚物具有本文所述之設計(例如，章節II.G.，例如間隔體設計，例如交替側接間隔體設計)或本文中別處顯示之化學結構(例如，圖2、16B及20B)。在某些實施例中，本發明寡聚物包含與SEQ ID NO：1之核苷酸72,802-72,992之補體內之區域具有至少約60%、至少約70%、至少約80%、至少約90%、至少約95%、至少約96%、至少約97%、至少約98%、至少約99%或100%序列一致性之核苷酸序列，其中視情況，寡聚物具有本文所述之設計(例如，章節II.G.，例如間隔體設計，例如交替側接間隔體設計)或本文中別處顯示之化學結構(例如，圖2、16B及20B)。在某些實施例中，本發明寡聚物包含與SEQ ID NO：1之核苷酸72,802-73,982之補體內之區域具有至少約60%、至少約70%、至少約80%、至少約90%、至少約95%、至少約96%、至少約97%、至少約98%、至少約99%或100%序列一致性之核苷酸序列，其中視情況，寡聚物具有本文所述之設計(例如，章節II.G.，例如間隔體設計，例如交替側接間隔體設計)或本文中別處顯示之化學結構(例如，圖2、16B及20B)。在某些實施例中，本發明寡聚物包含與SEQ ID NO：1之核苷酸72,802-73,972之補體內之區域具有至少約60%、至少約70%、至少約80%、至少約90%、至少約95%、至少約96%、至少約97%、至少約98%、至少約99%或100%序列一致性之核苷酸序列，其中視情況，寡聚物具有本文所述之設計(例如，章節II.G.，例如間隔體設計，例如交替側接間隔體設計)或本文中別處顯示之化學結構(例如，圖2、16B 及20B)。
在一些實施例中，本發明寡聚物與選自以下之核酸序列之補體內之區域具有至少約60%、至少約70%、至少約80%、至少約90%、至少約95%、至少約96%、至少約97%、至少約98%、至少約99%或100%序列一致性：SEQ ID NO：1之核苷酸72,862-73,012；72,872-73,012；72,882-73,012；72,892-73,012；72,902-73,012；72,862-73，002；72,872-73,002；72,882-73,002；72,892-73,002；72,902-73，002；72，862-72,992；72,872-72,992；72,882-72,992；72,892-72，992；72,902-72,992；72,862-72,982；72,872-72,982；72,882-72，982；72,892-72,982；72,902-72,982；72,862-72,972；72,872-72,972；72,882-72,972；72,892-72,972；及72,902-72,972，其中視情況，寡聚物具有本文中別處所述之設計(例如，章節II.G.，例如間隔體設計，例如交替側接間隔體設計)或本文中別處顯示之化學結構(例如，圖2、16B及20B)。在一些實施例中，該區域位於SEQ ID NO：1之核苷酸72,862-73,012之補體內。在一些實施例中，該區域位於SEQ ID NO：1之核苷酸72,872-73,012之補體內。在一些實施例中，該區域位於SEQ ID NO：1之核苷酸72,882-73,012之補體內。在一些實施例中，該區域位於SEQ ID NO：1之核苷酸72,892-73,012之補體內。在一些實施例中，該區域位於SEQ ID NO：1之核苷酸72,902-73,012之補體內。在一些實施例中，該區域位於SEQ ID NO：1之核苷酸72,862-73,002之補體內。在一些實施例中，該區域位於SEQ ID NO：1之核苷酸72,872-73,002之補體內。在一些實施例中，該區域位於SEQ ID NO：1之核苷酸72,882-73,002之補體內。在一些實施例中，該區域位於SEQ ID NO：1之核苷酸72,892-73,002之補體內。
在其他實施例中，該區域位於SEQ ID NO：1之核苷酸72,902-73,002之補體內。在一些實施例中，該區域位於SEQ ID NO：1之核苷 酸72,862-72,992之補體內。在一些實施例中，該區域位於SEQ ID NO：1之核苷酸72,872-72,992之補體內。在一些實施例中，該區域位於SEQ ID NO：1之核苷酸72,882-72,992之補體內。在一些實施例中，該區域位於SEQ ID NO：1之核苷酸72,892-72,992之補體內。
在一些實施例中，該區域位於SEQ ID NO：1之核苷酸72,902-72,992之補體內。在一些實施例中，該區域位於SEQ ID NO：1之核苷酸72,862-72,982之補體內。在一些實施例中，該區域位於SEQ ID NO：1之核苷酸72,872-72,982之補體內。在一些實施例中，該區域位於SEQ ID NO：1之核苷酸72,882-72,982之補體內。在一些實施例中，該區域位於SEQ ID NO：1之核苷酸72,892-72,982之補體內。在一些實施例中，該區域位於SEQ ID NO：1之核苷酸72,902-72,982之補體內。在一些實施例中，該區域位於SEQ ID NO：1之核苷酸72,862-72,972之補體內。在一些實施例中，該區域位於SEQ ID NO：1之核苷酸72,872-72,972之補體內。在一些實施例中，該區域位於SEQ ID NO：1之核苷酸72,882-72,972之補體內。在一些實施例中，該區域位於SEQ ID NO：1之核苷酸72,892-72,972之補體內。在一些實施例中，該區域位於SEQ ID NO：1之核苷酸72,902-72,972之補體內。
在一個實施例中，寡聚物可包含選自由以下組成之群之序列：SEQ ID NO：804至900。在一個實施例中，寡聚物(或其鄰接核苷酸部分)針對所選序列視情況具有1、2或3個失配。在另一實施例中，寡聚物視情況包含一或多個核苷酸類似物。在其他實施例中，寡聚物具有本文中別處所述之設計(例如，章節II.G.I，例如間隔體設計，例如交替側接間隔體設計)或本文中別處所述之化學結構。可用於本發明之核苷酸類似物之非限制性實例揭示於本文中之別處。
在僅用小寫字母列示寡聚物序列時(例如ctttatttccaaattcactt(SEQ ID NO：676))，寡聚物中包括之核酸可為天然核酸或核苷酸類似物。 若將寡聚物序列闡述為小寫字母與大寫字母之組合(例如，CTTtatttccaaattcaCTT)，則序列中之大寫字母係核苷酸類似物(例如，LNA)，而小寫字母係天然核酸(例如，DNA)。因此，例如，在本文中提供序列「CTTtatttccaaattcaCTT」時，亦提供「ctttatttccaaattcactt(或SEQ ID NO：676)，其中在3'端之3個核酸係核苷酸類似物(例如，LNA)，且在5'端之3個核酸係天然核酸(例如，DNA)」或「具有LLLDDDDDDDDDDDDDDLLL之設計之ctttatttccaaattcactt(或SEQ ID NO：676)，其中L係核苷酸類似物且D係DNA單元。」
在某些實施例中，本發明寡聚物包含選自SEQ ID NO：4至953、956至958及960之核苷酸序列。參見圖2、3、6、7、16A、16B、20A及20B。在某些實施例中，本發明寡聚物包含選自圖2、3、6、7、16A、16B、20A及20B中所列示序列之核苷酸序列。然而，寡聚物之設計不受限於圖2、3、6、7、16A、16B、20A及20B中所示之設計。本發明寡聚物可具有任何寡聚物設計，例如間隔體、混合體、阻斷體或完全經修飾，如本文中別處所述。因此，在一些實施例中，本發明寡聚物包含選自SEQ ID NO：4至953、956至958及960之核苷酸序列，其中至少一個核苷酸經修飾。在其他實施例中，本發明寡聚物包含選自SEQ ID NO：4至953、956至958及960之核苷酸序列，其中在5'端之1至5個核苷酸及在3'端之1至5個核苷酸係核苷酸類似物(例如，LNA)，且中間之其他核苷酸係天然核酸。在其他實施例中，寡聚物包含選自SEQ ID NO：4至953、956至958及960之核苷酸序列，其中寡聚物之核苷酸設計如圖2、3、6及7中所述(大寫字母指示核苷酸類似物，例如LNA，且小寫字母指示天然核酸(例如DNA))。在其他實施例中，本發明寡聚物包含選自SEQ ID NO：4至953、956至958及960之核苷酸序列，其中主鏈包含至少一個硫代磷酸酯鍵。在具體實施例中，寡聚物包含選自圖7中序列之核苷酸序列，例如SEQ ID NO： 677、679、715、681644、647、593、716、474、683、587、685、646、680、201、473、645、532、538、535、650、533、590、7、153、686、471、223、688、53、154、202、595、655、482、227、485、589、370、548、250、251、258、256、51、69、71、255、84、262、365、285、392、417、76、74、390、28、46、43、49、52、67、56、60、698、773、782、684、784、780、786、795、798、794、797、796、705、592、472、720、745、691、687、690、740、724、695、689、741、714、726、799、484、801、536、800、543、545、537、476、528、477、479、487、467、602、594、604、603、529、530、598、527、539、481、480、469、540、600、486、601、531、588、586、542、596、544、468、653、591、534、470、547、478、546、648、541、466、599、483、597及475，其中寡聚物係如圖7中所述來設計，且其中大寫字母係核苷酸類似物，例如LNA，且小寫字母係DNA。寡聚物之非限制性實例顯示於圖2、3、6、7、16A及16B中。在一些實施例中，本發明寡聚物結合至靶核酸序列(例如，MAPT 轉錄物)且與細胞中之正常(即，對照)表現程度相比，將MAPT 轉錄物之表現抑制或降低至少10%或20%，例如與細胞中之正常表現程度(例如在寡聚物或偶聯物不存在下之表現程度)相比至少30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%或95%。
在某些實施例中，本發明寡聚物結合至MAPT 轉錄物並與細胞中之正常(即對照)表現程度相比，將MAPT mRNA之表現抑制或降低至少約10%或約20%，例如與細胞中之正常表現程度(例如在寡聚物或偶聯物不存在下之表現程度)相比至少約30%、約40%、約50%、約60%、約70%、約80%、約90%或約95%。在某些實施例中，與未暴露至該寡聚物之細胞(即，對照)相比，在投與寡聚物後，該寡聚物將細胞中Tau蛋白之表現降低至少60%、至少70%、至少80%或至少90%。 在一些實施例中，與未暴露至該寡聚物之細胞(即，對照)相比，在投與寡聚物後，該寡聚物將細胞中Tau蛋白之表現降低至少約60%、至少約70%、至少約80%或至少約90%。
在某些實施例中，本發明寡聚物具有至少一種選自以下之性質：(1)與尚未暴露至該寡聚物之對照細胞相比，降低細胞中Tau mRNA之表現；(2)基本上不降低細胞中之鈣振盪；(3)基本上不降低細胞中之微管蛋白強度；(4)降低細胞中Tau蛋白之表現；及(5)與尚未暴露至該寡聚物之對照細胞相比，其任何組合。
在一些實施例中，本發明寡聚物基本上不降低細胞(例如神經元細胞)中之鈣振盪。若寡聚物基本上不降低細胞中之鈣振盪，則寡聚物之此性質對應於寡聚物之降低之神經毒性。在一些實施例中，鈣振盪係未暴露至寡聚物之細胞中之振盪之大於或等於95%、大於或等於90%、大於或等於85%、大於或等於80%、大於或等於75%或大於或等於70%。
鈣振盪對神經元細胞之正確功能非常重要。已顯示皮質神經元網絡經歷自發鈣振盪，導致釋放神經傳遞質麩胺酸鹽。除了網絡中之其他相關神經元外，鈣振盪亦可調節神經元與相關神經膠質之相互作用，以釋放除麩胺酸鹽以外之其他神經傳遞質。用於正常腦功能之神經元網絡之穩態需要經調節鈣振盪。(參見，Shashank等人，Brain Research ,1006(1)：8-17(2004)；Rose等人，Nature Neurosci. ,4：773-774(2001)；Zonta等人，J Physiol Paris. ,96(3-4)：193-8(2002)；Pasti等人，J.Neurosci. ,21(2)：477-484(2001)。)麩胺酸鹽亦活化兩種不同離子通道α-胺基-3-羥基-5-甲基-4-異噁唑丙酸(AMPA)受體及N-甲基-D-天冬胺酸鹽(NMDA)受體。
在一些實施例中，在本發明方法中量測之鈣振盪係AMPA依賴性鈣振盪。在一些實施例中，鈣振盪係NMDA依賴性鈣振盪。在一些實 施例中，鈣振盪係γ-胺基丁酸(GABA)依賴性鈣振盪。在一些實施例中，鈣振盪可為AMPA依賴性、NMDA依賴性或GABA依賴性鈣振盪中兩者或更多者之組合。
在某些實施例中，在本發明方法中量測之鈣振盪係AMPA依賴性鈣振盪。為量測AMPA依賴性鈣振盪，鈣振盪可在Mg2+ 離子(例如，MgCl2 )存在下量測。在某些實施例中，方法進一步包含以容許檢測AMPA依賴性鈣振盪之量添加Mg2+ 離子(例如，MgCl2 )。在一些實施例中，容許檢測AMPA依賴性鈣振盪之有效離子濃度係至少約0.5mM。在其他實施例中，誘導AMPA依賴性鈣振盪之有效離子濃度係至少約0.6mM、至少約0.7mM、至少約0.8mM、至少約0.9mM、至少約1mM、至少約1.5mM、至少約2.0mM、至少約2.5mM、至少約3.0mM、至少約4mM、至少約5mM、至少約6mM、至少約7mM、至少約8mM、至少約9mM或至少約10mM。在具體實施例中，可用於該等方法中之Mg2+ 離子(例如，MgCl2 )之濃度為1mM。在某些實施例中，可用於本發明方法中之Mg2+ 離子(例如，MgCl2 )之濃度為約1mM至約10mM、約1mM至約15mM、約1mM至約20mM或約1mM至約25mM。Mg2+ 離子可藉由添加鎂鹽來添加，例如碳酸鎂、氯化鎂、檸檬酸鎂、氫氧化鎂、氧化鎂、硫酸鎂及硫酸鎂七水合物。
在一些實施例中，在本發明方法中經由使用檢測細胞內鈣含量波動之螢光探針來量測鈣振盪。舉例而言，細胞內鈣通量之檢測可藉由用結合至鈣離子且具有所得可檢測螢光變化之螢光染料(稱為螢光鈣指示劑)(例如，Fluo-4 AM及Fura Red AM染料，可得自Molecular Probes.Eugene,OR，美國)對細胞進行染色來達成。
在其他實施例中，本發明寡聚物不顯著降低細胞中之微管蛋白強度。在一些實施例中，微管蛋白強度係未暴露至寡聚物(或暴露至鹽水)之細胞中之微管蛋白強度之大於或等於95%、大於或等於90%、 大於或等於85%、大於或等於80%、大於或等於75%或大於或等於70%。
在一些實施例中，在使用0.04nM至400μM濃度之本發明寡聚物時觀察該性質。在相同或不同實施例中，對細胞中之MAPT mRNA及/或Tau蛋白之表現之抑制或降低產生與未暴露至寡聚物之細胞相比小於100%，例如小於98%、小於95%、小於90%、小於80%，例如小於70%之mRNA或蛋白質含量。對表現程度之調節可藉由量測Tau蛋白含量(例如藉由使用針對靶蛋白產生之適宜抗體進行諸如SDS-PAGE及之後西方墨點法之方法)來測定。或者，對表現程度之調節可藉由量測MAPT mRNA含量(例如藉由北方墨點法或定量RT-PCR)來測定。在經由mRNA含量量測抑制時，在使用適宜劑量(例如約0.04nM至約400μM濃度)時，在一些實施例中，下調程度通常係下調至在寡聚物不存在下細胞中之正常程度之約10-20%之程度。
在某些實施例中，本發明寡聚物之活體內耐受性小於或等於4之總分，其中該總分係5個類別之單元評分之和，該5個類別為1)過動；2)活動及喚起減少；3)運動功能障礙及/或共濟失調；4)異常姿勢及呼吸；及5)震顫及/或驚厥，且其中每一類別之單元評分係按0-4之量表來量測。在某些實施例中，活體內耐受性小於或等於3之總分、2之總分、1之總分或0之總分。在某一實施例中，對活體內耐受性之評價係如下文實例5中所述來測定。
在一些實施例中，寡聚物在與靶序列雜交時可耐受1、2、3或4個(或更多個)失配，且仍充分結合至靶以顯示期望效應，即對靶mRNA及/或蛋白質之下調。失配可藉由例如增加寡聚物核苷酸序列之長度及/或增加核苷酸類似物之數目來補償，其揭示於本文中之別處。
在一些實施例中，本發明寡聚物在與靶序列雜交時包含不多於3 個失配。在其他實施例中，鄰接核苷酸序列在與靶序列雜交時包含不多於2個失配。在其他實施例中，鄰接核苷酸序列在與靶序列雜交時包含不多於1個失配。在一些實施例中，靶序列係SEQ ID NO：1之核苷酸134,947-138,940內之區域。在一些實施例中，鄰接核苷酸序列在與靶序列(SEQ ID NO：1之核苷酸134,947-138,940內之區域)雜交時包含不多於單一失配。在一些實施例中，靶序列係SEQ ID NO：1之核苷酸135,050-138,940內之區域。在一些實施例中，鄰接核苷酸序列在與靶序列(SEQ ID NO：1之核苷酸135,050-138,940內之區域)雜交時包含不多於單一失配。在一些實施例中，靶序列係SEQ ID NO：1之核苷酸72,802-73,072內之區域。在一些實施例中，鄰接核苷酸序列在與靶序列(SEQ ID NO：1之核苷酸72,802-73,072內之區域)雜交時包含不多於單一失配。
在一些實施例中，補體或區域內之區域可由11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28或29個鄰接核苷酸、例如12-22、例如14-21個核苷酸組成。適宜地，在一些實施例中，該區域之長度與本發明寡聚物之鄰接核苷酸序列相同。
在一些實施例中，本發明寡聚物包含根據SEQ ID NO：4至953、956至958及960中之任一者之核苷酸序列或該序列內之區域。
在其他實施例中，本發明寡聚物包含根據SEQ ID NO：804至900中之任一者之核苷酸序列或該序列內之區域。在其他實施例中，本發明寡聚物包含根據SEQ ID NO：936至953、956至958及960中之任一者之核苷酸序列或該序列內之區域。
然而，人們認識到，在一些實施例中，寡聚物之核苷酸序列可包含與靶序列不互補之額外5'或3'核苷酸，例如獨立地1、2、3、4或5個5'及/或3'額外核苷酸。在此方面，在一些實施例中，本發明寡聚物可包含在5'及/或3'側接額外核苷酸之鄰接核苷酸序列。在一些實施例 中，額外5'及/或3'核苷酸係天然核苷酸，例如DNA或RNA。
在一些實施例中，本發明寡聚物包含根據SEQ ID NO：677之核苷酸序列(例如，ASO-000757)或其區域。在一些實施例中，本發明寡聚物包含根據SEQ ID NO：679之核苷酸序列(例如，ASO-001928)或其區域。在一些實施例中，本發明寡聚物包含根據SEQ ID NO：715之核苷酸序列(例如，ASO-001962)或其區域。在一些實施例中，本發明寡聚物包含根據SEQ ID NO：681之核苷酸序列(例如，ASO-001921)或其區域。在一些實施例中，本發明寡聚物包含根據SEQ ID NO：644之核苷酸序列(例如，ASO-000756)或其區域。在一些實施例中，本發明寡聚物包含根據SEQ ID NO：647之核苷酸序列(例如，ASO-001948)或其區域。在一些實施例中，本發明寡聚物包含根據SEQ ID NO：593之核苷酸序列(例如，ASO-001941)或其區域。在一些實施例中，本發明寡聚物包含根據SEQ ID NO：716之核苷酸序列(例如，ASO-001956)或其區域。在一些實施例中，本發明寡聚物包含根據SEQ ID NO：474之核苷酸序列(例如，ASO-001919)或其區域。在一些實施例中，本發明寡聚物包含根據SEQ ID NO：683之核苷酸序列(例如，ASO-001942)或其區域。在一些實施例中，本發明寡聚物包含根據SEQ ID NO：587之核苷酸序列(例如，ASO-000755)或其區域。在一些實施例中，本發明寡聚物包含根據SEQ ID NO：685之核苷酸序列(例如，ASO-001935)或其區域。在一些實施例中，本發明寡聚物包含根據SEQ ID NO：472之核苷酸序列(例如，ASO-001940)或其區域。在一些實施例中，本發明寡聚物包含根據SEQ ID NO：646之核苷酸序列(例如，ASO-001955)或其區域。在一些實施例中，本發明寡聚物包含根據SEQ ID NO：680之核苷酸序列(例如，ASO-001968)或其區域。在一些實施例中，本發明寡聚物包含根據SEQ ID NO：201之核苷酸序列(例如，ASO-000662)或其區域。在一些實施例中，本發明寡聚物包含根據SEQ ID NO：473之核苷 酸序列(例如，ASO-001933)或其區域。在一些實施例中，本發明寡聚物包含根據SEQ ID NO：645之核苷酸序列(例如，ASO-001967)或其區域。在一些實施例中，本發明寡聚物包含根據SEQ ID NO：532之核苷酸序列(例如，ASO-001954)或其區域。在一些實施例中，本發明寡聚物包含根據SEQ ID NO：538之核苷酸序列(例如，ASO-001960)或其區域。在一些實施例中，本發明寡聚物包含根據SEQ ID NO：535之核苷酸序列(例如，ASO-001966)或其區域。在一些實施例中，本發明寡聚物包含根據SEQ ID NO：650之核苷酸序列(例如，ASO-001961)或其區域。在一些實施例中，本發明寡聚物包含根據SEQ ID NO：533之核苷酸序列(例如，ASO-001947)或其區域。在一些實施例中，本發明寡聚物包含根據SEQ ID NO：590之核苷酸序列(例如，ASO-001920)或其區域。在一些實施例中，本發明寡聚物包含根據SEQ ID NO：7之核苷酸序列(例如，ASO-000829)或其區域。在一些實施例中，本發明寡聚物包含根據SEQ ID NO：740之核苷酸序列(例如，ASO-002007)或其區域。在一些實施例中，本發明寡聚物包含根據SEQ ID NO：714之核苷酸序列(例如，ASO-002012)或其區域。在一些實施例中，本發明寡聚物包含根據SEQ ID NO：487之核苷酸序列(例如，ASO-002038)或其區域。
在一些實施例中，本發明寡聚物包含根據SEQ ID NO：153之核苷酸序列(例如，ASO-000540)或其區域。在一些實施例中，本發明寡聚物包含根據SEQ ID NO：686之核苷酸序列(例如，ASO-000013)或其區域。在一些實施例中，本發明寡聚物包含根據SEQ ID NO：471之核苷酸序列(例如，ASO-000753)或其區域。在一些實施例中，本發明寡聚物包含根據SEQ ID NO：223之核苷酸序列(例如，ASO-000642)或其區域。在一些實施例中，本發明寡聚物包含根據SEQ ID NO：688之核苷酸序列(例如，ASO-000762)或其區域。在一些實施例中，本發明寡聚 物包含根據SEQ ID NO：53之核苷酸序列(例如，ASO-000389)或其區域。在一些實施例中，本發明寡聚物包含根據SEQ ID NO：154之核苷酸序列(例如，ASO-000555)或其區域。在一些實施例中，本發明寡聚物包含根據SEQ ID NO：202之核苷酸序列(例如，ASO-000566)或其區域。在一些實施例中，本發明寡聚物包含根據SEQ ID NO：595之核苷酸序列(例如，ASO-001934)或其區域。在一些實施例中，本發明寡聚物包含根據SEQ ID NO：655之核苷酸序列(例如，ASO-000761)或其區域。在一些實施例中，本發明寡聚物包含根據SEQ ID NO：482之核苷酸序列(例如，ASO-001926)或其區域。在一些實施例中，本發明寡聚物包含根據SEQ ID NO：485之核苷酸序列(例如，ASO-000758)或其區域。在一些實施例中，本發明寡聚物包含根據SEQ ID NO：589之核苷酸序列(例如，ASO-000760)或其區域。在一些實施例中，本發明寡聚物包含根據SEQ ID NO：370之核苷酸序列(例如，ASO-000635)或其區域。在一些實施例中，本發明寡聚物包含根據SEQ ID NO：548之核苷酸序列(例如，ASO-000759)或其區域。在一些實施例中，本發明寡聚物包含根據SEQ ID NO：250之核苷酸序列(例如，ASO-000388)或其區域。在一些實施例中，本發明寡聚物包含根據SEQ ID NO：251之核苷酸序列(例如，ASO-000390)或其區域。在一些實施例中，本發明寡聚物包含根據SEQ ID NO：258之核苷酸序列(例如，ASO-000394)或其區域。在一些實施例中，本發明寡聚物包含根據SEQ ID NO：256之核苷酸序列(例如，ASO-000396)或其區域。在一些實施例中，本發明寡聚物包含根據SEQ ID NO：51之核苷酸序列(例如，ASO-000411)或其區域。在一些實施例中，本發明寡聚物包含根據SEQ ID NO：69之核苷酸序列(例如，ASO-000435)或其區域。在一些實施例中，本發明寡聚物包含根據SEQ ID NO：71之核苷酸序列(例如，ASO-000442)或其區域。在一些實施例中，本發明寡聚物包含根據SEQ ID NO：255之核苷 酸序列(例如，ASO-000447)或其區域。在一些實施例中，本發明寡聚物包含根據SEQ ID NO：84之核苷酸序列(例如，ASO-000449)或其區域。在一些實施例中，本發明寡聚物包含根據SEQ ID NO：262之核苷酸序列(例如，ASO-000451)或其區域。在一些實施例中，本發明寡聚物包含根據SEQ ID NO：365之核苷酸序列(例如，ASO-000468)或其區域。在一些實施例中，本發明寡聚物包含根據SEQ ID NO：285之核苷酸序列(例如，ASO-000478)或其區域。在一些實施例中，本發明寡聚物包含根據SEQ ID NO：392之核苷酸序列(例如，ASO-000527)或其區域。在一些實施例中，本發明寡聚物包含根據SEQ ID NO：417之核苷酸序列(例如，ASO-000543)或其區域。在一些實施例中，本發明寡聚物包含根據SEQ ID NO：76之核苷酸序列(例如，ASO-000558)或其區域。在一些實施例中，本發明寡聚物包含根據SEQ ID NO：74之核苷酸序列(例如，ASO-000581)或其區域。在一些實施例中，本發明寡聚物包含根據SEQ ID NO：390之核苷酸序列(例如，ASO-000614)或其區域。在一些實施例中，本發明寡聚物包含根據SEQ ID NO：28之核苷酸序列(例如，ASO-000830)或其區域。在一些實施例中，本發明寡聚物包含根據SEQ ID NO：46之核苷酸序列(例如，ASO-001778)或其區域。在一些實施例中，本發明寡聚物包含根據SEQ ID NO：43之核苷酸序列(例如，ASO-001779)或其區域。在一些實施例中，本發明寡聚物包含根據SEQ ID NO：49之核苷酸序列(例如，ASO-001780)或其區域。在一些實施例中，本發明寡聚物包含根據SEQ ID NO：52之核苷酸序列(例如，ASO-001781)或其區域。在一些實施例中，本發明寡聚物包含根據SEQ ID NO：67之核苷酸序列(例如，ASO-001782)或其區域。在一些實施例中，本發明寡聚物包含根據SEQ ID NO：56之核苷酸序列(例如，ASO-001925，或其區域。在一些實施例中，本發明寡聚物包含根據SEQ ID NO：60之核苷酸序列(例如，ASO-001953)或其區 域。在一些實施例中，本發明寡聚物包含根據SEQ ID NO：698之核苷酸序列(例如，ASO-214296)或其區域。在一些實施例中，本發明寡聚物包含根據SEQ ID NO：773之核苷酸序列(例如，ASO-000118)或其區域。在一些實施例中，本發明寡聚物包含根據SEQ ID NO：782之核苷酸序列(例如，ASO-000125)或其區域。
在一些實施例中，本發明寡聚物包含根據SEQ ID NO：807之核苷酸序列(例如，ASO-000461)或其區域。在一些實施例中，本發明寡聚物包含根據SEQ ID NO：824之核苷酸序列(例如，ASO-001783)或其區域。在一些實施例中，本發明寡聚物包含根據SEQ ID NO：825之核苷酸序列(例如，ASO-001784)或其區域。在一些實施例中，本發明寡聚物包含根據SEQ ID NO：811之核苷酸序列(例如，ASO-000520)或其區域。在一些實施例中，本發明寡聚物包含根據SEQ ID NO：818之核苷酸序列(例如，ASO-000774)或其區域。在一些實施例中，本發明寡聚物包含根據SEQ ID NO：817之核苷酸序列(例如，ASO-000773)或其區域。
在一些實施例中，本發明寡聚物之序列評分大於或等於0.2，其中該序列評分係藉由下式I計算：
在其他實施例中，本發明寡聚物之序列評分大於或等於0.2，其中序列評分係藉由下式IA計算：
在該等實施例中，大於或等於截止值之序列評分對應於降低之寡聚物神經毒性。
在某些實施例中，本發明寡聚物之序列評分大於或等於約0.1、0.2、0.25、0.3、0.35、0.4、0.45、0.5、0.55、0.6、0.65、0.7、 0.75、0.8、0.85、0.9、0.95或1.0。在一個實施例中，本發明寡聚物包含與MAPT 轉錄物之非編碼區雜交之鄰接核苷酸序列，其中寡聚物之序列評分大於或等於約0.1、0.2、0.25、0.3、0.35、0.4、0.45、0.5、0.55、0.6、0.65、0.7、0.75、0.8、0.85、0.9、0.95或1.0。在另一實施例中，本發明寡聚物包含與MAPT 轉錄物之3' UTR雜交之鄰接核苷酸序列，其中寡聚物之序列評分大於或等於約0.1、0.2、0.25、0.3、0.35、0.4、0.45、0.5、0.55、0.6、0.65、0.7、0.75、0.8、0.85、0.9、0.95或1.0。在另一實施例中，本發明寡聚物包含與MAPT 轉錄物之5' UTR雜交之鄰接核苷酸序列，其中寡聚物之序列評分大於或等於約0.1、0.2、0.25、0.3、0.35、0.4、0.45、0.5、0.55、0.6、0.65、0.7、0.75、0.8、0.85、0.9、0.95或1.0。在另一實施例中，本發明寡聚物包含與MAPT 轉錄物之外顯子2雜交之鄰接核苷酸序列，其中寡聚物之序列評分大於或等於約0.1、0.2、0.25、0.3、0.35、0.4、0.45、0.5、0.55、0.6、0.65、0.7、0.75、0.8、0.85、0.9、0.95或1.0。在所有該等實施例中，在序列評分大於或等於截止值時，認為寡聚物具有降低之神經毒性。
II.C. 寡聚物長度
寡聚物可包含長度總計為10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49或50個鄰接核苷酸之鄰接核苷酸序列。
在一些實施例中，寡聚物包含長度總計為約10-22、例如10-21或12-18、例如13-17或12-16、例如13、14、15、16、17、18、19、20或21個鄰接核苷酸之鄰接核苷酸序列。
在一些實施例中，寡聚物包含長度總計為10、11、12、13或14個鄰接核苷酸之鄰接核苷酸序列。
在一些實施例中，本發明寡聚物由不多於22個核苷酸、例如不多於21或20個核苷酸、例如不多於18個核苷酸、例如15、16或17個核苷酸組成。在一些實施例中，本發明寡聚物包含少於22個核苷酸。應理解，在給予寡聚物或鄰接核苷酸序列長度之範圍時，該範圍包括該範圍中提供之下限及上限長度，例如(或介於其之間)10-50包括10及50二者。
II.D. 核苷及核苷類似物
在本發明之一態樣中，寡聚物包含一或多個非天然核苷酸類似物。如本文所用「核苷酸類似物」係天然核苷酸(例如DNA或RNA核苷酸)之藉助糖及/或鹼基部分中之修飾之變體。在寡核苷酸情況下，類似物原則上可僅為「沉默」或「等效」於天然核苷酸，即對寡核苷酸起作用抑制靶基因表現之方式沒有功能性效應。然而，例如，若該等「等效」類似物之製造更容易或更便宜，或對於儲存或製造條件更穩定，或代表標籤或標記，則其可係有用的。然而，在一些實施例中，類似物將對寡聚物起作用以抑制表現之方式具有功能性效應；例如藉由產生提高之對靶之結合親和性及/或提高之對細胞內核酸酶之抗性及/或提高之轉運至細胞中之便利性。核苷類似物之具體實例闡述於例如以下文獻中：Freier及Altmann；Nucl.Acid Res. ,1997,25,4429-4443及Uhlmann；Curr.Opinion in Drug Development ,2000,3(2),293-213，以及方案1：
在一個實施例中，寡聚物包括至少1個、至少2個、至少3個、至少4個、至少5個、至少6個、至少7個、至少8個、至少9個或至少10個核苷酸類似物。在另一實施例中，寡聚物包括4、6、8或10個核苷酸類似物。
核苷酸類似物之實例包括(但不限於)鎖核酸(LNA)；2'-O-烷基-RNA；2'-胺基-DNA；2'-氟-DNA；阿拉伯糖核酸(ANA)；2'-氟-ANA、己糖醇核酸(HNA)、嵌入核酸(INA)、約束之乙基核苷(cEt)、2'-O-甲基核酸(2'-OMe)、2'-O-甲氧基乙基核酸(2'-MOE)或其任何組 合。
「己糖醇核酸」或「HNA」由具有位於2-[S]-位置之核鹼基之磷酸化2,3-二去氧-D-阿拉伯糖基-己糖醇單元組成。
「cEt」或「約束之乙基」意指具有包含連接4'-碳與2'-碳之橋之糖部分之二環核苷，其中該橋具有下式：4'-CH(CH3)-O-2'。
「2'-O-甲氧基乙基」(亦為2'-MOE及2'-O(CH2)2-OCH3及MOE)係指呋喃糖基環之2'位置處之O-甲氧基-乙基修飾。經2’-O-甲氧基乙基修飾之糖係經修飾糖。
如本文所用「2'-F」係指呋喃糖基糖環之2'位置之包含氟基團之修飾。
如本文所用「2'-OMe」或「2'-OCH3」或「2'-O-甲基」各自係指呋喃糖基糖環之2'位置處之包含-OCH3基團之修飾。
因此，寡聚物可包含天然核苷酸之簡單序列，例如2'-去氧核苷酸(本文中一般稱為「DNA」)，但亦可能係核糖核苷酸(本文中一般稱為「RNA」)或該等天然核苷酸與一或多種非天然核苷酸(即核苷酸類似物)之組合。該等核苷酸類似物可適宜地增強寡聚物對靶序列之親和性。
適宜核苷酸類似物之實例係由全文以引用方式併入之WO2007/031091提供，或在其中提及。
在寡聚物中納入增強親和性之核苷酸類似物(例如LNA或2'-取代糖)可容許減小特異性結合之寡聚物之大小，且亦可將上限降低至在非特異性或異常結合發生之前寡聚物之大小。
在一些實施例中，寡聚物包含至少一種LNA。LNA化合物之其他細節揭示於本文中之別處。在一些實施例中，寡聚物包含至少2個LNA。在一些實施例中，寡聚物包含3-10個LNA，例如6或7個LNA，例如至少3或至少4、或至少5、或至少6、或至少7或8個LNA。在一些 實施例中，所有核苷酸類似物皆可為LNA。
在具體實施例中，本發明寡聚物包括二環糖。二環糖之非限制性實例包括cEt、2',4'-約束2′-O-甲氧基乙基(cMOE)、LNA、α-LNA、β-LNA、2'-O,4'-C-伸乙基-橋接核酸(ENA)、胺基-LNA、氧基-LNA或硫代-LNA。
術語「硫代-LNA」包含鎖核苷酸，其中下文通式III中之Y選自S或-CH2 -S-。硫代-LNA可呈β-D及α-L-構形二者。
術語「胺基-LNA」包含鎖核苷酸，其中下文通式III中之Y選自-N(H)-、N(R)-、CH2 -N(H)-及-CH2 -N(R)-，其中R選自氫及C1-4 -烷基。胺基-LNA可呈β-D及α-L-構形二者。
術語「氧基-LNA」包含鎖核苷酸，其中下文通式III中之Y代表-O-。氧基-LNA可呈β-D及α-L-構形二者。
術語「ENA」包含鎖核苷酸，其中下文通式III中之Y係-CH2 -O-(其中-CH2 -O-中之氧原子連接至相對於鹼基B之2'-位置)。Re 係氫或甲基。
在一些實例性實施例中，LNA選自β-D-氧基-LNA、α-L-氧基-LNA、β-D-胺基-LNA及β-D-硫代-LNA，尤其β-D-氧基-LNA。
將認識到，在提及僅由核苷酸組成之核苷酸序列基序或核苷酸序列時，由該序列定義之本發明寡聚物可包含相應核苷酸類似物代替序列中存在之一或多個核苷酸，該核苷酸類似物係例如LNA單元或其他核苷酸類似物，包括cEt、cMOE、α-LNA、β-LNA、ENA、胺基-LNA、氧基-LNA、硫代-LNA，其提高寡聚物/靶雙螺旋體之雙螺旋體穩定性/Tm (即增強親和性之核苷酸類似物)。
在一些實施例中，在增強親和性之核苷酸類似物以外之區域(例如如本文中所提及之區域B及/或如本文中所提及之區域D)，及/或在寡核苷酸中未經修飾之例如DNA核苷酸之位點處，及/或在鄰接核苷 酸序列之5'或3'區域中，發現寡聚物之核苷酸序列與靶序列之間之任何失配。
核苷酸之該修飾之實例包括修飾糖部分以提供2'-取代基或產生橋接(鎖核酸)結構，其增強結合親和性且亦可提供提高之核酸酶抗性。
在一個實施例中，核苷酸類似物係氧基-LNA(例如β-D-氧基-LNA及α-L-氧基-LNA)，及/或胺基-LNA(例如β-D-胺基-LNA及α-L-胺基-LNA)及/或硫代-LNA(例如β-D-硫代-LNA及α-L-硫代-LNA)及/或ENA(例如β-D-ENA及α-L-ENA)。在具體實施例中，核苷酸類似物係β-D-氧基-LNA。
在一些實施例中，存於本發明寡聚物內(例如在本文所提及之區域A及C中)之核苷酸類似物獨立地選自例如：2'-O-烷基-RNA單元、2'-胺基-DNA單元、2'-氟-DNA單元、LNA單元、阿拉伯糖核酸(ANA)單元、2'-氟-ANA單元、HNA單元、INA(嵌入核酸，Christensen,2002.Nucl.Acids.Res.2002 30：4918-4925，以引用方式併入本文中)單元及2'-MOE單元。在一些實施例中，上述類型之核苷酸類似物中僅有一種存於本發明寡聚物或其鄰接核苷酸序列中。
在一些實施例中，核苷酸類似物係2'-O-甲氧基乙基-RNA(2'-MOE)、2'-氟-DNA單體、LNA核苷酸類似物、cEt、cMOE、α-LNA、β-LNA、ENA、胺基-LNA、氧基-LNA或硫代-LNA單元，且因此本發明寡核苷酸可包含獨立地選自類似物中該等類型之核苷酸類似物，或可包含選自上述之彼等之僅一種類型之類似物。在一些實施例中，至少一個核苷酸類似物係2'-MOE-RNA，例如2、3、4、5、6、7、8、9或10個2'-MOE-RNA核苷酸單元。在一些實施例中，至少一個核苷酸類似物係2'-氟DNA，例如2、3、4、5、6、7、8、9或10個2'-氟-DNA核苷酸單元。
在一些實施例中，本發明寡聚物包含至少一個鎖核酸(LNA)單元，例如1、2、3、4、5、6、7、8、9或10個LNA單元，例如3-7或4-8個LNA單元，或3、4、5、6、7或8個LNA單元。在一些實施例中，所有核苷酸類似物皆為LNA。在一些實施例中，寡聚物可包含β-D-氧基-LNA及以下LNA單元中之一或多者二者：硫代-LNA、胺基-LNA、氧基-LNA及/或ENA，其呈β-D或α-L構形或其組合。在一些實施例中，所有LNA胞嘧啶單元皆係5'-甲基胞嘧啶。在本發明之一些實施例中，寡聚物可包含LNA及DNA單元二者。在某些實施例中，LNA及DNA單元之總和為10-50、10-30、例如10-25、例如10-22、例如10-21。在本發明之一些實施例中，寡聚物之核苷酸序列(例如鄰接核苷酸序列)由至少一個LNA組成且其餘核苷酸單元係DNA單元。在一些實施例中，寡聚物僅包含LNA核苷酸類似物及天然核苷酸(例如RNA或DNA，例如DNA核苷酸)，視情況具有經修飾核苷酸間鍵聯，例如硫代磷酸酯。
術語「核鹼基」係指核苷酸之鹼基部分且涵蓋天然以及非天然變體二者。因此，「核鹼基」不僅涵蓋已知嘌呤及嘧啶雜環，且亦涵蓋其雜環類似物及互變異構物。
核鹼基之實例包括但不限於腺嘌呤、鳥嘌呤、胞嘧啶、胸苷、尿嘧啶、黃嘌呤、次黃嘌呤、5-甲基胞嘧啶、異胞嘧啶、假異胞嘧啶、5-溴尿嘧啶、5-丙炔基尿嘧啶、6-胺基嘌呤、2-胺基嘌呤、肌苷、二胺基嘌呤及2-氯-6-胺基嘌呤。
在一些實施例中，存於寡聚物中之至少一個核鹼基係選自由以下組成之群之經修飾核鹼基：5-甲基胞嘧啶、異胞嘧啶、假異胞嘧啶、5-溴尿嘧啶、5-丙炔基尿嘧啶、6-胺基嘌呤、2-胺基嘌呤、肌苷、二胺基嘌呤及2-氯-6-胺基嘌呤。
在某些實施例中，本發明包括包含核苷酸類似物之寡聚物。在 一些實施例中，核苷酸類似物包含經修飾核鹼基，例如5-甲基胞嘧啶。在其他實施例中，核苷酸類似物包含經修飾核鹼基，例如5-甲基胞嘧啶、異胞嘧啶、假異胞嘧啶、5-溴尿嘧啶、5-丙炔基尿嘧啶、6-胺基嘌呤、2-胺基嘌呤、肌苷、二胺基嘌呤及2-氯-6-胺基嘌呤。在某些實施例中，寡聚物具有如圖2或圖16B中所揭示之化學結構。
II.E. LNA
術語「LNA」係指二環核苷類似物，稱為「鎖核酸」。其可係指LNA單體，或在用於「LNA寡核苷酸」情況下時，LNA係指含有一或多個該等二環核苷酸類似物之寡核苷酸。LNA核苷酸之特徵為在核糖糖環之C2'與C4'之間存在連接體基團(例如橋)，例如如下文所述之雙基(biradical)R4* -R2* 所顯示。
在某些實施例中，用於本發明寡核苷酸化合物中之LNA具有以下通式V之結構：
其中對於所有手性中心，可發現不對稱基團呈R或S取向；其中X選自-O-、-S-、-N(RN*)-、-C(R6R6*)-，例如在一些實施例中，-O-；B選自氫、視情況經取代之C1-4-烷氧基、視情況經取代之C1-4-烷基、視情況經取代之C1-4-醯氧基、包括天然及核鹼基類似物之核鹼基、DNA嵌入劑、光化學活性基團、熱化學活性基團、螯合基團、報導基因基團及配體；在一些實施例中，B係核鹼基或核鹼基類似 物；P指定與毗鄰單體之核苷酸間鍵聯或5'-末端基團，該核苷酸間鍵聯或5'-末端基團視情況包括取代基R5或同樣適用的取代基R5*；P*指定與毗鄰單體之核苷酸間鍵聯或3'-末端基團；R4*及R2*一起指定二價連接體基團，該二價連接體基團由1-4個選自以下之基團/原子組成：-C(RaRb)-、-C(Ra)=C(Rb)-、-C(Ra)=N-、-O-、-Si(Ra)2-、-S-、-SO2-、-N(Ra)-及>C=Z，其中Z選自-O-、-S-及-N(Ra)-，且Ra及Rb各自獨立地選自氫、視情況經取代之C1-12-烷基、視情況經取代之C2-12-烯基、視情況經取代之C2-12-炔基、羥基、視情況經取代之C1-12-烷氧基、C2-12-烷氧基烷基、C2-12-烯基氧基、羧基、C1-12-烷氧基羰基、C1-12-烷基羰基、甲醯基、芳基、芳基氧基-羰基、芳基氧基、芳基羰基、雜芳基、雜芳基氧基-羰基、雜芳基氧基、雜芳基羰基、胺基、單-及二(C1-6-烷基)胺基、胺甲醯基、單-及二(C1-6-烷基)-胺基-羰基、胺基-C1-6-烷基-胺基羰基、單-及二(C1-6-烷基)胺基-C1-6-烷基-胺基羰基、C1-6-烷基-羰基胺基、脲基、C1-6-烷醯基氧基、碸基、C1-6-烷基磺醯基氧基、硝基、疊氮基、硫基、C1-6-烷硫基、鹵素、DNA嵌入劑、光化學活性基團、熱化學活性基團、螯合基團、報導基因基團及配體，其中芳基及雜芳基可視情況經取代且其中兩個孿型取代基Ra及Rb可一起指定視情況經取代之亞甲基(=CH2)，其中對於所有手性中心，可發現不對稱基團呈R或S取向，且；存在之取代基R1*、R2、R3、R5、R5*、R6及R6*中之每一者獨立地選自氫、視情況經取代之C1-12-烷基、視情況經取代之C2-12-烯基、視情況經取代之C2-12-炔基、羥基、C1-12-烷氧基、C2-12-烷氧基烷基、C2-12-烯基氧基、羧基、C1-12-烷氧基羰基、C1-12-烷基羰基、甲醯基、芳基、芳基氧基-羰基、芳基氧基、芳基羰基、雜芳 基、雜芳基氧基-羰基、雜芳基氧基、雜芳基羰基、胺基、單-及二(C1-6-烷基)胺基、胺甲醯基、單-及二(C1-6-烷基)-胺基-羰基、胺基-C1-6-烷基-胺基羰基、單-及二(C1-6-烷基)胺基-C1-6-烷基-胺基羰基、C1-6-烷基-羰基胺基、脲基、C1-6-烷醯基氧基、碸基、C1-6-烷基磺醯基氧基、硝基、疊氮基、硫基、C1-6-烷硫基、鹵素、DNA嵌入劑、光化學活性基團、熱化學活性基團、螯合基團、報導基因基團及配體，其中芳基及雜芳基可視情況經取代，且其中兩個孿型取代基可一起指定側氧基、硫酮基、亞胺基或視情況經取代之亞甲基；其中RN選自氫及C1-4-烷基，且其中兩個毗鄰(非孿型)取代基可指定產生雙鍵之另一鍵；且RN*在存在且不參與雙基時選自氫及C1-4-烷基；及其鹼性鹽及酸加成鹽。對於所有手性中心，可發現不對稱基團呈R或S取向。
在一些實施例中，R4*及R2*一起指定由選自由以下組成之群之基團組成之雙基：C(RaRb)-C(RaRb)-、C(RaRb)-O-、C(RaRb)-NRa-、C(RaRb)-S-及C(RaRb)-C(RaRb)-O-，其中每一Ra及Rb可視情況獨立地經選擇。在一些實施例中，Ra及Rb可視情況獨立地選自由氫及C1-6烷基(例如甲基，例如氫)組成之群。
在一些實施例中，R4* 及R2* 一起指定雙基-O-CH(CH2 OCH3 )-(2'O-甲氧基乙基二環核酸，Seth等人，2010,J.Org.Chem)，其呈R-或S-構形。
在一些實施例中，R4* 及R2* 一起指定雙基-O-CH(CH2 CH3 )-(2'O-乙基二環核酸，Seth等人，2010,J.Org.Chem)，其呈R-或S-構形。
在一些實施例中，R4* 及R2* 一起指定雙基-O-CH(CH3 )-，其呈R-或S-構形。在一些實施例中，R4* 及R2* 一起指定雙基-O-CH2 -O-CH2 -(Seth等人，2010,J.Org.Chem)。
在一些實施例中，R4* 及R2* 一起指定雙基-O-NR-CH3 -(Seth等 人，2010,J.Org.Chem)。
在一些實施例中，LNA單元具有選自以下群之結構：
其中cEt LNA單元中CH3 -取代基之取向可獨立地為R 或S ，且其中cMOE LNA單元中MeOCH2 -取代基之取向可獨立地為R 或S ，且其中5’-Me-LNA單元中CH3 -取代基之取向可獨立地為R 或S 。
在一些實施例中，R1* 、R2 、R3 、R5 、R5* 獨立地選自由以下組成之群：氫、鹵素、C1-6 烷基、經取代C1-6 烷基、C2-6 烯基、經取代C2-6 烯基、C2-6 炔基或經取代C2-6 炔基、C1-6 烷氧基、經取代C1-6 烷氧基、醯基、經取代醯基、C1-6 胺基烷基或經取代C1-6 胺基烷基。對於所有手性中心，可發現不對稱基團呈R 或S 取向。
在一些實施例中，R1* 、R2 、R3 、R5 、R5* 係氫。
在一些實施例中，R1* 、R2 、R3 獨立地選自由以下組成之群：氫、鹵素、C1-6 烷基、經取代C1-6 烷基、C2-6 烯基、經取代C2-6 烯基、C2-6 炔基或經取代C2-6 炔基、C1-6 烷氧基、經取代C1-6 烷氧基、醯基、經取代醯基、C1-6 胺基烷基或經取代C1-6 胺基烷基。對於所有手性中心，可發現不對稱基團呈R 或S 取向。
在一些實施例中，R1* 、R2 、R3 係氫。
在一些實施例中，R5 及R5* 各自獨立地選自由以下組成之群：H、-CH3 、-CH2 -CH3 、-CH2 -O-CH3 及-CH=CH2 。適宜地，在一些實施例中，R5 或R5* 係氫，而另一基團(分別係R5 或R5* )選自由以下組成之群：C1-5 烷基、C2-6 烯基、C2-6 炔基、經取代C1-6 烷基、經取代C2-6 烯基、經取代C2-6 炔基或經取代醯基(-C(=O)-)；其中每一經取代基團係 經獨立地選自以下之取代基單取代或多取代：鹵素、C1-6 烷基、經取代C1-6 烷基、C2-6 烯基、經取代C2-6 烯基、C2-6 炔基、經取代C2-6 炔基、OJ1 、SJ1 、NJ1 J2 、N3 、COOJ1 、CN、O-C(=O)NJ1 J2 、N(H)C(=NH)NJ1 J2 或N(H)C(=X)N(H)J2 ，其中X係O或S；且J1 及J2 各自獨立地係H、C1-6 烷基、經取代C1-6 烷基、C2-6 烯基、經取代C2-6 烯基、C2-6 炔基、經取代C2-6 炔基、C1-6 胺基烷基、經取代C1-6 胺基烷基或保護基團。在一些實施例中，R5 或R5* 係經取代C1-6 烷基。在一些實施例中，R5 或R5* 係經取代亞甲基，其中較佳取代基包括一或多個獨立地選自以下之基團：F、NJ1 J2 、N3 、CN、OJ1 、SJ1 、O-C(=O)NJ1 J2 、N(H)C(=NH)NJ1 J2 或N(H)C(O)N(H)J2 。在一些實施例中，J1 及J2 各自獨立地係H或C1-6 烷基。在一些實施例中，R5 或R5* 係甲基、乙基或甲氧基甲基。在一些實施例中，R5 或R5* 係甲基。在另一實施例中，R5 或R5* 係乙烯基。在一些實施例中，R5 或R5* 係經取代醯基。在一些實施例中，R5 或R5* 係C(=O)NJ1 J2 。對於所有手性中心，可發現不對稱基團呈R 或S 取向。該等5'經修飾二環核苷酸揭示於WO 2007/134181中，其係全文以引用方式併入本文中。
在一些實施例中，B係核鹼基，包括核鹼基類似物及天然核鹼基，例如嘌呤或嘧啶，或經取代嘌呤或經取代嘧啶，例如本文所提及之核鹼基，例如選自由以下組成之群之核鹼基：腺嘌呤、胞嘧啶、胸腺嘧啶、腺嘌呤、尿嘧啶及/或經修飾或經取代核鹼基，例如5-噻唑并-尿嘧啶、2-硫-尿嘧啶、5-丙炔基-尿嘧啶、2'硫-胸腺嘧啶、5-甲基胞嘧啶、5-噻唑并-胞嘧啶、5-丙炔基-胞嘧啶及2,6-二胺基嘌呤。
在一些實施例中，R4* 及R2* 一起指定選自以下之雙基：-C(Ra Rb )-O-,-C(Ra Rb )-C(Rc Rd )-O-、-C(Ra Rb )-C(Rc Rd )-C(Re Rf )-O-、-C(Ra Rb )-O-C(Rc Rd )-、-C(Ra Rb )-O-C(Rc Rd )-O-、-C(Ra Rb )-C(Rc Rd )-、-C(Ra Rb )-C(Rc Rd )-C(Re Rf )-、-C(Ra )=C(Rb )-C(Rc Rd )-、-C(Ra Rb )-N(Rc )-、- C(Ra Rb )-C(Rc Rd )-N(Re )-、-C(Ra Rb )-N(Rc )-O-及-C(Ra Rb )-S-、-C(Ra Rb )-C(Rc Rd )-S-，其中Ra 、Rb 、Rc 、Rd 、Re 及Rf 各自獨立地選自氫、視情況經取代之C1-12 -烷基、視情況經取代之C2-12 -烯基、視情況經取代之C2-12 -炔基、羥基、C1-12 -烷氧基、C2-12 -烷氧基烷基、C2-12 -烯基氧基、羧基、C1-12 -烷氧基羰基、C1-12 -烷基羰基、甲醯基、芳基、芳基氧基-羰基、芳基氧基、芳基羰基、雜芳基、雜芳基氧基-羰基、雜芳基氧基、雜芳基羰基、胺基、單-及二(C1-6 -烷基)胺基、胺甲醯基、單-及二(C1-6 -烷基)-胺基-羰基、胺基-C1-6 -烷基-胺基羰基、單-及二(C1-6 -烷基)胺基-C1-6 -烷基-胺基羰基、C1-6 -烷基-羰基胺基、脲基、C1-6 -烷醯基氧基、碸基、C1-6 -烷基磺醯基氧基、硝基、疊氮基、硫基、C1-6 -烷硫基、鹵素、DNA嵌入劑、光化學活性基團、熱化學活性基團、螯合基團、報導基因基團及配體，其中芳基及雜芳基可視情況經取代且其中兩個孿型取代基Ra 及Rb 可一起指定視情況經取代之亞甲基(=CH2 )。對於所有手性中心，可發現不對稱基團呈R 或S 取向。
在另一實施例中，R4* 及R2* 一起指定選自以下之雙基(二價基團)：-CH2 -O-、-CH2 -S-、-CH2 -NH-、-CH2 -N(CH3 )-、-CH2 -CH2 -O-、-CH2 -CH(CH3 )-、-CH2 -CH2 -S-、-CH2 -CH2 -NH-、-CH2 -CH2 -CH2 -、-CH2 -CH2 -CH2 -O-、-CH2 -CH2 -CH(CH3 )-、-CH=CH-CH2 -、-CH2 -O-CH2 -O-、-CH2 -NH-O-、-CH2 -N(CH3 )-O-、-CH2 -O-CH2 -、-CH(CH3 )-O-及-CH(CH2 -O-CH3 )-O-及/或-CH2 -CH2 -及-CH=CH-。對於所有手性中心，可發現不對稱基團呈R 或S 取向。
在一些實施例中，R4* 及R2* 一起指定雙基C(Ra Rb )-N(Rc )-O-，其中Ra 及Rb 獨立地選自由以下組成之群：氫、鹵素、C1-6 烷基、經取代C1-6 烷基、C2-6 烯基、經取代C2-6 烯基、C2-6 炔基或經取代C2-6 炔基、C1-6 烷氧基、經取代C1-6 烷氧基、醯基、經取代醯基、C1-6 胺基烷基或經取代C1-6 胺基烷基，例如氫，且；其中Rc 選自由以下組成之群： 氫、鹵素、C1-6 烷基、經取代C1-6 烷基、C2-6 烯基、經取代C2-6 烯基、C2-6 炔基或經取代C2-6 炔基、C1-6 烷氧基、經取代C1-6 烷氧基、醯基、經取代醯基、C1-6 胺基烷基或經取代C1-6 胺基烷基，例如氫。
在一些實施例中，R4* 及R2* 一起指定雙基C(Ra Rb )-O-C(Rc Rd )-O-，其中Ra 、Rb 、Rc 及Rd 獨立地選自由以下組成之群：氫、鹵素、C1-6 烷基、經取代C1-6 烷基、C2-6 烯基、經取代C2-6 烯基、C2-6 炔基或經取代C2-6 炔基、C1-6 烷氧基、經取代C1-6 烷氧基、醯基、經取代醯基、C1-6 胺基烷基或經取代C1-6 胺基烷基，例如氫。
在一些實施例中，R4* 及R2* 形成雙基-CH(Z)-O-，其中Z選自由以下組成之群：C1-6 烷基、C2-6 烯基、C2-6 炔基、經取代C1-6 烷基、經取代C2-6 烯基、經取代C2-6 炔基、醯基、經取代醯基、經取代醯胺、硫醇或經取代硫基；且其中經取代基團各自獨立地經獨立地選自以下之視情況經保護之取代基單取代或多取代：鹵素、側氧基、羥基、OJ1 、NJ1 J2 、SJ1 、N3 、OC(=X)J1 、OC(=X)NJ1 J2 、NJ3 C(=X)NJ1 J2 及CN，其中J1 、J2 及J3 各自獨立地為H或C1-6 烷基，且X係O、S或NJ1 。 在一些實施例中，Z係C1-6 烷基或經取代C1-6 烷基。在一些實施例中，Z係甲基。在一些實施例中，Z係經取代C1-6 烷基。在一些實施例中，取代基係C1-6 烷氧基。在一些實施例中，Z係CH3 OCH2 -。對於所有手性中心，可發現不對稱基團呈R 或S 取向。該等二環核苷酸揭示於US 7,399,845中，其係全文以引用方式併入本文中。在一些實施例中，R1* 、R2 、R3 、R5 、R5* 係氫。在一些實施例中，R1* 、R2 、R3* 係氫，且R5 、R5* 中之一者或二者可不為氫，如上文及WO 2007/134181中所提及，其係全文以引用方式併入本文中。
在一些實施例中，R4* 及R2* 一起指定橋中包含經取代胺基之雙基，例如由雙基-CH2 -N(Rc )-組成或包含雙基-CH2 -N(Rc )-，其中Rc 係C1-12 烷基氧基。在一些實施例中，R4* 及R2* 一起指定雙基-Cq3 q4 -NOR- ，其中q3 及q4 獨立地選自由以下組成之群：氫、鹵素、C1-6 烷基、經取代C1-6 烷基、C2-6 烯基、經取代C2-6 烯基、C2-6 炔基或經取代C2-6 炔基、C1-6 烷氧基、經取代C1-6 烷氧基、醯基、經取代醯基、C1-6 胺基烷基或經取代C1-6 胺基烷基；其中每一經取代基團獨立地經獨立地選自以下之取代基單取代或多取代：鹵素、OJ1 、SJ1 、NJ1 J2 、COOJ1 、CN、O-C(=O)NJ1 J2 、N(H)C(=NH)NJ1 J2 或N(H)C(=X=N(H)J2 ，其中X係O或S；且J1 及J2 各自獨立地為H、C1-6 烷基、C2-6 烯基、C2-6 炔基、C1-6 胺基烷基或保護基團。對於所有手性中心，可發現不對稱基團呈R 或S 取向。該等二環核苷酸揭示於WO2008/150729中，其係全文以引用方式併入本文中。在一些實施例中，R1* 、R2 、R3 、R5 、R5* 獨立地選自由以下組成之群：氫、鹵素、C1-6 烷基、經取代C1-6 烷基、C2-6 烯基、經取代C2-6 烯基、C2-6 炔基或經取代C2-6 炔基、C1-6 烷氧基、經取代C1-6 烷氧基、醯基、經取代醯基、C1-6 胺基烷基或經取代C1-6 胺基烷基。在一些實施例中，R1* 、R2 、R3 、R5 、R5* 係氫。在一些實施例中，R1* 、R2 、R3 係氫且R5 、R5* 中之一者或二者可不為氫，如上文及WO 2007/134181中所提及。在一些實施例中，R4* 及R2* 一起指定雙基(二價基團)C(Ra Rb )-O-，其中Ra 及Rb 各自獨立地係鹵素、C1 -C12 烷基、經取代C1 -C12 烷基、C2 -C12 烯基、經取代C2 -C12 烯基、C2 -C12 炔基、經取代C2 -C12 炔基、C1 -C12 烷氧基、經取代C1 -C12 烷氧基、OJ1 、SJ1 、SOJ1 、SO2 J1 、NJ1 J2 、N3 、CN、C(=O)OJ1 、C(=O)NJ1 J2 、C(=O)J1 、O-C(=O)NJ1 J2 、N(H)C(=NH)NJ1 J2 、N(H)C(=O)NJ1 J2 或N(H)C(=S)NJ1 J2 ；或Ra 及Rb 一起為=C(q3)(q4)；q3 及q4 各自獨立地係H、鹵素、C1 -C12 烷基或經取代C1 -C12 烷基；每一經取代基團獨立地經獨立地選自以下之取代基單取代或多取代：鹵素、C1 -C6 烷基、經取代C1 -C6 烷基、C2 -C6 烯基、經取代C2 -C6 烯基、C2 -C6 炔基、經取代C2 -C6 炔基、OJ1 、SJ1 、NJ1 J2 、N3 、CN、C(=O)OJ1 、C(=O)NJ1 J2 、 C(=O)J1 、O-C(=O)NJ1 J2 、N(H)C(=O)NJ1 J2 或N(H)C(=S)NJ1 J2 ，且；J1 及J2 各自獨立地係H、C1-C6 烷基、經取代C1-C6 烷基、C2 -C6 烯基、經取代C2 -C6 烯基、C2 -C6 炔基、經取代C2 -C6 炔基、C1-C6 胺基烷基、經取代C1-C6 胺基烷基或保護基團。該等化合物揭示於WO2009006478A中，其係全文以引用方式併入本文中。
在一些實施例中，R4* 及R2* 形成雙基-Q-，其中Q係C(q1 )(q2 )C(q3 )(q4 )、C(q1 )=C(q3 )、C[=C(q1 )(q2 )]-C(q3 )(q4 )或C(q1 )(q2 )-C[=C(q3 )(q4 )]；q1 、q2 、q3 、q4 各自獨立地係H、鹵素、C1-12 烷基、經取代C1-12 烷基、C2-12 烯基、經取代C1-12 烷氧基、OJ1 、SJ1 、SOJ1 、SO2 J1 、NJ1 J2 、N3 、CN、C(=O)OJ1 、C(=O)-NJ1 J2 、C(=O)J1 、-C(=O)NJ1 J2 、N(H)C(=NH)NJ1 J2 、N(H)C(=O)NJ1 J2 或N(H)C(=S)NJ1 J2 ；J1 及J2 各自獨立地係H、C1-6 烷基、C2-6 烯基、C2-6 炔基、C1-6 胺基烷基或保護基團；且視情況其中在Q係C(q1 )(q2 )(q3 )(q4 )且q3 或q4 中之一者係CH3 時，則q3 或q4 中之另一者或q1 及q2 中之一者中之至少一者不為H。在一些實施例中，R1* 、R2 、R3 、R5 、R5* 係氫。對於所有手性中心，可發現不對稱基團呈R 或S 取向。該等二環核苷酸揭示於WO2008/154401中，其係全文以引用方式併入本文中。在一些實施例中，R1* 、R2 、R3 、R5 、R5* 獨立地選自由以下組成之群：氫、鹵素、C1-6 烷基、經取代C1-6 烷基、C2-6 烯基、經取代C2-6 烯基、C2-6 炔基或經取代C2-6 炔基、C1-6 烷氧基、經取代C1-6 烷氧基、醯基、經取代醯基、C1-6 胺基烷基或經取代C1-6 胺基烷基。在一些實施例中，R1* 、R2 、R3 、R5 、R5* 係氫。在一些實施例中，R1* 、R2 、R3 係氫且R5 、R5* 中之一者或二者可不為氫，如上文及WO 2007/134181或WO2009/067647中所提及(α-L-二環核酸類似物)。
其他二環核苷類似物及其在反義寡核苷酸中之用途揭示於WO2011/115818、WO2011/085102、WO2011/017521、 WO09/100320、WO10/036698、WO09/124295及WO09/006478中，其各自係全文以引用方式併入本文中。在一些態樣中，該等核苷類似物可用於本發明化合物中。
在一些實施例中，用於本發明寡核苷酸化合物中之LNA具有以下通式VI之結構：
其中Y選自由以下組成之群：-O-、-CH2 O-、-S-、-NH-、N(Re )及/或-CH2 -；Z及Z*獨立地選自核苷酸間鍵聯、RH 、末端基團或保護基團；B構成天然或非天然核苷酸鹼基部分(核鹼基)，且RH 選自氫及C1-4-烷基；Ra 、Rb 、Rc 、Rd 及Re 視情況獨立地選自由以下組成之群：氫、視情況經取代之C1-12 -烷基、視情況經取代之C2-12 -烯基、視情況經取代之C2-12 -炔基、羥基、C1-12 -烷氧基、C2-12 -烷氧基烷基、C2-12 -烯基氧基、羧基、C1-12 -烷氧基羰基、C1-12 -烷基羰基、甲醯基、芳基、芳基氧基-羰基、芳基氧基、芳基羰基、雜芳基、雜芳基氧基-羰基、雜芳基氧基、雜芳基羰基、胺基、單-及二(C1-6 -烷基)胺基、胺甲醯基、單-及二(C1-6 -烷基)-胺基-羰基、胺基-C1-6 -烷基-胺基羰基、單-及二(C1-6 -烷基)胺基-C1-6 -烷基-胺基羰基、C1-6 -烷基-羰基胺基、脲基、C1-6 -烷醯基氧基、碸基、C1-6 -烷基磺醯基氧基、硝基、疊氮基、硫基、C1-6 -烷硫基、鹵素、DNA嵌入劑、光化學活性基團、熱化學活性基團、螯合基團、報導基因基團及配體，其中芳基及雜芳基可視情況經取代且其中兩個孿型取代基Ra 及Rb 可一起指定視情況經取代之亞甲基(=CH2 )；及RH 選自氫及C1-4-烷基。在一些實施例中，Ra 、Rb 、Rc 、Rd 及Re 視情況獨立地選自由氫及C1-6 烷基(例如甲基)組成之群。 對於所有手性中心，可發現不對稱基團呈R 或S 取向，例如兩個實例性立體化學異構物包括β-D及α-L同種型，其可如下文所圖解說明：
具體實例性LNA單元顯示於下文中：
在其他實施例中，本發明寡聚物包含具有經修飾糖部分之核苷酸，如圖2、3、6、7、16A、16B、20A或20B中所述。
II.F. RNase招募
人們認識到，寡聚化合物可經由非RNase介導之靶mRNA降解(例如藉由對轉譯之立體阻礙)或其他方法發揮功能，然而，在一態樣中，本發明寡聚物能招募內切核糖核酸酶(RNase)，例如RNaseH。
在一態樣中，寡聚物或鄰接核苷酸序列包含至少7個鄰接核苷酸 單元(例如至少8或至少9個鄰接核苷酸單元(殘基)，在某些實施例中包括7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22或23個鄰接核苷酸)之區域，其在與互補靶RNA形成雙螺旋體時能招募RNase。能招募RNase之鄰接序列可為如在如本文所述間隔體情況中提及之區域B。在一些實施例中，能招募RNase之鄰接序列(例如區域B)之大小可較高，例如10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22或23個核苷酸單元。
全文以引用方式併入本文中之美國專利第6,617,442號提供測定RNaseH活性之活體外方法，其可用於測定招募RNaseH之能力。因此，在一個實施例中，本發明寡聚物能招募RNaseH。在另一實施例中，本發明包括鑑別能利用RNaseH機制、例如招募RNaseH之寡聚物之方法。
寡聚物可經篩選以鑑別彼等在招募RNaseH中有效者。寡聚物招募RNaseH之能力可藉由量測寡聚物與RNaseH之結合來測定。測定寡聚物與RNaseH之結合之方法為業內所熟知。舉例而言，寡聚物可經放射標記且寡聚物與RNaseH之結合可藉由放射自顯影來檢測。在一些實施例中，可製備RNaseH與麩胱甘肽-S-轉移酶或小肽標籤之融合蛋白並將其固定至諸如珠粒等固相。然後可將欲針對與此酶之結合篩選之經標記或未經標記寡聚物與該固相一起培育。然後可藉由檢測經結合標記或藉由自固相特異性溶析經結合寡聚物來鑑別結合至固定至固相之酶之寡聚物。另一種方法涉及在寡聚物庫中篩選結合配偶體。使用重組的加標籤或經標記的RNaseH從庫中選擇與酶相互作用之寡聚物。對寡聚物之測序導致鑑別彼等將更有效作為反義分子之寡聚物。
使用美國專利第6,617,442號之實例91-95所提供之方法，若在提供有互補RNA靶時寡聚物之初始速率(如以pmol/l/min量測)為使用僅 DNA寡核苷酸測定之初始速率之至少1%(例如至少5%，例如至少10%或大於20%)，則認為該寡聚物能招募RNaseH，該僅DNA寡核苷酸具有相同鹼基序列但僅含有DNA單體，無2'取代，在該寡核苷酸之所有單體之間具有硫代磷酸酯鍵聯基團。
在一些實施例中，使用美國專利第6,617,442號之實例91-95所提供之方法，若在提供有互補RNA靶及RNaseH時，RNaseH初始速率(如以pmol/l/min所量測)為使用等效僅DNA寡核苷酸所測定之初始速率之小於1%(例如小於5%，例如小於10%或小於20%)，則認為寡聚物基本上不能招募RNaseH，該等效僅DNA寡核苷酸無2'取代，在該寡核苷酸之所有核苷酸之間具有硫代磷酸酯鍵聯基團。
在其他實施例中，使用美國專利第6,617,442號之實例91-95所提供之方法，若在提供有互補RNA靶及RNaseH時，RNaseH初始速率(如以pmol/l/min所量測)為使用等效僅DNA寡核苷酸所測定之初始速率之至少20%(例如至少40%，例如至少60%，例如至少80%)，則認為寡聚物能招募RNaseH，該等效僅DNA寡核苷酸無2'取代，在該寡核苷酸之所有核苷酸之間具有硫代磷酸酯鍵聯基團。
通常，寡聚物中形成連續核苷酸單元在與互補靶RNA形成雙螺旋體時能招募RNase之區域係由核苷酸單元組成，該等核苷酸單元與RNA靶形成DNA/RNA樣雙螺旋體，且包括DNA單元及LNA單元，其呈α-L構形、尤佳為α-L-氧基LNA。
在一些實施例中，能招募RNase之單體選自由以下組成之群：DNA單體、α-L-LNA單體、C4'烷基化DNA單體(參見PCT/EP2009/050349，及Vester等人，Bioorg.Med.Chem.Lett.18(2008)2296-2300，全文以引用方式併入本文中)及UNA(無鏈接核酸)(unlinked nucleic acid)核苷酸(參見Fluiter等人，Mol.Biosyst.,2009,10,1039，以引用方式併入本文中)。UNA係解鎖核酸，通常其中核糖之C2-C3 C-C鍵已移除，形成解鎖「糖」殘基。
II.G. 寡聚物設計
本發明寡聚物可包含含核苷酸及核苷酸類似物之核苷酸序列，且可呈間隔體、阻斷體、混合體、頭聚物、尾聚物或總聚物形式。可用於本發明寡聚物之間隔體、阻斷體、混合體、頭聚物、尾聚物或總聚物之構形之實例闡述於美國專利申請公開案第2012/0322851號中，其全文以引用方式併入本文中。
間隔體寡聚物係包含能招募RNase(例如RNaseH)之核苷酸鄰接延伸段(例如至少7個DNA核苷酸之區域)之寡聚物，在5'及3'兩端側接增強親和性之1-6個核苷酸類似物之區域於能招募RNase之核苷酸鄰接延伸段之5'及3'。
「頭聚物」定義為包含區域X及其鄰接區域Y之寡聚物，且區域Y之最5'端單體連接至區域X之最3'單體。區域X包含非RNase招募之核苷類似物鄰接延伸段，且區域Y包含DNA單體或可由RNase識別並裂解之核苷類似物單體之鄰接延伸段(例如至少7個鄰接單體)。
「尾聚物」定義為包含區域X及與其鄰接之區域Y之寡聚物，且區域Y之最5'單體連接至區域X之最3'單體。區域X包含DNA單體或可由RNase識別並裂解之核苷類似物單體之鄰接延伸段(例如至少7個鄰接單體)，且區域Y包含非RNase招募核苷類似物之鄰接延伸段。
其他稱為「混合體」之「嵌合」寡聚物由(i)DNA單體或可由RNase識別並裂解之核苷類似物單體及(ii)非RNase招募核苷類似物單體之交替組合物組成。
「總聚物」係僅包含非天然核苷酸或核苷酸類似物之單鏈寡聚物。
在一些實施例中，除了增強寡聚物對靶區域之親和性以外，一些核苷類似物亦介導RNase(例如，RNaseH)結合及裂解。由於α-L- LNA單體招募RNaseH活性至某一程度，在一些實施例中，含有α-L-LNA單體之寡聚物之空位區域(例如，如本文所提及之區域B)由較少可由RNaseH識別並裂解之單體組成，且在混合體構築中引入更強撓性。
II.G.1. 間隔體設計
在一實施例中，本發明寡聚物係間隔體。間隔體寡聚物係包含能招募RNase、例如RNaseH之核苷酸之鄰接延伸段(例如本文中稱為區域B(B)之至少7個DNA核苷酸之區域)之寡聚物，其中區域B在5'及3'側接增強親和性之核苷酸類似物之區域，例如在能招募RNase之核苷酸之鄰接延伸段之5'及3'之1-10個核苷酸類似物，該等區域分別稱為區域A(A)及C(C)。
在某些實施例中，間隔體係交替側接間隔體，其實例論述於下文中。在某些實施例中，交替側接間隔體展現之非靶結合少於傳統間隔體。在某些實施例中，交替側接間隔體之長期耐受性優於傳統間隔體。
交替側接間隔體可包含式(5’至3’)A-B-C之(聚)核苷酸序列，其中：區域A(A)(5’區域或第一翼序列)包含至少一個核苷酸類似物，例如至少一個LNA單元，例如1-10個核苷酸類似物，例如LNA單元，且；區域B(B)包含能招募RNase(在與互補RNA分子、例如前mRNA或mRNA靶形成雙螺旋體時)之至少7個鄰接核苷酸，例如DNA核苷酸，且；區域C(C)(3’區域或第二翼序列)包含至少一個核苷酸類似物，例如至少一個LNA單元，例如1-10個核苷酸類似物，例如LNA單元；其中區域A及C可在A及C中之任一位置包括1-2個DNA核苷酸區域(例如，DNA間隔體)之插入，其中該等DNA插入可各自長1-3個DNA單元。
在某些其他實施例中，間隔體(例如交替側接間隔體)包含式(5'至 3')A-B-C或視情況A-B-C-D或D-A-B-C之(聚)核苷酸序列，其中：區域A(A)(5'區域)包含至少一個核苷酸類似物，例如至少一個LNA單元，例如1-10個核苷酸類似物，例如LNA單元，且；區域B(B)包含能招募RNase之(在與互補RNA分子、例如mRNA靶形成雙螺旋體時)至少7個鄰接核苷酸，例如DNA核苷酸，且；區域C(C)(3'區域)包含至少一個核苷酸類似物，例如至少一個LNA單元，例如1-10個核苷酸類似物，例如LNA單元，且；區域D(D)在存在時包含1、2或3個核苷酸單元，例如DNA核苷酸。
在一些實施例中，區域A包含1、2、3、4、5、6、7、8、9或10個核苷酸類似物，例如LNA單元，例如2-5個核苷酸類似物，例如2-5個LNA單元，例如2-5個核苷酸類似物，例如3-5個LNA單元；及/或區域C由1、2、3、4、5、6、7、8、9或10個核苷酸類似物組成，例如LNA單元，例如2-5個核苷酸類似物，例如2-5個LNA單元，例如2-5個核苷酸類似物，例如3-5個LNA單元。
在一些實施例中，B包含能招募RNase之7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22或23個鄰接核苷酸，或能招募RNase之8-14、或7-10、或7-9、例如8、例如9、例如10、或例如14個鄰接核苷酸。在一些實施例中，區域B包含至少7個DNA核苷酸單元，例如7-23個DNA單元、例如7-20個DNA單元、例如7-14個DNA單元、例如8-14個DNA單元、例如7、8、9、10、11、12、13或14個DNA單元。
在一些實施例中，區域A包含3、4或5個核苷酸類似物，例如LNA，區域B由7、8、9、10、11、12、13或14個DNA單元組成，且區域C由3、4或5個核苷酸類似物(例如LNA)組成。該等設計包括(A-B-C)5-10-5、3-14-3、3-10-3、3-10-4、4-10-3、3-9-3、3-9-4、4-9-3、3-8-3、3-8-4、4-8-3、3-7-3、3-7-4及4-7-3，且可進一步包括區域 D，該區域D可具有1至3個核苷酸單元，例如DNA單元。
在一些實施例中，本發明寡聚物(例如交替側接間隔體)具有式5’-A-B-C-3’，其中(i)B係7至23個DNA單元之鄰接序列；(ii)A係1至10個核苷酸之第一翼序列，其中該第一翼序列包含一或多個核苷酸類似物及視情況一或多個DNA單元(例如，DNA間隔體)且其中該等核苷酸類似物中之至少一者位於A之5’端；且(iii)C係1至10個核苷酸之第二翼序列，其中該第二翼序列包含一或多個核苷酸類似物及視情況一或多個DNA單元(例如，DNA間隔體)且其中該等核苷酸類似物中之至少一者位於C之3’端。
在其他實施例中，寡聚物(例如交替側接間隔體)具有式5'-A-B-C-3’，其中B係7至23個DNA單元之鄰接序列，A係LmDnLoDpLq且C係Lm’Dn’Lo’Dp’Lq’且其中L係核苷酸類似物；D係DNA單元；m及q’係1至6個單元；n、p、n’及p’係0至2個單元；且o、q、m’及o’係0至5。
在一些實施例中，第一翼序列(式中之A)包含選自以下之核苷酸類似物與DNA單元之組合：(i)1-9個核苷酸類似物及1個DNA單元；(ii)1-8個核苷酸類似物及1-2個DNA單元；(iii)1-7個核苷酸類似物及1-3個DNA單元；(iv)1-6個核苷酸類似物及1-4個DNA單元；(v)1-5個核苷酸類似物及1-5個DNA單元；(vi)1-4個核苷酸類似物及1-6個DNA單元；(vii)1-3個核苷酸類似物及1-7個DNA單元；(viii)1-2個核苷酸類似物及1-8個DNA單元；及(ix)1個核苷酸類似物及1-9個DNA單元。
在某些實施例中，第二翼序列(式中之C)包含選自以下之核苷酸類似物與DNA單元之組合：(i)1-9個核苷酸類似物及1個DNA單元；(ii)1-8個核苷酸類似物及1-2個DNA單元；(iii)1-7個核苷酸類似物及1-3個DNA單元；(iv)1-6個核苷酸類似物及1-4個DNA單元；(v)1-5個 核苷酸類似物及1-5個DNA單元；(vi)1-4個核苷酸類似物及1-6個DNA單元；(vii)1-3個核苷酸類似物及1-7個DNA單元；(viii)1-2個核苷酸類似物及1-8個DNA單元；及(ix)1個核苷酸類似物及1-9個DNA單元。
在一些實施例中，寡聚物式中之A具有選自以下之子式：L、LL、LDL、LLL、LLDL、LDLL、LDDL、LLLL、LLLLL、LLLDL、LLDLL、LDLLL、LLDDL、LDDLL、LLDLD、LDLLD、LDDDL、LLLLLL、LLLLDL、LLLDLL、LLDLLL、LDLLLL、LLLDDL、LLDLDL、LLDDLL、LDDLLL、LDLLDL、LDLDLL、LDDDLL、LLDDDL及LDLDLD，且寡聚物式中之C具有選自以下之子式：L、LL、LDL、LLL、LLDL、LLLL、LDLL、LDDL、LLDD、LLLLL、LLLLD、LLLDL、LLDLL、LDLLL、LLDDL、LDDLL、LLDLD、LDLLD、LDDDL、LLLLLL、LLLLDL、LLLDLL、LLDLLL、LDLLLL、LLLDDL、LLDLDL、LLDDLL、LDDLLL、LDLLDL、LDLDLL、LDDDLL、LLDDDL及LDLDLD。
在某些實施例中，寡聚物(例如交替側接間隔體)具有式5’A-B-C 3’，其中B係7至23個DNA單元之鄰接序列，A具有式LLDLL、LDLLL或LLLDL，且C具有式LLDLL或LDLDLL，且其中L係LNA單元且D係DNA單元。
在其他實施例中，本發明寡聚物係具有式5’A-B-C 3’之交替側接間隔體，其中寡聚物具有12至25個核苷酸之長度，A係具有式Lm dn Lo dp Lq 之第一翼序列，C係具有式Lq’ dp’ Lo’ dn’ Lm 之第二翼序列，其中每一翼獨立地具有1-17個核苷酸之長度且視情況夾雜有DNA間隔物dn 、dp 、dn 及dp ，其各自獨立地具有0至3個DNA單元，且每一翼側接7至23個核苷酸之皆為DNA之空位；其中m及m’係至少1； 且n、n’、p及p’獨立地為0-3個單元；使得m+n+o+p+q=1-17；且獨立地m’+n’+o’+p’+q’=1-17；或(m+n+o+p+q)及(m’+n’+o’+p’+q’)獨立地為1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12,、13、14、15、16或17；或B包含7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22或23之DNA空位。
其他間隔體設計揭示於WO2004/046160中，其係全文以引用方式併入本文中。全文以引用方式併入本文中之WO2008/113832係關於「短聚物」間隔體寡聚物。在一些實施例中，本文中呈現之寡聚物可為該等短聚物間隔體。
在一些實施例中，寡聚物(例如交替側接間隔體)包含總計10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20個核苷酸單元之鄰接核苷酸序列，其中該鄰接核苷酸序列具有式(5'-3')A-B-C，或視情況A-B-C-D或D-A-B-C，其中；A由1、2、3、4或5個核苷酸類似物單元(例如LNA單元)組成；B由在與互補RNA分子(例如mRNA靶)形成雙螺旋體時能招募RNase之7、8、9、10、11、12、13或14個鄰接核苷酸單元組成；且C由1、2、3、4或5個核苷酸類似物單元(例如LNA單元)組成。在存在時，D由單一DNA單元組成。
在一些實施例中，A包含1個LNA單元。在一些實施例中，A包含2個LNA單元。在一些實施例中，A包含3個LNA單元。在一些實施例中，A包含4個LNA單元。在一些實施例中，A包含5個LNA單元。在一些實施例中，C包含1個LNA單元。在一些實施例中，C包含2個LNA單元。在一些實施例中，C包含3個LNA單元。在一些實施例中，C包含4個LNA單元。在一些實施例中，C包含5個LNA單元。在一些實施例中，B包含7個核苷酸單元。在一些實施例中，B包含8個核苷 酸單元。在一些實施例中，B包含9個核苷酸單元。在某些實施例中，B包含10個核苷單元。在某些實施例中，B包含11個核苷單元。在某些實施例中，B包含12個核苷單元。在某些實施例中，B包含13個核苷單元。在某些實施例中，B包含14個核苷單元。在某些實施例中，B包含7-23個DNA單體。在一些實施例中，B包含7-23個DNA單元，例如7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22或23個DNA單元。在一些實施例中，B由DNA單元組成。在一些實施例中，B包含至少一個呈α-L構形之LNA單元，例如2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22或23個呈α-L-構形之LNA單元。在一些實施例中，B包含至少一個α-L-氧基LNA單元或其中所有呈α-L-構形之LNA單元皆係α-L-氧基LNA單元。在一些實施例中，存於A-B-C中之核苷酸數選自(核苷酸類似物單元-區域B-核苷酸類似物單元)：1-8-1、1-8-2、2-8-1、2-8-2、3-8-3、2-8-3、3-8-2、4-8-1、4-8-2、1-8-4、2-8-4，或；1-9-1、1-9-2、2-9-1、2-9-2、2-9-3、3-9-2、1-9-3、3-9-1、4-9-1、1-9-4，或；1-10-1、1-10-2、2-10-1、2-10-2、1-10-3及3-10-1。在一些實施例中，A-B-C中之核苷酸數選自：2-7-1、1-7-2、2-7-2、3-7-3、2-7-3、3-7-2、3-7-4及4-7-3。在其他實施例中，寡聚物含有10個B中之DNA單元、A(第一翼)中之LDLLL及C(第二翼)中之LLDLL。在其他實施例中，寡聚物含有9個B中之DNA單元、A中之LDDLL及C中之LDLDLL。在其他實施例中，寡聚物含有10個B中之DNA單元、A中之LLDLL及C中之LLDLL。在其他實施例中，寡聚物含有9個B中之DNA單元、A中之LLLLL及C中之LDDLL。在某些實施例中，區域A及C各自包含3個LNA單體，且區域B由7、8、9、10、11、12、13或14個核苷單體(例如DNA單體)組成。在一些實施例中，A及C二者各自由兩個LNA單元組成，且B由7、8或9個核苷酸單元(例如DNA單元) 組成。在各個實施例中，其他間隔體設計包括彼等其中區域A及/或C由3、4、5或6個核苷類似物(例如含有2'-O-甲氧基乙基-核糖(2'-MOE)之單體或含有2'-氟-去氧核糖之單體)組成且區域B由7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22或23個核苷(例如DNA單體)者，其中區域A-B-C具有3-8-3、3-9-3、3-10-3、5-10-5或4-12-4單體。其他間隔體設計揭示於WO 2007/146511A2中，全文以引用方式併入本文中。
在一些實施例中，交替側接寡聚物具有至少10個鄰接核苷酸，包含區域A、區域B及區域C(A-B-C)，其中區域B包含至少5個鄰接核苷單元且在5'側接有1-8個鄰接核苷單元之區域A且在3'側接有1-8個鄰接核苷單元之區域C，其中區域B在與互補RNA形成雙螺旋體時能招募RNaseH，且其中區域A及區域C選自由以下組成之群：(i)區域A包含5’LNA核苷單元及3’LNA核苷單元，及介於5' LNA核苷單元與3' LNA核苷單元之間之至少一個DNA核苷單元，且區域C包含至少兩個3’LNA核苷；或(ii)區域A包含至少一個5’LNA核苷且區域C包含5’LNA核苷單元、至少兩個末端3’LNA核苷單元及介於5' LNA核苷單元與3' LNA核苷單元之間之至少一個DNA核苷單元，且(iii)區域A包含5’LNA核苷單元及3’LNA核苷單元及介於5' LNA核苷單元與3' LNA核苷單元之間之至少一個DNA核苷單元；且區域C包含5’LNA核苷單元、至少兩個末端3’LNA核苷單元及介於5' LNA核苷單元與3' LNA核苷單元之間之至少一個DNA核苷單元。
在一些實施例中，區域A或區域C包含1、2或3個DNA核苷單元。在其他實施例中，區域A及區域C包含1、2或3個DNA核苷單元。在其他實施例中，區域B包含至少5個鄰接DNA核苷單元。在某些實施例中，區域B包含6、7、8、9、10、11、12、13或14個鄰接DNA核苷單 元。在一些實施例中，區域B之長度為8、9、10、11或12個核苷酸。在其他實施例中，區域A包含兩個5’末端LNA核苷單元。在一些實施例中，區域A具有式5’[LNA]1-3 [DNA]1-3 [LNA]1-3 或5’[LNA]1-2 [DNA]1-2 [LNA]1-2 [DNA]1-2 [LNA]1-2 。在其他實施例中，區域C具有式[LNA]1-3 [DNA]1-3 [LNA]2-3 3’或[LNA]1-2 [DNA]1-2 [LNA]1-2 [DNA]1-2 [LNA]2-3 3’。在其他實施例中，區域A具有式5’[LNA]1-3 [DNA]1-3 [LNA]1-3 或5’[LNA]1-2 [DNA]1-2 [LNA]1-2 [DNA]1-2 [LNA]1-2 ，且區域C包含2、3、4或5個鄰接LNA核苷單元。在一些實施例中，區域C具有式[LNA]1-3 [DNA]1-3 [LNA]2-3 3’或[LNA]1-2 [DNA]1-2 [LNA]1-2 [DNA]1-2 [LNA]2 -3 3’，且區域A包含1、2、3、4或5個鄰接LNA核苷單元。在其他實施例中，區域A具有選自由以下組成之群之LNA及DNA核苷之5’-3’序列：L、LL、LDL、LLL、LLDL、LDLL、LDDL、LLLL、LLLLL、LLLDL、LLDLL、LDLLL、LLDDL、LDDLL、LLDLD、LDLLD、LDDDL、LLLLLL、LLLLDL、LLLDLL、LLDLLL、LDLLLL、LLLDDL、LLDLDL、LLDDLL、LDDLLL、LDLLDL、LDLDLL、LDDDLL、LLDDDL及LDLDLD，其中L代表LNA核苷，且D代表DNA核苷。在其他實施例中，區域C具有選自由以下組成之群之LNA及DNA核苷之5’-3’序列：LL、LLL、LLLL、LDLL、LLLLL、LLDLL、LDLLL、LDDLL、LDDLLL、LLDDLL、LDLDLL、LDDDLL、LDLDDLL、LDDLDLL、LDDDLLL及LLDLDLL。在另一實施例中，區域A具有選自由以下組成之群之LNA及DNA核苷之5’-3’序列：LDL、LLDL、LDLL、LDDL、LLLDL、LLDLL、LDLLL、LLDDL、LDDLL、LLDLD、LDLLD、LDDDL、LLLLDL、LLLDLL、LLDLLL、LDLLLL、LLLDDL、LLDLDL、LLDDLL、LDDLLL、LDLLDL、LDLDLL、LDDDLL、LLDDDL及LDLDLD，且區域C具有選自由以下組成之群之LNA及DNA核苷之5’-3’序列： LDLL、LLLLL、LLDLL、LDLLL、LDDLL、LDDLLL、LLDDLL、LDLDLL、LDDDLL、LDLDDLL、LDDLDLL、LDDDLLL及LLDLDLL。
在某些實施例中，交替側接寡聚物具有構成5'-3'核苷序列之鄰接核苷酸，其選自由以下組成之群：LLDDDLLDDDDDDDDLL、LDLLDLDDDDDDDDDLL、LLLDDDDDDDDDDLDLL、LLLDDDDDDDDDLDDLL、LLLDDDDDDDDLDDDLL、LLLDDDDDDDDLDLDLL、LLLDLDDDDDDDDDLLL、LLLDLDDDDDDDDLDLL、LLLLDDDDDDDDDLDLL、LLLLDDDDDDDDLDDLL、LLLDDDLDDDDDDDDLL、LLLDDLDDDDDDDDDLL、LLLDDLLDDDDDDDDLL、LLLDDLLDDDDDDDLLL、LLLLLDDDDDDDLDDLL、LDLLLDDDDDDDDDDLL、LDLLLDDDDDDDLDDLL、LDLLLLDDDDDDDDDLL、LLDLLLDDDDDDDDDLL、LLLDLDDDDDDDDDDLL、LLLDLDDDDDDDLDDLL、LLLDLLDDDDDDDDDLL、LLLLDDDDDDDLDDDLL、LLLLLDDDDDDDDDLDLL、LLLLDDDDDDDDDDLDLL、LLLDDDDDDDDDDDLDLL、LLDLDDDDDDDDDDLDLL、LDLLLDDDDDDDDDLDLL、LLLDDDDDDDDDDLDDLL、LLLDDDDDDDDDLDDDLL、LLLDDDDDDDDLDLDDLL、LLLLDDDDDDDDDLDDLL、LLLLDDDDDDDDDLDLLL、LLLLDDDDDDDDLDDDLL、LLLLDDDDDDDDLDDLLL、LLLLDDDDDDDDLDLDLL、LLLLDDDDDDDLDDLDLL、LLLLDDDDDDDLDLDDLL、LLDLLDDDDDDDDDDDLL、LLDLLLDDDDDDDDLDLL、LLLDLDDDDDDDDDDDLL、LLLDLDDDDDDDDDLDLL、LLLDLDDDDDDDDLDDLL、 LLLDLDDDDDDDLDLDLL、LLLLDDDDDDDDDLLDLL、LLLLLDDDDDDDDDLDLLL、LLLLLDDDDDDDDDLDDLL、LLLLDDDDDDDDDDLLDLL、LLLLDDDDDDDDDDLDLLL、LLLLDDDDDDDDDDLDDLL、LLLDDDDDDDDDDDLLDLL、LLLDDDDDDDDDDDLDLLL、LLLLLDDDDDDDDDLLDLL、LLLDDDDDDDDDDDLDDLL、LLDLLDDDDDDDDDLDDLL、LLLDLDDDDDDDDDDLDLL、LLLDLDDDDDDDDDLDDLL、LLLLDDDDDDDDDLDLDLL、LLLLDDDDDDDDLLDLDLL、LDLLLDDDDDDDDDDLLDLL、LLDLLDDDDDDDDDDLLDLL、LLDLDDDDDDDDDDDDLLLL、LLDDLDDDDDDDDDDDLLLL、LLLDLDDDDDDDDDDDLLLL、LLDLDDDDDDDDDDDDDLLL、LLDLLDDDDDDDDDDDLLLL、LLDDLDDDDDDDDDDDDLLL、LLLDDDDDDDDDDDLDDLLL、LLLDLDDDDDDDDDDDDLLL、LLDLLDDDDDDDDDDDDLLL、LLLLDDDDDDDDDDDLLDLL、LLLLDDDDDDDDDDLLDDLL、LLLDDLDDDDDDDDDLDLLL、LLDDLDLDDDDDDDDDLLLL、LLDDLLDDDDDDDDDLDLLL、LLLDLDDDDDDDDDLDLDLL、LLDLLDDDDDDDDDLDDLLL、LLLDLDDDDDDDDDDLDLLL、LLDLDDLDDDDDDDDDLLLL、LLLLDDDDDDDDDLDLDDLL、LLLDLDDDDDDDDDLDDLLL、LLDLDLDDDDDDDDDDLLLL、LLDLLDDDDDDDDDDLDLLL、LLDLDLDDDDDDDDDLLDLL、LLDDLLDDDDDDDDDLLDLL、LLLLDDDDDDDDDLDDLDLL、LLLDDLDDDDDDDDDLLDLL、LLDLLDDDDDDDDDLLDDLL、LLDLDLDDDDDDDDDLDLLL、LLLDLDDDDDDDDDLLDDLL、LLDDLLDDDDDDDDDDLLLL、LLDLLDDDDDDDDDLDLDLL、LLLLDDDDDDDDDDLDDLLL、LLLDDLDDDDDDDDDDLLLL、LLLDLDDDDDDDDDDLLDLL、 LLLLDDDDDDDDDDLDLDLL、LLLLDDDDDDDDDDDLDLLL及LLDDLLDDDDDDDDDDLDLL；其中L代表LNA核苷，且D代表DNA核苷。在其他實施例中，LNA核苷係β-D-氧基LNA。
在其他實施例中，交替側接寡聚物具有構成LNA及DNA核苷單元之5'-3'交替序列之鄰接核苷酸，其選自由以下組成之群：2 -3-2 -8-2 、1 -1-2 -1-1 -9-2 、3 -10-1 -1-2 、3 -9-1 -2-2 、3 -8-1 -3-2 、3 -8-1 -1-1 -1-2 、3 -1-1 -9-3 、3 -1-1 -8-1 -1-2 、4 -9-1 -1-2 、4 -8-1 -2-2 、3 -3-1 -8-2 、3 -2-1 -9-2 、3 -2-2 -8-2 、3 -2-2 -7-3 、5 -7-1 -2-2 、1 -1-3 -10-2 、1 -1-3 -7-1 -2-2 、1 -1-4 -9-2 、2 -1-3 -9-2 、3 -1-1 -10-2 、3 -1-1 -7-1 -2-2 、3 -1-2 -9-2 、4 -7-1 -3-2 、5 -9-1 -1-2 、4 -10-1 -1-2 、3 -11-1 -1-2 、2 -1-1 -10-1 -1-2 、1 -1-3 -9-1 -1-2 、3 -10-1 -2-2 、3 -9-1 -3-2 、3 -8-1 -1-1 -2-2 、4 -9-1 -2-2 、4 -9-1 -1-3 、4 -8-1 -3-2 、4 -8-1 -2-3 、4 -8-1 -1-1 -1-2 、4 -7-1 -2-1 -1-2 、4 -7-1 -1-1 -2-2 、2 -1-2 -11-2 、2 -1-3 -8-1 -1-2 、3 -1-1 -11-2 、3 -1-1 -9-1 -1-2 、3 -1-1 -8-1 -2-2 、3 -1-1 -7-1 -1-1 -1-2 、4 -9-2 -1-2 、4 -7-1 -3-3 、5 -9-1 -1-3 、5 -9-1 -2-2 、4 -10-2 -1-2 、4 -10-1 -1-3 、4 -10-1 -2-2 、3 -11-2 -1-2 、3 -11-1 -1-3 、5 -9-2 -1-2 、3 -11-1 -2-2 、2 -1-2 -9-1 -2-2 、3 -1-1 -10-1 -1-2 、3 -1-1 -9-1 -2-2 、4 -9-1 -1-1 -1-2 、4 -8-2 -1-1 -1-2 、1 -1-3 -10-2 -1-2 、2 -1-2 -10-2 -1-2 、2 -1-1 -12-4 、2 -2-1 -11-4 、3 -1-1 -11-4 、2 -1-1 -13-3 、2 -1-2 -11-4 、2 -2-1 -12-3 、3 -11-1 -2-3 、3 -1-1 -12-3 、2 -1-2 -12-3 、4 -11-2 -1-2 、4 -10-2 -2-2 、3 -2-1 -9-1 -1-3 、2 -2-1 -1-1 -9-4 、2 -2-2 -9-1 -1-3 、3 -1-1 -9-1 -1-1 -1-2 、2 -1-2 -9-1 -2-3 、3 -1-1 -10-1 -1-3 、2 -1-1 -2-1 -9-4 、4 -9-1 -1-1 -2-2 、3 -1-1 -9-1 -2-3 、2 -1-1 -1-1 -10-4 、2 -1-2 -10-1 -1-3 、2 -1-1 -1-1 -9-2 -1-2 、2 -2-2 -9-2 -1-2 、4 -9-1 -2-1 -1-2 、3 -2-1 -9-2 -1-2 、2 -1-2 -9-2 -2-2 、2 -1-1 -1-1 -9-1 -1-3 、3 -1-1 -9-2 -2-2 、2 -2-2 -10-4 、2 -1-2 -9-1 -1-1 -1-2 、4 -10-1 -2-3 、3 -2-1 -10-4 、3 -1-1 -10-2 -1-2 、4 -10-1 -1-1 -1-2 、4 -11-1 -1-3 及2 -2-2 -10-1 -1-2 ；其中第一個數字代表LNA單元數，下一數字代表DNA單元，且其後LNA與DNA區域交 替。
在其他實施例中，本發明寡聚物具有圖2、3、6、7、16A、16B、20A或20B中所述之設計。
II.H. 核苷酸間鍵聯
本文中所述寡聚物之單體係經由鍵聯基團偶合在一起。適宜地，每一單體經由鍵聯基團連接至3'毗鄰單體。
熟習此項技術者應理解，在本發明情況下，在寡聚物末端之5'單體不包含5'鍵聯基團，但其可包含或可不包含5'末端基團。
術語「鍵聯基團」或「核苷酸間鍵聯」欲意指能將兩個核苷酸共價偶合在一起之基團。具體且較佳之實例包括磷酸酯基團及硫代磷酸酯基團。
本發明寡聚物或其鄰接核苷酸序列之核苷酸係經由鍵聯基團偶合在一起。適宜地，每一核苷酸經由鍵聯基團連接至3'毗鄰核苷酸。
適宜核苷酸間鍵聯包括彼等列示於WO2007/031091內者，例如列示於WO2007/031091(其全文以引用方式併入本文中)之第34頁第1段中之核苷酸間鍵聯。
可用於本發明中之適宜核苷酸間鍵聯之實例包括磷酸二酯鍵聯、磷酸三酯鍵聯、甲基磷酸酯鍵聯、胺基磷酸酯鍵聯、硫代磷酸酯鍵聯及其組合。
在一些實施例中，較佳將核苷酸間鍵聯自其正常磷酸二酯修飾至對核酸酶攻擊抗性更強者，例如硫代磷酸酯或硼烷磷酸酯，該二者可由RNaseH裂解，在降低靶基因之表現中亦容許反義抑制途徑。
如本文所提供之適宜含硫(S)核苷酸間鍵聯可較佳。尤其對於間隔體之空位區域(B)而言，硫代磷酸酯核苷酸間鍵聯亦較佳。硫代磷酸酯鍵聯亦可用於側接多個區域(A及C，且用於連接A或C至D，及視需要在區域D內)。
然而，尤其例如在使用核苷酸類似物防止區域A及C內之核苷酸間鍵聯被內切核酸酶降解時(例如在區域A及C包含LNA核苷酸時)，區域A、B及C可包含硫代磷酸酯以外之核苷酸間鍵聯，例如磷酸二酯鍵聯。
寡聚物中之核苷酸間鍵聯可為磷酸二酯、硫代磷酸酯或硼烷磷酸酯以容許RNaseH裂解所靶向RNA。由於改良之核酸酶抗性及其他原因(例如易於製造)，硫代磷酸酯較佳。
在本發明寡聚物之一態樣中，核苷酸及/或核苷酸類似物係藉助硫代磷酸酯基團彼此連接。
人們認識到，尤其在核苷酸類似物單元之間或毗鄰該等核苷酸類似物單元(通常在區域A及或C中)將磷酸二酯鍵聯(例如一個或兩個鍵聯)包括至原本硫代磷酸酯寡聚物中可改變寡聚物之生物利用度及/或生物分佈，參見WO2008/113832，其以引用方式併入本文中。
在一些實施例(例如上文所提及之實施例)中，若適宜且未明確指示，所有其餘鍵聯基團皆係磷酸二酯或硫代磷酸酯或其混合物。
在一些實施例中，所有核苷酸間鍵聯基團皆係硫代磷酸酯。
在提及具體間隔體寡核苷酸序列(例如本文所提供之彼等)時應理解，在不同實施例中，尤其對於核苷酸類似物(例如LNA)單元之間之鍵聯，在鍵聯係硫代磷酸酯鍵聯時，可使用替代鍵聯(例如本文所揭示之彼等)，例如可使用磷酸酯(磷酸二酯)鍵聯。同樣，在提及具體間隔體寡核苷酸序列(例如本文所提供之彼等)時，在C殘基注釋為5'甲基修飾胞嘧啶時，在不同實施例中，一或多個存於寡聚物中之C可為未修飾C殘基。
於2011年6月2日公開且全文以引用方式併入本文中之美國公開案第2011/0130441號係關於具有至少一個藉由中性核苷間鍵聯連接至3'或5'末端之二環核苷之寡聚化合物。因此，本發明寡聚物可具有至 少一個藉由中性核苷間鍵聯(例如一或多個磷酸三酯、甲基磷酸酯、MMI、醯胺-3、甲縮醛或硫代甲縮酸)連接至3'或5'末端之二環核苷。其餘鍵聯可為硫代磷酸酯。
在一些實施例中，本發明寡聚物具有圖2、16B或20B中闡述之核苷酸間鍵聯。如本文(例如圖2、16B或20B)所用硫代磷酸酯鍵聯指示為「s」，且磷酸二酯鍵聯係藉由不存在「s」來指示。
在一些實施例中，核苷酸間鍵聯係硫代磷酸酯鍵聯與磷酸二酯鍵聯之組合。組合鍵聯之非限制性實例顯示於ASO-002623、ASO-002667、ASO-002674、ASO-002631、ASO-002639及ASO-002624中。
III. 偶聯物
在該情況下，術語「偶聯物」意欲指示藉由如本文所述之寡聚物與一或多個非核苷酸或非多核苷酸部分之共價或非共價連接(「偶聯」)形成之異質性分子。非核苷酸或非多核苷酸部分之實例包括巨分子劑，例如蛋白質、脂肪酸鏈、糖殘基、糖蛋白、聚合物或其組合。通常proteins can be抗體for a target protein.在一些實施例中，典型聚合物係聚乙二醇。
因此，在不同實施例中，本發明寡聚物包含通常由鄰接核苷酸序列組成之多核苷酸區域及另一非核苷酸區域二者。在提及包含鄰接核苷酸序列之本發明寡聚物時，化合物可包含非核苷酸組份，例如偶聯物組份。
本發明亦提供偶聯物，其包含如本文所述之本發明寡聚物及至少一個共價連接至寡聚物之非核苷酸或非多核苷酸部分。因此，在其中本發明寡聚物包含如本文所揭示之指定核酸或核苷酸序列之不同實施例中，化合物亦可包含至少一個共價連接至寡聚物之非核苷酸或非多核苷酸部分(例如，不包含一或多個核苷酸或核苷酸類似物)。
偶聯(至偶聯物部分)可增強本發明寡聚物之活性、細胞分佈或細胞攝取。該等部分包括(但不限於)抗體、多肽、脂質部分(例如膽固醇部分)、膽酸、硫醚。
本發明寡聚物亦可偶聯至活性原料藥，例如阿斯匹林(aspirin)、布洛芬(ibuprofen)、磺胺藥、抗糖尿病藥、抗細菌劑或抗生素。
在某些實施例中，偶聯部分係固醇，例如膽固醇。
III.A. 經活化寡聚物
如本文所用術語「經活化寡聚物」係指共價連接(即，官能化)至至少一個官能部分之本發明寡聚物，該部分允許寡聚物共價鍵聯至一或多個偶聯部分(即自身並非核酸或單體之部分)以形成本文所述偶聯物。通常，官能部分將包含能經由例如腺嘌呤鹼基之3'-羥基或環外NH2 基團共價鍵結至寡聚物之化學基團、可為親水之間隔物及能結合至偶聯部分之末端基團(例如，胺基、硫氫基或羥基)。在一些實施例中，此末端基團未經保護，例如係NH2 基團。在其他實施例中，末端基團經例如任何適宜保護基團保護，例如彼等闡述於「Protective Groups in Organic Synthesis」，Theodora W Greene及Peter G M Wuts，第3版(John Wiley & Sons,1999)中者。
在一些實施例中，本發明寡聚物在5'端經官能化以容許偶聯部分共價連接至寡聚物之5'端。在其他實施例中，本發明寡聚物可在3'端經官能化。在其他實施例中，本發明寡聚物可沿主鏈或在雜環鹼基部分上經官能化。在其他實施例中，本發明寡聚物可在一個以上獨立地選自5'端、3'端、主鏈及鹼基之位置處經官能化。
在一些實施例中，本發明經活化寡聚物係藉由在合成期間納入一或多個共價連接至官能部分之單體來合成。在其他實施例中，本發明經活化寡聚物係用尚未經官能化之單體合成，且該寡聚物在合成完成後進行官能化。
IV. 醫藥組合物及投與途徑
本發明寡聚物可用於醫藥調配物及組合物中。適宜地，該等組合物包含醫藥上可接受之稀釋劑、載劑、鹽或佐劑。
本發明寡聚物可包括於單位調配物中，例如以足以向患者遞送治療有效量且在所治療患者中不引起嚴重副作用之量包括於醫藥上可接受之載劑或稀釋劑中。然而，在一些形式之療法中，就確保治療性治療之正向結果而言，嚴重副作用可係可接受的。
經調配藥物可包含醫藥上可接受之結合劑及佐劑。膠囊、錠劑或九劑可含有例如以下化合物：作為黏合劑之微晶纖維素、樹膠或明膠；作為賦形劑之澱粉或乳糖；作為潤滑劑之硬脂酸鹽；各種甜味劑或矯味劑。對於膠囊，劑量單位可含有如脂肪油之液體載劑。同樣，糖或腸內吸收劑之包衣可為劑量單位之一部分。寡核苷酸調配物亦可為活性醫藥成份及形成膠束乳液之脂質之乳液。
端視期望局部抑或全身性治療及欲治療區域，本發明之醫藥組合物可以多種方式投與。投與可為(a)經口，(b)經肺投與，例如藉由吸入或吹入粉末或氣溶膠，包括藉由霧化器投與；氣管內、鼻內投與，(c)局部投與，包括表皮、經皮、經眼投與及投與黏膜，包括陰道及直腸遞送；或(d)非經腸投與，包括靜脈內、動脈內、皮下、腹膜內或肌內注射或灌注；或顱內，例如鞘內、腦室內或心室內投與。在一個實施例中，寡聚物係IV、IP、經口、局部或作為濃注注射投與，或直接投與靶器官。在另一實施例中，寡聚物係作為濃注注射鞘內或腦室內投與。
用於局部投與之醫藥組合物及調配物可包括經皮貼劑、軟膏、洗劑、乳霜、凝膠、滴劑、噴霧劑、栓劑、液體及粉末。可能需要或期望習用醫藥載劑、水性、粉末或油性基質、增稠劑及諸如此類。局部調配物之實例包括彼等其中本發明寡聚物與局部遞送劑混合者，該 局部遞送劑係例如脂質、脂質體、脂肪酸、脂肪酸酯、類固醇、螯合劑及表面活性劑。用於經口投與之組合物及調配物包括但不限於粉末或顆粒、微粒、奈米粒子、於水或非水性介質中之懸浮液或溶液、膠囊、凝膠膠囊、小藥囊、錠劑或微錠劑。用於非經腸、鞘內、腦室內或心室內投與之組合物及調配物可包括無菌水溶液，其亦可含有緩衝劑、稀釋劑及其他適宜添加劑，例如但不限於滲透增強劑、載劑化合物及其他醫藥上可接受之載劑或賦形劑。
本發明之醫藥組合物包括但不限於溶液、乳液及含有脂質體之調配物。該等組合物可自多種組份生成，該等組份包括(但不限於)預成型液體、自乳化固體及自乳化半固體。將藥物遞送至靶組織可藉由載劑介導之遞送來增強，包括但不限於陽離子脂質體、環糊精、卟啉衍生物、具支鏈樹枝狀聚合物、聚乙烯亞胺聚合物、奈米粒子及微球(Dass CR.J Pharm Pharmacol 2002；54(1)：3-27).
可便利地以單位劑型呈現之本發明醫藥調配物可根據醫藥工業中熟知之習用技術來製備。該等技術包括使活性成份與醫藥載劑或賦形劑結合之步驟。一般而言，調配物係藉由使活性成份與液體載劑或微細固體載劑或二者均勻且充分結合且然後(若需要)使產物成型來製備。
對於非經腸、皮下、真皮內或局部投與，調配物可包括無菌稀釋劑、緩衝劑、張力調節劑及抗細菌劑。活性寡聚物可用抵抗降解或自體內立即消除之載劑來製備，包括具有受控釋放性質之植入體或微膠囊。對於靜脈內投與，載劑可為生理鹽水或磷酸鹽緩衝鹽水。2007年3月22日公開之國際公開案第WO2007/031091(A2)號另外提供適宜醫藥上可接受之稀釋劑、載劑及佐劑，其係以引用方式併入本文中。
V. 診斷
本發明另外提供在診斷Tau相關疾病(例如tau蛋白病變)期間可用 之診斷方法。tau蛋白病變之非限制性實例包括(但不限於)阿茲海默氏病、進行性核上性麻痺、拳擊手型失智症(慢性創傷性腦病)、額顳葉失智症、與染色體17相關之帕金森氏症、李替克-波迪哥病(關島型帕金森失智複合症)、纏結為主之失智症、神經節神經膠質瘤、神經節細胞瘤、腦膜血管瘤病、亞急性硬化性泛腦炎、鉛毒腦病、結節性硬化症、哈勒沃登-施帕茨病、匹克氏病、皮質基底節退化症、嗜銀顆粒病、皮質基底核退化症、脂褐質沈積症、額顳葉失智症、核上性麻痺或額顳葉退化。
本發明寡聚物可用於量測Tau轉錄物在來自個體之組織或體液中之表現並比較所量測表現程度與在正常組織或體液中之標準Tau轉錄物表現程度，其中表現程度與標準相比有所增加指示可藉由本發明寡聚物治療之病症。
本發明寡聚物可用於使用熟習此項技術者已知之任何方法分析生物樣品中之Tau轉錄物含量(Touboul等人，Anticancer Res.(2002)22(6A)：3349-56；Verjout等人，Mutat.Res.(2000)640：127-38)；Stowe等人，J.Virol.Methods(1998)75(1)：93-91)。
「生物樣品」欲指自個體、細胞系、組織培養物或可能表現Tau轉錄物之其他細胞源獲得之任何生物樣品。自哺乳動物獲得組織生檢及體液之方法為業內所熟知。
VI. 包含寡聚物之套組
本發明另外提供包含本文所述之本發明寡聚物且可用於實施本文所述方法之套組。在某些實施例中，套組在一或多個容器中包含至少一種寡聚物。在一些實施例中，套組含有實施檢測分析所需要及/或足以實施檢測分析之所有組份，包括所有對照、實施分析之指導及任何用於分析及結果呈現之所需軟體。熟習此項技術者將容易地認識到，所揭示寡聚物可容易地納入業內熟知之已確立套組格式中之一者 中。
VII. 使用方法
本發明寡聚物可用作研究試劑用於例如診斷、治療及預防。
在研究中，該等寡聚物可用於特異性抑制細胞及實驗動物中之Tau蛋白合成(通常藉由降解或抑制mRNA且由此預防蛋白質形成)，由此促進對靶之功能分析或對其作為治療介入之靶之可用性之評估。另外提供下調細胞或組織中之MAPT mRNA及/或Tau蛋白之表現之方法，其包含使細胞或組織在活體外或活體內與有效量之本發明寡聚物、偶聯物或組合物中之一或多種接觸。
在診斷中，寡聚物可用於藉由北方墨點法、原位雜交或類似技術檢測並定量細胞及組織中之MAPT 轉錄物表現。
對於治療，藉由投與本發明寡聚化合物來治療懷疑患有可藉由調節MAPT 轉錄物及/或Tau蛋白之表現來治療之疾病或病症的動物或人類。另外提供藉由投與治療或預防有效量之本發明寡聚物或組合物中之一或多者來治療懷疑患有或易患與MAPT 轉錄物及/或Tau蛋白之表現相關之疾病或病況之哺乳動物(例如治療人類)之方法。本發明寡聚物、偶聯物或醫藥組合物通常係以有效量投與。在一些實施例中，本發明寡聚物或偶聯物用於治療中。
本發明另外提供本發明寡聚物，其用於治療本文所提及之一或多種疾病，例如選自以下之疾病：阿茲海默氏病、進行性核上性麻痺、唐氏症候群、拳擊手型失智症(慢性創傷性腦病及其他創傷性腦損傷)、額顳葉失智症、額顳葉失智症伴隨與染色體17相關之帕金森氏症(FTDP-17)、李替克-波迪哥病(關島型帕金森失智複合症)、纏結為主之失智症、神經節神經膠質瘤、神經節細胞瘤、腦膜血管瘤病、亞急性硬化性泛腦炎、鉛毒腦病、半邊巨腦症、結節性硬化症、哈勒沃登-施帕茨病、匹克氏病、皮質基底節退化症、嗜銀顆粒病、皮質 基底核退化症、脂褐質沈積症、額顳葉失智症、核上性麻痺及額顳葉退化(綜述於以下文獻中：Frost等人，Trends Cell Biol (2015)25：216-53；Dyment等人，Neurobiol.Aging (2014)Sept 6：S0197-4580；Moussaud等人，Mol.Neurodeg (2014)29：43 Ross等人，South Med.J. (2014)107：715-21)。另外，本發明提供寡聚物，其用於治療腦網絡功能障礙疾病，包括所有形式之癲癇及抑鬱症(Inoue等人，Epilepsy (2012)102：8-12；Xi等人，Med Hypotheses (2011)76：897-900；Hou等人，Can.J.Psychiatry (2004)3：164-71)。本發明另外提供治療tau蛋白病變之方法，該方法包含將有效量之一或多種寡聚物、偶聯物或其醫藥組合物投與投與有需要之動物(例如有需要之患者)。
在某些實施例中，疾病、病症或病況與MAPT 基因轉錄物及/或Tau蛋白之過表現相關。
本發明亦提供抑制(例如，藉由降低)細胞或組織中之MAPT 基因轉錄物及/或Tau蛋白之表現之方法，該方法包含使細胞或組織在活體外或活體內與有效量之一或多種本發明寡聚物、偶聯物或其醫藥組合物接觸，以影響MAPT 基因轉錄物之表現之降格，由此減少Tau蛋白。
本發明亦提供如所述之本發明寡聚物或偶聯物之用途，其用於製造用於治療如本文所提及之病症之藥劑，或用於治療如本文所提及之病症之方法中。
本發明另外提供抑制正在表現Tau之細胞中之Tau蛋白之方法，其包含將本發明寡聚物或偶聯物投與該細胞以影響對細胞中之Tau蛋白之抑制。
本發明包括在有需要之個體中降低、改善、預防或治療神經元超興奮性之方法，其包含投與本發明寡聚物或偶聯物。
本發明亦提供治療如本文所提及之病症之方法，該方法包含將如本文所述之本發明寡聚物或偶聯物及/或本發明醫藥組合物投與有 需要之患者。
本發明之寡聚物及其他組合物可用於治療與Tau蛋白之突變形式的過表現或表現相關之病況。
本發明提供本發明寡聚物或偶聯物，其用作藥劑，例如用於治療tau蛋白病變。在一些實施例中，tau蛋白病變係選自以下之疾病：阿茲海默氏病、進行性核上性麻痺、拳擊手型失智症(慢性創傷性腦病)、額顳葉失智症、額顳葉失智症伴隨與染色體17相關之帕金森氏症、李替克-波迪哥病(關島型帕金森失智複合症)、唐氏症候群、半邊巨腦症、纏結為主之失智症、神經節神經膠質瘤、神經節細胞瘤、腦膜血管瘤病、亞急性硬化性泛腦炎、鉛毒腦病、結節性硬化症、哈勒沃登-施帕茨病、匹克氏病、皮質基底節退化症、嗜銀顆粒病、皮質基底核退化症、脂褐質沈積症、額顳葉失智症、核上性麻痺及額顳葉退化(綜述於以下文獻中：Frost等人，Trends Cell Biol (2015)25：216-53；Thom等人，Brain (2011)134：2969-81；Zheng等人，Mol.Neurobiol. (2014)49：1532-9)。
本發明提供本發明寡聚物或偶聯物，其用作藥劑，例如用於治療癲癇發作(Dyment等人，Neurobiol.Aging (2014)Sept 6 S0197-4580；Inoue等人，Epilepsy (2012)102：8-12；Gheyera等人，Ann Neurol (2014-76：443-56)。在一些實施例中，癲癇發作選自癲癇、青少年肌陣攣性癲癇、反射性癲癇、兒童期良性局灶性癲癇(BFEC)、全身性癲癇伴熱性癲癇發作+(GEFS+)、嬰兒遊走性部分性癲癇發作(MPSI)、孟德爾癲癇症候群(Mendelian epilepsy syndrome)、小兒驚厥、嬰兒痙攣、嬰兒嚴重肌陣攣性癲癇(SMEI或德拉韋症候群)、青少年肌陣攣性癲癇(JME或詹茲氏症候群(Janz syndrome))、安格曼症候群、蕾特氏症候群、X染色體易裂症候群中之癲癇、舞蹈手足徐動症(ICCA)症候群、傷害相關癲癇發作、腦損傷、腦中風、腦膜炎及熱性 癲癇發作。在某些實施例中，癲癇係良性家族性嬰兒癲癇(BFIE)。
在其他實施例中，癲癇發作選自特發性全身性癲癇、特發性部分性癲癇、症狀性全身性癲癇或症狀性部分性癲癇。在一些實施例中，癲癇發作係選自以下之特發性癲癇：兒童期失神性癲癇、青少年肌陣攣性癲癇、癲癇伴隨他人覺醒時大發作型癲癇(epilepsy with grand mal seizures on awakening others)、兒童期良性局灶性癲癇。在某些實施例中，癲癇發作係選自以下之症狀性癲癇：韋斯特症候群、雷葛氏症候群症候群、顳葉癲癇或額葉癲癇。在其他實施例中，癲癇發作係選自以下之特發性全身性癲癇：肌陣攣性癲癇發作(突然且極短持續時間之四肢急動)、失神性癲癇發作(神志恍惚)或全身性強直陣攣性癲癇發作(大發作型癲癇)。在其他實施例中，癲癇發作係特發性部分性癲癇，包括兒童期良性局灶性癲癇(BFEC)。
本發明亦提供本發明寡聚物或偶聯物，其用作藥劑，例如用於治療運動障礙。在一些實施例中，運動障礙選自靜坐不能(不能靜坐)、運動不能(活動過少)、關聯性運動(鏡像運動或同側聯合動作)、手足徐動症(扭曲扭轉或扭動)、共濟失調(肌肉運動嚴重失調)、顫搐(劇烈不隨意的快速且無規則運動)、單側顫搐(僅影響身體一側)、運動徐緩(緩慢運動)、腦性麻痺、舞蹈症(快速不隨意運動)、席登罕氏舞蹈症(Sydenham's chorea)、風濕性舞蹈症、杭丁頓氏症、運動困難(異常不隨意運動)、遲發性運動障礙、肌張力障礙(持續扭轉)、變形性肌張力障礙、瞼痙攣、指痙攣、痙攣性斜頸(頭頸扭曲)、多巴胺反應性及張力障礙(遺傳性進展性肌張力障礙伴隨日變化或瀨川氏病(Segawa's disease))、自發性震顫、頦痙攣(頦及下唇間歇性不隨意上下運動)、肌陣攣(肌肉或肌肉群短暫不隨意顫搐)、代謝性全身不適運動症候群(MGUMS)、鏡像運動障礙(身體一側鏡射另一側之隨意運動而不隨意運動)、帕金森氏病、陣發性運動源性運動障礙、不寧腿症 候群RLS(維特馬克-艾克包姆疾病(WittMaack-Ekboms disease))、痙攣(收縮)、刻板型運動障礙、重複言動(重複)、抽動障礙(不隨意、強迫性、重複、刻板型)、妥瑞氏症候群、震顫(振盪)、休息震顫(4-8Hz)、姿勢性震顫、動作性震顫、自發性震顫(6-8Hz可變振幅)、小腦性震顫(6-8Hz可變振幅)、帕金森氏病震顫(4-8Hz可變振幅)、生理性震顫(10-12Hz低振幅)、威爾森氏症(Wilson's disease)及抽搐。
本發明另外提供本發明寡聚物在製造用於治療如本文所提及之疾病、病症或病況之藥劑中之用途。在一些實施例中，本發明寡聚物或偶聯物用於製造用於治療tau蛋白病變、癲癇發作或其組合之藥劑。
一般而言，本發明之一個態樣係關於治療患有或易患與異常Tau含量相關之病況(即tau蛋白病變)之哺乳動物之方法，其包含向哺乳動物投與治療有效量之靶向MAPT 轉錄物之包含一或多個LNA單元之寡聚物。本發明寡聚物、偶聯物或醫藥組合物通常係以有效量投與。
在一些實施例中，如本文所提及之疾病或病症可與MAPT 基因或其蛋白質產物與Tau蛋白相關或與Tau蛋白相互作用之基因中之突變相關。因此，在一些實施例中，靶mRNA係MAPT 序列之突變形式。
本發明之令人關注之態樣係關於如本文所定義之寡聚物(化合物)或如本文所定義之偶聯物之用途，其用於製備用於治療如本文所提及之疾病、病症或病況之藥劑。
本發明方法可用於治療或預防由異常Tau蛋白含量引起之疾病。在一些實施例中，由異常Tau蛋白含量引起之疾病係tau蛋白病變。在某些實施例中，tau蛋白病變包括阿茲海默氏病、進行性核上性麻痺、拳擊手型失智症(慢性創傷性腦病)、額顳葉失智症、與染色體17相關之帕金森氏症、李替克-波迪哥病(關島型帕金森失智複合症)、纏結為主之失智症、神經節神經膠質瘤、神經節細胞瘤、腦膜血管瘤 病、亞急性硬化性泛腦炎、鉛毒腦病、結節性硬化症、哈勒沃登-施帕茨病、匹克氏病、皮質基底節退化症、嗜銀顆粒病、皮質基底核退化症、脂褐質沈積症、額顳葉失智症、核上性麻痺、唐氏症候群及額顳葉退化。
在某些實施例中，治療或預防之疾病或病況係神經病症。在其他實施例中，神經病症選自進行性核上性麻痺、額顳葉失智症-tau(FTD-tau)、額顳葉失智症及與染色體17相關之帕金森氏症(FTDP-17)、皮質基底核退化症(CBD)、創傷性腦損傷、慢性創傷性腦病、HIV相關神經認知障礙、嗜銀顆粒病、唐氏症候群-阿茲海默氏病、健忘型輕度認知損傷-阿茲海默氏病、帕金森氏病失智症、哈勒沃登-施帕茨病(泛酸鹽激酶相關神經退化症)、C型尼曼匹克症、肌強直性營養不良、肌肉萎縮性脊髓側索硬化症、帕金森氏病、杭丁頓氏症、半邊巨腦症、結節性硬化複合症、2b型局灶性皮質發育不良或神經節細胞瘤。在某些實施例中，疾病或病況係無tau蛋白病變之癲癇性病症，例如德拉韋症候群(嬰兒嚴重肌陣攣性癲癇)、顳葉癲癇、大田原症候群(早期幼兒癲癇性腦病伴爆發抑制)、拉弗拉體病、全身性癲癇伴熱性癲癇發作、嬰兒痙攣(韋斯特症候群)、雷葛氏症候群、安格曼症候群、蕾特氏症候群、蘭道克雷夫症候群、局灶性癲癇發作、單純局灶性癲癇發作(不喪失意識)、局灶性認知障礙性癲癇發作(意識受損)、演變成全身性僵直-陣攣(GTC)驚厥之局灶性癲癇發作、全身性癲癇發作(驚厥性或非驚厥性，伴隨涉及皮質下結構之雙側放電)、失神性癲癇發作、肌陣攣性癲癇發作、陣攣性癲癇發作、強直性癲癇發作、強直陣攣性癲癇發作、失張性癲癇發作、自閉症、自閉症譜系障礙(例如，如在精神疾病診斷與統計手冊V(DSM-V)中所定義)、亞斯伯格症、廣泛性發育障礙或其任何組合。
在某些實施例中，神經病症係神經退化病症、癲癇性病症、特 發性成人癲癇性病症或其任何組合。在其他實施例中，疾病或病況係神經退化病症伴隨tau蛋白病變(即，涉及Tau蛋白在腦中之累積之神經退化疾病)、伴隨tau蛋白病變之癲癇性病症(涉及Tau蛋白在腦中之累積之癲癇性病症)、無tau蛋白病變之癲癇性病症(不涉及Tau蛋白在腦中之累積之癲癇性病症)、無tau蛋白病變之特發性成人癲癇性病症(不涉及Tau蛋白在腦中之累積之特發性成人癲癇性病症)或其任何組合。在某些其他實施例中，治療或預防之疾病或病況係伴隨tau蛋白病變之神經退化疾病，例如進行性核上性麻痺、額顳葉失智症-tau(FTD-tau)、額顳葉失智症及與染色體17相關之帕金森氏症(FTDP-17)、皮質基底核退化症(CBD)、創傷性腦損傷、慢性創傷性腦病、HIV相關神經認知障礙、嗜銀顆粒病、唐氏症候群-阿茲海默氏病、健忘型輕度認知損傷-阿茲海默氏病、帕金森氏病失智症、哈勒沃登-施帕茨病(泛酸鹽激酶相關神經退化症)、C型尼曼匹克症、肌強直性營養不良、肌肉萎縮性脊髓側索硬化症、帕金森氏病或杭丁頓氏症。在某些實施例中，治療或預防之疾病或病況係伴隨tau蛋白病變之癲癇性病症，例如半邊巨腦症、結節性硬化複合症、2b型局灶性皮質發育不良或神經節細胞瘤。在某些實施例中，疾病或病況係無tau蛋白病變之癲癇性病症，例如德拉韋症候群(嬰兒嚴重肌陣攣性癲癇)、顳葉癲癇、大田原症候群(早期幼兒癲癇性腦病伴爆發抑制)、拉弗拉體病、全身性癲癇伴熱性癲癇發作、嬰兒痙攣(韋斯特症候群)、雷葛氏症候群、安格曼症候群、蕾特氏症候群或蘭道克雷夫症候群。在某些實施例中，治療或預防之疾病或病況係無tau蛋白病變之特發性成人癲癇性病症，例如局灶性癲癇發作、單純局灶性癲癇發作(不喪失意識)、局灶性認知障礙性癲癇發作(意識受損)、演變成全身性僵直-陣攣(GTC)驚厥之局灶性癲癇發作、全身性癲癇發作(驚厥性或非驚厥性，伴隨涉及皮質下結構之雙側放電)、失神性癲癇發作、肌陣攣性 癲癇發作、陣攣性癲癇發作、強直性癲癇發作、強直陣攣性癲癇發作或失張性癲癇發作。在某些實施例中，治療或預防之神經病症係自閉症、自閉症譜系障礙(例如，如在精神疾病診斷與統計手冊V(DSM-V)中所定義)、亞斯伯格症或廣泛性發育障礙。
替代而言，在一些實施例中，本發明另外係關於治療異常Tau蛋白含量之方法，該方法包含將本發明寡聚物或本發明偶聯物或本發明醫藥組合物投與有需要之患者。
本發明亦係關於如本文所定義之寡聚物、組合物或偶聯物，其用作藥劑。
本發明進一步係關於如本文所定義之化合物、組合物或偶聯物之用途，其用於製造用於治療異常Tau蛋白含量或Tau蛋白突變體形式(例如等位基因變體，例如彼等與本文所提及疾病中之一者相關者)之異常表現程度之藥劑。
需要治療之患者係患有或可能患疾病或病症之患者。
除非另有指示，否則本發明之實踐將採用細胞生物學、細胞培養、分子生物學、轉基因生物學、微生物學、重組DNA及免疫學中為熟習此項技術者熟知之習用技術。該等技術在文獻中已全面解釋。例如，參見Sambrook等人編輯(1989)Molecular Cloning A Laboratory Manual(第2版；Cold Spring Harbor Laboratory Press)；Sambrook等人編輯(1992)Molecular Cloning：A Laboratory Manual,(Cold Springs Harbor Laboratory,NY)；D.N.Glover編輯，(1985)DNA Cloning，第I卷及第II卷；Gait編輯(1984)Oligonucleotide Synthesis；Mullis等人，美國專利第4,683,195號；Hames及Higgins編輯(1984)Nucleic Acid Hybridization；Hames及Higgins編輯(1984)Transcription And Translation；Freshney(1987)Culture Of Animal Cells(Alan R.Liss,Inc.)；Immobilized Cells And Enzymes(IRL Press)(1986)；Perbal (1984)A Practical Guide To Molecular Cloning；the treatise,Methods In Enzymology(Academic Press,Inc.,N.Y.)；Miller及Calos編輯(1987)Gene Transfer Vectors For Mammalian Cells(Cold Spring Harbor Laboratory)；Wu等人編輯，Methods In Enzymology，第154及155卷；Mayer及Walker編輯(1987)Immunochemical Methods In Cell And Molecular Biology(Academic Press,London)；Weir及Blackwell編輯(1986)Handbook Of Experimental Immunology，第I-IV卷；Manipulating the Mouse Embryo,Cold Spring Harbor Laboratory Press,Cold Spring Harbor,N.Y.,(1986)；Crooks,Antisense Drug Technology：Principles,strategies and applications，第2版，CRC Press(2007)及Ausubel等人(1989)Current Protocols in Molecular Biology(John Wiley and Sons,Baltimore,Md.)。
上文所引用之所有參考文獻以及本文所引用之所有參考文獻皆係全文以引用方式併入本文中。
以說明方式而非限制方式提供以下實例。
實例
實例1：寡聚物之構築
設計多種寡聚物靶向MAPT 前mRNA之3' UTR。基因體MAPT 序列參見圖1。舉例而言，構築寡聚物以靶向SEQ ID NO：1之核苷酸134,821-138,940。寡聚物之實例性序列闡述於圖2、3、6及7中。在一些實施例中，寡聚物經設計為間隔體或混合體。圖2顯示用於所選序列之寡聚物設計之非限制性實例。可將相同方法應用於本文所揭示之任何其他序列。間隔體經構築以含有鎖核酸-LNA(大寫字母)。舉例而言，間隔體可在5'端及3'端具有β-去氧LNA且具有硫代磷酸酯主鏈。但LNA亦可經任何其他核苷酸類似物取代且主鏈可為另一類型之主鏈(例如，磷酸二酯鍵聯、磷酸三酯鍵聯、甲基磷酸酯鍵聯、胺基 磷酸酯鍵聯或其組合)。
寡聚物係使用業內熟知之方法來合成。製備該等寡聚物之實例性方法闡述於Barciszewski等人，第10章-「Locked Nucleic Acid Aptamers」，Nucleic Acid and Peptide Aptamers：Methods and Protocols ，第535卷，Gunter Mayer(編輯)(2009)中，其全部內容係以引用方式明確併入本文中。
在圖2中，在序列指定中，大寫指定經修飾核苷酸，例如LNA核苷酸(β-D-氧基、α-L-氧基、β-D-胺基或β-D-硫代LNA或其他經修飾核苷酸，例如cEt、cMOE、UNA或ENA)且小寫指定DNA核苷酸。因此，由TAGccctaaagtcCCA(SEQ ID NO：53，即ASO-000389)代表之序列代表具有5’-T及3’-A之3-10-3 16聚體經修飾核苷酸-DNA-經修飾核苷酸間隔體，例如3-10-3 LNA-DNA-LNA間隔體。一些寡聚物可為如本文中別處所述之交替側接間隔體。在一些實施例中，具有7個核苷酸空位之交替側接間隔體之所選實例係ASO-002399、ASO-002482、ASO-002437及ASO-002425。本文所揭示之寡聚物序列中之任一者可具有圖中顯示之交替側接間隔體設計。另外，本文所揭示之寡聚物序列中之任一者可具有圖2、16B及20B中顯示之化學結構。
在圖2中，下文指定本發明寡核苷酸之組份，且寡核苷酸始終以5'至3'方向繪示。因此，寡聚物之5'端與表中之前mRNA終點編號雜交，且寡聚物之3'端與圖中之前mRNA起點編號雜交。提及SEQ ID編號時包括特定序列，但不包括寡聚物設計或其化學結構。
β-D-氧基LNA核苷酸指定為OxyB，其中B指定核苷酸鹼基，例如胸腺嘧啶(T)、尿苷(U)、胞嘧啶(C)、甲基胞嘧啶(MC)、腺嘌呤(A)或鳥嘌呤(G)，且因此包括OxyA、OxyT、OxyMC、OxyC及OxyG。
α-L-氧基LNA核苷酸指定為AlfaOxyB，其中B指定核苷酸鹼基，例如胸腺嘧啶(T)、尿苷(U)、胞嘧啶(C)、甲基胞嘧啶(MC)、腺嘌呤 (A)或鳥嘌呤(G)，且因此包括AlfaOxyA、AlfaOxyT、AlfaOxyMC、AlfaOxyC及AlfaOxyG。C或c之前之字母M或m指示5-甲基胞嘧啶。
β-D-胺基LNA核苷酸指定為胺基B，其中B指定核苷酸鹼基，例如胸腺嘧啶(T)、尿苷(U)、胞嘧啶(C)、甲基胞嘧啶(MC)、腺嘌呤(A)或鳥嘌呤(G)，且因此包括胺基A、胺基T、胺基MC、胺基C及胺基G。C或c之前之字母M或m指示5-甲基胞嘧啶。包括5甲基胞嘧啶之寡聚物之一些實例包括ASO-002672、ASO-002658、ASO-002622、ASO-002629、ASO-002621、ASO-002665及ASO-002630。參見圖2。
β-D-硫代-LNA核苷酸指定為ThioB，其中B指定核苷酸鹼基，例如胸腺嘧啶(T)、尿苷(U)、胞嘧啶(C)、甲基胞嘧啶(MC)、腺嘌呤(A)或鳥嘌呤(G)，且因此包括ThioA、ThioT、ThioMC、ThioC及ThioG。C或c之前之字母M或m指示5-甲基胞嘧啶。
DNA核苷酸指定為DNAb，其中小寫b指定核苷酸鹼基，例如胸腺嘧啶(T)、尿苷(U)、胞嘧啶(C)、5-甲基胞嘧啶(MC)、腺嘌呤(A)或鳥嘌呤(G)，且因此包括DNAa、DNAt、DNAc、DNAmc及DNAg。C或c之前之字母M或m指示5-甲基胞嘧啶。
核苷酸指定之後之字母「s」指示硫代磷酸酯鍵聯而不存在「s」指示磷酸二酯鍵聯。
因此，具有序列ATTtccaaattcaCTT且具有全硫代磷酸酯核苷酸間鍵聯之3-10-3 β-D-氧基LNA-DNA-β-D-氧基LNA間隔體將指定為OxyAs OxyTs OxyTs DNAts DNAcs DNAcs DNAas DNAas DNAas DNAts DNAts DNAcs DNAas OxyMCs OxyTs OxyT。在一些實施例中，寡聚物具有硫代磷酸酯與磷酸二酯核苷酸間鍵聯之混合物。具有硫代磷酸酯與磷酸二酯核苷酸間鍵聯之混合物之寡聚物之實例包括(但不限於)ASO-002625、ASO-002675、ASO-002633、ASO-002640、ASO-002632、ASO-002647、ASO-002655、ASO-002641、 ASO-002648、ASO-002666、ASO-002659、ASO-002652、ASO-002645、ASO-002638、ASO-003270、ASO-003269、ASO-003268、ASO-002673、ASO-002661、ASO-002654、ASO-002668、ASO-002676、ASO-002669及ASO-002662。參見圖2。
具有失配之寡聚物之製備
亦使用業內熟知之標準方法來製備在不同位置具有失配鹼基之寡聚物。具有失配鹼基之寡聚物之實例於圖2或3中以「mm」提供。具體失配鹼基對加粗、加下劃線、加斜體且突出顯示。
實例2：Tau蛋白之活體外減少
測試靶向MAPT 轉錄物之3' UTR之每一寡聚物在表現呈含有桿狀病毒質粒之轉基因之完整人類MAPT 基因之小鼠初級神經元中減少Tau蛋白之能力(C57-bl6 BAC-Tg hTau；Polydoro等人，J.Neurosci. (2009)29(34)：10747-9)。初級hTau小鼠胚胎前腦神經元培養物由於已敲除小鼠tau而不表現內源性小鼠tau。初級神經元係根據製造商方案藉由木瓜酶消化來生成(Worthington Biochemical Corporation,LK0031050)。簡言之，自在鼠類MAPT -空背景上表現完整人類微管相關蛋白Tau(MAPT )基因之hTau小鼠E18 BAC-Tg胚胎解剖前腦且將其在37℃下在木瓜酶/DNase/伊格爾氏平衡鹽溶液(Earle’s balanced salt solution)(EBSS)溶液中培育30-45分鐘。在將細胞糰粒研磨並離心後，藉由與含有蛋白酶抑制劑、牛血清白蛋白(BSA)及DNase之EBSS一起培育來停止反應。研磨細胞並用補充有2% B-27、100μg/ml青黴素、85μg/ml鏈黴素及0.5mM麩醯胺酸之Neurobasal(NB,Invitrogen)洗滌。將細胞以15,000個細胞/孔平鋪至聚-D-離胺酸塗佈之96孔光學成像板(BD Biosciences)上之經補充NB培養基中。
在獲得表現人類MAPT 基因之初級hTau小鼠胚胎前腦神經元培養物之後，用寡聚物處理培養物以抑制Tau mRNA及蛋白質表現。然後 使培養物經受免疫細胞化學及成像以量測抑制。在平鋪後1天(DIV 1)，移除初級hTau小鼠胚胎前腦神經元培養物上之一半經補充neurobasal(NB)培養基，並更換為含有不同濃度之LNA寡聚物中經補充NB培養基。將初級hTau神經元培養物與LNA寡聚物一起培養直至平鋪後13天(DIV 13)。在DIV 13，用不含鈣及鎂之達爾伯克氏(Dulbecco's)磷酸鹽緩衝鹽水(DPBS,Invitrogen)沖洗培養物並於4%多聚甲醛/4%蔗糖/DPBS中固定15min。沖洗培養物，然後在室溫下在DPBS加0.1% Triton X-100(TX-100)及3% BSA中封阻並可滲透化處理1小時。沖洗培養物，然後在室溫下在DPBS加3% BSA及0.1% TX-100中與一級抗體(1：500，Tau5抗體，用於量測Tau蛋白，Invitrogen AHB0042；及1：500，β-III微管蛋白(TuJ-1)抗體，用於量測神經突面積，Abcam ab41489)一起培育2小時。沖洗培養物並在室溫下在DPBS加3% BSA及0.1% TX-100中與Hoeschst 33342核染料(1：800,Invitrogen)及AlexaFluor螢光偶聯二級抗體(Invitrogen,1：500)一起培育1小時。充分沖洗培養物並儲存於DPBS中直至成像為止。成像係使用Cellomics VTi自動化免疫螢光成像系統來實施。簡言之，使用未處理細胞，將每一螢光團通道之飽和程度設定為70%。然後自每孔獲取12個連續影像，且使用Cellomics VTi Spot檢測器(第4版)影像分析軟體計算Tau及TuJ-1蛋白質二者之總螢光強度及總螢光面積。為評估寡聚物處理導致之Tau蛋白減少，創建每孔之Tau5總螢光強度對Tuj-1總螢光面積之比率(Tau/TuJ-1)，然後將所有資料正規化至未處理孔之平均Tau/Tuj-1比率。TuJ-1強度用作每一樣品之內標準。為評估來自寡聚物處理之神經突/神經元毒性，將來自每孔之Tuj-1總螢光面積正規化至未處理孔之平均Tuj-1總螢光面積。亦獲取每孔之核計數作為與LNA寡聚物處理相關之毒性之替代量度。資料表示為平均值±S.D.。對於免疫細胞化學，資料點代表來自以一式三份處理之孔之平均值± S.D.。使用經寬濃度範圍之LNA寡聚物處理之孔生成功效值，自其與來自鹽水對照樣品之正規化值相比，分析所得正規化Tau/Tuj-1及Tuj-1值。分析係使用非線性回歸來實施，且將最高值及最低值分別設定為100%及0%之固定值，其中100%抑制代表與對照樣品相比完全減少信號(圖3)。對於qPCR，使用單因子ANOVA以Dunnett’s多重比較測試分析資料，以比較鹽水處理組與LNA寡聚物處理組。將統計學顯著性設定為p<0.05之值。
將每一寡聚物對Tau蛋白之減少與鹽水相比較。Tau蛋白減少與鹽水相比較之結果顯示於圖3中。若反義寡核苷酸處理之神經元中之Tau蛋白含量等於或高於對照細胞中，則抑制%表示為0抑制。反義寡聚物對其具有抑制性之靶區域被視為Tau轉錄物上之「熱點(hot-spot)」。
在平鋪後1天(DIV01)將寡聚物稀釋於水中並添加至細胞至5μM之終濃度。對於IC50 測定，用5μM之最高濃度處理神經元且使用1：3之濃度反應稀釋來定義IC50 值。某些寡聚物之計算IC50 值顯示於圖6中。
實例3：自發鈣振盪量測
本申請案顯示，細胞內游離鈣濃度之振盪(鈣振盪)之降低對應於增加之寡聚物對細胞之神經毒性。降低之量及其對應於神經毒性之增加之方式可如本文所述來確定。為量測初級皮質神經元自發鈣振盪，自Sprague-Dawley大鼠胚胎(E19)製備大鼠初級皮質神經元。將細胞以25,000個細胞/孔平鋪至384孔聚-D-離胺酸塗佈之螢光成像板讀取器(FLIPR板)(Greiner Bio-One)上之25μl/孔之含有B27補充劑及2mM麩醯胺酸之神經基礎培養基中。使細胞在37℃下在5% CO2 中生長11天並在DIV04及DIV08餵給25μl額外培養基以供在DIV11使用。在實驗當天，自板移除培養基並用50μl/孔之37℃分析緩衝液(漢克氏平衡鹽 溶液(Hank’s Balanced Salt Solution)，含有2mM CaCl2 及10mM Hopes pH 7.4)將細胞洗滌一次。在1mM MgCl2 存在及不存在下測試振盪(圖4)。向細胞加載細胞永久性螢光鈣染料fluo-4 AM(Life Technologies)。Fluo-4 AM係以2.5mm在含有20% plutonic F-127之DMSO中製備，然後以1：1000稀釋於分析緩衝液中。將細胞在37℃及5% CO2 下與20μl 2.5μM fluo-4 AM一起培育1hr。在1hr後，添加20μl室溫分析緩衝液，且容許細胞平衡至室溫並再持續10分鐘且置於FLIPR中。在添加反義寡聚物之前經100秒(1次讀取/秒)讀取基底信號(細胞內鈣之量測)。用FLIPR中之384孔頭將寡聚物添加於20μl分析緩衝液(75μM)中達25μM之終濃度。在添加寡聚物後再經200秒(1次讀取/秒)讀取FLIPR信號。在FLIPR上實施第二次5分鐘添加後讀板(300個1秒點)以容許捕獲額外資料。輸出來自5分鐘讀取之原始資料且使用Excel計算波尖幅度及頻率。計算係藉由量測對照(未處理)孔之300秒讀取之平均FLIPR信號來實施。對於經處理孔，研發評分系統，其中對於每個信號增加大於平均對照值(上文所計算)之50%之1秒讀取，給予1分。對於每個增加小於平均對照值之50%之1秒讀取，給予0分。出於圖形目的，對於每種處理，計算總分並將其轉化為對照百分比。若反義寡聚物產生之鈣振盪反應大於僅AMPA，則對照百分比表示為大於100%(圖6)。
在兩種條件下，在作為Mg2+ 離子源之1mM MgCl2 存在及不存在下量測寡聚物對初級神經元自發鈣振盪之效應，如先前所述(Murphy等人，J.Neurosci. 12 ,4834-4845(1992))。對經分離N-甲基-D-天冬胺酸鹽(NMDA)-受體介導之鈣振盪及α-胺基-3-羥基-5-甲基-4-異噁唑丙酸(AMPA)-受體介導之鈣振盪實施此量測。呈現於圖4中之資料顯示，添加AMPA受體拮抗劑6-氰基-7-硝基喹喏啉-2,3-二酮(CNQX；3μM)將鈣振盪降低20%，代表分析中之總AMPA反應(圖4顯示AMPA標 記棒)。在藉由1mM MgCl2 阻斷(NMDA)受體功能時，鈣振盪進一步降低約80%(圖4顯示NMDA標記棒)。
在1mM MgCl2 存在或不存在下(在每種情形中代表100%對照；圖5)評價NMDA或AMPA介導之自發鈣振盪之反義寡聚物抑制。添加25μM反義寡聚物(ASO)抑制AMPA受體但不抑制NMDA受體介導之振盪(圖5)。顯示ASO及其他行為類似之寡聚物對活體內中樞神經系統(CNS)網絡活性及活體外電生理自發神經元活性具有負面影響(數據未顯示)。Tau反義寡核苷酸對初級神經元中之自發鈣振盪之影響概述於圖6中。參見Murphy等人，J.Neurosci. 12 ,4834-4845(1992)。
量測本發明寡聚物之鈣振盪降低並概述於圖6中。選擇在鈣振盪分析中顯示大於對照之25%之寡聚物用於進一步分析。
實例4：序列評分計算
本申請案亦顯示，如本文所計算之寡聚物之序列評分對應於寡聚物之神經毒性。在本發明之某些態樣中，序列評分愈高，寡聚物之神經毒性愈低。其範圍內之序列評分指示寡聚物具有降低之神經毒性之不同截止值可如本文所述來確定。
計算每種寡聚物之序列評分以預測寡聚物之適合性及神經毒性。序列評分係針對所有寡聚物測定之數學計算且係基於G及C核苷酸或其類似物在給定寡聚物序列內之之百分比。將下式應用於所有寡聚物以計算序列評分：
給出寡聚物ASO-000013(SEQ ID NO：686；序列評分0.25)之實例性計算：ATTtccaaattcaCTT：4-0/16=0.25之序列評分。
計算所選寡聚物之序列評分用於進一步研究。為確定序列評分之截止值，如實例5中所示實施活體內耐受性研究。
實例5：活體內耐受性及活體內Tau mRNA減少
測試寡聚物之活體內耐受性以觀察在注射至動物中時耐受寡聚物之程度。
受試者
測試寡聚物在小鼠及大鼠中之活體內耐受性。用於Tau qPCR及行為研究之動物係成年C57Bl/6J雌性小鼠(20-30g；Jackson Laboratories,Bar Harbor,ME)，每籠飼養3-4只。將動物保持於維持在恆定溫度(21±2℃)及濕度(50±10%)下且每天照明12小時(在0600小時開燈)之飼育室中。在一些情形中，使用表現由tau啟動子驅動之源自人類PAC H1單倍型之tau轉基因，且其中天然小鼠Tau基因缺失之雄性及雌性轉基因小鼠(30-40g)(Polydoro等人，J.Neurosci. (2009)29(34)：10741-9)來評價藥效學終點及組織藥物濃度。對於鞘內灌注研究，雌性Sprague-Dawley大鼠(在測試時180-225g；Harlan)單獨飼養在維持在恆定溫度(21±2℃)及濕度(50±10%)下且每天照明12小時(在0600h開燈)之飼育室中。在整個研究期間，所有動物可隨意獲得食物及水。在0700與1500小時之間實施行為研究。根據Bristol-Myers Squibb Company之動物照護及使用委員會(Animal Care and Use Committee)之指南及由國立衛生研究院(National Institutes of Health)出版之「Guide for Care and Use of Laboratory Animals」來維持動物。研究方案經Bristol-Myers Squibb Company之動物照護及使用委員會批准。
投與途徑：腦室內或鞘內注射。
將寡聚物藉由腦室內(ICV)注射或鞘內注射投與小鼠。腦室內注射係根據Haley及McCormick之方法使用配備有27或30號針之Hamilton微型注射器來實施。針在距離尖端2.5mm處裝備有聚乙烯護套以限制其向腦中之穿刺。使用異氟醚麻醉劑(1.5-4%)麻醉小鼠。用一隻手之 拇指及食指藉由頸背部之松垂皮膚來固持稱重為20-30g之欲注射小鼠。然後藉由施加溫和但牢固之壓力，抵靠堅固平直表面按壓來固定動物頭部。然後在距前鹵橫向約1mm且尾側1mm處插入針尖穿過頭皮及顱骨。一旦針定位，以5微升體積給予鹽水媒劑中之反義寡核苷酸並經20-30秒注射至右(或左)側腦室中。在移除前使針保持就位10秒。此程序無需手術或切口。將動物在加熱墊上加熱直至其自程序恢復。在給藥後之多個時間點(例如給藥後1週至16週)在乾冰上或RNAlater中收集腦組織(右側額葉皮質區)分別用於藥物濃度分析及Tau qPCR。
對於小鼠之鞘內(IT)注射，將動物維持在淡異氟醚麻醉劑(1.5-5%)下。藉由腰帶將小鼠牢固保持在一隻手中且將連接至Hamilton注射器之30G 1/2英吋針垂直於脊柱插入L5與L6之背側面之間之組織中。在針進入蛛網膜下空間時，觀察到尾部突然側向移動。使用此反射作為對於IT投與成功置針之指示物。將5-10μL體積之反義寡核苷酸緩慢注射(經約60秒)至蛛網膜下空間中。
對於大鼠中之鞘內注射，使用Yaksh及Rudy,Physiol.Behav.(1976)17(6)：1031-6闡述之方法以手術方式植入鞘內導管。將大鼠安置至立體定位架且經由鼻錐維持異氟醚麻醉劑。大致在耳接合線處開始切開皮膚切口並沿中線向尾側延伸約3cm。在肌肉中線兩側約3mm處側向切開連接至顱骨枕脊之肌肉。使用牽開器或鑷子將肌肉向尾側剝離以暴露顱骨基底處之池膜。自該膜謹慎移除筋膜及組織。使用16-22號針之彎曲坡口端在池膜中製造1-2mm側向切口。將由聚乙烯管(延伸至約1.3mm外徑之PE10管)製得之經滅菌IT導管插入穿過切口並謹慎地穿過蛛網膜下空間向尾側前進，同時將其在拇指與食指之間旋轉，且同時用另一隻手溫和牽拉尾基部以對準脊髓。若遇到任何阻力，略微收回導管，且再次緩慢前進。一旦導管已前進至期望區 域，則將其用20μL無菌鹽水沖洗並使用19號針在距切口約1cm處穿過顱端之皮膚。用插針塞住導管。在手術後5天中向大鼠經口給予抗生素。在手術後至少5天，將單一反義寡核苷酸注射劑稀釋於水中並經由可程式化灌注幫浦(Knopf)以10μl/分鐘之速率以10至50μl之體積遞送。在即將遞送反義寡核苷酸前給予5ul之短暫鹽水沖洗，且在寡核苷酸遞送後立即以10μl/分鐘之速率給予10μl鹽水沖洗，以覆蓋導管之怠體積(6-7μl)。亦1-2×/週給予動物20ul之鹽水沖洗直至用於實驗為止。
急性耐受性行為評價
在單一ICV(腦室內)或IT(鞘內)注射反義寡核苷酸後1小時中，觀察動物之行為副作用並針對副作用之嚴重程度按零(無副作用)至20(驚厥導致安樂死)之量表進行評分。將耐受性量表分為5個神經行為類別：1)過動，2)活動及喚起減少，3)運動功能障礙/共濟失調，4)異常姿勢及呼吸，及5)震顫/驚厥。每一類別係按0-4之量表評分，且最差可能總分為20。觀察動物在飼養籠中之行為變化，然後將其自飼養籠移出以供更詳細的觀察，包括量測握力及翻正反射。
新物體識別
使用新物體識別(NOR)任務來量測短期識別記憶。NOR測試係基於齧齒類動物探索新物體多於探索熟悉物體之自發行為(Dodart等人，Neuroreport (1997)8(5)：1173-8；Ennaceur and Delacour,Behav.Brain Res. (1988)31(1)：47-59)。在訓練(T1)與測試(T2)時段之間之1小時保持間隔後，自訓練時段記住物體之小鼠將在測試時段顯示對新物體之偏好。對於該等實驗，將動物處置3天並在測試時段前一天對室(48cm×38cm×20cm)習慣化。該室由聚乙烯製得且內襯有乙烯地板。在測試當天，將動物置於矩形測試室中並容許其在15分鐘之訓練期中探索兩個相同物體(7.6cm高×5.1cm寬)。1小時後，將小鼠放 回測試室中進行10分鐘之測試時段，此次一個物體係其在訓練期間已觀察過的且一個物體係新物體。在訓練與測試時段期間且在受試者之間用25%乙醇將物體充分清潔，且在當天結束時用溫和清潔劑再次清潔。僅在動物鼻子指向物體時才視為物體探索。使用ObjectScan追蹤軟體(Cleversys,Reston,VA)記錄探索。資料係以探索物體花費之時間的百分比來報告(即，新時間/新+熟悉時間*100)。
莫氏水迷宮(Morris Water Maze)
基於莫氏水迷宮分析來評價空間學習及記憶(MorrisJ.Neurosci. (1984)11(1)：47-60)。水迷宮代表具有120cm直徑之池。使用白色無毒蛋彩塗料(20℃±1)使水不透明。池外圍繞有不同外部迷宮線索。
在隱藏平臺訓練之前，藉由在2次預訓練試驗期間使其沿矩形通道向下游來使所有小鼠暴露於水迷宮池。將逃避平臺置於通道中間。若小鼠在60秒試驗期間未能找到並登上平臺，則將該小鼠引導至該平臺並使其停留至多10秒。在預訓練後，使小鼠經歷隱藏平臺訓練，在此期間使10×10cm平臺浸沒於表面下方1.5cm處。在整個訓練期間平臺位置保持不變，而放置位置在4次每日試驗之間以及橫跨4天訓練隨機改變。小鼠經連續4天每天接受2個時段。每一時段由2次試驗及10min試驗間隔組成。每次試驗容許之最長時間為60秒。若小鼠未找到或登上平臺，則由實驗者將該小鼠引導至該平臺。在每次訓練試驗後容許所有小鼠在平臺上停留10秒。
對於探查試驗，移除平臺並容許每只小鼠游泳60秒。探查試驗之放置位置距隱藏平臺訓練期間使用之平臺位置180°。在60秒後，將小鼠引導至平臺位置，之後自池收回。對於早期記憶檢索，在最後一次隱藏平臺訓練後2h探查小鼠；在最後一次隱藏平臺訓練後16h評價長期記憶回憶。在16h探查試驗後2h，所有小鼠經歷可見平臺訓練，其中將位置線索(使用樂高(lego)建造之柱)置於隱藏平臺上方。給予 小鼠2次訓練試驗。用視訊追蹤系統(Cleversys,Inc)記錄所有行為。自動記錄逃避潛伏期、行進距離、游泳路徑、游泳速度及平臺穿越以供後續分析。
貓道(catwalk)
貓道(Noldus，荷蘭)係自動化且電腦化之步態分析技術，其容許客觀量化多個靜態及動態步態參數。將小鼠置於貓道一端上，且容許自由探索3min或直至其進行5次順從試驗為止，以先發生者為準。使用貓道軟體輸出資料並歸類。使用經歸類試驗之平均值進行資料分析。所關注量度包括但不限於：痕跡位置或後爪位置與同側前爪之先前放置之間之距離、初次及末次雙足接觸時間、爪擺動速度及在腳步週期中之爪站立或爪與玻璃板接觸之持續時間。
行為統計
所有行為測試之統計分析皆係使用GraphPad Prism(GraphPad Software,Inc.,La Jolla,CA)來實施。對於NOR，使用用於組內分析之配對t-測試或藉由用於組間分析之ANOVA及之後的杜納氏事後測試(Dunnett’s post-hoc test)來分析資料。對於MWM，使用重複MWM ANOVA來分析獲取階段，且使用單因子ANOVA及之後的杜納氏事後進行探查試驗分析。
腦Tau mRNA分析
腦均質化
使用Quiagen TissueLyzer II將小鼠腦組織在10×體積之補充有磷酸酶抑制劑混合劑組2及3、1mM PMSF(Sigma,Saint Louis,MO)及無EDTA全蛋白酶抑制劑混合劑(Roche,Indianapolis,IN)之高鹽/蔗糖緩衝液(10mM Tris-HCl,pH 7.4,800mM NaCl,10%蔗糖(w/v),1mM EGTA)中均質化。將均質物在4℃下以20,000×g離心20分鐘。將上清液在4℃下以100,000×g離心1小時並分析上清液。
RT-PCR分析
對於cDNA合成及後續PCR，將來自腦組織之300ng RNA添加至96孔板(Axygen,PCR-96-C-S)之1個孔中。向每孔中添加7.5μl混合母液(每次反應5μL 2.5mM NTP混合液及2.5μL隨機引子)並將板以1000rpm離心且在70℃下置於溫度循環器中3min。將板立即在冰上冷卻且添加4μl反應混合母液。在PCR之前，將板短暫離心以在孔底部收集樣品。cDNA合成係在42℃下實施60min，在95℃下實施10min，之後保持在4℃下。將cDNA樣品用分子生物學級別之水以1：3稀釋且儲存於-20℃下直至進一步使用為止。
對於PCR，每一樣品以一式三份用兩個探針組運行(MAPT：Taqman表現分析Hs00902193_m1；RhoA：Taqman表現分析；GAPDH Taqman表現分析Hs01922876_u1)。向每一反應物中添加4μl預先稀釋之cDNA及6μL混合母液並將板離心。將樣品在95℃下培育20秒，之後進行40個在95℃下1秒且在60℃下20秒之循環。
使用δ δ Ct方法分析資料，其中首先將每一樣品正規化至GAPDH，然後表示為未處理對照動物之百分比(參見圖7)。
結果
將在ICV注射100μg反義寡核苷酸後之活體內累積耐受性臨限值設定為4。圖8A中之相關性分析顯示，活體內耐受性低於4之寡聚物往往具有等於或高於0.2之序列評分。圖8B中之正方形代表不僅基於活體外Tau蛋白減少且亦基於藉由上文概述之微管蛋白及自發鈣振盪準則評價之初級神經元健康及活性進行優先級排序之寡聚物。活體外功效資料與活體內tau mRNA減少非常一致，從而容許寡聚物之額外優先級排序。鑑別在3’UTR中之核苷酸處或與3’UTR中之核苷酸部分重疊靶向MAPT之有效LNA寡核苷酸且發現其在活體外初級神經元中及在活體內ICV投與後耐受良好(參見圖7)。
圖7中所示之活體內急性耐受性評分及腦tau mRNA%對照資料顯示，與靶MAPT mRNA序列雜交之所選寡聚物既耐受良好又有效減少活體內Tau mRNA(例如，ASO-000013-ATTtccaaattcaCTT-SEQ.ID No.686：138,888-138,903)。
實例6：寡聚物優先級排序
本文所述分析可與所選寡聚物組合用於進一步測試。所選寡聚物之性質可如表1中所示來闡述。基於該等準則，針對額外活體外及活體內劑量-反應測試來選擇某些寡聚物。
在另一實施例中，可基於以下特徵選擇寡聚物：(1)Tau蛋白減少>30%之Tau蛋白減少(5μM寡聚物)；(2)鈣振盪<25%之鈣振盪減少；及(3)序列評分等於或高於0.2。
實例7：活體內資料
將寡聚物注射至動物中以測定其對Tau表現及對動物行為性質之效應。
研究動物及投與途徑
用於此實例中之動物係與實例5中所述相同之小鼠及大鼠且係以與實例5中所述相同之方式來處置。如實例5中所述注射動物。
如實例5中所述實施RT-PCR分析。
跑輪分析
飼養籠跑輪分析在隨意自由旋轉跑輪(Columbus Instruments)中量測自發活動。每個輪具有磁性感測器，該感測器連接至電腦介面並以 使用者指定之間隔記錄輪轉數。在此研究中，將小鼠個別置入具有跑輪之籠中且以15min增量監測輪旋轉。為容許習慣化並建立基線活動程度，經7天測試對照及測試小鼠，之後將其轉移至清潔籠中並藉由ICV注射給予鹽水或100ug ASO-000774。處理後2週，使小鼠返回跑輪籠以經7天評估治療效果。
腦Tau mRNA分析
腦均質化
如實例5中所述將小鼠腦組織均質化。存活及熱性癲癇發作資料(Gheyara等人，Ann Neurol. 2014；76(3)：443-456)。
熱誘導之癲癇發作：如所述使用熱燈在P30-45小鼠中誘導癲癇發作(Oakley等人，Proc Natl Acad Sci U S A 2009；106：3994-3999)，但使用2分鐘之馴化期。藉由Cox比例風險回歸使用R存活包(Therneau TM.Survival analysis.R包2.37-4 ed2013版)分析存活及熱性癲癇發作資料且用Holm之方法針對多重比較加以校正(Holm S.Scand J Stat 1979；6：65-70)。對於腦切片中藥物誘導之癲癇活動之分析，使用R包擬合線性混合效應模型(Laird等人，Biometrics 1982；38：963-974.)。對於每只小鼠及每種基因型包括隨機截距，使得由於「部分彙集」而不需要多重比較校正。獲得參數估計值之5000次抽取(draw)，且將95%信賴區間(CI)估計為該等抽取之第2.5及第97.5分位數。藉由圍繞差異反轉模擬CI來計算機率值。單獨實施對log(峰頻率10.1)及log(脈衝頻率10.1)之分析。
CSF收集
所有動物方案皆由Wallingford BMS動物照護及使用委員會批准。在如Barten等人，J Alz.Res. 24：127-141(2011)所述驅血後，自小鼠之小腦延髓池收集CSF。簡言之，在解剖顯微鏡下用30號針刺穿硬腦膜後，用P20移液器收集CSF。監測體溫且使用加熱墊及燈使其 維持在正常值。在暴露小腦延髓池並使用1ml胰島素注射器回抽後，自大鼠收集CSF。將CSF置於冰上，短暫離心以移除任何紅血球，轉移至另一管中同時量測體積，且在乾冰上冷凍。在單一濃注ICV注射ASO-000013後4週後觀察藉由Tau蛋白酶聯免疫吸附分析(下文所述之ELISA)量測之CSF Tau蛋白減少(數據未顯示)。
Tau蛋白酶聯免疫吸附分析(ELISA)
對於腦組織，使用BT2(針對Tau胺基酸194-198之抗體，Thermo Scientific)以2.5μg/ml之濃度塗佈96孔黑色ELISA板(Costar)並在37℃下保持1小時。在TBST中洗滌後，將板用TBS中之3%牛血清白蛋白封閉。將重組人類Tau441(rPeptide；Bogart,GA)或腦均質物之1：5000稀釋液稀釋於TBS中之1% BSA+0.05% Tween-20中。將鹼性磷酸酶偶聯Tau-5(針對Tau胺基酸210-230之抗體，Covance,Emeryville,CA)以1：2000稀釋度添加至樣品用於在4℃及振盪下共培育過夜。在TBST中洗滌後，用來自Applied Biosystems之Tropix CDP Star檢測試劑放大信號。在Envision(Perkin Elmer)上讀取化學發光信號。對於CSF樣品，此ELISA係以384孔格式實施以使所需CSF體積降至最低。將10μl CSF之1：2稀釋液添加至每孔。
原位雜交
在經安置20μm新鮮冷凍腦切片上實施Tau mRNA或ASO-000013之原位雜交(ISH)檢測。使載玻片解凍，在室溫下在4%多聚甲醛中固定10分鐘，在磷酸鹽緩衝鹽水(PBS)中洗滌並用0.25%乙酸酐/0.1M三乙醇胺在室溫(RT)下乙醯化10分鐘。在PBS洗滌後，將每一載玻片在67℃下在0.7ml預加熱雜交緩衝液(HB)、50%甲醯胺/5×鹽水檸檬酸鈉(SSC)、100μg/ml酵母tRNA、1×Denhardt’s中預雜交30分鐘。將5’FAM標記之ASO-000013正義探針(與所有LNA探針互補，ASO-000067=SPC-11404)加熱至90℃並保持4分鐘，在冰上冷卻，然後稀釋於HB 中。在67℃下將載玻片用hybrislip(Electron Microscopy Sciences,Hatfield,PA)在0.45ml中雜交30分鐘。隨後將其浸於0.1×SSC中，然後在0.1×SSC中在67℃下洗滌3次。然後將載玻片在3%過氧化氫中處理10分鐘，在PBS中洗滌，並在RT下在0.1M Tris-HCl,pH 7.5,0.15M NaCl,0.5%封閉劑(FP1020,Perkin Elmer Waltham,MA)中封閉15分鐘。此後在RT下在兔抗螢光黃-辣根過氧化酶中培育30分鐘。在TBST洗滌(Tris緩衝鹽水，含有0.05% Tween 20)後，實施酪醯胺(tyramide)信號放大(TSA Plus,Perkin Elmer)。在TBST中洗滌載玻片，使用DAPI進行核染色，且使用Prolong Gold(Invitrogen,Carlsbad,CA)安置蓋玻片。對於產色檢測，將載玻片(TSA洗滌後)第二次與抗螢光黃-HRP一起在RT下培育30分鐘，在TBST中洗滌並使用DAB受質(Quanto,Thermo Scientific,Freemont,CA)顯色。Tau mRNA及ASO-00013寡聚物ISH指示在單一ICV濃注注射100μg ASO-000013後，tau mRNA減少之均勻分佈及橫跨小鼠腦之寡聚物(數據未顯示)。
結果
在投與不同寡聚物後在小鼠中量測人類tau mRNA含量之活體內降低(圖7)。如圖9A及9B中所示，在單一ICV濃注100μg ASO-000013(即，ATTtccaaattcaCTT，其中大寫字母代表LNA核苷酸，而小寫字母代表DNA核苷酸)投與至野生型C57小鼠(N=12)後，腦Tau mRNA及Tau蛋白隨時間減少。在注射後2、4、8及12週量測Tau mRNA表現(正規化至GAPDH)。在注射後2、4、8及12週量測Tau蛋白(鹽水之%)含量。此寡聚物產生Tau mRNA及蛋白質之持久減少，且Tau蛋白在單一濃注ICV注射後12週後仍在減少。本發明內所定義之其他寡聚物在持久組織寡聚物暴露(圖10)下展現Tau mRNA(如藉由qRT-PCR所量測)及蛋白質(如藉由ELISA(進一步闡述於下文中)所量測)之更顯著之減少。
Tau mRNA減少
在經由腦室內或鞘內給藥直接投與至腦脊液(CSF)中時，類似於ASO-000013、ASO-000757、ASO-000762、ASO-000761、ASO-000758、ASO-000760及ASO-000759之寡核苷酸或寡聚物顯示初級hTau神經元中Tau蛋白之有效敲低及活體外及活體內良好耐受性(參見例如圖7)。在C57 bl6小鼠中在腦室內投與100ug後，其亦在腦中展示穩健持久之Tau降低(圖7)。在經該等寡聚物處理之初級神經元中未觀察到對初級神經元中鈣振盪之抑制。在直接注射至CSF中時，對初級神經元中鈣振盪之此抑制明顯指示與網絡功能障礙相關之急性活體內耐受性問題。
在100μg腦室內(ICV)濃注注射後，如ASO-000013之寡聚物產生持續Tau降低(參見圖9)。將100μg/5μl注射至wt C57小鼠中，在wt小鼠中進行3個月研究；N=12。達成穩健且持續之Tau RNA(圖9A)及蛋白質(圖9B)減少；3×33ug腦室內濃注注射產生類似結果(數據未顯示)。
在將類似於ASO-000013及ASO-000757之寡聚物鞘內(IT)注射至腰部留口之大鼠中之後，亦觀察到劑量依賴性Tau RNA減少(數據未顯示)。將300μg ASO-000013或ASO-000757之單一濃注IT注射注射至腰部置管之大鼠中(如上文所述)。在使用該等代表性寡聚物之所建議臨床投與途徑單一濃注投與後3天及4週時，觀察到穩健且持續之腦Tau mRNA減少(圖11)。IT投與係治療tau依賴性病症之較佳臨床途徑。
Tau蛋白減少
將3'UTR中之Tau ASO以100μg腦室內(ICV)投與hTau或野生型B16小鼠，以理解Tau蛋白減少相對於mRNA減少之滯後。在該等研究期間，多種Tau ASO在單一100μg ICV濃注劑量後超出4週時不耐受。 此區域中之一些最有效Tau ASO亦降低非既定靶Ras同系物基因家族成員A(「RhoA」)之表現。RhoA係Rho家族中之小GTPase蛋白。儘管RhoA活性之效應尚未完全熟知，但其主要與細胞骨架調節、主要地肌動蛋白應力纖維形成及肌動球蛋白收縮力相關。在人類中，其係由基因RHOA 編碼。RHOA 基因含有actttatttccaaatacacttcttt之序列(SEQ ID NO：959)。圖12顯示，RHOA 基因片段與所選寡聚物(例如，ASO-000757、ASO-000755或ASO-000753)具有1至4個鹼基對失配。
某些傳統間隔體序列在空位設計及翼設計中進一步經修飾。具體而言，將傳統間隔體設計轉化為交替側接間隔體設計(例如，ASO-001967、ASO-001941、ASO-001933及ASO-1940)。圖12顯示，傳統間隔體在單一100μg ICV濃注劑量後超過4週後不耐受，而交替側接間隔體展現超過4週後之耐受性。
圖12亦顯示，微管蛋白(Tuj1)與所示ASO之長期耐受性高度相關。大於25%之Rho A減少亦與缺乏長期耐受性(在圖12中顯示在單一ICV濃注注射100μg之每種ASO後大於4週)相關。
如上文所述在小鼠中作為單一濃注腦室內(ICV)投與ASO-001933(100μg-200μg)，且產生大於50%之腦Tau蛋白減少，此減少在hTau小鼠中持續4-12週。在該等劑量值下，在小鼠中在單一ICV劑量後之20週時期中未觀察到毒性臨床體徵且未觀察到明顯或組織學發現。亦投與ASO-000013且結果類似於ASO-001933。單一ICV濃注注射100μg在如藉由新物體識別或情境恐懼製約所評價之認知中、如藉由貓道、旋轉棒及跑輪所評價之運動功能中未產生不良變化(數據未顯示)。在攜載完整人類tau基因(hTau)之Tau敲除小鼠中，人類Tau腦mRNA及蛋白質減少之EC50 為約2.72μg/g(414nM)。如圖13顯示，在hTau小鼠腦中單一腦室內(ICV)注射後，ASO-001933(Tau ASO)產生持久之劑量反應性腦hTau蛋白減少。在hTau小鼠中ICV注射鹽水或 50、100、150及200μg之Tau ASO(n=10/組)。在給藥後8週解剖額葉皮質區以藉由ELISA(BT2/HT7)測定總Tau蛋白含量。使用二因子ANOVA及Bonferroni事後分析，***p<0.001。誤差槓代表SEM。
在tau蛋白病變(Tg4510)及德拉韋症候群小鼠模型二者中研究腦Tau蛋白阻抑程度與功能結果量度之間之關係。在該等遺傳小鼠模型中生成之初始資料(圖14及15)表明，腦可溶性及不溶性Tau蛋白與對照相比之約25-50%減少對於tau蛋白病變(如PSP及/或頑固性兒童早期癲癇，如德拉韋病)之潛在功能改良係足夠的。具體而言，圖14A顯示，ASO-000774之單一100μg ICV濃注減少總Tau蛋白。藉由使用本文所述之BT-2及HT-7 ELISA來量測蛋白質減少。p<0.05不成對t-測試。在圖14B中，在如上文所述之跑輪分析中評價Tg4510及雙陰性同窩出生仔畜對照(Dbl Neg)。ASO-000774之單一100μg ICV濃注將Tg4510之過動逆轉至Dbl Neg同窩出生仔畜對照之程度，p<0.05二因子RMANOVA，之後進行Bonferroni事後測試。
另外，腦可溶性及不溶性Tau蛋白與對照相比之約25-50%減少足以改良在SCNA1 基因中具有突變之德拉韋小鼠之存活及熱誘導癲癇發作(圖15)。經20μg或37μg靶向Tau mRNA之3’-UTR區域之Tau ASO-000762之單一ICV投與處理之德拉韋小鼠在出生後10天展現約20-50%之Tau蛋白減少(數據未顯示)。另外，如圖15A顯示，與同窩出生仔畜對照相比，德拉韋小鼠在30天至55天之間顯示更大活小鼠百分比。藉由Cox比例風險回歸顯示顯著治療效應。測試德拉韋小鼠以量測體溫過高誘導之全身性強直陣攣性癲癇發作(GTCS)。圖15B顯示，在注射後8-9週，在德拉韋小鼠中，20μg之ASO-000762抵抗體溫過高誘導之全身性強直陣攣性癲癇發作(GTCS)。與活體內德拉韋研究一致，在衍生自德拉韋及人類同基因型對照經誘導多潛能幹細胞(「iPSC」)之神經元中測試之ASO-001933校正由神經傳遞質誘導之網絡活性(數據 未顯示)。
實例8：靶向5' UTR及/或外顯子2之寡聚物之構築
設計多種寡聚物靶向MAPT 前mRNA之5' UTR及/或外顯子2。基因體MAPT 序列參見圖1。舉例而言，構築寡聚物以靶向SEQ ID NO：1之核苷酸72,802-73,072。寡聚物之實例性序列闡述於圖16A及B中。在一些實施例中，寡聚物經設計為間隔體或混合體。圖16A及B顯示用於所選序列之寡聚物設計之非限制性實例。可將相同方法應用於本文所揭示之任何其他序列。間隔體經構築以含有鎖核酸-LNA(大寫字母)。舉例而言，間隔體可在5'端及3'端具有β-去氧LNA且具有硫代磷酸酯主鏈。但LNA亦可經任何其他核苷酸類似物取代且主鏈可為其他類型之主鏈(例如，磷酸二酯鍵聯、磷酸三酯鍵聯、甲基磷酸酯鍵聯、胺基磷酸酯鍵聯或其組合)。所提及SEQ ID編號包括特定序列，但不包括寡聚物設計。
寡聚物係使用業內熟知之方法來合成。製備該等寡聚物之實例性方法闡述於Barciszewski等人，第10章-「Locked Nucleic Acid Aptamers」，Nucleic Acid and Peptide Aptamers：Methods and Protocols ，第535卷，Gunter Mayer(編輯)(2009)中，其全部內容係以引用方式明確併入本文中。
實例9：食蟹猴中之Tau mRNA及蛋白質減少
進行性核上性麻痺(PSP)係神經退化症候群臨床特徵為進行性姿勢不穩定、核上性凝視麻痹、帕金森氏症及認知損害。PSP在神經病理學上定義為tau陽性神經原纖維纏結在自大腦皮質、基底神經節延伸至小腦及腦幹之腦區域中之累積。受影響最嚴重之腦區域包括腦幹黑質、腦橋核及小腦齒狀核。業內認為，該等區域中之Tau蛋白病變支持PSP之若干種臨床特徵，例如姿勢不穩定、發音困難及凝視麻痹。在腦區域中對Tau mRNA轉錄物及因此對蛋白質之阻抑可對PSP 患者之治療具有治療意義。
受試者係在研究開始時稱重為3.5-10.0kg之雄性食蟹猴。向每只食蟹猴植入鞘內CSF導管，該導管係在L3或L4椎骨進入，延伸至大約L1椎骨。導管之近端連接至皮下輸液埠。經由該埠藉由重力流動收集CSF至最大0.5ml CSF/樣品。將CSF離心並將上清液保持在-90℃下直至分析為止。將自可用靜脈獲得之血漿保持在-90℃下直至分析為止。
向食蟹猴以0.33ml/min及1.0ml體積投與溶解於鹽水中之ASO-1933，之後投與0.5ml無菌水沖洗劑。總灌注時間為4.5min。
在用氯胺酮及異氟醚麻醉的同時向食蟹猴投與適當體積之市售安樂死溶液。之後立即獲得驗屍組織並將腦轉移至濕冰以供解剖。使用ASI食蟹猴腦基質中之6mm切片以及自由手(free handed)技術解剖所關注區域。將新鮮樣品置於RNAlater中，或在乾冰上冷凍以供後續分析。將一些切片完整冷凍以供免疫組織化學分析。將切片置於稱量船(weigh boat)中並使其漂浮在用乾冰冷卻之異戊烷上。在冷凍後，立即將切片儲存於-90℃下直至分析為止。
對於腦塊切片，在低溫恒溫器冠狀切面上切割經冷凍腦塊，並將切片解凍安置至super frost載玻片上，乾燥，在乾冰上再次冷凍，並儲存於-80℃下直至使用為止。使用自給予媒劑、16mg ASO-1933(1×16)或兩次16mg ASO-1933(2×16，間隔2週)之食蟹猴收集之腦切片進行原位雜交(ISH)研究。
為使用[35 S]標記之反義ISH量測Tau mRNA表現，合成Tau DNA模板及[35 S]標記之反義探針。藉由PCR使用正向引子5’-CAA GCT CGC ATG GTC AGT AA-3’(SEQ ID NO：954)及反向引子5’-AAT TAA CCC TCA CTA AAG GGA GA TTC TCA GTG GAG CCG ATC TT-3’(SEQ ID NO：955)自食蟹猴cDNA庫(Zyagen KD-201)擴增Tau DNA模板(425bp,687-1111，登錄號：XM_005584540.1)。藉由凝膠電泳觀察期望大小之產物。使用[35 S]UTP(Perkin Elmer NEG-739)以T3 RNA聚合酶(Invitrogen AM1316)轉錄Tau DNA模板以產生[35 S]標記之反義ISH探針。
為使用[35 S]標記之反義探針量測Tau mRNA ISH，使載玻片解凍，在4℃下於4%多聚甲醛中固定15min，之後沖洗。然後在乙酸酐/三乙醇胺中處理載玻片，之後沖洗。在50℃下將載玻片於預雜交溶液中預雜交3小時，並在雜交溶液中與1.5×104 cpm/ul[35 S]核糖核酸探針(riboprobe)(0.75ml/載玻片)雜交。在雜交後，在室溫下洗滌載玻片。然後用Rnase A在37℃下處理載玻片，洗滌兩次，之後進行高嚴格度洗滌。將切片在含有0.3M NH4 Ac之90%醇中脫水，乾燥，並抵靠磷光屏(Perkin Elmer PPN 7001487)曝光。在曝光後，在屏幕上捕獲放射自顯影影像並使用Cyclone storage phosphor系統及OptiQuant獲取及分析軟體(PerkinElmer,Waltham,MA)加以分析。
使用QUANTIGENE® ViewRNA組織ISH在亞核及細胞層面檢測Tau mRNA表現。藉由Affymetrix合成靶向Tau mRNA之反義探針(1型)(2344-3300，登錄號：XM_005584529)。將載玻片固定於磷酸鹽緩衝鹽水(PBS)中之4%甲醛中。在各自經10分鐘通過醇梯度後，乾燥載玻片，之後進行蛋白酶QF消化。隨後，洗滌切片並與靶探針雜交。然後在洗滌緩衝液中洗滌載玻片並儲存於儲存緩衝液中過夜。然後經由一系列連續PreAmp及Amp雜交步驟處理載玻片。將切片與標記探針AP一起培育，之後與Fast Red受質一起培育，在PBS中沖洗，且使用Gill蘇木素或DAPI複染。使用DAKO ultramount封固劑將載玻片加蓋玻片並儲存。使用Leica亮視野顯微鏡或Leica共焦螢光顯微鏡(激發：630nm；發射：760)使經標記Tau mRNA可視化。
為量測Tau蛋白表現，使用Tau12(BioLegend,San Diego,CA，針 對tau 441序列上之胺基酸6-18之表位)及BT2(Thermo Scientific,Rockville,IL，針對胺基酸194-198之表位)分別以2.5μg/ml及1μg/ml來塗佈Costar 3925 ELISA板。將板在37℃下培育1h，之後用含有0.05% Tween-20(TBST)之TBS洗滌。藉由添加含有0.1% Tween-20之TBS中之3%牛血清白蛋白(BSA)在室溫及振盪下阻斷非特異性結合4h。將板用TBST洗滌，之後添加樣品或用重組h-tau441蛋白生成之標準曲線，該二者皆係在TBST加1% BSA中製備。將含有標準曲線及樣品之板在4℃及振盪下培育過夜。使用Lightning Link偶聯套組(Novus Biologicals,Littleton,CO)將以下檢測抗體與鹼性磷酸酶(AP)偶聯：BT2及HT7(Thermo Scientific，159-163之表位)。將AP-偶聯檢測抗體稀釋於TBST加1% BSA中並與樣品及標準曲線在室溫及振盪下共培育1h。在用TBST洗滌後，經30min添加具有Sapphire-II AP受質之即用型Tropix CDP-Star(Applied Biosystems,Bedford,MA)。使用Perkin Elmer EnVision微量讀板器(Waltham,MA)測定化學發光信號。
N-末端tau夾心型ELISA(Tau12-BT2)係由作為捕獲及檢測之抗Tau抗體Tau12及抗Tau抗體BT2之鹼性磷酸酶(AP)偶聯物組成。中間結構域tau夾心型ELISA(BT2-HT7)係由作為捕獲抗體及檢測之抗Tau抗體BT2及抗Tau抗體HT7之鹼性磷酸酶(AP)偶聯物組成。用tris緩衝鹽水(50μL/孔)中之2.5μg/ml抗Tau BT2單株抗體(Thermo,Waltham,MA)或5μg/ml之Tau12抗tau單株抗體(Covance)塗佈高結合黑色孔ELISA板(Costar,Corning,Tewksbury,MA)。用含有0.05% tween-20(TBS-T)之tris緩衝鹽水洗滌板，之後在室溫及振盪下在3% BSA/TBS(BSA，Roche,Indianapolis,IN)中封閉。如上文所列示再洗滌板，之後以一式三份(50μL/孔)添加樣品。將食蟹猴CSF樣品以1：30(BT2/HT7)或1：25(Tau12/BT2)稀釋於1% BSA/TBS-T中。製作Tau 441(R-肽，Bogart,GA)標準曲線。將樣品在4℃及振盪下在ELISA板上培 育過夜。將AP偶聯HT7或BT2在1% BSA/TBS-T中稀釋至0.25μg/ml(HT7)或0.1μg/ml(BT2)，並添加至板(50μL/孔)中以供與標準品及樣品在室溫及振盪下共培育1小時。將板再洗滌，之後添加化學發光受質(Tropix CDP Star,Applied Biosystems,Grand Island,NY)(100μL/孔)並在室溫及振盪下培育30分鐘。The plates were read on a Perkin Elmer TopCount.使用GraphPad Prism軟體自Tau-441標準曲線讀出未知樣品值。
該等研究顯示，鞘內施用之Tau ASO分佈至黑質、腦橋核及齒狀核並在按兩個16mg劑量(間隔2週)(2×16)鞘內投與ASO-001933後在食蟹猴之該等腦區域中阻抑Tau mRNA表現。圖17A顯示在給予媒劑或ASO-001933 2×16mg(間隔1週)之猴之黑質、腦橋核及齒狀核中，tau mRNA表現(較淺陰影)之原位雜交(ISH)放射自顯影影像。如圖17B顯示，在兩種猴之所有三個區域中，ASO-001933皆產生對Tau mRNA表現之顯著阻抑。ASO-001933產生之Tau mRNA敲低效應係使用QUANTIGENE® ViewRNA ISH分析(數據未顯示)進一步顯示。圖17B顯示，在經媒劑處理之猴中，高強度Tau mRNA標記主要存於黑質、腦橋核及齒狀核之神經元細胞體中。在食蟹猴中，投與ASO-001933之間隔一週之兩個單一16mg鞘內劑量以評價在其中病理性Tau在PSP中累積之解剖學腦區域中，Tau mRNA減少之解剖學分佈(圖17A)。
在猴中，在給藥後2週內，4mg ASO-001933之單一鞘內(IT)劑量在皮質腦區域中產生介於58%至80%之間之Tau mRNA減少，且在小腦中產生63%之減少(數據未顯示)。人們認為，該等腦區域對於治療PSP中之Tau依賴性功能障礙(神經退化tau蛋白病變)及德拉韋症候群(癲癇及自閉症譜系障礙)很重要，該等疾病係Tau反義分子(如ASO-001933)之主要適應症。
與Tau mRNA一致，圖18A及18B顯示，在猴中作為IT濃注注射(2個8mg劑量，間隔2週給予)之ASO-001933投與能在腦中減少約70%之Tau蛋白(圖18A)及在CSF中減少約60%之Tau蛋白(圖18B)。在ASO投與後12週觀察Tau蛋白表現。類似地，在小鼠中作為單一ICV腦室內注射(100μg)之ASO-001933投與能在腦中減少約50%之Tau蛋白(數據未顯示)及在CSF中減少約34%之Tau蛋白(數據未顯示)。該等資料表明，CSF Tau蛋白之減少可為靶嚙合之臨床可及之生物標記。
在小鼠或大鼠中作為單一濃注腦室內(圖19A：ICV，25-150μg)或鞘內(圖19B：IT，400-900μg)投與ASO-002038，如實例5中所述。ASO-002038在腦中產生劑量依賴性hTau mRNA減少，且在小鼠中計算EC50 值為約598nM。在該等劑量值下，在小鼠中在單一ICV劑量後未觀察到毒性臨床體徵且未觀察到嚴重或組織學發現。多種ASO(包括ASO-000013、ASO-001933、ASO-001967、ASO-001940、ASO-001941及其他)產生類似hTau劑量依賴性減少、人類Tau腦mRNA之減少之類似EC50 ，且在小鼠中耐受良好(數據未顯示)。
實例10：Tau、Rho及微管蛋白mRNA表現之QUANTIGENE分析
為量測tau、rhoA及微管蛋白mRNA減少，自在小鼠tau敲除背景下表現人類tau轉基因之E18轉基因小鼠之前腦建立初級神經元培養物。(Andorfer等人，J Neurochem 86：582-590(2003))。如實例2中所述製備培養物。或者，根據製造商說明書使用來自Cellular Dynamics Inc.之iNeurons。
溶解：將細胞以50,000個細胞/孔平鋪於聚-D-離胺酸塗佈之96孔板上並維持在含有B27、glutamax及青黴素-鏈黴素之神經基礎培養基中。將ASO稀釋於水中並在DIV01添加至細胞至5μM之終濃度。對於IC50 確定，用5uM之最高濃度處理神經元並使用1：3之濃度反應稀釋度來定義IC50 。在ASO處理後，將神經元在37℃下培育5天以達成mRNA 之穩態減少。移除培養基並將細胞在DPBS中洗滌1×且如下來溶解。對溶解物信使RNA之量測係使用QUANTIGENE 2.0試劑系統(Affymetrix)來實施，其使用依賴於特別設計之RNA捕獲探針組之具支鏈DNA信號擴增方法來量化RNA。藉由將50μl蛋白酶K添加至5ml預升溫之溶解混合劑並用dH2 O稀釋至1：4最終稀釋度來製備工作細胞溶解緩衝溶液。將工作溶解緩衝液添加至板(150μl/孔)，研磨混合，密封並培育。在溶解後，滴定各孔以混合並儲存於-80℃下或立即分析。
分析：端視所用具體捕獲探針(tau、RhoA或微管蛋白)將溶解物稀釋於溶解混合劑中。然後將總計80μl/孔添加至捕獲板(經捕獲探針塗佈之96孔聚苯乙烯板)。藉由組合12.1μl無核酸酶水、6.6μl溶解混合物、1μl封閉試劑、0.3μl特定2.0探針組(人類MAPT目錄號15486、人類RHOA目錄號SA-11696或人類β 3微管蛋白目錄號SA-15628)，根據製造商說明書(QUANTIGENE 2.0 Affymetrix)來生成工作探針組試劑。然後將20μl工作探針組試劑添加至捕獲板上之80μl溶解物稀釋液(或對於背景樣品，80μl溶解混合劑)中。將板離心，然後將其在55℃下培育16-20小時以雜交(靶RNA捕獲)。藉由用緩衝液將板洗滌3次以移除未結合材料來開始靶RNA之信號擴增及檢測。添加2.0 Pre-Amplifier雜交試劑(100μl/孔)，在55℃下培育1小時，然後抽吸並添加洗滌緩衝液並抽吸3次。然後如所述添加2.0 Amplifier雜交試劑(100μl/孔)，在55℃下培育1小時並如先前所述重複洗滌。隨後添加2.0標記探針雜交試劑(100μl/孔)，在50℃下培育1小時並如先前所述重複洗滌。最後，將板離心以移除任何過量洗滌緩衝液並添加2.0受質(100μl/孔)。將板在室溫下培育5分鐘並將板在PerkinElmer Envision多標記讀取器上在光度計模式下在15分鐘內成像。
資料測定：對於所關注基因，自每一技術重複之平均信號減去 平均分析背景信號。將減去背景的平均信號除以管家微管蛋白RNA之減去背景的平均信號。相對於對照經處理樣品溶解物計算經處理樣品之抑制%。經寡聚物(ASO)處理之細胞之QUANTIGENE分析結果顯示於圖20A及20B中。
<110> 美商必治妥美雅史谷比公司 丹麥商羅氏創新中心哥本哈根有限公司 理査 E 歐森 安琪拉 M 卡可瑟 彼得 哈吉朵恩 安賈 荷哈特 霍格 瑪莉安 萊貝克 詹森 尼爾斯 費斯克 尼爾森 容後補呈 容後補呈 傑佛瑞 M 布朗 史堤芬 E. 瑪瑟
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<223> ASO-002151
<400> 872
<210> 873
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列
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<223> ASO-002152
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<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> ASO-002153
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<211> 16
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
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<213> 人工序列
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<223> ASO-002161
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<213> 人工序列
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<213> 人工序列
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<212> DNA
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<211> 16
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<213> 人工序列
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<212> DNA
<213> 人工序列
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<220>
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<220>
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<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
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<211> 16
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<213> 人工序列
<220>
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<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
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<211> 17
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
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<212> DNA
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<220>
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<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> ASO-002188
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<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
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<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
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<211> 16
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
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<211> 16
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> ASO-002674
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<211> 16
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
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<211> 16
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
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<211> 16
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> ASO-002624
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<210> 899
<211> 16
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> ASO-002637
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<211> 16
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
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<211> 16
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> ASO-002625
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<211> 16
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
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<211> 16
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> ASO-002633
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<211> 17
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> ASO-002640
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<211> 17
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> ASO-002632
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<211> 17
<212> DNA
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<220>
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<213> 人工序列
<220>
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<211> 16
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> ASO-002641
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<211> 16
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> ASO-002648
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<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> ASO-002666
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<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> ASO-002659
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<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> ASO-002652
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<210> 913
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> ASO-002645
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<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> ASO-002638
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<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> ASO-003270
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<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> ASO-003269
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<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> ASO-003268
<400> 917
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<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> ASO-002673
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<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> ASO-002661
<400> 919
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<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> ASO-002654
<400> 920
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<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> ASO-002668
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<211> 16
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> ASO-002676
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<211> 16
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> ASO-002669
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<211> 16
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> ASO-002662
<400> 924
<210> 925
<211> 16
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> ASO-002672
<400> 925
<210> 926
<211> 17
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> ASO-002658
<400> 926
<210> 927
<211> 16
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> ASO-002622
<400> 927
<210> 928
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> ASO-002629
<400> 928
<210> 929
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> ASO-002621
<400> 929
<210> 930
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> ASO-002665
<400> 930
<210> 931
<211> 16
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> ASO-002630
<400> 931
<210> 932
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> ASO-002399
<400> 932
<210> 933
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> ASO-002482
<400> 933
<210> 934
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> ASO-002437
<400> 934
<210> 935
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> ASO-002425
<400> 935
<210> 936
<211> 16
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> ASO-000069
<400> 936
<210> 937
<211> 16
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> ASO-000070
<400> 937
<210> 938
<211> 17
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> ASO-002107
<400> 938
<210> 939
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> ASO-257283
<400> 939
<210> 940
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> ASO-257284
<400> 940
<210> 941
<211> 16
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> ASO-002627
<400> 941
<210> 942
<211> 17
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> ASO-002677
<400> 942
<210> 943
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> ASO-002670
<400> 943
<210> 944
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> ASO-002663
<400> 944
<210> 945
<211> 15
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> ASO-002635
<400> 945
<210> 946
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> ASO-002643
<400> 946
<210> 947
<211> 16
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> ASO-002671
<400> 947
<210> 948
<211> 17
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> ASO-002664
<400> 948
<210> 949
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> ASO-002626
<400> 949
<210> 950
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> ASO-002634
<400> 950
<210> 951
<211> 17
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> ASO-002642
<400> 951
<210> 952
<211> 16
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> ASO-002649
<400> 952
<210> 953
<211> 15
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> ASO-002656
<400> 953
<210> 954
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 正向引子
<400> 954
<210> 955
<211> 43
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 反向引子
<400> 955
<210> 956
<211> 16
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> SAN-002678
<400> 956
<210> 957
<211> 17
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> SAN-002650
<400> 957
<210> 958
<211> 16
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> SAN-002657
<400> 958
<210> 959
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> RhoA
<400> 959
<210> 960
<211> 16
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> ASO-000071
<400> 960

Claims (22)

  1. 一種長度為10至50個核苷酸之寡聚物，其包含與微管相關蛋白tau(MAPT)轉錄物內之核酸序列雜交之鄰接核苷酸序列，其中該核酸序列對應於SEQ ID NO：1之核苷酸134,947-138,940。
  2. 一種長度為10至50個核苷酸之寡聚物，其包含與微管相關蛋白tau(MAPT)轉錄物內之核酸序列雜交之鄰接核苷酸序列，其中該核酸序列對應於SEQ ID NO：1之核苷酸72,802-73,072。
  3. 如請求項1或2中任一項之寡聚物，其中該核苷酸序列包含至少一個核苷酸類似物。
  4. 如請求項1至3中任一項之寡聚物，其係間隔體(gapmer)、阻斷體(blockmer)、混合體(mixmer)、頭聚物(headmer)、尾聚物(tailmer)或總聚物(totalmer)。
  5. 如請求項1至4中任一項之寡聚物，其具有式5’-A-B-C-3’(I)，其中(i)B係7至23個DNA單元之鄰接序列；(ii)A係1至10個核苷酸之第一翼序列，其中該第一翼序列包含一或多個核苷酸類似物及視情況一或多個DNA單元且其中該等核苷酸類似物中之至少一者位於A之5’端；及(iii)C係1至10個核苷酸之第二翼序列，其中該第二翼序列包含一或多個核苷酸類似物及視情況一或多個DNA單元且其中該等核苷酸類似物中之至少一者位於C之3’端。
  6. 如請求項5之寡聚物，其中A選自L、LL、LDL、LLL、LLLL、LLDL、LDLL、LDDL、LLDD、LLLLL、LLLDL、LLDLL、LDLLL、LLDDL、LDDLL、LLDLD、LDLLD、LDLDL、LDDDL、LLLLLL、LLLLDL、LLLDLL、LLDLLL、LDLLLL、 LLLDDL、LLDLDL、LLDDLL、LDDLLL、LDLLDL、LDLDLL、LDDDLL、LLDDDL及LDLDLD，及C選自L、LL、LDL、LLL、LLLL、LLDL、LDLL、LDDL、LLDD、LLLLL、LLLDL、LLDLL、LDLLL、LLDDL、LDDLL、LLDLD、LDLLD、LDLDL、LDDDL、LLLLLL、LLLLDL、LLLDLL、LLDLLL、LDLLLL、LLLDDL、LLDLDL、LLDDLL、LDDLLL、LDLLDL、LDLDLL、LDDDLL、LLDDDL及LDLDLD。
  7. 如請求項1至6中任一項之寡聚物，其中該或該等核苷酸類似物選自鎖核酸(LNA)；2'-O-烷基-RNA；2'-胺基-DNA；2'-氟-DNA；阿拉伯糖核酸(ANA)；2'-氟-ANA、己糖醇核酸(HNA)、嵌入核酸(INA)、約束之乙基核苷(constrained ethyl nucleoside)(cEt)、2'-O-甲基核酸(2'-OMe)、2'-O-甲氧基乙基核酸(2'-MOE)及其任何組合。
  8. 如請求項1及3至7中任一項之寡聚物，其中該核苷酸序列與以下核苷酸內之核酸序列雜交：SEQ ID NO：1之核苷酸135,700-138,940；136,000-138,940；136,620-138,940；136,860-138,940；137,060-138,940；137,300-138,940；137,830-138,940；138,030-138,940；138,350-138,940；134,821-135,020；135,700-135,820；136,000-136,110；136,620-136,760；136,860-136,960；137,060-137,110；137,300-137,400；137,830-137,900；138,030-138,140；138,350-138,450；或138,860-138,940。
  9. 如請求項2至7中任一項之寡聚物，其中該核苷酸序列與以下核苷酸內之核酸序列雜交：SEQ ID NO：1之核苷酸72,802-73,072；72,812-73,062；72,822-73,052；72,832-73,042；72,842-73,032； 72,852-73,022；72,862-73,012；72,872-73,002；72,882-72,992；72,892-72,982；或72,902-72,972。
  10. 如請求項1至9中任一項之寡聚物，其中該核苷酸序列與選自圖2、3、6、7、16A、16B、20A及20B中之序列之核酸序列具有至少約80%、至少約90%、至少約95%、至少約96%、至少約97%、至少約98%、至少約99%或100%序列一致性。
  11. 如請求項10之寡聚物，其中該寡聚物具有圖2、3、6、7、16A、16B、20A或20B中顯示之設計。
  12. 如請求項1至11中任一項之寡聚物，其具有至少一種選自以下之性質：(1)與尚未暴露於該寡聚物之對照細胞相比，降低細胞中Tau mRNA之表現；及(2)與尚未暴露於該寡聚物之對照細胞相比，降低細胞中Tau蛋白之表現。
  13. 如請求項1至12中任一項之寡聚物，其中與該寡聚物接觸之神經元細胞之鈣振盪係比不與該寡聚物接觸之細胞中之振盪大於或等於95%、大於或等於90%、大於或等於85%、大於或等於80%、大於或等於75%或大於或等於70%。
  14. 如請求項1至13中任一項之寡聚物，其包含核苷酸A、T、C及G及核苷酸A、T、C及G之至少一個類似物，且序列評分大於或等於0.2，其中該序列評分係藉由下式I計算：
  15. 如請求項1至14中任一項之寡聚物，其包含選自以下之核苷間鍵聯：磷酸二酯鍵聯、磷酸三酯鍵聯、甲基磷酸酯鍵聯、胺基磷酸酯鍵聯、硫代磷酸酯鍵聯及其組合。
  16. 如請求項1至15中任一項之寡聚物，其中該寡聚物具有圖2、16B或20B中所述之化學結構。
  17. 一種偶聯物(conjugate)，其包含如請求項1至16中任一項之寡聚物，其中該寡聚物共價連接至至少一個非核苷酸或非多核苷酸部分。
  18. 一種組合物，其包含如請求項1至16中任一項之寡聚物或如請求項17之偶聯物及醫藥上可接受之載劑。
  19. 一種套組，其包含如請求項1至16中任一項之寡聚物或如請求項17之偶聯物或如請求項18之組合物及使用說明。
  20. 一種抑制或降低細胞中之Tau蛋白表現之方法，該方法包含將如請求項1至16中任一項之寡聚物或如請求項17之偶聯物或如請求項18之組合物投與表現Tau蛋白之細胞，其中該細胞中Tau蛋白表現在該投與後抑制或降低。
  21. 一種治療或預防神經病症之方法，其包含投與有效量之如請求項1至16中任一項之寡聚物或如請求項17之偶聯物或如請求項18之組合物。
  22. 如請求項21之方法，其中該神經病症選自進行性核上性麻痺、額顳葉失智症-tau(FTD-tau)、額顳葉失智症及與染色體17相關之帕金森氏症(parkinsonism)(FTDP-17)、皮質基底核退化症(CBD)、創傷性腦損傷、慢性創傷性腦病、HIV相關神經認知障礙、嗜銀顆粒病、唐氏症候群-阿茲海默氏病(Down syndrome-Alzheimer's disease)、健忘型輕度認知損傷-阿茲海默氏病、帕金森氏病失智症、哈勒沃登-施帕茨病(Hallervorden-Spatz disease，泛酸鹽激酶相關神經退化症)、C型尼曼匹克症(Niemann Pick disease type C)、肌強直性營養不良、肌肉萎縮性脊髓側索硬化症、帕金森氏病、杭丁頓氏症(Huntington's disease)、半邊巨腦症、結節性硬化複合症、2b型局灶性皮質發育不良或神經節細胞瘤。
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