BR112020016347A2 - Oligonucleotídeos antisense de camk2d e seus usos - Google Patents

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BR112020016347A2
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Richard E. Olson
Brian R. Anderson
Peter Hagedorn
Marianne Lerbech Jensen
Ivar M. McDonald
Stephen E. Mercer
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Bristol-Myers Squibb Company
Roche Innovation Center Copenhagen A/S
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Abstract

a presente invenção refere-se a oligonucleotídeos antisense que têm como alvo o mrna de camk2d em uma célula, levando à expressão reduzida da proteína camk2d. a redução da expressão da proteína camk2d é benéfica para o tratamento de certos distúrbios médicos, por exemplo, doenças ou distúrbios cardiovasculares associados.

Description

Relatório Descritivo da Patente de Invenção para “OLIGONUCLEOTÍDEOS ANTISENSE DE CAMK2D E SEUS USOS”.
REFERÊNCIA À LISTAGEM DE SEQUÊNCIAS APRESENTADA ELETRONICAMENTE VIA EFS-WEB
[0001] O conteúdo da listagem de sequências apresentada eletronicamente (Nome: 3338_102PC04_SequenceListing_ST25.txt; Tamanho: 746.302 bytes; e Data de Criação: 20 de fevereiro de 2019) apresentado neste pedido é incorporado no presente documento por referência em sua totalidade.
CAMPO DA DESCRIÇÃO
[0002] A presente descrição refere-se a compostos oligoméricos antisense (ASOs) que têm como alvo a transcrição de proteína quinase dependente de cálcio/calmodulina tipo delta II (CAMK2D) em uma célula, levando à expressão reduzida da proteína CAMK2D. A redução da expressão da proteína CAMK2D pode ser benéfica a uma variedade de distúrbios médicos, tais como doenças ou distúrbios cardiovasculares associados.
ANTECEDENTES
[0003] Serina/treonina quinases dependentes de cálcio/calmodulina (Ca2+/CaM) (CaMKs) constituem uma família de 81 proteínas no proteassoma humano que desempenham um papel central na sinalização celular, transmitindo sinais de Ca2+. Quatro isoenzimas de CaMKII (α, β, γ e δ), além de cerca de 30 variantes de excisão, são expressas em humanos. Braun, A.P., et al., Annual Review of Physiology 57: 417-445 (1995). Destes, a proteína CaMKIIδ (“CAMK2D”) é a isoforma mais abundante no coração e desempenha um papel importante nos processos de acoplamento excitação- contração (ECC) e relaxamento da fisiologia cardíaca normal. Mattiazzi A., et al., Am J. Physiol Heart Circ Physiol 308: H1177-H1191 (2015). A atividade de CAMK2D também foi descrita como sendo importante no processo de recuperação após certa lesão relacionada ao coração (por exemplo, lesão de isquemia-reperfusão). Disse M., et al., Am J. Physiol Heart Circ Physiol 285:H1198-205 (2003).
[0004] Apesar de vários avanços científicos, as doenças relacionadas ao coração continuam sendo a principal causa de morte para homens e mulheres em todo o mundo. A American Heart Association estima que, até 2030, quase 40% da população dos EUA apresentará algum tipo de doença cardiovascular e os custos médicos diretos devem atingir US $ 818 bilhões. Veja Benjamin, E.J., et al., Circulation 135: e146-e603 (2017). No entanto, Mattiazzi et al. observa que “a natureza onipresente de CaMKII e seus efeitos em diferentes alvos proteicos desafiam o uso de inibidores de CaMKII como uma ferramenta terapêutica”. Am J Physiol Heart Circ Physiol 308:H1177- H1191 (2015). Portanto, novas opções de tratamento muito mais poderosas e econômicas são altamente desejáveis.
SUMÁRIO DA DESCRIÇÃO
[0005] A presente descrição é direcionada a um oligonucleotídeo antisense (ASO) compreendendo, consistindo essencialmente de, ou consistindo da sequência de nucleotídeos contíguos de 10 a 30 nucleotídeos de comprimento que é complementar, tal como totalmente complementar, a uma sequência de ácidos nucleicos em uma transcrição da proteína quinase dependente de cálcio/calmodulina tipo delta II (CAMK2D). Em algumas modalidades, o ASO da presente descrição, ou sua sequência de nucleotídeos contíguos, é pelo menos cerca de 80%, pelo menos cerca de 85%, pelo menos cerca de 90%, pelo menos cerca de 95%, ou cerca de 100% complementar à sequência de ácidos nucleicos dentro da transcrição da CAMK2D. Em algumas modalidades, a transcrição de CAMK2D é selecionada a partir do grupo que consiste de SEQ ID NO: 1 e SEQ ID NO: 2.
[0006] Em algumas modalidades, o ASO no presente documento descrito é capaz de reduzir a expressão da proteína CAMK2D em uma célula humana (por exemplo, célula HEK293) que está expressando a proteína CAMK2D. Em algumas modalidades, a expressão da proteína CAMK2D é reduzida em pelo menos cerca de 30%, pelo menos cerca de 35%, pelo menos cerca de 40%, pelo menos cerca de 45%, pelo menos cerca de 50%, pelo menos cerca de 55%, pelo menos cerca de 60%, pelo menos cerca de 65%, pelo menos cerca de 70%, pelo menos cerca de 75%, pelo menos cerca de 80%, pelo menos cerca de 85%, pelo menos cerca de 90%, pelo menos cerca de 95% ou cerca de 100% em comparação à expressão da proteína CAMK2D em uma célula humana que não é exposta ao ASO.
[0007] Em algumas modalidades, o ASO é capaz de reduzir a expressão da transcrição de CAMK2D (por exemplo, mRNA) em uma célula humana (por exemplo, célula HEK293) que está expressando a transcrição de CAMK2D. Em algumas modalidades, a expressão da transcrição de CAMK2D é reduzida em pelo menos cerca de 30%, pelo menos cerca de 35%, pelo menos cerca de 40%, pelo menos cerca de 45%, pelo menos cerca de 50%, pelo menos cerca de 55%, pelo menos cerca de 60%, pelo menos cerca de 65%, pelo menos cerca de 70%, pelo menos cerca de 75%, pelo menos cerca de 80%, pelo menos cerca de 85%, pelo menos cerca de 90%, pelo menos cerca de 95%, ou cerca de 100% em comparação à expressão da transcrição de CAMK2D em uma célula humana que não é exposta ao ASO.
[0008] Em algumas modalidades, o ASO descrito no presente documento é um gapmer. Em algumas modalidades, o ASO tem um design de LLLDnLLL, LLLLDnLLLL, ou LLLLLDnLLLLL, em que L é um análogo de nucleosídeo, D é DNA, e n pode ser qualquer número inteiro entre 4 e 24. Em algumas modalidades, n pode ser qualquer número inteiro entre 6 e 14. Em algumas modalidades, n pode ser qualquer número inteiro entre 8 e 12.
[0009] Em algumas modalidades, o análogo de nucleosídeo do ASO descrito no presente documento compreende um 2'-O-alquil-RNA; 2'-O- metil-RNA (2'-OMe); 2'-alcóxi-RNA; 2'-O-metoxietil-RNA (2'-MOE); 2'- amino-DNA; 2'-fluro-RNA; 2'-fluoro-DNA; ácido nucleico arabino (ANA); 2'-fluoro-ANA; ou análogo de nucleosídeo bicíclico (LNA). Em algumas modalidades, um ou mais dos análogos de nucleosídeos do ASO é um nucleosídeo modificado por açúcar. Em algumas modalidades, o nucleosídeo modificado por açúcar é um nucleosídeo modificado por açúcar 2’ que aumenta a afinidade. Em algumas modalidades, um ou mais do análogo de nucleosídeo compreende um nucleosídeo contendo um açúcar bicíclico. Em algumas modalidades, o nucleosídeo modificado por açúcar 2’ que aumenta a afinidade é um LNA. Em algumas modalidades, o LNA é selecionado a partir do grupo que consiste de etil nucleosídeo restrito (cEt), 2'-O-metoxietil 2',4'-restrito (cMOE), α-L-LNA, β-D-LNA, ácidos nucleicos em ponte 2'-O,4'-C-etileno (ENA), amino-LNA, óxi-LNA, tio-LNA ou quaisquer suas combinações. Em algumas modalidades, o ASO compreende uma ou mais nucleobases 5'-metil-citosina.
[0010] Em algumas modalidades, o ASO no presente documento descrito é capaz de (i) reduzir o nível de mRNA que codifica CAMK2D em Cardiomiócitos Derivados de Células-Tronco Pluripotentes induzíveis humanas (hiPSC-CM); (ii) reduzir o nível de proteína de CAMK2D em hiPSC-CM; (iii) reduzir, melhorar ou tratar um ou mais sintomas de uma doença ou distúrbio cardiovascular, e (iv) quaisquer suas combinações.
[0011] Em algumas modalidades, a sequência de nucleotídeos contíguos do ASO é complementar a uma sequência de ácidos nucleicos que compreende os (i) nucleotídeos 625 - 842 da SEQ ID NO: 1; (ii) nucleotídeos 1.398 - 59.755 da SEQ ID NO: 1; (iii) nucleotídeos
61.817 - 104.725 da SEQ ID NO: 1; (iv) nucleotídeos 112.162 - 118.021 da SEQ ID NO: 1; (v) nucleotídeos 119.440 - 135.219 da SEQ ID NO: 1; (vi) nucleotídeos 137.587 - 157.856 da SEQ ID NO: 1; (vii) nucleotídeos
159.191 - 266.174 da SEQ ID NO: 1; ou (viii) nucleotídeos 272.788 -
310.949 da SEQ ID NO: 1. Em algumas modalidades, a sequência de nucleotídeos contíguos do ASO é complementar a uma sequência de ácidos nucleicos que compreende os (i) nucleotídeos 675 - 792 da SEQ ID NO: 1; (ii) nucleotídeos 1.448 - 59.705 da SEQ ID NO: 1; (iii) nucleotídeos 61.867 - 104.675 da SEQ ID NO: 1; (iv) nucleotídeos
112.212 - 117.971 da SEQ ID NO: 1; (v) nucleotídeos 119.490 - 135.169 da SEQ ID NO: 1; (vi) nucleotídeos 137.637 - 157.806 da SEQ ID NO: 1; (vii) nucleotídeos 159.241 - 266.124 da SEQ ID NO: 1; ou (viii) nucleotídeos 272.838 - 310.899 da SEQ ID NO: 1. Em algumas modalidades, a sequência de nucleotídeos contíguos do ASO é complementar a uma sequência de ácidos nucleicos que compreende os (i) nucleotídeos 725 - 742 da SEQ ID NO: 1; (ii) nucleotídeos 1.498 -
59.655 da SEQ ID NO: 1; (iii) nucleotídeos 61.917 - 104.625 da SEQ ID NO: 1; (iv) nucleotídeos 112.262 - 117.921 da SEQ ID NO: 1; (v) nucleotídeos 119.540 - 135.119 da SEQ ID NO: 1; (vi) nucleotídeos
137.687 - 157.756 da SEQ ID NO: 1; (vii) 159.291 - 266.074 da SEQ ID NO: 1; ou (viii) nucleotídeos 272.888 - 310.849 da SEQ ID NO: 1.
[0012] Em algumas modalidades, a sequência de nucleotídeos contíguos do ASO compreende a SEQ ID NO: 4 a SEQ ID NO: 1713 com uma ou duas incompatibilidades. Em algumas modalidades, a sequência de nucleotídeos contíguos do ASO compreende a sequência nucleotídica selecionada a partir das sequências nas Figuras 1A e 1B (SEQ ID NO: 4 a SEQ ID NO: 1713). Em algumas modalidades, a sequência de nucleotídeos contíguos do ASO compreende a SEQ ID NO: 25, SEQ ID NO: 27, SEQ ID NO: 114, SEQ ID NO: 158, SEQ ID NO: 190, SEQ ID NO: 327, SEQ ID NO: 463, SEQ ID NO: 513, SEQ ID NO: 516, SEQ ID NO: 519, SEQ ID NO: 657, SEQ ID NO: 659, SEQ ID
NO: 827, SEQ ID NO: 1249, SEQ ID NO: 1326, SEQ ID NO: 1409, SEQ ID NO: 1524, SEQ ID NO: 1530, SEQ ID NO: 1662, ou SEQ ID NO:
1676. Em algumas modalidades, a sequência de nucleotídeos contíguos do ASO compreende as SEQ ID NO: 55, SEQ ID NO: 61, SEQ ID NO: 63, SEQ ID NO: 71, SEQ ID NO: 75, SEQ ID NO: 79, SEQ ID NO: 84, SEQ ID NO: 85, SEQ ID NO: 92, SEQ ID NO: 102, SEQ ID NO: 105, SEQ ID NO: 128, SEQ ID NO: 130, SEQ ID NO: 133, SEQ ID NO: 138, SEQ ID NO: 161, SEQ ID NO: 178, SEQ ID NO: 180, SEQ ID NO: 186, SEQ ID NO: 195, SEQ ID NO: 200, SEQ ID NO: 202, SEQ ID NO: 234, SEQ ID NO: 264, SEQ ID NO: 387, SEQ ID NO: 390, SEQ ID NO: 396, SEQ ID NO: 441, SEQ ID NO: 446, SEQ ID NO: 457, SEQ ID NO: 467, SEQ ID NO: 523, SEQ ID NO: 524, SEQ ID NO: 636, SEQ ID NO: 640, SEQ ID NO: 700, SEQ ID NO: 740, SEQ ID NO: 832, SEQ ID NO: 965, SEQ ID NO: 1015, SEQ ID NO: 1065, SEQ ID NO: 1071, SEQ ID NO: 1155, SEQ ID NO: 1475, SEQ ID NO: 1508, SEQ ID NO: 1685, SEQ ID NO: 1686, SEQ ID NO: 1687, SEQ ID NO: 1688, ou SEQ ID NO: 1690.
[0013] Em algumas modalidades, o ASO da presente descrição tem um designer selecionado do grupo que consiste nos desenhos da FIGURA 3, em que a letra maiúscula é um nucleosídeo modificado por açúcar e a letra minúscula é DNA.
[0014] Em algumas modalidades, o ASO descrito no presente documento é capaz de reduzir a expressão da proteína CAMK2D em uma célula hiPSC-CM que está expressando a proteína CAMK2D. Em algumas modalidades, a expressão da proteína CAMK2D é reduzida em pelo menos cerca de 20%, pelo menos cerca de 30%, pelo menos cerca de 40%, pelo menos cerca de 50%, pelo menos cerca de 60%, pelo menos cerca de 70%, pelo menos cerca de 80%, pelo menos cerca de 90% ou cerca de 100% em comparação com uma célula não exposta ao ASO. Em algumas modalidades, o ASO é capaz de reduzir a expressão da transcrição de CAMK2D (por exemplo, mRNA) em uma célula hiPSC-CM que está expressando a transcrição de CAMK2D. Em algumas modalidades, a expressão da transcrição de CAMK2D é reduzida em pelo menos cerca de 20%, pelo menos cerca de 30%, pelo menos cerca de 40%, pelo menos cerca de 50%, pelo menos cerca de 60%, pelo menos cerca de 70%, pelo menos cerca de 80%, pelo menos cerca de 90% ou cerca de 100% em comparação com uma célula não exposta ao ASO.
[0015] Em algumas modalidades, o ASO tem de 14 a 20 nucleotídeos de comprimento. Em algumas modalidades, a sequência nucleotídica do ASO compreende uma ou mais ligações internucleosídicas modificadas. Em algumas modalidades, pelo menos 75%, pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 95% ou 100% das ligações internucleosídicas são modificadas. Em certas modalidades, cada uma das ligações internucleotídicas no ASO da presente descrição é uma ligação fosforotioato.
[0016] A presente descrição também fornece um conjugado compreendendo o ASO como descrito no presente documento, em que o ASO é covalentemente ligado a pelo menos uma porção não nucleotídica ou não polinucleotídica. Em algumas modalidades, a porção não nucleotídica ou não polinucleotídica compreende uma proteína, uma cadeia de ácidos graxos, um resíduo de açúcar, uma glicoproteína, um polímero, ou quaisquer suas combinações.
[0017] Também é fornecida no presente documento uma composição farmacêutica compreendendo o ASO ou o conjugado, como no presente documento descrito, e um diluente, veículo, sal ou adjuvante farmaceuticamente aceitável. Em certas modalidades, um sal farmaceuticamente aceitável compreende um sal de sódio, um sal de potássio ou um sal de amônio. Em algumas modalidades, a composição farmacêutica compreende ainda pelo menos um agente terapêutico adicional. Em algumas modalidades, o agente terapêutico adicional é um antagonista de CAMK2D. Em algumas modalidades, o antagonista de CAMK2D é um anticorpo anti-CAMK2d ou seu fragmento.
[0018] A presente descrição fornece ainda um kit compreendendo o ASO, o conjugado ou a composição farmacêutica, conforme descrito no presente documento, e instruções de uso. Também é descrito um kit de diagnóstico compreendendo o ASO, o conjugado ou a composição farmacêutica da presente descrição, e instruções de uso.
[0019] A presente descrição também é um método direcionado de inibição ou redução da expressão da proteína CAMK2D em uma célula, compreendendo administrar o ASO, o conjugado, ou a composição farmacêutica, descritos no presente documento, à célula que expressa a proteína CAMK2D, em que a expressão da proteína CAMK2D na célula é inibida ou reduzida após a administração. Em algum aspecto, a presente descrição é direcionada a um método in vitro de inibição ou redução da expressão da proteína CAMK2D em uma célula, compreendendo contatar o ASO, o conjugado, ou a composição farmacêutica, descritos no presente documento, à célula que expressa a proteína CAMK2D, em que a expressão da proteína CAMK2D na célula é inibida ou reduzida após o contato. Em algumas modalidades, o ASO inibe ou reduz a expressão da transcrição de CAMK2D (por exemplo, mRNA) na célula após a administração. Em algumas modalidades, a expressão da transcrição de CAMK2D (por exemplo, mRNA) é reduzida em pelo menos cerca de 20%, pelo menos cerca de 30%, pelo menos cerca de 40%, pelo menos cerca de 50%, pelo menos cerca de 60%, pelo menos cerca de 70%, pelo menos cerca de 80%, pelo menos cerca de 90%, ou cerca de 100% após a administração em comparação a uma célula não exposta ao ASO. Em algumas modalidades, a expressão da proteína CAMK2D é reduzida em pelo menos cerca de 60%, pelo menos cerca de 70%, pelo menos cerca de
75%, pelo menos cerca de 80%, pelo menos cerca de 85%, pelo menos cerca de 90%, pelo menos cerca de 95%, pelo menos cerca de 96 %, pelo menos cerca de 97 %, pelo menos cerca de 98 %, pelo menos cerca de 99 %, ou cerca de 100% após a administração em comparação a uma célula não exposta ao ASO. Em algumas modalidades, a célula é uma célula cardíaca, por exemplo, hiPSC-CM.
[0020] É fornecido no presente documento um método para reduzir, melhorar ou tratar um ou mais sintomas de uma doença ou distúrbio cardiovascular em um indivíduo em sua necessidade, compreendendo a administração de uma quantidade eficaz de ASO, conjugado ou da composição farmacêutica da presente descrição ao indivíduo. A presente descrição também fornece o uso de ASO, conjugado ou composição farmacêutica, descritos no presente documento, para a fabricação de um medicamento. Em algumas modalidades, o medicamento é para o tratamento de uma doença ou distúrbio cardiovascular em um indivíduo em sua necessidade. Em algumas modalidades, o ASO, o conjugado ou a composição farmacêutica da presente descrição são para uso em terapia. Em algumas modalidades, o ASO, o conjugado ou a composição farmacêutica, descritos no presente documento, são para uso na terapia de uma doença ou distúrbio cardiovascular em um indivíduo em sua necessidade.
[0021] Em algumas modalidades, a doença ou distúrbio cardiovascular compreende uma doença arterial coronariana, acidente vascular cerebral, insuficiência cardíaca, doença cardíaca hipertensiva, doença cardíaca reumática, cardiomiopatia, arritmia cardíaca, doença cardíaca congênita, cardite de doença cardíaca valvular, aneurismas aórticos, doença arterial periférica, doença tromboembólica, trombose venosa, ou quaisquer suas combinações. Em algumas modalidades, a doença ou distúrbio cardiovascular é uma insuficiência cardíaca. Em algumas modalidades, a insuficiência cardíaca compreende uma insuficiência cardíaca do lado esquerdo, uma insuficiência cardíaca do lado direito, uma insuficiência cardíaca congestiva, uma insuficiência cardíaca com fração de ejeção reduzida (HFrEF), uma insuficiência cardíaca com fração de ejeção preservada (HFpEF), uma insuficiência cardíaca com fração de ejeção de faixa intermediária (HFmrEF), cardiomiopatia hipertrófica (HCM), doença cardíaca hipertensiva (HHD), ou cardiomiopatia hipertensiva hipertrófica.
[0022] Em algumas modalidades, o indivíduo é um ser humano. Em algumas modalidades, o ASO, o conjugado ou a composição farmacêutica da presente descrição é administrado de forma intracardíaca, oral, parenteral, intratecal, intracerebroventricular, pulmonar, tópica ou intraventricular.
BREVE DESCRIÇÃO DAS FIGURAS
[0023] As FIGURAS 1A e 1B mostram ASOs exemplares tendo como alvo o pré-mRNA de CAMK2D. A FIGURA 1A mostra os ASOs tendo como alvo um único sítio dentro do pré-mRNA de CAMK2D. A FIGURA 1B mostra os ASOs tendo como alvo múltiplos sítios (isto é, dois ou três) dentro do pré-mRNA de CAMK2D. Cada coluna das Figuras 1A e 1B mostra o número da SEQ ID designado apenas para a sequência ASO, as posições inicial e final alvo na sequência do pré- mRNA de CAMK2D (para a FIGURA 1B, os vários sítios alvo são identificados como #1, #2 ou #3), a sequência ASO sem qualquer design ou estrutura química particular, o número de ASO (No. ASO), e a sequência ASO com uma estrutura química.
[0024] A FIGURA 2 mostra tanto a redução percentual da expressão de mRNA de CAMK2D nas células HEK293 (eixo geométrico y) quanto a posição relativa dos ASOs na transcrição de CAMK2D (eixo geométrico x). Cada círculo representa um ASO individual. Como ainda descrito no Exemplo 2, as células HEK293 foram tratadas com 25 µM de ASO e a expressão do mRNA de CAMK2D (normalizada para
GAPDH) é mostrada como um percentual de controle.
[0025] A FIGURA 3 mostra certos ASOs exemplares com seu design. Cada coluna da FIGURA 3 mostra a SEQ ID NO apenas para a sequência ASO, as posições inicial e final alvo na sequência do pré- mRNA de CAMK2D (em que o ASO se liga a vários sítios (veja a FIGURA 1B), são fornecidas as posições inicial e final alvo exemplares), o número do design de ASO (No. DES), a sequência ASO com um design, e o número de ASO (No. ASO).
[0026] A FIGURA 4 mostra a redução percentual da expressão do mRNA de CAMK2D tanto em células HEK293 quanto em cardiomiócitos derivados de células-tronco pluripotentes induzíveis humanas (hiPSC- CM) após cultura in vitro com vários ASOs, conforme descrito nos Exemplos 2 e 3. As células foram tratadas com 25 µM (HEK293) ou 500 nM (hiPSC-CM) de ASO e a expressão do mRNA de CAMK2D (normalizada para GAPDH) é mostrada como um percentual de controle. Onde nenhum valor é fornecido, o ASO específico não foi testado sob condições particulares.
[0027] A FIGURA 5 mostra a potência dos ASOs exemplares no nível de expressão do mRNA de CAMK2D em camundongos C57BL/6JBom uma semana após administração subcutânea. O nível de expressão do mRNA de CAMK2D foi normalizado para GAPDH e depois mostrado em relação ao grupo de controle (isto é, amostras tratadas com solução salina).
DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO I. Definições
[0028] Deve-se observar que o termo “um” ou “uma” entidade refere-se a uma ou mais dessa entidade; por exemplo, “uma sequência nucleotídica” é entendida como representando uma ou mais sequências nucleotídicas. Como tal, os termos “um” (ou “uma”), “um ou mais” e “pelo menos um” podem ser usados no presente documento de forma intercambiável.
[0029] Além disso, “e/ou”, quando usado no presente documento, deve ser tomado como descrição específica de cada um dos dois aspectos ou componentes especificados com ou sem o outro. Assim, o termo “e/ou”, conforme usado em uma frase como “A e/ou B” no presente documento, pretende incluir “A e B”, “A ou B”, “A” (sozinho) e “B “(sozinho). Da mesma forma, o termo “e/ou”, conforme usado em uma frase tal como “A, B e/ou C”, visa a abranger cada um dos seguintes aspectos: A, B e C; A, B ou C; A ou C; A ou B; B ou C; A e C; A e B; B e C; A (sozinho); B (sozinho); e C (sozinho).
[0030] Entende-se que sempre que aspectos são descritos no presente documento com a linguagem “compreendendo”, também são fornecidos aspectos análogos descritos em termos de “consistindo de” e/ou “consistindo essencialmente de”.
[0031] A menos que definido de outra forma, todos os termos técnicos e científicos usados no presente documento têm o mesmo significado que geralmente entendido por uma pessoa versada na técnica à qual esta descrição está relacionada. Por exemplo, o Concise Dictionary of Biomedicine and Molecular Biology, Juo, Pei-Show, 2ª ed., 2002, CRC Press; The Dictionary of Cell and Molecular Biology, 3a ed., 1999, Academic Press; e o Oxford Dictionary Of Biochemistry And Molecular Biology, Revisado, 2000, Oxford University Press, fornecem a uma pessoa versada um dicionário geral com muitos dos termos utilizados nessa descrição.
[0032] Unidades, prefixos e símbolos são indicados em sua forma aceita pelo Système International de Unites (SI). As variações numéricas são inclusivas dos números que definem o intervalo. Salvo indicação em contrário, as sequências nucleotídicas são escritas da esquerda para a direita na orientação 5' para 3'. As sequências de aminoácidos são escritas da esquerda para a direita na orientação amino para carbóxi. Os títulos no presente documento fornecidos não são limitações dos vários aspectos da descrição, que podem ser observados com referência à especificação como um todo. Por conseguinte, os termos definidos imediatamente abaixo são mais completamente definidos com referência à especificação em sua totalidade.
[0033] O termo “cerca de” é usado no presente documento para significar proximamente, aproximadamente, ao redor, ou nas regiões de. Quando o termo “cerca de” é usado em combinação com uma faixa numérica, ele modifica essa faixa estendendo os limites acima e abaixo dos valores numéricos estabelecidos. Em geral, o termo “cerca de” pode modificar um valor numérico acima e abaixo do valor declarado por uma variação de, por exemplo, 10%, para cima ou para baixo (superior ou inferior). Por exemplo, se for citado que “o ASO reduz a expressão da proteína CAMK2d em uma célula após a administração do ASO em pelo menos cerca de 60%”, está implícito que os níveis de CAMK2D são reduzidos em uma faixa de 50% a 70%.
[0034] O termo “ácidos nucleicos” ou “nucleotídeos” pretende abranger múltiplos ácidos nucleicos. Em algumas modalidades, o termo “ácidos nucleicos” ou “nucleotídeos” refere-se a uma sequência alvo, por exemplo, pré-mRNAs, mRNAs ou DNAs in vivo ou in vitro. Quando o termo se refere aos ácidos nucleicos ou nucleotídeos em uma sequência alvo, os ácidos nucleicos ou nucleotídeos podem ser sequências que ocorrem naturalmente dentro de uma célula. Em outras modalidades, “ácidos nucleicos” ou “nucleotídeos” se referem a uma sequência nos ASOs da descrição. Quando o termo se refere a uma sequência nos ASOs, os ácidos nucleicos ou nucleotídeos não ocorrem naturalmente, isto é, são quimicamente sintetizados, produzidos enzimaticamente, produzidos recombinantemente, ou quaisquer suas combinações. Em uma modalidade, os ácidos nucleicos ou nucleotídeos nos ASOs são produzidos sintética ou recombinantemente, porém não são uma sequência ocorrendo naturalmente ou um seu fragmento. Em outra modalidade, os ácidos nucleicos ou nucleotídeos nos ASOs não estão ocorrendo naturalmente porque contêm pelo menos um análogo de nucleotídeo que não ocorre naturalmente. O termo “ácido nucleico” ou “nucleosídeo” refere-se a um único segmento de ácido nucleico, por exemplo, um DNA, um RNA ou um seu análogo, presente em um polinucleotídeo. “Ácido nucleico” ou “nucleosídeo” inclui ácidos nucleicos ocorrendo naturalmente ou ácidos nucleicos de ocorrência não natural. Em algumas modalidades, os termos “nucleotídeo”, “unidade” e “monômero” são usados de forma intercambiável. Será entendido que, ao se fazer referência a uma sequência de nucleotídeos ou monômeros, o que é referido é a sequência de bases, tais como A, T, G, C ou U, e seus análogos.
[0035] O termo “nucleotídeo”, conforme utilizado no presente documento, refere-se a um glicosídeo compreendendo uma porção de açúcar, uma porção de base e um grupo covalentemente ligado (grupo de ligação), tal como um grupo de ligação internucleotídica de fosfato ou fosforotioato, e abrange tanto os nucleotídeos ocorrendo naturalmente, tais como DNA ou RNA, como os nucleotídeos ocorrendo não naturalmente contendo frações de açúcar e/ou base modificadas, que também são referidas no presente documento como “análogos de nucleotídeos”. No presente documento, um único nucleotídeo (unidade) também pode ser referido como uma unidade de monômero ou ácido nucleico. Em certas modalidades, o termo “análogos de nucleotídeo” refere-se a nucleotídeos que têm frações de açúcar modificadas. Exemplos não limitativos de nucleotídeos que possuem frações de açúcar modificadas (por exemplo, LNA) estão descritos em outras partes neste documento. Em outras modalidades, o termo “análogos de nucleotídeo” refere-se a nucleotídeos que possuem frações de nucleobase modificadas. Os nucleotídeos que possuem frações de nucleobase modificadas incluem, porém não estão limitados a 5-metil- citosina, isocitosina, pseudoisocitosina, 5-bromouracila, 5- propiniluracila, 6-aminopurina, 2-aminopurina, inosina, diaminopurina, e 2-cloro-6-aminopurina.
[0036] O termo “nucleosídeo”, como utilizado no presente documento, é usado para se referir a um glicosídeo compreendendo uma porção de açúcar e uma porção de base, e pode, portanto, ser utilizado quando se refere às unidades de nucleotídeos, que são covalentemente ligadas pelas ligações internucleotídicas entre os nucleotídeos do ASO. No campo da biotecnologia, o termo “nucleotídeo” é frequentemente usado para se referir a um monômero ou unidade de ácido nucleico. No contexto de um ASO, o termo “nucleotídeo” pode se referir apenas à base, isto é, uma sequência de nucleobases compreendendo citosina (DNA e RNA), guanina (DNA e RNA), adenina (DNA e RNA), timina (DNA) e uracila (RNA), em que estão implícitas a presença da cadeia principal do açúcar e ligações internucleotídicas. Da mesma forma, particularmente no caso de oligonucleotídeos onde um ou mais dos grupos de ligação internucleotídica são modificados, o termo “nucleotídeo” pode se referir a um “nucleosídeo”. Por exemplo, o termo “nucleotídeo” pode ser usado, mesmo ao especificar a presença ou natureza das ligações entre os nucleosídeos.
[0037] O termo “comprimento de nucleotídeo”, conforme utilizado no presente documento, significa o número total de nucleotídeos (monômeros) em uma determinada sequência. Por exemplo, a sequência tacatattatattactcctc (SEQ ID NO: 158) possui 20 nucleotídeos; assim, o comprimento nucleotídico da sequência é 20. O termo “comprimento nucleotídico” é, portanto, utilizado no presente documento de forma intercambiável com “número nucleotídico”.
[0038] Como uma pessoa versada na técnica perceberia, o nucleotídeo terminal 5' de um oligonucleotídeo não compreende um grupo de ligação internucleotídica 5', embora possa compreender um grupo terminal 5'.
[0039] Como utilizado no presente documento, o termo “alquila”, sozinho ou em combinação, significa um grupo alquila de cadeia linear ou cadeia ramificada com 1 a 8 átomos de carbono, particularmente, um grupo alquila de cadeia linear ou ramificada com 1 a 6 átomos de carbono e, mais particularmente, um grupo alquila de cadeia linear ou ramificada com 1 a 4 átomos de carbono. Exemplos de grupos alquila C1-C8 de cadeia linear e cadeia ramificada são metila, etila, propila, isopropila, butila, isobutila, terc-butila, as pentilas isoméricas, as hexilas isoméricas, as heptilas isoméricas e as octilas isoméricas, particularmente metila, etila, propila, butila e pentila. Exemplos particulares de alquila são metila. Outros exemplos de alquila são mono, di ou trifluoro metila, etila ou propila, tal como ciclopropila (cPr), ou mono, di ou trifluoro cicloproila.
[0040] O termo “alcóxi”, sozinho ou em combinação, significa um grupo da fórmula alquil-O- no qual o termo “alquila” tem o significado precedentemente fornecido, tal como metóxi, etóxi, n-propóxi, isopropóxi, n -butóxi, isobutóxi, sec.butóxi e terc.butóxi. “Alcóxi” em particular é metóxi.
[0041] O termo “oxi”, sozinho ou em combinação, significa o grupo -O-.
[0042] O termo “alquenila”, sozinho ou em combinação, significa um resíduo de hidrocarboneto de cadeia linear ou ramificada compreendendo uma ligação olefínica e até 8, preferivelmente até 6, particularmente preferido até 4, átomos de carbono. Exemplos de grupos alquenila são etenila, 1-propenila, 2-propenila, isopropenila, 1- butenila, 2-butenila, 3-butenila e isobutenila.
[0043] O termo “alquinila”, sozinho ou em combinação, significa um resíduo de hidrocarboneto de cadeia linear ou ramificada compreendendo uma ligação tripla e até 8, preferivelmente até 6, particularmente preferido até 4, átomos de carbono.
[0044] Os termos “halogênio” ou “halo”, sozinhos ou em combinação, significam flúor, cloro, bromo ou iodo e, particularmente, flúor, cloro ou bromo, mais particularmente, flúor e cloro, tal como flúor. O termo “halo”, em combinação com outro grupo, indica a substituição do referido grupo por pelo menos um halogênio, particularmente substituído por um a cinco halogênios, particularmente um a quatro halogênios, isto é, um, dois, três ou quatro halogênios. Os termos “hidroxila” e “hidróxi”, sozinhos ou em combinação, significam o grupo - OH.
[0045] Os termos “tio-hidroxila” e “tio-hidróxi”, sozinhos ou em combinação, significam o grupo -SH.
[0046] O termo “carbonila”, sozinho ou em combinação, significa o grupo -C(O)-.
[0047] O termo “carbóxi” ou “carboxila”, sozinho ou em combinação, significa o grupo -COOH.
[0048] O termo “amino”, sozinho ou em combinação, significa o grupo amino primário (-NH2), o grupo amino secundário (-NH-), ou o grupo amino terciário (-N-).
[0049] O termo “alquilamino”, sozinho ou em combinação, significa um grupo amino, como definido acima, substituído por um ou dois grupos alquila, como definido acima.
[0050] O termo “aminocarbonila, sozinho ou em combinação, significa o grupo -C(O)-NH2.
[0051] O termo “sulfonila”, sozinho ou em combinação, significa o grupo -SO2.
[0052] O termo “sulfinila”, sozinho ou em combinação, significa o grupo -SO-.
[0053] O termo “sulfanila”, sozinho ou em combinação, significa o grupo -S-.
[0054] O termo “ciano”, sozinho ou em combinação, significa o grupo -CN.
[0055] O termo “azido”, sozinho ou em combinação, significa o grupo -N3.
[0056] O termo “nitro”, sozinho ou em combinação, significa o grupo NO2.
[0057] O termo “formila”, sozinho ou em combinação, significa o grupo -C(O)H.
[0058] O termo “arila”, sozinho ou em combinação, indica um sistema de anel mono ou bicíclico carbocíclico aromático monovalente compreendendo 6 a 10 átomos de carbono no anel, opcionalmente substituído por 1 a 3 substituintes independentemente selecionados de halogênio, hidroxila, alquila, alquenila, alquinila, alcóxi, alcoxialquila, alquenilóxi, carboxila, alcoxicarbonila, alquilcarbonila e formila. Exemplos de arila incluem fenila e naftila, em particular fenila.
[0059] O termo “heteroarila”, sozinho ou em combinação, indica um sistema de anel mono- ou bicíclico heterocíclico aromático monovalente de 5 a 12 átomos no anel, compreendendo 1, 2, 3 ou 4 heteroátomos selecionados de N, O e S, os átomos restantes no anel sendo carbono, opcionalmente substituído por 1 a 3 substituintes selecionados independentemente de halogênio, hidroxila, alquila, alquenila, alquinila, alcóxi, alcoxialquila, alquenilóxi, carboxila, alcoxicarbonila, alquilcarbonila e formila. Exemplos de heteroarila incluem pirrolila, furanila, tienila, imidazolila, oxazolila, tiazolila, triazolila, oxadiazolila, tiadiazolila, tetrazolila, piridinila, pirazinila, pirazolila, piridazinila, pirimidinila, triazinila, azepinila, diazepinila, isoxazolila, benzofuranila, isotiazolila, benzotienila, indolila, isoindolila, isobenzofuranila, benzimidazolila, benzoxazolila, benzoisoxazolila, benzotiazolila, benzoisotiazolila, benzooxadiazolila, benzotiadiazolila, benzotriazolila,
purinila, quinolinila, isoquinolinila, quinazolinila, quinoxalinila, carbazolila, ou acridinila.
[0060] O termo “heterociclo”, sozinho ou em combinação, indica um sistema de anel mono- ou bicíclico heterocíclico não aromático monovalente de 5 a 12 átomos no anel, compreendendo 1, 2, 3 ou 4 heteroátomos selecionados de N, O e S, os átomos restantes no anel sendo carbono, opcionalmente substituído por 1 a 3 substituintes independentemente selecionados de halogênio, hidroxila, alquila, alquenila, alquinila, alcóxi, alcoxialquila, alquenilóxi, carboxila, alcoxicarbonila, alquilcarbonila e formila.
[0061] O termo “grupo protetor”, sozinho ou em combinação, significa um grupo que bloqueia seletivamente um sítio reativo em um composto multifuncional, de modo que uma reação química possa ser realizada seletivamente em outro sítio reativo não protegido. Grupos de proteção podem ser removidos. Grupos de proteção exemplares são grupos protetores de amino, grupos protetores de carbóxi ou grupos protetores de hidróxi.
[0062] Se um dos materiais ou compostos de partida da invenção contiver um ou mais grupos funcionais que não sejam estáveis ou sejam reativos nas condições de reação de uma ou mais etapas de reação, os grupos de proteção apropriados (como descrito, por exemplo, em “Protective Groups in Organic Chemistry” de T. W. Greene e P. G. M. Wuts, 3ª Ed., 1999, Wiley, Nova Iorque) podem ser introduzidos antes da etapa crítica dos métodos de aplicação bem conhecidos na técnica. Esses grupos protetores podem ser removidos em uma etapa posterior da síntese com a utilização de métodos padrão descritos na literatura. Exemplos de grupos protetores são terc-butoxicarbonila (Boc), 9- fluorenilmetil carbamato (Fmoc), 2-trimetilsililetil carbamato (Teoc), carbobenzilóxi (Cbz) e p-metoxibenziloxicarbonila (Moz).
[0063] Os compostos descritos no presente documento podem conter vários centros assimétricos e podem estar presentes na forma de enantiômeros opticamente puros, misturas de enantiômeros, tais como, por exemplo, racematos, misturas de diastereoisômeros, racematos diastereoisoméricos, ou misturas de racematos diastereoisoméricos.
[0064] O termo “átomo de carbono assimétrico” significa um átomo de carbono com quatro substituintes diferentes. De acordo com a Convenção de Cahn-Ingold-Prelog, um átomo de carbono assimétrico pode ser da configuração “R” ou “S”.
[0065] Como utilizado no presente documento, o termo “açúcar bicíclico” refere-se a uma porção de açúcar modificada compreendendo um anel de 4 a 7 membros compreendendo uma ponte conectando dois átomos do anel de 4 a 7 membros para formar um segundo anel, resultando em uma estrutura bicíclica. Em algumas modalidades, a ponte conecta o C2' e C4' do anel de açúcar ribose de um nucleosídeo (isto é, ponte 2'-4 '), como observado nos nucleosídeos LNA.
[0066] Como utilizado no presente documento, uma “região de codificação” ou “sequência de codificação” é uma porção de polinucleotídeo que consiste em códons traduzíveis em aminoácidos. Embora um “códon de parada” (TAG, TGA ou TAA) não seja tipicamente traduzido em um aminoácido, ele pode ser considerado parte de uma região de codificação, porém, quaisquer sequências de flanqueamento, por exemplo, promotores, sítios de ligação ribossômicos, terminadores transcricionais, introns, regiões não traduzidas (“UTRs”), e similares, não fazem parte de uma região de codificação. Os limites de uma região de codificação são tipicamente determinados por um códon de partida no terminal 5', que codifica o terminal amino do polipeptídeo resultante, e um códon de parada de tradução no terminal 3', que codifica o terminal carboxila do polipeptídeo resultante.
[0067] O termo “região não codificante”, como utilizado no presente documento, significa uma sequência nucleotídica que não é uma região codificante. Exemplos de regiões não codificantes incluem, porém não se limitam a, promotores, sítios de ligação ribossômicos, terminadores transcricionais, introns, regiões não traduzidas (“UTRs”), exons não codificantes, e similares. Alguns dos exons podem ser totalmente ou parte da região não traduzida 5' (5' UTR) ou da região não traduzida 3' (3' UTR) de cada transcrição. As regiões não traduzidas são importantes para tradução eficiente da transcrição e para controlar a taxa de tradução e a meia-vida da transcrição.
[0068] O termo “região”, quando usado no contexto de uma sequência de nucleotídeos, refere-se a uma seção dessa sequência. Por exemplo, a frase “região dentro de uma sequência nucleotídica” ou “região dentro do complemento de uma sequência nucleotídica” refere- se a uma sequência mais curta do que a sequência nucleotídica, porém maior do que pelo menos 10 nucleotídeos localizados na sequência nucleotídica específica ou no complemento da sequência nucleotídica, respectivamente. O termo “subsequência” também pode se referir a uma região de uma sequência de nucleotídeos.
[0069] O termo “a jusante”, quando se refere a uma sequência nucleotídica, significa que um ácido nucleico ou uma sequência nucleotídica está localizado em 3' em relação a uma sequência nucleotídica de referência. Em certas modalidades, sequências de nucleotídeos a jusante referem-se às sequências que seguem o ponto de partida da transcrição. Por exemplo, o códon de iniciação da tradução de um gene está localizado a jusante do sítio inicial da transcrição.
[0070] O termo “montante” refere-se a uma sequência de nucleotídeos que está localizada em 5' em relação a uma sequência de nucleotídeos de referência.
[0071] Como utilizado no presente documento, o termo “região reguladora” refere-se a sequências nucleotídicas localizadas a montante (sequências não codificantes 5'), dentro, ou a jusante (sequências não codificantes 3') de uma região codificante, e que influencia a transcrição, processamento de RNA, estabilidade ou tradução da região codificadora associada. As regiões reguladoras podem incluir promotores, sequências líderes de tradução, introns, sequências de reconhecimento de poliadenilação, sítios de processamento de RNA, sítios de ligação efetores, UTRs e estruturas em gancho. Se uma região de codificação for destinada a expressão em uma célula eucariótica, um sinal de poliadenilação e uma sequência de terminação da transcrição estarão geralmente localizados em 3' para a sequência de codificação.
[0072] O termo “transcrição”, conforme usado no presente documento, pode se referir a uma transcrição primária que é sintetizada pela transcrição de DNA e se torna um RNA mensageiro (mRNA) após o processamento, isto é, um RNA mensageiro precursor (pré-mRNA), e o próprio mRNA processado. O termo “transcrição” pode ser usado de forma intercambiável com “pré-mRNA” e “mRNA”. Depois que as fitas de DNA são transcritas para as transcrições primárias, os transcritos primários recém-sintetizados são modificados de várias maneiras para serem convertidos em suas formas funcionais maduras para produzir diferentes proteínas e RNAs, tais como mRNA, tRNA, rRNA, lncRNA, miRNA e outros. Assim, o termo “transcrição” pode incluir exons, introns, 5’UTRs e 3' UTRs.
[0073] O termo “expressão”, conforme utilizado no presente documento, refere-se a um processo pelo qual um polinucleotídeo produz um produto genético, por exemplo, um RNA ou um polipeptídeo. Inclui, sem limitação, a transcrição do polinucleotídeo em RNA mensageiro (mRNA) e a tradução de um mRNA em um polipeptídeo. A expressão produz um “produto genético”. Como utilizado no presente documento, um produto genético pode ser um ácido nucleico, por exemplo, um RNA mensageiro produzido pela transcrição de um gene, ou um polipeptídeo que é traduzido a partir de uma transcrição. Os produtos dos genes no presente documento descritos incluem ainda ácidos nucleicos com modificações pós-transcricionais, por exemplo, poliadenilação ou excisão, ou polipeptídeos com modificações pós- traducionais, por exemplo, metilação, glicosilação, adição de lipídios, associação com outras subunidades de proteínas, ou clivagem proteolítica.
[0074] Os termos “idêntica” ou “identidade” percentual, no contexto de dois ou mais ácidos nucleicos, se referem a duas ou mais sequências que são iguais ou que têm uma porcentagem especificada de nucleotídeos ou resíduos de aminoácidos que são iguais, quando comparados e alinhados (introduzindo intervalos, se necessário) para correspondência máxima, sem considerar quaisquer substituições conservadoras de aminoácidos como parte da identidade de sequência. A identidade percentual pode ser medida usando software ou algoritmos de comparação de sequência, ou por inspeção visual. São conhecidos na técnica vários algoritmos e softwares que podem ser utilizados para obter alinhamentos de sequências de aminoácidos ou nucleotídeos.
[0075] Um exemplo não limitativo de um algoritmo de alinhamento de sequência é o algoritmo descrito em Karlin et al., 1990, Proc. Natl. Acad. Sci., 87:2264-2268, conforme modificado em Karlin et al., 1993, Proc. Natl. Acad. Sci., 90:5873-5877, e incorporado nos programas NBLAST e XBLAST (Altschul et al., 1991, Nucleic Acids Res., 25:3389- 3402). Em certas modalidades, Gapped BLAST pode ser usado como descrito em Altschul et al., 1997, Nucleic Acids Res. 25:3389-3402. BLAST-2, WU-BLAST-2 (Altschul et al., 1996, Methods in Enzymology, 266: 460-480), ALIGN, ALIGN-2 (Genentech, São Francisco do Sul, Califórnia) ou Megalign (DNASTAR) são programas de software publicamente disponíveis adicionais que podem ser usados para alinhar sequências. Em certas modalidades, a identidade percentual entre duas sequências de nucleotídeos é determinada usando o programa GAP no pacote de software GCG (por exemplo, usando uma matriz NWSgapdna.CMP e um peso de intervalo de 40, 50, 60, 70 ou 90, e um peso de comprimento de 1, 2, 3, 4, 5 ou 6). Em certas modalidades alternativas, o programa GAP no pacote de software GCG, que incorpora o algoritmo de Needleman e Wunsch (J. Mol. Biol. (48): 444- 453 (1970)) pode ser usado para determinar a identidade percentual entre duas sequências de aminoácidos (por exemplo, usando uma matriz BLOSUM 62 ou uma matriz PAM250, e um peso de intervalo de 16, 14, 12, 10, 8, 6 ou 4, e um peso de comprimento de 1, 2, 3, 4, 5). Alternativamente, em certas modalidades, a identidade percentual entre sequências de nucleotídeos ou aminoácidos é determinada usando o algoritmo de Myers e Miller (CABIOS, 4:11-17 (1989)). Por exemplo, a identidade percentual pode ser determinada usando o programa ALIGN (versão 2.0) e usando um PAM120 com tabela de resíduos, uma penalidade de comprimento de intervalo 12 e uma penalidade de intervalo 4. Um versado na técnica pode determinar parâmetros apropriados para o alinhamento máximo por software de alinhamento específico. Em certas modalidades, são usados parâmetros padrão do software de alinhamento.
[0076] Em certas modalidades, a identidade percentual “X” de uma primeira sequência de nucleotídeos para uma segunda sequência de nucleotídeos é calculada como 100 x (Y/Z), em que Y é o número de resíduos de aminoácidos marcados como correspondências idênticas no alinhamento das primeira e segunda sequências (conforme alinhadas por inspeção visual ou um programa de alinhamento de sequência específico), e Z é o número total de resíduos na segunda sequência. Se o comprimento de uma primeira sequência for maior que o da segunda sequência, a identidade percentual da primeira sequência para a segunda sequência será maior do que a identidade percentual da segunda sequência para a primeira sequência.
[0077] Diferentes regiões dentro de uma única sequência alvo de polinucleotídeos que se alinham com uma sequência de referência polinucleotídica podem ter sua própria identidade percentual de sequência. Observa-se que o valor percentual da identidade de sequência é arredondado para o décimo mais próximo. Por exemplo, 80,11, 80,12, 80,13 e 80,14 são arredondados para 80,1, enquanto 80,15, 80,16, 80,17, 80,18 e 80,19 são arredondados para 80,2. Observa-se também que o valor do comprimento sempre será um número inteiro.
[0078] Conforme utilizados no presente documento, os termos “homólogo” e “homologia” são intercambiáveis com os termos “identidade” e “idêntico”.
[0079] O termo “sua variação que ocorre naturalmente” refere-se a variantes da sequência polipeptídica de CAMK2D ou sequência de ácidos nucleicos de CAMK2D (por exemplo, transcrição) que existem naturalmente dentro do grupo taxonômico definido, como mamíferos, tais como camundongos, macacos e humanos. Tipicamente, ao se referir a “variantes que ocorrem naturalmente” de um polinucleotídeo, o termo também pode abranger qualquer variante alélica do DNA genômico que codifica CAMK2D, que é encontrado na Posição cromossômica 4q26 (isto é, os resíduos 113.451.032 a 113.761.927 do No. de Acesso ao GenBank NC_000004.12) por translocação ou duplicação cromossômica, e o RNA, como o mRNA derivado dele. “Variações ocorrendo naturalmente” também podem incluir variantes derivadas de excisão alternativa do mRNA de CAMK2D. Quando referenciado a uma sequência polipeptídica específica, por exemplo, o termo também inclui formas de proteínas que ocorrem naturalmente, que podem, portanto, ser processadas, por exemplo, por modificações co ou pós-traducionais, tais como clivagem de peptídeos de sinal, clivagem proteolítica, glicosilação, etc.
[0080] Na determinação do grau de “complementaridade” entre os ASOs da descrição (ou suas regiões) e a região alvo do ácido nucleico que codifica CAMK2D de mamíferos (por exemplo, o gene CAMK2D), tais como os descritos no presente documento, o grau de “complementaridade” (também “homologia” ou “identidade”) é expresso como a identidade percentual (ou porcentagem de homologia) entre a sequência ASOs (ou sua região) e a sequência da região alvo (ou o complemento inverso da região alvo) que melhor se alinha com ela. A porcentagem é calculada contando o número de bases alinhadas que são idênticas entre as duas sequências, dividindo pelo número total de monômeros contíguos no ASO e multiplicando por 100. Nessa comparação, se existirem intervalos, é preferível que tais intervalos sejam meramente incompatíveis, em vez de áreas em que o número de monômeros dentro do intervalo difere entre o ASO da descrição e a região alvo.
[0081] O termo “complemento”, conforme usado no presente documento, indica uma sequência que é complementar a uma sequência de referência. É sabido que a complementaridade é o princípio básico da replicação e transcrição do DNA, pois é uma propriedade compartilhada entre duas sequências de DNA ou RNA, de modo que, quando elas estão alinhadas antiparalelas entre si, as bases nucleotídicas em cada posição nas sequências serão complementares, muito parecido com olhar no espelho e ver o inverso das coisas. Portanto, por exemplo, o complemento de uma sequência de 5'“ATGC”3' pode ser escrito como 3'“TACG”5' ou 5'“GCAT”3'. Os termos “complemento reverso”, “complementar reverso” e “complementaridade reversa”, conforme utilizados no presente documento, são intercambiáveis com os termos “complemento”, “complementar” e
“complementaridade”. Em algumas modalidades, o termo “complementar” refere-se a 100% de correspondência ou complementaridade (isto é, totalmente complementar) a uma sequência de ácidos nucleicos contíguos dentro de uma transcrição de CAMK2D. Em algumas modalidades, o termo “complementar” refere-se a pelo menos cerca de 80%, pelo menos cerca de 85%, pelo menos cerca de 90%, pelo menos cerca de 91 %, pelo menos cerca de 92 %, pelo menos cerca de 93 %, pelo menos cerca de 94 %, pelo menos cerca de 95%, pelo menos cerca de 96 %, pelo menos cerca de 97 %, pelo menos cerca de 98 % ou pelo menos cerca de 99 % de correspondência ou complementaridade a uma sequência de ácidos nucleicos contíguos dentro de uma transcrição de CAMK2D.
[0082] Os termos “correspondente à” e “corresponde a”, ao fazer referência a duas sequências separadas de ácidos nucleicos ou nucleotídeos, podem ser usados para esclarecer regiões das sequências que correspondem ou são similares entre si com base na homologia e/ou funcionalidade, embora os nucleotídeos das sequências específicas possam estar numerados de maneira diferente. Por exemplo, diferentes isoformas de uma transcrição de gene podem ter porções similares ou conservadas de sequências de nucleotídeos cuja numeração pode diferir nas respectivas isoformas com base na excisão alternativa e/ou outras modificações. Além disso, reconhece-se que diferentes sistemas de numeração podem ser usados ao caracterizar uma sequência de ácidos nucleicos ou nucleotídeos (por exemplo, uma transcrição de gene, e se deve começar a numerar a sequência a partir do códon inicial da tradução ou incluir o 5'UTR). Além disso, é reconhecido que o ácido nucleico ou a sequência de nucleotídeos de diferentes variantes de um gene ou transcrição de gene pode variar. Como utilizado no presente documento, no entanto, considera-se que as regiões das variantes que compartilham ácido nucleico ou homologia e/ou funcionalidade de sequência nucleotídica “correspondem” entre si. Por exemplo, uma sequência de nucleotídeos de uma transcrição de CAMK2D correspondente aos nucleotídeos X a Y da SEQ ID NO: 1 (“sequência de referência”) refere-se a uma sequência de transcrição de CAMK2d (por exemplo, pré-mRNA ou mRNA de CAMK2D) que possui uma sequência idêntica ou uma sequência similar aos nucleotídeos X a Y da SEQ ID NO: 1, em que X é o sítio inicial e Y é o sítio final (como mostrado nas Figuras 1A e 1B). Uma pessoa versada na técnica pode identificar os resíduos X e Y correspondentes na sequência de transcrição de CAMK2D alinhando a sequência de transcrição de CAMK2D com a SEQ ID NO: 1.
[0083] Os termos “análogo de nucleotídeo correspondente” e “nucleotídeo correspondente” pretendem indicar que a nucleobase no análogo de nucleotídeo e o nucleotídeo que ocorre naturalmente têm a mesma capacidade de emparelhamento ou hibridização. Por exemplo, quando a unidade 2-desoxirribose do nucleotídeo está ligada a uma adenina, o “análogo de nucleotídeo correspondente” contém uma unidade de pentose (diferente da 2-desoxirribose) ligada a uma adenina.
[0084] O termo “Número DES” ou “No. DES”, como utilizado no presente documento, refere-se a um único número dado a uma sequência de nucleotídeos que possui um padrão específico de nucleosídeos (por exemplo, DNA) e análogos de nucleosídeos (por exemplo, LNA). Como utilizado no presente documento, o design de um ASO é mostrado por uma combinação de letras maiúsculas e letras minúsculas. Por exemplo, DES-0231 refere-se a uma sequência ASO tacatattatattactcctc (SEQ ID NO: 158) com um design ASO LLLDDDDDDDDDDDDDDLLL (isto é, TACatattatattactcCTC), em que o L (isto é, a letra maiúscula) indica um análogo de nucleosídeo (por exemplo, LNA ) e o D (isto é, a letra minúscula) indica um nucleosídeo (por exemplo, DNA).
[0085] A anotação da química de ASO é a seguinte: Os nucleotídeos Beta-D-óxi LNA são designados por OxyB, em que B designa uma base nucleotídica, tal como timina (T), uridina (U), citosina (C), 5-metilcitosina (MC), adenina (A) ou guanina (G) e, portanto, inclui OxyA, OxyT, OxyMC, OxyC e OxyG. Os nucleotídeos de DNA são designados por DNAb, em que a letra minúscula b designa uma base nucleotídica, tal como timina (T), uridina (U), citosina (C), 5-metilcitosina (Mc), adenina (A) ou guanina (G) e, portanto, inclui DNAa, DNAt, DNA e DNAg. A letra M antes de C ou c indica 5-metilcitosina. A letra “s” indica uma ligação internucleotídica de fosforotioato.
[0086] O termo “Número ASO” ou “No. ASO”, como utilizado no presente documento, refere-se a um único número dado a uma sequência de nucleotídeos que possui a estrutura química detalhada dos componentes, por exemplo, nucleosídeos (por exemplo, DNA), análogos de nucleosídeos (por exemplo, beta-D-óxi-LNA), nucleobases (por exemplo, A, T, G, C, U ou MC), e a estrutura da cadeia principal (por exemplo, fosforotioato ou fosforodiéster). Por exemplo, ASO-0231 pode se referir a OxyTs OxyAs OxyMCs DNAas DNAts DNAas DNAts DNAts DNAas DNAts DNAas DNAts DNAts DNAas DNAcs DNAts DNAcs OxyMCs OxyTs OxyMC.
[0087] “Potência” é normalmente expressa como um valor de IC50 ou EC50, em µM, nM ou pM, a menos que indicado de outra forma. A potência também pode ser expressa em termos de porcentagem de inibição. IC50 é a concentração inibitória média de uma molécula terapêutica. EC50 é a concentração eficaz média de uma molécula terapêutica em relação a um veículo ou controle (por exemplo, solução salina). Em ensaios funcionais, IC50 é a concentração de uma molécula terapêutica que reduz uma resposta biológica, por exemplo, transcrição de mRNA ou expressão de proteína, em 50% da resposta biológica que é alcançada pela molécula terapêutica. Em ensaios funcionais, EC50 é a concentração de uma molécula terapêutica que produz 50% da resposta biológica, por exemplo, transcrição de mRNA ou expressão de proteína. IC50 ou EC50 podem ser calculadas por qualquer número de meios conhecidos na técnica.
[0088] Como usado no presente documento, o termo “inibição”, por exemplo, a expressão da transcrição gênica de CAMK2D e/ou proteína CAMK2D, refere-se ao ASO que reduz a expressão da transcrição gênica de CAMK2D e/ou proteína CAMK2D em uma célula ou tecido. Em algumas modalidades, o termo “inibição” refere-se à inibição completa (100% de inibição ou nível não detectável) da transcrição gênica de CAMK2D ou proteína CAMK2D. Em outras modalidades, o termo “inibição” refere-se a pelo menos 5%, pelo menos 10%, pelo menos 15%, pelo menos 20%, pelo menos 25%, pelo menos 30%, pelo menos 35%, pelo menos 40%, pelo menos 45%, pelo menos 50%, pelo menos 60%, pelo menos 70%, pelo menos 80%, pelo menos 90%, pelo menos 95% ou pelo menos 99 % de inibição da expressão da transcrição do gene CAMK2D e/ou da proteína CAMK2D em uma célula ou tecido.
[0089] Por “indivíduo” ou “individual” ou “animal” ou “paciente” ou “mamífero” entende-se qualquer indivíduo, particularmente um indivíduo mamífero, para quem o diagnóstico, prognóstico ou terapia é desejado. Os indivíduos mamíferos incluem seres humanos, animais domésticos, animais de fazenda, animais de esporte, e animais de zoológicos, incluindo, por exemplo, seres humanos, primatas não humanos, cães, gatos, porquinhos-da-índia, coelhos, ratos, camundongos, cavalos, gado, ursos, e assim por diante.
[0090] O termo “composição farmacêutica” refere-se a uma preparação que permite que a atividade biológica do ingrediente ativo seja eficaz e que não contenha componentes adicionais que sejam inaceitavelmente tóxicos a um indivíduo ao qual a composição seja administrada. Essa composição pode ser estéril.
[0091] Uma “quantidade eficaz” de um ASO, conforme descrito no presente documento, é uma quantidade suficiente para realizar um propósito especificamente citado. Uma “quantidade eficaz” pode ser determinada empiricamente e de maneira rotineira, em relação à finalidade citada.
[0092] Os termos como “tratando” ou “tratamento” ou “tratar” ou “aliviando” ou “aliviar” referem-se tanto a (1) medidas terapêuticas que curam, desaceleram, diminuem os sintomas e/ou interrompem a progressão de uma condição ou distúrbio patológico diagnosticado quanto a (2) medidas profiláticas ou preventivas que impedem e/ou retardam o desenvolvimento de uma condição ou distúrbio patológico alvo. Assim, aqueles que precisam de tratamento incluem aqueles que já estão com o distúrbio; aqueles propensos a ter o distúrbio; e aqueles em quem o distúrbio deve ser prevenido. Em certas modalidades, um indivíduo é “tratado” com êxito para uma doença ou condição, descrito em outra parte neste documento, de acordo com os métodos fornecidos no presente documento, se o paciente mostrar, por exemplo, alívio total, parcial ou transitório, ou eliminação de sintomas associados à doença ou distúrbio. II. Oligonucleotídeos Antisense
[0093] A presente descrição usa oligonucleotídeos antisense (ASOs) para uso na modulação da função de moléculas de ácido nucleico que codificam CAMK2D de mamíferos, tal como o ácido nucleico de CAMK2D, por exemplo, transcrição de CAMK2D, incluindo pré-mRNA de CAMK2D e mRNA de CAMK2D, ou variantes ocorrendo naturalmente de tais moléculas de ácido nucleico que codificam CAMK2D de mamífero. O termo “ASO”, no contexto da presente descrição, refere-se a uma molécula formada por ligação covalente de dois ou mais nucleotídeos (isto é, um oligonucleotídeo).
[0094] O ASO compreende uma sequência de nucleotídeos contíguos de cerca de 10 a cerca de 30, tais como 10-20, 14-20, 16-20 ou 15-25, nucleotídeos de comprimento. Os termos “ASO antisenso”, “oligonucleotídeo antisenso” e “oligômero”, conforme utilizados no presente documento, são intercambiáveis com o termo “ASO”.
[0095] Uma referência a um número de SEQ ID inclui uma sequência de nucleobases particular, porém não inclui qualquer design ou estrutura química completa. Além disso, os ASOs descritos nas figuras no presente documento mostram um design representativo, porém não estão limitados ao design específico mostrado nas Figuras, a menos que indicado de outra forma. No presente documento, um único nucleotídeo (unidade) também pode ser referido como um monômero ou unidade. Quando este relatório se refere a um número ASO específico, a referência inclui a sequência, o design do ASO específico, e a estrutura química. Quando este relatório se refere a um número DES específico, a referência inclui a sequência e o design ASO específicos. Por exemplo, quando uma reivindicação (ou este relatório) se refere à SEQ ID NO: 158, inclui a sequência nucleotídica de apenas tacatattatattactcctc. Quando uma reivindicação (ou o relatório) se refere a DES-0231, inclui a sequência nucleotídica de tacatattatattactcctc com o design ASO de TACatattatattactcCTC. Alternativamente, o design de ASO-0231 também pode ser escrito como SEQ ID NO: 158, em que cada um do primeiro nucleotídeo, segundo nucleotídeo, terceiro nucleotídeo, 18o nucleotídeo, o 19o nucleotídeo, e o 20o nucleotídeo da extremidade 5', é um nucleotídeo modificado, por exemplo, LNA, e cada um dos outros nucleotídeos é um nucleotídeo não modificado (por exemplo, DNA). O número ASO inclui a sequência e o design do ASO, bem como os detalhes específicos do ASO. Portanto, por exemplo, ASO-0231, referido neste pedido, indica OxyTs OxyAs OxyMCs DNAas DNAts DNAas DNAts DNAts DNAas DNAts DNAas DNAts DNAts
DNAas DNAcs DNAts DNAcs OxyMCs OxyTs OxyMC, em que “s” indica ligação de fosforotioato.
[0096] Em várias modalidades, o ASO da descrição não compreende RNA (unidades). Em algumas modalidades, o ASO compreende uma ou mais unidades de DNA. Em uma modalidade, o ASO de acordo com a descrição, é uma molécula linear ou é sintetizada como uma molécula linear. Em algumas modalidades, o ASO é uma molécula de fita simples e não compreende regiões curtas de, por exemplo, pelo menos 3, 4 ou 5 nucleotídeos contíguos, que são complementares a regiões equivalentes dentro do mesmo ASO (isto é, duplexes) – nesse aspecto, o ASO não é (essencialmente) de fita dupla. Em algumas modalidades, o ASO não é essencialmente de fita dupla. Em algumas modalidades, o ASO não é um siRNA. Em várias modalidades, o ASO da descrição pode consistir inteiramente da região nucleotídica contígua. Assim, em algumas modalidades, o ASO não é substancialmente autocomplementar.
[0097] Em outras modalidades, a presente descrição inclui fragmentos de ASOs. Por exemplo, a descrição inclui pelo menos um nucleotídeo, pelo menos dois nucleotídeos contíguos, pelo menos três nucleotídeos contíguos, pelo menos quatro nucleotídeos contíguos, pelo menos cinco nucleotídeos contíguos, pelo menos seis nucleotídeos contíguos, pelo menos sete nucleotídeos contíguos, pelo menos oito nucleotídeos contíguos, ou pelo menos nove nucleotídeos contíguos dos ASOs descritos no presente documento. Os fragmentos de qualquer uma das sequências descritas no presente documento são considerados como parte da descrição. II.A. O Alvo
[0098] Adequadamente, o ASO da descrição é capaz de regular negativamente (por exemplo, reduzir ou remover) a expressão do mRNA ou proteína CAMK2D. Nesse aspecto, o ASO da descrição pode afetar a inibição indireta da proteína CAMK2D através da redução nos níveis de mRNA de CAMK2D, tipicamente em uma célula de mamífero, tal como uma célula humana, como um cardiócito. Em particular, a presente descrição é direcionada a ASOs que têm como alvo uma ou mais regiões do pré-mRNA de CAMK2D (por exemplo, regiões de introns, regiões de exons e/ou regiões de junção de exon-intron). A menos que indicado de outra forma, o termo “CAMK2D”, conforme usado no presente documento, pode se referir a CAMK2D de uma ou mais espécies (por exemplo, seres humanos, primatas não humanos, cães, gatos, porquinhos da índia, coelhos, ratos, camundongos, cavalos, gado e ursos).
[0099] Proteína quinase dependente de cálcio/calmodulina tipo delta II (CAMK2D) também é conhecida como subunidade delta de CaM quinase II e subunidade delta de CamK-II. Os sinônimos de CAMK2D são conhecidos e incluem CaMKIIδ ou CAMKD. A sequência para o gene CAMK2D humano pode ser encontrada sob o Número de Acesso ao GenBank NC_000004.12 publicamente disponível. A sequência para a transcrição de pré-mRNA da CAMK2D humana (SEQ ID NO: 1) corresponde ao complemento reverso dos resíduos 113.451.032 -
113.761.927 de NC_000004.12. A sequência de mRNA de CAMK2D (No. de Acesso ao GenBank NM_001221.3) é fornecida na SEQ ID NO: 2, exceto que o nucleotídeo “t” na SEQ ID NO: 2 é mostrado como “u” no mRNA. A sequência para a proteína CAMK2D humana pode ser encontrada nos Números de Acesso publicamente disponíveis: Q13557 (sequência canônica, SEQ ID NO: 3), A8MVS8, Q52PK4, Q59G21, Q8N553, Q9UGH6, Q9UQE9, cada um dos quais sendo incorporado no presente documento por referência em sua totalidade.
[0100] São conhecidas variantes naturais do produto do gene CAMK2D humano. Por exemplo, variantes naturais da proteína CAMK2D humana podem conter uma ou mais substituições de aminoácidos selecionadas de: D167E, Q463E e T493I, e quaisquer suas combinações. Também são conhecidas na técnica variantes adicionais da proteína CAMK2D humana resultantes de excisão alternativa. A Isoforma Delta 3 de CAMK2D (identificador: Q13557-3 da UniProt) difere da sequência canônica (SEQ ID NO: 3) como a seguir: 328-328: K → KKRKSSSSVQMM. A sequência da Isoforma Delta 4 de CAMK2D (identificador: Q13557-4) difere da sequência canônica (SEQ ID NO: 3) da seguinte maneira: 328-328: K → KINNKANVVTSPKENIPTPAL. A sequência da Isoforma Delta 6 de CAMK2D (identificador: Q13557-8) difere da sequência canônica (SEQ ID NO: 3) como a seguir: 479-499: Ausente. A sequência da Isoforma Delta 7 de CAMK2D (identificador: Q13557-9) difere da sequência canônica (SEQ ID NO: 3) como a seguir: 328-328: K → KKRKSSSSVQMM e 479-499: Ausente. A sequência da Isoforma Delta 8 de CAMK2D (identificador: Q13557-5) difere da sequência canônica (SEQ ID NO: 3) como a seguir: 328-328: K → KINNKANVVTSPKENIPTPAL e 479-499: Ausente. A sequência da Isoforma Delta 9 de CAMK2D (identificador: Q13557-6) difere da sequência canônica (SEQ ID NO: 3) como a seguir: 329-329: E → EPQTTVIHNPDGNKE. A sequência da Isoforma Delta 10 de CAMK2D (identificador: Q13557-10) difere da sequência canônica (SEQ ID NO: 3) como a seguir: 329-329: E → EPQTTVIHNPDGNKE e 479-499: Ausente. A sequência da Isoforma Delta 11 de CAMK2D (identificador: Q13557-11) difere da sequência canônica (SEQ ID NO: 3) como a seguir: 328-328: K → KKRKSSSSVQMMEPQTTVIHNPDGNK. A sequência da Isoforma Delta 12 de CAMK2D (identificador: Q13557-12) difere da sequência canônica (SEQ ID NO: 3) como a seguir: 478-478: K → N e 479-499: Ausente. Portanto, os ASOs da presente descrição podem ser projetados para reduzir ou inibir a expressão das variantes naturais da proteína CAMK2D.
[0101] Um exemplo de uma sequência de ácidos nucleicos alvo dos
ASOs é o pré-mRNA de CAMK2D. A SEQ ID NO: 1 representa uma sequência genômica de CAMK2D humana (isto é, complemento reverso dos nucleotídeos 113.451.032 a 113.761.927 do No. de Acesso ao GenBank NC_000004.12). A SEQ ID NO: 1 é idêntica a uma sequência de pré-mRNA de CAMK2D, exceto que o nucleotídeo “t” na SEQ ID NO: 1 é mostrado como “u” no pré-mRNA. Em certas modalidades, o “ácido nucleico alvo” compreende um intron de ácidos nucleicos, que codificam a proteína CAMK2D ou suas variantes que ocorrem naturalmente, e ácidos nucleicos de RNA derivados, por exemplo, pré-mRNA. Em outras modalidades, o ácido nucleico alvo compreende uma região de exon de um ácido nucleico, que codifica a proteína CAMK2D ou suas variantes que ocorrem naturalmente, e ácidos nucleicos de RNA derivados, por exemplo, pré-mRNA. Em ainda outras modalidades, o ácido nucleico alvo compreende uma junção exon-intron de um ácido nucleico, que codifica a proteína CAMK2D ou suas variantes que ocorrem naturalmente, e ácidos nucleicos de RNA derivados, por exemplo, pré- mRNA. Em algumas modalidades, por exemplo, quando usado em pesquisa ou diagnósticos, o “ácido nucleico alvo” pode ser um cDNA ou um oligonucleotídeo sintético derivado dos alvos de ácidos nucleicos do DNA ou RNA acima. A sequência da proteína CAMK2D humana codificada pelo pré-mRNA da CAMK2D é mostrada como SEQ ID NO:
3. Em outras modalidades, o ácido nucleico alvo compreende uma região não traduzida de ácidos nucleicos que codificam a proteína CAMK2D ou suas variantes que ocorrem naturalmente, por exemplo, 5' UTR, 3' UTR, ou ambos.
[0102] Em algumas modalidades, um ASO da descrição hibridiza com uma região dentro dos introns de uma transcrição de CAMK2D, por exemplo, SEQ ID NO: 1. Em certas modalidades, um ASO da descrição hibridiza com uma região dentro dos exons de uma transcrição de CAMK2D, por exemplo, SEQ ID NO: 1. Em outras modalidades, um
ASO da descrição hibridiza com uma região dentro da junção exon- intron de uma transcrição de CAMK2D, por exemplo, SEQ ID NO: 1. Em algumas modalidades, um ASO da descrição hibridiza com uma região dentro de uma transcrição de CAMK2D (por exemplo, intron, exon ou uma junção exon-intron), por exemplo, SEQ ID NO: 1, em que o ASO tem um design de acordo com a fórmula: 5’ABC 3', conforme descrito em outra parte neste documento (por exemplo, Seção II.G).
[0103] Em algumas modalidades, o ASO tem como alvo um mRNA que codifica uma isoforma particular da proteína CAMK2D (por exemplo, Isoforma Delta 3-12). Em algumas modalidades, o ASO tem como alvo todas as isoformas da proteína CAMK2D. Em outras modalidades, o ASO tem como alvo duas isoformas (por exemplo, Isoforma Delta 3 e Isoforma Delta 7, Isoforma Delta 4 e Isoforma Delta 8, e Isoforma Delta 9 e Isoforma Delta 10) da proteína CAMK2D.
[0104] Em algumas modalidades, o ASO compreende uma sequência de nucleotídeos contíguos (por exemplo, 10 a 30 nucleotídeos de comprimento) que é complementar a uma sequência de ácidos nucleicos dentro de uma transcrição de CAMK2D, por exemplo, uma região correspondente à SEQ ID NO: 1. Em algumas modalidades, o ASO compreende uma sequência de nucleotídeos contíguos que hibridiza com uma sequência de ácidos nucleicos, ou uma região dentro da sequência, de uma transcrição de CAMK2D (“região alvo”), em que a sequência de ácidos nucleicos corresponde aos nucleotídeos: (i) nucleotídeos 625 - 842 da SEQ ID NO: 1; (ii) nucleotídeos 1.398 - 59.755 da SEQ ID NO: 1; (iii) nucleotídeos 61.817 - 104.725 da SEQ ID NO: 1; (iv) nucleotídeos 112.162 - 118.021 da SEQ ID NO: 1; (v) nucleotídeos 119.440 - 135.219 da SEQ ID NO: 1; (vi) nucleotídeos 137.587 - 157.856 da SEQ ID NO: 1; (vii) nucleotídeos
159.191 - 266.174 da SEQ ID NO: 1; e (viii) nucleotídeos 272.788 -
310.949 da SEQ ID NO: 1, e em que, opcionalmente, o ASO tem um dos designs descritos no presente documento (por exemplo, Seção II.G) ou uma estrutura química mostrada em outras partes neste documento (por exemplo, as FIGURAS 1A e 1B).
[0105] Em algumas modalidades, a região alvo corresponde aos nucleotídeos 725 - 742 da SEQ ID NO: 1. Em outras modalidades, a região alvo corresponde aos nucleotídeos 1.498 - 59.655 da SEQ ID NO: 1. Em certas modalidades, a região alvo corresponde aos nucleotídeos 61.917 - 104.625 da SEQ ID NO: 1. Em algumas modalidades, a região alvo corresponde aos nucleotídeos 112.262 -
117.921 da SEQ ID NO: 1. Em algumas modalidades, a região alvo corresponde aos nucleotídeos 119.540 - 135.119 da SEQ ID NO: 1. Em outras modalidades, a região alvo corresponde aos nucleotídeos
137.687 - 157.756 da SEQ ID NO: 1. Em certas modalidades, a região alvo corresponde aos nucleotídeos 159.291 - 266.074 da SEQ ID NO:
1. Em algumas modalidades, a região alvo corresponde aos nucleotídeos 272.888 - 310.849 da SEQ ID NO: 1.
[0106] Em algumas modalidades, a região alvo corresponde aos nucleotídeos 725 - 742 da SEQ ID NO: 1 ± 10, ± 20, ± 30, ± 40, ± 50, ± 60, ± 70, ± 80 ou ± 90 nucleotídeos na extremidade 3' e/ou na extremidade 5'. Em outras modalidades, a região alvo corresponde aos nucleotídeos 1.498 - 59.655 da SEQ ID NO: 1 ± 10, ± 20, ± 30, ± 40, ± 50, ± 60, ± 70, ± 80, ou ± 90 nucleotídeos na extremidade 3’ e/ou na extremidade 5'. Em certas modalidades, a região alvo corresponde aos nucleotídeos 61.917 - 104.625 da SEQ ID NO: 1 ± 10, ± 20, ± 30, ± 40, ± 50, ± 60, ± 70, ± 80, ou ± 90 nucleotídeos na extremidade 3’ e/ou na extremidade 5'. Em algumas modalidades, a região alvo corresponde aos nucleotídeos 112.262 - 117.921 da SEQ ID NO: 1 ± 10, ± 20, ± 30, ± 40, ± 50, ± 60, ± 70, ± 80, ou ± 90 nucleotídeos na extremidade 3’ e/ou na extremidade 5'. Em algumas modalidades, a região alvo corresponde aos nucleotídeos 119.540 - 135.119 da SEQ ID NO: 1 ± 10, ± 20, ± 30,
± 40, ± 50, ± 60, ± 70, ± 80, ou ± 90 nucleotídeos na extremidade 3’ e/ou na extremidade 5'. Em outras modalidades, a região alvo corresponde aos nucleotídeos 137.687 - 157.756 da SEQ ID NO: 1 ± 10, ± 20, ± 30, ± 40, ± 50, ± 60, ± 70, ± 80 ou ± 90 nucleotídeos na extremidade 3’ e/ou na extremidade 5'. Em certas modalidades, a região alvo corresponde aos nucleotídeos 159.291 - 266.074 da SEQ ID NO: 1 ± 10, ± 20, ± 30, ± 40, ± 50, ± 60, ± 70, ± 80, ou ± 90 nucleotídeos na extremidade 3’ e/ou na extremidade 5'. Em algumas modalidades, a região alvo corresponde aos nucleotídeos 272.888 - 310.849 da SEQ ID NO: 1 ± 10, ± 20, ± 30, ± 40, ± 50, ± 60, ± 70, ± 80, ou ± 90 nucleotídeos na extremidade 3’ e/ou na extremidade 5'.
[0107] Em algumas modalidades, o ASO da presente descrição hibridiza com várias regiões alvo dentro da transcrição de CAMK2D (por exemplo, pré-mRNA, SEQ ID NO: 1). Em algumas modalidades, o ASO hibridiza com duas regiões alvo diferentes dentro da transcrição de CAMK2D. Em algumas modalidades, o ASO hibridiza com três regiões alvo diferentes dentro da transcrição de CAMK2D. As sequências de ASOs exemplares que hibridizam com várias regiões alvo e os sítios iniciais/finais das diferentes regiões alvo são fornecidos na FIGURA 1B. Em algumas modalidades, os ASOs que hibridizam com várias regiões dentro da transcrição de CAMK2D (por exemplo, pré-mRNA, SEQ ID NO: 1) são mais potentes (por exemplo, com menor EC50) na redução da expressão de CAMK2D em comparação com os ASOs que hibridizam com uma única região dentro da transcrição de CAMK2D (por exemplo, pré-mRNA, SEQ ID NO: 1).
[0108] Em algumas modalidades, o ASO da descrição é capaz de hibridizar com o ácido nucleico alvo (por exemplo, transcrição de CAMK2D) sob condições fisiológicas, isto é, condições in vivo. Em algumas modalidades, o ASO da descrição é capaz de hibridizar com o ácido nucleico alvo (por exemplo, transcrição de CAMK2D) in vitro. Em algumas modalidades, o ASO da descrição é capaz de hibridizar com o ácido nucleico alvo (por exemplo, transcrição de CAMK2D) in vitro sob condições rigorosas. As condições rigorosas para a hibridização in vitro dependem, entre outras coisas, da captação produtiva de células, acessibilidade do RNA, temperatura, energia livre de associação, concentração de sal, e tempo (veja, por exemplo, Stanley T Crooke, Antisense Drug Technology: Principles, Strategies and Applications, 2ª Edição, CRC Press (2007)). Geralmente, são utilizadas condições de alto a moderado rigor para hibridização in vitro, para permitir a hibridização entre ácidos nucleicos substancialmente similares, porém não entre ácidos nucleicos diferentes. Um exemplo de condições rigorosas de hibridização inclui hibridização em tampão 5X de solução salina-citrato de sódio (SSC) (cloreto de sódio 0,75 M/citrato de sódio 0,075 M) por 1 hora a 40 °C, seguida de lavagem da amostra 10 vezes em 1X SSC a 40 °C e 5 vezes em tampão 1X SSC à temperatura ambiente. As condições de hibridização in vivo consistem em condições intracelulares (por exemplo, pH fisiológico e condições iônicas intracelulares) que direcionam a hibridização de oligonucleotídeos antisense com sequências alvo. As condições in vivo podem ser imitadas in vitro por condições rigorosas relativamente baixas. Por exemplo, a hibridização pode ser realizada in vitro em 2X SSC (cloreto de sódio 0,3 M/citrato de sódio 0,03 M), SDS 0,1 % a 37 °C. Uma solução de lavagem contendo 4X SSC, SDS 0,1 % pode ser usada a 37 °C, com uma lavagem final em 1X SSC a 45 °C.
[0109] Em algumas modalidades, o ASO da presente descrição é capaz de direcionar uma transcrição de CAMK2D de uma ou mais espécies (por exemplo, seres humanos, primatas não humanos, cães, gatos, porquinhos da índia, coelhos, ratos, camundongos, cavalos, gado e ursos). Em certas modalidades, o ASO descrito no presente documento é capaz de direcionar a transcrição de CAMK2D tanto em seres humanos quanto em roedores (por exemplo, camundongos ou ratos). Por conseguinte, em algumas modalidades, o ASO é capaz de regular negativamente (por exemplo, reduzir ou remover) a expressão do mRNA ou da proteína CAMK2D tanto em seres humanos quanto em roedores (por exemplo, camundongos ou ratos).
[0110] As sequências da transcrição de CAMK2D de camundongo são conhecidas na técnica. Por exemplo, a sequência do gene CAMK2D do camundongo pode ser encontrada sob o Número de Acesso ao GenBank publicamente disponível NC_000069.6. A sequência para a transcrição de pré-mRNA de CAMK2D de camundongo corresponde aos resíduos 126.596.354 - 126.846.326 de NC_000069.6. As sequências para a transcrição de mRNA de CAMK2D de camundongo (tanto canônicas quanto as variantes) são conhecidas e estão disponíveis nos Números de Acesso NM_001025438.2 (sequência canônica), NM_001025439.2, NM_001293663.1, NM_001293664.1, NM_023813.4, NM_001346635.1, NM_001346636.1, NM_001293665.1, XM_006500836.3, XM_006500833.3, XM_006500835.3, XM_017319415.1, XM_006500818.3, XM_017319417.1, XM_017319418.1, XM_017319420.1, NM_001293666.1, XM_006500819.3, XM_017319416.1, XM_006500820.3, XM_006500822.3, XM_006500823.3, XM_006500824.3, XM_017319419.1, XM_006500826.3, XM_006500825.3, XM_006500829.3, BC052894.1, XM_006500831.3, XM_006500832.3, XM_017319422.1, XM_006500834.3, XM_006500839.3, e XM_017319421.1. A sequência da proteína CAMK2D de camundongo pode ser encontrada nos Números de Acesso publicamente disponíveis: Q6PHZ2 (sequência canônica), Q3UF87, Q3UQH9, Q5DTK4, Q8CAC5 e Q9CZE2, cada um sendo incorporado no presente documento por referência em sua totalidade. São conhecidas três isoformas da proteína CAMK2D de camundongo. A sequência da Isoforma Delta 6 de CAMK2D difere da sequência canônica como a seguir: 478-478: K → N e 479-499: Ausente. A sequência da Isoforma Delta 10 de CAMK2D difere da canônica como a seguir: 329-329: E → EPQTTVIHNPDGNKE; 478-478: K → N; e 479- 499: Ausente. A sequência da Isoforma Delta 5 de CAMK2D difere da sequência canônica como a seguir: 328-328: K → KINNKANVVTSPKENIPTPALEPQTTVIHNPDGNK; 478-478: K → N e 479-499: Ausente.
[0111] As sequências da transcrição de CAMK2D de rato também são conhecidas na técnica. O gene CAMK2D do rato pode ser encontrado sob o Número de Acesso ao GenBank publicamente disponível NC_005101.4. A sequência para a transcrição de pré-mRNA de CAMK2D de rato corresponde aos resíduos 230.900.907 -
231.132.207 de NC_005101.4. As sequências para a transcrição de mRNA de CAMK2D de rato (tanto canônica quanto as variantes) são conhecidas e estão disponíveis como Número de Acesso NM_012519.2 (sequência canônica), BC107562.1, XM_017590621.1, XM_017590605.1, XM_008761452.1, XM_017590606.1, XM_017590607.1, XM_017590608.1, XM_017590610.1, XM_017590611.1, XM_017590612.1, XM_006233285.3, XM_017590614.1, XM_017590615.1, XM_017590616.1, XM_017590613.1, XM_017590617.1, XM_017590618.1, XM_017590604.1, XM_017590609.1, XM_017590624.1, XM_017590625.1, XM_017590619.1, XM_017590620.1, XM_017590622.1, e XM_017590623.1. A sequência da proteína CAMK2D de rato pode ser encontrada nos Números de Acesso publicamente disponíveis: P15791 (sequência canônica), P97915, P97916, Q3B7L0, Q63904, Q63905, Q63906, Q63907, e Q63908, cada um sendo incorporado no presente documento por referência em sua totalidade. São conhecidas seis isoformas da proteína CAMK2D de rato.
A sequência da Isoforma Delta 2 de CAMK2D difere da sequência canônica como a seguir: 329-362: Ausente. A sequência da Isoforma Delta 3 de CAMK2D difere da sequência canônica como a seguir: 329- 335: INNKANV → KRKSSSV; 337-359: Ausente; e 360-362: GNK → QMM. A sequência da Isoforma Delta 4 de CAMK2D difere da sequência canônica como a seguir: 349-362: Ausente. A sequência da Isoforma Delta 5 de CAMK2D difere da sequência canônica como a seguir: 329- 362: Ausente e 512-533: KPPCIPNGKENFSGGTSLWQNI → N. A sequência da Isoforma Delta 6 de CAMK2D difere da sequência canônica como a seguir: 512-533: KPPCIPNGKENFSGGTSLWQNI → N. A sequência da Isoforma Delta 7 de CAMK2D difere da sequência canônica como a seguir: 349-362: Ausente e 512-533: KPPCIPNGKENFSGGTSLWQNI → N. II.B. Sequências ASO
[0112] Os ASOs da descrição compreendem uma sequência de nucleotídeos contíguos que corresponde ao complemento de uma região da transcrição de CAMK2D, por exemplo, uma sequência de nucleotídeos correspondente à SEQ ID NO: 1.
[0113] Em certas modalidades, a descrição fornece um ASO de 10 a 30, tal como 10 a 15 nucleotídeos, 10 a 20 nucleotídeos ou 10 a 25 nucleotídeos de comprimento, em que a sequência de nucleotídeos contíguos tem pelo menos cerca de 80%, pelo menos cerca de 85%, pelo menos cerca de 90%, pelo menos cerca de 95%, pelo menos cerca de 96 %, pelo menos cerca de 97 %, pelo menos cerca de 98 %, pelo menos cerca de 99 %, ou cerca de 100% de identidade de sequência de uma região dentro do complemento de uma transcrição de CAMK2D, tal como SEQ ID NO: 1 ou sua variante ocorrendo naturalmente. Assim, por exemplo, o ASO hibridiza com uma molécula de ácido nucleico de fita simples tendo a sequência da SEQ ID NO: 1 ou uma sua porção.
[0114] O ASO pode compreender uma sequência de nucleotídeos contíguos que é totalmente complementar (perfeitamente complementar) à região equivalente de um ácido nucleico que codifica uma proteína CAMK2D de mamífero (por exemplo, SEQ ID NO: 1). O ASO pode compreender uma sequência de nucleotídeos contíguos que é totalmente complementar (perfeitamente complementar) a uma sequência de ácidos nucleicos, ou uma região dentro da sequência, correspondendo aos nucleotídeos X-Y da SEQ ID NO: 1, em que X e Y são o sítio inicial e o sítio final, respectivamente, como mostrado nas Figuras 1A e 1B.
[0115] Em algumas modalidades, a sequência nucleotídica dos ASOs da descrição ou a sequência de nucleotídeos contíguos tem pelo menos cerca de 80% de identidade de sequência com uma sequência selecionada da SEQ ID NOs: 4 a 1713 (isto é, as sequências nas Figuras 1A e 1B), tais como pelo menos cerca de 80%, pelo menos cerca de 85%, pelo menos cerca de 90%, pelo menos cerca de 91 %, pelo menos cerca de 92 %, pelo menos cerca de 93 %, pelo menos cerca de 94 %, pelo menos cerca de 95%, pelo menos cerca de 96 % de identidade de sequência, pelo menos cerca de 97 % de identidade de sequência, pelo menos cerca de 98% de identidade de sequência, pelo menos cerca de 99 % de identidade de sequência, tal como cerca de 100% de identidade de sequência (homóloga). Em algumas modalidades, o ASO tem um design descrito em outra parte no presente documento (por exemplo, Seção II.G) ou uma estrutura química mostrada em outra parte no presente documento, (por exemplo, as Figuras 1A e 1B).
[0116] Em algumas modalidades, o ASO (ou sua porção nucleotídica contígua) é selecionado de, ou compreende, uma das sequências selecionadas do grupo que consiste das SEQ ID NOs: 4 a 1713 ou uma região de pelo menos 10 seus nucleotídeos contíguos, em que o ASO (ou sua porção nucleotídica contígua) pode opcionalmente compreender uma, duas, três ou quatro incompatibilidades quando comparado com a correspondente transcrição de CAMK2D.
[0117] Em algumas modalidades, o ASO compreende uma sequência selecionada do grupo que consiste de SEQ ID NO: 254, SEQ ID NO: 27, SEQ ID NO: 114, SEQ ID NO: 158, SEQ ID NO: 190, SEQ ID NO: 327, SEQ ID NO: 463, SEQ ID NO: 513, SEQ ID NO: 516, SEQ ID NO: 519, SEQ ID NO: 657, SEQ ID NO: 659, SEQ ID NO: 827, SEQ ID NO: 1249, SEQ ID NO: 1326, SEQ ID NO: 1409, SEQ ID NO: 1524, SEQ ID NO: 1530, SEQ ID NO: 1662 e SEQ ID NO: 1676.
[0118] Em algumas modalidades, o ASO compreende uma sequência selecionada do grupo que consiste de SEQ ID NO: 55, SEQ ID NO: 61, SEQ ID NO: 63, SEQ ID NO: 71, SEQ ID NO: 75, SEQ ID NO: 79, SEQ ID NO: 84, SEQ ID NO: 85, SEQ ID NO: 92, SEQ ID NO: 102, SEQ ID NO: 105, SEQ ID NO: 128, SEQ ID NO: 130, SEQ ID NO: 133, SEQ ID NO: 138, SEQ ID NO: 161, SEQ ID NO: 178, SEQ ID NO: 180, SEQ ID NO: 186, SEQ ID NO: 195, SEQ ID NO: 200, SEQ ID NO: 202, SEQ ID NO: 234, SEQ ID NO: 264, SEQ ID NO: 387, SEQ ID NO: 390, SEQ ID NO: 396, SEQ ID NO: 441, SEQ ID NO: 446, SEQ ID NO: 457, SEQ ID NO: 467, SEQ ID NO: 523, SEQ ID NO: 524, SEQ ID NO: 636, SEQ ID NO: 640, SEQ ID NO: 700, SEQ ID NO: 740, SEQ ID NO: 832, SEQ ID NO: 965, SEQ ID NO: 1015, SEQ ID NO: 1065, SEQ ID NO: 1071, SEQ ID NO: 1155, SEQ ID NO: 1475, SEQ ID NO: 1508, SEQ ID NO: 1685, SEQ ID NO: 1686, SEQ ID NO: 1687, SEQ ID NO: 1688, e SEQ ID NO: 1690.
[0119] Em algumas modalidades, os ASOs da descrição ligam-se à sequência de ácidos nucleicos alvo (por exemplo, transcrição de CAMK2D) e são capazes de inibir ou reduzir a expressão da transcrição de CAMK2D em pelo menos 10% ou 20% em comparação com o nível de expressão normal na célula (isto é, controle), por exemplo, pelo menos cerca de 30%, pelo menos cerca de 40%, pelo menos cerca de
50%, pelo menos cerca de 60%, pelo menos cerca de 70%, pelo menos cerca de 80%, pelo menos cerca de 90%, pelo menos cerca de 95%, pelo menos cerca de 96 %, pelo menos cerca de 97 %, pelo menos cerca de 98 %, pelo menos cerca de 99 %, ou cerca de 100% em comparação com o nível de expressão normal (por exemplo, nível de expressão em células que não foram expostas ao ASO).
[0120] Em algumas modalidades, os ASOs da descrição são capazes de reduzir a expressão de mRNA de CAMK2D in vitro em pelo menos cerca de 20%, pelo menos cerca de 30%, pelo menos cerca de 40%, pelo menos cerca de 50%, pelo menos cerca de 60%, pelo menos cerca de 70%, pelo menos cerca de 80%, pelo menos cerca de 90%, pelo menos cerca de 95%, pelo menos cerca de 96 %, pelo menos cerca de 97 %, pelo menos cerca de 98 %, pelo menos cerca de 99 %, ou cerca de 100% em células HEK293 quando as células estão em contato com 25 µM do ASO em comparação com células HEK293 que não estão em contato com o ASO (por exemplo, contato com solução salina).
[0121] Em algumas modalidades, os ASOs da descrição são capazes de reduzir a expressão de mRNA de CAMK2D in vitro em pelo menos cerca de 20%, pelo menos cerca de 30%, pelo menos cerca de 40%, pelo menos cerca de 50%, pelo menos cerca de 60%, pelo menos cerca de 70%, pelo menos cerca de 80%, pelo menos cerca de 90%, pelo menos cerca de 95%, pelo menos cerca de 96 %, pelo menos cerca de 97 %, pelo menos cerca de 98 %, pelo menos cerca de 99 %, ou cerca de 100% em células de cardiomiócitos derivados de células- tronco pluripotentes induzíveis humanas (hiPSC-CM) quando as células estão em contato com 500 nM do ASO em comparação com células hiPSC-CM que não estão em contato com o ASO (por exemplo, contato com solução salina).
[0122] Em certas modalidades, o ASO da descrição tem pelo menos uma propriedade selecionada do grupo que consiste de: (i) reduzir um nível de mRNA que codifica CAMK2D em Cardiomiócitos Derivados de Células-Tronco Pluripotentes Induzíveis (hiPSC-CM); (ii) reduzir o nível de proteína de CAMK2D em hiPSC-CM; (iii) reduzir, melhorar ou tratar um ou mais sintomas de uma doença ou distúrbio cardiovascular, e (iv) quaisquer suas combinações.
[0123] Em algumas modalidades, o ASO pode tolerar 1, 2, 3 ou 4 (ou mais) incompatibilidades, ao hibridizar com a sequência alvo e ainda se ligar suficientemente ao alvo para mostrar o efeito desejado, isto é, regulação negativa de mRNA e/ou proteína alvo. As incompatibilidades podem, por exemplo, ser compensadas pelo aumento do comprimento da sequência de nucleotídeos de ASO e/ou um número aumentado de análogos de nucleotídeos, que estão descritos em outra parte no presente documento.
[0124] Em algumas modalidades, o ASO da descrição compreende não mais do que 3 incompatibilidades ao hibridizar com a sequência alvo. Em outras modalidades, a sequência de nucleotídeos contíguos compreende não mais do que 2 incompatibilidades ao hibridizar com a sequência alvo. Em outras modalidades, a sequência de nucleotídeos contíguos compreende não mais do que 1 incompatibilidade ao hibridizar com a sequência alvo. II.C. Comprimento do ASO
[0125] Os ASOs podem compreender uma sequência de nucleotídeos contíguos de um total de 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29 ou 30 nucleotídeos contíguos de comprimento. Deve ser entendido que, quando um intervalo é dado a um ASO, ou comprimento de sequência de nucleotídeos contíguos, o intervalo inclui os comprimentos inferior e superior fornecidos no intervalo, por exemplo de (ou entre) 10-30, inclui tanto 10 quanto 30.
[0126] Em algumas modalidades, os ASOs compreendem uma sequência de nucleotídeos contíguos de um total de cerca de 14-20, 14,
15, 16, 17, 18, 19 ou 20 nucleotídeos contíguos de comprimento. II.D. Nucleosídeos e Análogos de Nucleosídeos
[0127] Em um aspecto da descrição, os ASOs compreendem um ou mais análogos de nucleosídeos que ocorrem não naturalmente. “Análogos de nucleosídeos”, conforme utilizado no presente documento, são variantes de nucleosídeos naturais, tais como nucleosídeos DNA ou RNA, em virtude de modificações nas frações de açúcar e/ou base. Os análogos podem, em princípio, ser meramente “silenciosos” ou “equivalentes” aos nucleosídeos naturais no contexto do oligonucleotídeo, isto é, não ter efeito funcional na forma como o oligonucleotídeo funciona para inibir a expressão do gene alvo. Tais análogos “equivalentes” podem, no entanto, ser úteis se, por exemplo, forem mais fáceis ou mais baratos de fabricar, ou forem mais estáveis para armazenamento ou condições de fabricação, ou representarem uma identificação ou etiqueta. Em algumas modalidades, no entanto, os análogos terão um efeito funcional na maneira como o ASO atua para inibir a expressão; por exemplo, produzindo afinidade de ligação aumentada ao alvo, e/ou resistência aumentada a nucleases intracelulares, e/ou maior facilidade de transporte para a célula. Exemplos específicos de análogos de nucleosídeos são descritos, por exemplo, por Freier & Altmann; Nucl. Acid Res., 1997, 25, 4429-4443 e Uhlmann; Curr. Opinion in Drug Development, 2000, 3(2), 293-213, e no Esquema 1. Os ASOs da presente descrição podem conter mais de um, mais de dois, mais de três, mais de quatro, mais de cinco, mais de seis, mais de sete, mais de oito, mais de nove, mais de 10, mais de 11, mais de 12, mais de 13, mais de 14, mais de 15, mais de 16, mais de 18, mais de 19, ou mais de 20 análogos de nucleosídeos. Em algumas modalidades, os análogos de nucleosídeos nos ASOs são os mesmos. Em outras modalidades, os análogos de nucleosídeos nos ASOs são diferentes. Os análogos de nucleotídeos nos ASOs podem ser qualquer um ou uma combinação dos seguintes análogos de nucleosídeo. II.D.1. Nucleobase
[0128] O termo nucleobase inclui as porções de purina (por exemplo, adenina e guanina) e pirimidina (por exemplo, uracila, timina e citosina) presentes em nucleosídeos e nucleotídeos que formam ligações de hidrogênio na hibridização de ácido nucleico. No contexto da presente descrição, o termo nucleobase também abrange nucleobases modificadas que podem diferir de nucleobases que ocorrem naturalmente, mas são funcionais durante a hibridização de ácido nucleico. Em algumas modalidades, a porção da nucleobase é modificada pela modificação ou substituição da nucleobase. Neste contexto, “nucleobase” refere-se a ambas as nucleobases que ocorrem naturalmente, tais como adenina, guanina, citosina, timidina, uracila, xantina e hipoxantina, bem como variantes de ocorrência não natural. Tais variantes estão, por exemplo, descritas em Hirao et al., (2012) Accounts of Chemical Research vol 45, página 2055 e Bergstrom (2009) Current Protocols in Nucleic Acid Chemistry Suppl 37 1.4.1.
[0129] Em algumas modalidades, a porção de nucleobase é modificada pela mudança da purina ou pirimidina em uma purina ou pirimidina modificada, tal como purina substituída ou pirimidina substituída, tal como uma nucleobase selecionada de isocitosina, pseudoisocitosina, 5-metil-citosina, 5-tiozolo-citosina, 5-propinil- citosina, 5-propinil-uracila, 5-bromouracila, 5-tiazolo-uracila, 2-tio- uracila, 2'tio-timina, inosina, diaminopurina, 6-aminopurina, 2- aminopurina, 2,6-diaminopurina, e 2-cloro-6-aminopurina.
[0130] As frações de nucleobase podem ser indicadas pelo código de letra para cada nucleobase correspondente, por exemplo, A, T, G, C ou U, em que cada letra pode incluir, opcionalmente, nucleobases modificadas de função equivalente. Por exemplo, nos oligonucleotídeos exemplificados, as frações de nucleobase são selecionadas de A, T, G,
C e 5-metil-citosina. Opcionalmente, para gapmers de LNA, podem ser usados nucleosídeos LNA de 5-metil-citosina. II.D.2. Modificação de Açúcar
[0131] O ASO da descrição pode compreender um ou mais nucleosídeos que têm uma porção de açúcar modificada, isto é, uma modificação da porção de açúcar em comparação com a porção de açúcar ribose encontrada no DNA e RNA. Numerosos nucleosídeos com modificação da porção do açúcar ribose foram produzidos, principalmente com o objetivo de melhorar certas propriedades de oligonucleotídeos, tais como afinidade e/ou resistência à nuclease.
[0132] Tais modificações incluem aquelas em que a estrutura do anel de ribose é modificada, por exemplo, pela substituição por um anel hexose (HNA), ou um anel bicíclico, que normalmente tem uma ponte birradical entre os carbonos C2' e C4' no anel de ribose (LNA), ou um anel de ribose não ligado, que normalmente não possui uma ligação entre os carbonos C2’ e C3' (por exemplo, UNA). Outros nucleosídeos modificados com açúcar incluem, por exemplo, ácidos nucleicos biciclohexose (WO2011/017521) ou ácidos nucleicos tricíclicos (WO2013/154798). Os nucleosídeos modificados também incluem nucleosídeos em que a porção de açúcar é substituída por uma porção não de açúcar, por exemplo, no caso de ácidos nucleicos peptídicos (PNA), ou ácidos nucleicos morfolínicos.
[0133] As modificações de açúcar também incluem modificações feitas através da alteração dos grupos substituintes no anel de ribose para grupos diferentes de hidrogênio, ou o grupo 2'-OH naturalmente encontrado em nucleosídeos de RNA. Os substituintes podem, por exemplo, ser introduzidos nas posições 2', 3', 4 'ou 5'. Os nucleosídeos com frações de açúcar modificadas também incluem nucleosídeos modificados em 2', tais como nucleosídeos substituídos em 2'. De fato, muito foco foi usado no desenvolvimento de nucleosídeos substituídos em 2', e numerosos nucleosídeos substituídos em 2' foram constatados ter propriedades benéficas quando incorporados em oligonucleotídeos, tais como aumentadas resistência e afinidade a nucleosídeos. II.D.2.a Nucleosídeos modificados 2'
[0134] Um nucleosídeo modificado por açúcar 2’ é um nucleosídeo que tem um substituinte que não o H ou -OH na posição 2' (nucleosídeo substituído em 2’) ou que compreende um birradical ligado em 2', e inclui nucleosídeos substituídos em 2' e nucleosídeos LNA (em ponte birradical 2’ – 4’). Por exemplo, o açúcar modificado em 2' pode fornecer afinidade de ligação aumentada (por exemplo, nucleosídeo modificado por açúcar 2’ que aumenta a afinidade), e/ou resistência de nuclease aumentada para o oligonucleotídeo. Exemplos de nucleosídeos modificados substituídos em 2' são 2'-O-alquil-RNA, 2'-O-metil-RNA, 2'- alcóxi-RNA, 2'-O-metoxietil-RNA (MOE), 2'-amino-DNA, 2'-Fluoro-RNA, 2'-Fluro-DNA, ácidos nucleicos arabino (ANA), e 2'-Fluoro-ANA nucleosídeo. Para mais exemplos, por favor veja, por exemplo, Freier & Altmann; Nucl. Acid Res., 1997, 25, 4429-4443; Uhlmann, Curr. Opinion in Drug Development, 2000, 3 (2), 293-213; e Deleavey e Damha, Chemistry and Biology 2012, 19, 937. Abaixo estão ilustrações de alguns nucleosídeos modificados substituídos em 2’.
(2’-O-Alila/2’-O-Etilamina) II.D.2.b Nucleosídeos de Ácido Nucleico Bloqueado (LNA).
[0135] Os nucleosídeos LNA são nucleosídeos modificados por açúcar 2’ que compreendem um grupo ligante (referido como um birradical ou uma ponte) entre C2' e C4' do anel de açúcar ribose de um nucleosídeo (isto é, ponte 2'-4'), que restringe ou bloqueia a conformação do anel de ribose. Estes nucleosídeos também são chamados de ácido nucleico em ponte ou ácido nucleico bicíclico (BNA) na literatura. O bloqueio da conformação da ribose está associado a uma afinidade aumentada de hibridização (estabilização duplex) quando o LNA é incorporado em um oligonucleotídeo por uma molécula de RNA ou DNA complementar. Isto pode ser determinado usualmente medindo a temperatura de fusão do oligonucleotídeo/complemento duplex.
[0136] Nucleosídeos LNA exemplares não limitativos estão descritos nos WO 99/014226, WO 00/66604, WO 98/039352, WO 2004/046160, WO 00/047599, WO 2007/134181, WO 2010/077578, WO 2010/036698, WO 2007/090071, WO 2009/006478, WO 2011/156202, WO 2008/154401, WO 2009/067647, WO 2008/150729, Morita et al., Bioorganic & Med.Chem. Lett. 12, 73-76, Seth et al., J. Org. Chem. 2010, Vol 75(5) pp. 1569-81, e Mitsuoka et al., Nucleic Acids Research 2009, 37(4), 1225-1238.
[0137] A ponte 2'-4 'compreende 1 a 4 átomos em ponte e é, em particular, de fórmula -X-Y- em que
[0138] X é oxigênio, enxofre, -CRaRb-, -C(Ra)=C(Rb), -C(=CRaRb)-, - C(Ra)=N, -Si(Ra)2-, -SO2-, -NRa-; -O-NRa-, -NRa-O-, >C=J, Se; –cPr-, - O-NRa-, NRa-CRaRb-, -N(Ra)-O-, ou -O-CRaRb-;
[0139] Y é oxigênio, enxofre, -(CRaRb)n -, -CRaRb-O-CRaRb-, - C(Ra)=C(Rb), -C(Ra)=N, -Si(Ra)2-, -SO2-, -NRa-, ou >C=J Se; –cPr-, -O- NRa-,-O-CRaRb-, ou NRa-CRaRb- ; em que n é 1 ou 2;
[0140] com a condição de que -X-Y- não seja -O-O-, Si(Ra)2-Si(Ra)2-, - SO2-SO2-, -C(Ra)=C(Rb)-C(Ra)=C(Rb), -C(Ra)=N-C(Ra)=N-, -C(Ra)=N- C(Ra)=C(Rb), -C(Ra)=C(Rb)-C(Ra)=N-, ou -Se-Se-;
[0141] J é oxigênio, enxofre, CH2, ou =N(Ra);
[0142] Ra é Rb são independentemente selecionados de hidrogênio, halogênio, hidroxila, ciano, tio-hidroxila, alquila opcionalmente substituída, alquenila opcionalmente substituída, alquinila opcionalmente substituída, alcóxi opcionalmente substituído, alcoxialquila, alquenilóxi, carboxila, alcoxicarbonila, alquilcarbonila, formila, arila, heterociclo, amino, alquilamino, carbamoila, alquilaminocarbonila, aminoalquilaminocarbonila, alquilaminoalquilaminocarbonila, alquilcarbonilamino, carbamido, alcanoilóxi, alquilsulfonilóxi sulfona, nitro, azido, tiolsulfetoalquilsulfanila, ariloxicarbonila, arilóxi, arilcarbonila, heteroarila, heteroariloxicarbonila, heteroarilóxi, heteroarilcarbonila, -OC(=Xa)Rc, -OC(=Xa)NRcRd e - NReC(=Xa)NRcRd; ou dois Ra e Rb geminais juntos formam metileno opcionalmente substituído; em que alquila substituída, alquenila substituída, alquinila substituída, alcóxi substituído e metileno substituído são alquila, alquenila, alquinila e metileno substituídos por 1 a 3 substituintes independentemente selecionados de halogênio, hidroxila, alquila, alquenila, alquinila, alcóxi, alcoxialquila, alquenilóxi, carboxila, alcoxicarbonila, alquilcarbonila, formila, heterociclo, arila e heteroarila;
[0143] Xa é oxigênio, enxofre ou -NRc;
[0144] Rc, Rd e Re são, independentemente, hidrogênio ou alquila; e
[0145] n é 1, 2 ou 3.
[0146] Em algumas modalidades, X é oxigênio, enxofre, -NRa-, - CRaRb- ou -C(=CRaRb)-, particularmente oxigênio, enxofre, -NH-, -CH2- ou -C(=CH2)-, mais particularmente, oxigênio.
[0147] Em algumas modalidades, Y é -CRaRb-, -CRaRb-CRaRb- ou - CRaRb-CRaRb-CRaRb-, particularmente -CH2-CHCH3-, -CHCH3-CH2-, CH2-CH2- ou -CH2-CH2-CH2-.
[0148] Em algumas modalidades, -X-Y- é -O-(CRaRb)n-, -S-CRaRb-, -N(Ra)CRaRb-, -CRaRb-CRaRb-, -O-CRaRb-O-CRaRb-, -CRaRb-O-CRaRb-, -C(=CRaRb)-CRaRb-, -N(Ra)CRaRb-, -O-N(Ra)CRaRb-, ou -N(Ra)-O- CRaRb-.
[0149] Em algumas modalidades, Ra e Rb são independentemente selecionados do grupo que consiste de hidrogênio, halogênio, hidroxila, alquila e alcoxialquila, em particular, hidrogênio, alquila e alcoxialquila.
[0150] Em algumas modalidades, Ra e Rb são independentemente selecionados do grupo que consiste de hidrogênio, halogênio, tal como flúor, hidroxila, metila e -CH2-O-CH3, em particular, hidrogênio, metila e -CH2-O-CH3.
[0151] Em algumas modalidades, Ra é hidrogênio ou alquila, em particular, hidrogênio ou metila.
[0152] Em algumas modalidades, Rb é hidrogênio ou alquila, em particular hidrogênio ou metila. Em algumas modalidades, um ou ambos Ra e Rb são hidrogênio. Em certas modalidades, apenas um de Ra e Rb é hidrogênio. Em algumas modalidades, um de Ra e Rb é metila e o outro é hidrogênio. Em outras modalidades, Ra e Rb são ambos metila ao mesmo tempo.
[0153] Em uma modalidade particular da invenção, -X-Y- é -O-CH2-, - S-CH2-, -S-CH(CH3)-, -NH-CH2-, -O-CH2CH2-, -O-CH(CH2-O-CH3)-, -O- CH(CH2CH3)-, -O-CH(CH3)-, -O-CH2-O-CH2-, -O-CH2-O-CH2-, -CH2-O- CH2-, -C(=CH2)CH2-, -C(=CH2)CH(CH3)-, -N(-O-CH3)- ou -N(CH3)-;
[0154] Em algumas modalidades, -X-Y- é -O-CRaRb- em que Ra e Rb são independentemente selecionados do grupo que consiste de hidrogênio, alquila e alcoxialquila, em particular, hidrogênio, metila e - CH2-O-CH3.
[0155] Em algumas modalidades, -X-Y- é -O-CH2- ou -O-CH(CH3), particularmente -O-CH2-.
[0156] A ponte 2'- 4 'pode ser posicionada abaixo do plano do anel de ribose (configuração beta-D-), ou acima do plano do anel (configuração alfa-L-), conforme ilustrado na fórmula (A) e fórmula (B), respectivamente.
[0157] Em algumas modalidades, o nucleosídeo modificado ou os nucleosídeos LNA do ASO da descrição tem uma estrutura geral da fórmula II ou III: Fórmula II Fórmula III
[0158] em que
[0159] W é selecionado de -O-, -S-, -N(Ra)-, -C(RaRb)-, em particular -O-;
[0160] B é uma nucleobase ou uma porção de nucleobase modificada;
[0161] Z é uma ligação internucleosídica a um nucleosídeo adjacente ou um grupo terminal 5’;
[0162] Z* é uma ligação internucleosídica a um nucleosídeo adjacente ou um grupo terminal 3';
[0163] R1, R2, R3, R5 e R5* são independentemente selecionados de hidrogênio, halogênio, alquila, alquenila, alquinila, hidróxi, alcóxi, alcoxialquila, alquenilóxi, carboxila, alcoxicarbonila, alquilcarbonila, formila, azida, heterociclo e arila;
[0164] Em algumas modalidades, –X-Y-, Ra é hidrogênio ou alquila, em particular hidrogênio ou metila. Em algumas modalidades de –X-Y-, Rb é hidrogênio ou alquila, em particular hidrogênio ou metila. Em outras modalidades de –X-Y-, um ou ambos de Ra e Rb são hidrogênio. Em outras modalidades de –X-Y-, apenas um de Ra e Rb é hidrogênio. Em algumas modalidades de –X-Y-, um de Ra e Rb é metila e o outro é hidrogênio. Em certas modalidades de –X-Y-, Ra e Rb são ambos metila ao mesmo tempo.
[0165] Em algumas modalidades, –X-, Ra é hidrogênio ou alquila, em particular hidrogênio ou metila. Em algumas modalidades de –X-, R b é hidrogênio ou alquila, em particular hidrogênio ou metila. Em outras modalidades de –X-, um ou ambos Ra e Rb são hidrogênio. Em certas modalidades de –X-, apenas um de Ra e Rb é hidrogênio. Em certas modalidades de –X-, um de Ra e Rb é metila e o outro é hidrogênio. Em outras modalidades de –X-, Ra e Rb são ambos metila ao mesmo tempo.
[0166] Em algumas modalidades, –Y-, Ra é hidrogênio ou alquila, em particular hidrogênio ou metila. Em certas modalidades de –Y-, Rb é hidrogênio ou alquila, em particular hidrogênio ou metila. Em outras modalidades de –Y-, um ou ambos de Ra e Rb são hidrogênio. Em algumas modalidades de –Y-, apenas um de Ra e Rb é hidrogênio. Em outras modalidades de –Y-, um de Ra e Rb é metila e o outro é hidrogênio. Em algumas modalidades de –Y-, Ra e Rb são ambos metila ao mesmo tempo.
[0167] Em algumas modalidades, R1, R2, R3, R5 e R5*são independentemente selecionados de hidrogênio e alquila, em particular hidrogênio e metila.
[0168] Em algumas modalidades, R1, R2, R3, R5 e R5*são todos hidrogênios ao mesmo tempo.
[0169] Em algumas modalidades, R1, R2, R3 são todos hidrogênios ao mesmo tempo, um de R5 e R5* é hidrogênio e o outro é conforme definido acima, em particular alquila, mais particularmente metila.
[0170] Em algumas modalidades, R1, R2, R3 são todos hidrogênios ao mesmo tempo, um de R5 e R5* é hidrogênio e o outro é azida.
[0171] Em algumas modalidades, -X-Y- é -O-CH2-, W é oxigênio e R1, R2, R3, R5 e R5* são todos hidrogênio ao mesmo tempo. Tais nucleosídeos LNA estão descritos nos WO 99/014226, WO 00/66604, WO 98/039352 e WO 2004/046160, sendo todos incorporados no presente documento por referência, e incluem o que é comumente conhecido na técnica como nucleosídeos beta-D-óxi LNA e alfa-L-óxi LNA.
[0172] Em algumas modalidades, -X-Y- é -S-CH2-, W é oxigênio e R1, R2, R3, R5 e R5* são todos hidrogênio ao mesmo tempo. Tais nucleosídeos tio LNA estão descritos nos WO 99/014226 e WO 2004/046160, que são incorporados no presente documento por referência.
[0173] Em algumas modalidades, -X-Y- é -NH-CH2-, W é oxigênio e R1, R2, R3, R5 e R5* são todos hidrogênio ao mesmo tempo. Tais nucleosídeos amino LNA estão descritos nos WO 99/014226 e WO 2004/046160, que são incorporados no presente documento por referência.
[0174] Em algumas modalidades, -X-Y- é -O-CH2CH2- ou - OCH2CH2CH2-, W é oxigênio e R1, R2, R3, R5 e R5* são todos hidrogênio ao mesmo tempo. Tais nucleosídeos LNA estão descritos no WO 00/047599 e Morita et al., Bioorganic & Med.Chem. Lett. 12, 73-76, que são incorporados no presente documento por referência, e incluem o que é comumente conhecido na técnica como ácidos nucleicos em ponte 2'-O,4'-C-etileno (ENA).
[0175] Em algumas modalidades, -X-Y- é -O-CH2-, W é oxigênio, R1, R2, R3 são todos hidrogênio ao mesmo tempo, um de R5 e R5* é hidrogênio e o outro não é hidrogênio, tal como alquila, por exemplo metila. Tais nucleosídeos LNA substituídos em 5’ estão descritos no WO 2007/134181, que é incorporado no presente documento por referência.
[0176] Em algumas modalidades, -X-Y- é -O-CRaRb-, em que um ou ambos de Ra e Rb não são hidrogênio, em particular alquila, tal como metila, W é oxigênio, R1, R2, R3 são todos hidrogênio ao mesmo tempo,
um de R5 e R5* é hidrogênio e o outro não é hidrogênio, em particular alquila, por exemplo metila. Tais nucleosídeos LNA bis modificados estão descritos no WO 2010/077578, que é incorporado no presente documento por referência.
[0177] Em algumas modalidades, -X-Y- é -O-CH(CH2-O-CH3)- (“ácido nucleico 2' O-metoxietil bicíclico”, Seth et al., J. Org. Chem. 2010, Vol 75(5) pp. 1569-81).
[0178] Em algumas modalidades, -X-Y- é -O-CHRa-, W é oxigênio e R1, R2, R3, R5 e R5* são todos hidrogênio ao mesmo tempo. Tais nucleosídeos LNA substituídos em 6' estão descritos no WO 2010/036698 e WO 2007/090071, sendo ambos incorporados no presente documento por referência. Em tais nucleosídeos LNA substituídos em 6', Ra é, em particular, alquila C1-C6, tal como metila.
[0179] Em algumas modalidades, -X-Y- é -O-CH(CH2-O-CH3)-, W é oxigênio e R1, R2, R3, R5 e R5* são todos hidrogênio ao mesmo tempo. Tais nucleosídeos LNA também são conhecidos na técnica como MOEs cíclicos (cMOE) e estão descritos no WO 2007/090071.
[0180] Em algumas modalidades, -X-Y- é -O-CH(CH3)-.
[0181] Em algumas modalidades, -X-Y- é -O-CH2-O-CH2- (Seth et al., J. Org. Chem 2010 op. Cit.)
[0182] Em algumas modalidades, -X-Y- é -O-CH(CH3)-, W é oxigênio e R1, R2, R3, R5 e R5* são todos hidrogênio ao mesmo tempo. Tais nucleosídeos 6'-metil LNA também são conhecidos na técnica como nucleosídeos cET e podem ser diastereoisômeros (S)-cET ou (R)- cET, conforme descrito nos WO 2007/090071 (beta-D) e WO 2010/036698 (alfa-L), que são incorporados no presente documento por referência.
[0183] Em algumas modalidades, -X-Y- é -O-CRaRb-, em que nem Ra nem Rb é hidrogênio, W é oxigênio e R1, R2, R3, R5 e R5* são todos hidrogênio ao mesmo tempo. Em certas modalidades, Ra e Rb são ambos alquila ao mesmo tempo, em particular, ambos metila ao mesmo tempo. Tais nucleosídeos LNA dissubstituídos em 6’ estão descritos no WO 2009/006478, que é incorporado no presente documento por referência.
[0184] Em algumas modalidades, -X-Y- é -S-CHRa-, W é oxigênio e R1, R2, R3, R5 e R5*são todos hidrogênio ao mesmo tempo. Tais nucleosídeos tio LNA substituídos em 6' estão descritos no WO 2011/156202, que é incorporado no presente documento por referência. Em certas modalidades de tal LNA tio substituído em 6', Ra é alquila, em particular, metila.
[0185] Em algumas modalidades, -X-Y- é -C(=CH2)C(RaRb)-, tal como W é oxigênio, e R1, R2, R3, R5 e R5*são todos hidrogênio ao mesmo tempo. Tais nucleosídeos vinil carbo LNA estão descritos nos WO 2008/154401 e WO 2009/067647, que são incorporados por meio deste por referência.
[0186] Em algumas modalidades, -X-Y- é -N(ORa)-CH2-, W é oxigênio e R1, R2, R3, R5 e R5*são todos hidrogênio ao mesmo tempo. Em algumas modalidades, Ra é alquila, tal como metila. Tais nucleosídeos LNA são também conhecidos como LNAs N substituídos e estão descritos no WO 2008/150729, que é incorporado no presente documento por referência.
[0187] Em algumas modalidades, -X-Y- é -O-NCH3- (Seth et al., J. Org. Chem 2010 op. cit.).
[0188] Em algumas modalidades, -X-Y- é ON(Ra)- –N(Ra)-O-, -NRa- CRaRb-CRaRb-, ou –NRa-CRaRb-, W é oxigênio e R1, R2, R3, R5 e R5* são todos hidrogênio ao mesmo tempo. Em certas modalidades, Ra é alquila, tal como metila. (Seth et al., J. Org. Chem 2010 op. cit.).
[0189] Em algumas modalidades, R5 e R5* são ambos hidrogênios ao mesmo tempo. Em outras modalidades, um de R5 e R5*é hidrogênio e o outro é alquila, tal como metila. Em tais modalidades, R1, R2 e R3 podem ser, em particular, hidrogênio, e -X-Y- pode ser, em particular, - O-CH2- ou -O-CHC(Ra)3-, tal como -O-CH(CH3)-.
[0190] Em algumas modalidades, -XY- é -CRaRb-O-CRaRb-, tal como -CH2-O-CH2-, W é oxigênio e R1, R2, R3, R5 e R5* são todos hidrogênio ao mesmo tempo. Em tais modalidades, Ra pode ser, em particular, alquila, tal como metila. Tais nucleosídeos LNA também são conhecidos como nucleotídeos conformacionalmente restritos (CRNs) e estão descritos no WO 2013/036868, que é incorporado no presente documento por referência.
[0191] Em algumas modalidades, -XY- é -O-CRaRb-O-CRaRb-, tal como -O-CH2-O-CH2-, W é oxigênio e R1, R2, R3, R5 e R5* são todos hidrogênio ao mesmo tempo. Em certas modalidades, Ra pode ser, em particular, alquila, tal como metila. Tais nucleosídeos LNA também são conhecidos como nucleotídeos COC e estão descritos em Mitsuoka et al., Nucleic Acids Research 2009, 37(4), 1225-1238, que é incorporado no presente documento por referência.
[0192] Será reconhecido que, a menos que especificado, os nucleosídeos LNA podem estar na estereoisoforma beta-D ou alfa-L.
[0193] Certos exemplos de nucleosídeos LNA são apresentados no Esquema 1.
(β-D-óxi LNA, β-tio LNA, α-L-óxi LNA, LNA substituído por β-D-amino, 6’metil β-D-óxi LNA, 6’dimetil β-D-óxi LNA, 5’metil β-D-óxi LNA, 5’ metil,6’dimetil β-D-óxi LNA, Carbocíclico(vinil)β-D-LNA, Carbocíclico(vinil)α-L-LNA, 6’metil tio β-D LNA, β-D amino LNA substituído)
[0194] Como ilustrado em outra parte, em algumas modalidades da descrição os nucleosídeos LNA nos oligonucleotídeos são nucleosídeos beta-D-óxi-LNA. II.E. Degradação mediada por nuclease
[0195] A degradação mediada por nuclease refere-se a um oligonucleotídeo capaz de mediar a degradação de uma sequência de nucleotídeos complementar ao formar um duplex com tal sequência.
[0196] Em algumas modalidades, o oligonucleotídeo pode funcionar via degradação mediada por nuclease do ácido nucleico alvo, onde os oligonucleotídeos da descrição são capazes de recrutar uma nuclease, particularmente, e endonuclease, de preferência endoribonuclease (RNase), tal como RNase H. Exemplos de designs de oligonucleotídeos que operam via mecanismos mediados por nuclease são oligonucleotídeos que tipicamente compreendem uma região de pelo menos 5 ou 6 nucleosídeos de DNA e são flanqueados em um lado ou em ambos os lados por nucleosídeos que aumentam a afinidade, por exemplo, gapmers, headmers e tailmers. II.F. Atividade e Recrutamento de RNaseH
[0197] A atividade de RNase H de um oligonucleotídeo antisense refere-se a sua capacidade de recrutar RNase H quando em um duplex com uma molécula de RNA complementar e induzir a degradação da molécula de RNA complementar. WO01/23613 fornece métodos in vitro para determinar a atividade de RNaseH, que podem ser usados para determinar a capacidade de recrutar RNaseH. Normalmente, um oligonucleotídeo é considerado capaz de recrutar RNaseH se, quando fornecido com uma sequência de ácidos nucleicos alvo complementar, ele apresentar uma taxa inicial, medida em pmol/l/min, de pelo menos 5%, tal como pelo menos 10%, ou mais do que 20% da taxa inicial determinada ao usar um oligonucleotídeo tendo a mesma sequência de bases que o oligonucleotídeo modificado sendo testado, mas contendo apenas monômeros de DNA, com ligações de fosforotioato entre todos os monômeros no oligonucleotídeo e usando a metodologia fornecida pelos Exemplos 91-95 do WO01/23613.
[0198] Em algumas modalidades, um oligonucleotídeo é considerado essencialmente incapaz de recrutar RNaseH se, quando fornecido com o ácido nucleico alvo complementar, a taxa inicial de
RNaseH, medida em pmol/l/min, for inferior a 20%, tal como inferior a 10%, tal como inferior a 5% da taxa inicial determinada ao usar um oligonucleotídeo tendo a mesma sequência de bases que o oligonucleotídeo sendo testado, mas contendo apenas monômeros de DNA, sem substituições em 2', com ligações de fosforotioato entre todos os monômeros no oligonucleotídeo e usando a metodologia fornecida pelos Exemplos 91 - 95 do WO01/23613. II.G. Design ASO
[0199] O ASO da descrição pode compreender uma sequência de nucleotídeos que compreende tanto nucleosídeos quanto análogos de nucleosídeos, e pode estar na forma de um gapmer, blockmer, mixmer, headmer, tailmer ou totalmer. Exemplos de configurações de um gapmer, blockmer, mixmer, headmer, tailmer ou totalmer que podem ser usadas com o ASO da descrição são descritos na Publ. do Pedido de Patente U.S. No. 2012/0322851.
[0200] O termo “gapmer”, tal como utilizado no presente documento, refere-se a um oligonucleotídeo antisense que compreende uma região de oligonucleotídeos de recrutamento de RNase H (intervalo), que é flanqueado em 5' e 3' por um ou mais nucleosídeos modificados que aumentam a afinidade (flancos). Os termos “headmers” e “tailmers” são oligonucleotídeos capazes de recrutar RNase H onde um dos flancos está ausente, isto é, apenas uma das extremidades do oligonucleotídeo compreende nucleosídeos modificados que aumentam a afinidade. Para headmers, o flanco 3' está ausente (isto é, o flanco 5' compreende nucleosídeos modificados que aumentam a afinidade), e para os tailmers o flanco 5’ está ausente (isto é, o flanco 3' compreende nucleosídeos modificados que aumentam a afinidade). O termo “gapmer LNA” é um oligonucleotídeo gapmer em que pelo menos um dos nucleosídeos modificados que aumentam a afinidade é um nucleosídeo LNA. O termo “gapmer de flanco misto” refere-se a um gapmer LNA em que as regiões de flanco compreendem pelo menos um nucleosídeo LNA e pelo menos um nucleosídeo DNA ou nucleosídeo não modificado por LNA, tal como pelo menos um nucleosídeo modificado substituído em 2’, tal como, por exemplo, 2'-O-alquil-RNA, 2'-O-metil-RNA, 2'- alcóxi-RNA, 2'-O-metoxietil-RNA (MOE), 2'-amino-DNA, 2'-Fluoro-RNA, 2'-Fluro-DNA, ácido nucleico arabino (ANA), e nucleosídeo(s) 2'-Fluoro- ANA.
[0201] Outros ASOs “quiméricos”, chamados de “mixmers”, consistem de uma composição alternativa de (i) monômeros de DNA ou monômeros análogos de nucleosídeo reconhecíveis e cliváveis por RNase, e (ii) monômeros análogos de nucleosídeo que não recrutam RNase.
[0202] Um “totalmer” é um ASO de fita simples que compreende apenas nucleotídeos que ocorrem naturalmente ou análogos de nucleotídeos.
[0203] Em algumas modalidades, além de aumentar a afinidade do ASO à região alvo, alguns análogos de nucleosídeos também medeiam a ligação e clivagem de RNase (por exemplo, RNaseH). Uma vez que os monômeros α-L-LNA recrutam a atividade de RNaseH até certo ponto, em algumas modalidades, as regiões de intervalo (por exemplo, região B, como referido no presente documento) de ASOs contendo monômeros α-L-LNA consistem em menos monômeros reconhecíveis e cliváveis pelo RNaseH e é introduzida mais flexibilidade na construção de mixmer. II.G.1. Design de Gapmer
[0204] Em algumas modalidades, o ASO da descrição é um gapmer e compreende um intervalo contíguo de nucleotídeos (por exemplo, um ou mais DNA) que é capaz de recrutar um RNase, tal como RNaseH, no presente documento referido como região B (B), em que a região B é flanqueada tanto em 5' quanto em 3' por regiões de análogos de nucleosídeo 5' e 3' para o intervalo contíguo de nucleotídeos da região B - essas regiões são referidas como regiões A (A) e C (C), respectivamente. Em algumas modalidades, os análogos de nucleosídeos são nucleosídeos modificados por açúcar (por exemplo, nucleosídeos modificados por açúcar de alta afinidade). Em certas modalidades, os nucleosídeos modificados por açúcar das regiões A e C aumentam a afinidade do ASO com o ácido nucleico alvo (isto é, nucleosídeos modificados por açúcar 2’ que aumentam a afinidade). Em algumas modalidades, os nucleosídeos modificados por açúcar são nucleosídeos modificados por açúcar 2’, tais como modificações de açúcar 2’ de alta afinidade, tal como LNA ou 2'-MOE.
[0205] Em um gapmer, a maioria dos nucleosídeos 5’ e 3' da região B são nucleosídeos de DNA e estão posicionados adjacentes a análogos de nucleosídeos (por exemplo, nucleosídeos modificados por açúcar de alta afinidade) das regiões A e C, respectivamente. Em algumas modalidades, as regiões A e C podem ser ainda definidas por terem análogos de nucleosídeos na extremidade mais distante da região B (isto é, na extremidade 5’ da região A e na extremidade 3' da região C).
[0206] Em algumas modalidades, os ASOs da presente descrição compreendem uma sequência de nucleotídeos de fórmula (5’ a 3') A-B- C, em que: (A) (região 5’ ou uma primeira sequência de flancos) compreende pelo menos um análogo de nucleosídeo ( por exemplo, 3- 5 unidades LNA); (B) compreende pelo menos quatro nucleosídeos consecutivos (por exemplo, 4-24 unidades de DNA), que são capazes de recrutar RNase (quando formados em um duplex com uma molécula de RNA complementar, tal como o pré-mRNA ou mRNA alvo); e (C) (região 3’ ou uma segunda sequência de flancos) compreende pelo menos um análogo de nucleosídeo (por exemplo, 3-5 unidades LNA).
[0207] Em algumas modalidades, a região A compreende 3-5 análogos de nucleotídeos, tais como LNA, a região B consiste de 6-24 (por exemplo, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13 ou 14) unidades de DNA, e a região C consiste de 3 ou 4 análogos de nucleotídeos, tais como o LNA. Tais designs incluem (A-B-C) 3-14-3, 3-11-3, 3-12-3, 3-13-3, 4-9-4, 4- 10-4, 4-11-4, 4-12-4 e 5-10-5. Em algumas modalidades, o ASO tem um design de LLLDnLLL, LLLLDnLLLL ou LLLLLDnLLLLL, em que L é um análogo de nucleosídeo, D é DNA e n pode ser qualquer número inteiro entre 4 e 24. Em algumas modalidades, n pode ser qualquer número inteiro entre 6 e 14. Em algumas modalidades, n pode ser qualquer número inteiro entre 8 e 12.
[0208] Outros designers de gapmer são descritos nos WO2004/046160, WO 2007/146511 e WO2008/113832, cada um sendo incorporado no presente documento por referência em sua totalidade. II.H. Ligações Internucleotídicas
[0209] Os monômeros dos ASOs descritos no presente documento são acoplados entre si por meio de grupos de ligação. Adequadamente, cada monômero está ligado ao monômero adjacente 3’ por meio de um grupo de ligação.
[0210] A pessoa versada na técnica entenderia que, no contexto da presente descrição, o monômero 5’ no final de um ASO não compreende um grupo de ligação 5', embora possa ou não compreender um grupo terminal 5’.
[0211] Os termos “grupo de ligação” ou “ligação internucleosídica” destinam-se a significar um grupo capaz de acoplar covalentemente dois nucleosídeos entre si. Os exemplos específicos e preferidos incluem grupos fosfato e grupos fosforotioato.
[0212] Os nucleosídeos do ASO da descrição, ou sua sequência nucleosídica contígua, são acoplados entre si por meio de grupos de ligação. Adequadamente, cada nucleosídeo está ligado ao nucleosídeo adjacente 3’ por meio de um grupo de ligação.
[0213] Em algumas modalidades, a ligação internucleosídica é modificada de seu fosfodiéster normal para um que seja mais resistente ao ataque de nuclease, tal como o fosforotioato, que é clivável por RNaseH, também permite que a via de inibição antisense reduza a expressão do gene alvo. Em algumas modalidades, pelo menos 75%, pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 91%, pelo menos 92%, pelo menos 93%, pelo menos 94%, pelo menos 95%, em pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98%, pelo menos 99% ou 100% das ligações internucleosídicas são modificadas. II.I. Conjugados
[0214] O termo conjugado, tal como utilizado no presente documento, refere-se a um ASO que está covalentemente ligado a uma porção não nucleotídica (porção conjugada ou região C ou terceira região).
[0215] A conjugação do ASO da descrição a uma ou mais porções não nucleotídicas pode melhorar a farmacologia do ASO, por exemplo, afetando a atividade, distribuição celular, absorção celular ou estabilidade do ASO. Em algumas modalidades, as porções não nucleotídicas modificam ou aumentam as propriedades farmacocinéticas do ASO, melhorando a distribuição celular, biodisponibilidade, metabolismo, excreção, permeabilidade e/ou absorção celular do ASO. Em certas modalidades, as porções não nucleotídicas podem direcionar o ASO para um órgão, tecido ou tipo de célula específico e, assim, aumentar a eficácia do ASO nesse órgão, tecido ou tipo de célula. Em outras modalidades, as porções não nucleotídicas reduzem a atividade do ASO em tipos de células, tecidos ou órgãos não alvo, por exemplo, atividade fora do alvo ou atividade em tipos de células, tecidos ou órgãos não alvo. Os WO 93/07883 e WO2013/033230 proporcionam porções conjugadas adequadas. Outras porções conjugadas adequadas são aquelas capazes de se ligar ao receptor de asialoglicoproteína (ASGPr). Em particular, porções conjugadas de N-acetilgalactosamina trivalente são adequadas para ligação ao ASGPr, veja, por exemplo, WO 2014/076196, WO 2014/207232 e WO 2014/179620, cada um sendo incorporado por meio deste por referência.
[0216] Em algumas modalidades, a porção não nucleotídica (porção conjugada) é selecionada a partir do grupo que consiste de carboidratos, ligantes de receptores de superfície celular, substâncias medicamentosas, hormônios, substâncias lipofílicas, polímeros, proteínas, peptídeos, toxinas (por exemplo, toxinas bacterianas ), vitaminas, proteínas virais (por exemplo, capsídeos) e suas combinações. II.J. ASOs ativados
[0217] O termo “ASO ativado”, tal como utilizado no presente documento, refere-se a um ASO que está covalentemente ligado (isto é, funcionalizado) a pelo menos um componente funcional que permite a ligação covalente do ASO a uma ou mais porções conjugadas, isto é, porções que não são os próprios ácidos nucleicos ou monômeros, para formar os conjugados no presente documento descritos. Normalmente, um componente funcional compreenderá um grupo químico que é capaz de se ligar covalentemente ao ASO, por meio de, por exemplo, um grupo 3'-hidroxila ou o grupo NH2 exocíclico da base adenina, um espaçador que pode ser hidrofílico e um grupo terminal que é capaz de se ligar a uma porção conjugada (por exemplo, um grupo amino, sulfidrila ou hidroxila). Em algumas modalidades, este grupo terminal não está protegido, por exemplo, é um grupo NH2. Em outras modalidades, o grupo terminal é protegido, por exemplo, por qualquer grupo de proteção adequado, tal como aqueles descritos em “Protective Groups in Organic Synthesis” por Theodora W Greene e Peter GM Wuts, 3ª edição (John Wiley & Sons, 1999), que é incorporado por meio deste por referência.
[0218] Em algumas modalidades, os ASOs da descrição são funcionalizados na extremidade 5’, a fim de permitir uma ligação covalente da porção conjugada à extremidade 5' do ASO. Em outras modalidades, os ASOs da descrição podem ser funcionalizados na extremidade 3’. Em ainda outras modalidades, os ASOs da descrição podem ser funcionalizados ao longo da cadeia principal ou na porção de base heterocíclica. Em ainda outras modalidades, ASOs da descrição podem ser funcionalizados em mais de uma posição independentemente selecionada a partir da extremidade 5’, da extremidade 3', da cadeia principal e da base.
[0219] Em algumas modalidades, os ASOs ativados da descrição são sintetizados pela incorporação durante a síntese de um ou mais monômeros que estão covalentemente ligados a um componente funcional. Em outras modalidades, os ASOs ativados da descrição são sintetizados com monômeros que não foram funcionalizados e o ASO é funcionalizado após a conclusão da síntese. III. Composições Farmacêuticas e Vias de Administração
[0220] O ASO da descrição pode ser usado em formulações e composições farmacêuticas. Em algumas modalidades, tais composições compreendem um diluente, veículo, sal ou adjuvante farmaceuticamente aceitável. Em certas modalidades, um sal farmaceuticamente aceitável compreende um sal de sódio, um sal de potássio ou um sal de amônio.
[0221] O ASO da descrição pode ser incluído em uma formulação unitária, tal como em um veículo ou diluente farmaceuticamente aceitável, em uma quantidade suficiente para suprir a um paciente uma quantidade terapeuticamente eficaz sem causar efeitos colaterais graves no paciente tratado. No entanto, em algumas formas de terapia, efeitos colaterais graves podem ser aceitáveis, em termos de garantir um resultado positivo para o tratamento terapêutico.
[0222] O fármaco formulado pode compreender agentes de ligação e adjuvantes farmaceuticamente aceitáveis. As cápsulas, comprimidos ou pílulas podem conter, por exemplo, os seguintes compostos: celulose microcristalina, goma ou gelatina como aglutinantes; amido ou lactose como excipientes; estearatos como lubrificantes; vários agentes adoçantes ou aromatizantes. Para cápsulas, a unidade de dosagem pode conter um veículo líquido como óleos graxos. Da mesma forma, os revestimentos de açúcar ou agentes entéricos podem fazer parte da unidade de dosagem. As formulações de ASO também podem ser emulsões dos ingredientes farmacêuticos ativos e um lipídio formando uma emulsão micelular.
[0223] As composições farmacêuticas da presente descrição podem ser administradas de várias maneiras, dependendo se o tratamento local ou sistêmico é desejado e da área a ser tratada. A administração pode ser (a) oral; (b) pulmonar, por exemplo, por inalação ou insuflação de pós ou aerossóis, incluindo por nebulizador; intratraqueal, intranasal, (c) tópica, incluindo membranas epidérmicas, transdérmicas, oftálmicas e mucosas, incluindo suprimento vaginal e retal; ou (d) parenteral, incluindo injeção ou infusão intravenosa, intra-arterial, subcutânea, intraperitoneal ou intramuscular; ou administração intracraniana, por exemplo, intratecal, intracerebroventricular ou intraventricular. Em algumas modalidades, o ASO é administrado por via intravenosa, intraperitoneal, oral, tópica ou como uma injeção em bolo ou administrado diretamente no órgão alvo. Em algumas modalidades, o ASO é administrado intracardialmente ou intraventricularmente como uma injeção em bolus. Em algumas modalidades, o ASO é administrado por via subcutânea. Em algumas modalidades, o ASO é administrado por via oral.
[0224] As composições e formulações farmacêuticas para administração tópica podem incluir adesivos transdérmicos, pomadas,
loções, cremes, géis, gotas, sprays, supositórios, líquidos e pós. Podem ser necessários ou desejáveis veículos, bases aquosas, em pó ou oleosas, espessantes e similares farmaceuticamente convencionais. Exemplos de formulações tópicas incluem aqueles em que o ASO da descrição está em mistura com um agente de suprimento tópico, tal como lipídios, lipossomas, ácidos graxos, ésteres de ácidos graxos, esteroides, agentes quelantes e tensoativos. As composições e formulações para administração oral incluem, mas não se limitam a pós ou grânulos, microparticulados, nanoparticulados, suspensões ou soluções em água ou meio não aquoso, cápsulas, cápsulas em gel, sachês, comprimidos ou mini comprimidos. As composições e formulações para administração parenteral, intratecal, intracerebroventricular ou intraventricular podem incluir soluções aquosas estéreis, que também podem conter tampões, diluentes e outros aditivos adequados, tais como, porém não se limitando a, intensificadores de penetração, compostos transportadores e outros veículos ou excipientes farmaceuticamente aceitáveis.
[0225] As composições farmacêuticas da presente descrição incluem, porém não se limitam a, soluções, emulsões e formulações contendo lipossomas. Estas composições podem ser geradas a partir de uma variedade de componentes que incluem, porém não se limitam a, líquidos pré-formados, sólidos autoemulsificantes e semissólidos autoemulsificantes. O suprimento de fármaco ao tecido alvo pode ser aumentado pela distribuição mediada por veículo, incluindo, porém não se limitando a, lipossomas catiônicos, ciclodextrinas, derivados de porfirina, dendrímeros de cadeia ramificada, polímeros de polietilenimina, nanopartículas e microesferas (Dass CR. J Pharm Pharmacol 2002; 54(l):3-27).
[0226] As formulações farmacêuticas da presente descrição, que podem ser convenientemente apresentadas na forma de dosagem unitária, podem ser preparadas de acordo com técnicas convencionais bem conhecidas na indústria farmacêutica. Tais técnicas incluem a etapa de associar os ingredientes ativos com o(s) veículo(s) ou excipiente(s) farmacêutico(s). Em geral, as formulações são preparadas associando-se uniforme e intimamente os ingredientes ativos com veículos líquidos ou veículos sólidos finamente divididos ou ambos, e então, se necessário, moldando o produto.
[0227] Para administração parenteral, subcutânea, intradérmica ou tópica, a formulação pode incluir um diluente estéril, tampões, reguladores de tonicidade e antibacterianos. Os ASOs ativos podem ser preparados com veículos que protegem contra a degradação ou eliminação imediata do corpo, incluindo implantes ou microcápsulas com propriedades de liberação controlada. Para administração intravenosa, os veículos podem ser solução salina fisiológica ou solução salina tamponada com fosfato. A Publicação Internacional No. WO2007/031091 (A2), publicada em 22 de março de 2007, fornece ainda diluente, veículo e adjuvantes farmaceuticamente aceitáveis adequados - que são incorporados por meio deste por referência. IV. Diagnósticos
[0228] Esta descrição fornece ainda um método de diagnóstico útil durante o diagnóstico de doenças cardiovasculares, por exemplo, uma insuficiência cardíaca. Exemplos não limitativos de doenças cardiovasculares que podem ser diagnosticadas com os presentes ASOs incluem, porém não se limitam a, doença arterial coronariana, acidente vascular cerebral, insuficiência cardíaca, doença cardíaca hipertensiva, doença cardíaca reumática, cardiomiopatia, arritmia cardíaca, doença cardíaca congênita, cardite de doença cardíaca valvular, aneurismas aórticos, doença arterial periférica, doença tromboembólica e trombose venosa. Em algumas modalidades, a insuficiência cardíaca compreende uma insuficiência cardíaca do lado esquerdo, uma insuficiência cardíaca do lado direito, uma insuficiência cardíaca congestiva, uma insuficiência cardíaca com fração de ejeção reduzida (HFrEF), uma insuficiência cardíaca com fração de ejeção preservada (HFpEF), uma insuficiência cardíaca com fração de ejeção de faixa média (HFmrEF), uma cardiomiopatia hipertrófica (HCM), uma doença cardíaca hipertensiva (HHD) ou cardiomiopatia hipertrófica hipertensiva.
[0229] Os ASOs da descrição podem ser usados para medir a expressão da transcrição de CAMK2D em um tecido ou fluido corporal de um indivíduo e comparar o nível de expressão medido com um nível de expressão da transcrição de CAMK2D padrão em tecido normal ou fluido corporal, em que um aumento no nível de expressão em comparação com o padrão é indicativo de um distúrbio tratável por um ASO da descrição.
[0230] Os ASOs da descrição podem ser usados para testar os níveis de transcrição de CAMK2D em uma amostra biológica usando quaisquer métodos conhecidos pelos versados na técnica. (Touboul et. Al., Anticancer Res. (2002) 22 (6A): 3349-56; Verjout et. Al., Mutat. Res. (2000) 640:127-38); Stowe et. al., J. Virol. Methods (1998) 75 (1): 93- 91).
[0231] O termo “amostra biológica” refere-se a qualquer amostra biológica obtida a partir de um indivíduo, linhagem celular, cultura de tecidos ou outra fonte de células que potencialmente expressam a transcrição de CAMK2D. Os métodos para obter essa amostra biológica de mamíferos são bem conhecidos na técnica. V. Kits compreendendo ASOs
[0232] Esta descrição ainda fornece kits que compreendem um ASO da descrição no presente documento descrita e que podem ser usados para realizar os métodos descritos no presente documento. Em certas modalidades, um kit compreende pelo menos um ASO em um ou mais recipientes. Em algumas modalidades, os kits contêm todos os componentes necessários e/ou suficientes para realizar um ensaio de detecção, incluindo todos os controles, instruções para realizar ensaios, e qualquer software necessário para análise e apresentação dos resultados. Um versado na técnica reconhecerá facilmente que o ASO descrito pode ser prontamente incorporado em um dos formatos de kit estabelecidos que são bem conhecidos na técnica.
[0233] Os ASOs da descrição podem ser utilizados como reagentes de pesquisa para, por exemplo, diagnóstico, terapêutica e profilaxia.
[0234] Na pesquisa, tais ASOs podem ser usados para inibir especificamente a síntese da proteína CAMK2D (tipicamente degradando ou inibindo o mRNA e, assim, prevenir a formação de proteína) em células e animais experimentais, facilitando assim a análise funcional do alvo ou uma avaliação de sua utilidade como alvo de intervenção terapêutica. São fornecidos ainda métodos de regulação negativa da expressão de mRNA de CAMK2D e/ou proteína CAMK2D em células ou tecidos, que compreendem contatar células ou tecidos, in vitro ou in vivo, com uma quantidade eficaz de um ou mais dos ASOs, conjugados ou composições da descrição.
[0235] Em diagnósticos, os ASOs podem ser usados para detectar e quantificar a expressão da transcrição de CAMK2D em células e tecidos por Northern blotting, hibridização in situ, ou técnicas similares.
[0236] Quanto à terapêutica, um animal ou um ser humano, suspeito de ter uma doença ou distúrbio que pode ser tratado modulando a expressão da transcrição de CAMK2D e/ou proteína CAMK2D, é tratado pela administração de ASOs de acordo com esta descrição. Além disso, são fornecidos métodos de tratamento de um mamífero, tal como o tratamento de um ser humano, suspeito de ter ou estar propenso a uma doença ou condição, associada ao aumento da expressão da transcrição de CAMK2D e/ou proteína CAMK2D, pela administração de uma quantidade terapêutica ou profilaticamente eficaz de um ou mais ASOs ou composições da descrição. O ASO, um conjugado ou uma composição farmacêutica, de acordo com a descrição, é tipicamente administrado em uma quantidade eficaz. Em algumas modalidades, o ASO ou conjugado da descrição é usado na terapia.
[0237] A descrição fornece ainda um ASO de acordo com a descrição, para uso no tratamento de uma ou mais das doenças cardiovasculares referidas no presente documento, tais como uma doença selecionada de uma doença arterial coronariana, acidente vascular cerebral, insuficiência cardíaca, doença cardíaca hipertensiva, doença cardíaca reumática, cardiomiopatia, arritmia cardíaca, doença cardíaca congênita, cardite de doença cardíaca valvular, aneurismas aórticos, doença arterial periférica, doença tromboembólica e trombose venosa.
[0238] Em certas modalidades, a doença, distúrbio ou condição está associado à superexpressão da transcrição do gene CAMK2D e/ou da proteína CAMK2D.
[0239] A descrição também fornece métodos de inibição (por exemplo, redução) da expressão da transcrição do gene CAMK2D e/ou proteína CAMK2D em uma célula ou um tecido, o método compreende contatar a célula ou tecido, in vitro ou in vivo, com uma quantidade eficaz de um ou mais ASOs, conjugados ou suas composições farmacêuticas, da descrição, para afetar a degradação da expressão da transcrição do gene CAMK2D, reduzindo assim a proteína CAMK2D.
[0240] A descrição também fornece o uso de ASO ou conjugado da descrição, conforme descrito, para a fabricação de um medicamento para o tratamento de um distúrbio, como referido no presente documento, ou para um método de tratamento de um distúrbio, como referido no presente documento.
[0241] A descrição fornece ainda um método para inibir ou reduzir a proteína CAMK2D em uma célula que está expressando CAMK2D, compreendendo a administração de um ASO ou um conjugado, de acordo com a descrição, à célula, de modo a afetar a inibição ou redução da proteína CAMK2D na célula.
[0242] A descrição inclui um método para reduzir, melhorar, prevenir ou tratar a hiperexcitabilidade de neurônios motores (por exemplo, como aqueles encontrados em cardiomiócitos) em um indivíduo em sua necessidade, compreendendo a administração de um ASO ou um conjugado de acordo com a descrição.
[0243] A descrição também fornece um método para o tratamento de um distúrbio, conforme referido no presente documento, o método compreendendo a administração de um ASO ou um conjugado de acordo com a descrição, e/ou uma composição farmacêutica, de acordo com a descrição, a um paciente em sua necessidade.
[0244] Os ASOs e outras composições de acordo com a descrição podem ser usados para o tratamento de condições associadas à superexpressão da proteína CAMK2D.
[0245] De modo geral, um aspecto da descrição é direcionado a um método de tratamento de um mamífero que sofre ou é suscetível a condições associadas a níveis anormais de CAMK2D, compreendendo administrar ao mamífero uma quantidade terapeuticamente eficaz de um ASO direcionado à transcrição de CAMK2D, que compreende uma ou mais unidades de LNA. O ASO, um conjugado ou uma composição farmacêutica, de acordo com a descrição, é tipicamente administrado em uma quantidade eficaz.
[0246] Um aspecto interessante da descrição é direcionado ao uso de um ASO (composto), conforme definido no presente documento, ou um conjugado, conforme definido no presente documento, para a preparação de um medicamento para o tratamento de uma doença, distúrbio ou condição, conforme referido no presente documento.
[0247] Os métodos da descrição podem ser usados para o tratamento ou profilaxia contra doenças causadas por níveis anormais da proteína CAMK2D. Em algumas modalidades, as doenças causadas por níveis anormais de proteína CAMK2D são doenças cardiovasculares. Em certas modalidades, as doenças cardiovasculares podem incluir uma doença arterial coronariana, acidente vascular cerebral, insuficiência cardíaca, doença cardíaca hipertensiva, doença cardíaca reumática, cardiomiopatia, arritmia cardíaca, doença cardíaca congênita, cardite de doença cardíaca valvular, aneurismas aórticos, doença arterial periférica, doença tromboembólica, e trombose venosa.
[0248] Em certas modalidades, a doença cardiovascular é uma insuficiência cardíaca, que pode incluir uma insuficiência cardíaca do lado esquerdo, uma insuficiência cardíaca do lado direito, uma insuficiência cardíaca congestiva, uma insuficiência cardíaca com fração de ejeção reduzida (HFrEF), uma insuficiência cardíaca com fração de ejeção preservada (HFpEF), uma insuficiência cardíaca com fração de ejeção de faixa intermediária (HFmrEF), uma cardiomiopatia hipertrófica (HCM), uma doença cardíaca hipertensiva (HHD), ou uma cardiomiopatia hipertensiva hipertrófica.
[0249] Alternativamente citado, em algumas modalidades, a descrição é, além disso, direcionada a um método para tratar níveis anormais de proteína CAMK2D, o método compreendendo a administração de um ASO da descrição, ou um conjugado da descrição, ou uma composição farmacêutica da descrição a um paciente em sua necessidade.
[0250] A descrição também se refere a um ASO, uma composição ou um conjugado, conforme definido no presente documento, para uso como um medicamento.
[0251] A descrição se refere ainda ao uso de um composto, composição ou um conjugado, conforme definido no presente documento, para a fabricação de um medicamento para o tratamento de níveis anormais de proteína CAMK2D ou expressão de formas mutantes da proteína CAMK2D (tais como variantes alélicas, em que as variantes alélicas estão associadas a uma das doenças referidas no presente documento).
[0252] Um paciente que necessita de tratamento é um paciente que sofre ou tem probabilidade de sofrer da doença ou distúrbio.
[0253] A prática da presente descrição usará, a menos que indicado de outra forma, técnicas convencionais de biologia celular, cultura de células, biologia molecular, biologia transgênica, microbiologia, DNA recombinante e imunologia, que estão dentro dos conhecimentos da técnica. Tais técnicas são explicadas por completo na literatura. Veja, por exemplo, Sambrook et al., ed. (1989) Molecular Cloning A Laboratory Manual (2ª ed.; Cold Spring Harbor Laboratory Press); Sambrook et al., ed. (1992) Molecular Cloning: A Laboratory Manual, (Cold Springs Harbor Laboratory, NY); D. N. Glover ed., (1985) DNA Cloning, Volumes I e II; Gait, ed. (1984) Oligonucleotide Synthesis; Mullis et al. Pat. U.S. No. 4.683.195; Hames e Higgins, eds. (1984) Nucleic Acid Hybridization; Hames e Higgins, eds. (1984) Transcription And Translation; Freshney (1987) Culture Of Animal Cells (Alan R. Liss, Inc.); Immobilized Cells And Enzymes (IRL Press) (1986); Perbal (1984) A Practical Guide To Molecular Cloning; o tratado, Methods In Enzymology (Academic Press, Inc., N.Y.); Miller e Calos eds. (1987) Gene Transfer Vectors For Mammalian Cells, (Cold Spring Harbor Laboratory); Wu et al., eds., Methods In Enzymology, Vols. 154 e 155; Mayer e Walker, eds. (1987) Immunochemical Methods In Cell And Molecular Biology (Academic Press, Londres); Weir e Blackwell, eds., (1986) Handbook Of Experimental Immunology, Volumes I-IV; Manipulating the Mouse Embryo, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y., (1986); ); Crooke, Antisense drug Technology:
Principles, Strategies and Applications, 2ª Ed. CRC Press (2007) e em Ausubel et al. (1989) Current Protocols in Molecular Biology (John Wiley and Sons, Baltimore, Md.).
[0254] Todas as referências citadas acima, bem como todas as referências citadas neste documento, são incorporadas no presente documento por referência em sua totalidade.
[0255] Os seguintes exemplos são oferecidos a título de ilustração e não de limitação.
EXEMPLOS Exemplo 1: Construção de ASOs
[0256] Os oligonucleotídeos antisense descritos no presente documento foram designados para visar várias regiões no pré-mRNA de CAMK2D (SEQ ID NO: 1). A SEQ ID NO: 1 mostra a sequência genômica de CAMK2D, que corresponde ao complemento reverso dos resíduos 113.451.032 a 113.761.927 de Acesso ao GenBank No. NC_000004.12. Por exemplo, os ASOs foram construídos para visar as regiões indicadas usando os sítios inicial e final da SEQ ID NO: 1, como mostrado nas Figuras 1A e 1B. As sequências exemplares dos ASOs da presente descrição são fornecidas nas Figuras 1A e 1B. Em algumas modalidades, os ASOs foram designados para serem gapmers, como mostrado na FIGURA 3. Os gapmers descritos foram construídos para conter ácidos nucleicos bloqueados - LNAs (letras maiúsculas). Por exemplo, um gapmer pode ter beta-desóxi LNA na extremidade 5' e na extremidade 3' e ter uma cadeia principal de fosforotioato. Porém, o LNA também pode ser substituído por quaisquer outros análogos de nucleosídeo e a cadeia principal pode ser outros tipos de estruturas (por exemplo, ligação fosfodiéster, uma ligação fosfotriéster, uma ligação metilfosfonato, uma ligação fosforoamidato ou quaisquer suas combinações).
[0257] Os ASOs foram sintetizados usando métodos bem conhecidos na técnica. Métodos exemplares de preparação de tais ASOs são descritos em Barciszewski et al., Capítulo 10 - “Locked Nucleic Acid Aptamers” em Nucleic Acid and Peptide Aptamers: Methods and Protocols, vol. 535, Gunter Mayer (ed.) (2009), cujo inteiro conteúdo é expressamente incorporado por este meio no presente documento por referência. Exemplo 2: ensaio qPCR para medir a redução de mRNA de CAMK2D em células HEK293
[0258] Os ASOs da presente descrição foram testados quanto à sua capacidade de reduzir a expressão de mRNA de CAMK2D em células renais embrionárias humanas (HEK293) (Coleção Europeia de Culturas de Células Autenticadas (ECACC), no. de catálogo 85120602). As células HEK293 foram cultivadas em meio de cultura de células (DMEM AQ D0819, FBS 10% e Pen/Estrep). A cada 5 dias, as células foram tripsinadas por lavagem com solução salina tamponada com fosfato (PBS), seguida pela adição de solução de tripsina-EDTA 0,25%, incubação por 2-3 minutos a 37 °C, e trituração antes da semeadura das células. As células foram mantidas em cultura por até 15 passagens.
[0259] Para uso experimental, 3.500 células por poço foram semeadas em placas de 96 poços em 100 µL de meio de crescimento. Os ASOs foram preparados a partir de um estoque de 750 µM e dissolvidos em PBS. Aproximadamente 24 horas após a semeadura das células, os ASOs foram adicionados às células a uma concentração final de 25 µM. As células foram, em seguida, incubadas durante 3 dias sem qualquer mudança de meio. Após a incubação, as células foram colhidas por remoção de meio seguido pela adição de 125 µL de tampão de lise PURELINK®Pro 96 e 125 µL de etanol 70%. Em seguida, o RNA foi purificado de acordo com as instruções do fabricante e eluído em um volume final de 50 µL de água, resultando em uma concentração de RNA de 10-20 ng/µL. Em seguida, o RNA foi diluído 10 vezes em água antes da reação qPCR de uma etapa.
[0260] Para a reação qPCR de uma etapa, qPCR-mix (qScriptTMXLE 1 etapa RT-qPCR TOUGHMIX®Low ROX, da QauntaBio) foi misturado com duas sondas Taqman em uma relação de 10:1:1 (qPCR-mix: sonda1:sonda2) para gerar o mastermix. As sondas Taqman foram adquiridas da LifeTechnologies: CAMK2D_ Hs009943538_m1; GAPDH 4325792. O mastermix (6 µL) e o RNA (4 µL, 1-2 ng/µL) foram então misturados em uma placa qPCR (MICROAMP® optical 384-well, catálogo no. 4309849). Depois de selar a placa, a placa foi submetida a uma rotação rápida, 1000 g por 1 minuto à temperatura ambiente, e transferida para um sistema ViiaTM 7 (Applied Biosystems, Thermo). As seguintes condições de PCR foram utilizadas: 50 °C por 15 minutos; 95 °C por 3 minutos; 40 ciclos de: 95 °C por 5 segundos, seguido por uma diminuição de temperatura de 1,6 °C/s, seguida por 60 °C por 45 segundos. Os dados foram analisados usando o Software de PCR QuantStudio™ Real_time. A inibição percentual para as amostras tratadas com ASO foi calculada em relação às amostras tratadas de controle. Os resultados são mostrados nas Figuras 2 e 4. Exemplo 3: Análise QUANTIGENE® (ensaio de 96 poços) para Medir a Redução de mRNA de CAMK2D em Cardiomiócitos derivados de Células-Tronco Pluripotentes Induzíveis Humanas (hiPSC-CM)
[0261] A capacidade dos ASOs para reduzir o mRNA de CAMK2D humana foi medida in vitro por análise QUANTIGENE®. Cardiomiócitos derivados de células-tronco pluripotentes induzíveis humanas (hiPSC- CMs) das células Cellular Dynamics International (“iCell2”) foram descongelados, disseminados em placas e cultivados de acordo com as instruções do fabricante. Esses cardiomiócitos são derivados de células-tronco pluripotentes induzidas humanas, que foram primeiro diferenciadas com êxito em cardiomiócitos funcionais em 2009. Zhang et al., Circ Res 104(4):230-41 (2009). Desde então, hiPSC-CMs têm sido utilizados para estudar vários aspectos do coração humano e doenças relacionadas. Como essas células carregam os traços genéticos dos doadores humanos dos quais são obtidas, elas costumam ser melhores indicadores da fisiologia ou fisiopatologia humana em comparação com os modelos animais existentes. Blazeski et al., Prog Biophys Mol Biol 110:166-177 (2012).
[0262] Fluxo de trabalho: Antes da semeadura de células, placas de 96 poços pré-revestidas com colágeno foram revestidas com fibronectina como a seguir. Fibronectina (1 mg/mL) foi diluída 1:100 em PBS (-Ca2+, -Mg2+) e 50 µL de solução de fibronectina diluída foram adicionados a cada poço da placa de 96 poços. A placa foi suavemente agitada horizontalmente para garantir um revestimento uniforme de fibronectina no fundo de cada poço. Em seguida, as placas foram incubadas a 37 °C durante 90 minutos. As células foram adicionadas às placas imediatamente após a aspiração da solução de fibronectina, de acordo com as instruções do fabricante. As células foram semeadas a
30.000 células/poço em 100 µL de Meio de Disseminação em placas do fabricante e, em seguida, incubadas a 37 °C e 5% de CO2 por 4 horas. Em seguida, o Meio de Disseminação foi aspirado e substituído por 100 µL de Meio de Manutenção do fabricante. As células foram incubadas a 37 °C e 5% de CO2 com troca de meio em dias alternados. Os ASOs foram diluídos em água e adicionados às células em DIV08 (isto é, 8 dias após a disseminação em placas). As células foram, em seguida, incubadas a 37 °C e 5% de CO2 durante 3 dias após a adição de ASO para atingir uma redução do estado estacionário do mRNA.
[0263] Após a incubação, o meio foi removido e as células sofreram lise como a seguir. O tampão de lise das células de trabalho foi feito adicionando-se 1 parte de proteinase K a 99 partes de QUANTIGENE® 3x tampão de lise e depois diluindo-se 1:3 em dH2O. O tampão de lise de trabalho foi adicionado às placas a 220 uL/poço. Após a adição de tampão de lise, a placa foi agitada em um agitador de placas por 10 minutos em velocidade média (isto é, velocidade 5-6 de 10). As placas foram, em seguida, incubadas a 55 °C durante 30 minutos. Após esta incubação, os lisados foram congelados a -80 °C ou ensaiados imediatamente. A medição do mRNA do lisado foi realizada usando o QUANTIGENE® 2.0 Reagent System (AFFYMETRIX®), que quantifica o RNA usando um método de amplificação de sinal de DNA ramificado dependente do conjunto de sonda de captura de RNA alvo especificamente projetado.
[0264] Ensaio: Cada poço da placa de captura (placa de poliestireno de 96 poços revestida com sondas de captura) foi carregado com 20 uL de conjunto de sonda de trabalho. Os reagentes do conjunto de sonda de trabalho foram gerados pela combinação de água livre de nuclease (12,05 µL), mistura de lise (6,65 µL), reagente de bloqueio (1 µL) e conjunto de sonda 2.0 específico (0,3 µL) (catálogo CAMK2D humano #SA-3000428 ou catálogo POLR2A humano #SA-10004), de acordo com as instruções do fabricante (QUANTIGENE® 2.0 AFFYMETRIX®). Os lisados celulares (ou tampão de lise 1x para uso em poços em branco de controle de fundo) foram então adicionados às placas de captura em um volume de 80 µL/poço, fornecendo 100 µL de fluido total por poço. As placas foram seladas, usando o selo em folha QUANTIGENE® em combinação com um selador de manivela. As placas foram centrifugadas a 240g por 60 segundos e, em seguida, incubadas por 16-20 horas a 55 °C para hibridizar (captura de RNA alvo).
[0265] A amplificação de sinal e a detecção de RNA alvo começaram pela lavagem das placas com tampão de lavagem 3 vezes (200, 300, e 300 µL/poço em série, com remoção de tampão entre cada etapa) para remover qualquer material não ligado, seguido por uma etapa de centrifugação invertida por 1 min a 240g para secar os poços. Em seguida, o reagente de hibridização 2.0 Pre-Amplifier (100 µL/poço) foi adicionado, incubado a 55 °C por 1 hora, depois aspirado, e o tampão de lavagem foi adicionado e aspirado 3 vezes (200, 300 e 300 uL/poço em série, com a remoção de tampão entre cada etapa), seguido por uma etapa de centrifugação invertida por 1 min a 240g para secar os poços. O reagente de hibridização 2.0 Amplifier foi então adicionado (100 µL/poço), incubado por 1 hora a 55 °C e, em seguida, as etapas de lavagem, aspiração e secagem foram repetidas conforme descrito acima. O reagente de hibridização 2.0 Label Probe foi adicionado em seguida (100 µL/poço), incubado por 1 hora a 50 °C e, em seguida, as etapas de lavagem, aspiração e secagem foram repetidas conforme descrito precedentemente. Em seguida, 2.0 Substrate foi adicionado (100 µL/poço) às placas. As placas foram incubadas por 5 minutos à temperatura ambiente e, em seguida, imageadas em um leitor de placas PerkinElmer Envision multilabel no modo luminômetro em 15 minutos.
[0266] Determinação de dados: Para o gene de interesse, o sinal médio de segundo plano do ensaio foi subtraído do sinal médio de cada repetição técnica. Os sinais médios de segundo plano subtraídos para o gene de interesse foram então normalizados ao sinal médio de segundo plano subtraído para o mRNA de manutenção de POLR2A. A inibição percentual para a amostra tratada foi calculada em relação ao lisado da amostra tratada de controle. Os resultados dos ensaios QUANTIGENE® para células tratadas com ASOs a uma concentração de 500 nM são fornecidos na FIGURA 4. Exemplo 4: Análise da Redução de mRNA de CAMK2D In Vivo
[0267] Para avaliar a potência dos ASOs na redução do nível de mRNA de CAMK2D in vivo, camundongos C57BL/6JBom fêmeas foram administrados por via subcutânea com um dos ASOs mostrados na FIGURA 5. Os ASOs foram administrados em uma dose de 30 mg/kg/dia por três dias consecutivos (dia 1, 2 e 3). Os camundongos foram observados em relação às mudanças comportamentais e de peso corporal. Os camundongos foram sacrificados no dia 8 e o tecido cardíaco foi colhido para isolamento e análise de RNA, como descrito abaixo.
[0268] O tampão de lise do tecido MagNA Pure (Roche) foi adicionado à seção de tecido cardíaco e homogeneizado usando esferas de aço inoxidável até que um lisado uniforme fosse obtido. A incubação durante 30 minutos à temperatura ambiente completou a lise. O RNA foi isolado usando o MagNA Pure96 (Roche) com o kit Cellular RNA Large Volume.
[0269] A concentração de RNA foi normalizada a 5 ng/µl, e qPCR de uma etapa foi realizada usando 20 ng de RNA, qPCR Taqman Mastermix, e as seguintes sondas Taqman: CAMK2D (Thermo Mm00499266_m1) e GAPDH (Thermo 4352339E).
[0270] As condições de PCR foram as seguintes: 50 °C durante 15 minutos; 95 °C por 3 minutos; 40 ciclos de: 95 °C por 5 segundos. Os dados foram analisados usando o software de PCR QUANTSTUDIOTM Real-time. A inibição percentual para as amostras tratadas com ASO foi calculada em relação às amostras tratadas com solução salina.
[0271] Conforme mostrado na FIGURA 5, todos os ASOs testados foram capazes de diminuir o nível de mRNA de CAMK2D quando administrados a camundongos C57BL/6JBom. Coletivamente, os resultados fornecidos no presente documento demonstram a potência dos ASOs tanto in vitro quanto in vivo, e apoiam que ASOs de CAMK2D específicos são terapêuticos modificadores de doenças para o tratamento de vários distúrbios médicos, tais como doenças ou distúrbios cardiovasculares associados.
[0272] Este pedido PCT reivindica o benefício prioritário do Pedido Provisório U.S. Nos. 62/633.502, depositado em 21 de fevereiro de
2018; 62/635.954, depositado em 27 de fevereiro de 2018; 62/665.998 depositado em 2 de maio de 2018; e 62/778.679, depositado em 12 de dezembro de 2018, cada um sendo incorporado no presente documento por referência em sua totalidade.

Claims (3)

REIVINDICAÇÕES
1. Oligonucleotídeo antisense (ASO), caracterizado pelo fato de que compreende uma sequência de nucleotídeos contíguos de 10 a 30 nucleotídeos de comprimento que é complementar, tal como totalmente complementar, a uma sequência de ácidos nucleicos em uma transcrição de proteína quinase dependente de cálcio/calmodulina tipo delta II (CAMK2D).
2. ASO de acordo com a reivindicação 1, ou sua sequência de nucleotídeos contíguos, caracterizado pelo fato de que é pelo menos cerca de 80%, pelo menos cerca de 85%, pelo menos cerca de 90%, pelo menos cerca de 95%, ou cerca de 100% complementar à sequência de ácidos nucleicos dentro da transcrição de CAMK2D.
3. ASO de acordo com a reivindicação 1 ou 2, caracterizado pelo fato de que a transcrição de CAMK2D é selecionada do grupo que consiste em SEQ ID NO: 1 e SEQ ID NO: 2.
4. ASO de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 3, caracterizado pelo fato de que o ASO é capaz de reduzir a expressão da proteína CAMK2D em uma célula humana (por exemplo, célula HEK293) que expressa a proteína CAMK2D.
5. ASO de acordo com a reivindicação 4, caracterizado pelo fato de que a expressão da proteína CAMK2D é reduzida em pelo menos cerca de 30%, pelo menos cerca de 35%, pelo menos cerca de 40%, pelo menos cerca de 45%, pelo menos cerca de 50%, pelo menos cerca de 55%, pelo menos cerca de 60%, pelo menos cerca de 65%, pelo menos cerca de 70%, pelo menos cerca de 75%, pelo menos cerca de 80%, pelo menos cerca de 85%, pelo menos cerca de 90%, pelo menos cerca de 95%, ou cerca de 100% em comparação com a expressão da proteína CAMK2D em uma célula humana que não é exposta ao ASO.
6. ASO de acordo com qualquer uma das reivindicações
1 a 5, caracterizado pelo fato de que é capaz de reduzir a expressão da transcrição de CAMK2D (por exemplo, mRNA) em uma célula humana (por exemplo, célula HEK293), que está expressando a transcrição de CAMK2D.
7. ASO de acordo com a reivindicação 6, caracterizado pelo fato de que a expressão da transcrição de CAMK2D é reduzida em pelo menos cerca de 30%, pelo menos cerca de 35%, pelo menos cerca de 40%, pelo menos cerca de 45%, pelo menos cerca de 50%, pelo menos cerca de 55%, pelo menos cerca de 60%, pelo menos cerca de 65%, pelo menos cerca de 70%, pelo menos cerca de 75%, pelo menos cerca de 80%, pelo menos cerca de 85%, pelo menos cerca de 90%, pelo menos cerca de 95%, ou cerca de 100% em comparação com a expressão da transcrição de CAMK2D em uma célula humana que não é exposta ao ASO.
8. ASO de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 7, caracterizado pelo fato de que o ASO é um gapmer.
9. ASO de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 8, caracterizado pelo fato de que o ASO tem um design de LLLDnLLL, LLLLDnLLLL, ou LLLLLDnLLLLL, em que L é um análogo de nucleosídeo, o D é DNA, e n pode ser qualquer número inteiro entre 4 e
24.
10. ASO de acordo com a reivindicação 9, caracterizado pelo fato de que n pode ser qualquer número inteiro entre 6 e 14.
11. ASO de acordo com a reivindicação 9, caracterizado pelo fato de que n pode ser qualquer número inteiro entre 8 e 12.
12. ASO de acordo com qualquer uma das reivindicações 9 a 11, caracterizado pelo fato de que o análogo de nucleosídeo compreende um 2'-O-alquil-RNA; 2'-O-metil-RNA (2'-OMe); 2'-alcóxi- RNA; 2'-O-metoxietil-RNA (2'-MOE); 2'-amino-DNA; 2'-fluro-RNA; 2'- fluoro-DNA; ácido nucleico arabino (ANA); 2'-fluoro-ANA; ou análogo de nucleosídeo bicíclico (LNA).
13. ASO de acordo com qualquer uma das reivindicações 9 a 12, caracterizado pelo fato de que um ou mais dos análogos de nucleosídeo é um nucleosídeo modificado por açúcar.
14. ASO de acordo com a reivindicação 13, caracterizado pelo fato de que o nucleosídeo modificado por açúcar é um nucleosídeo modificado por açúcar 2’ que aumenta a afinidade.
15. ASO de acordo com qualquer uma das reivindicações 9 a 12, caracterizado pelo fato de que um ou mais dos análogos de nucleosídeo compreende um nucleosídeo que contém um açúcar bicíclico.
16. ASO de acordo com a reivindicação 14, caracterizado pelo fato de que o nucleosídeo modificado por açúcar 2’ que aumenta a afinidade é um LNA.
17. ASO de acordo com a reivindicação 16, caracterizado pelo fato de que o LNA é selecionado do grupo que consiste de etil nucleosídeo restrito (cEt), 2'-O-metoxietil 2',4'-restrito (cMOE), α-L-LNA, β-D-LNA, ácidos nucleicos em ponte 2'-O,4'-C-etileno (ENA), amino- LNA, óxi-LNA, tio-LNA, ou quaisquer suas combinações.
18. ASO de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 17, caracterizado pelo fato de que o ASO compreende uma ou mais nucleobases 5'-metil-citosina.
19. ASO de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 18, caracterizado pelo fato de que o ASO é capaz de (i) reduzir o nível de mRNA que codifica CAMK2D em Cardiomiócitos Derivados de Células-Tronco Pluripotentes induzíveis (hiPSC-CM); (ii) reduzir o nível de proteína de CAMK2D em hiPSC-CM; (iii) reduzir, melhorar ou tratar um ou mais sintomas de uma doença ou distúrbio cardiovascular, e (iv) quaisquer suas combinações.
20. ASO de acordo com qualquer uma das reivindicações
1 a 19, caracterizado pelo fato de que a sequência de nucleotídeos contíguos é complementar a uma sequência de ácidos nucleicos que compreende os (i) nucleotídeos 625-842 da SEQ ID NO: 1; (ii) nucleotídeos 1.398 - 59.755 da SEQ ID NO: 1; (iii) nucleotídeos 61.817 - 104.725 da SEQ ID NO: 1; (iv) nucleotídeos 112.162 - 118.021 da SEQ ID NO: 1; (v) nucleotídeos 119.440 - 135.219 da SEQ ID NO: 1; (vi) nucleotídeos 137.587 - 157.856 da SEQ ID NO: 1; (vii) nucleotídeos
159.191 - 266.174 da SEQ ID NO: 1; ou (viii) nucleotídeos 272.788 -
310.949 da SEQ ID NO: 1.
21. ASO de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 19, caracterizado pelo fato de que a sequência de nucleotídeos contíguos é complementar a uma sequência de ácidos nucleicos que compreende (i) os nucleotídeos 675-792 da SEQ ID NO: 1; (ii) nucleotídeos 1.448 - 59.705 da SEQ ID NO: 1; (iii) nucleotídeos 61.867 - 104.675 da SEQ ID NO: 1; (iv) nucleotídeos 112.212 - 117.971 da SEQ ID NO: 1; (v) nucleotídeos 119.490 - 135.169 da SEQ ID NO: 1; (vi) nucleotídeos 137.637 - 157.806 da SEQ ID NO: 1; (vii) nucleotídeos
159.241 - 266.124 da SEQ ID NO: 1; ou (viii) nucleotídeos 272.838 -
310.899 de SEQ ID NO: 1.
22. ASO de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 19, caracterizado pelo fato de que a sequência de nucleotídeos contíguos é complementar a uma sequência de ácidos nucleicos que compreende (i) os nucleotídeos 725 - 742 da SEQ ID NO: 1; (ii) nucleotídeos 1.498 - 59.655 da SEQ ID NO: 1; (iii) nucleotídeos 61.917 - 104.625 da SEQ ID NO: 1; (iv) nucleotídeos 112.262 - 117.921 da SEQ ID NO: 1; (v) nucleotídeos 119.540 - 135.119 da SEQ ID NO: 1; (vi) nucleotídeos 137.687 - 157.756 da SEQ ID NO: 1; (vii) 159.291 -
266.074 da SEQ ID NO: 1; ou (viii) nucleotídeos 272.888 - 310.849 da SEQ ID NO: 1.
23. ASO de acordo com qualquer uma das reivindicações
1 a 22, caracterizado pelo fato de que a sequência de nucleotídeos contíguos compreende a SEQ ID NO: 4 a SEQ ID NO: 1713 com uma ou duas incompatibilidades.
24. ASO de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 23, caracterizado pelo fato de que a sequência de nucleotídeos contíguos compreende a sequência de nucleotídeos selecionada das sequências nas Figuras 1A e 1B (SEQ ID NO: 4 a SEQ ID NO: 1713).
25. ASO de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 24, caracterizado pelo fato de que a sequência de nucleotídeos contíguos compreende SEQ ID NO: 25, SEQ ID NO: 27, SEQ ID NO: 114, SEQ ID NO: 158, SEQ ID NO: 190, SEQ ID NO: 327, SEQ ID NO: 463, SEQ ID NO: 513, SEQ ID NO: 516, SEQ ID NO: 519, SEQ ID NO: 657, SEQ ID NO: 659, SEQ ID NO: 827, SEQ ID NO : 1249, SEQ ID NO: 1326, SEQ ID NO: 1409, SEQ ID NO: 1524, SEQ ID NO: 1530, SEQ ID NO: 1662 ou SEQ ID NO: 1676.
26. ASO de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 24, caracterizado pelo fato de que o nucleotídeo contíguo compreende SEQ ID NO: 55, SEQ ID NO: 61, SEQ ID NO: 63, SEQ ID NO: 71, SEQ ID NO: 75, SEQ ID NO: 79, SEQ ID NO: 84, SEQ ID NO: 85, SEQ ID NO: 92, SEQ ID NO: 102, SEQ ID NO: 105, SEQ ID NO: 128, SEQ ID NO: 130, SEQ ID NO: 133, SEQ ID NO: 138, SEQ ID NO: 161, SEQ ID NO: 178, SEQ ID NO: 180, SEQ ID NO: 186, SEQ ID NO: 195, SEQ ID NO: 200, SEQ ID NO: 202, SEQ ID NO: 234, SEQ ID NO: 264, SEQ ID NO: 387, SEQ ID NO: 390, SEQ ID NO: 396, SEQ ID NO: 441, SEQ ID NO: 446, SEQ ID NO: 457, SEQ ID NO: 467, SEQ ID NO: 523, SEQ ID NO: 524, SEQ ID NO: 636, SEQ ID NO: 640, SEQ ID NO: 700, SEQ ID NO: 740, SEQ ID NO: 832, SEQ ID NO: 965, SEQ ID NO: 1015, SEQ ID NO: 1065, SEQ ID NO: 1071, SEQ ID NO: 1155, SEQ ID NO: 1475, SEQ ID NO: 1508, SEQ ID NO: 1685, SEQ ID NO: 1686, SEQ ID NO: 1687, SEQ ID NO: 1688, ou SEQ ID NO: 1690.
27. ASO de acordo com a reivindicação 1 ou 26, caracterizado pelo fato de que tem um design selecionado do grupo que consiste dos designs da Figura 3, em que a letra maiúscula é um nucleosídeo modificado por açúcar e a letra minúscula é DNA.
28. ASO de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 27, caracterizado pelo fato de que é capaz de reduzir a expressão da proteína CAMK2D em uma célula hiPSC-CM que expressa a proteína CAMK2D.
29. ASO de acordo com a reivindicação 28, caracterizado pelo fato de que a expressão da proteína CAMK2D é reduzida em pelo menos cerca de 20%, pelo menos cerca de 30%, pelo menos cerca de 40%, pelo menos cerca de 50%, pelo menos cerca de 60%, pelo menos cerca de 70%, pelo menos cerca de 80%, pelo menos cerca de 90% ou cerca de 100% em comparação com uma célula não exposta ao ASO.
30. ASO de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 29, caracterizado pelo fato de que é capaz de reduzir a expressão da transcrição de CAMK2D (por exemplo, mRNA) em uma célula hiPSC- CM que expressa a transcrição de CAMK2D.
31. ASO de acordo com a reivindicação 30, caracterizado pelo fato de que a expressão da transcrição de CAMK2D é reduzida em pelo menos cerca de 20%, pelo menos cerca de 30%, pelo menos cerca de 40%, pelo menos cerca de 50%, pelo menos cerca de 60%, pelo menos cerca de 70%, pelo menos cerca de 80%, pelo menos cerca de 90%, ou cerca de 100% em comparação com uma célula não exposta ao ASO.
32. ASO de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 31, caracterizado pelo fato de que tem de 14 a 20 nucleotídeos de comprimento.
33. ASO de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 32, caracterizado pelo fato de que a sequência de nucleotídeos compreende uma ou mais ligações internucleosídicas modificadas.
34. ASO de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 33, caracterizado pelo fato de que uma ou mais ligações internucleosídicas modificadas é uma ligação fosforotioato.
35. ASO de acordo com a reivindicação 33 ou 34, caracterizado pelo fato de que pelo menos 75%, pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 95%, ou 100% das ligações internucleosídicas são modificadas.
36. ASO de acordo com a reivindicação 35, caracterizado pelo fato de que cada uma das ligações internucleosídicas no ASO é uma ligação fosforotioato.
37. Conjugado compreendendo o ASO como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 36, caracterizado pelo fato de que o ASO é covalentemente ligado a pelo menos uma porção não nucleotídica ou não polinucleotídica.
38. Conjugado de acordo com a reivindicação 37, caracterizado pelo fato de que a porção não nucleotídica ou não polinucleotídica compreende uma proteína, uma cadeia de ácido graxo, um resíduo de açúcar, uma glicoproteína, um polímero, ou quaisquer suas combinações.
39. Composição farmacêutica, caracterizada pelo fato de que compreende o ASO como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 36, ou o conjugado como definido na reivindicação 37 ou 38, e um diluente, veículo, sal ou adjuvante farmaceuticamente aceitável.
40. Composição farmacêutica de acordo com a reivindicação 39, caracterizada pelo fato de que o sal farmaceuticamente aceitável compreende um sal de sódio, um sal de potássio, um sal de amônio, ou quaisquer suas combinações.
41. Composição farmacêutica de acordo com a reivindicação 39 ou 40, caracterizada pelo fato de que compreende ainda pelo menos um outro agente terapêutico.
42. Composição farmacêutica de acordo com a reivindicação 41, caracterizada pelo fato de que o outro agente terapêutico é um antagonista de CAMK2D.
43. Composição farmacêutica de acordo com a reivindicação 42, caracterizada pelo fato de que o antagonista de CAMK2D é um anticorpo anti-CAMK2d ou seu fragmento.
44. Kit, caracterizado pelo fato de que compreende o ASO como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 36, o conjugado como definido na reivindicação 37 ou 38, ou a composição farmacêutica como definida em qualquer uma das reivindicações 39 a 43, e instruções de uso.
45. Kit de diagnóstico, caracterizado pelo fato de que compreende o ASO como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 36, o conjugado como definido na reivindicação 37 ou 38, ou a composição farmacêutica como definida em qualquer uma das reivindicações 39 a 43, e instruções de uso.
46. Método para inibir ou reduzir a expressão da proteína CAMK2D em uma célula, dito método caracterizado pelo fato de que compreende a administração do ASO como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 36, do conjugado como definido na reivindicação 37 ou 38, ou da composição farmacêutica como definida em qualquer uma das reivindicações 39 a 43, à célula que expressa a proteína CAMK2D, em que a expressão da proteína CAMK2D na célula é inibida ou reduzida após a administração.
47. Método in vitro para inibir ou reduzir a expressão da proteína CAMK2D em uma célula, caracterizado pelo fato de que compreende contatar o ASO como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 36, o conjugado como definido na reivindicação 37 ou 38, ou a composição farmacêutica como definida em qualquer uma das reivindicações 39 a 43, à célula que expressa a proteína CAMK2D, em que a expressão da proteína CAMK2D na célula é inibida ou reduzida após o contato.
48. Método de acordo com a reivindicação 46 ou 47, caracterizado pelo fato de que o ASO inibe ou reduz a expressão da transcrição de CAMK2D (por exemplo, mRNA) na célula após a administração.
49. Método de acordo com a reivindicação 48, caracterizado pelo fato de que a expressão da transcrição de CAMK2D (por exemplo, mRNA) é reduzida em pelo menos cerca de 20%, pelo menos cerca de 30%, pelo menos cerca de 40%, pelo menos cerca de 50%, pelo menos cerca de 60%, pelo menos cerca de 70%, pelo menos cerca de 80%, pelo menos cerca de 90%, ou cerca de 100% após a administração em comparação com uma célula não exposta ao ASO.
50. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 46 a 49, caracterizado pelo fato de que a expressão da proteína CAMK2D é reduzida em pelo menos cerca de 60%, pelo menos cerca de 70%, pelo menos cerca de 75%, pelo menos cerca de 80%, pelo menos cerca de 85%, pelo menos cerca de 90%, pelo menos cerca de 95%, pelo menos cerca de 96 %, pelo menos cerca de 97 %, pelo menos cerca de 98 %, pelo menos cerca de 99 % ou cerca de 100% após a administração em comparação com uma célula não exposta ao ASO.
51. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 46 a 50, caracterizado pelo fato de que a célula é uma célula cardíaca, por exemplo, hiPSC-CM.
52. Método para reduzir, melhorar ou tratar um ou mais sintomas de uma doença ou distúrbio cardiovascular em um indivíduo em sua necessidade, dito método caracterizado pelo fato de que compreende a administração de uma quantidade eficaz do ASO como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 36, do conjugado como definido na reivindicação 37 ou 38, ou da composição farmacêutica como definida em qualquer uma das reivindicações 39 a 43, ao indivíduo.
53. Uso de ASO como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 36, de conjugado como definido na reivindicação 37 ou 38, ou de composição farmacêutica como definida em qualquer uma das reivindicações 39 a 43, dito uso caracterizado pelo fato de que é para a fabricação de um medicamento.
54. Uso de ASO como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 36, de conjugado como definido na reivindicação 37 ou 38, ou de composição farmacêutica como definida em qualquer uma das reivindicações 39 a 43, dito uso caracterizado pelo fato de que é para a fabricação de um medicamento para o tratamento de uma doença ou distúrbio cardiovascular em um indivíduo em sua necessidade.
55. ASO de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 36, conjugado como definido na reivindicação 37 ou 38, ou composição farmacêutica como definida em qualquer uma das reivindicações 39 a 43, caracterizado pelo fato de que é para uso em terapia.
56. ASO de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 36, conjugado como definido na reivindicação 37 ou 38, ou composição farmacêutica como definida em qualquer uma das reivindicações 39 a 43, caracterizado pelo fato de que é para uso na terapia de uma doença ou distúrbio cardiovascular em um indivíduo em sua necessidade.
57. ASO de acordo com a reivindicação 19, método como definido na reivindicação 52, uso como definido na reivindicação 54, ou o ASO para uso como definido na reivindicação 56, caracterizado pelo fato de que a doença ou distúrbio cardiovascular compreende uma doença arterial coronariana, acidente vascular cerebral, insuficiência cardíaca, doença cardíaca hipertensiva, doença cardíaca reumática, cardiomiopatia, arritmia cardíaca, doença cardíaca congênita, cardite de doença cardíaca valvular, aneurismas aórticos, doença arterial periférica, doença tromboembólica, trombose venosa, ou quaisquer suas combinações.
58. Método, uso ou ASO de acordo com a reivindicação 57, caracterizado pelo fato de que a doença ou distúrbio cardiovascular é insuficiência cardíaca.
59. Método, uso ou ASO de acordo com a reivindicação 58, caracterizado pelo fato de que a insuficiência cardíaca compreende uma insuficiência cardíaca do lado esquerdo, uma insuficiência cardíaca do lado direito, uma insuficiência cardíaca congestiva, uma insuficiência cardíaca com fração de ejeção reduzida (HFrEF), uma insuficiência cardíaca com fração de ejeção preservada (HFpEF), uma insuficiência cardíaca com fração de ejeção de faixa intermediária (HFmrEF), cardiomiopatia hipertrófica (HCM), doença cardíaca hipertensiva (HHD), ou cardiomiopatia hipertensiva hipertrófica.
60. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 52 e 57 a 59, uso como definido em qualquer uma das reivindicações 54 e 57 a 59, ou ASO para uso como definido em qualquer uma das reivindicações 56 a 59, caracterizado pelo fato de que o indivíduo é um ser humano.
61. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 52 e 57 a 60, uso como definido em qualquer uma das reivindicações 54 e 57 a 60, ou ASO para uso como definido em qualquer uma das reivindicações 56 a 60, caracterizado pelo fato de que o ASO, o conjugado ou a composição farmacêutica é administrado de forma intracardíaca, oral, parenteral, intratecal, intracerebroventricular, pulmonar, tópica ou intraventricular.
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