JP2823959B2 - 改良された取り込みおよびその他の性質を持つ誘導化オリゴヌクレオチド - Google Patents

改良された取り込みおよびその他の性質を持つ誘導化オリゴヌクレオチド

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JP2823959B2 JP5507961A JP50796193A JP2823959B2 JP 2823959 B2 JP2823959 B2 JP 2823959B2 JP 5507961 A JP5507961 A JP 5507961A JP 50796193 A JP50796193 A JP 50796193A JP 2823959 B2 JP2823959 B2 JP 2823959B2
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Description

【発明の詳細な説明】 〔関連出願の参照〕 本出願は1990年１月11日に出願された出願番号第463,
358号および1990年８月13日に出願された出願番号第56
6,977号の一部継続出願である1991年１月11日に出願さ
れたPCT/US91/00243の一部継続出願である1991年10月24
日に出願された出願番号第782,374号の一部継続出願で
ある。本出願の譲受人に譲渡されているこれらの出願の
全開示は本明細書に引例として含まれている。
〔技術分野〕
本出願は連結基を経て結合されているステロイド、レ
ポーター分子、レポーター酵素、非芳香族親油性分子、
ペプチドまたは蛋白質のごとき置換基を持つ機能性化
（functionalized）ヌクレオシドを含む配列特異的オリ
ゴヌクレオチドに関する。
〔背景技術〕
メッセンジャーRNA（mRNA）は蛋白質合成を指令す
る。アンチセンス法はmRNAまたはDNAへの比較的短いオ
リゴヌクレオチドの相補的なハイブリダイゼーションで
あり、それによりこれらの細胞内核酸の必須の機能が破
壊される。ハイブリダイゼーションとは相補的ワトソン
−クリック塩基対による、RNAまたは一本鎖DNAへのオリ
ゴヌクレオチドの配列特異的水素結合である。
Cohenにより“オリゴヌクレオチド：遺伝子発現のア
ンチセンスインヒビター"CRC Press,Inc.,Boca Raton,F
I（1989）に議論されているごとく、核酸機能の破壊を
起こす天然の出来事は２つの型にわけられると考えられ
る。第１のハイブリダイゼーション停止は、オリゴヌク
レオチドインヒビターが標的核酸に結合し、単なる立体
障害により必須蛋白質（最も多くの場合、リボソーム）
の核酸への結合を妨げて停止を起こさせる。最も広く研
究されている２つのアンチセンス薬剤であるメチルホス
ホネート オリゴヌクレオチド（例えばMiller et al.,
Anti Cancer Drug Design 1987,2,117を参照されたい）
およびα−アノマーオリゴヌクレオチドは、ハイブリダ
イゼーション停止により核酸機能を破壊すると考えられ
ている。
アンチセンス オリゴヌクレオチドが停止を起こさせ
る第２の型は、細胞内RNase Ｈによる標的とされたRNA
の酵素的切断である。２′−デオキシリボフラノシル
オリゴヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチド類似体
は、標的とされたRNAにハイブリダイズしてデュープレ
ックスを形成し、RNase Ｈ酵素を活性化してRNA鎖を切
断し、それによりRNAの正常機能を破壊する。ホスホロ
チオエート オリゴヌクレオチドはアンチセンス剤の最
も卓越した例であり、この型のアンチセンス停止により
作用する。
診断薬、研究試薬および治療剤のためのアンチセンス
薬剤として、オリゴヌクレオチドおよびオリゴヌクレオ
チド類似体の応用を目ざす多くの研究が行われている。
少なくとも治療目的には、アンチセンス オリゴヌクレ
オチドおよびオリゴヌクレオチド類似体は活性を発揮す
るために細胞膜を通過して輸送されるかまたは細胞によ
り取り込まれなくてはならない。膜または細胞輸送を増
加させる一つの方法はたれさがった（pendant）親油性
基を付けることである。
Ramirez,et al.,J.Am.Chem.Soc. 1982,104:5483は、
ダイマーTpTの３′および５′位に独立してリン脂質基
５′−Ｏ−（1,2−ジ−Ｏ−ミリストイル−Sn−グリセ
ロ−３−ホスホリル）を導入した。その後、Shea,et a
l.,Nuc.Acids Res. 1990,18,3777は、オリゴヌクレオチ
ドの５′−末端の５′−リン酸基に連結された1,2−ジ
−Ｏ−ヘキシルデシル−rac−グリセロール基を持つオ
リゴヌクレオチドを記載している。Shea,et al.,の著者
のうちの何人かはこれらおよびその他の化合物を特許出
願PCT/US90/01002に開示している。別のグリコシルリン
脂質がGuerra et.al.,Tetrahedron Letters 1987,28,35
81により記載されている。
別の研究においては、オリゴヌクレオチドの第１およ
び第２のヌクレオチド（３′末端から）の間のヌクレオ
チド間結合へコレステリル基が結合された。この研究は
米国特許出願第4,958,013号およびLetsinger,et.al.,Pr
oc.Natl.Acad.Sci.USA 1989,86,6553に記載されてい
る。
Yamana et.al.,Bioconjugate Chem. 1990,1,319によ
り報告されているごとく、オリゴヌクレオチドの糖部分
の２′位に芳香酸インターカレーション剤アントラキノ
ンが結合された。
Lemairte,et.al.,Proc.Natl.Acad.Sci. USA 1986,84,
648およびLeonetti,et.al.,Bioconjugate Chem. 1990,
1,149は、オリゴヌクレオチドの３′末端を３′末端リ
ボース糖部分を含むように改良している。この末端リボ
ースの過ヨウ素酸酸化に続いての還元、およびＮ−モル
ホリン環を通しての結合によりポリ（Ｌ−リジン）がオ
リゴヌクレオチドに連結された。オリゴヌクレオチド−
ポリ（Ｌ−リジン）複合体は欧州特許出願87109348.0に
記載されており、ここでリジン残基はオリゴヌクレオチ
ドの５′または３′末端ヌクレオチドの５′または３′
リン酸に結合されていた。Corey,et.al.,Science 1987,
238,1401;Zuckermann,et.al.,J.Am.Chem.Soc. 1988,11
0,1614;およびCorey.et.al.,J.Am.Chem.Soc. 1989,111,
8524に記載されているごとく、オリゴヌクレオチドへの
ペプチドの連結にオリゴヌクレオチドの３′末端でのジ
スルフィド結合もまた利用されてきた。
Nelson,et.al.,Nuc.Acids Res. 1989,17,7187,は、オ
リゴヌクレオチドの３′末端へのビオチンの結合のため
の連結剤を記載している。この試薬Ｎ−Fmoc−Ｏ−DMT
−３−アミノ−1,2−プロパンジオールは、３′−Amine
の名前でClontech Laboratories（Palo Alto,CA）か
ら、および３′−Amino−Modifierの名前でGlen Resear
ch Corporation（Sterling,VA）から市販品として入手
可能である。この試薬はまたJudy,et.al.,Tetrahedr−o
n Letters1992,32,879により報告されているごとく、オ
リゴヌクレオチドへのペプチドの連結に利用された。オ
リゴヌクレオチドの５′末端への連結のための類似の市
販試薬（実際は種々の長さのポリメチレン連結部を持つ
一連の連結剤）は５′−Amino−Modifier C6である（Gl
en Research Corporationから）。これらの化合物また
は類似のものはオリゴヌクレオチドの５′末端へのフル
オレセインの連結にKrieg.et.al.,Antisense Research
and Development 1991,1,161により利用された。興味あ
る他の化合物もまたオリゴヌクレオチドの３′末端に連
結されてきた。Asseline,et.al.,Proc.Natl.Acad.Sci.U
SA 1984,81,3297はポリメチレン結合を通してのポリ（T
p）オリゴヌクレオチドの３′末端リン酸基へのアクリ
ジンの連結について記載している。Haralambidis,et.a
l.,Tetrahedron Letters 1987,28,5199は固体支持体上
へのペプチドの合成、続いてのオリゴヌクレオチドの
３′末端ヌクレオチドの３′水酸基を通してのそのペプ
チドへのオリゴヌクレオチドの連結について報告してい
る。Chollet,Nucleosides ＆ Nucleotides 1990,9,957
はオリゴヌクレオチドの５′末端リン酸へAminolink2
（Applied Biosystems,Foster City.CA）を結合させ
た。彼らは次にオリゴヌクレオチドへのインターロイキ
ン蛋白質の連結に二機能性連結基SMPB（Pierce Chemica
l Co.,Rockford,I1）を使用した。
Dreyer,et.al.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 1985,82,96
8,が報告しているごとく、ピリミジンヌクレオシドの５
位へEDTA鉄錯体が連結されている。Haralambidis,et.a
l.,Nucleic Acid Research 1987,15,4857が報告してい
るごとく同じ方法でフルオレセインが、およびPCT出願P
CT/US/02198に記載されているごとく同じ方法でビオチ
ンがオリゴヌクレオチドへ連結された。フルオレセイ
ン，ビオチンおよびビレンはまたTelser,et.al.,J.Am.C
hem.Soc. 1989,111,6966により報告されているごとく、
同じ方法で連結された。Glen Research Corporationか
らの市販の試薬、Amino−Modifier−dTを用いて類似の
連結基を持つピリミジンヌクレオチドをオリゴヌクレオ
チド内へ導入することができるであろう。
ラジオシンチグラフ イメージングの研究に使用する
ためのEDTAに連結されたコール酸がBetebenner,et.al.,
Bioconjugate Chem. 1991,2,117,により報告されてい
る；しかしながら、ヌクレオシド、ヌクレオチドまたは
オリゴヌクレオチドへのコール酸の連結は知られていな
い。
〔発明の目的〕
本発明は、細胞膜を通過する改良された輸送能力を持
つ配列特異的オリゴヌクレオチドを提供することを目的
とする。
本発明はまた、動物の体の状態、特に疾病状態をアッ
セイするための研究および診断の方法および試薬の改良
を提供することを目的とする。
さらに本発明は、DNAまたはRNAの活性の調節を介する
疾病の処置のために、改良された通過性および取り込み
の性質を持つ治療および研究物質を提供することを目的
とする。
〔発明の簡単な説明〕
本明細書から明らかなこれらおよび他の目的に従う
と、少なくとも一つのヌクレオシドの２′位が、例えば
ステロイド分子、レポーター分子、非芳香族親油性分
子、レポーター酵素、ペプチド、蛋白質、水溶性ビタミ
ン、脂溶性ビタミン、RNA切断複合体、金属キレート
剤、ポルフィリン、アルキル化剤、ハイブリッドホスヌ
クレアーゼ／インターカレーター、ピレンまたはアリー
ルアジド光架橋剤のような置換基で機能性化された複数
の連結されたヌクレオシドを含む化合物が提供される。
好適には置換基は介在連結基（intervening linking gr
oup）を用いて２′位に連結される。
本発明のある好適な実施態様においては、置換基はス
テロイド分子、ビオチン、レポーター酵素またはフルオ
レセイン色素分子を含む。これらの実施態様において、
ステロイド分子はコール酸、デオキシコール酸、デヒド
ロコール酸、コルチゾン、テストステロン、コレステロ
ールおよびジゴキシゲニンからなる群より選択され、最
も好適なステロイド分子はコール酸である。好適なレポ
ーター酵素には西洋ワサビペルオキシダーゼおよびアル
カリ性ホスファターゼが含まれる。
さらに好適な実施態様において、２′位に結合される
非芳香族親油性分子には、脂環式炭化水素、飽和または
不飽和脂肪酸、ワックス、テルペノイド、またはアダマ
ンタンおよびバクミンスターフルーレンを含む多脂環式
炭化水素が含まれる。本発明に従ったワックスには、脂
肪酸の一価アルコールエステルおよび脂肪族ジアミドが
含まれる。バクミンスターフルーレンには共有結合で結
合した種々の数の炭素原子を含むサッカーボールの形を
したケージ分子が含まれる。テルペノイドにはC10テル
ペン、C20セスキテルペン、ビタミンＡ（レチノー
ル）、レチノイン酸、レチナールおよびデヒドロレチノ
ールを含むC30ジテルペン、C30トリテルペン、C40テト
ラテルペンおよびその他のより高級なポリテルペノイド
が含まれる。
別の好適な実施態様において、２′位に結合されたペ
プチドまたは蛋白質には配列特異性ペプチドおよびホス
ファターゼ、ペルオキシダーゼおよびヌクレアーゼを含
む配列特異性蛋白質が含まれる。
本発明の好適な連結分子にはΩ−アミノアルコキシ連
結剤、Ω−アミノアルキルアミノ連結剤、ヘテロ二官能
性連結剤またはホモ二官能性連結剤が含まれる。本発明
の特に好適な連結分子は５−アミノペントキシ基であ
る。
本発明の好適な実施態様において、連結されたヌクレ
オシドの少なくとも一部は２′−デオキシ−２′−フル
オロ、２′−メトキシ、２′−エトキシ、２′−プロパ
ノキシ、２′−アミノアルコキシまたはアリルオキシ
ヌクレオシドである。本発明の別の好適な実施態様にお
いて、連結されたヌクレオシドはホスホロチオエート連
結基により連結されている。
本発明はまた複数の連結ヌクレオシドを持つ化合物を
提供する。好適な実施態様において、ヌクレオシドの少
なくとも一つは：（１）その２′位に連結されたコール
酸を持つ２′−機能性化ヌクレオシド；（２）そのヘテ
ロ環式塩基に連結されたコール酸を持つヘテロ環式塩基
機能性化ヌクレオシド；（３）その５′位に連結された
コール酸を持つ５′末端ヌクレオシド；（４）その３′
位に連結されたコール酸を持つ３′末端ヌクレオシド；
または（５）鎖間ヌクレオシドを隣接するヌクレオシド
に連結している鎖間結合に連結されているコール酸を持
つ前記鎖間ヌクレオシドである。
連結されたヌクレオシドを持つ本発明のある種の実施
態様において、少なくとも一つの連結されたヌクレオシ
ドは２′−デオキシ−２′−フルオロ、２′−Ｏ−C1−
C20−アルキル、２′−Ｏ−C2−C20−アルケニル、２′
−Ｏ−C2−C20アルキニル、２′−Ｓ−C1−C20アルキ
ル、２′−Ｓ−C2−C20−アルケニル、２′−Ｓ−C2−C
20−アルキニル、２′−NH−C1−C20−アルキル、２′
−NH−C2−C20−アルケニルまたは２′−NH−C2−C20−
アルキニル置換基を持っている。
さらに本発明に従うと複数の連結ヌクレオシドを持つ
化合物の細胞の取り込みを増加させる方法が提供され、
この方法は生物を化合物と接触させることを含み、ここ
でその化合物はその２′位がステロイド分子、レポータ
ー分子、非芳香族親油性分子、レポーター酵素、ペプチ
ド、蛋白質、水溶性ビタミン、または脂溶性ビタミンに
より機能性化されたヌクレオシドを少なくとも一つ含ん
でいる。化合物のための不活性担体をさらに含む組成物
中に本化合物を含ませることができる。
本発明はまたアンチセンスオリゴヌクレオチドの結合
親和性および／または安定性を促進する方法を提供し、
この方法は、ステロイド分子、レポーター分子、非芳香
族親油性分子、レポーター酵素、ペプチド、蛋白質、水
溶性ビタミンおよび脂溶性ビタミンによりオリゴヌクレ
オチドを機能性化することを含む。
〔発明の詳細な説明〕
アンチセンス治療は単核の原核生物および真核生物か
ら多細胞真核生物までの範囲の種々の生物で実施でき
る。その遺伝、代謝または細胞の調節の基礎的部分とし
てDNA−RNA転写またはRNA−蛋白質翻訳を利用する生物
は、アンチセンス治療学および／または予防学を受け入
れることができる。見かけ上、細菌、酵母、原生動物、
藻類、すべての植物および温血動物を含むすべての高等
動物のような多様な生物がアンチセンス療法で処置可能
である。さらに、多細胞真核生物の各々の細胞もまたそ
の細胞活性の絶対必要な部分としてDNA−RNA転写および
RNA−蛋白質翻訳の両方を含んでいるのでアンチセンス
治療学および／または予防学をそのような細胞集団に対
して実施することもできる。さらに、真核細胞の多くの
細胞小器官（例えばミトコンドリアおよびクロロプラス
ト）もまた転写および翻訳機構を含んでいる。そのよう
なものとして、単一細胞、細胞集団または細胞内小器官
もまたアンチセンス治療学または診断学で処置できる生
物の定義内に含めることができる。ここで使用されるか
ぎり、治療学とは疾病状態（例えば細菌、原生動物また
はその他の感染のように生物を殺す）の根絶または不規
則なまたは有害な細胞増殖または発現の制御の両方を含
むことを意味している。
特定の理論により束縛されるのを望むわけではない
が、核内の多くの核蛋白質の存在は流入後核内でのそれ
らの選択的保持というよりむしろ核外皮を通してのそれ
らの選択的流入のためと信じられている。この機構によ
ると、核はある種の蛋白質を選択的に取り込むことがで
きるが、その他のものは取り込めない。取り込みは核内
でのペプチドまたは蛋白質の蓄積を可能にする選択的シ
グナル配列を提供するペプチドまたは蛋白質の配列に基
づいている。そのようなペプチドシグナル配列の一つが
SV40のラージＴ抗原の一部として見い出される。例えば
Dingwell,et al.,Ann.Rev.Cell Bio. 1986,2,367;Yoned
a,et al.,Experimental Cell Research 1987,170,439;
およびWychowski,et al.,J.Virol.1986,61,3862を参照
されたい。
本発明に従うと、ステロイド分子、レポーター分子、
非芳香族親油性分子、レポーター酵素、ペプチド、蛋白
質、水溶性ビタミン、脂溶性ビタミン、RNA切断複合
体、金属キレート剤、ポルフィリン、アルキル化剤、ハ
イブリッドホスヌクレアーゼ／インターカレーターまた
はアリールアジド光架橋剤のような置換基が、細胞膜を
通してのアンチセンス診断または治療剤の輸送を助ける
ためにアンチセンス診断または治療剤中の少なくとも一
つのヌクレオシドに結合されている。そのようなアンチ
センス診断または治療剤は、問題とするRNAまたはDNAの
領域に対して“アンチセンス”である複数の連結された
ヌクレオシドの配列から形成されている。従って連結さ
れたヌクレオシドの一つまたはそれ以上のヌクレオシド
は連結基を通してヌクレオシドへ結合されていた置換基
を含むように“機能性化されている”。同定の目的には
そのような機能性化されたヌクレオシドは置換基を有す
る（例えばステロイドを有する）ヌクレオシドとして特
徴付けられるであろう。配列内に少なくとも一つの機能
性化されたヌクレオシドを持つ連結ヌクレオシドは、機
能性化されたヌクレオシドを含んでいない連結ヌクレオ
シドと比較した場合、強化されたアンチセンス活性を示
した。これらの“機能性化された”連結ヌクレオシドは
さらに細胞膜を横ぎる輸送が増加していることが示され
た。
本発明の目的において、術語“レポーター分子”およ
び“レポーター酵素”には、分光学、放射活性、比色ア
ッセイ、蛍光および特異的結合のような物理学的性質を
利用して、ゲル、液体、全細胞系、破壊された細胞系な
どの中でそれらの同定を可能にする物理的または化学的
性質を持つ分子または酵素が含まれる。ステロイドには
ペルヒドロ−1,2−シクロペンタノフェナントレン環系
を含む化学化合物が含まれる。蛋白質およびペプチドは
アミノ酸のポリマーとしての通常の意味で用いられる。
普通、ペプチドは単位分子当り蛋白質より少ないアミノ
酸モノマーを含んでいるアミノ酸ポリマーである。非芳
香族親油性分子には脂肪酸、エステル、アルコールおよ
び他の脂質分子、並びにアダマンタンおよびバクミンス
ターフルーレンのようにその構造内に芳香環を含んでい
ない合成ケージ構造が含まれる。
ステロイド分子として特に有用であるのは、コール
酸、デオキシコール酸およびデヒドロコール酸を含む胆
汁酸である。他の有用なステロイドはコルチゾン、ジゴ
キシゲニン、テストステロン、コレステロール、および
コルチゾン環の３位の二重結合を介して結合されている
トリメチルアミノメチルヒドラジド基を持つコルチゾン
のようなカチオン性ステロイドである。特に有用なレポ
ーター分子はビオチンおよびフルオレセイン色素であ
る。特に有用な非芳香族親油性分子は脂環式炭化水素、
飽和および不飽和脂肪酸、ワックス、テルペンおよびア
ダマンタンおよびバクミンスターフルーレンを含む多脂
環式炭化水素である。特に有用なレポーター酵素はアル
カリ性ホスファターゼおよび西洋ワサビペルオキシダー
ゼである。特に有用なペプチドおよび蛋白質は配列特異
的ペプチド、およびホスホジエステラーゼ、ペルオキシ
ダーゼ、ホスファターゼおよびヌクレアーゼ蛋白質を含
む蛋白質である。そのようなペプチドおよび蛋白質に
は、SV40ペプチド、RNaseA,RNaseHおよびスタフィロコ
ッカスのヌクレアーゼが含まれる。特に有用なテレペノ
イドはビタミンＡ、レチノイン酸、レチナールおよびデ
ヒドロレチノールである。
本発明に従うビタミンは、一般的に水溶性または脂溶
性に分類できる。水溶性ビタミンにはチアミン、リボフ
ラビン、ニコチン酸またはナイアシン、ビタミンB6ピリ
ドキサール群、パントテン酸、ビオチン、葉酸、B12コ
バミド補酵素、イノシトール、コリンおよびアスコルビ
ン酸が含まれる。脂溶性ビタミンにはビタミンＡ群、ビ
タミンＤ、ビタミンＥトコフェロール群およびビタミン
Ｋ（およびフィトール）が含まれる。ビタミンＡ群（レ
チノイン酸およびレチノールを含む）は、サイトゾルレ
チノール結合蛋白質タイプII（CRBP−II）、レチノール
結合蛋白質（RBP）および細胞性レチノール結合蛋白質
（CRBP）のような特異的蛋白質との相互作用を介して吸
収され標的組織に輸送される。ヒトの体の色々な部分で
発見されたこれらの蛋白質は、約15KDの分子量を持って
いる。それらはビタミンＡ群の化合物、特にレチノイン
酸およびレチノールとの特異的相互作用を持っている。
ビタミンＡ群の化合物は種々の群構成メンバーにみら
れる酸またはアルコール官能基を介してオリゴヌクレオ
チドへ結合できる。例えば、レチノイン酸の酸部分のＮ
−ヒドロキシスクシンイミドエステルとオリゴヌクレオ
チドにぶらさげた連結基上のアミン機能の結合により、
アミド結合を介してビタミンＡ化合物がオリゴヌクレオ
チドに連結される。また、レチノールは５′結合に有用
であるそのホスホロアミダイトに変換された。
α−トコフェロール（ビタミンＥ）およびその他のト
コフェロール（ベータからゼータ）には親油特性がある
ので、取り込みを促進させるためにオリゴヌクレオチド
へ結合できる。また親油性ビタミン、ビタミンＤおよび
そのエルゴステロール前駆体は、最初にヒドロキシル基
を例えばヘミスクシネートエステルに活性化させること
によりそのヒドロキシル基を介してオリゴヌクレオチド
へ結合できる。次にオリゴヌクレオチドからぶらさがっ
ているアミノ連結体への結合が達成される。ビタミン上
のヒドロキシ基を介してオリゴヌクレオチドアミノ連結
基へ結合できる他のビタミンには、チアミン、リボフラ
ビン、ピリドキシン、ピリドキサミン、ピリードキサー
ル、デオキシピリドキシンが含まれる。脂溶性ビタミン
Ｋおよび関連キノン−含有化合物は、キノン環上のカル
ボニル基を介して結合できる。ビタミンＫのフィトール
部分もまたオリゴヌクレオチドの細胞への結合を促進さ
せるのに働くであろう。
ピリドキサール（ビタミンB6）は特異的B6結合蛋白質
を持っている。ピリドキサール輸送におけるこれらの蛋
白質の役割はZhangおよびMcCormick,Proc.Natl.Acad.Sc
i.USA 1991 88,10407,により研究されている。Zhangお
よびMcCormickはまた、一連のＮ−（４′−ピリドキシ
ル）アミン（いくつかの合成アミンがピリドキサールの
４′位に結合されている）がB6輸送体により助長された
過程により細胞内へ入ることが可能であることも示し
た。彼らはまた細胞内におけるこれらの合成アミンの放
出についても示した。他のピリドキサール群構成物とし
ては、ピリドキシン、ピリドキサミン、ピリドキサール
リン酸およびピリドキシン酸が含まれる。ピリドキシン
酸、ナイアシン、パントテン酸、ビオチン、葉酸および
アスコルビン酸は、レチノイン酸で説明したように、オ
リゴヌクレオチド上に位置するアミノ連結基と反応性を
持つＮ−ヒドロキシスクシンイミドエステルを用いてオ
リゴヌクレオチドに結合できる。
アンチセンス性を改良するための別の群には、RNA切
断複合体、ピレン、金属キレート剤、ポルフィリン、ア
ルキル化剤、ハイブリッドインターカレーター／リガン
ドおよび光架橋剤が含まれる。RNA切断剤にはＯ−フェ
ナントロリン/Cu錯体およびRu（ビピリジン）3 2+錯体が
含まれる。Ru（bpy）3 2+錯体は核酸と相互作用し、核酸
を光化学的に切断する。金属キレート剤にはEDTA,DTPA
およびｏ−フェナントロリンが含まれる。アルキル化剤
にはヨードアセトアミドのような化合物が含まれる。ポ
ルフィリンにはポルフィリン、その置換形および金属錯
体が含まれる。ピレンにはピレンおよび他のピレンを基
本骨格としたカルボン酸が含まれ、同様のプロトコール
を用いて結合することができる。
ハイブリッド インターカレーター／リガンドにはホ
トヌクレアーゼ／インターカレーターリガンド６
〔〔〔９−〔〔６−（４−ニトロベンズアミド）ヘキシ
ル〕アミノ〕アクリジン−４−イル〕カルボニル〕アミ
ノ〕ヘキサノイルペンタフルオロフェニルエステルが含
まれる。この化合物は二つの注目に値する特色、すなわ
ち、インターカレーターであるアクリジン部分およびホ
トヌクレアーゼであるｐ−ニトロベンズアミド基を持っ
ている。
光架橋剤としては例えばＮ−ヒドロキシスクシンイミ
ジル−４−アジドベンゾエート（HSAB）およびＮ−スク
シンイミジル−６（４′−アジド−２′−ニトロフェニ
ル−アミノ）ヘキサノエート（SANPAH）のようなアリー
ルアジドが含まれる。オリゴヌクレオチドへ結合された
アリールアジドは照射により核酸および蛋白質と架橋を
達成する。これらはまた担体蛋白質（KLHまたはBSAのよ
うな）とも架橋し、オリゴヌクレオチドに対する抗体を
生じさせる。
本発明の置換基をヌクレオシド、ヌクレオチドおよび
／またはオリゴヌクレオチドに連結するために種々の連
結基が使用できる。Ω−アミノアルコキシ部分およびΩ
−アミノアルキルアミノ部分のようなある種の連結基
は、ヌクレオシドの２′位へのステロイド分子またはレ
ポーター分子の連結に特に有用である。多くの連結基は
市販品として入手可能であり、ヘテロ二機能性およびホ
モ二機能性連結部分はPierce Co.（Rockford,IL）から
入手可能である。ヘテロ二機能性およびホモ二機能性連
結部分は、Ω−アミノアルコキシおよびΩ−アミノアル
キルアミノ部分と連結してペプチドおよび蛋白質をヌク
レオシドに結合させる伸長連結部を形成するのに特に有
用である。他の市販品として入手可能な連結基は５′−
Amino−Modifier C6および３′−Amino−Modifier試薬
（両方ともGlen Research Corporation,Sterling,VAか
ら入手可能）である。５′−Amino−Modifier C6はま
たAminolink−２としてABI（Applied Biosystems Inc.,
Foster City,CA）からも入手可能であり、３′−Amino
−ModifierもまたClontech Laboratories Inc（Palo Al
to,CA）から入手可能である。前もってヌクレオシドに
結合された連結基を持つヌクレオチド類似体はGlen Res
earch Corporationから登録商標“Amino−Modifier−d
T"として市販品として入手可能である。このヌクレオシ
ド−連結基試薬、すなわちピリミジン環の５位に〔Ｎ
（７−トリフルオロアセチルアミノヘプチル）３−アク
リルアミド〕置換基を持つウリジン誘導体は一般的には
Jablonski,et al.,Nucleic Acid Research 1986,14,611
5,に従って合成される。本発明のヌクレオシド類似体
は、そのN6プリンアミノ基が連結基により機能性化され
たアデニンヌクレオシド、その環外N2プリンアミノ基が
連結基により機能性化されたグアニンヌクレオシドおよ
びそのN4ピリミジンアミノ基または５ピリミジン位が連
結基により機能性化されたシトシンヌクレオシドを含む
ことを意図している。
本発明の配列特異的な連結ヌクレオシドは、標準ヌク
レオチド前駆体またはすでに連結部分を持っているヌク
レオチド前駆体を使用し、適当なDNA合成装置により組
み立てられる。配列特異的連結ヌクレオシドの合成が完
了したら、置換基と連結部とを反応させることができ
る。従って本発明は好適にはDNA合成装置上で既知の技
術により所望のように連結されたヌクレオシド配列を最
初に組立てる。一つまたはそれ以上の連結されたヌクレ
オシドは次に機能性化され、または選択された置換基で
誘導体化される。
PCT/US91/00243、出願番号第463,358号および出願番
号第566,977（これらの記載は本明細書の一部としてこ
こに含まれる）は、オリゴヌクレオチドのヌクレオシド
への、例えば２′−Ｏ−メチル、２′−Ｏ−エチル、
２′−Ｏ−プロピル、２′−Ｏ−アリル、２′−Ｏ−ア
ミノアルキルまたは２′−デオキシ−２′−フルオロ基
の組込みがオリゴヌクレオチドのハイブリダイゼーショ
ン特性を促進することを記載している。これらの出願は
また、ホスホロチオエート主鎖を含むオリゴヌクレオチ
ドはヌクレアーゼ安定性を促進したことも記載してい
る。本発明の機能性化された連結ヌクレオシドは、さら
にホスホロチオエート主鎖または２′−Ｏ−C1−C20−
アルキル（例えば２′−Ｏ−メチル、２′−Ｏ−エチ
ル、２′−Ｏ−プロピル）、２′−Ｏ−C2−C20−アル
ケニル（例えば、２′−Ｏ−アリル）、２′−Ｏ−C2−
C20−アルキニル、２′−Ｓ−C1−C20−アルキル、２′
−Ｓ−C2−C20−アルケニル、２′−Ｓ−C2−C20−アル
キニル、２′−NH−C1−C20−アルキル（２′−Ｏ−ア
ミノアルキル）、２′−NH−C2−C20−アルケニル、
２′−NH−C2−C20−アルキニルまたは２′−デオキシ
−２′−フルオロ基のいずれかまたは両方を含むように
拡大しうる。例えば、1992年７月23日に出願された出願
番号第918,362号（この記載は本明細書の一部としてこ
こに含まれる）を参照されたい。
その５′末端にアミノ基を持つオリゴヌクレオチドを
DNA合成装置を用いて製造し、次に本発明の置換基（例
えばコール酸）の活性エステル誘導体と反応させる。活
性エステル誘導体は当業者にはよく知られている。代表
的活性エステルにはＮ−ヒドロスクシンイミド エステ
ル、テトラフルオロフェノール酸エステル、ペンタフル
オロフェノール酸エステルおよびペンタクロロフェノー
ル酸エステルが含まれる。コール酸については、アミノ
基と活性エステルとの反応により連結基を介して５′位
にコール酸が結合されたオリゴヌクレオチドが生成され
た。５′末端のアミノ基は前に示した５′−Amino−Mod
ifier C6試薬を利用して都合良く調製できる。
３′−アミノ修飾制御多孔ガラス（Clontech Laborat
ories Inc.,Palo Alto,CAから販売）とコール酸活性エ
ステルとを反応させることにより３′−末端アミノ基へ
コール酸を結合できる。
３′,5′−ジアミノ配列とコール酸活性エステルとを
反応させることにより、連結されたヌクレオシド配列の
両方の末端にコール酸を結合することができる。必要な
オリゴヌクレオシド配列は、前記の３′−Amino−Modif
ierおよび５′−Amino−Modifier C6（またはAminolin
k−２）試薬を利用して、または前記の３′−アミノ修
飾制御多孔ガラス試薬を５′−Amino−Modifier C2
（またはAminolink−２）試薬と組合わせて利用するこ
とにより合成される。
本発明のさらに別の実施態様においては、例えば５′
−ジメトキシトリチル−２′−Ｏ−（ε−フタルイミジ
ルアミノペンチル）−２′−デオキシ−アデノシン−
３′−N,N−ジイソプロピル−シアノエトキシホスホル
アミダイトのような適当な機能性化ヌクレオチドを用い
て、一つまたはそれ以上の選択されたヌクレオシドの
２′位にアミノ連結基を持つオリゴヌクレオシド配列が
製造される。例えば、Manoharan,et al.,Tetrahedron L
etters. 1991,34,7171および前に参照した出願番号第PC
T/US91/00243,566,977および463,358号を参照された
い。１つまたは複数のヌクレオチドが、活性エステルま
たはそのチオイソシアネートを用いてコール酸または別
の置換基に結合される。この方法は１つの連結ヌクレオ
シド配列内へ多数の機能性基を導入することを可能にす
る。実際ヌクレオシドの各々がそのようにして置換でき
る。
さらに本発明の機能性ヌクレオシド配列において、一
つまたはそれ以上のヌクレオシドのヘテロ環塩基がステ
ロイド分子、レポーター分子、非芳香族親油性分子、レ
ポーター酵素、ペプチド、蛋白質、水溶性ビタミン、脂
溶性ビタミン、RNA切断複合体、金属キレート剤、ポル
フィリン、アルキル化剤、ハイブリッドホトヌクレアー
ゼ／インターカレーターまたはアリールアジド光架橋剤
に結合される。Jablonski,et al.,上記文献、により記
載されているような５′−Ｏ−（ジメトキシトリチル）
−５−〔Ｎ−（７−トリフルオロアセチルアミノヘブチ
ル）−３−アクリルアミド〕−２′−デオキシウリジン
−３′−Ｏ−（メチル−N,N−ジイソプロピル）ホスホ
ロアミド（Glen Researchより市販品としても入手可
能）を利用して、所望のヌクレオシド（そのヘテロ環塩
基上の連結基を取り込むように機能性化されている）が
DNA合成装置を用いて連結ヌクレオシド配列内へ取り込
まれる。
レポーター酵素、ペプチドおよび蛋白質の連結ヌクレ
オシドへの複合（結合）は、酵素ペプチドまたは蛋白質
をヌクレオシド上の上記のアミノ連結基に複合させるこ
とにより達成される。このことはいくつかの方法により
達成される。本発明のペプチド機能性化または蛋白質機
能性化ヌクレオシドは、EDC/sulfo−NHS（すなわち、１
−エチル−３（３−ジメチルアミノプロピルカルボジイ
ミド/N−ヒドロキシ−スルホスクシンイミド）を用いる
ペプチドまたは蛋白質のヌクレオシドへの複合、すなわ
ち、レポーター酵素、ペプチドまたは蛋白質のカルボキ
シル末端とヌクレオチド上の連結基のアミノ官能基との
複合により製造できる。さらに、本発明の連結されたヌ
クレオシド配列は、EDC/sulfo−NHSを用い、レポーター
酵素、ペプチドまたは蛋白質中のアスパラギン酸または
グルタミン酸残基のカルボキシル基を連結ヌクレオシド
配列のアミノ官能基に複合させることによっても製造で
きる。
好適には、ヌクレオシド配列上の連結基のアミノ官能
基にレポーター酵素、ペプチドまたは蛋白質上のチオー
ル官能基を連結するｍ−マレインイミドベンゾイル−Ｎ
−ヒドロキシスルホスクシンイミド エステル（MBS）
またはスクシンイミジル ４−（Ｎ−マレインイミドメ
チル）シクロヘキサン−１−カルボキシレート（SMCC）
のようなヘテロ二機能性連結基を介してヌクレオシド配
列にレポーター酵素、ペプチドまたは蛋白質を複合させ
ることにより、レポーター酵素−、ペプチド−、蛋白質
−機能性化連結ヌクレオシド配列が製造できる。この機
構によると、連結ヌクレオシド上の連結基のアミノ基と
MBSまたはSMCCマレイミド連結基との反応によりオリゴ
ヌクレオシド−マレイミド複合体が形成される。次にこ
の複合体を遊離のスルフヒドリル基を持つペプチドまた
は蛋白質と反応させる。
第２の好適な方法においては、配列上の連結基のアミ
ノ基へペプチドまたは蛋白質上のアミノ基を連結するジ
スクシンイミジル スベレート（DSS）のようなホモ二
機能性連結基を用いる配列へのペプチドまたは蛋白質の
複合により、レポーター酵素−、ペプチド−、蛋白質−
機能性化連結ヌクレオシド配列が製造できる。この機構
によると、ヌクレオシド上のアミノ基とジスクシンイミ
ジル基質連結基との反応によりオリゴヌクレオシド−ス
クシンイミジル複合体が形成される。連結基の大きさを
伸ばすためジスクシンイミジル基質連結基を配列上のア
ミン連結基と連結させる。次に伸ばされた連結基を、例
えばレポーター酵素、ペプチドおよび蛋白質上のリジン
のアミンまたは他の利用可能なＮ末端アミンのようなア
ミノ基と反応させる。
本発明のさらなる目的、利点および新規な特色は以下
の実施例の検討により当業者には明らかになるであろう
が、以下の実施例は本発明の制限を意図するものではな
い。
以下の実施例において、無水ジメチルホルムアミド、
コール酸およびＮ−ヒドロキシスクシンイミドはAldric
h Chemical Co.（Milwaukee,WI）から購入された。エチ
ル−３−（３−ジメチルアミノ）プロピルカルボジイミ
ド（EDACまたはEDC）は遊離塩基としてEDACのラベルでJ
BL Scientific（San Luis Obispo,CA）から、またはED
CのラベルでPierce（Rockford,IL）から得られた。Amin
olink−２はABIから購入されおよび３′−Amino−Modif
ier,5′−Amino−Modifier C6およびAmino−Modifier d
T試薬はGlen Research Corporationから購入された。NM
RスペクトルはVarian Unity−400の装置で測定された。
オリゴヌクレオチド合成はApplied Biosystems380Bまた
は394DNA合成装置上、製造社により供給された試薬を用
いる標準ホルホロアミダイトプロトコールに従って実施
された。修飾ホルホロアミダイトが使用された場合、よ
り長い結合時間（10−15分）が用いられた。HPLCはモデ
ル991検出器を備えたWaters600E装置で実施された。特
に指示しない限り、以下の条件が分析用クロマトグラフ
ィーに使用された:Hamilton PRP−１カラム（15×2.5c
m）；溶媒A:50mMTEAA,pH7.0;溶媒B:80％CH3CNを含む45m
MTEAA;流速:1.5ml/分；グラジエント:5％Ｂ最初の５
分、その後１分毎にＢを直線的（１％）に増加および分
取の目的には:Waters Delta Pak Ｃ−４カラム；流速:
5ml/分；グラジエント：最初の10分間５％B,その後１分
毎に直線的に増加（１％）。
すべてのオリゴヌクレオチドは標準的に左から右へ
５′から３′の順でリストされている。
実施例１ コール酸Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド エステル（化
合物１） コール酸（4.09g,15ミリモル）およびＮ−ヒドロキシ
スクシンイミド（5.25g,45ミリモル）の混合物に無水DM
F（150ml）を加えた。混合物は窒素雰囲気下撹拌した。
次にEDAC（4ml,25ミリモル）を加え、混合物を一夜撹拌
した。反応液は次にゴム状になるまで蒸発させ、1:1の
酢酸エチルおよび４％NaHCO3溶液（pH7.9）（各々100m
l）に分配させた。有機層を飽和NaCl溶液で洗浄し、無
水Na2SO4で乾燥させて蒸発させると淡黄色あわ状物質と
して表記化合物を得た（4.6g,91％）。13 C NMR（DMSO−d6）δ12.27,16.71,22.58,22.80,25.4
2,26.19,27.20,28.49,30.41,30.56,34.36,34.82,34.82,
35.31,39.09,39.09,41.38,41.53,45.84,46.05,66.25,7
0.45,71.03,169.28および170.16。
実施例２ ヘテロ環塩基コール酸末端標識オリゴデオキシヌクレオ
チド 配列： オリゴマー:TTG CTT＊CCA TCT TCC TCG TC （ここでＴ＊は２′−デオキシウリジン ヌクレオチド
のヘテロ環塩基への連結基を経て連結されているコール
酸を含むように機能性化されているヌクレオチドを表わ
している）のオリゴヌクレオチドは１マイクロモルの規
模で製造された。オリゴマー１はHPVアンチセンス オ
リゴヌクレオチドとして有用である。
A.中間体連結基の製造 構造−CH＝CH−Ｃ（Ｏ）−NH−（CH2）６−NH−Ｃ
（Ｏ）−CF3の連結基は、Amino−Modifier−dTとしてGl
en Research Corporationから入手した適切な保護化お
よび活性化２′−デオキシウリジン ホスホロアミド中
間体を経て導入された。連結基を持ったオリゴヌクレオ
チドは脱保護し、HPLCにより精製した。
B.コール酸 機能性化オリゴヌクレオチドの製造 実施例２−Ａの連結基を持つオリゴヌクレオチドの一
部（約100O.D.単位,550ナノモル）を500μの0.2MNaHC
O3緩衝液に溶解し、この溶液にコール酸Ｎ−ヒドロキシ
スクシンイミドエステル（化合物1,75mg,149マイクロモ
ル）を加えて45℃に一夜加熱した。次にこの溶液はセフ
ァデックスＧ−25（1.0×25cm）カラムを通過させた。
オリゴヌクレオチド分画を2mlまで濃縮し、続いてHPLC
にて精製するとコール酸がヘテロ環塩基のＣ−５に内部
的に連結された所望の複合体が得られた。
実施例３ ５′−末端 コール酸末端標識オリゴデオキシヌクレオ
チド オリゴヌクレオチド配列の５′末端に結合されたコー
ル酸を持つホスホロチオエート オリゴヌクレオチド： オリゴマー2:5′−CHA−CsTsGs TsCsTs CsCsAs TsCsTs
TsCsAs CsT （ここでCHAはコール酸を表わし、および下付き文字
“s"はホスホロチオエートヌクレオチド間 バックボー
ン連結を表わしている）が製造された。
A.中間体連結基の製造 ５′末端アミノ基を持つオリゴヌクレオチド配列はホ
スホロアミダイト方法論を用いるDNA合成装置の標準法
により３×1.0マイクロモルのスケールで合成された。
ホスホロチオエート ヌクレオチド間バックボーンはホ
スホロチオエート試薬（Beaucage試薬、すなわち、3H−
1,2−ベンゾジチオエート−３−オン1,1−ジオキシド;R
adhakrishuan,et al.,J.Am.Chem.Soc., 1990,112,1253
参照）を用いて形成された。オリゴヌクレオチド合成の
最後の工程でAminolink−２試薬が使用された。濃NH4OH
中55℃で16時間脱保護すると５′−アミノ連結基−オリ
ゴヌクレオチドを得る。
B.コール酸 機能性化オリゴヌクレオチドの製造 実施例３−Ａの粗５′−アミノ連結基−オリゴヌクレ
オチド（100O.D.単位,260nmでの計算吸光係数1.6756×1
05に基づくと約600ナノモル）を新しく調製したNaHCO3
緩衝液（500μ,0.2M,pH8.1）に溶解し、200μのDMF
に溶解したコール酸Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエス
テル（化合物1.75mg,149マイクロモル）溶液で処理し
た。反応混合物は45℃に一夜加熱した。この溶液は次に
セファデックスＧ−25（1.0×25cm）カラムを通過させ
た。オリゴヌクレオチド分画を2mlまで濃縮し、続いてH
PLCにて精製すると54O.D.単位の所望の複合体を得た（5
4％収率）。HPLCの保持時間は未反応オリゴヌクレオチ
ドおよびオリゴヌクレオチド合成の間に生成される副生
配列が37.42であり、最終生成物は54.20であった。
実施例４ ３′末端コール酸末端標識オリゴデオキシヌクレオチド A.3′末端コール酸オリゴヌクレオチド オリゴヌクレオチド配列の３′末端にコール酸を持つ
ホスホロチオエートオリゴヌクレオチド： オリゴマー3:CsTsGs TsCsTs CsCsAs TsCsCs TsCsTs TsC
sAs CsT3′−CHA （ここでCHAはコール酸を表わし、下付き文字“s"はホ
スホロチオエートヌクレオチド間バックボーン連結を表
わしている）が製造された。
1.中間体連結基の製造 ３′末端アミノ基を持つオリゴヌクレオチド配列はCl
ontch Laboratories（Palo Alto.CA）からの３′−アミ
ノ修飾制限細孔ガラス（CPG）を固体支持体として用い
て合成された。上記のBeaucage試薬がホスホロチオエー
ト ヌクレオチド間バックボーンを形成させるのに利用
された。合成は“トリチル−オフ”様式で実施された。
得られた固形支持物は濃NH4OH中55℃にて16時間脱保護
された。セファデックスＧ−25カラムにより精製して上
記のオリゴヌクレオチド配列の３−アミノ機能性化ホス
ホロチオエート オリゴヌクレオチドを得た。
2.コール酸機能性化オリゴヌクレオチドの製造 実施例４−Ａ−１の粗オリゴヌクレオチド（50O.D.単
位 約300ナノモル）を実施例３の方法にならってコー
ル酸Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル（化合物1,
40mg）と反応させた。HPLC保持時間は出発オリゴヌクレ
オチドが37.45であり、生成物は51.68であった。
B.3′末端コール酸オリゴヌクレオチド その３′末端に結合されたコール酸およびオリゴヌク
レオチド配列： オリゴマー4:TsGsGs GsAsGs CsCsAs TsAsGs CsGsA GsGs
Cs3′−CHA （式中、CHAはコール酸を表わし、下付き文字“s"はホ
スホロチオエートヌクレオチド間バックボーン結合を表
わしている）を持つホスホロチオエートオリゴヌクレオ
チドが実施例４−Ａ−２のオリゴヌクレオチドの方法と
同じ方法で製造された。
実施例５ ３′末端コール酸および５′末端コール酸二重末端標識
オリゴデオキシヌクレオチド オリゴヌクレオチド配列の３′末端および５′末端の
両方に結合されたコール酸を持つホスホロチオエート
オリゴヌクレオチド： オリゴマー5:5′−CHA CsTsGs TsCsTs CsCsAs TsCsTs T
sCsAs CsT3′−CHA （式中、CHAはコール酸を表わし、下付き文字“s"はホ
スホロチオエートヌクレオチド間バックボーン結合を表
す）が３×1.0マイクロモルのスケールで合成された。
オリゴマー５はコール酸で機能性化されていることを除
くとオリゴマー１と同じ配列を持っている。
A.中間体連結基の製造 オリゴヌクレオチド合成はCloutech Laboratoriesか
らの３′−アミノ修飾制限細孔ガラス（CPG）を固体支
持体として用いて実施された。オリゴヌクレオチド合成
は上記実施例４のごとくホスホロアミダイト合成方法論
およびBeaucage試薬を利用して実施された。基本的配列
合成完了後、DNA合成装置に入れたまま、オリゴヌクレ
オチドの５′末端ヘアノミ官能基を導入するためAminol
ink−２試薬が使用された。濃水酸化アンモニウムで脱
保護し、セファデックスＧ−25カラムで精製すると
３′,5′−ジアミノ連結基オリゴヌクレオチドが得られ
た。
B.コール酸機能性化オリゴヌクレオチドの製造 粗ジアミノ連結基オリゴヌクレオチド（50O.D.単位,2
60nmでの計算吸光係数1.6756×105に基づくと約300ナノ
モル）を新しく調製したNaHCO3緩衝液（500μ,0.2M,p
H8.1）に溶解し、コール酸Ｎ−ヒドロキシスクシンイミ
ドエステル（化合物1.50mg、98.6マイクロモル）を200
μのDMFに溶解した溶液で処理した。反応混合物は45
℃にて一夜加熱した。次に反応液をセファデックスＧ−
25カラム（1.0×25cm）を通過させた。オリゴヌクレオ
チド分画を2mlまで濃縮し、逆相HPLCで精製した。保持
時間は未反応オリゴヌクレオチドが37.76、３′−コー
ル酸結合オリゴヌクレオチドが51.65、５′−コール酸
結合オリゴヌクレオチドが54.34、および３′,5′−ジ
−コール酸結合オリゴヌクレオチドが58.75であった。5
8.75分の生成物をセファデックスＧ−25カラムで脱塩す
ると11O.D.単位（22％）の所望の生成物を得た。
実施例６ ３′末端コール酸または５′末端コール酸機能性化２′
−Ｏ−メチル誘導化オリゴデオキシヌクレオチド オリゴヌクレオチド配列の３′末端かまたは５′末端
に結合されたコール酸を持ち、さらにオリゴヌクレオチ
ドのヌクレオチドの各々に２′−Ｏ−メチル基を含むよ
うに一様に機能性化されているホスホロチオエート オ
リゴヌクレオチドが合成された。一様な２′−Ｏ−メチ
ル置換基を持つ以下のオリゴヌクレオチドが合成され
た： オリゴマー6:5′−CHA CCC AGG CUC AGA ３′； オリゴマー7:5′CCC AGG CUC AGA ３′−CHA;およ
び オリゴマー8:5′−CHA GAG CUC CCA GGC ３′． A.中間体連結基の製造 中間体５′または３′−アミノ連結基オリゴヌクレオ
チドはChemgenes Inc.（Needham,MA）から入手可能な
２′−Ｏ−メチル ホスホロアミダイト ヌクレオチド
およびホスホロアミダイト化学を利用し、各々実施例３
および４に従って実施された。各々の中間体オリゴヌク
レオチドは濃NH4OHで脱保護され、濃縮され、セファデ
ックスＧ−25カラムで脱塩された。
B.コール酸機能性化オリゴヌクレオチドの製造 実施例６−Ａ−１から得られた粗オリゴヌクレオチド
（30から40O.D.単位、260nmでのオリゴマー６、７およ
び８の各々の計算吸光係数（それぞれ1.1797×105,1.17
77×105および1.1481×105）に基づくと250−350ナノモ
ル）を乾燥し、250μの0.2M NaHCO3緩衝液に溶解さ
せ、500μの0.2M NaHCO3緩衝液および200μのDMF
に溶解したコール酸Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエス
テル（化合物1,30から40mg、60から80マイクロモル）の
溶液を加えて40−45℃の間で12−24時間加熱した。反応
混合物は蒸発させて2mlの水に溶解して３×2mlの酢酸エ
チルで洗浄した。得られた水性溶液は逆相HPLCにより精
製した。オリゴマー６に対してのHPLC保持時間は、出発
オリゴヌクレオチド物質が34.65で生成物は58.75であ
り；オリゴマー７に対してのHPLC保持時間は出発オリゴ
ヌクレオチド物質が37.23および生成物が55.32であり；
およびオリゴマー８に対してのHPLC保持時間は、出発オ
リゴヌクレオチド物質が34.99および生成物が56.98であ
った。生成物は濃縮し、セファデックスＧ−25カラムで
脱塩した。各々の場合においての平均収率は約20％であ
った。
実施例７ ２′−保護−アミン終結連結基を持つオリゴヌクレオチ
ド A.5′−ジメトキシトリチル−２′−（Ｏ−フェニル−
Ｎ−フタルイミド）−２′−デオキシアデノシンホスホ
ロアミダイト（化合物２） 所望のオリゴヌクレオチド配列内のヌクレオチドの
２′位に機能性を導入するため、オリゴヌクレオチドの
ヌクレオチド成分の２′位へ結合された連結基を提供す
るのに５′−ジメトキシトリチル−２′−（Ｏ−ペンチ
ル−Ｎ−フタルイミド）−２′−デオキシアデノシンホ
スホロアミダイト（化合物２）が利用された。化合物２
はアデノシンから出発して上記の特許出願US91/00243お
よび463,358に従って合成された。簡単に記すと、この
方法ではアデノシンをDMF中NaHで処理し、続いてＮ−
（５−ブロモペンチル）フタルイミドで処理する。さら
に（CH3）3SiCl,Ph−Ｃ（Ｏ）−ClおよびNH4OHで処理す
るとN6ベンジル保護２′−ペンチル−Ｎ−フタルイミド
機能性化アデノシンを得た。DIPAおよびCH2Cl2での処理
により５′位にDMT保護基が加えられる。最後にホスフ
ァイト化すると所望のホスホロアミダイト化合物である
化合物２を与える。化合物２はDNA合成装置で無水CH3CN
中0.09Mの溶液として使用された。オリゴヌクレオチド
合成は化合物２のオリゴヌクレオチド配列内への結合の
結合時間を10分に延長した標準合成サイクルを用いたAB
I390Bまたは394合成装置にて実施された。98％以上の結
合効率が化合物２の結合に観察された。
B.ホスホジエステル オリゴヌクレオチドを含む２′−
保護−アミン連結基 ホスホジエステル ヌクレオチド間結合を持つ以下の
オリゴヌクレオチドが合成された： オリゴマー9:5′TA＊Ｇ ３′； オリゴマー10:5′CCA＊Ｇ ３′； オリゴマー11:5′GGC TGA＊CTG CG ３′； オリゴマー12:CTG TCT CCA＊TCC TCT TCA CT;およ
び オリゴマー13;CTG TCT CCA＊TCC TCT TCA＊CT （式中Ａ＊はペンチル−Ｎ−フタルイミド機能性を取り
込むように機能性化されたヌクレオチドを表わしてい
る）。オリゴマー12および13はウシパピローマウイルス
−１（BPV−１）のE2領域に対するアンチセンス化合物
である。オリゴマー12および13は２′の修飾を除くとオ
リゴマー３と同じ配列を持っている。オリゴヌクレオチ
ドは10マイクロモル スケールかまたは３×１マイクロ
モル スケールにて“トリチル−オン”様式で合成され
た。標準脱保護条件（30％NH4OH,55℃,24時間）が用い
られた。オリゴヌクレオチドは逆相HPLC（Waters Delta
−Pak C415μm,300A,同じ充填剤のガードカラムを付け
た25×100mmカラム）にて精製された。次に脱トリチル
化され、セファデックスＧ−25カラムを用いるサイズ排
除によりさらに精製された。プロトンおよびリンNMR両
方のNMR分析によりオリゴマー９および10に対して期待
される構造が確認された。
C.ホスホロチオエート オリゴヌクレオチドを含む２′
−保護−アミン連結基 ホスホロチオエート ヌクレオチド間結合を持つ以下
のオリゴヌクレオチドが合成された： オリゴマー14:TsTsGs CsTsTs CsCsA＊ s TsCsTs TsCsCs
TsCsGs TsC; オリゴマー15:TsGsGs GsAsGs CsCsAs TsAsGs CsGsA＊ s
GsGsC;および オリゴマー16:TsGsGs GsA＊ sGs CsCsA＊ s TsA＊ sGs CsG
sA＊ s GsGsC （式中、Ａ＊はペンチル−Ｎ−フタルイミド機能性を取
り込むように機能性化されたヌクレオチドを表わし、下
付き文字“s"はホスホロチオエート ヌクレオチド間バ
ックボーン結合を表わしている）。オリゴマー14はウシ
パピローマウイルス１（BPV−１）のE2領域に対しての
アンチセンス化合物である。オリゴマー15および16はIC
AMに対するアンチセンス化合物である。オリゴマー14は
２′修飾を除いてオリゴマー３と同じ配列を持ってお
り、一方オリゴマー15および16は２′修飾を除いてオリ
ゴマー４と同じ配列を持っている。これらのオリゴヌク
レオチドは実施例７−Ｂの方法に従って合成されたが、
ただし合成のホスファイト部分の酸化においてはBeauca
ge試薬（上記実施例３参照）が無水CH3CN溶媒の0.24M溶
液として使用された。オリゴヌクレオチドは“トリチル
−オン”様式で合成され、実施例７−Ｂの精製法を利用
して逆相HPLCにより精製された。
D.RNAオリゴヌクレオチドを含む２′−Ｏ−メチル誘導
化２′−保護アミン連結基 ２′−保護アミン機能性で機能性化されていない各々
のヌクレオチド上に２′−Ｏ−メチル基を持つ以下のオ
リゴヌクレオチドが合成された： オリゴマー17:CCA Ａ＊GC CUC AGA;および オリゴマー18:CCA GGC UCA GA＊Ｔ （式中、Ａ＊はペンチル−Ｎ−フタルイミド機能性を取
り込むように機能性化されたヌクレオチドを表わし、
３′末端ヌクレオチドを除く残りのヌクレオチドは各々
２′−Ｏ−メチル誘導化ヌクレオチドである）。オリゴ
ヌクレオチド17および18の３′末端ヌクレオチドは２′
−デオキシヌクレオチドである。オリゴマー17および18
は両方ともHIV−１ TAR領域に対するアンチセンス化合
物である。オリゴヌクレオチドは、ペンチル−Ｎ−フタ
ルイミド機能性を含むヌクレオチドの導入には化合物２
を用いる実施例６の方法を利用し、残りのRNAヌクレオ
チドにはChemgenes Inc.（Needham,MA）からの適当なＯ
−メチルホスホロアミダイトヌクレオチドを利用して合
成された。３′末端終結２′−デオキシヌクレオチドは
DNA合成装置で利用される標準ホスホロアミダイトであ
った。オリゴヌクレオチドは実施例７−Ｂの方法に従っ
て脱保護および精製された。
実施例８ ２′位でのオリゴヌクレオチドの機能性化 A.ビオチンによる機能性化 1.単一部位修飾 約10O.D.単位（A260）のオリゴマー12（実施例７参
照）（計算吸光係数1.6756×105に基づくと約60ナノモ
ル）をマイクロフュージチューブ内で乾燥した。オリゴ
ヌクレオチドは200μの0.2M NaHCO3緩衝液に溶解
し、Ｄ−ビオチン−Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエス
テル（2.5mg,7.3マイクロモル）（Sigma,St.Louis,MO）
を加え、続いて40μのDMFを加えた。溶液は一夜放置
した。反応液をセファデックスＧ−25カラム（0.7×15c
m）に加え、オリゴヌクレオチド分画を合わせた。分析H
PLCは85％近くの生成物への変換を示した。生成物をHPL
Cで精製し（991検出器を付けたWaters600E,Hamilton P
RP−１カラム0.7×15cm;溶液A:50mM TEAA pH7.0;B:80
％のアセトニトリルを含む45mM TEAA:流速1.5ml:濃度
勾配：最初の５分５％B,その後１分毎にＢを直線的に増
加（１％））、さらにセファデックスＧ−25で脱塩する
とオリゴヌクレオチド： オリゴマー19:CTG TCT CCA＊ TCC TCT TCA CT （式中、Ａ＊は示されたヌクレオチドの２′位へ２′−
Ｏ−ペンチルアミノ連結基を介して連結されている機能
性ビオチンを組込むように機能性化されているヌクレオ
チドを表わしている）を得た。HPLC保持時間は下記表１
に示されている。
2.多部位修飾 約10O.D.単位（A260）のオリゴマー13（実施例７参
照、約60ナノモル）を実施例８−Ａ−１の方法を用いて
300μの0.2M NaHCO3緩衝液/50μDMF中、Ｄ−ビオ
チン−Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル（5mg）
で処理した。分析HPLCは65％の二重標識オリゴヌクレオ
チド生成物および30％の単一標識生成物（二つの利用可
能反応部位のうち）を示した。HPLCおよびセファデック
スＧ−25精製によりオリゴヌクレオチドを得た： オリゴマー20:CTG TCT CCA＊TCC TCT TCA＊CT （式中、Ａ＊は示されたヌクレオチドの２′位へ２′−
Ｏ−ペンチルアミノ連結基を介して連結されている機能
性ビオチンを組込むように機能性化されているヌクレオ
チドを表わしている）。この生成物（および付随する単
一標識生成物）のHPLC保護時間は下記表１に示されてい
る。
B.フルオレセインによる機能性化 1.単一部位修飾 1M NaHCO3を1M Na2CO3に加えることにより1M Na2C
O3/1M NaHCO3緩衝液（pH9.0）が調製された。200μ
のこの緩衝液をマイクロフュージチューブ中の10O.D.単
位のオリゴマー12（実施例７）に加えた。10mgのフルオ
レセイン−イソシアネートを500μのDMFに加えて0.05
M溶液を作った。100μのフルオレセイン溶液をマイク
ロフュージチューブ中のオリゴヌクレオチド溶液に加え
た。チューブをアルミニウムホイルで覆って一夜放置し
た。反応混合物を25％（v/v）のエチルアルコールを含
む水で平衡化されているセファデックスＧ−25カラム
（0.7×20cm）へ加えた。カラムは同一溶媒で溶出され
た。生成物の移動度は過剰のフルオレセイン試薬の濃い
黄色バンドから良く分離された黄色バンドとして観察す
ることができた。260nmおよび485nmに吸収を示す分画を
合わせ、実施例８−Ａ−１の精製法に従ってHPLCにより
精製した。分析HPLCは81％の二重に機能性化された所望
のオリゴヌクレオチドを示した。この生成物を凍結乾燥
させセファデックスで脱塩するとオリゴヌクレオチド： オリゴマー21:CTG TCT CCA＊ TCC TCT TCA CT （式中、Ａ＊は示されたヌクレオチドの２′位へ２′−
Ｏ−ペンチル−アミノ連結基を介して連結された機能性
フルオレセインを組込むように機能性化されたヌクレオ
チドを表わしている）を得た。HPLC保持時間は下記表１
に示されている。
2.多部位修飾 10O.D.単位（A260）のオリゴマー13（実施例７から）
を300μの実施例８−Ｂ−１の1M NaHCO3/1M Na2CO3
緩衝液に溶解して、200μの実施例８−Ｂ−１のフル
オレセイン−イソチオシアネート貯蔵溶液を加えた。得
られた溶液は実施例８−Ｂ−１に従って処理された。分
析HPLCは61％の二重標識生成物および38％の単一標識生
成物を示した。反応液の後処理によりオリゴヌクレオチ
ド： オリゴマー22:CTG TCT CCA＊TCC TCT TCA＊CT （式中、Ａ＊は示されたヌクレオチドの２′位へ２′−
Ｏ−ペンチル−アミノ連結基を介して連結された機能性
フルオレセインを組込むように機能性化されたヌクレオ
チドを表わしている）を得た。HPLC保持時間は下記表１
に示されている。
C.コール酸による機能性化 1.単一部位修飾 100O.D.単位（A260）のオリゴマー12（実施例７参
照）を200μ0.2M NaHCO3緩衝液/40μDMF中コール
酸−NHSエステル（化合物1,5mg,9.9マイクロモル）で処
理した。反応混合物は45℃で16時間加熱した。生成物は
実施例８−Ａ−１の方法に従って単離された。分析HPLC
は85％以上の生成物形成を示した。反応液の後処理によ
りオリゴヌクレオチド： オリゴマー23:CTG TCT CCA＊TCC TCT TCA CT （式中、Ａ＊は示されたヌクレオチドの２′位へ２′−
Ｏペンチル−アミノ連結基を介して連結された機能性コ
ール酸を組込むように機能性化されたヌクレオチドを表
わしている）が得られた。HPLC保持時間は下記表１に示
されている。
2.多部位修飾 10O.D.単位（A260）のオリゴマー13（実施例７参照）
を300μの0.2M NaHCO3緩衝液/50μDMF中コール酸
−NHSエステル（化合物1,10mg,19.8マイクロモル）で処
理した。反応混合物は45℃で16時間加熱した。生成物は
実施例８−Ａ−１の方法に従って単離された。分析HPLC
は58％の二重標識生成物、17％の第１の単一標識生成物
および24％の第２の単一標識生成物を示した。実施例８
−Ａ−１に従って後処理するとオリゴヌクレオチド： オリゴマー24:CTG TCT CCA＊TCC TCT TCA＊CT （式中、Ａ＊は示されたヌクレオチドの２′位へ２′−
Ｏ−ペンチル−アミノ連結基を介して連結された機能性
コース酸を組込むように機能性化されたヌクレオチドを
表わしている）が得られた。HPLC保持時間は下記表１に
示されている。
D.ジゴキシゲニンによる機能性化 1.単一部位修飾 10O.D.単位（A260）のオリゴマー12（実施例７参照）
を200μの0.1Mホウ酸pH8.3緩衝液/40μのDMF中、ジ
ゴキシゲニン−３−Ｏ−メチルカルボニル−ε−アミノ
カプロン酸Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル（Bo
ehringer Mannheim Corporation,Indianapolis,IN）で
処理した。反応混合物は一夜放置された。生成物は実施
例８−Ａ−１の方法に従って単離された。反応液の後処
理によりオリゴヌクレオチド： オリゴマー25:CTG TCT CCA＊TCC TCT TCA CT （式中、Ａ＊は示されたヌクレオチドの２′位へ、２′
−Ｏ−ペンチル−アミノ連結基を介して連結された機能
性ジゴキシゲニンを組込むように機能性化されたヌクレ
オチドを表わしている）が得られた。HPLC保持時間は下
記表１に示されている。
2.多部位修飾 10O.D.単位（A260）のオリゴマー13（実施例７参照）
を300μの0.1Mホウ酸pH8.3緩衝液/50μのDMF中、ジ
ゴキシゲニン−３−Ｏ−メチルカルボニル−ε−アミノ
カプロン酸Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル（Bo
ehringer Mannheim Corporation,Indianapolis,IN）で
処理した。反応混合物は一夜放置した。生成物は実施例
８−Ａ−１の方法に従って単離された。
実施例８−Ａ−１に従って後処理するとオリゴヌクレ
オチド： オリゴマー26:CTG TCT CCA＊TCC TCT TCA＊CT （式中、Ａ＊は示されたヌクレオチドの２′位へ２′−
Ｏ−ペンチル−アミノ連結基を介して連結された機能性
ジゴキシゲニンを組込むように機能性化したヌクレオチ
ドを表わしている）が得られた。HPLC保持時間は下記表
１に示されている。
実施例９ レポーター酵素、ペプチドおよび蛋白質による２′位で
のオリゴヌクレオチドの機能性化 A.ヘテロ二機能性連結基の使用 1.オリゴヌクレオチド−マレイミド複合体の合成 オリゴマー12（実施例７）（100O.D.単位,600ナノモ
ル）を5mlのナシ型フラスコ中で凍結乾燥した。スルフ
ォーSMCC試薬、Pierce Chemical Co.（Rockford,IL）
（16mg、46マイクロモル）をリン酸緩衝液（800μ、
0.1M,pH7.0）に溶解してオリゴヌクレオチドが含まれて
いるフラスコへ加えた。試薬の洗浄にさらに200μの
緩衝液を使い、それをオリゴヌクレオチドフラスコに移
した。フラスコの内容物を一夜撹拌し、フラクションコ
レクターを備えたセファデックスＧ−25カラム（１×40
cm）へ加えた。オリゴヌクレオチド−マレイミド複合体
含有分画を集め、他のNHS型生成物からの分離を分析HPL
Cで試験した。
2.オリゴヌクレオチド−ペプチド複合体の合成 実施例９−Ａ−１のオリゴヌクレオチド−マレイミド
複合体の一部（約50O.D.単位、300ナノモル）をマイク
ロフュージチューブ中で凍結乾燥した。SV40ペプチド
（pro−asp−lys−lys−arg−lys−cys）（2.5mg,約2.5
マイクロモル）をリン酸緩衝液（800μ,0.1M,pH7.0）
にとり、オリゴヌクレオチド−マレイミド複合体含有チ
ューブに加えた。チューブの内容物はアルゴン雰囲気下
で一夜撹拌した。反応混合物をセファデックスＧ−25カ
ラムを通し、オリゴヌクレオチド−ペプチド複合体分画
はHPLCで同定した。HPLCおよびセファデックスＧ−25上
の脱塩による生成物含有分画からの生成物の単離により
配列： オリゴマー27:CTG TCT CCA＊TCC TCT TCA CT 〔式中、Ａ＊は示されたヌクレオチドの２′位へ２′−
Ｏ−ペンチル−アミノ−スルフォ−SMCC（スルフォスク
シンイミジル−４−（Ｎ−マレイミドメチル）シクロヘ
キサン−１−カルボキシレート）連結基を介して、連結
された機能性SV40ペプチドを組込むように機能性化され
たヌクレオチドを表わしている〕のオリゴヌクレオチド
が得られる。
B.ホモ二機能性連結基の使用 1.オリゴヌクレオチド−ジスクシンイミジル スベレー
ト複合体の合成 オリゴマー12（実施例７）の一部（10O.D.単位,60ナ
ノモル）を、蒸発乾固し、新しく調製した0.1M NaHCO3
/50mM EDTA（100μ,pH8.25）に溶解した。この溶液
は次にDSS,Pierce Chemical Co.（Rockford,Il）（2.6m
g,7マイクロモル）のDMSO（200μ）溶液で処理した。
反応液は室温で15分間保持し、その後４℃にて水で前も
って充填および洗浄したセファデックスＧ−25カラム
（１×40cm）に直ちに加えた。オリゴヌクレオチド分画
を25mlのナシ型フラスコに直ちに合わせ、ドライアイス
／イソプロピルアルコール中で急速に凍結させ、凍結乾
燥して粉末にした。
2.オリゴヌクレオチド−蛋白質複合体の合成 子ウシ腸アルカリ性ホスファターゼ（Boehringer Man
nheim）（20.6mg,2.06ml,147ナノモル）の溶液をその容
量が50μ未満になるまで４℃にて6000rpmでCentricon
微量濃縮器中で回転させた。次にそれを1mlの冷トリス
緩衝液（pH8.5,0.1M,0.1NaClおよび0.05M MgCl2含有）
に再溶解し、二回以上濃縮した。最後に濃縮液を400μ
の同じ緩衝液に溶解した。この溶液を実施例９−Ｂ−
１からの活性化オリゴヌクレオチドへ加え、反応液は室
温で18時間保存した。生成物は約30mlに希釈し、４℃に
維持されたセファデックスＧ−25カラム（１×20cm,塩
素型）に加えた。カラムは溶出された分画のUV吸収がほ
とんどゼロになるまで50nMトリス−Cl pH8.5で溶出し
た。カラムは続いて0.05Mから0.75M（各々150ml）のNaC
l塩濃度勾配を付けて溶出した。異なったピークはオリ
ゴヌクレオチドおよびアルカリ性ホスファターゼ活性の
両方でアッセイを行い、生成物を含む分画を合わせた。
典型的には最初のピークは過剰の酵素、第２のピークは
オリゴヌクレオチド−蛋白質複合体および第３のピーク
は未反応オリゴヌクレオチドである。HPLCおよびセファ
デックスＧ−25での脱塩による生成物含有分画からの生
成物の単離により配列： オリゴマー28:CTG TCT CCA＊TCC TCT TCA CT 〔式中、Ａ＊は示されたヌクレオチドの２′位へ２′−
Ｏ−ペンチル−アミノ−スルフォ−SMCC（スルフォスク
シンイミジル−４−（Ｎ−マレイミドメチル）シクロヘ
キサン−１−カルボキシレート）連結基を介して連結さ
れている機能性アルカリ性ホスファターゼを組込むよう
に機能性化されているヌクレオチドを表わしている〕の
オリゴヌクレオチドが得られる。
実施例10 ヘテロ環塩基ペプチド複合オリゴヌクレオチド 実施例９−Ａ−１の方法を利用し、実施例２−Ａの中
間体アミノ連結基オリゴヌクレオチドとスルフォ−SMCC
試薬を反応させた。単離されたオリゴヌクレオチド−マ
レイミド複合体は続いて実施例９−Ａ−２に従ってSV40
ペプチドとさらに反応させた。これにより構造： オリゴマー29:TTG CTT＊CCA TCT TCC TCG TC （式中、Ｔ＊は２′−デオキシウリジンヌクレオチドの
ヘテロ環塩基へ伸長連結基を介して連結されたペプチド
を含むように機能性化されたヌクレオチドを表わしてい
る）のオリゴヌクレオチドが得られる。
実施例11 ３′末端蛋白質複合オリゴヌクレオチド 実施例９−Ｂ−１の方法を利用し、実施例６−Ａの
２′−Ｏ−メチル誘導化中間体アミノ連結基オリゴヌク
レオチドをDSS試薬と反応させる。単離されたオリゴヌ
クレオチド−ジスクシンイミジル スベレート複合体は
続いて実施例９−Ｂ−２の方法を用いてリジン含有ヌク
レアーゼRNaseHとさらに反応させる。このことにより構
造： オリゴマー30:CsCsCs AsGsGs CsUsCs AsGsA−３′−蛋
白質 （式中、蛋白質はRNaseHを表わし、下付き文字“s"はホ
スホロチオエートヌクレオチド間バックボーン結合を表
わし、オリゴヌクレオチドのヌクレオチドの各々はその
中に２′−Ｏ−メチル基を含んでいる）のオリゴヌクレ
オチドが得られる。
実施例12 ５′末端蛋白質複合２′−Ｏ−メチル誘導化オリゴヌク
レオチド 実施例９−Ｂ−１の方法を利用し、実施例６−Ａの
２′−Ｏ−メチル誘導化中間体アミノ連結基オリゴヌク
レオチド（オリゴマー６）をDSS試薬と反応させた。単
離されたオリゴヌクレオチド−ジスクシンイミジル ス
ベレート複合体は続いて実施例９−Ｂ−２の方法を用い
てリジン含有ブドウ球菌ヌクレアーゼとさらに反応させ
た。このことにより構造： オリゴマー31:5′−蛋白質−CsCsCs AsGsGs CsUsCs AsG
sA3′ （式中、蛋白質はブドウ球菌ヌクレアーゼを表わし、下
付き文字“s"はホスホロチオエート ヌクレオチド間バ
ックボーン結合を表わし、オリゴヌクレオチドの各々の
ヌクレオチドはその中に２′−Ｏ−メチル基を含んでい
る）のオリゴヌクレオチドが得られる。
方法Ａ つなぎ留められた２′−アミノ部分を含む機能性化オリ
ゴヌクレオチドの構造の確認 本発明のオリゴヌクレオチドはヘビ毒ホスホジエステ
ラーゼおよび子ウシ腸アルカリ性ホスファターゼで個々
のヌクレオシドへ消化された。消化後、ヌクレオシド組
成がHPLCにより分析された。HPLC分析によりつなぎ留め
られた２′−アミノ部分を持つ機能性化ヌクレオチド化
合物はオリゴヌクレオチド内へ正しく組込まれているこ
とが確かめられた。
ヘビ毒ホスホジエステラーゼ〔Boehringer−Mannheim
カタログ番号108260,1mg（1.5単位）/0.5ml〕および子
ウシ腸からのアルカリ性ホスファターゼ（１単位／マイ
クロリットル、Boehringer−Mannheimカタログ番号7130
23）をトリス−HCl緩衝液（pH7.2,50mM）に溶解し、オ
リゴヌクレオチドのその構成ヌクレオシドへの消化に使
用した。0.5O.D.単位のオリゴヌクレオチドを溶解した5
0μの緩衝液（20merに対し約40μＭ最終濃度）に５μ
のヘビ毒ホスホジエステラーゼ（約0.3単位/ml、最終
濃度）および10μのアルカリ性ホスファターゼ（約15
0単位/ml、最終濃度）を加えた。反応混合物は37℃で３
時間インキュベートした。インキュベーションに続いて
反応混合物を逆相分析カラム（約30×2.5cm）を用いてH
PLCにより分析した；溶媒A:50mM TEAA pH7;溶媒B:ア
セトニトリル;10分で100％への濃度勾配、次に５％Ｂで
15分、次に10％Ｂおよび次に洗浄。これらの消化の結果
は代表的オリゴヌクレオチドに対して表２に示されてい
る。
表２から明らかなように、試験オリゴヌクレオチドの
成分ヌクレオチドに対して正しいヌクレオシド比が観察
された。
方法Ｂ コール酸オリゴヌクレオチド複合体の融解温度（Tm）の
決定 その相補的鎖へ結合するオリゴヌクレオチドの相対的
能力がオリゴヌクレオチドおよびその相補的鎖のハイブ
リダイゼーション複合体の融解温度を決定することによ
り比較された。二重らせんの特徴的な物理的性質である
融解温度（Tm）は50％らせん対コイル（ハイブリダイズ
していない）形が存在する温度をセ氏度で示している。
TmはUVスペクトルを用いて測定され、ハイブリダイゼー
ションの形成および破壊（融解）が決定される。ハイブ
リダイゼーションの間に起こる塩基のスタッキングには
UV吸収の減少が伴なう（淡色効果）。したがってUV吸収
の減少はより高いTmを示している。Tmが高ければ高いほ
ど鎖の結合の強さが大きい。非ワトソン−クリック塩基
対形成はTmに対し強い不安定化効果を持っている。した
がって、標的RNAに対してアンチセンスオリゴヌクレオ
チドが最適な結合を持つには塩基対の絶対的な忠実さが
必要である。
1.末端複合体 a.合 成 一連のオリゴヌクレオチドが標準合成法（機能性化さ
れていないオリゴヌクレオチドに対して）または５′末
端アミノ連結基を持つオリゴヌクレオチドに対しては前
記実施例３−Ａの方法または５′末端コール酸含有オリ
ゴヌクレオチドに対しては実施例３−Ｂの方法を利用し
て合成された。各々のオリゴヌクレオチドは次の５−LO
アンチセンス配列を持っていた： ５′TCC AGG TGT CCG CAT Ｃ ３′．ヌクレオ
チドは1.0マイクロモル スケールで合成された。オリ
ゴマー32は正常ホスホジエステルヌクレオチド間結合を
持つ親化合物であった。オリゴマー33は基本オリゴヌク
レオチド配列中にホスホロチオエート ヌクレオチド間
結合が組込まれている。オリゴマー34は基本オリゴヌク
レオチド配列の５′末端に５′−アミノ連結基を持つ中
間体オリゴヌクレオチドであり、オリゴマー35はホスホ
ロチオエートヌクレオチド間結合が組込まれた類似の
５′−アミノ連結基化合物である。オリゴマー36は基本
ホスホジエステル オリゴヌクレオチド配列の５′末端
コール酸複合体であり、一方オリゴマー37はホスホロチ
オエート ヌクレオチド間結合が組込まれた類似の５′
−コール酸複合体である。オリゴマー32および33は“ト
リチル−オン”様式で合成され、HPLCにより精製され
た。オリゴマー34および35は前記実施例30−Ａに従って
Beaucage試薬処理を行なわないでまたは行って合成さ
れ、各々ホスホジエステルまたはホスホロチオエート
ヌクレオチド間結合を得た。オリゴマー36および37はDM
Fに溶解したコール酸Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエ
ステル（化合物１）を利用し実施例３−Ｂに従って各々
オリゴマー34および35の試料から製造された。オリゴマ
ー36および37はHPLCにより精製された。生成物は濃縮さ
れ、セファデックスＧ−25カラムで脱塩された。ゲル電
気泳動分析によっても純粋な生成物が確認され、純粋な
複合体は親オリゴマーヌクレオチドまたは５′−アミノ
機能性化オリゴヌクレオチドよりも遅く移動する。
b.融解分析 試験オリゴヌクレオチド〔本発明またはその他のホス
ホジエステル、ホスホロチオエート、コール酸複合ホス
ホジエステル、コール酸複合ホスホロチエートまたは
５′−アミノ連結中間体ホスホジエステルまたはホスホ
ロチオエートオリゴヌクレオチド〕および相補的DNAま
たはRNAオリゴヌクレオチドを各々のオリゴヌクレオチ
ドに対して４μＭの標準濃度にて緩衝液（100mM NaCl,
10mM Na−リン酸,pH7.0,0.1mM EDTA）中でインキュベ
ートした。試料は90度Ｃに加熱し最初の吸光度をGuilfo
rd Response II分光光度計（Corning）を用いて測定し
た。試料は続いて徐々に15度Ｃまで冷却し、次に熱変性
過程間の260nmでの吸光度の変化をモニターした。温度
は１度上昇させて吸光度を読み取り、融解曲線の一次微
分をとることにより融解ブロフィールを分析した。Tmを
決定するため二状態直線回帰分析を用いてもデータを分
析した。これらの試験の結果はある種の試験化合物のHP
LC保持時間とともに表３に示されている。
表３から明らかなようにオリゴヌクレオチドの末端で
のコール酸の複合はオリゴヌクレオチドのTmには影響し
ない。
2.2′−Ｏ−ペンチルアミノ連結基を組込んだ鎖 a.合 成 配列： オリゴマー38:GGA＊ CCG GA＊Ａ＊ GGT Ａ＊CG Ａ
＊Ｇ （式中、Ａ＊はその２′位にペンチルアミノ官能基を組
込むように機能性化されたヌクレオチドを表わしてい
る）のオリゴヌクレオチドが実施例７−Ｂの方法を利用
して１マイクロモルスケールで合成された。オリゴヌク
レオチドは逆相HPLCで精製され、セファデックスＧ−25
で脱トリチル化および脱塩された。PAGEゲル分析は単一
のバンドを示した。同じ配列を持つが２′−Ｏ−アミノ
連結基を持たないさらなるオリゴヌクレオチド、オリゴ
マー39が標準法により合成された。この配列の相補的DN
Aオリゴヌクレオチド： オリゴマー40:CCT GGC CTT CCA TGC TC もまた標準法で合成され、配列： オリゴマー41:CCU GGC CUU CCA UGC UC の相補的RNAオリゴヌクレオチドも同様であった。
b.融解分析 融解分析が方法Ｂ−１−ｂの方法に従って実施され
た。結果は表４に示されている。
表４から明らかなように、RNA相補鎖に対して２′−
アミノ連結基を持つ鎖と非修飾鎖間のTmの変化は1.1度
であった（修飾当り0.22の変化）。DNA鎖に対しての変
化は−6.1度であった（修飾当り−1.2の変化）。
親非修飾オリゴヌクレオチドと比較した場合、２′−
アミノ連結基含有鎖はRNAとのハイブリダイゼーション
において安定化効果を、DNAとのハイブリダイゼーショ
ンにおいて不安定化効果を持っていた。
本発明の化合物は、細胞取り込みを促進するその能力
について試験された。それはウシパピローマウイルス−
１（BPV−１）の発現を阻害する能力で判断するかまた
はルシフェラーゼ産生（HIV−１に対する）を含むアッ
セイにより試験された。
方法Ｃ E2トランス活性化アッセイにより測定されたウシパピロ
ーマウイルス（bpv−１）の発現阻害により判定された
細胞取込みの決定 この試験のため配列： オリゴマー42:CTG TCT CCA TCC TCT TCA CT のホスホロチオエートオリゴヌクレオチド類似体が基本
配列として使用された。この配列はウシパピローマウイ
ルスタイプ１（BPV−１）のE2遺伝子の翻訳開始領域に
対して相補的であるように設計された。オリゴマー42は
本アッセイの陽性対照および標準として役立った。オリ
ゴマー３（前記実施例４から）は第２の試験化合物とし
て役立った。それはホスホロチオエートオリゴヌクレオ
チドであるということ、およびさらにオリゴヌクレオチ
ドの３′末端に複合されているコール酸部分を持ってい
ることを除いては同一の塩基配列を持っている。オリゴ
マー２（前記実施例２より）は第３の試験化合物として
用いた。これもまた同一の配列を持つホスホロチオエー
トオリゴヌクレオチドであり、それは５′末端に複合さ
れているコール酸部分を持っている。オリゴマー５（前
記実施例５より）は第４の試験化合物として用いた。こ
れもまた同一の配列を持つホスホロチオエートオリゴヌ
クレオチドであり、およびそれは３′−末端および５′
末端の両方に複合されたコール酸部分を持っている。第
５の試験化合物はBPV−１と有意な配列相同性を持って
いないホスホロチオエートオリゴヌクレオチドであっ
た。第６の試験化合物はBPV−１と有意な配列相同性を
持たない別のホスホロチオエートオリゴヌクレオチドで
あった。最後の試験化合物、第７の試験化合物は３′末
端に複合されたコール酸を持つが、BPV−１と有意な配
列相同性を持っていないホスホロチオエートオリゴヌク
レオチドであった。化合物5,6および７はアッセイの陰
性対照として役立った。
各々の試験ではＩ−38細胞が60mmペトリ皿にcm2当り
５×104細胞で播種された。播種して８時間後、培地を
吸引し、試験オリゴヌクレオチドを含む培地に置き換え
て一夜インキュベートした。インキュベーション後、培
地を吸引し、オリゴヌクレオチドを含まない新しい培地
に置き換えて１時間インキュベートした。次に細胞を２
μｇのpE2RE−１−CATでのCaPO4法によりトランスフェ
クトした。４時間のインキュベーション期間の後、細胞
に１分間グリセロールショック（15％グリセロール）を
与え、続いてPBSで２回洗浄した。培地を本来の濃度の
オリゴヌクレオチドを含むDMEMに置換した。細胞を48時
間インキュベートした後採取した。細胞溶解物のクロラ
ムフェニコール アセチルトランスフェラーゼを常法に
より分析した。アセチル化および非アセチル化14C−ク
ロラムフェニコールを薄層クロマトグラフィーにて分離
し、液体シンチレーションにより定量した。結果はパー
セントアセチル化として表現されている。
陽性対照化合物の２つのロットが29％および30％のレ
ベルでアセチル化することが観察された。陰性対照であ
る試験化合物5,6および７は各々59％,58％および47％ア
セチル化することが観察された。３′−コール酸複合試
験化合物、オリゴマー３は23％アセチル化することが観
察され、５′−コール酸複合試験化合物、オリゴマー２
は36％までアセチル化することが観察され、および３′
末端および５′末端の両方で複合されている試験化合
物、オリゴマー５は27％までアセチル化することが観察
された。
この試験の結果は、オリゴヌクレオチドの３′末端で
のコール酸基への置換は活性を増加させることを示唆し
ている。このことは、増加した活性は増加した細胞輸送
の結果であったことを示唆している。
方法Ｄ コール酸連結２′−Ｏ−メチル置換オリゴヌクレオチド
によるpHIVlucの阻害により判定された細胞取込みの決
定 この試験には、試験ウェズ中にオリゴヌクレオチドを
存在させないことが対照として働いた。すべてのオリゴ
ヌクレオチドは２′−Ｏ−メチル類似体として試験され
た。この試験には配列： オリゴマー43:CCC AGG CUC AGA （式中、オリゴヌクレオチドの各々のヌクレオチドは
２′−Ｏ−メチル置換基を含んでいる）のオリゴヌクレ
オチドを基本試験化合物として用いた。
配列： オリゴマー44:5′−CHA CCC AGG CUC AGA （式中、CHAはコール酸を表わしており、オリゴヌクレ
オチドの各々のヌクレオチドは２′−Ｏ−メチル置換基
を含んでいる）の第２の試験化合物もまた第１の試験化
合物と同一の配列であった。この第２の試験化合物はそ
の５′−末端に複合されたコール酸を含んでおり、実施
例７−Ｃで同定されている２′−Ｏ−メチル ホスホロ
アミダイト中間体を利用して実施例３の方法に従って製
造された。
配列： オリゴマー45:CCC AGG CUC AGA ３′−CHA （式中、CHAはコール酸を表わし、オリゴヌクレオチド
の各々のヌクレオチドは２′−Ｏ−メチル置換基を含ん
でいる）の第３の試験化合物もまた第１の試験化合物と
同じ配列であった。第３の試験化合物は実施例７−Ｃで
同定された２′−Ｏ−メチルホスホロアミダイト中間体
を利用し、実施例４の方法に従って製造された。第４の
試験化合物は第２の配列の２′−Ｏ−メチルオリゴヌク
レオチドであった： オリゴマー46:GAG CUC CCA GGC （式中、オリゴヌクレオチドの各々のヌクレオチドは
２′−Ｏ−メチル置換基を含んでいる）。第５の試験化
合物は配列： オリゴマー47:5′−CHA GAG CUC CCA GGC （式中、CHAはコール酸を表わし、オリゴヌクレオチド
の各々のヌクレオチドは２′−Ｏ−メチル置換基を含ん
でいる）を持っていた。それは第４の試験化合物と同一
の配列であった。この試験化合物はその５′末端に複合
されたコール酸を含んでおり、実施例７−Ｃで同定され
たような２′−Ｏ−メチルホスホロアミダイト中間体を
利用し、実施例３の方法に従って製造された。
第６の試験化合物は配列： オリゴマー48:CAU GCU GCA GCC のランダム化オリゴヌクレオチドであった。
ヒーラ細胞を６つのウェルの培養皿にウェル当り４×
105細胞で播種した。試験オリゴヌクレオチドを１μＭ
で３つのウェルに加え、37℃で20時間インキュベートし
た。培地およびオリゴヌクレオチドを除去し、細胞をPB
Sで洗浄し、CaPO4でトランスフェクトした。簡単に記す
と、ルシフェラーゼcDNAおよびHIVLTRを各々含むプラス
ミドpT3/T71ucおよびpHIVpap（NAR19（12））のKpn I/H
ind III制限断片を結合することにより構築され、HIVLT
Rの転写制御のもとルシフェラーゼcDNAを発現するプラ
スミドであるpHIVluc（５μｇ）およびSV40プロモータ
ーの制御下にHIVtat蛋白質を発現するプラスミドpCDEBt
at（６μｇ）を500μの250mM CaCl2に加え、次に500
μの２×HBSを加えてボルテックスする。30分後、CaP
O4沈殿物をプレートの６つのウェルに等しく分配し、４
時間インキュベートした。培地および沈殿物を除去し、
細胞をPBSで洗浄して新しいオリゴヌクレオチドおよび
培地を加えた。インキュベーションを一夜続けた。次の
朝各々のウェルのルシフェラーゼ活性が決定された。培
地を除去し、細胞は２回PBSで洗浄した。細胞は次にプ
レート上で200μのLB（１％トリトンＸ−100,25mMグ
リシルグリシンpH7.8,15mM MgSO4,4mM EGTA,1mM DT
T）で溶解させた。各々のウェルからその一部75μ
を、75μのアッセイ緩衝液（25mMグリシルグリシン,p
H7.8,15mM MgSO4,4mM EGTA,15mM KPO4,1mM DTT,2.5
mM ATP）と一緒に96ウェルプレートのウエルに加え
た。プレートはDynatecマルチウェル ルミノメーター
中で読み取られ、各々のウェルに75μのルシフェリン
緩衝液（25mMグリシルグリシン、pH7.8,15mM MgSO4,4m
M EGTA,4mM DTT,1mMルシフェリン）を注入したら直ぐ
発光される光を読み取る（光単位）。
ランダム配列化合物（オリゴマー48）および他の非コ
ール酸複合試験化合物（オリゴマー43および46）は同じ
ような活性を持っていた。第１の配列の５′−複合体
（オリゴマー44）もまた非複合化合物と同じような活性
を持っていた。第２の配列の５′−複合体（オリゴマー
47）は非複合化合物と比較して活性の３倍の増加を示
し、第１の配列の３′−複合体（オリゴマー45）はオリ
ゴマー47と比較してさらに３倍の活性の増加を示した。
すべてのコール酸結合試験オリゴヌクレオチドは非コ
ール酸結合オリゴヌクレオチドと比較して著しいルシフ
ェラーゼ産生の阻害を示した。このことは増加した活性
はコール酸結合試験オリゴヌクレオチドの細胞膜輸送が
増加した結果であることを示唆している。
実施例13 レチノイン酸複合オリゴヌクレオチド A.レチノイン酸Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド エステ
ル レチノイン酸（15ミリモル,4.5g,Fluka）およびＮ−
ヒドロキシスクシンイミド（5.25g,45ミリモル）の混合
物に無水DMF（150ml）を加えた。混合物はアルゴン下で
撹拌した。次にEDAC〔エチル−３−（３−ジメチルアミ
ノ）プロピルカルボジイミド〕（4ml、25ミリモル）を
加え、混合物は一夜撹拌した。反応液を黄色ゴム状物に
なるまで蒸発させ、200mlの酢酸エチルに溶解して４％N
aHCO3溶液（200ml）続いて飽和NaCl溶液で連続的に洗浄
した後、無水MgSO4で乾燥し、蒸発させると所望の化合
物を黄色固形物としてほぼ90％の収率で得た。
B.レチノール ホスホロアミダイト 全−トランス−レチノール（1g）を真空乾燥し、アル
ゴン雰囲気下、無水CH2Cl2（10ml）に溶解した。ジイソ
プロピルエチルアミン（2.65ml、21.5ミリモル）をシリ
ンジで注入し、反応混合物は氷浴で冷却した。２−シア
ノエチル−N,N−ジイソプロピルクロロホスホロアミダ
イト（2.5g,2.45ml,10.5ミリモル）をアルゴン雰囲気
下、シリンジにより徐々に注入した。反応混合物を30分
間撹拌すると、その時点でTLC（CH2Cl2:CH3OH:Et3N,90:
10:0.1）はアルコールのそのホスホロアミダイトへの完
全な変換を示した。反応混合物を100mlの飽和NaHCO3に
加え、続いて反応フラスコをCH2Cl2（２×25ml）で洗浄
して加えた。CH2Cl2層を分離し、100mlの飽和NaCl溶液
で洗浄し、MgSO4で乾燥後黄色あわ状物になるまで蒸発
させた。シリカカラム精製によるこのアミダイトの分解
が知られているのでこのアミダイトはさらに精製するこ
となくDNA合成装置に直接使用された。
C.レチノイン酸機能性オリゴヌクレオチド 配列： オリゴマー49:TsGsGs GsAsGs CsCsGs TsAsGs CsGsAs Gs
GsCs−３′AL （式中、ALは３′−アミノ連結基を表わしており、“s"
はホスホロチオエート ヌクレオチド間バックボーン結
合を表わしている）のオリゴヌクレオチドの多数のバッ
チがClontechより入手可能な３′−アミン−ON固体支持
体を用いるホスホロアミダイト方法論を利用し、DNA合
成装置上標準法により10マイクロモルのスケールで実施
例４の方法に従って合成された。合成の間、ホスホロチ
オエート バックボーンはBeaucage試験により形成され
た。オリゴヌクレオチドは標準プロトコールを用いて脱
保護および精製された。
３′−アミノ連結基−オリゴヌクレオチド（オリゴマ
ー49,100O.D.単位、約550ナノモル）を新しく調製したN
aHCO3緩衝液（500μ,0.2M,pH8.1）に溶解し、500μ
のDMFに溶解したレチノイン酸Ｎ−ヒドロキシスクシン
イミド エステル（50mg,125マイクロモル）の溶液を加
えた。反応混合物はアルミニウムホイルで被覆し、37℃
の浴に一夜放置した。次にセファデックスＧ−25カラム
（１×40cm）を通し、最初の溶出液を集め、濃縮し、再
び別のセファデックスＧ−25カラム（１×40mM）を通過
させて過剰のビタミンＡ試薬を除去した。黄色オリゴヌ
クレオチド分画を濃縮し、続いてHPLCにより精製してレ
チノイン酸−オリゴヌクレオチド複合体を得た。
実施例14 葉酸複合オリゴヌクレオチド 葉酸（30mg,68マイクロモル）および１−ヒドロキシ
ベンゾトリアゾール（30mg,222マイクロモル）の混合物
を900mlの乾燥DMFに溶解させた。この溶液に50mlのEDAC
（312マイクロモル）を加えた。得られる黄色粘張物質
をよくボルテックスし、溶液の500mlを0.2M NaHCO3緩
衝液に溶解した100O.D.単位の３′−アミノ連結基オリ
ゴヌクレオチド（オリゴマー49,537マイクロモル）へ移
した。黄色溶液はボルテックスし、アルミニウムホイル
で被覆し、16時間反応させた。混合物は次にセファデッ
クスＧ−25カラム（１×40cm）に加えた。オリゴヌクレ
オチド分画を集め、濃縮し、もう一度セファデックスＧ
−25カラムを通過させた。オリゴヌクレオチド分画を濃
縮し、逆相HPLCにより精製した。複合体は約32.5分を中
心とする幅広いピークとして現れた。一方、オリゴヌク
レオチド出発物質は30分の保持時間を持っていた（逆相
HPLCにおいて、60分で溶媒Ｂの100％CH3CNが５％→40
％、溶媒Ａとしては50mM TEAA pH7.0）。複合体は濃
縮され、脱塩のため再びセファデックスＧ−25カラムを
通過させた。ゲル分析は出発オリゴヌクレオチドより遅
く移動する物質を示した。
実施例15 葉酸メチル複合オリゴヌクレオチド 実施例14と類似の方法により、５−メチル葉酸もまた
オリゴマー49に結合された。
実施例16 ピリドキサール複合オリゴヌクレオチド ３′−アミノ連結基−オリゴヌクレオチド（オリゴマ
ー49,20O.D.単位,260nmでの計算吸光係数1.828×105に
基づくと約110ナノモル）を100マイクロリットルの水に
溶解した。100mlの1M NaOAc緩衝液（pH5.0）続いて5mg
のピリドキサール塩酸塩（24マイクロモル）および50μ
の60mM NaCNBH3溶液を加えた。溶液をボルテックス
し、一夜放置した。反応液はセファデックスＧ−25カラ
ム通過させ、分析HPLCカラムでさらに精製した。
実施例17 トコフェロール複合オリゴヌクレオチド A.ビタミンＥ（トコフェロール）−ヘミスクシネート−
NHSエステル α−トコフェロールヘミスクシネート（Sigma,5g,9.4
ミリモル）を、前記実施例13−Ａのビタミン−Ａ NHS
エステル合成で記載したごとく３当量のＮ−ヒドロキシ
スクシンイミドおよび２当量のEDACで処理した。実施例
13と同じ方法で後処理すると表記化合物を淡い褐色のワ
ックス様固形物として得た。
B.トコフェロール複合オリゴヌクレオチド α−トコフェロール−ヘミスクシネート−NHSエステ
ルはレチノイン酸複合のために実施例13−Ｃに記載した
方法と同じ方法により処理された。複合体は約50％の収
率で得られた。
実施例18 ウリジンを基礎にしたアミノ連結基の合成 A.5′−ジメトキシトリチル−２′−（Ｏ−ペンチル−
Ｎ−フタルイミド）ウリジンホスホロアミダイトの製造 Wagner,et al.,J.Org.Chem., 1974，39,24のプロトコ
ールを利用し、ウリジン（45g,0.184モル）を1.4の無
水メタノール中のジ−ｎ−ブチルスズオキシド（45g,0.
181モル）と還流した。溶媒を濾過し、生じた２′,3′
−Ｏ−ジブチルスタニレン−ウリジンを真空下100℃で
４時間乾燥させると81g（93％）が得られた。
２′,3′−Ｏ−ジブチルスタニレン−ウリジンは真空
下P2O5上で12時間乾燥させた。この化合物（20g,42.1ミ
リモル）の無水DMF（500ml）溶液に25g（84.2ミリモ
ル）のＮ−（５−ブロモペンチル）フタルイミド（Tran
s World Chemicals,Rockville,Maryland）および12.75g
（85ミリモル）のフッ化セシウム（CeF）を加え、混合
物は室温で72時間撹拌した。反応混合物は蒸発させた後
一度トルエンと共蒸発させ、白色残渣はEtOAcおよび水
（各々400ml）に分配させた。EtOAc相を濃縮し、シリカ
ゲルカラム（700g）に加えた。CH2Cl2−CH3OH（20:1v/
v）で溶出させるとＯ−ペンチル−ω−Ｎ−フタルイミ
ドウリジンの２′−および３′−異性体の混合物を含む
分画を与えた、収率50％。
混合物は乾燥ピリジン中DMTクロリドと室温で６時間
反応させた。過剰のDMT−Clを消滅させるのにCH3OHを使
用し、残渣は0.5％Et3N含有CH2Cl2および水に分配させ
た。有機層を乾燥し（MgSO4）、残渣はシリカカラムに
加えた。CH2Cl2:CH3OH（20:1,v/v）で溶出すると２′お
よび３′異性体が分離された。
２′−Ｏ−ペンチル−ω−Ｎ−フタルイミド−５′−
DMT−ウリジンは実施例７に参照した方法によりそのホ
スホロアミダイトへ変換された。
B.5′−ジメトキシトリチル−２−（Ｏ−ヘキシル−Ｎ
−フタルイミド）ウリジンホスホロアミダイトの製造 Ｎ−（６−ブロモヘキシル）フタルイミドを用い、実
施例18−Ａと類似の方法でウリジンの２′位へ２′−６
つの炭素のアミノ連結基が導入された。
C.5′−ジメトキシトリチル−２−（Ｏ−デシル−Ｎ−
フタルイミド）ウリジンホスホロアミダイトの製造 実施例18−Ａと類似の方法を用い、ヌクレオチドへの
２′−10の炭素のアミノ連結基の導入にＮ−（10−ブロ
モデシル）フタルイミドが同様に使用された。
実施例19 シチジンを基礎としたアミノ連結基の合成 A.5′−ジメトキシトリチル−２−（Ｏ−プロピル−Ｎ
−フタルイミド）シチジンホスホロアミダイトの製造 ５′−DMT保護２′−Ｏ−機能性化シチジンホスホロ
アミダイトはアデノシンをシチジンに置換した実施例７
の方法により製造された。
B.2′−アミノ連結基を持つ３′−末端ヌクレオチドを
含むオリゴヌクレオチドの製造 ホスホジエステル ヌクレオチド間結合および３′末
端ヌクレオチドに２′−アミノ連結基を持つ以下のオリ
ゴヌクレオチドが合成された： オリゴマー50:GGC GUC UCC AGG GGA UCU GAC＊ オリゴマー51:TCT GAG TAG CAG AGG AGC TC＊ （式中、Ｃ＊は機能性プロピル−Ｎ−フタルイミドを取
込むように機能性化されたヌクレオチドを表わしてい
る）。オリゴマー50はCMVのCap領域に対してアンチセン
スであり、オリゴマー51はICAM配列に対してアンチセン
スである。オリゴヌクレオチドは３マイクロモルスケー
ルで合成された。合成完了後標準プロトコールを用いて
脱保護し、逆相HPLCにより精製して脱トリチル化および
脱塩した。
実施例20 ２′−アミノ連結基を持つオリゴヌクレオチドのチオ連
結基を持つオリゴヌクレオチドへの変換 A.オリゴマー50 オリゴマー50（25O.D.単位）を0.2M NaHCO3緩衝液
中、5mgのSATA（Ｎ−スクシンイミジル−Ｓ−アセチル
チオアセテート）で処理した。反応混合物はセファデッ
クスＧ−25カラムを通過させ、オリゴヌクレオチド分画
を濃縮し、200mM NH2OH塩酸塩水溶液（1ml）で処理し
た。
B.オリゴマー51 オリゴマー51（25O.D.単位）を0.2M NaHCO3緩衝液
中、5mgのSATA（Ｎ−スクシンイミジル−Ｓ−アセチル
チオアセテート）で処理した。反応混合物はセファデッ
クスＧ−25カラムを通過させ、オリゴヌクレオチド分画
を濃縮し、200mMヒドロキシルアミン塩酸塩水溶液（1m
l）で処理した。
実施例21 オリゴヌクレオチドの２′位でのＯ−フェナントロリン
の複合 A.オリゴマー52 実施例20−Ａから得られた溶液に2mgの５−（ヨード
アセトアミド）−Ｏ−フェナントロリン試薬を加え、一
夜振とうした。複合体はサイズ排除カラムおよび逆相HP
LCにより精製されオリゴマー52を得た： オリゴマー52:GGC GUC UCC AGG GGA UCU GAC−
２′PHA （式中、PHAはその２′位で構造２′−Ｏ−（CH2）３−
NH−Ｃ（＝Ｏ）−CH2−Ｓ−CH2−Ｃ（＝Ｏ）−NH−のチ
オール連結基を介してフェナントロリンで機能性化され
ているヌクレオチドを表わしている）。
B.オリゴマー53 実施例20−Ｂから得られた溶液に2mgの５−（ヨード
アセトアミド）−Ｏ−フェナントロリン試薬を加え一夜
振とうした。複合体はサイズ排除カラムおよび逆相HPLC
により精製され、オリゴマー53を得た： オリゴマー53:TCT GAG TAG CAG AGG AGC TC−
２′PHA （式中、PHAはその２′位で構造２′−Ｏ−（CH2）３−
NH−Ｃ（＝Ｏ）−CH2−Ｓ−CH2−Ｃ（＝Ｏ）−NH−のチ
オール連結基を通してフェナントロリンで機能性化され
ているヌクレオチドを表わしている）。
実施例22 オリゴヌクレオチドの内部部位に２′−アミノ連結基を
介して架橋剤／アルキル化剤を持つヌクレオシドを含む
オリゴヌクレオチド A.ウリジン２′−アミノ連結基を持つオリゴヌクレオチ
ドの合成 ホスホジエステル ヌクレオチド間結合および内部部
位に２′アミノ連結基を持つ下記のオリゴヌクレオチド
が実施例18のウリジン２′−アミノ連結基を利用して合
成された： オリゴマー54:GGC CAG AUC UGA GCC UGG GAG CU
＊Ｃ UGU GGC Ｃ （式中Ｕ＊は、機能性プロピル−Ｎ−フタルイミドを取
込むように機能性化されたヌクレオチドを表わしてい
る）。オリゴマー54はTAR RNAのG16からC46位に対応す
るオリゴヌクレオチドである。
B.TAR構造のU38位へのヨードアセトアミドの複合 オリゴマー54をヨード酢酸Ｎ−ヒドロキシスクシンイ
ミドエステルと反応させてTAR構造のU38位でヨードアセ
トアミド誘導体を形成させた。従ってU38位はTAR構造の
G26またはG28のグアニン塩基の７位との架橋に利用可能
である。
実施例23 オリゴヌクレオチドの２′位でのピレンの複合 A.単２′部位修飾 10O.D.単位（A260）のオリゴマー12（実施例７−Ｂ）
（計算吸光係数1.68×105に基づくと約60ナノモル）を
マイクロフュージチューブ内で乾燥させた。200μの
0.2M NaHCO3緩衝液でそれを溶解させ、ピレン−１−酪
酸Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル（すなわち、
スクシンイミジル−１−ピレン ブチレート,3mg,7.79
マイクロモル、Molecular Probes,Eugene,Oregon）、続
いて400μのDMFを加えた。混合物は37℃で一夜インキ
ュベートした。溶液をセファデックスＧ−25カラム（１
×40cm）に加え、オリゴヌクレオチド分画を合併した。
生成物はHPLCにより精製された。ピレン複合体は典型的
なピレン吸収を300および400nmの間に示した。生成物は
26.94分のHPLC保持時間を持っており、一方、親オリゴ
ヌクレオチドは21.78分の保持時間を持っていた。（991
検出器を備えたWaters 600E;Hamilton PRP−１カラム
（15×25cm）；溶媒A:50mM TEAA,pH7.0;B:80％アセト
ニトリルを含む45mM TEAA;流速1.5ml/分；濃度勾配：
最初の５分間５％B,その後１分毎にＢを直線的（１％）
に増加）。
B.多２′部位修飾 10O.D.単位のオリゴマー12（実施例７−Ｂ）を２倍量
のピレン−１−酪酸Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド（40
0μのDMF中、6mg）で処理し、実施例23−Ａと同じ様
式で後処理した。セファデックスＧ−25精製、続いての
HPLC精製により、二重にピレンが複合されたオリゴヌク
レオチドが得られた。二重に複合されたオリゴヌクレオ
チドは32.32分のHPLC保持時間を示し、一方、親オリゴ
ヌクレオチドは21.78分の保持時間を持っていた。（991
検出器を備えたWaters 600E;Hamilton PRP−１カラム
（15×25cm）；溶媒A:50mM TEAA,pH7.0;B:80％アセト
ニトリルを含む45mM TEAA;流速1.5ml/分：濃度勾配：
最初の５分は５％B,その後、１分毎にＢを直線的（１
％）に増加）。
実施例24 オリゴヌクレオチドの２′位でのアクリジンの複合 A.単２′部位の修飾 10O.D.単位（A260）のオリゴマー12（実施例７−Ｂ、
約60ナノモル）を乾燥し、200μの1M NaHCO3/Na2CO3
緩衝液、pH9.0に溶解した。９−アクリジニル−イソチ
オシアネート（5mg,2.1マイクロモル,Molecular Probe
s,Eugene,Oregon）は200μのDMFに溶解した。この溶
液をオリゴヌクレオチドに加え、ボルテックスし、アル
ミニウムホイルで覆って37℃で一夜放置した。反応混合
物はセファデックスＧ−25カラム（１×40cm）を通すこ
とにより精製され、濃縮してさらにHPLC（逆相）により
精製した。生成物は25.32分のHPLC保持時間を持ってお
り、一方親オリゴヌクレオチドは21.78分の保持時間を
持っていた。（991検出器を備えたWaters600E;Hamilton
PRP−１カラム（15×25cm）；溶媒A:50mM TEAA,pH7.
0;B:80％アセトニトリルを含む45mM TEAA;流速1.5ml/
分：濃度勾配最初の５分間は５％B,その後１分毎にＢを
直線的（１％）に増加させる）。
B.多２′部位修飾 400μの1M Na2CO3/NaHCO3緩衝液（pH9.0）に溶解
した10O.D.単位（A260）のオリゴマー13（実施例７−
Ｂ）を400μのDMFに溶解した10mgの９−アクリジニル
−イソチオシアナートで処理した。反応混合物はボルテ
ックスし、アルミニウムホイルで覆って37℃で一夜放置
した。反応混合物は実施例24−Ａの単一部位反応のよう
に精製された。二重に複合されたアクリジン−オリゴヌ
クレオチドはHPLCで単一修飾生成物に続いて最後のピー
クとして溶出した。生成物は32.32分のHPLC保持時間を
持ち、一方親オリゴヌクレオチドは21.78分の保持時間
を持っていた。（991検出器を備えたWaters 600E;Hami
lton PRP−１カラム（15×25cm）；溶媒A:50mM TEAA,
pH7.0;B:80％アセトニトリルを含む45mM TEAA:流速1.5
ml/分：濃度勾配：最初の５分間は５％Ｂ、その後１分
毎にＢを直線的（１％）に増加させる。
実施例25 オリゴヌクレオチドの２′位でのポルフィリンの複合 メチルピロポルフィリンXXIエチルエステル（Aldric
h）はＮ−ヒドロキシスクシンイミドおよびEDACを用い
てアミノカプロン酸と縮合された。得られたカルボン酸
は次に再びＮ−ヒドロキシスクシンイミドおよびEDACで
活性化し、実施例23−Ａの方法に従ってオリゴマー12で
処理すると２′−ポルフィリン複合オリゴヌクレオチド
を与えた。
実施例26 オリゴヌクレオチドの２′位でのハイブリッド インタ
ーカレーター−リガンドの複合 A.ホトヌクレアーゼ／インターカレーターリガンド ホトヌクレアーゼ／インターカレーターリガンド６−
〔〔９−〔〔６−（４−ニトロベンズアミド）ヘキシ
ル〕アミノ〕アクリジン−４−イル〕カルボニル〕アミ
ノ〕ヘキサノイル−ペンタフルオロフェニルエステルは
Egholm et al.,J.Am. Chem.Soc. 1992,114,1895の方法
により合成された。
B.単２′部位修飾 10O.D.単位のオリゴマー12（実施例７−Ｂ）を100μ
の0.1M,ホウ酸緩衝液（pH8.4）に溶解し、300μの
６−〔〔〔９−〔〔６−（４−ニトロベンズアミド）ヘ
キシル〕アミノ〕アクリジン−４−イル〕カルボニル〕
アミノ〕ヘキサノイルペンタフルオロフェニル エステ
ルのDMF溶液（1mlのDMFに10mg）を加えた。溶液をアル
ミニウム ホイルで覆い、放置して一夜反応させた。生
成物は反応混合液のセファデックスＧ−25およびHPLC精
製により精製された。
C.多２′部位修飾 10O.D.単位（A260）のオリゴマー13（実施例７−Ｂ）
を200μの0.1Mホウ酸緩衝液（pH8.4）に溶解し、660
μの６−〔〔〔９−〔〔６−（４−ニトロベンズアミ
ド）ヘキシル〕アミノ〕アクリジン−４−イル〕カルボ
ニル〕アミノ〕ヘキサノイルペンタフルオロフェニル
エステルのDMF溶液（1ml溶液に10mg）を加え、反応液は
アルミニウムホイルで覆って一夜放置した。明るい黄色
液はセファデックスＧ−25および逆相HPLCにより精製さ
れ二重に複合されたオリゴヌクレオチドを与えた。
実施例27 オリゴヌクレオチドの２′位でのビピリジン複合体の複
合 A.ビピリジン複合体 スクシンイミジル−４−カルボキシル−４′−メチル
−2,2′−ビピリジンはTelser et al.,J.Am.Chem.Soc.
1989,111,7221の方法に従って合成される。
B.単２′部位修飾 10O.D.A260単位のオリゴマー12を0.1Mホウ酸緩衝液pH
8.5/DMF中:200倍モル過剰のスクシンイミジル−４−カ
ルボキシル−４′−メチル−2,2′−ビピリジンと反応
させた。反応液はセファデックスＧ−25および逆相HPLC
により精製して複合化されたオリゴヌクレオチドを得
た。
実施例28 オリゴヌクレオチドの２′位でのアリールアジド光架橋
剤の複合 A.N−ヒドロキシスクシンイミジル−４−アジドベンゾ
エート（HSAB）の複合 オリゴマー14（すなわち、TTG CTT CCA＊ TCT TC
C TCG TC、式中Ａ＊は２′−ｏ−ペンチルアミノアデ
ノシンを表わしている、実施例７−Ｃ、100O.D.単位、
計算吸光係数1.6792×106OD単位に基づくと595ナノモ
ル）を乾燥し、500μの0.2M NaHCO3緩衝液pH8.1に溶
解し、500μのDMFに溶解した25mgのＮ−ヒドロキシス
クシンイミジル−４−アジドベンゾエート（HSAB,96マ
イクロモルPierceおよびSigmaの両方から入手可能）を
加えた。反応液は37℃で一夜放置して反応させ、セファ
デックスＧ−25カラム（１×40cm）を２回通過させた。
オリゴヌクレオチド分画は逆相HPLCにより精製された。
生成物は38.79分のHPLC保持時間を持ち、一方親オリゴ
ヌクレオチドは逆相カラム中で33.69分の保持時間を持
っていた（60分で５％→40％CH3CN）。
B.N−スクシンイミジル−６（４′−アジド−２′−ニ
トロフェニル−アミノ）ヘキサノエートの複合 オリゴマー14（実施例７−C,200OD単位）を500μの
NaHCO3緩衝液（0.2M,pH8.1）に溶解し、500μのDMFに
溶解した500mgのＮ−スクシンイミジル−６（４′−ア
ジド−２′−ニトロフェニル−アミノ）ヘキサノエート
（SANPAH,128マイクロモル,PierceおよびSigmaの両方か
ら入手可能）で処理した。反応バイアルにアルミニウム
ホイルでラップし、37℃に一夜加熱した。反応混合物は
セファデックスＧ−25カラム（１×40cm）を二度通過さ
せた。オリゴヌクレオチド分画は逆相HPLCにより精製さ
れた。生成物は40.69分のHPLC保持時間を持ち、一方親
オリゴヌクレオチドは33.69分の保持時間を逆相カラム
で持っていた（60分で５％→40％CH3CN）。
方法Ｄ 複合化されたオリゴヌクレオチドのデュープレックス融
解温度 方法Ｂ−1bに記載したプロトコールを利用して相補的
DNAに対する本発明の種々の２−アミノ連結複合体オリ
ゴマーの融解温度が得られた。複合オリゴマーは２′−
Ｏ−ペンチルアミノ基を持つ同じ配列のオリゴマーと比
較された。同じ配列の非修飾（すなわち野生型）鎖もま
た比較の目的で試験された。単部位および多部位の両方
の複合オリゴマーが試験された。
表５に示したごとく、TmおよびΔTm/修飾が測定され
た（両方とも２′−ペンチルアミノを持つオリゴマーと
比較して）。野生型配列は： オリゴマー55:CTG TCT CCA TCC TCT TCA CT であり、単部位配列は： オリゴマー12:CTG TCT CCA＊ TCC TCT TCA CT であり、多部位配列は： オリゴマー13:CTG TCT CCA＊ TCC TCT TCA＊ CT であった（式中、Ａ＊は複合化の部位を表わしてい
る）。
実施例29 オリゴヌクレオチドの２′位でのイミダゾール−４−酢
酸の複合 A.イミダゾール−４−酢酸の活性化 イミダゾール−４−酢酸と2,4−ジニトロフルオロベ
ンゼンを反応させた。得られたイミダゾール−Ｎ−（DN
P）−４−酢酸は実施例13の方法に従いNHS/EDACで処理
してそのＮ−ヒドロキシスクシンイミドエステルに変換
された。
B.2′−部位修飾 10O.D.A260単位のオリゴマー12を0.1Mホウ酸緩衝液pH
8.5/DMF（各々200μ）中100倍モル過剰のイミダゾー
ル−Ｎ−（DNP）−４−酢酸NHSエステルと反応させた。
一夜反応後、反応混合物はDNP保護基を切断するため200
μのメルカプトエタノールで処理した。得られた反応
混合物はセファデックスＧ−25カラムを通し、続いて逆
相HPLCにより精製され、イミダゾール複合オリゴヌクレ
オチドを得た。
実施例30 オリゴヌクレオチドの２′位への金属キレート剤の複合 A.EDTA錯体 核酸切断剤としてオリゴヌクレオチドへ結合するため
のEDTAFe（II）錯体を生成させるためSluka,et al.,J.A
m.Chem.Soc. 1990，112,6369の方法に従ってEDTAのトリ
シクロヘキシルエステルが合成された。
B.EDTA ２′−部位修飾 EDTAのトリシクロヘキシルエステル（1.25mg,1.94ミ
リモル）およびヒドロキシベンゾトリアゾール（HOBt,1
mg,6.6ミリモル）をDMF（50μ）に溶解し、EDAC10μ
を加えた。この溶液に100μの0.1Mホウ酸緩衝液に
溶解したオリゴヌクレオチド12（10OD単位）を加え、一
夜放置した。反応液はセファデックスＧ−25カラムを通
過させ、オリゴヌクレオチド分画を濃NH3（100μ）で
１時間処理し、酸保護基を切断した。最終的精製はサイ
ズ排除およびHPLCにより達成された。
C.DTPA ２′−部位修飾 単一部位修飾のためオリゴマー12を0.1M NaHCO3/DMF
中ジエチレントリアミンペンタ無水酢酸（DTPA）で処理
した。複合体はカドリニウムイオン（Gd III）と錯体形
成させ取込み測定試薬の対照試薬を得た（他の使用も可
能）。
実施例31 オリゴヌクレオチドの２′位へとコレステロールの複合 A.方法１−２′−アミノ連結基 コレステロール−ヘミスクシネートがそのＮ−ヒドロ
キシスクシンイミドエステルに変換された。それは次に
実施例23−Ａの方法に従ってオリゴマー12または実施例
23−Ｂの方法に従ってオリゴマー13へ複合された。
B.方法２−ジスルフィド架橋を介してのコレステロール
の複合 工程１ アルゴン雰囲気下、氷酢酸（400μ）を含むクロロ
ホルム（20ml）に溶解した2,2′−ジチオビス（５−ニ
トロピリジン）（1.4g,4ミリモル）の撹拌溶液にチオコ
レステロール（1.4g,3.5ミリモル）を加えた。反応は室
温で一夜続けさせ、沈殿した５−ニトロピリジン−２−
チオンを除去し、溶液を蒸発させてシリカカラムで精製
するとＳ−（２−チオ−５−ニトロピリジル）−チオコ
レステロールが得られた。
工程２ オリゴマー55:TsGsGs GsAsGs CsCsGs TsA＊ sGs CsGsAs
GsGsCs （式中、Ａ＊は２′−Ｏ−ペンチルアミノ連結基を取込
むように機能性化されたアデノシンヌクレオシドを表わ
している）が実施例７に従って合成される。このオリゴ
ヌクレオチドは実施例20のオリゴマー50に対して記載し
た方法に従ってチオール連結基化合物へ変換された。
チオール連結基含有オリゴヌクレオチド（オリゴマー
55）を過剰のＳ−（２−チオ−５−ニトロピリジル）−
チオコレステロールと反応させてジスルフィド架橋を介
してオリゴヌクレオチドの２′位へコレステロール部分
を複合させた。
実施例32 DNA/RNA合成のための固体支持体含有２′−アミノ連結
基の合成 A.5′−ジメトキシトリチル−２′−Ｏ−（ペンチル−
Ｎ−フタルイミド）ウリジン ５′−ジメトキシトリチル−２′−Ｏ−（ペンチル−
Ｎ−フタルイミド）ウリジンは実施例18に記載した方法
に従って合成された。
B.スクシネート ヌクレオシド 工程Ａのヌクレオシド（１ミリモル）を10mlの無水ピ
リジン中、４−DMAP（122mg,1ミリモル）および無水コ
ハク酸（250mg,2.5ミリモル）で処理した。一夜振とう
後、TLC（EtOAc:ヘキサン6:4,0.1％Et3N）はヌクレオシ
ドの完全なコハク酸化を示した。10mlの水を加え反応液
はさらに１時間振とうした。反応混合物を蒸発させCHCl
3および20％クエン酸（各々50ml）に分配した。クロロ
ホルム層を食塩溶液で洗浄して蒸発させた。これは次の
工程に使用された。
C.ニトロフェニル スクシネート 工程Ｂからの乾燥３′−Ｏ−スクシネートをピリジン
（400μ）を含む乾燥ジオキサン（10ml）に溶解し
た。４−ニトロフェノール（280mg,2ミリモル）を加え
続いてDCC（1.32g,5ミリモル）を加えて反応液を24時間
振とうした。尿素の細かい沈殿を濾去し、濾液は蒸発さ
せてシリカカラムへ加えた。カラムからは0.1％Et3Nを
含む５％CH3OH−CHCl3で溶離した。ヌクレオシドの３′
−ニトロフェニル スクシネートはカラムから最初に溶
出された。生成物含有分画を蒸発させるとあわ状物を与
えた。
D.ヌクレオシド固体支持体 工程Ｃからの３′−ニトロフェニルスクシネートを5m
lの無水DMFに溶解し、5gの500Å細孔直径アミノプロピ
ルCPG支持体を加えて８時間振とうした。CPG支持体を濾
過し、メタノール（５×20ml）続いてエーテル（５×2
0）で洗浄して乾燥させた。CPG支持体はピリジン／無水
酢酸/N−メチルイミダゾール（20ml,8:1:1v/v/v）で30
分処理してキャップ形成させた。CPG支持体は次に濾取
し、ピリジン、メタノールおよびエーテルで洗浄した後
風乾した。ジメトキシトリチルのアッセイによりCPG支
持体の負荷能力は27ミリモル／グラムであったことが示
された。
方法Ｅ 葉酸複合オリゴヌクレオチドの細胞取り込みの決定 葉酸によるオリゴヌクレオチド複合の影響はChiang,e
t al.,J.Biol.Chem. 1991，266,18162の方法を利用して
ICAM−１の阻害により決定された。この方法の利用にお
いては、ヒト肺上皮癌腫細胞（A549細胞）を96ウエルプ
レート中でコンフルエントになるまで増殖させた。培地
を除き、細胞を葉酸を含まない培地で３回洗浄した。葉
酸を含まない培地を加え、配列５′−TGG GAG CCA T
AG CGA GGC−３′を持つICAM−１特異的アンチセンス
ホスホロチオエート オリゴヌクレオチドの濃度を増加
させる（葉酸へ複合したものまたはそのままをインキュ
ベーション培地に添加した）。このオリゴヌクレオチド
は18塩基のホスホロチオエートオリゴヌクレオチドであ
り、ヒトICAM−１ mRNAのAUG翻訳開始コドンを標的と
している（Chiang et al.,J.Biol.Chem. 1991，266,181
62）。オリゴヌクレオチドをA549細胞と24時間インキュ
ベートした後、培地へ2.5ng/ml腫瘍壊死因子−αを加え
ることによりICAM−１が誘導された。細胞は腫瘍壊死因
子−αおよびオリゴヌクレオチド存在下さらに15時間イ
ンキュベートした。ICAM−１発現はChiang,et al.によ
り記述されているごとく特異的ELISAにより決定した。
以前に示したように、インキュベーション培地へ試験オ
リゴヌクレオチドを単独で添加してもICAM−１発現の阻
害を起こさなかった。しかしながら、オリゴヌクレオチ
ドをカチオン性リポソームで処方すると力価が少くとも
1000倍増加し、また核中のオリゴヌクレオチドの出現と
も相関した（Bennett,et al.,Molecular Phamacology 1
991，41,1023）。この試験の結果は表６に示されてい
る。30μＭレベルでは葉酸複合オリゴヌクレオチドは40
％の活性の促進を示した。
当業者には本発明の好適な実施態様に対する多くの変
形および変更がなされるであろうことおよびそのような
変形および変更は本発明の精神から離れることなくなさ
れるであろうことが理解されるであろう。従って付随す
る請求の範囲は、すべてのそのような均等な変形例が本
発明の真の精神と範囲内にあることを意図するものであ
る。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 クック，フィリップ・ダン アメリカ合衆国カリフォルニア州92009, カールズバッド，ボレロ・ストリート 7340 (72)発明者 ベネット，クラレンス・フランク アメリカ合衆国カリフォルニア州92008, カールズバッド，ヴェイルウッド・アベ ニュー 2613 (56)参考文献 米国特許4958013（ＵＳ，Ａ) Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．，111 ［18］，（1989），ｐ6966〜6976

Claims (7)

    (57)【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】問題とするRNAまたはDNAの領域に対してア
    ンチセンスである複数の連結されたヌクレオシドを含
    み、該ヌクレオシドの少なくとも一つがリボヌクレオシ
    ドであって、その２′位へのステロイド分子、レポータ
    ー分子、非芳香族親油性分子、レポーター酵素、ペプチ
    ド、蛋白質、水溶性ビタミン、脂溶性ビタミン、RNA切
    断複合体、金属キレート剤、ポルフィリン、アルキル化
    剤、ハイブリッド ホトヌクレアーゼ／インターカレー
    ターまたはアリールアジド光架橋剤の結合により機能性
    化されている化合物。
  2. 【請求項２】連結部が前記ステロイド分子、レポーター
    分子、非芳香族親油性分子、レポーター酵素、ペプチド
    または蛋白質を前記機能性化ヌクレオシドの２′位に結
    合させている請求項１に記載の化合物。
  3. 【請求項３】前記機能性化ヌクレオシドが、前記ヌクレ
    オシドの２′位に結合されたステロイド分子、ビオチ
    ン、フルオレセイン色素分子、脂環式炭化水素分子、飽
    和または不飽和脂肪酸、ワックス、テルペン、多脂環式
    炭化水素、アダマンタン、バクミンスターフルーレン、
    レポーター酵素、ペプチド、蛋白質、チアミン、リボフ
    ラビン、ニコチン酸、ナイアシン、ピリドキサール、パ
    ントテン酸、ビオチン、葉酸、葉酸メチル、ビタミンB
    12コバミド、イノシトール、コリン、アスコルビン酸、
    レチノイン酸、レチノール、トコフェロール、ビタミン
    Ｄ、ビタミンＫ、EDTA、DTPA、Ｏ−フェナントロリン、
    ホトヌクレアーゼ／インターカレーター、アリールアジ
    ド光架橋剤、フェナントロリン／金属錯体またはビピリ
    ジン／金属錯体を含む請求項１に記載の化合物。
  4. 【請求項４】前記連結部がΩ−アミノアルコキシまたは
    Ω−アミノアルキルアミノ部分を含む請求項２に記載の
    化合物。
  5. 【請求項５】コール酸、デオキシコール酸、デヒドロコ
    ール酸、コルチゾン、テストステロン、コレステロール
    またはジゴキシゲニンが前記ヌクレオシドの２′位に結
    合されている請求項１に記載の化合物。
  6. 【請求項６】連結されたヌクレオシドの少なくとも一つ
    が、２′デオキシ−２′−フルオロ、２′−メトキシ、
    ２′−エトキシ、２′−プロポキシ、２′−アミノアル
    コキシまたは２′−アリルオキシヌクレオシドである請
    求項１に記載の化合物。
  7. 【請求項７】連結されたヌクレオシドの少なくとも二つ
    がホスホロチオエート連結部により連結されている請求
    項１に記載の化合物。
JP5507961A 1991-10-24 1992-10-23 改良された取り込みおよびその他の性質を持つ誘導化オリゴヌクレオチド Expired - Fee Related JP2823959B2 (ja)

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