FR2727970A1 - Conjugues fullerene-oligonucleotide, ou fullerene-nucleotide leurs complexes avec des nanoparticules et leurs utilisations therapeutiques - Google Patents
Conjugues fullerene-oligonucleotide, ou fullerene-nucleotide leurs complexes avec des nanoparticules et leurs utilisations therapeutiques Download PDFInfo
- Publication number
- FR2727970A1 FR2727970A1 FR9414940A FR9414940A FR2727970A1 FR 2727970 A1 FR2727970 A1 FR 2727970A1 FR 9414940 A FR9414940 A FR 9414940A FR 9414940 A FR9414940 A FR 9414940A FR 2727970 A1 FR2727970 A1 FR 2727970A1
- Authority
- FR
- France
- Prior art keywords
- conjugate
- fullerene
- oligonucleotide
- nucleotide
- complex according
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Granted
Links
Classifications
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K9/00—Medicinal preparations characterised by special physical form
- A61K9/48—Preparations in capsules, e.g. of gelatin, of chocolate
- A61K9/50—Microcapsules having a gas, liquid or semi-solid filling; Solid microparticles or pellets surrounded by a distinct coating layer, e.g. coated microspheres, coated drug crystals
- A61K9/51—Nanocapsules; Nanoparticles
- A61K9/5107—Excipients; Inactive ingredients
- A61K9/513—Organic macromolecular compounds; Dendrimers
- A61K9/5138—Organic macromolecular compounds; Dendrimers obtained by reactions only involving carbon-to-carbon unsaturated bonds, e.g. polyvinyl pyrrolidone, poly(meth)acrylates
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
- A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
- A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
- A61K47/52—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an inorganic compound, e.g. an inorganic ion that is complexed with the active ingredient
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
- A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
- A61K47/69—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the conjugate being characterised by physical or galenical forms, e.g. emulsion, particle, inclusion complex, stent or kit
- A61K47/6905—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the conjugate being characterised by physical or galenical forms, e.g. emulsion, particle, inclusion complex, stent or kit the form being a colloid or an emulsion
- A61K47/6907—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the conjugate being characterised by physical or galenical forms, e.g. emulsion, particle, inclusion complex, stent or kit the form being a colloid or an emulsion the form being a microemulsion, nanoemulsion or micelle
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
- A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
- A61K47/69—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the conjugate being characterised by physical or galenical forms, e.g. emulsion, particle, inclusion complex, stent or kit
- A61K47/6921—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the conjugate being characterised by physical or galenical forms, e.g. emulsion, particle, inclusion complex, stent or kit the form being a particulate, a powder, an adsorbate, a bead or a sphere
- A61K47/6927—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the conjugate being characterised by physical or galenical forms, e.g. emulsion, particle, inclusion complex, stent or kit the form being a particulate, a powder, an adsorbate, a bead or a sphere the form being a solid microparticle having no hollow or gas-filled cores
- A61K47/6929—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the conjugate being characterised by physical or galenical forms, e.g. emulsion, particle, inclusion complex, stent or kit the form being a particulate, a powder, an adsorbate, a bead or a sphere the form being a solid microparticle having no hollow or gas-filled cores the form being a nanoparticle, e.g. an immuno-nanoparticle
- A61K47/6931—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the conjugate being characterised by physical or galenical forms, e.g. emulsion, particle, inclusion complex, stent or kit the form being a particulate, a powder, an adsorbate, a bead or a sphere the form being a solid microparticle having no hollow or gas-filled cores the form being a nanoparticle, e.g. an immuno-nanoparticle the material constituting the nanoparticle being a polymer
- A61K47/6935—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the conjugate being characterised by physical or galenical forms, e.g. emulsion, particle, inclusion complex, stent or kit the form being a particulate, a powder, an adsorbate, a bead or a sphere the form being a solid microparticle having no hollow or gas-filled cores the form being a nanoparticle, e.g. an immuno-nanoparticle the material constituting the nanoparticle being a polymer the polymer being obtained otherwise than by reactions involving carbon to carbon unsaturated bonds, e.g. polyesters, polyamides or polyglycerol
- A61K47/6937—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the conjugate being characterised by physical or galenical forms, e.g. emulsion, particle, inclusion complex, stent or kit the form being a particulate, a powder, an adsorbate, a bead or a sphere the form being a solid microparticle having no hollow or gas-filled cores the form being a nanoparticle, e.g. an immuno-nanoparticle the material constituting the nanoparticle being a polymer the polymer being obtained otherwise than by reactions involving carbon to carbon unsaturated bonds, e.g. polyesters, polyamides or polyglycerol the polymer being PLGA, PLA or polyglycolic acid
-
- B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
- B82—NANOTECHNOLOGY
- B82Y—SPECIFIC USES OR APPLICATIONS OF NANOSTRUCTURES; MEASUREMENT OR ANALYSIS OF NANOSTRUCTURES; MANUFACTURE OR TREATMENT OF NANOSTRUCTURES
- B82Y5/00—Nanobiotechnology or nanomedicine, e.g. protein engineering or drug delivery
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07H—SUGARS; DERIVATIVES THEREOF; NUCLEOSIDES; NUCLEOTIDES; NUCLEIC ACIDS
- C07H21/00—Compounds containing two or more mononucleotide units having separate phosphate or polyphosphate groups linked by saccharide radicals of nucleoside groups, e.g. nucleic acids
Landscapes
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Nanotechnology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Epidemiology (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Public Health (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Immunology (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Dispersion Chemistry (AREA)
- Biophysics (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Medical Informatics (AREA)
- Crystallography & Structural Chemistry (AREA)
- Inorganic Chemistry (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Optics & Photonics (AREA)
- Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
- Medicinal Preparation (AREA)
Abstract
Conjugués entre des fullérènes, en C60 à C84 , et des oligonucléotides, ou des nucléotides, et complexes formés entre ces conjugués et des nanoparticules, telles que des particules de polyalkylcyanoacrylate. Ces conjugués et ces complexes peuvent être utilisés comme médicaments, en particulier pour le traitement des pathologies cancéreuses ou pour le traitement de maladies virales.
Description
La présente invention a pour objet des conjugués fullérène-oligonucléotide et des conjugués fullérènenucléotide ainsi que des complexes comprenant de tels conjugués associés à des nanoparticules.
Elle est en outre relative à l'utilisation thérapeutique de ces conjugués et complexes.
Les oligonucléotides peuvent être utilisés aussi bien à l'encontre d'acides nucléiques simple brin que d'ARN messager ou d'ADN double brin (Hélène et Toulmé, Biochim, Biophys.
Acta, 1990, 1049, 99-1258); Thuong et Hélène, Angew, Chem.
1993, 105, 697-726; Angew. Chem. Int. Ed. Engl. 1993, 32, 666690) pour bloquer la traduction de 1'ARN messager cible (stratégie anti-sens) ou la transcription du gène cible par la formation d'une triple hélice (stratégie anti-gène).
La substitution d'oligonucléotides par des agents réactifs peut induire des réactions irréversibles sur la séquence cible. Des substituants hydrophobes peuvent aussi être utilisés pour améliorer la fixation dans des systèmes biologiques (Boutourine et al. Biochimie, 1992, 74, 485-489;
Krieg et al, Proc. Natl. Acad. Sci, USA 1993, 90, 1048-1052).
Krieg et al, Proc. Natl. Acad. Sci, USA 1993, 90, 1048-1052).
Des études récentes sur la chimie des fullérènes ont permis d'obtenir des fullérènes fonctionnalisés (Diederich et
Rubin, Angew. Chem. 1992, 104, 1123-1146; Angew. Chem. Int.
Rubin, Angew. Chem. 1992, 104, 1123-1146; Angew. Chem. Int.
Ed. Engl. 1992, 31, 1101-1123; Tokuyama et al, J. Am. Chem.
Soc. 1993, 115, 7918-7919).
Des publications (Friedman et al; J. Am. Chem. Soc.
1993, 115, 6506-6509; Shinazi et al., Antimier, Agents
Chemothr. 1993, 37, 1707-1710) ont montré que des fullérènes modifiés de manière adéquate ont une activité biologique sur des cellules vivantes, des enzymes, des virus et de 1'ADN.
Chemothr. 1993, 37, 1707-1710) ont montré que des fullérènes modifiés de manière adéquate ont une activité biologique sur des cellules vivantes, des enzymes, des virus et de 1'ADN.
Ainsi, l'irradiation d'un mélange d'ADN et du fullerène
C60 lié à un acide carboxylique, par une lumière à faible énergie induit des clivages spécifiques au niveau des guanines sur les brins d'ADN. Cette sélectivité de clivage a été attribuée à l'action d'une espèce activée de l'oxygène générée par la photoactivation de la molécule de fullérène. Des expériences récentes (Tokuyama et Nakamura, J. Org. Chem.
C60 lié à un acide carboxylique, par une lumière à faible énergie induit des clivages spécifiques au niveau des guanines sur les brins d'ADN. Cette sélectivité de clivage a été attribuée à l'action d'une espèce activée de l'oxygène générée par la photoactivation de la molécule de fullérène. Des expériences récentes (Tokuyama et Nakamura, J. Org. Chem.
1994, 59, 1135-1138) ont mis en évidence que l'acide carboxylique en C60 génère ces espèces activées de l'oxygène dans l'eau.
Néanmoins, les méthodes décrites dans l'état de la technique ne permettent pas de cliver en un site spécifique une molécule d'ADN.
Le demandeur s'est donc attaché à résoudre ce problème.
I1 a trouvé que le couplage d'un fullérène avec un oligonucléotide, spécifique du site dans lequel doit être introduit le clivage, aboutit à un clivage spécifique de ce site.
La présente invention a donc pour objet un conjugué fullérène-oligonucléotide ou fullérène-nucléotide, dans lequel ledit fullérène est avantageusement un fullérène en C60 à C84.
De tels fullérènes peuvent être en particulier ceux décrits par Diederich et Rubin (1992 précédemment cités) et en particulier un fullérène en C60, ou un fullérène supérieur en
C70 ou en C84.
C70 ou en C84.
L'oligonucléotide lié de manière covalente au fullérène afin de former le conjugué mentionné ci-dessus, est avantageusement un oligonucléotide simple brin et peut comprendre de 2 à 100 nucléotides.
De tels oligonucléotides présentent une séquence complémentaire de celle du site dans la molécule d'ADN ou d'ARN dans lequel doit être introduit la coupure ou le clivage, appelée aussi molécule cible.
De tels ADN ou ARN cibles peuvent être par exemple des séquences de virus ou des séquences de gènes intervenant dans des pathologies cancéreuses et/ou virales.
Le conjugué mentionné ci-dessus peut aussi être associé à une nanoparticule sous la forme d'un complexe, et en particulier à une nanoparticule hydrophobe.
Avantageusement, une telle nanoparticule est formée d'un acide polylactique ou d'un copolymère acide polylactiqueglycolique, éventuellement associés à du polyéthylène glycol, ou d'un polyalkylcyanoacrylate tel que le polyisohexylcyanoacrylate.
Ces dernières particules sont décrites par Chavany et al, (Pharmaceutical Research, 1992, 9, 441.)
Les conjugués non associés à une nanoparticule, forment des structures observables en microscopie électronique qui peuvent être des filaments de l'ordre de plusieurs dizaines de nanomètres de longueur, et présentant un diamètre inférieur à 10 nm, ou des micelles de l'ordre de 40 à 50 nm de diamètre.
Les conjugués non associés à une nanoparticule, forment des structures observables en microscopie électronique qui peuvent être des filaments de l'ordre de plusieurs dizaines de nanomètres de longueur, et présentant un diamètre inférieur à 10 nm, ou des micelles de l'ordre de 40 à 50 nm de diamètre.
En présence de nanoparticules de polyisohexylcyanoacrylate, les filaments disparaissent et les conjugués s'associent aux nanoparticules. Un avantage particulier de ces complexes réside en l'absence de cations hydrophobes comme le bromure de cétyltriméthylammonium (CTAB), considérés comme cytotoxiques.
Un autre avantage de l'association de ces conjugués à des nanoparticules hydrophobes réside dans une amélioration de l'absorption de ces conjugués sur les membranes cellulaires, et de ce fait dans une amélioration de la pénétration de ces conjugués dans les cellules vivantes.
Les conjugués selon la présente invention, seuls ou associés sous forme de complexes, peuvent se fixer sur diverses molécules, telles que des ARN messager et viraux (stratégie antisens et pince oligonucléotidique), sur des ADN (stratégie triple hélice ) ou sur des protéines (stratégie aptamères).
On notera en outre que le dérivé du fullérène en C60, qui est avantageusement utilisé pour la formation de conjugués selon l'invention, présente une absence de toxicité chez la souris, la dose létale étant supérieure à 500 mg/kg.
Les conjugués objet de la présente invention, et leurs complexes formés avec des nanoparticules, peuvent être utilisés à des fins thérapeutiques, afin d'inhiber totalement ou partiellement l'expression d'un gène donné, par exemple en inhibant la transcription du gène ou la traduction de 1'ARN messager, soit en l'absence soit en présence d'irradiation par la lumière visible ou ultraviolette.
De tels gènes peuvent être en particulier des gènes responsables ou intervenant dans des pathologies du type cancer, tels que les oncogènes, ou des gènes de virus tels que le virus HIV.
La présente invention du fait de la spécificité de fixation de l'oligonucléotide présente l'avantage de pouvoir intervenir de manière très spécifique dans des régions précises de gènes dont on connaît au moins partiellement la séquence.
La présente invention a donc pour objet des compositions pharmaceutiques contenant une quantité efficace d'un conjugué ou d'un complexe tel que décrit ci-dessus, en association avec des excipients pharmacologiquement compatibles. Une telle composition comprendra avantageusement de 1 yg à 10 mg du conjugué objet de la présente invention.
La présente invention est en outre relative à un médicament contenant un tel conjugué ou un tel complexe.
Elle a de plus pour objet l'utilisation d'un tel conjugué ou d'un tel complexe pour la fabrication d'un médicament pour le traitement de pathologies comme le cancer, ou pour le traitement de maladies virales.
Une autre utilisation des conjugués selon la présente invention consiste en l'analyse de fragments d'ADN. Pour ce faire, les préparations d'ADN à analyser sont mises en présence des conjugués, ou de leurs complexes, et sont traités avec une lumière à faible énergie, puis les produits de réaction sont mis en évidence par des méthodes connues de l'homme du métier.
Avantageusement, les conjugués, ou leurs complexes, sont administrés par injection intraveineuse, par voie intradermique ou par application locale. L'individu auquel a été administré ces molécules peut en outre être traité par une lumière à faible énergie.
La présente invention est en outre relative à un procédé de fabrication d'un conjugué tel que décrit ci-dessus, comprenant une activation du fullérène et de l'oligonucléotide, ou du nucléotide, permettant leur couplage covalent.
Avantageusement, un tel procédé comprend les étapes suivantes:
- réaction d'un dérivé du fullérène comportant un groupe hydroxyle et de bromure de bromoacétate selon le schéma
I ci-après,
- introduction d'un groupement thiol sur un oligonucléotide ou un nucléotide non bloqué par réaction dudit oligonucléotide ou nucleotide avec de la N-méthylimidazole puis avec de la cystamine et création du groupe thiol par réaction du produit ainsi obtenu avec du dithiotreitol, selon le schéma II ci-après dans lequel Nu représente un nucléotide,
- mise en contact des produits des deux étapes précédentes en présence de pyridine.
- réaction d'un dérivé du fullérène comportant un groupe hydroxyle et de bromure de bromoacétate selon le schéma
I ci-après,
- introduction d'un groupement thiol sur un oligonucléotide ou un nucléotide non bloqué par réaction dudit oligonucléotide ou nucleotide avec de la N-méthylimidazole puis avec de la cystamine et création du groupe thiol par réaction du produit ainsi obtenu avec du dithiotreitol, selon le schéma II ci-après dans lequel Nu représente un nucléotide,
- mise en contact des produits des deux étapes précédentes en présence de pyridine.
Le produit final est un conjugué présentant, dans le cas d'un fullérène en C60 la formule selon le schéma III ciapres.
L'homme du métier se reportera avantageusement au manuel: Maniatis et al. 1982 Molecular Cloning- A Laboratory
Manual- CSM ed. New York ou à l'une de ses récentes rééditions pour la mise en oeuvre de la présente invention.
Manual- CSM ed. New York ou à l'une de ses récentes rééditions pour la mise en oeuvre de la présente invention.
La présente invention est illustrée sans pour autant être limitée par les exemples suivants dans lesquels
Les figures la à ld illustrent respectivement le conjugué utilisé (figure la) et les molécules cibles hybridées audit conjugué, qui sont un ADN simple brin (figure nid), un
ADN double brin (figure lc) ou un ADN double brin présentant une boucle (figure nid). Sur les figures lb à id, les flèches représentent les sites de coupure.
Les figures la à ld illustrent respectivement le conjugué utilisé (figure la) et les molécules cibles hybridées audit conjugué, qui sont un ADN simple brin (figure nid), un
ADN double brin (figure lc) ou un ADN double brin présentant une boucle (figure nid). Sur les figures lb à id, les flèches représentent les sites de coupure.
Le résultat de ces coupures est mis en évidence sur la figure 2 qui est un gel d'électrophorèse de la structure présentant une boucle, représentée sur la figure id, mis en présence du conjugué représenté sur la figure la, sans pipéridine ( puits 1 à 5) ou en présence de pipéridine (puits 7 à 11), non irradié (puits 1 et 7) ou irradié par une lumière à faible énergie durant 15 minutes (puits 2 et 8), 30 minutes (puits 3 et 9), 45 minutes (puits 4 et 10), et 60 minutes (puits 5 et 11). Le gel a été analysé à l'aide d'un phosphorimageur. Le puits 6 correspond à la séquence des résidus G obtenue après traitement avec le diméthylsulfate et la pipéridine.
La séquence dans la région de coupure et la localisation des résidus guanine sont indiquées (la numérotation débute à partir de l'extrémité 5').
EXEMPLE 1
Préparation d'un conjugué fullérène en C60-oliqonucléotide.
Préparation d'un conjugué fullérène en C60-oliqonucléotide.
1 ) Formation d'un qroupement réactif sur un méthanofullérène
Un dérivé du fullérène tel que décrit par Diederich et
Rubin (1992, précédemment cités) et Tokuyama et ai. (1993, précédemment cités) est mis à réagir avec du bromure de bromoacétate en présence de pyridine, dans du toluène à 20'C durant vingt minutes.
Un dérivé du fullérène tel que décrit par Diederich et
Rubin (1992, précédemment cités) et Tokuyama et ai. (1993, précédemment cités) est mis à réagir avec du bromure de bromoacétate en présence de pyridine, dans du toluène à 20'C durant vingt minutes.
2 ) Préparation de l'oliqonucléotide.
Un oligonucléotide non bloqué est mis à réagir avec de la N-méthylimidazole en présence de triphénylphosphine et de bis(2-thiopyridine) dans le diméthylsulfoxide ou le diméthylformamide à 20"C.
Le produit obtenu est mis en présence de cystamine pendant 20 minutes puis de dithiotréitol afin d'obtenir un dérivé thiol.
3 ) Fabrication du coniuqué.
Les produits des deux étapes précédentes sont mis à réagir en présence de triéthylamine dans de la pyridine à 20"C.
Le rendement de cette réaction est de l'ordre de 30 à 40%.
Le conjugué présente une couleur marron-rouge, est soluble dans l'eau et précipite dans de l'éthanol ou du Lit104 dans de l'acétone.
La purification du conjugué par CHLP n'est pas possible en raison de l'adsorption irréversible du conjugué sur les supports de gel de silice modifié.
Sur des gels de polyacrylamide le conjugué forme des agrégats dans les puits. L'électrophorèse sur des gels d'agarose à 1% comprenant du Triton X100 à 0,1 % révèle une bande homogène colorée migrant plus lentement que les oligonucléotides non conjugués. Cette technique a été utilisée pour purifier le conjugué des oligonucléotides n'ayant pas reagi.
EXEMPLE 2
Coupure de diverses molécules cibles d'ADN par le conjugué svnthétisé dans l'exemple 1.
Coupure de diverses molécules cibles d'ADN par le conjugué svnthétisé dans l'exemple 1.
Trois oligodésoxynucléotides différents ont été utilisés comme cible afin de tester les propriétés de coupure en présence de lumière d'un conjugué obtenu selon l'exemple 1 et comprenant un fullérène en C60 conjugué à un oligonucléotide de 14 nucléotides.
Une représentation schématique de ce conjugué est celle de la figure la, sur laquelle la séquence de l'oligonucléotide est représentée.
Les trois molécules cibles sont:
- un oligonucléotide de 20 nucléotides (figure lb);
- un oligonucléotide double brin de 26 paires de bases (figure tic);
- un oligonucléotide de 41 nucléotides partiellement double brin et présentant une structure en boucle de cinq bases (figure nid).
- un oligonucléotide de 20 nucléotides (figure lb);
- un oligonucléotide double brin de 26 paires de bases (figure tic);
- un oligonucléotide de 41 nucléotides partiellement double brin et présentant une structure en boucle de cinq bases (figure nid).
L'irradiation des complexes formés après mise en présence du conjugué et des molécules cibles a été effectuée à l'aide d'une lampe à Xenon (1000 W) à travers un filtre absorbant la lumière à des longueurs d'ondes inférieures à 310 nm, dans un tampon contenant 10 mM cacodylate, pH 6, 50 mM
NaCl, 50-100 nM de molécule cible, avec des concentrations croissantes du conjugué ( de 1 à 60 pM).
NaCl, 50-100 nM de molécule cible, avec des concentrations croissantes du conjugué ( de 1 à 60 pM).
Les trois molécules cibles ont été marquées à l'extrémité 5' par 32P à l'aide de gamma32p-ATP et de polynucléotide kinase ( commercialisée par Amersham).
L'analyse par électrophorèse a été effectuée sur un gel de polyacrylamide à 12 % dénaturant, avant et après le traitement par la pipéridine.
La figure 2 montre que la photo-coupure induite par le conjugué a lieu à des sites bien définis dans les molécules cibles, contrairement au résultat obtenu avec des acides carboxyliques en C60 non conjugués, décrits précédemment. On observe que des coupures ont lieu principalement sur les guanines mais aussi sur les thymines, bien qu'avec une efficacité plus faible.
Le traitement à la pipéridine augmente légèrement l'intensité des bandes de coupure du gel.
La comparaison des bandes générées après traitement à la pipéridine après la réaction avec le diméthylsulfate (DMS) suggère que les fragments obtenus par coupure photo-induite se termine par un 3' phosphate.
La localisation des sites de coupure sur les trois molécules cibles est représentée sur les figures lb, îc et Id.
Les guanines les plus réactives sont localisées dans la région en forme de boucle de la structure tige-boucle (figure 1d).
Sur 1'ADN double brin, les coupures ont lieu sur les guanines du brin contenant des purines, à proximité de l'extrémité 3' du troisième brin de la structure formée (figure tic).
Aucune coupure n'est observée sur l'autre brin du double brin, qui ne contient aucune guanine, à proximité de l'extrémité 3' du troisième brin.
Sur la molécule cible simple brin ( figure lb) des coupures photo-induites ont lieu sur des guanines à proximité de l'extrémité 3' du conjugue formé.
Les coupures ont lieu quasi exclusivement sur des bases guanines, ce qui est en accord avec l'hypothèse d'une intervention d'une espèce activée de l'oxygène.
Les résultats indiquent que la partie fullérène du conjugué n'empêche pas la formation de structure double brin ou triple brin.
En outre, ils montrent que le conjugué oligonucléotidefullérène se fixe spécifiquement sur la séquence cible en simple ou en double brin.
<tb> <SEP> R <SEP> o
<tb> <SEP> n
<tb> Hzzeq <SEP> SS~ <SEP> II <SEP> H~S0 >
<tb> <SEP> o' <SEP> N'
<tb> <SEP> o
<tb> <SEP> Nu(--iu)n
<tb> <SEP> Nu(Nu)n
<tb>
SCHEMA II
<tb> <SEP> n
<tb> Hzzeq <SEP> SS~ <SEP> II <SEP> H~S0 >
<tb> <SEP> o' <SEP> N'
<tb> <SEP> o
<tb> <SEP> Nu(--iu)n
<tb> <SEP> Nu(Nu)n
<tb>
SCHEMA II
SCHEMA III
Claims (15)
1. Conjugué entre un fullérène et un oligonucléotide ou un nucléotide.
2. Conjugué selon la revendication 1, caractérisé en ce que ledit fullérène est en C60 à C84.
3. Conjugué selon l'une des revendications 1 et 2, caractérisé en ce que ledit fullérène est en C60.
4. Conjugué selon l'une des revendications 1 à 3, caractérisé en ce que ledit oligonucléotide est simple brin.
5. Conjugué selon l'une des revendications 1 à 4, caractérisé en ce que ledit oligonucléotide comprend de 2 à 100 nucléotides.
6. Complexe comprenant un conjugue selon l'une des revendications 1 à 5 associé à une nanoparticule.
7. Complexe selon la revendication 6, caractérisé en ce que ladite particule est hydrophobe.
8. Complexe selon l'une des revendications 6 et 7, caractérisé en ce que ladite particule est formée de polyalkylcyanoacrylate et avantageusement de polyisohexylcyanoacrylate.
9. Complexe selon l'une des revendications 6 et 7, caractérisé en ce que ladite particule est formée d'acide polylactique ou d'un copolymère acide polylactique-glycolique, éventuellement associés à du polyéthylène glycol.
10. Composition pharmaceutique contenant une quantité efficace d'un conjugué ou d'un complexe selon l'une des revendications 1 à 9 en association avec des excipients pharmacologiquement compatibles.
11. Médicament contenant un conjugué ou un complexe selon l'une des revendications 1 à 9.
12. Utilisation d'un conjugué ou d'un complexe selon l'une des revendications 1 à 9 pour la fabrication de médicaments pour le traitement des pathologies de type cancéreuses.
13. Utilisation d'un conjugué ou d'un complexe selon l'une des revendications 1 à 9 pour la fabrication d'un médicament pour le traitement des maladies virales.
14. Procédé de fabrication d'un conjugué selon l'une des revendications 1 à 5, comprenant une activation du fullérène et de l'oligonucléotide, ou du nucléotide, permettant leur couplage covalent.
15. Procédé de fabrication d'un conjugué selon la revendication 14 comprenant les étapes suivantes:
- réaction d'un dérivé du fullérène comportant un groupe hydroxyle et de bromure de bromoacétate,
- introduction d'un groupement thiol sur un oligonucléotide, ou un nucléotide, non bloqué par réaction dudit oligonucléotide, ou nucléotide, avec de la Nméthylimidazole puis avec de la cystamine et création du groupement thiol par réaction du produit ainsi obtenu avec du dithiotreitol, et
- mise en contact des produits des deux étapes précédentes en présence de pyridine.
Priority Applications (2)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
FR9414940A FR2727970A1 (fr) | 1994-12-12 | 1994-12-12 | Conjugues fullerene-oligonucleotide, ou fullerene-nucleotide leurs complexes avec des nanoparticules et leurs utilisations therapeutiques |
PCT/FR1995/001649 WO1996018635A1 (fr) | 1994-12-12 | 1995-12-12 | Conjugues fullerene-oligonucleotide, ou fullerene-nucleotide, leurs complexes avec des nanoparticules et leurs utilisations theraputiques |
Applications Claiming Priority (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
FR9414940A FR2727970A1 (fr) | 1994-12-12 | 1994-12-12 | Conjugues fullerene-oligonucleotide, ou fullerene-nucleotide leurs complexes avec des nanoparticules et leurs utilisations therapeutiques |
Publications (2)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
FR2727970A1 true FR2727970A1 (fr) | 1996-06-14 |
FR2727970B1 FR2727970B1 (fr) | 1997-02-28 |
Family
ID=9469718
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
FR9414940A Granted FR2727970A1 (fr) | 1994-12-12 | 1994-12-12 | Conjugues fullerene-oligonucleotide, ou fullerene-nucleotide leurs complexes avec des nanoparticules et leurs utilisations therapeutiques |
Country Status (2)
Country | Link |
---|---|
FR (1) | FR2727970A1 (fr) |
WO (1) | WO1996018635A1 (fr) |
Families Citing this family (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
WO2021162725A1 (fr) * | 2020-02-16 | 2021-08-19 | Butzloff Peter Robert | Composition électrodynamique à pivotement et médicament |
Citations (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
WO1993007883A1 (fr) * | 1991-10-24 | 1993-04-29 | Isis Pharmaceuticals, Inc. | Oligonucleotides derives presentant diverses qualites dont une meilleure facilite d'absorption |
-
1994
- 1994-12-12 FR FR9414940A patent/FR2727970A1/fr active Granted
-
1995
- 1995-12-12 WO PCT/FR1995/001649 patent/WO1996018635A1/fr active Application Filing
Patent Citations (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
WO1993007883A1 (fr) * | 1991-10-24 | 1993-04-29 | Isis Pharmaceuticals, Inc. | Oligonucleotides derives presentant diverses qualites dont une meilleure facilite d'absorption |
Non-Patent Citations (9)
Title |
---|
A.M.KRIEG ET AL.: "Modification of Antisense Phosphodiester Oligodeoxynucleotides by a 5'-Cholesteryl Moiety Increases Cellular Modification and Improves Efficacy.", PROCEEDINGS OF THE NATIONAL ACADEMY OF SCIENCES OF USA., vol. 90, no. 3, 1993, WASHINGTON US, pages 1048 - 1052 * |
ANTIMICROB. AGENTS CHEMOTHER., vol. 37, no. 8, 1993, pages 1707 - 1710 * |
CHEM. PHYS. LETT., vol. 202, no. 5, 1993, pages 384 - 388 * |
CHEMICAL ABSTRACTS, vol. 118, no. 10, 1993, Columbus, Ohio, US; abstract no. 88169a, P.M.AJAYAN ET AL.: "Distribution of Pentagons and Shapes in Carbon Nano-tubes and Nano-particles." page 499; column 2; * |
CHEMICAL ABSTRACTS, vol. 120, no. 5, 1994, Columbus, Ohio, US; abstract no. 45238w, R.F.SCHINAZI ET AL.: "Synthesis and Virucidal Activity of a Water-Soluble Configurationally Stable, Derivatized C60 Fullerene." page 30; column 2; * |
CHEMICAL ABSTRACTS, vol. 122, no. 1, 1995, Columbus, Ohio, US; abstract no. 358k, R.F.SCHINAZI ET AL.: "Anti-Human Immunodeficiency Virus, Toxicity in Cell Culture, and Tolerance in Mammals of a Water-Soluble Fullerene." page 36; column 1; * |
H.TOKUYAMA ET AL.: "Photoinduced Biochemical Activity of Fullerene Carboxylic Acid.", JOURNAL OF THE AMERICAN CHEMICAL SOCIETY., vol. 115, 1993, GASTON, PA US, pages 7918 - 7919 * |
PROC. - ELECTROCHEM. SOC., vol. 94, no. 24, 1994, pages 689 - 696 * |
S.H.FRIEDMAN ET AL.: "Inhibition of the HIV-1 Protease by Fullerene Derivatives : Model Building Studies and Experimental Verification.", JOURNAL OF THE AMERICAN CHEMICAL SOCIETY., vol. 115, 1993, GASTON, PA US, pages 6506 - 6509 * |
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
WO1996018635A1 (fr) | 1996-06-20 |
FR2727970B1 (fr) | 1997-02-28 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
Shi et al. | Effects of tetrahedral DNA nanostructures on autophagy in chondrocytes | |
Sharma et al. | Versatility of peptide nucleic acids (PNA s): Role in chemical biology, drug discovery, and origins of life | |
Tam et al. | Photoresponsive self‐assembled DNA nanomaterials: design, working principles, and applications | |
Carneiro et al. | Long-range assembly of DNA into nanofibers and highly ordered networks using a block copolymer approach | |
JPH10501237A (ja) | オリゴヌクレオチドのためのシクロデキストリン細胞送達系 | |
US20080177053A1 (en) | DNA nanocage by self-organization of DNA and process for producing the same, and DNA nanotube and molecule carrier using the same | |
Fang et al. | Cleaving DNA by nanozymes | |
WO2011072133A1 (fr) | Compositions thérapeutiques et procédés pour la distribution d'agents actifs liés de manière clivable à des nanoparticules | |
JPH06506834A (ja) | 閉鎖アンチセンス及びセンスオリゴヌクレオチドとそれらの適用 | |
CA2180032C (fr) | Controle de l'expression de genes | |
JPWO2006101173A1 (ja) | 核酸分子とコラーゲンの複合体微細粒子製剤 | |
US9359282B2 (en) | Functionalized nanodiamonds as delivery platforms for nucleic acids | |
US20220380809A1 (en) | Delivery of intact crispr/cas9 protein using supramolecular nanoparticle (smnp) vectors | |
FR2727970A1 (fr) | Conjugues fullerene-oligonucleotide, ou fullerene-nucleotide leurs complexes avec des nanoparticules et leurs utilisations therapeutiques | |
FR2926818A1 (fr) | siRNA CATIONIQUES, SYNTHESE ET UTILISATION POUR L'ARN INTERFERENCE | |
FR2697254A1 (fr) | Conjugués constitués par un oligonucléotide lié à des dérivés de métalloporphyrine cationique, leur préparation et leur utilisation. | |
CN101015696A (zh) | 一种反义寡聚核苷酸-碳纳米管药物载体 | |
Ts et al. | Nonionic Oligonucleotide Analogs (Matagen™) as Anticodic Agents in Duplex and Triplex Formation | |
Babele et al. | Carbon nanotubes: A review on risks assessment, mechanism of toxicity and future directives to prevent health implication | |
KR20130022671A (ko) | 전립선암 특이적 siRNA 전달체 | |
JP5605793B2 (ja) | β−1,3−グルカン/核酸複合体の調製方法 | |
Dai et al. | Facile construction of a DNA tetrahedron in unconventional ladder-like arrangements at room temperature | |
FR2649321A1 (fr) | Compositions a base de derives nucleotidiques, leurs procedes de preparation, et leurs utilisations notamment en tant que compositions pharmaceutiques | |
JP2023535287A (ja) | TdTに基づく酵素的核酸の基質としての塩基修飾ヌクレオチド | |
JPH07504885A (ja) | 治療用化合物 |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
ST | Notification of lapse |