JP5605793B2

JP5605793B2 - β−１，３−グルカン／核酸複合体の調製方法

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Publication number: JP5605793B2
Application number: JP2010043592A
Authority: JP
Inventors: 和朗櫻井; 慎一望月; 翼松崎
Original assignee: Japan Science and Technology Agency; National Institute of Japan Science and Technology Agency
Current assignee: Japan Science and Technology Agency; National Institute of Japan Science and Technology Agency
Priority date: 2010-02-27
Filing date: 2010-02-27
Publication date: 2014-10-15
Anticipated expiration: 2030-02-27
Also published as: JP2011178707A

Description

本発明は、β−１，３−グルカンと核酸から成る複合体の調製に関し、特に、塩基性水溶液を用いての製造方法、さらに未反応のβ−１，３−グルカン、核酸を除去し複合体を精製することに関する。

ヒトゲノムの解読が１９５３年のＤＮＡ二重らせん構造の発見から５０年となる２００３年に完了した。現在は各種のタンパク質の活性メカニズムとその相互作用の解明が進められている。さらに、最近はタンパク質をコードしていないＲＮＡが遺伝子の転写や翻訳を制御していることが分かってきた。こうした成果を応用するひとつの方法に、生理活性のある短い人工的核酸（核酸医薬）を用いて生体機能を操作する技術が提唱されている。しかし、天然型の核酸であるリン酸エステル型ＤＮＡやＲＮＡは生体中では、核酸分解酵素やタンパク質との非特異的吸着によって極めて短時間で失活する。このため、天然型の核酸医薬品は、ヒトの臨床研究では有意な効果をもたらしていない。

上述した天然型の核酸の問題点、すなわち、生体環境内や培養液中において短時間で失活するとの問題点を解決するために、天然型の核酸を化学的に修飾した化学修飾核酸、天然の核酸によく似た類似核酸が多く提案されている。前者の例では、例えば、今西らが提案した、リボースの２’位の酸素原子と４’位の炭素原子とをメチレン基またはエチレン基等で架橋したＬＮＡ（locked nucleic acid）と呼ばれる化学修飾核酸（非特許文献１）や、天然型のリン酸エステルの酸素原子をイオウ原子で置換したＳオリゴと呼ばれる化合物が知られている。また、後者では、核酸の主鎖にアミド結合を導入したＰＮＡ（ペプチド核酸）と呼ばれる化合物が知られている（非特許文献２）。これらを総称して核酸アナログと呼ぶ。核酸アナログは、天然型核酸の問題であった失活までの時間を大幅に伸ばす事に成功した。これは、核酸分解酵素が核酸アナログを認識できないためである。しかし、生体内でタンパク質と非特異的に吸着し予期せぬ生理活性、重篤な肝障害を引き起こすなど、非天然であるが故の毒性が問題になっている（非特許文献３）。

天然型の核酸を生体適合性のある化合物に内包して送り届ける技術も提案されてきた。レトロウイルス（非特許文献４）またはアデノウイルス（非特許文献５）等は、遺伝子キャリアとしてin vitroでは極めて見込みのある結果を与えたが、これら天然由来のウイルスの炎症性、免疫原的性質、ならびに突然変異誘発および細胞ゲノム中への組み込みの危険性が特に原因してこれらのin vivoにおける使用は制限されている。

そこで、天然由来の遺伝子キャリアの代替物として、ウイルス系よりも取り扱いが簡単であるのみならず、細胞へＤＮＡを確実に効率良く集中させることが可能な人工材料の非ウイルスキャリヤーの使用が提示された（非特許文献６）。これまでに、非ウイルス性の人工キャリアとしてポリエチレングリコール修飾したポリカチオン（非特許文献７）、ポリエチレンイミン（非特許文献８）、カチオン性ポリマーのブロック共重合体（非特許文献９）、デンドリマー（非特許文献１０）などが開発されてきた。しかし、こうしたカチオン性高分子の安全性は確認されていない。カチオン性を有するには、アミノ基の存在が不可欠であるが、アミノ基は生理活性が高く、体内毒性等の危険がある。

本発明者らはこれまでに遺伝子キャリアとしてβ−１，３−グルカンに着目し、β−１，３−グルカンが核酸医薬（アンチセンスＤＮＡ、ＣｐＧＤＮＡ）と新しいタイプの複合体を形成することを見出してきた（特許文献１、２、非特許文献１１、１２）。

もともと天然では、３重らせんで存在するこの多糖をジメチルスルホキシド（DMSO）等の非プロトン性極性有機溶媒に溶解して１本鎖に解離させた後に、１本鎖の核酸を加え、溶媒を水に戻すことによって、核酸１本及び多糖２本からなる３重らせん複合体が形成することを見出した。この場合、当該多糖と核酸の複合体は主として水素結合と疎水性相互作用に因るものと考えられている（非特許文献１３）。

しかしながら、上記の多糖／核酸複合体の調製過程において非プロトン性極性有機溶媒を用いているため、上記方法により調製される複合体溶液中にも、低濃度ではあるが非プロトン性極性有機溶媒が残存していると考えられる。複合体の臨床応用を考慮に入れると、有機溶媒が残存している薬剤を用いることは望ましくない。

β−１，３−グルカンの３重らせん調製過程において非プロトン性極性有機溶媒を用いない方法として、例えば、０．１Ｎ以上の水酸化ナトリウム水溶液にβ−１，３−グルカンを溶解させ、１本鎖に解離させ、強酸による中和、及び水による透析により３重らせんを作製する方法が報告されている（非特許文献１４−１７）。しかし、この方法の場合、強酸による中和時に局所的にｐＨが低下し、ＤＮＡが加水分解を起こしたり、複合体が分解したりするおそれがある。

国際公開第０１／３４２０７号パンフレット国際公開第０２／０７２１５２号パンフレット

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本発明は上記課題に鑑みなされたもので、有機溶媒を用いずにβ−１，３−グルカンと核酸から成る複合体を、高収率かつ高純度で調製する方法を提供することを目的とする。

本発明者らは、非プロトン性極性有機溶媒の代わりに塩基性水溶液にβ−１，３−グルカンを溶解させることによって３重らせん構造を取るβ−１，３−グルカンを１本鎖に解離させ、この溶液に核酸を含む緩衝液を混合して溶液を中和し、かつ適当な時間インキュベートすることで、１本鎖核酸と２本のβ−１，３−グルカン分子鎖とからなる３重らせん状のβ−１，３−グルカン／核酸複合体を高収率で調製できることを見出し、本発明を完成するに至った。

すなわち、本発明は、次の態様に係るものである。
（１）核酸を溶解したｐＨ４．０〜８．０の水系緩衝液と、β−１，３−グルカンを溶解した塩基性水溶液とを混合し、インキュベートすることにより、２本のβ−１，３−グルカン分子鎖と１本鎖核酸とからなる３重らせん構造を有するβ−１，３−グルカン／核酸複合体を調製する工程と、ゲル濾過クロマトグラフィー（ＧＰＣ）及び陰イオン交換クロマトグラフィーの一方又は双方を用いて前記β−１，３−グルカン／核酸複合体を含有する溶液を処理することにより該β−１，３−グルカン／核酸複合体を形成していないβ−１，３−グルカン及び核酸を除去し、前記β−１，３−グルカン／核酸複合体を精製する工程とを有するβ−１，３−グルカン／核酸複合体の調製方法。
（２）前記β−１，３−グルカン／核酸複合体を精製する工程において、前記β−１，３−グルカン／核酸複合体を含有する溶液を、まず陰イオン交換クロマトグラフィー、次いでゲル濾過クロマトグラフィー（ＧＰＣ）で処理する（１）記載のβ−１，３−グルカン／核酸複合体の調製方法。
（３）前記塩基性水溶液として、０．１Ｎ以上１Ｎ以下の水酸化ナトリウム水溶液を用いる（１）及び（２）のいずれか１項記載のβ−１，３−グルカン／核酸複合体の調製方法。
（４）多糖との結合部位として塩基配列（Ｘ）_ｎ［Ｘは任意のリボヌクレオチド及びデオキシリボヌクレオチドのいずれかを表し、ｎは自然数を表す。］で表されるポリヌクレオチド鎖を有する核酸を用いる（１）から（３）のいずれか１項記載のβ−１，３−グルカン／核酸複合体の調製方法。
（５）前記Ｘが、デオキシアデノシン（ｄＡ）及びシチジン（Ｃ）のいずれかである（４）記載のβ−１，３−グルカン／核酸複合体の調製方法。
（６）前記ｎの値が２０以上８０以下である（４）及び（５）のいずれか１項記載のβ−１，３−グルカン／核酸複合体の調製方法。
（７）水系緩衝液として、ｐＨ４．０〜８．０のリン酸系緩衝液及びトリス系緩衝液から選択される緩衝液を用いる（１）から（６）のいずれか１項記載のβ−１，３−グルカン／核酸複合体の調製方法。

３重らせん構造が解離し１本鎖となったβ−１，３−グルカンを含む塩基性水溶液中に核酸を添加し溶液を中和すると、２本のβ−１，３−グルカン分子が、らせん定数の近似する１本鎖核酸と水素結合を介して会合し、３重らせん構造を有するβ−１，３−グルカン／核酸複合体を形成するが、中和に強酸を使用すると、局所的に溶液のｐＨが低下することにより、核酸が加水分解を受けるおそれがある。

それに対し、本発明のβ−１，３−グルカン／核酸複合体の調製方法では、β−１，３−グルカンを含む塩基性溶液の中和に強酸を使用しないため、核酸が分解されることなくβ−１，３−グルカンと複合体を形成し、ＤＭＳＯ等の非プロトン性極性有機溶媒を用いた場合に匹敵する高収率でβ−１，３−グルカン／核酸複合体を調製することができる。また、非プロトン性極性有機溶媒用いないため、透析による水との置換等の煩雑な処理が不要となり、後処理が簡便に行える。さらに、ゲル濾過クロマトグラフィーによる複合体の分取および陰イオン交換クロマトグラフィーによる未反応のβ−１，３−グルカンの除去のいずれか一方又は双方の精製過程と組み合わせることにより、より高純度のβ−１，３−グルカン／核酸複合体を提供することができる。

ｄＡの長さがＤＮＡの複合化率に及ぼす影響を示す図である（実施例１）。ＳＰＧ、ＤＮＡの混合比を変えた時のＤＮＡの複合化率の変化を示す図である（実施例２）。中和に用いる緩衝液がＤＮＡの複合化率の変化に及ぼす影響を示す図である（実施例３）。リン酸緩衝液による塩酸による中和との比較を示す図である（比較例１）。リン酸緩衝液による塩酸による中和との比較を示す図である（比較例２）。ＭＩＦ−ｄＡ３０／ＳＰＧ複合体のＧＰＣクロマトグラムである（実施例４）。ＭＩＦ−ｄＡ４０／ＳＰＧ複合体のＧＰＣクロマトグラムである（実施例４）。陰イオン交換カラムを用いた複合体の精製の原理を示す図である（実施例５）。ＭＩＦ−ｄＡ４０／ＳＰＧ複合体、ＭＩＦ−ｄＡ６０／ＳＰＧ複合体の陰イオン交換クロマトグラフィーにおけるＳＰＧの溶出曲線である（実施例５）。ＭＩＦ−ｄＡ４０／ＳＰＧ複合体、ＭＩＦ−ｄＡ６０／ＳＰＧ複合体の陰イオン交換クロマトグラフィーにおける核酸／ＳＰＧ複合体の溶出曲線である（実施例５）。

本発明の一実施の形態に係るβ−１，３−グルカン／核酸複合体（以下「複合体」と略称する場合がある。）の調製方法（以下「本方法」と略称する場合がある。）は、核酸を溶解したｐＨ４．０〜８．０の水系緩衝液と、β−１，３−グルカンを溶解した塩基性水溶液とを混合し、インキュベートすることにより、２本のβ−１，３−グルカン分子鎖と１本鎖核酸とからなる３重らせん構造を有するβ−１，３−グルカン／核酸複合体を調製する工程と、ゲル濾過クロマトグラフィー（ＧＰＣ）及び陰イオン交換クロマトグラフィーの一方又は双方を用いて複合体を含有する溶液を処理することにより、複合体を形成していない未反応のβ−１，３−グルカン及び核酸を除去し、複合体を精製する工程とを有する。
以下、各工程についてより具体的に説明する。

（１）核酸を溶解した水系緩衝液
「緩衝液」とは、酸またはアルカリを加えても水素イオン濃度の変化を微小にとどめることができる（緩衝作用を有する）溶液であり、例として、弱酸とその共役塩基である塩との混合溶液等が挙げられる。酢酸等の弱酸（ＡＨ）とその共役塩基（Ａ⁻）の混合溶液は、多くのＨ^＋またはＯＨ⁻を添加しても、その緩衝作用によりｐＨの変化をわずかだけに抑えることができる。弱塩基（Ｂ）とその共役酸（ＢＨ^＋）を含む系も同様な緩衝作用を有する。

塩基性水溶液を中和する溶液として、塩酸、硫酸等の鉱酸水溶液を用いることもできるが、それらの鉱酸水溶液による中和では最終的に中和点（ｐＨ７）に調整するのは溶液量を厳密に制御しなければならない。しかし、緩衝液による中和ではそれほど厳密に容量を制御する必要はない。とりわけリン酸緩衝液（330mM NaH₂PO₄;pH4.7）を使用する場合には、複合体調製後に細胞実験、動物実験に用いても溶媒置換を行う必要がないメリットもある。

使用する緩衝液のpHとしては、pH4〜8までの緩衝液を用い、好ましくはpH4.7〜7.6の緩衝液が良い。pHの低い緩衝液を用いると中和に必要な溶液量が少なくて済み、核酸の分解を抑制し、核酸濃度が高い状態で複合体を得られる。

非プロトン性極性有機溶媒を使用した際には、溶媒を水に戻す際に有機溶媒の10倍の体積の水を必要とし、最終核酸濃度が薄くなってしまうが、緩衝液を用いた塩基性水溶液の中和過程では核酸溶液の体積は2倍程度にしか薄まらず、その後の濃度調製が容易となる。

核酸としてＲＮＡを使用する場合には、塩基性水溶液に接触すると核酸が分解してしまうおそれがあるため、本方法のように、あらかじめ緩衝液中に核酸を溶かしておき、その後１本鎖に解離したβ−１，３−グルカンを含有する塩基性水溶液を添加し中和を行う方法が好ましい。

β−１，３−グルカンと複合体を形成する核酸には機能性核酸（アンチセンスＤＮＡ、ｓｉＲＮＡ、ＣｐＧＤＮＡ）配列の５’末端側及び３’末端側のいずれか一方または双方にポリ（ｄＡ（デオキシアデノシン））配列、ポリ（Ｃ（シチジン））配列のいずれかを付加させる。この付加させたホモポリマーの部位がβ−１，３−グルカンと複合体を形成する。

ポリ（ｄＡ）、ポリ（Ｃ）のホモポリマーの長さとして、２０量体以上８０量体以下のものを用いる。ホモポリマーの長さが長い方がβ−１，３−グルカンとの複合化率は高い結果が得られている。しかし、あまり長すぎると、アンチセンス、ＣｐＧのヘテロ配列の効果が低くなると懸念されるため、ホモポリマーは８０量体以下の方が好ましい。

（２）β−１，３−グルカンを溶解した塩基性溶液
主鎖がβ−１，３−グルカン及びβ−１，３−キシランからなる多糖は、ポリ（Ｃ）等の核酸と近似するらせん定数を有しており（例えば、高橋、小畠、鈴木、Prog. Polym. Phys. Jpn.27巻、767ページ、及び「Conformation of Carbohydrates」、Sharwood
academic publisher、1998年を参照）、核酸塩基と水素結合可能な水酸基を有しているため、核酸と相互作用し、三重らせん構造を有する安定な複合体を形成することが知られている。β−１，３−グルカンの具体例としては、シゾフィラン、カードラン、レンチナン、パーキマン、グリホラン、スクレログルカン等が挙げられる。これらは、主鎖がβ−結合（β−Ｄ−結合）により結合したグルカンで、側鎖の頻度が異なる天然の多糖である。これらのβ−１，３−グルカンは、化学修飾等の処理を行うことなくそのまま用いてもよいが、通常の過ヨウ素酸化法を用いてその側鎖を適当に間引くことにより、その溶解性を制御することもできる。

β−１，３−グルカンの分子量は、複合体の調製に用いられる核酸の塩基長、核酸の５’末端側及び３’末端側に結合させたホモポリマーの塩基長等に応じて適宜調節される。しかし、分子量が小さいと、いわゆるクラスター効果（高分子系の協同現象）が発現し難くなり好ましくない。通常は、核酸と複合体を形成しうるβ−１，３−グルカンの重量平均分子量としては、核酸塩基の種類や高次構造によって異なるが、好ましくは2000以上、さらに好ましくは4000以上、より好ましくは6000以上である。また、ポリヌクレオチド上の核酸塩基と水素結合を形成する水酸基の数は、通常は、5個以上、好ましくは、8個以上、さらに好ましくは、10個以上必要である。
なお、β−１，３−グルカンの重量平均分子量は、光散乱法、沈降速度法（超遠心法）等の任意の公知の方法を用いて決定することができる。

β−１，３−グルカンは、一般に菌類や真性細菌によって産生されるため、これらの微生物を培養後、菌体をホモゲナイズし、細胞溶出分や不溶性残渣等の不純物から超遠心法等の方法により単離することにより得ることができる。一般に、このようにして得られるβ−１，３−グルカンは高分子量（重量平均分子量が数十万程度）で三重らせん構造を取る。必要に応じて低分子化して用いてもよい。低分子化は、β−１，３−グルカンの種類や所望の分子量に応じて、酵素分解、酸加水分解等から適宜適当な方法及び条件を選択して行う。例えば、シゾフィランの場合には、80%DMSO−硫酸による加水分解等により、種々の分子量を有する一本鎖シゾフィランを得ることができる。

シゾフィラン等のβ−１，３−グルカンは、通常、水中で三重らせん構造を呈している。したがって、ポリヌクレオチドと複合体を形成するために、塩基性水溶液に溶解して分子間水素結合及び疎水性相互作用による会合状態を解いて一本鎖にする。これにポリヌクレオチドを含有する水溶液（又はアルコール等の極性溶媒の溶液）を添加してゆくと、溶媒の極性の増大に伴い、疎水性相互作用によりポリヌクレオチドとβ−１，３−グルカンとが会合し、１本鎖核酸の分子鎖を取り込みながら分子内および分子間でポリヌクレオチドと多糖との会合体が形成される。その結果、（１分子の）１本鎖核酸と２分子のβ−１，３−グルカン分子とからなる３重らせん構造を有する複合体が形成される。複合体の形成は、例えば、ＣＤ（円偏光二色性）スペクトルを測定することにより、コンホメーション変化を調べることによって確認することができる。得られる複合体は、一般に水溶性であり、温度変化やｐＨの変化によって解離及び再結合する。更に、複合体は核酸分解酵素に対する耐性を有し、ポリヌクレオチドが破壊されることもない。

塩基性水溶液としては水酸化ナトリウム水溶液及び水酸化カリウム水溶液がよく使用されるが、臨床応用を考慮すると血中ではナトリウムイオンの方が高濃度であるため、水酸化ナトリウム溶液を用いるのが好ましい。

（３）複合体の形成
複合体調製過程として、水に溶解させたＤＮＡを直前にリン酸緩衝液と混ぜ、β−１，３−グルカンの塩基性水溶液（0.25N NaOH）と混合させる。リン酸緩衝液（330mM NaH₂PO₄;pH4.7）と塩基性水溶液を体積比１：１で混合することで中性溶液（pH7.0〜8.0）となる。混和後、溶液を所定の温度（例えば４℃）で一晩以上インキュベートし、複合化を完結させる。
複合体の形成は、ゲル濾過クロマトグラフィー（ＧＰＣ）、円偏光二色性（ＣＤ）スペクトル等の任意の公知の方法で確認できる。

（４）ゲル濾過クロマトグラフィーによる精製
上記のようにして得られる溶液には、複合体以外に未反応の核酸及びβ−１，３−グルカンを含んでいるため、さらに精製を行う必要がある。精製の一手段として、未反応の核酸及びβ−１，３−グルカンと複合体との分子量の差を利用して、分取ＧＰＣカラムを用いて、複合体のピーク部分を分取することにより、未反応の核酸及びβ−１，３−グルカンの除去を行うことができる

ＧＰＣは、例えば以下の条件で行うことができる。
カラム；ポリヒドロキシメタクリレートを基材とした水系用カラム（OHpak SB-802.5 HQ及びOHpak SB-806 HQ等；Shodex）
溶離液；０．１Ｍリン酸緩衝液（pH 7.4）＋0.5M KCl
流速；0.8mL／分

（５）陰イオン交換クロマトグラフィーによる精製
反応溶液中から未反応のβ−１，３−グルカンの除去を行うために、陰イオン交換クロマトグラフィーを用いる。複合体は核酸の電荷により陰イオン交換カラムに担持されるが、未反応のβ−１，３−グルカンは電荷を有さないため、カラムを素通りする。反応溶液をカラムに通した後に、高塩濃度溶液（1M Tris−塩酸緩衝液）により複合体を溶出させる。

陰イオン交換クロマトグラフィーは、例えば下記の条件で行うことができる。
陰イオン交換カラム；低圧クロマトグラフィー用の弱陰イオン交換カラム（Macro-Prep EDAE、リガンド：-NH⁺(C₂H₅)₂、容量：1mL；BioRad）
洗浄液；ＰＢＳ（リン酸緩衝生理食塩水）
溶出液；1M Tris−塩酸緩衝液（pH7.6）（ナカライ）

上述のＧＰＣ及び陰イオン交換クロマトグラフィーによる複合体の精製は、どちらか一方のみを行ってもよく、両者共に行ってもよい。後者の場合、陰イオン交換カラムの容量の方が一般に小さいため、先に陰イオン交換クロマトグラフィーにより未反応のβ−１，３−グルカンを除去し、次いでＧＰＣによる精製を行う方が好ましい。

実施例１：ポリ（ｄＡ）の長さの違いによる複合化率の検討
本実施例で用いたシゾフィラン（ＳＰＧ）（三井製糖（株）より提供）は、ＧＰＣにより分子量を算出したところ１本鎖状態では１５万で、３本鎖では４５万であった。このＳＰＧと、dA（デオキシアデノシン）のホモポリマーであるdA30、dA40、dA60（ファスマック（株）より購入）との複合化を行った。

ＳＰＧを0.25N
NaOH溶液に溶解し（15mg/mL）２日以上放置し、完全にＳＰＧを１本鎖に解離させた。サンプル調製方法は、ポリ（ｄＡ）溶液とリン酸緩衝液（330mM NaH₂PO₄、pH4.5）とを混合し、ＳＰＧとＤＮＡの混合比がモル比で３：１となるようＳＰＧの塩基性水溶液を添加し攪拌した。得られた溶液を４℃で一晩静置させた後、ＧＰＣ測定を行った。

測定で得られたＧＰＣのクロマトグラム（吸光度（260nm））を図１に示す。複合体と未反応のＤＮＡのピーク面積からＤＮＡの複合化率（全ＤＮＡのモル数に対する複合体に含まれるＤＮＡのモル数の割合）を算出すると、dA30、dA40、dA60について、それぞれ40%、75%、100%であった。このことよりdAの長さを長くすることによりＤＮＡの複合化率が向上することがわかる。また、反応開始から３時間後でもＧＰＣ測定を行ったが、同様のクロマトグラムが観察された。このことより複合化にかける時間は３時間以上で十分であることが確認された。

実施例２：ＳＰＧとＤＮＡの混合比の違いによる複合化率の検討
ＤＮＡ濃度を一定にし、添加するＳＰＧの量を変化させ、実施例１と同様に複合体を調製し、ＧＰＣ測定を行った。各サンプルの混合比（モル比、重量比）を表１に示す。

測定で得られたＧＰＣのクロマトグラム（吸光度（260nm））を図２に示す。添加するＳＰＧの比率を上げるにつれ、未反応ＤＮＡの量が減少し、溶出時間の短い位置（より高分子量の画分に相当する）にＵＶピークが観察されることから、複合化率が上昇していることがわかる。ＳＰＧがＤＮＡに対し、モル比で0.75以上であれば複合化率80%以上を達成できることがわかる。また、ＤＮＡに対しＳＰＧの比率を上げても（ＳＰＧ：ＤＮＡ＝１０：１又は３０：１）複合化率はほとんど変わらなかった。

実施例３：ＳＰＧ溶液を中和する緩衝液の違いによる複合化率の変化の検討
ＳＰＧを中和する緩衝液としてリン酸緩衝液（330mM NaH₂PO₄、pH4.5；バッファーＡ）以外に、ｐＨの異なるリン酸緩衝液（pH6.5;NaH₂PO₄とNa₂HPO₄で調製；バッファーＢ）あるいはトリス−塩酸緩衝液（330mM Tris-HCl、pH7.6；バッファーＣ）を試みた。また、比較例として、緩衝液の代わりにＤＭＳＯを用いて調製した複合体との比較も行った。表２に示すような混合比で各サンプルを調製し、ＧＰＣ測定を行った。

測定で得られたＧＰＣのクロマトグラム（吸光度（２６０ｎｍ））結果を図３に示す。本実験ではＤＮＡは腫瘍壊死因子（ＴＮＦ−α）に対するアンチセンスＤＮＡ（aacccatcggctggcaccac：配列番号１）の３’側にdA60を付加させたものを用いた。未反応のＤＮＡのピークは14〜15分の位置に見られ、吸光度の値が0.02であったが、反応後では、80〜90%のＤＮＡはＳＰＧと複合化していることがわかる。中和する緩衝液の違いによる複合化率の違いはほとんどないことがわかる。また、ＤＭＳＯ法と比べても複合化率の違いは認められない。

表２から緩衝液として330mMリン酸緩衝液（pH4.5）を用いると最終濃度は150mMとなることがわかる。また、この時のＤＮＡ濃度は33μMとなっている。細胞を播種した培地中にＤＮＡを添加する際に、ＤＮＡ濃度は高くても数μMとなるように調製するため、反応溶液を約１０倍以上希釈し培地に添加することになる。最終的に使用した緩衝剤の濃度は非常に低くなり、細胞等への影響はほとんどないと考えられる。

比較例１
中和溶液として緩衝液ではなく、0.1Nの塩酸を用いて中和を行い、緩衝液による中和との違いを比較した。塩酸溶液を用いた複合体調製では、緩衝液による中和過程と同様に塩酸溶液に核酸を混合させ、直後に水酸化ナトリウム溶液との中和を行った。また、中和は塩酸溶液と水酸化ナトリウム溶液を容積比で２：１になるように混合させpHを約７に調整した。なお、使用したＳＰＧ及び核酸は表２と同様である。

測定で得られたＧＰＣのクロマトグラム（吸光度（260nm））結果を図４に示す。塩酸による中和ではＤＮＡの複合化率は約50%前後であるが、核酸のピーク面積が他と比べ小さいことがわかる。これは、最初に核酸を塩酸に添加した際に一部の核酸が分解したためと考えられる。これに対し、リン酸緩衝液による中和では約80%であり面積比から見てもほとんど分解していないことがわかる。

比較例２
先に述べたように核酸としてＲＮＡを使用する場合には、塩基性水溶液に接触すると核酸が分解してしまう恐れがある。そこで、塩酸溶液と水酸化ナトリウム溶液を混合し、pHを約７に調整した直後にＤＮＡ溶液を添加した。

測定で得られたＧＰＣのクロマトグラム（吸光度（260nm））結果を図５に示す。塩酸によるＤＮＡの分解は無いように見えるが、ＤＮＡの複合化率は約40%であった。リン酸緩衝液による中和（複合化率：80%）と比較すると、中和溶液としてはリン酸緩衝液を用いた方が複合化には好ましいことがわかる。

実施例４：ＧＰＣを用いた複合体の分取
マクロファージ遊走阻止因子（ＭＩＦ）に対するアンチセンスＤＮＡ（tggtgttcacgatgaacataggcatg：配列番号２）の３’末端側にdA30あるいはdA40を付加させたＤＮＡを用いて実施例１と同様に複合体を調製し、少量をＧＰＣに流し複合体の確認を行った。その後、反応溶液を全量ＧＰＣに流し、複合体のフラクションを確認しながら検出器から流出してくる溶液を分取した。分取したフラクションのＧＰＣクロマトグラムにより複合体の精製度を検証した。

測定で得られたＧＰＣのクロマトグラム（吸光度（260nm））結果を図６に示す。図６ではdA30を付加させた時の結果である。図６上の分取前のクロマトグラムから、溶出時間14〜19分の位置に複合体（複合化率は約40%）が見られる。14〜19分のフラクションを分取し、それをＧＰＣで測定すると、確かに複合体の割合が増加しているのが認められ複合体の割合を算出すると約80%であることがわかった（図６下）。

dA40を付加させたＤＮＡとＳＰＧを複合化させると複合化率は約50%であった（図７上）。溶出時間14〜17分のフラクションを分取し、それをＧＰＣで測定すると約90%の精製度で複合体を得ることができた（図７下）。

実施例５：陰イオン交換カラムを用いた複合体の精製
実施例４に従い未反応のＤＮＡを取り除くことは可能であるが、反応溶液中には未反応のＳＰＧが混在している。そこで、これを陰イオン交換カラムに通すことで複合体の精製を試みる。陰イオン交換カラムによる複合体の精製の原理を図８に示す。ＤＮＡ、ＳＰＧ、複合体が混在する溶液を陰イオン交換カラムに通すと、負電荷を帯びているＤＮＡ及び複合体はカラムに担持されるが、電荷を有さないＳＰＧはカラムに担持されず溶出される。次にカラムに溶離液（1M Tris−塩酸緩衝液）を流し、担持されたＤＮＡ及び複合体を溶出させる。

本実験ではＴＮＦ−αに対するアンチセンスＤＮＡの３’末端側にdA40あるいはdA60を付加させたＤＮＡを用いて、実施例１に従い複合体を調製し、陰イオン交換カラムに通し、ＰＢＳでカラムを洗浄（900μL）した際に溶出されたもの（陰イオン交換カラムに担持されなかった分子）をＧＰＣで確認した。また、ＳＰＧ溶液に関しても同様の実験を行った。

測定で得られたＧＰＣのクロマトグラム（屈折率；ＲＩ）結果を図９に示す。ＳＰＧ溶液をカラムに通し、ＰＢＳで溶出するとＵＶにピークは現れずＲＩでのみピークが見られ、確かにＳＰＧが溶出されたことがわかる（renature SPG）。また、ピーク面積からカラムに入れたＳＰＧの１００％が溶出されたことがわかる。dA40、dA60を有するＤＮＡとの複合体ではそれぞれ少量のＳＰＧが溶出されていることがわかる。また、両サンプルともＵＶのピークは見られないことを確認している。つまり、ＰＢＳで洗浄しても核酸は全く溶出されていないことがわかる。カラムに入れたＳＰＧ量はそれぞれ同量にしてあるため、ＳＰＧの溶出量が少ない複合体（dA60）の方が、複合化率が高いことがわかる。

ＰＢＳによる洗浄の後に、核酸を溶出させるために1M Tris−塩酸緩衝液９００μＬを溶出液として用い、溶出された溶液を同様にＧＰＣで確認した。

測定で得られたＧＰＣのクロマトグラム（ＲＩ、吸光度（260nm））結果を図１０に示す。ＲＩの結果から、両サンプルともカラム精製前の早い溶出時間（13〜16分に見えているピークがカラム精製後には消えているのがわかる。これは未反応のＳＰＧがカラム精製後に取り除けていると考えられる。また、ＵＶの結果を見ると、カラム精製前後でピークの変化が見られていないことからカラムを通しても複合体からのＤＮＡの解離なしに回収できていることがわかる。また、溶出液としてＧＰＣ測定用の溶出液（0.1Mリン酸緩衝液(pH7.4)+0.5M KCl）や0.5M以下のTris−塩酸緩衝液では核酸の溶出が確認されなかった（カラムに担持されたまま）ため、1M Tris−塩酸緩衝液が溶出液として適当と考えられる。

Claims

核酸を溶解したｐＨ４．０〜８．０の水系緩衝液と、β−１，３−グルカンを溶解した塩基性水溶液とを混合し、インキュベートすることにより、２本のβ−１，３−グルカン分子鎖と１本鎖核酸とからなる３重らせん構造を有するβ−１，３−グルカン／核酸複合体を調製する工程と、ゲル濾過クロマトグラフィー（ＧＰＣ）及び陰イオン交換クロマトグラフィーの一方又は双方を用いて前記β−１，３−グルカン／核酸複合体を含有する溶液を処理することにより該β−１，３−グルカン／核酸複合体を形成していないβ−１，３−グルカン及び核酸を除去し、前記β−１，３−グルカン／核酸複合体を精製する工程とを有するβ−１，３−グルカン／核酸複合体の調製方法。
前記β−１，３−グルカン／核酸複合体を精製する工程において、前記β−１，３−グルカン／核酸複合体を含有する溶液を、まず陰イオン交換クロマトグラフィー、次いでゲル濾過クロマトグラフィー（ＧＰＣ）で処理することを特徴とする請求項１記載のβ−１，３−グルカン／核酸複合体の調製方法。
前記塩基性水溶液として０．１Ｎ以上１Ｎ以下の水酸化ナトリウム水溶液を用いることを特徴とする請求項１及び２のいずれか１項記載のβ−１，３−グルカン／核酸複合体の調製方法。
多糖との結合部位として塩基配列（Ｘ）_ｎ［Ｘは任意のリボヌクレオチド及びデオキシリボヌクレオチドのいずれかを表し、ｎは自然数を表す。］で表されるポリヌクレオチド鎖を有する核酸を用いることを特徴とする請求項１から３のいずれか１項記載のβ−１，３−グルカン／核酸複合体の調製方法。
前記Ｘが、デオキシアデノシン（ｄＡ）及びシチジン（Ｃ）のいずれかであることを特徴とする請求項４記載のβ−１，３−グルカン／核酸複合体の調製方法。
前記ｎの値が２０以上８０以下であることを特徴とする請求項４及び５のいずれか１項記載のβ−１，３−グルカン／核酸複合体の調製方法。
水系緩衝液として、ｐＨ４．０〜８．０のリン酸系緩衝液及びトリス系緩衝液から選択される緩衝液を用いることを特徴とする請求項１から６のいずれか１項記載のβ−１，３−グルカン／核酸複合体の調製方法。