WO2022075460A1 - 均質なβ－１，３－グルカン／核酸複合体、及びその用途 - Google Patents

均質なβ－１，３－グルカン／核酸複合体、及びその用途 Download PDF

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Abstract

本発明は、β-1,3-グルカン、及びβ-1,3-グルカンと水素結合を介して結合するホモポリヌクレオチドを含む核酸を含み、2本のβ-1,3-グルカン鎖と該核酸に含まれるβ-1,3-グルカンと水素結合を介して結合するホモポリヌクレオチドを含む1本の核酸鎖からなる3重らせん構造を有するβ-1,3-グルカン／核酸複合体の集団であって、 該集団に含まれるβ-1,3-グルカン／核酸複合体の30%以上が、以下の条件を満たす、β-1,3-グルカン／核酸複合体の集団を提供する： （i）複合体を構成するβ-1,3-グルカンと水素結合を介して結合するホモポリヌクレオチドを含む核酸に含まれるホモポリヌクレオチドの長さが均一であり、且つ （ii）1分子の複合体に含まれるβ-1,3-グルカンと水素結合を介して結合するホモポリヌクレオチドを含む核酸の分子数が1、2及び3からなる群から選択されるいずれかである。

Description

均質なβ－１，３－グルカン／核酸複合体、及びその用途
　本発明は、均質なβ-1,3-グルカン／核酸複合体、及びその用途に関する。詳細には、2本のβ-1,3-グルカン鎖と1本のポリデオキシアデニル酸を含む核酸鎖からなる3重らせん構造を有する均質な低分子のβ-1,3-グルカン／核酸複合体の集団、及びその細胞へ核酸を導入するための用途等に関する。
　シゾフィラン（SPG）は、スエヒロタケにより産生される細胞外多糖類の一種である。その化学構造は、線形に連結されたβ-1,3-D-グルコース及び3個の主鎖グルコースあたり1個のβ-1,6-D-グルコース側鎖からなる（図1A）。SPGはそのファミリーであるカードランの最初の発見の後、Kikumotoらにより1970年に発見された。SPG等のβ-1,3-グルカンは、中性溶媒中に溶解したときは、半屈曲性の棒様の三重らせん構造を呈しているが（tSPG、図1B）、アルカリ性溶媒（> 0.25N NaOH）やジメチルスルホキシド（DMSO）に溶解すると三重らせんが解離して一本鎖（sSPG）となる。sSPGからtSPGへの再生及び復元は、sSPGの溶液の条件を、pH5～8或いはDMSO／水（重量比）＜4等のtSPGに好ましい条件に変化させることにより観察される。復元されたSPGの局所的な構造は確かに元のtSPGと同じ三重らせんを呈するが、X線回折パターンによると、多くの分岐及び架橋が全体の形態にわたり観察される。これは、真っすぐで分岐のない棒状を呈する元のtSPGとは対照的である。低濃度で復元を行うと円形の物体が形成されることもあり、これはおそらくは多重化において円形の形態を形成できる「バックバイティング反応」と呼ばれる分子内の端と端との相互作用の結果である。
　このβ-1,3-D-グルカンファミリーの興味深い性状の1つが、図1D及びEに示す様な多糖／ポリヌクレオチド複合体の形成である。ポリ（シチジル酸）（ポリ(C)）及びポリ（デオキシアデニル酸）（ポリ（dA））のような単鎖のホモポリヌクレオチドが復元工程に存在すると、tSPGに代わり新たな複合体が形成される（非特許文献1～4）。この複合体は、2つの主鎖グルコースが1つのヌクレオチドと結合した正確な化学量論の組成を有する（図1E）。デクチン-1（Dectin-1）と呼ばれる受容体によるSPGの生物学的な認識を利用して、この複合体はアンチセンス核酸、CpG DNAs、及びsiRNA等の治療的オリゴヌクレオチドをこの受容体を発現する抗原提示細胞へ送達するための媒体として用いられている（非特許文献3、5～8）。
　ホモポリヌクレオチドの中でも、ポリ（dA）xは、SPGに対して最も高い結合親和性を示し、Xが約30を超えると、複合化収率が100%近くになる。近年、図1Cに示されるように、ポリヌクレオチド骨格における1つの酸素を硫黄に置換することにより、結合安定性が更に促進されることが見出された（非特許文献9）。このホスホロチオエート化により安定な複合体が形成され、スキャッタリング技術を用いた溶液中における複合体のより正確な分子的特性評価が可能となる（非特許文献10）。このような正確な特性評価は、米国食品医薬品局を含む規制当局により高く推奨されている。これは、粒子径及びその分布が、ナノメディシンの安全性及び有効性を評価するための最も重要な品質特性であるからである。これに関連して、SPG-ポリヌクレオチド複合体の希溶液の特性を研究することは、臨床試験を開始するための当局への申請を提出するためのみならず、高分子化学の分野における視野を拡大するために欠くことができない。
　本発明者らは、以前の報告において、SPG-dAxの希溶液の特性を研究し、この複合体は半屈曲性の棒として振る舞うことを見出した（非特許文献10）。
　非特許文献11には、デオキシアデニンの60量体（dA60）とシゾフィラン（SPG）との複合体（dA60/SPG）を、ゲル浸透クロマトグラフィーで解析したこと、及びdA60/SPGが、分子量の異なる複数の複合体の混合物であることが示されている。
Journal of the American Chemical Society 2000, 122 (18), 4520-4521. Biomacromolecules 2001, 2 (3), 641-650. J Am Chem Soc 2004, 126 (27), 8372-3. Chem Commun (Camb) 2005,(35), 4383-98. Bioconjugate chemistry 2017, 28 (2), 565-573. Journal of Controlled Release 2015, 220, 495-502. Proceedings of the National Academy of Sciences 2014, 111 (8), 3086-3091. International journal of molecular sciences 2020, 21 (2), 683-693. Bioorganic Chemistry 2010, 38 (6), 260-264. The Journal of Physical Chemistry 2012, 116 (1), 87-94. 高分子 2018, 67(7), 404-409
　従来報告されているSPGとポリ（dA）との複合体は、優れた核酸送達媒体であるものの、その核酸送達効率の更なる向上が期待される。また、従来のポリ（dA）/SPG複合体は、複数の形態の複合体の混合物であるため、医薬として開発する上で化学的な「同等性の保証」の観点から改善の余地があり、化学的により均質な複合体の提供が求められる。
　本発明は、化学的に均質で、優れた核酸送達能力を有するβ-1,3-グルカン／核酸複合体を提供することを目的とする。
　本発明者らは、特に、低分子量のSPG／ポリ（dA）複合体に焦点を当てて、その特性を詳細に解析した。SPGを超音波処理又はアルカリ加水分解により低分子化し、ポアサイズ10kDa又は50kDaの限外ろ過膜に付すことにより、高分子量成分を除去した。得られた低分子SPGをdA60と複合化し、得られた複合体の混合物を低分子量解析用のゲル濾過クロマトグラフィーで分離すると、3つのピークが明確に観察された。この3つのピークに低分子量側からq1、q2、q3と名前をつけて分画し、各ピークに含まれるSPG/dA60複合体の分子量等の特性を光散乱等で詳細に解析したところ、q1：q2：q3の分子量比が1：2：3となり、q1の複合体にはdA60が1分子、q2の複合体にはdA60が2分子、q3の複合体にはdA60が3分子含まれていることを見出した。更に、各複合体に含まれる主鎖グルコースのモル数と塩基（dA）のモル数の比（［mG］/［dA］）を計算したところ、q1、q2、q3のいずれについても、化学量論比の2とほぼ一致した。この結果から、ポリ（dA）は複合体形成過程で自らと過不足なく複合化が可能なちょうどよい大きさ（長さ）の1本鎖のSPGを選んで複合体を形成し、得られたq1、q2及びq3の複合体は、1分子の複合体に含まれるdA60分子の数、主鎖グルコースのモル数で表したときのSPGの大きさ、及び分子量等の点で均質であることが示唆された。
　更に、この均質な低分子SPG／ポリ（dA）複合体を用いて、細胞内へ核酸を導入したところ、驚くべきことに、高分子量SPG／ポリ（dA）複合体と比較して、核酸導入効率が上昇した。本発明者らは、これらの知見に基づき、更に検討を進め、本発明を完成した。
　即ち、本発明は以下に関する。
［1］β-1,3-グルカン、及びβ-1,3-グルカンと水素結合を介して結合するホモポリヌクレオチドを含む核酸を含み、2本のβ-1,3-グルカン鎖と該核酸に含まれるβ-1,3-グルカンと水素結合を介して結合するホモポリヌクレオチドを含む1本の核酸鎖からなる3重らせん構造を有するβ-1,3-グルカン／核酸複合体の集団であって、
該集団に含まれるβ-1,3-グルカン／核酸複合体の30%以上が、以下の条件を満たす、β-1,3-グルカン／核酸複合体の集団：
（i）複合体を構成するβ-1,3-グルカンと水素結合を介して結合するホモポリヌクレオチドを含む核酸に含まれるホモポリヌクレオチドの長さが均一であり、且つ
（ii-a）1分子の複合体に含まれるβ-1,3-グルカンと水素結合を介して結合するホモポリヌクレオチドを含む核酸の分子数が1、2又は3である。
［2］該集団に含まれるβ-1,3-グルカン／核酸複合体の40%以上が、(i)及び(ii-a)の条件を満たす、［1］のβ-1,3-グルカン／核酸複合体の集団。
［3］該集団に含まれるβ-1,3-グルカン／核酸複合体の50%以上が、(i)及び(ii-a)の条件を満たす、［1］のβ-1,3-グルカン／核酸複合体の集団。
［4］該集団に含まれるβ-1,3-グルカン／核酸複合体の60%以上が、(i)及び(ii-a)の条件を満たす、［1］のβ-1,3-グルカン／核酸複合体の集団。
［5］該集団に含まれるβ-1,3-グルカン／核酸複合体の70%以上が、(i)及び(ii-a)の条件を満たす、［1］のβ-1,3-グルカン／核酸複合体の集団。
［6］該集団に含まれるβ-1,3-グルカン／核酸複合体の80%以上が、(i)及び(ii-a)の条件を満たす、［1］のβ-1,3-グルカン／核酸複合体の集団。
［7］該集団に含まれるβ-1,3-グルカン／核酸複合体の90%以上が、(i)及び(ii-a)の条件を満たす、［1］のβ-1,3-グルカン／核酸複合体の集団。
［8］（ii-a）の1分子の複合体に含まれるβ-1,3-グルカンと水素結合を介して結合するホモポリヌクレオチドを含む核酸の分子数が1又は2である、［1］～［7］のいずれかのβ-1,3-グルカン／核酸複合体の集団。
［9］（i）及び（ii-a）の条件を満たすβ-1,3-グルカン／核酸複合体の総和の50%以上が、1分子の複合体に含まれるβ-1,3-グルカンと水素結合を介して結合するホモポリヌクレオチドを含む核酸の分子数が1のβ-1,3-グルカン／核酸複合体である、［1］～［8］のいずれかのβ-1,3-グルカン／核酸複合体の集団。
［10］β-1,3-グルカン、及びβ-1,3-グルカンと水素結合を介して結合するホモポリヌクレオチドを含む核酸を含み、2本のβ-1,3-グルカン鎖と該核酸に含まれるβ-1,3-グルカンと水素結合を介して結合するホモポリヌクレオチドを含む1本の核酸鎖からなる3重らせん構造を有するβ-1,3-グルカン／核酸複合体の集団であって、
該集団に含まれるβ-1,3-グルカン／核酸複合体の30%以上が、以下の条件を満たす、β-1,3-グルカン／核酸複合体の集団：
（i）複合体を構成するβ-1,3-グルカンと水素結合を介して結合するホモポリヌクレオチドを含む核酸に含まれるホモポリヌクレオチドの長さが均一であり、且つ
（ii-b）1分子の複合体に含まれるβ-1,3-グルカンと水素結合を介して結合するホモポリヌクレオチドを含む核酸の分子数が均一であり、該分子数が1、2及び3からなる群から選択されるいずれかである。
［11］該集団に含まれるβ-1,3-グルカン／核酸複合体の40%以上が、(i)及び(ii-b)の条件を満たす、［10］のβ-1,3-グルカン／核酸複合体の集団。
［12］該集団に含まれるβ-1,3-グルカン／核酸複合体の50%以上が、(i)及び(ii-b)の条件を満たす、［10］のβ-1,3-グルカン／核酸複合体の集団。
［13］該集団に含まれるβ-1,3-グルカン／核酸複合体の60%以上が、(i)及び(ii-b)の条件を満たす、［10］のβ-1,3-グルカン／核酸複合体の集団。
［14］該集団に含まれるβ-1,3-グルカン／核酸複合体の70%以上が、(i)及び(ii-b)の条件を満たす、［10］のβ-1,3-グルカン／核酸複合体の集団。
［15］該集団に含まれるβ-1,3-グルカン／核酸複合体の80%以上が、(i)及び(ii-b)の条件を満たす、［10］のβ-1,3-グルカン／核酸複合体の集団。
［16］該集団に含まれるβ-1,3-グルカン／核酸複合体の90%以上が、(i)及び(ii-b)の条件を満たす、［10］のβ-1,3-グルカン／核酸複合体の集団。
［17］（ii-b）の1分子の複合体に含まれるβ-1,3-グルカンと水素結合を介して結合するホモポリヌクレオチドを含む核酸の分子数が1である、［10］～［16］のいずれかのβ-1,3-グルカン／核酸複合体の集団。
［18］1分子の複合体に含まれる、β-1,3-グルカンの主鎖グルコース単位数の、ホモポリヌクレオチドを構成するヌクレオチド単位数に対する比（主鎖グルコース単位数／ヌクレオチド単位数）の平均が1.5～2.5である、［1］～［17］のいずれかのβ-1,3-グルカン／核酸複合体の集団。
［19］該集団に含まれるβ-1,3-グルカン／核酸複合体の30%以上が、更に以下の条件を満たす、［1］～［18］のいずれかのβ-1,3-グルカン／核酸複合体の集団：
（iii）1分子の複合体に含まれるβ-1,3-グルカンの分子数が1又は2である。
［20］該集団に含まれるβ-1,3-グルカン／核酸複合体の80%以上が、更に(iii)の条件を満たす、［19］のβ-1,3-グルカン／核酸複合体の集団。
［21］（i）の複合体を構成するβ-1,3-グルカンと水素結合を介して結合するホモポリヌクレオチドを含む核酸に含まれるホモポリヌクレオチドの長さが、20～100塩基である、［1］～［20］のいずれかのβ-1,3-グルカン／核酸複合体の集団。
［22］ホモポリヌクレオチドがポリデオキシアデニル酸である、［1］～［21］のいずれかのβ-1,3-グルカン／核酸複合体の集団。
［23］β-1,3-グルカンがシゾフィラン又はカードランである、［1］～［22］のいずれかのβ-1,3-グルカン／核酸複合体の集団。
［24］β-1,3-グルカンがシゾフィランである、［23］のβ-1,3-グルカン／核酸複合体の集団。
［25］β-1,3-グルカンと水素結合を介して結合するホモポリヌクレオチドを含む核酸が付加核酸を含み、該付加核酸がホモポリヌクレオチドの末端に連結されている、［1］～［24］のいずれかのβ-1,3-グルカン／核酸複合体の集団。
［26］付加核酸がホモポリヌクレオチドの5’末端に連結されている、［25］のβ-1,3-グルカン／核酸複合体の集団。
［27］付加核酸が標的遺伝子に対する発現抑制活性を有する、［25］又は［26］のβ-1,3-グルカン／核酸複合体の集団。
［28］付加核酸が、アンチセンス核酸、siRNA又はmiRNAである、［25］～［27］のいずれかのβ-1,3-グルカン／核酸複合体の集団。
［29］［1］～［28］のいずれかのβ-1,3-グルカン／核酸複合体の集団を製造する方法であって、
　β-1,3-グルカンと水素結合を介して結合するホモポリヌクレオチドを含む核酸と、β-1,3-グルカンとを混合することにより、β-1,3-グルカン、及びβ-1,3-グルカンと水素結合を介して結合するホモポリヌクレオチドを含む核酸を含み、2本のβ-1,3-グルカン鎖と該核酸に含まれるβ-1,3-グルカンと水素結合を介して結合するホモポリヌクレオチドを含む1本の核酸鎖からなる3重らせん構造を有するβ-1,3-グルカン／核酸複合体を調製する工程を含み、
　混合に供するβ-1,3-グルカンの重量平均分子量が10万以下であり、ゲル浸透クロマトグラフィーで分離し、示差屈折率検出器で検出したときに、10万以上の分子量のβ-1,3-グルカンのピーク面積が全体の50％以下である、β-1,3-グルカン／核酸複合体の集団を製造する方法。
［30］混合に供するβ-1,3-グルカンに含まれる主鎖グルコース単位総数の、混合に供するβ-1,3-グルカンと水素結合を介して結合するホモポリヌクレオチドを含む核酸に含まれる、ホモポリヌクレオチドを構成するヌクレオチド単位総数に対する比（主鎖グルコース単位総数／ヌクレオチド単位総数）が4以上である、［29］の製造方法。
［31］主鎖グルコース単位総数／ヌクレオチド単位総数が16以下である、［30］の製造方法。
［32］得られたβ-1,3-グルカン／核酸複合体をゲル透過クロマトグラフィーに付し、1分子の複合体に含まれるβ-1,3-グルカンと水素結合を介して結合するホモポリヌクレオチドを含む核酸の分子数が1、2及び3からなる群から選択されるいずれかであるβ-1,3-グルカン／核酸複合体を単離する工程を更に含む、［29］～［31］のいずれかのβ-1,3-グルカン／核酸複合体の集団を製造する方法。
［33］［1］～［28］のいずれかのβ-1,3-グルカン／核酸複合体の集団を含む、核酸を細胞内へ導入するための組成物。
［34］細胞がDectin-1陽性細胞である、［33］の組成物。
［35］［1］～［28］のいずれかのβ-1,3-グルカン／核酸複合体の集団を、細胞へ接触することを含む、核酸を細胞内へ導入する方法。
［36］［1］～［28］のいずれかのβ-1,3-グルカン／核酸複合体の集団の、核酸を細胞内へ導入するための使用。
［37］［27］又は［28］のβ-1,3-グルカン／核酸複合体の集団を含む、細胞における標的遺伝子の発現を抑制するための組成物。
［38］細胞がDectin-1陽性細胞である、［37］の組成物。
［39］［27］又は［28］のβ-1,3-グルカン／核酸複合体の集団を、細胞へ接触することを含む、該細胞における標的遺伝子の発現を抑制する方法。
［40］［27］又は［28］のβ-1,3-グルカン／核酸複合体の集団の、細胞における標的遺伝子の発現を抑制するための使用。
［1-1］β-1,3-グルカン、及びβ-1,3-グルカンと水素結合を介して結合するホモポリヌクレオチドを含む核酸を含み、2本のβ-1,3-グルカン鎖と該核酸に含まれるβ-1,3-グルカンと水素結合を介して結合するホモポリヌクレオチドを含む1本の核酸鎖からなる3重らせん構造を有するβ-1,3-グルカン／核酸複合体の集団であって、
該集団に含まれるβ-1,3-グルカン／核酸複合体の80%以上が、以下の条件を満たす、β-1,3-グルカン／核酸複合体の集団：
（i）複合体を構成するβ-1,3-グルカンと水素結合を介して結合するホモポリヌクレオチドを含む核酸に含まれるホモポリヌクレオチドの長さが均一であり、且つ
（ii）1分子の複合体に含まれるβ-1,3-グルカンと水素結合を介して結合するホモポリヌクレオチドを含む核酸の分子数が均一であり、該分子数が1、2及び3からなる群から選択されるいずれかである。
［2-1］1分子の複合体に含まれる、β-1,3-グルカンの主鎖グルコース単位数の、ホモポリヌクレオチドを構成するヌクレオチド単位数に対する比（主鎖グルコース単位数／ヌクレオチド単位数）の平均が1.5～2.5である、［1-1］のβ-1,3-グルカン／核酸複合体の集団。
［3-1］該集団に含まれるβ-1,3-グルカン／核酸複合体の80%以上が、更に以下の条件を満たす、［1-1］又は［2-1］のβ-1,3-グルカン／核酸複合体の集団：
（iii）1分子の複合体に含まれるβ-1,3-グルカンの分子数が1又は2である。
［4-1］（ii）の1分子の複合体に含まれるβ-1,3-グルカンと水素結合を介して結合するホモポリヌクレオチドを含む核酸の分子数が1である、［1-1］～［3-1］のいずれか記載のβ-1,3-グルカン／核酸複合体の集団。
［5-1］（i）の複合体を構成するβ-1,3-グルカンと水素結合を介して結合するホモポリヌクレオチドを含む核酸に含まれるホモポリヌクレオチドの長さが、20～100塩基である、［1-1］～［4-1］のいずれか記載のβ-1,3-グルカン／核酸複合体の集団。
［6-1］ホモポリヌクレオチドがポリデオキシアデニル酸である、［1-1］～［5-1］のいずれか記載のβ-1,3-グルカン／核酸複合体の集団。
［7-1］β-1,3-グルカンがシゾフィラン又はカードランである、［1-1］～［6-1］のいずれか記載のβ-1,3-グルカン／核酸複合体の集団。
［8-1］β-1,3-グルカンがシゾフィランである、［7-1］のβ-1,3-グルカン／核酸複合体の集団。
［9-1］β-1,3-グルカンと水素結合を介して結合するホモポリヌクレオチドを含む核酸が付加核酸を含み、該付加核酸がホモポリヌクレオチドの末端に連結されている、［1-1］～［8-1］のいずれか記載のβ-1,3-グルカン／核酸複合体の集団。
［10-1］付加核酸がホモポリヌクレオチドの5’末端に連結されている、［9-1］のβ-1,3-グルカン／核酸複合体の集団。
［11-1］付加核酸が標的遺伝子に対する発現抑制活性を有する、［9-1］又は［10-1］のβ-1,3-グルカン／核酸複合体の集団。
［12-1］付加核酸が、アンチセンス核酸、siRNA又はmiRNAである、［9-1］～［11-1］のいずれか記載のβ-1,3-グルカン／核酸複合体の集団。
［13-1］［1-1］～［12-1］のいずれかのβ-1,3-グルカン／核酸複合体の集団を製造する方法であって、
　β-1,3-グルカンと水素結合を介して結合するホモポリヌクレオチドを含む核酸と、β-1,3-グルカンとを混合することにより、β-1,3-グルカン、及びβ-1,3-グルカンと水素結合を介して結合するホモポリヌクレオチドを含む核酸を含み、2本のβ-1,3-グルカン鎖と該核酸に含まれるβ-1,3-グルカンと水素結合を介して結合するホモポリヌクレオチドを含む1本の核酸鎖からなる3重らせん構造を有するβ-1,3-グルカン／核酸複合体を調製する工程を含み、
　混合に供するβ-1,3-グルカンの重量平均分子量が10万以下であり、ゲル浸透クロマトグラフィーで分離し、示差屈折率検出器で検出したときに、10万以上の分子量のβ-1,3-グルカンのピーク面積が全体の50％以下である、β-1,3-グルカン／核酸複合体の集団を製造する方法。
［14-1］混合に供するβ-1,3-グルカンに含まれる主鎖グルコース単位総数の、混合に供するβ-1,3-グルカンと水素結合を介して結合するホモポリヌクレオチドを含む核酸に含まれる、ホモポリヌクレオチドを構成するヌクレオチド単位総数に対する比（主鎖グルコース単位総数／ヌクレオチド単位総数）が4以上である、［13-1］の製造方法。
［15-1］主鎖グルコース単位総数／ヌクレオチド単位総数が16以下である、［14-1］の製造方法。
［16-1］得られたβ-1,3-グルカン／核酸複合体をゲル透過クロマトグラフィーに付し、1分子の複合体に含まれるβ-1,3-グルカンと水素結合を介して結合するホモポリヌクレオチドを含む核酸の分子数が1、2及び3からなる群から選択されるいずれかであるβ-1,3-グルカン／核酸複合体を単離する工程を更に含む、［13-1］～［15-1］のいずれかのβ-1,3-グルカン／核酸複合体の集団を製造する方法。
［17-1］［1-1］～［12-1］のいずれかのβ-1,3-グルカン／核酸複合体の集団を含む、核酸を細胞内へ導入するための組成物。
［18-1］細胞がDectin-1陽性細胞である、［17-1］の組成物。
［19-1］［1-1］～［12-1］のいずれかのβ-1,3-グルカン／核酸複合体の集団を、細胞へ接触することを含む、核酸を細胞内へ導入する方法。
［20-1］［1-1］～［12-1］のいずれかのβ-1,3-グルカン／核酸複合体の集団の、核酸を細胞内へ導入するための使用。
［21-1］［11-1］又は［12-1］のβ-1,3-グルカン／核酸複合体の集団を含む、細胞における標的遺伝子の発現を抑制するための組成物。
［22-1］細胞がDectin-1陽性細胞である、［21-1］記載の組成物。
［23-1］［11-1］又は［12-1］のβ-1,3-グルカン／核酸複合体の集団を、細胞へ接触することを含む、該細胞における標的遺伝子の発現を抑制する方法。
［24-1］［11-1］又は［12-1］のβ-1,3-グルカン／核酸複合体の集団の、細胞における標的遺伝子の発現を抑制するための使用。
　本発明により、化学的に均質なβ-1,3-グルカン／核酸複合体の集団が提供される。本発明のβ-1,3-グルカン／核酸複合体の集団は、1分子の複合体中に含まれる核酸分子の数、主鎖グルコースのモル数で表したときのβ-1,3-グルカンの大きさ、複合体の大きさ等の点で均質であり、化学的な「同等性の保証」の観点から医薬として開発する上で有利である。また、本発明のβ-1,3-グルカン／核酸複合体の集団は、優れた核酸送達能力を有し、細胞内へ核酸を導入するためのキャリアーとして有用である。また、本発明により、優れた核酸送達能力をする低分子量β-1,3-グルカン／核酸複合体の豊富なβ-1,3-グルカン／核酸複合体の集団が提供される。
図1は、シゾフィラン（SPG）の化学構造を示す。（A）SPGの繰り返し単位。(B)SPGの三重らせん構造。(C)ホスホロチオエート化ポリ（デオキシアデニル酸）（dAx）の化学構造。(D)SPGとdAxから作成された複合体の模式図。(E)2本の主鎖グルコースと1本のdAxから構成された化学量論的構造。 図2は、本発明の複合体集団を構成する複合体の典型的な構造を模式的に示す。 図3は、ゲル浸透クロマトグラフィー（GPC）による低分子量SPG、又はdA60と低分子量SPG（S-3）の複合体の分離の例を示す。A：S-3の分画前後のRIクロマトグラム。B：分画前後の複合体、並びに裸のdA60のUVクロマトグラム。C：3つのピークを単離する分画後のUVクロマトグラム。比較の容易のため、ベースラインを上方へ移動した。 図4は、DNAが鋳型として働き、dAxが長さの一致するSPG鎖と複合体を形成するDNA鋳型モデルの模式図を示す。 図5は、様々な([mG]／[dA])mixで得られたdA60と低分子量SPG（S-3）の複合体のGPCによる分離を示す。A：RIクロマトグラム。B: UVクロマトグラム。C: ([mG]／[dA])f。 図6は、GPCによる低分子SPG、及びdA40と低分子SPGの複合体の分離の例を示す。A：低分子SPGのGPCによる分離。B：dA40と低分子SPGの複合体のGPCによる分離。 図7は、SPG-S3とYB-1ASから得た低分子複合体（q1, q2, q3）のGPC分画前及び後のRIクロマトグラムを示す。 図8は、SPG-S3とYB-1ASから得た単離された低分子複合体（q1, q2, q3）のPC-9細胞生存率への効果を多分散複合体又は分画前の低分子複合体と比較した例を示す。 図9は、SPG-S3とmiR-145から得た単離された低分子複合体（q1, q2, q3）のPC-9細胞生存率への効果を多分散複合体又は分画前の低分子複合体と比較した例を示す。 図10は、SPG-S3とmiR-143から得た単離された低分子複合体（q1, q2, q3）のPC-9細胞生存率への効果を多分散複合体又は分画前の低分子複合体と比較した例を示す。 図11は、SPG-S3とmiR-145の低分子複合体（q1, q2, q3）及びSPG-S3とmiR-143の低分子複合体（q1, q2, q3）のCCF-STTG1細胞の生存率への効果を示す。 図12は、低分子複合体による標的タンパク質発現低下をウェスタンブロッティングで確認した結果を示す。 図13は、低分子化SPGとK-ras-ASから得た単離された低分子複合体（q1-K-ras-AS）のPC-9細胞生存率への効果を多分散複合体（L-SPG/K-ras-AS）と比較した例を示す。*P < 0.05、**P < 0.01。 図14は、低分子複合体（q1-K-ras-AS）のPC-9細胞におけるK-rasタンパク質発現への効果を多分散複合体（L-SPG/K-ras-AS）と比較したウェスタンブロッティングの結果を示す。 図15は、低分子化SPGとK3から得た単離された低分子複合体（q1-K3, q2-K3, q3-K3）の脾臓細胞IL-6産生誘導への効果を多分散複合体（L-SPG/K3）又はnaked K3と比較した例を示す。*P < 0.05、**P < 0.01。
（1）均質なβ-1,3-グルカン／核酸複合体の集団
　一態様において、本発明は、β-1,3-グルカン、及びβ-1,3-グルカンと水素結合を介して結合するホモポリヌクレオチドを含む核酸を含み、2本のβ-1,3-グルカン鎖と該核酸に含まれるβ-1,3-グルカンと水素結合を介して結合するホモポリヌクレオチドを含む1本の核酸鎖からなる3重らせん構造を有するβ-1,3-グルカン／核酸複合体の集団（本発明の複合体集団A）を提供する。本発明の複合体集団Aには、低分子量β-1,3-グルカン／核酸複合体が豊富に含まれており、該集団に含まれるβ-1,3-グルカン／核酸複合体の30%以上（好ましくは、40%以上、50%以上、60%以上、70%以上、80%以上、85%以上、86%以上、87%以上、88%以上、88%以上、89%以上、90%以上、91%以上、92%以上、93%以上、94%以上、95%以上、96%以上、97%以上、98%以上、99%以上、99.5%以上、99.9%以上）が、以下の条件を満たす：
（i）複合体を構成するβ-1,3-グルカンと水素結合を介して結合するホモポリヌクレオチドを含む核酸に含まれるホモポリヌクレオチドの長さが均一であり、且つ
（ii-a）1分子の複合体に含まれるβ-1,3-グルカンと水素結合を介して結合するホモポリヌクレオチドを含む核酸の分子数が1、2又は3である。
　別の態様において、本発明は、β-1,3-グルカン、及びβ-1,3-グルカンと水素結合を介して結合するホモポリヌクレオチドを含む核酸を含み、2本のβ-1,3-グルカン鎖と該核酸に含まれるβ-1,3-グルカンと水素結合を介して結合するホモポリヌクレオチドを含む1本の核酸鎖からなる3重らせん構造を有するβ-1,3-グルカン／核酸複合体の集団（本発明の複合体集団B）を提供する。本発明の複合体集団Bは、化学的特性において均質であり、該集団に含まれるβ-1,3-グルカン／核酸複合体の30%以上（好ましくは、40%以上、50%以上、60%以上、70%以上、80%以上、85%以上、86%以上、87%以上、88%以上、88%以上、89%以上、90%以上、91%以上、92%以上、93%以上、94%以上、95%以上、96%以上、97%以上、98%以上、99%以上、99.5%以上、99.9%以上）が、以下の条件を満たす：
（i）複合体を構成するβ-1,3-グルカンと水素結合を介して結合するホモポリヌクレオチドを含む核酸に含まれるホモポリヌクレオチドの長さが均一である。
（ii-b）1分子の複合体に含まれるβ-1,3-グルカンと水素結合を介して結合するホモポリヌクレオチドを含む核酸の分子数が均一であり、該分子数が1、2及び3からなる群から選択される。
　なお、本明細書において、「β-1,3-グルカンと水素結合を介して結合するホモポリヌクレオチド」を単に「ホモポリヌクレオチド」と称する場合がある。
　「β-1,3-グルカン／核酸複合体の集団」とは、複数のβ-1,3-グルカン／核酸複合体の集合をいう。本発明の複合体集団を構成するβ-1,3-グルカン／核酸複合体の数は、通常103以上（例えば、104以上、105以上、106以上、107以上、108以上、109以上、1010以上、1011以上、1012以上）である。本発明の複合体集団を構成するβ-1,3-グルカン／核酸複合体の数の上限値は特に限定されないが、例えば、1030以下、1029以下、1028以下等であってもよい。
　「複合体」とは、複数の分子が、静電結合、ファンデルワールス結合、水素結合、疎水性相互作用などの非共有結合又は共有結合を介して会合することにより得られる産物を意味する。本発明の複合体集団を構成する複合体においては、β-1,3-グルカンとホモポリヌクレオチドとの間の水素結合を介して、2本のβ-1,3-グルカン鎖と該ホモポリヌクレオチドを含有する1本の核酸鎖とが会合し、3重らせん構造を形成することにより、β-1,3-グルカンとβ-1,3-グルカンと水素結合を介して結合するホモポリヌクレオチドを含む核酸とが複合化している。
　β-1,3-グルカンとは、D-グルコースが、β-1,3-グリコシド結合で連なった構造を有する多糖をいう。本発明の複合体集団を構成するβ-1,3-グルカン／核酸複合体に含まれるβ-1,3-グルカンは、ポリデオキシアデニル酸と3重らせん構造を有する複合体を形成する限り特に限定されないが、例えば、シゾフィラン、レンチナン、スクレログルカン、カードラン、パーキマン、グリホラン、ラミナラン等を挙げることが出来る。β-1,3-グルカンは、好ましくは、シゾフィラン、レンチナンまたはスクレログルカンのように、β-1,6-グルコピラノシド分枝を含有するβ-1,3-グルカン、又はカードランのように分岐を含有しない直鎖β-1,3-グルカンであり、より好ましくはシゾフィラン又はカードランである。
　シゾフィラン（SPG）は、スエヒロタケから単離することができる。SPGは、β-(1→3)-D-グルカンの主鎖と、各3個のグルコース当り1個のβ-(1→6)-D-グルコシル側鎖からなる。レンチナン（LNT）は、公知のβ-1,3-1,6-グルカンであり、シイタケの子実体から単離することができる。カードランは、直鎖β-1,3-グルカンであり、アグロバクテリウム等の微生物の培養液から単離することが出来る。
　本発明の複合体集団A又はBを構成するβ-1,3-グルカン／核酸複合体を構成する核酸は、β-1,3-グルカンと水素結合を介して結合するホモポリヌクレオチドを含む。該ホモポリヌクレオチドは1本鎖であり得る。該核酸が部分構造としてβ-1,3-グルカンと水素結合を介して結合する1本鎖のホモポリヌクレオチドを含むことにより、2本のβ-1,3-グルカン鎖と、該ホモポリヌクレオチドを含む1本の核酸鎖からなる3重らせん構造の形成が可能となる。β-1,3-グルカンと水素結合を介して結合するホモポリヌクレオチドとしては、ポリデオキシアデニル酸（ポリデオキシアデノシン、ポリデオキシリボアデニル酸）（ポリ（dA））、ポリデオキシチミジル酸（ポリデオキシチミジン、ポリデオキシリボチミジル酸）（ポリ（dT））、ポリアデニル酸（ポリアデノシン、ポリリボアデニル酸）（ポリA）、ポリシチジル酸（ポリシチジン、ポリリボシチジル酸）（ポリC）が挙げられる。好ましくは、β-1,3-グルカンと水素結合を介して結合するホモポリヌクレオチドはポリ（dA）である。β-1,3-グルカンと水素結合を介して結合するホモポリヌクレオチドの長さ（塩基数）は、該ホモポリヌクレオチドを含む1本の核酸鎖が2本のβ-1,3-グルカン（例、シゾフィラン）鎖と3重らせん構造の複合体を形成するのに十分な長さであれば、特に限定されない。安定な三重らせん構造を形成する観点からは、ホモポリヌクレオチドの長さ（塩基数）は、通常10以上、好ましくは20以上、より好ましくは30以上である。該ホモポリヌクレオチドは、長ければ長いほどβ-1,3-グルカンと安定な三重らせん構造を形成するので、理論的には上限はないが、長すぎると、合成時において核酸の長さにバラつきが生じ易くなるので、通常、ホモポリヌクレオチドの長さ（塩基数）は、200以下、好ましくは100以下、より好ましくは80以下、更に好ましくは60以下である。ホモポリヌクレオチドの長さ（塩基数）は、好ましくは20～100、より好ましくは30～80、より好ましくは30～60（具体的には、30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59又は60）である。
　β-1,3-グルカンと水素結合を介して結合するホモポリヌクレオチドを含む核酸は、ホモポリヌクレオチドの末端に連結された付加核酸を含んでいてもよい。付加核酸は、ホモポリヌクレオチドの5’末端又は3’末端のいずれに連結されていてもよく、5’末端と3’末端の両方に連結されていてもよい。付加核酸は、ホモポリヌクレオチドの5’末端又は3’末端のいずれか一方のみに連結されていてもよい。好ましくは、付加核酸は、ホモポリヌクレオチドの5’末端に連結されるか、又はホモポリヌクレオチドの5’末端のみに連結される。付加核酸は、1本鎖又は2本鎖の核酸であり得る。核酸の種類としては、特に制限はなく、DNA、RNA、DNAとRNAのキメラ核酸、DNA/RNAのハイブリッド等であってもよい。付加核酸の長さ（塩基数）は、特に限定されないが、複合体の化学的均一性の観点から、通常1000以下、好ましくは500以下、より好ましくは100以下、更に好ましくは50以下（例、40以下、30以下、29以下、28以下、27以下、26以下、25以下）である。
　一態様として、付加核酸は、所望の標的遺伝子に対する発現抑制活性を有する核酸である。該核酸としては、アンチセンス核酸（例、アンチセンスDNA）、siRNA、miRNA、shRNA等を挙げることができるが、これらに限定されない。好ましくは、アンチセンス核酸（例、アンチセンスDNA）、siRNA又はmiRNAである。アンチセンス核酸は、標的遺伝子のmRNA又はpre-mRNAに相補的な配列を有する1本鎖の核酸（好ましくは、DNA）であり、その長さ（塩基数）は典型的には20程度（例、15～30）である。通常、アンチセンス核酸は、標的遺伝子のmRNA又はpre-mRNAに結合してタンパク質の翻訳を阻害する。siRNAは、標的遺伝子のmRNAに相補的な配列を有する2本鎖のRNAであり、長さ（塩基数）は典型的には21～23程度である。siRNAは、センス鎖及びアンチセンス鎖からなり、通常、アンチセンス鎖が標的遺伝子のmRNAと完全に相補的な配列を含み、センス鎖は標的遺伝子のmRNA配列の部分配列を含む。siRNAは、標的mRNAを切断することにより、標的遺伝子の発現を抑制する。miRNAは、標的遺伝子のmRNAに部分相補的な配列を有する1本鎖又は2本鎖のRNAであり、長さ（塩基数）は典型的には19～27程度である。「部分相補的な配列」とは、完全に相補的な配列ではなく、一部にミスマッチがあることを意味する。二本鎖のmiRNAは、センス鎖及びアンチセンス鎖からなり、通常、アンチセンス鎖が標的遺伝子のmRNAと部分相補的な配列を含み、センス鎖はアンチセンス鎖と相補的な配列を含む。miRNAは、標的mRNAに結合し、翻訳を抑制することにより、標的遺伝子の発現を抑制する。siRNA及びmiRNAのセンス鎖及び／又はアンチセンス鎖の3’末端にはオーバーハングを設けてよい。オーバーハングは通常2塩基のDNA又はRNAであり、TT、UU等の配列を挙げることができる。オーバーハングは、好ましくは連続する2つのデオキシチミンd(TT)である。2本鎖のsiRNA又はmiRNAをホモポリヌクレオチドの末端に連結する場合、センス鎖をホモポリヌクレオチドの末端に連結してもよく、アンチセンス鎖をホモポリヌクレオチドの末端に連結してもよいが、好ましくはセンス鎖をホモポリヌクレオチドの末端に連結する。より好ましくはホモポリヌクレオチドの5’末端にセンス鎖の3’末端を連結する。2本鎖のsiRNA又はmiRNAのいずれかの鎖の3’末端にホモポリヌクレオチドを連結する場合、該鎖の3’末端にはオーバーハングはなくてもよく、ホモポリヌクレオチドを連結しない鎖の3’末端のみにオーバーハングを設けてもよい。例えば、ホモポリヌクレオチドの5’末端にセンス鎖の3’末端を連結する場合、該センス鎖の3’末端にはオーバーハングはなくてもよく、アンチセンス鎖の3’末端のみにオーバーハング（例、d(TT)）を設けてもよい。
　標的遺伝子に対する発現抑制活性を有する核酸とホモポリヌクレオチドとは、直接共有結合により連結されていてもよいし、スペーサー配列を介して連結されていてもよい。スペーサー配列とは、2つの近接した構成要素の間に挿入される1以上のヌクレオチドを含むヌクレオチド配列を意味する。スペーサー配列の長さは、特に限定されないが、通常1～10ヌクレオチド長、好ましくは1～5ヌクレオチド長、より好ましくは1～3ヌクレオチド長である。一態様において、標的遺伝子に対する発現抑制活性を有する核酸とホモポリヌクレオチドとが、スペーサー配列を介さずに（即ち、直接共有結合により）連結される。
　β-1,3-グルカンと水素結合を介して結合するホモポリヌクレオチドを含む核酸は、ヌクレアーゼによる分解（例、エクソ又はエンドヌクレアーゼによる分解）に対して抵抗性となるように適切に修飾されていてもよい。例えば、リボヌクレオチドの2’位のヒドロキシル基の全部又は一部をフッ素又はメトキシ基で置換してもよい。また該核酸中のホスホジエステル結合の一部又は全てを、ホスホロチオエート結合又はホスホロジチオエート結合により置換してもよい。好ましくは、β-1,3-グルカンと水素結合を介して結合するホモポリヌクレオチドを含む核酸に含まれるホスホジエステル結合の少なくとも一部がホスホロチオエート結合により置換される。
　一態様において、β-1,3-グルカンと水素結合を介して結合するホモポリヌクレオチドを含む核酸は、該核酸に含まれるβ-1,3-グルカンと水素結合を介して結合するホモポリヌクレオチド（例、ポリ（dA））においてホスホロチオエート結合又はホスホロジチオエート結合による修飾を含む。より好ましくは、該ホモポリヌクレオチド（例、ポリ（dA））に含まれるホスホジエステル結合の全てが、ホスホロチオエート結合又はホスホロジチオエート結合に置換され、さらに好ましくは該ホモポリヌクレオチド（例、ポリ（dA））に含まれるホスホジエステル結合の全てが、ホスホロチオエート結合に置換される。ホスホロチオエート結合への置換により、ヌクレアーゼ分解に対する抵抗性に加えて、β-1,3-グルカンとの安定した複合化が期待できる。
　付加核酸として、siRNA又はmiRNAを用いる場合、そのアンチセンス鎖に含まれるリボヌクレオチドの2’位のヒドロキシル基の全部又は一部をフッ素又はメトキシ基で置換することが好ましい。好ましくは、siRNA又はmiRNAのアンチセンス鎖に含まれるリボヌクレオチドの2’位のヒドロキシル基の全部がフッ素又はメトキシ基で置換される。2’位のヒドロキシル基はフッ素又はメトキシ基のいずれで置換してもよいが、例えば、フッ素置換体とメトキシ置換体とが交互に整列するように、置換を行ってもよい。
　本発明の複合体集団A又はBに含まれるβ-1,3-グルカン／核酸複合体の30%以上（好ましくは、40%以上、50%以上、60%以上、70%以上、80%以上、85%以上、86%以上、87%以上、88%以上、88%以上、89%以上、90%以上、91%以上、92%以上、93%以上、94%以上、95%以上、96%以上、97%以上、98%以上、99%以上、99.5%以上、99.9%以上）は、該複合体を構成するβ-1,3-グルカンと水素結合を介して結合するホモポリヌクレオチドを含む核酸に含まれるβ-1,3-グルカンと水素結合を介して結合するホモポリヌクレオチド（例、ポリ（dA））の長さ（塩基数）に関して均一（同一）である。即ち、本発明の複合体集団の30%以上（好ましくは、40%以上、50%以上、60%以上、70%以上、80%以上、85%以上、86%以上、87%以上、88%以上、88%以上、89%以上、90%以上、91%以上、92%以上、93%以上、94%以上、95%以上、96%以上、97%以上、98%以上、99%以上、99.5%以上、99.9%以上）のメンバーが、同一で画一的な長さ（塩基数）の「β-1,3-グルカンと水素結合を介して結合するホモポリヌクレオチド」を含む核酸を含有する。該ホモポリヌクレオチドの長さ（塩基数）は、通常200以下、好ましくは100以下、より好ましくは80以下、更に好ましくは60以下である。該ホモポリヌクレオチドの長さ（塩基数）は、好ましくは20～100、より好ましくは30～80、より好ましくは30～60（具体的には、30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59又は60）である。例えば、本発明の複合体集団A又はBに含まれるβ-1,3-グルカン／核酸複合体の30%以上（好ましくは、40%以上、50%以上、60%以上、70%以上、80%以上、85%以上、86%以上、87%以上、88%以上、88%以上、89%以上、90%以上、91%以上、92%以上、93%以上、94%以上、95%以上、96%以上、97%以上、98%以上、99%以上、99.5%以上、99.9%以上）が長さ（塩基数）60のホモポリヌクレオチド（例、ポリ（dA）））を含む核酸を含有する。このようにホモポリヌクレオチドの長さについて均一なβ-1,3-グルカン／核酸複合体の集団は、下記の本発明の製造方法において、ホモポリヌクレオチドの長さが均一なβ-1,3-グルカンと水素結合を介して結合するホモポリヌクレオチドを含む核酸の集団を用いてβ-1,3-グルカン／核酸複合体を調製することにより得ることができる。ホモポリヌクレオチドの長さが均一なβ-1,3-グルカンと水素結合を介して結合するホモポリヌクレオチドを含む核酸の集団は、周知の核酸合成技術及びカラム精製技術により得ることができる。
　本発明の複合体集団Aに含まれるβ-1,3-グルカン／核酸複合体の30%以上（好ましくは、40%以上、50%以上、60%以上、70%以上、80%以上、85%以上、86%以上、87%以上、88%以上、88%以上、89%以上、90%以上、91%以上、92%以上、93%以上、94%以上、95%以上、96%以上、97%以上、98%以上、99%以上、99.5%以上、99.9%以上）は、1分子の複合体に含まれるβ-1,3-グルカンと水素結合を介して結合するホモポリヌクレオチドを含む核酸の分子数が1、2又は3である。即ち、上記(i)の条件と、以下の（ii-a-1）～（ii-a-3）のいずれかの条件を満たすβ-1,3-グルカン／核酸複合体の総和が、本発明の複合体集団Aに含まれるβ-1,3-グルカン／核酸複合体の30%以上（好ましくは、40%以上、50%以上、60%以上、70%以上、80%以上、85%以上、86%以上、87%以上、88%以上、88%以上、89%以上、90%以上、91%以上、92%以上、93%以上、94%以上、95%以上、96%以上、97%以上、98%以上、99%以上、99.5%以上、99.9%以上）を占める：
（ii-a-1）1分子の複合体に含まれるβ-1,3-グルカンと水素結合を介して結合するホモポリヌクレオチドを含む核酸の分子数が1である。
（ii-a-2）1分子の複合体に含まれるβ-1,3-グルカンと水素結合を介して結合するホモポリヌクレオチドを含む核酸の分子数が2である。
（ii-a-3）1分子の複合体に含まれるβ-1,3-グルカンと水素結合を介して結合するホモポリヌクレオチドを含む核酸の分子数が3である。
　好ましくは、本発明の複合体集団Aに含まれるβ-1,3-グルカン／核酸複合体の30%以上（好ましくは、40%以上、50%以上、60%以上、70%以上、80%以上、85%以上、86%以上、87%以上、88%以上、88%以上、89%以上、90%以上、91%以上、92%以上、93%以上、94%以上、95%以上、96%以上、97%以上、98%以上、99%以上、99.5%以上、99.9%以上）は、1分子の複合体に含まれるβ-1,3-グルカンと水素結合を介して結合するホモポリヌクレオチドを含む核酸の分子数が1又は2である。即ち、上記(i)に加えて、（ii-a-1）又は（ii-a-2）の条件を満たすβ-1,3-グルカン／核酸複合体の総和が、本発明の複合体集団Aに含まれるβ-1,3-グルカン／核酸複合体の30%以上（好ましくは、40%以上、50%以上、60%以上、70%以上、80%以上、85%以上、86%以上、87%以上、88%以上、88%以上、89%以上、90%以上、91%以上、92%以上、93%以上、94%以上、95%以上、96%以上、97%以上、98%以上、99%以上、99.5%以上、99.9%以上）を占める。
　好ましい態様において、本発明の複合体集団Aにおいて、(i)及び(ii-a)の条件を満たすβ-1,3-グルカン／核酸複合体の総和の50%以上（好ましくは、60%以上、70％以上、80％以上、90％以上、95%以上）が、1分子の複合体に含まれるβ-1,3-グルカンと水素結合を介して結合するホモポリヌクレオチドを含む核酸の分子数が1のβ-1,3-グルカン／核酸複合体である。1分子の複合体に含まれる核酸の分子数が1のβ-1,3-グルカン／核酸複合体（q1）は、細胞内へ核酸を送達する能力に優れるため、q1を豊富に含む本発明の複合体集団Aは、細胞内へ核酸を導入するためのキャリアーとして有利である。
　本発明の複合体集団Bに含まれるβ-1,3-グルカン／核酸複合体の30%以上（好ましくは、40%以上、50%以上、60%以上、70%以上、80%以上、85%以上、86%以上、87%以上、88%以上、88%以上、89%以上、90%以上、91%以上、92%以上、93%以上、94%以上、95%以上、96%以上、97%以上、98%以上、99%以上、99.5%以上、99.9%以上）が、1分子の複合体に含まれるβ-1,3-グルカンと水素結合を介して結合するホモポリヌクレオチドを含む核酸の分子数に関して均一であり、該分子数が1、2及び3からなる群から選択される。即ち、本発明の複合体集団Bに含まれるβ-1,3-グルカン／核酸複合体の30%以上（好ましくは、40%以上、50%以上、60%以上、70%以上、80%以上、85%以上、86%以上、87%以上、88%以上、88%以上、89%以上、90%以上、91%以上、92%以上、93%以上、94%以上、95%以上、96%以上、97%以上、98%以上、99%以上、99.5%以上、99.9%以上）は、上記(i)の条件に加えて、以下から選択されるいずれかの条件を満たす。
（ii-b-1）1分子の複合体に含まれるβ-1,3-グルカンと水素結合を介して結合するホモポリヌクレオチドを含む核酸の分子数に関して均一であり、該分子数が1である。
（ii-b-2）1分子の複合体に含まれるβ-1,3-グルカンと水素結合を介して結合するホモポリヌクレオチドを含む核酸の分子数に関して均一であり、該分子数が2である。
（ii-b-3）1分子の複合体に含まれるβ-1,3-グルカンと水素結合を介して結合するホモポリヌクレオチドを含む核酸の分子数に関して均一であり、該分子数が3である。
　好ましくは、本発明の複合体集団Bに含まれるβ-1,3-グルカン／核酸複合体の30%以上（好ましくは、40%以上、50%以上、60%以上、70%以上、80%以上、85%以上、86%以上、87%以上、88%以上、88%以上、89%以上、90%以上、91%以上、92%以上、93%以上、94%以上、95%以上、96%以上、97%以上、98%以上、99%以上、99.5%以上、99.9%以上）が、1分子の複合体に含まれるβ-1,3-グルカンと水素結合を介して結合するホモポリヌクレオチドを含む核酸の分子数に関して均一であり、該分子数が1である。即ち、1分子の複合体にβ-1,3-グルカンと水素結合を介して結合するホモポリヌクレオチドを含む核酸を1分子のみ含むβ-1,3-グルカン／核酸複合体が、本発明の複合体集団Bの30%以上（好ましくは、40%以上、50%以上、60%以上、70%以上、80%以上、85%以上、86%以上、87%以上、88%以上、88%以上、89%以上、90%以上、91%以上、92%以上、93%以上、94%以上、95%以上、96%以上、97%以上、98%以上、99%以上、99.5%以上、99.9%以上）を占める。
　β-1,3-グルカン／核酸複合体の集団の30%以上（好ましくは80%以上）のメンバーが、1分子の複合体に含まれるβ-1,3-グルカンと水素結合を介して結合するホモポリヌクレオチドを含む核酸の分子数に関して均一であることは、β-1,3-グルカン／核酸複合体の集団をゲル浸透クロマトグラフィーにて分離し、分光光度計で検出することにより確認することができる。特定の分子数（1、2又は3）の核酸を含む複合体のピーク面積が全体の30%以上（好ましくは80%以上）であれば、β-1,3-グルカン／核酸複合体の集団の30%以上（好ましくは80%以上）のメンバーが、1分子の複合体に含まれる核酸の分子数に関して均一であるとすることができる。該分光光度計により、複合体に含まれる核酸の検出が可能な波長（例、260nm）で、分離した複合体を検出する。尚、本明細書において、あるβ-1,3-グルカン／核酸複合体の集団に含まれる、特定の形質のβ-1,3-グルカン／核酸複合体の割合（%）は、特に断りがない限り、このピーク面積に基づき算出することとする。
　また、β-1,3-グルカン／核酸複合体の集団の30%以上のメンバーが、1分子の複合体に含まれるβ-1,3-グルカンと水素結合を介して結合するホモポリヌクレオチドを含む核酸の分子数が1、2又は3であることも、β-1,3-グルカン／核酸複合体の集団をゲル浸透クロマトグラフィーにて分離し、分光光度計で検出することにより確認することができる。分子数1の核酸を含む複合体、分子数2の核酸を含む複合体、及び分子数3の核酸を含む複合体のピーク面積の合計が全体の30%以上であれば、β-1,3-グルカン／核酸複合体の集団の30%以上のメンバーが、1分子の複合体に含まれる核酸の分子数が1、2又は3であるとすることができる。該分光光度計により、複合体に含まれる核酸の検出が可能な波長（例、260nm）で、分離した複合体を検出する。
　一態様において、本発明の複合体集団A又はBは、1分子の複合体に含まれる、β-1,3-グルカンの主鎖グルコース単位数の、ホモポリヌクレオチドを構成するヌクレオチド単位数に対する比（主鎖グルコース単位数／ヌクレオチド単位数）の平均が1.5～2.5（好ましくは、1.6～2.4、より好ましくは1.7～2.3、更に好ましくは1.8～2.2）である。即ち、本発明の複合体集団A又はBにおいては、β-1,3-グルカンの主鎖グルコース単位数の、ホモポリヌクレオチドを構成するヌクレオチド単位数に対する比（主鎖グルコース単位数／ヌクレオチド単位数）の平均が、ほぼ化学量論比の2であり、β-1,3-グルカンと水素結合を介して結合するホモポリヌクレオチドを含む核酸に含まれるホモポリヌクレオチド（例、ポリ（dA））が、自らと過不足なく複合化が可能なちょうどよい大きさ（長さ）のβ-1,3-グルカンと会合している。β-1,3-グルカン／核酸複合体の集団の主鎖グルコース単位数／ヌクレオチド単位数比の平均は、以下のように求めることができる。該複合体集団における複合体の重量平均分子量を光散乱法で決定する。複合体集団を構成する複合体1分子に含まれるβ-1,3-グルカンと水素結合を介して結合するホモポリヌクレオチドを含む核酸の分子数、及び該核酸の分子量から、該重量平均分子量に占める該核酸相当分を計算する。該重量平均分子量から、該核酸相当分を差し引くことにより、該重量平均分子量に占めるβ-1,3-グルカン相当分を計算する。このβ-1,3-グルカン相当分をβ-1,3-グルカンの繰り返し単位の分子量で除して、得られた値に繰り返し単位に含まれる主鎖グルコース数を乗することにより、複合体1分子に含まれる主鎖グルコース単位数を計算する。複合体1分子に含まれるβ-1,3-グルカンと水素結合を介して結合するホモポリヌクレオチドを含む核酸の分子数、及び該核酸に含まれるホモポリヌクレオチドの塩基数から、複合体1分子に含まれるホモポリヌクレオチドを構成するヌクレオチド単位数を計算する。主鎖グルコース単位数をヌクレオチド単位数で除することにより、目的の数値を得る。
　本発明の複合体集団A又はBを構成する複合体の典型的な構造の模式図を図2に示す。実線がβ-1,3-グルカン、波線がβ-1,3-グルカン鎖と水素結合を介して結合するホモポリヌクレオチド（例、ポリ（dA））をそれぞれ示す。q1は、1分子の複合体に1分子のβ-1,3-グルカン鎖と水素結合を介して結合するホモポリヌクレオチドを含む核酸を含む複合体、q2は、1分子の複合体に2分子のβ-1,3-グルカン鎖と水素結合を介して結合するホモポリヌクレオチドを含む核酸を含む複合体、q3は、1分子の複合体に3分子のβ-1,3-グルカン鎖と水素結合を介して結合するホモポリヌクレオチドを含む核酸を含む複合体をそれぞれ示す。q1においては1つのホモポリヌクレオチドにより、1本のホモポリヌクレオチド鎖が構成される。q2においては2つのホモポリヌクレオチドがタンデムに整列することにより、2倍の長さ（塩基数）を有する1本のホモポリヌクレオチド鎖が構成される。q3においては3つのホモポリヌクレオチドがタンデムに整列することにより、3倍の長さ（塩基数）を有する1本のホモポリヌクレオチド鎖が構成される。Aの態様においては、1分子の複合体に含まれるβ-1,3-グルカンの分子数が2であり、これが1本のホモポリヌクレオチド鎖と3重らせん構造を形成する。Aの態様における1分子のβ-1,3-グルカン中の主鎖グルコース数は、ホモポリヌクレオチドの長さ（塩基数）の0.75～1.25倍（好ましくは、0.8～1.2倍、より好ましくは0.85～1.15倍、更に好ましくは0.9～1.1倍）であり得る。Bの態様においては、1分子の複合体に1分子のβ-1,3-グルカンが含まれ、このβ-1,3-グルカンがヘアピン構造を介して折りたたまれることにより2本鎖を形成し、これが1本のホモポリヌクレオチド鎖と3重らせん構造を形成する。Bの態様における1分子のβ-1,3-グルカンの主鎖グルコース数は、ホモポリヌクレオチド鎖の長さ（塩基数）の1.5～2.5倍（好ましくは、1.6～2.4倍、より好ましくは1.7～2.3倍、更に好ましくは1.8～2.2倍）であり得る。好ましくは、本発明の複合体集団を構成する複合体の30%以上（好ましくは、40%以上、50%以上、60%以上、70%以上、80%以上、85%以上、86%以上、87%以上、88%以上、88%以上、89%以上、90%以上、91%以上、92%以上、93%以上、94%以上、95%以上、96%以上、97%以上、98%以上、99%以上、99.5%以上、99.9%以上）のメンバーが、1分子の複合体に含まれるβ-1,3-グルカンの分子数が1又は2であるβ-1,3-グルカン／核酸複合体である。
　好ましい態様において、本発明の複合体集団A又はBに含まれるβ-1,3-グルカン／核酸複合体の30%以上（好ましくは、40%以上、50%以上、60%以上、70%以上、80%以上、85%以上、86%以上、87%以上、88%以上、88%以上、89%以上、90%以上、91%以上、92%以上、93%以上、94%以上、95%以上、96%以上、97%以上、98%以上、99%以上、99.5%以上、99.9%以上）が、更に以下の条件を満たす：
（iii）1分子の複合体に含まれるβ-1,3-グルカンの分子数が1又は2である。
即ち、1分子の複合体にβ-1,3-グルカンを1分子又は2分子のみ含むβ-1,3-グルカン／核酸複合体が、本発明の複合体集団A又はBの30%以上（好ましくは、40%以上、50%以上、60%以上、70%以上、80%以上、85%以上、86%以上、87%以上、88%以上、88%以上、89%以上、90%以上、91%以上、92%以上、93%以上、94%以上、95%以上、96%以上、97%以上、98%以上、99%以上、99.5%以上、99.9%以上）を占める。
　本発明の複合体集団A又はBに含まれる複合体の理論分子量は、以下の式で表すことが出来る。
理論分子量＝＜A＞＋＜B＞×2
＜A＞β-1,3-グルカンと水素結合を介して結合するホモポリヌクレオチドを含む核酸の分子量に、上記（ii-b）の1分子の複合体に含まれる該核酸の分子数（1、2又は3）を乗して得られた値
＜B＞上記（i）のホモポリヌクレオチドの長さ（塩基数）に上記（ii-b）の1分子の複合体に含まれる該核酸の分子数（1、2又は3）を乗して得られた値と同一数の主鎖グルコース数を有するβ-1,3-グルカンの分子量
　一態様において、本発明の複合体集団Bの重量平均分子量は、以下の範囲内である：
＜A＞＋＜B＞×1.5～＜A＞＋＜B＞×2.5
（好ましくは、＜A＞＋＜B＞×1.6～＜A＞＋＜B＞×2.4、
より好ましくは、＜A＞＋＜B＞×1.7～＜A＞＋＜B＞×2.3、
更に好ましくは＜A＞＋＜B＞×1.8～＜A＞＋＜B＞×2.2）。
　一態様において、本発明の複合体集団Bは、Mw（重量平均分子量）／Mn（数平均分子量）で表される分散指数が、0.8～1.2（好ましくは0.9～1.1、0.95～1.05、0.96～1.04、0.97～1.03、0.98～1.02、0.99～1.01）である。本発明の複合体集団BのMw／Mnは、複合体集団をGPCで分離し、光散乱測定器で解析することにより決定することができる。
　好ましい一態様において、本発明の複合体集団Aは、β-1,3-グルカン（例、シゾフィラン）、及びβ-1,3-グルカンと水素結合を介して結合するホモポリヌクレオチド（例、ポリ（dA））を含む核酸を含み、2本のβ-1,3-グルカン鎖と該核酸に含まれるβ-1,3-グルカンと水素結合を介して結合するホモポリヌクレオチド（例、ポリ（dA））を含む1本の核酸鎖からなる3重らせん構造を有するβ-1,3-グルカン／核酸複合体の集団であって、
　該集団に含まれるβ-1,3-グルカン／核酸複合体の30%以上（好ましくは、40%以上、50%以上、60%以上、70%以上、80%以上、85%以上、86%以上、87%以上、88%以上、88%以上、89%以上、90%以上、91%以上、92%以上、93%以上、94%以上、95%以上、96%以上、97%以上、98%以上、99%以上、99.5%以上、99.9%以上）が、以下の条件を満たし；
（i）複合体を構成するβ-1,3-グルカンと水素結合を介して結合するホモポリヌクレオチドを含む核酸に含まれるホモポリヌクレオチド（例、ポリ（dA））の長さが均一である。
（ii-a）1分子の複合体に含まれるβ-1,3-グルカンと水素結合を介して結合するホモポリヌクレオチドを含む核酸の分子数が1、2又は3（好ましくは1又は2）である。
（iii）1分子の複合体に含まれるβ-1,3-グルカンの分子数が1又は2である。
　(i)、（ii-a）及び(iii)の条件を満たすβ-1,3-グルカン／核酸複合体の総和の50%以上（好ましくは、60%以上、70％以上、80％以上、90％以上、95%以上）が、1分子の複合体に含まれるβ-1,3-グルカンと水素結合を介して結合するホモポリヌクレオチドを含む核酸の分子数が1のβ-1,3-グルカン／核酸複合体であり、
　（i）におけるホモポリヌクレオチド（例、ポリ（dA））の長さ（塩基数）は20～100（より好ましくは30～80、より好ましくは30～60（具体的には、30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59又は60）であってもよく；
　ホモポリヌクレオチド（例、ポリ（dA））におけるホスホジエステル結合の一部又は全てが、ホスホロチオエート結合に置換されていてもよく；
　β-1,3-グルカンと水素結合を介して結合するホモポリヌクレオチドを含む核酸が付加核酸を含み、該付加核酸がホモポリヌクレオチドの末端（好ましくは5’末端）に連結されており、該付加核酸は、アンチセンス核酸、siRNA、miRNA等の標的遺伝子に対する発現抑制活性を有する核酸であってもよく；
　1分子の複合体に含まれる、β-1,3-グルカンの主鎖グルコース単位数の、ホモポリヌクレオチドを構成するヌクレオチド単位数に対する比（主鎖グルコース単位数／ヌクレオチド単位数）の平均が1.5～2.5（好ましくは、1.6～2.4、より好ましくは1.7～2.3、更に好ましくは1.8～2.2）である。
　好ましい一態様において、本発明の複合体集団Bは、β-1,3-グルカン（例、シゾフィラン）、及びβ-1,3-グルカンと水素結合を介して結合するホモポリヌクレオチド（例、ポリ（dA））を含む核酸を含み、2本のβ-1,3-グルカン鎖と該核酸に含まれるβ-1,3-グルカンと水素結合を介して結合するホモポリヌクレオチド（例、ポリ（dA））を含む1本の核酸鎖からなる3重らせん構造を有するβ-1,3-グルカン／核酸複合体の集団であって、
　該集団に含まれるβ-1,3-グルカン／核酸複合体の30%以上（好ましくは、40%以上、50%以上、60%以上、70%以上、80%以上、85%以上、86%以上、87%以上、88%以上、88%以上、89%以上、90%以上、91%以上、92%以上、93%以上、94%以上、95%以上、96%以上、97%以上、98%以上、99%以上、99.5%以上、99.9%以上）が、以下の条件を満たし；
（i）複合体を構成するβ-1,3-グルカンと水素結合を介して結合するホモポリヌクレオチドを含む核酸に含まれるホモポリヌクレオチド（例、ポリ（dA））の長さが均一である。
（ii-b）1分子の複合体に含まれるβ-1,3-グルカンと水素結合を介して結合するホモポリヌクレオチドを含む核酸の分子数が均一であり、該分子数が1、2及び3からなる群から選択される（好ましくは1）。
　（i）におけるホモポリヌクレオチド（例、ポリ（dA））の長さ（塩基数）は20～100（より好ましくは30～80、より好ましくは30～60（具体的には、30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59又は60）であってもよく；
　ホモポリヌクレオチド（例、ポリ（dA））におけるホスホジエステル結合の一部又は全てが、ホスホロチオエート結合に置換されていてもよく；
　β-1,3-グルカンと水素結合を介して結合するホモポリヌクレオチドを含む核酸が付加核酸を含み、該付加核酸がホモポリヌクレオチドの末端（好ましくは5’末端）に連結されており、該付加核酸は、アンチセンス核酸、siRNA、miRNA等の標的遺伝子に対する発現抑制活性を有する核酸であってもよく；
　1分子の複合体に含まれる、β-1,3-グルカンの主鎖グルコース単位数の、ホモポリヌクレオチドを構成するヌクレオチド単位数に対する比（主鎖グルコース単位数／ヌクレオチド単位数）の平均が1.5～2.5（好ましくは、1.6～2.4、より好ましくは1.7～2.3、更に好ましくは1.8～2.2）であり；
　該複合体集団に含まれるβ-1,3-グルカン／核酸複合体の30%以上（好ましくは、40%以上、50%以上、60%以上、70%以上、80%以上、85%以上、86%以上、87%以上、88%以上、88%以上、89%以上、90%以上、91%以上、92%以上、93%以上、94%以上、95%以上、96%以上、97%以上、98%以上、99%以上、99.5%以上、99.9%以上）が、更に以下の条件を満たしていてもよく；且つ
（iii）1分子の複合体に含まれるβ-1,3-グルカンの分子数が1又は2である。
　Mw（重量平均分子量）／Mn（数平均分子量）で表される分散指数が、0.8～1.2（好ましくは0.9～1.1、0.95～1.05、0.96～1.04、0.97～1.03、0.98～1.02、0.99～1.01）である。
　好ましい一態様において、本発明の複合体集団Bは、β-1,3-グルカン（例、シゾフィラン）、及びポリデオキシアデニル酸を含む核酸を含み、2本のβ-1,3-グルカン鎖とポリデオキシアデニル酸を含む1本の核酸鎖からなる3重らせん構造を有するβ-1,3-グルカン／核酸複合体の集団であって、該集団に含まれるβ-1,3-グルカン／核酸複合体の30%以上（好ましくは、40%以上、50%以上、60%以上、70%以上、80%以上、85%以上、86%以上、87%以上、88%以上、88%以上、89%以上、90%以上、91%以上、92%以上、93%以上、94%以上、95%以上、96%以上、97%以上、98%以上、99%以上、99.5%以上、99.9%以上）が、以下の条件を満たし；
（i）複合体を構成するポリデオキシアデニル酸を含む核酸に含まれるポリデオキシアデニル酸の長さが均一である。
（ii-b-1）1分子の複合体に含まれるポリデオキシアデニル酸を含む核酸の分子数が均一であり、該分子数が1である。
　ポリデオキシアデニル酸の長さ（塩基数）が20～100（より好ましくは30～80、より好ましくは30～60（具体的には、30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59又は60））であり；
　ポリデオキシアデニル酸におけるホスホジエステル結合の一部又は全てが、ホスホロチオエート結合に置換されており；
　ポリデオキシアデニル酸を含む核酸が付加核酸を含み、該付加核酸がポリデオキシアデニル酸の末端（好ましくは5’末端）に連結されており、該付加核酸は、アンチセンス核酸、siRNA、miRNA等の標的遺伝子に対する発現抑制活性を有する核酸であってもよく；
　1分子の複合体に含まれる、β-1,3-グルカンの主鎖グルコース単位数の、ポリデオキシアデニル酸を構成するヌクレオチド単位数に対する比（主鎖グルコース単位数／ヌクレオチド単位数）の平均が1.5～2.5（好ましくは、1.6～2.4、より好ましくは1.7～2.3、更に好ましくは1.8～2.2）であり；
　該複合体集団に含まれるβ-1,3-グルカン／核酸複合体の30%以上（好ましくは、40%以上、50%以上、60%以上、70%以上、80%以上、85%以上、86%以上、87%以上、88%以上、88%以上、89%以上、90%以上、91%以上、92%以上、93%以上、94%以上、95%以上、96%以上、97%以上、98%以上、99%以上、99.5%以上、99.9%以上）が、更に以下の条件を満たしていてもよく；且つ
（iii）1分子の複合体に含まれるβ-1,3-グルカンの分子数が1又は2である。
　Mw（重量平均分子量）／Mn（数平均分子量）で表される分散指数が、0.8～1.2（好ましくは0.9～1.1、0.95～1.05、0.96～1.04、0.97～1.03、0.98～1.02、0.99～1.01）である。
（2）均質なβ-1,3-グルカン／核酸複合体の集団の製造
　本発明は、上記本発明のβ-1,3-グルカン／核酸複合体の集団A又はBの製造方法（本発明の製造方法）を提供する。本発明の製造方法は、以下の工程を含む：
　β-1,3-グルカンと水素結合を介して結合するホモポリヌクレオチドを含む核酸と、β-1,3-グルカンとを混合することにより、β-1,3-グルカン、及びβ-1,3-グルカンと水素結合を介して結合するホモポリヌクレオチドを含む核酸を含み、2本のβ-1,3-グルカン鎖とβ-1,3-グルカンと水素結合を介して結合するホモポリヌクレオチドを含む1本の核酸鎖からなる3重らせん構造を有するβ-1,3-グルカン／核酸複合体を調製する工程。
　混合に供するβ-1,3-グルカンと水素結合を介して結合するホモポリヌクレオチドを含む核酸（の集団）は、該核酸に含まれるβ-1,3-グルカンと水素結合を介して結合するホモポリヌクレオチド（例、ポリ（dA））の長さ（塩基数）に関して均一であり、該集団の30%以上（好ましくは、40%以上、50%以上、60%以上、70%以上、80%以上、85%以上、86%以上、87%以上、88%以上、88%以上、89%以上、90%以上、91%以上、92%以上、93%以上、94%以上、95%以上、96%以上、97%以上、98%以上、99%以上、99.5%以上、99.9%以上）のメンバーが、同一で画一的な長さ（塩基数）の「β-1,3-グルカンと水素結合を介して結合するホモポリヌクレオチド」を含む。
　混合に供するβ-1,3-グルカンは、低分子化処理に付したものであることが好ましい。低分子化処理としては、超音波処理、アルカリ加水分解、酸加水分解、酵素処理等を挙げることが出来る。β-1,3-グルカンが3本鎖から1本鎖へと解離するアルカリ条件下で超音波処理することにより、β-1,3-グルカンを効率的に低分子化することができる。この超音波処理の際に、β-1,3-グルカンを40～50℃程度に加熱してもよい。例えば、β-1,3-グルカンの重量平均分子量が、10万以下（好ましくは5万以下、より好ましくは3万以下）になるまで低分子化処理に付す。好ましい態様において、重量平均分子量が、10万以下（好ましくは5万以下、より好ましくは3万以下）であるβ-1,3-グルカン（の集団）を混合に供する。混合に供するβ-1,3-グルカン（の集団）の重量平均分子量は、通常3000以上（好ましくは4000以上、5000以上、6000以上、7000以上、8000以上、9000以上、1万以上）であり得る。
　また、高分子量のβ-1,3-グルカンは、大量の核酸分子と複合化して反応系から核酸分子を除去してしまい、均質なβ-1,3-グルカン／核酸複合体を妨げるので、低分子化処理に加えて、高分子量のβ-1,3-グルカンを除く処理に付してもよい。このような処理としては、限外ろ過、ゲル浸透クロマトグラフィー、透析等を挙げることが出来る。例えば、少なくとも10万以上（好ましくは5万以上）の重量平均分子量の画分を除去してもよい。例えば、β-1,3-グルカンをゲル浸透クロマトグラフィーで分離し、示差屈折率検出器で検出したときに、10万以上（好ましくは5万以上）の分子量のβ-1,3-グルカンのピーク面積が全体の50％以下（好ましくは40％以下、30％以下、20％以下、10％以下、5％以下）となるよう、高分子量のβ-1,3-グルカンを除去する。好ましい態様において、ゲル浸透クロマトグラフィーで分離し、示差屈折率検出器で検出したときに、10万以上（好ましくは5万以上）の分子量のβ-1,3-グルカンのピーク面積が全体の50％以下（好ましくは40％以下、30％以下、20％以下、10％以下、5％以下）であるβ-1,3-グルカン（の集団）を混合に供する。より好ましい態様において、重量平均分子量が、10万以下（好ましくは5万以下、より好ましくは3万以下）であり、ゲル浸透クロマトグラフィーで分離し、示差屈折率検出器で検出したときに、10万以上（好ましくは5万以上）の分子量のβ-1,3-グルカンのピーク面積が全体の50％以下（好ましくは40％以下、30％以下、20％以下、10％以下、5％以下）であるβ-1,3-グルカン（の集団）を混合に供する。
　β-1,3-グルカンは天然では三重らせん構造として存在するので、上述のようにして得られた低分子β-1,3-グルカンを、非プロトン性有機極性溶媒（ジメチルスルホキシド（DMSO）,アセトニトリル,アセトン等）またはアルカリ水溶液（水酸化ナトリウム、水酸化カリウム、アンモニア、水酸化カルシウム等）に溶解して一本鎖に解く。このようにして得られた一本鎖のβ-1,3-グルカンの溶液と、上述のβ-1,3-グルカンと水素結合を介して結合するホモポリヌクレオチド（例、ポリ（dA））を含む核酸の溶液（水溶液、中性付近のpHの緩衝水溶液、又は酸性の緩衝水溶液、好ましくは、水溶液又は中性付近のpHの緩衝水溶液）とを混合し、必要に応じて再度pHを中性付近に調整後、適当時間保持する、例えば、4℃で一夜保持する。その結果、2本のβ-1,3-グルカン鎖とβ-1,3-グルカンと水素結合を介して結合するホモポリヌクレオチドを含む1本の核酸鎖からなる3重らせん構造を有するβ-1,3-グルカン／核酸複合体が形成される。
　本発明の複合体集団Aを製造する場合、得られたβ-1,3-グルカン／核酸複合体をゲル浸透クロマトグラフィーに付し、1分子の複合体に含まれるβ-1,3-グルカンと水素結合を介して結合するホモポリヌクレオチドを含む核酸の分子数が1～3（好ましくは1～2）であるβ-1,3-グルカン／核酸複合体分画（q1+q2+q3、好ましくはq1+q2）を単離してもよい。この精製工程により、未反応のβ-1,3-グルカンや核酸；1分子の複合体に含まれるβ-1,3-グルカンと水素結合を介して結合するホモポリヌクレオチドを含む核酸の分子数が4を超える複合体を除去することにより、目的とする本発明の複合体集団Aを得ることができる。例えば、精製したβ-1,3-グルカン／核酸複合体の集団をゲル浸透クロマトグラフィーにて分離し、分光光度計で検出したときに、分子数1の核酸を含む複合体、分子数2の核酸を含む複合体、及び分子数3の核酸を含む複合体のピーク面積の合計（好ましくは、分子数1の核酸を含む複合体、及び分子数2の核酸を含む複合体のピーク面積の合計）が全体の30%以上（好ましくは、40%以上、50%以上、60%以上、70%以上、80%以上、85%以上、86%以上、87%以上、88%以上、88%以上、89%以上、90%以上、91%以上、92%以上、93%以上、94%以上、95%以上、96%以上、97%以上、98%以上、99%以上、99.5%以上、99.9%以上）となるように、分子数1～3（好ましくは、1～2）の核酸を含む複合体分画を単離する。
　本発明の複合体集団Bを製造する場合、得られたβ-1,3-グルカン／核酸複合体をゲル浸透クロマトグラフィーに付し、1分子の複合体に含まれるβ-1,3-グルカンと水素結合を介して結合するホモポリヌクレオチドを含む核酸の分子数が1、2及び3からなる群から選択されるいずれか（好ましくは1）であるβ-1,3-グルカン／核酸複合体を単離してもよい。この精製工程により、未反応のβ-1,3-グルカンや核酸；1分子の複合体に含まれるβ-1,3-グルカンと水素結合を介して結合するホモポリヌクレオチドを含む核酸の分子数が4を超える複合体を除去することにより、目的とする本発明の複合体集団Bを得ることができる。例えば、精製したβ-1,3-グルカン／核酸複合体の集団をゲル浸透クロマトグラフィーにて分離し、分光光度計で検出したときに、特定の分子数（1、2又は3、好ましくは1）のβ-1,3-グルカンと水素結合を介して結合するホモポリヌクレオチドを含む核酸を含む複合体のピーク面積が全体の30%以上（好ましくは、40%以上、50%以上、60%以上、70%以上、80%以上、85%以上、86%以上、87%以上、88%以上、88%以上、89%以上、90%以上、91%以上、92%以上、93%以上、94%以上、95%以上、96%以上、97%以上、98%以上、99%以上、99.5%以上、99.9%以上）となるように、特定の分子数（1、2又は3、好ましくは1）のβ-1,3-グルカンと水素結合を介して結合するホモポリヌクレオチドを含む核酸を含む複合体を分画し得る。
　この精製工程は必須ではなく、本発明の製造方法はこの精製工程を含まなくてもよい。特に、重量平均分子量が、10万以下（好ましくは5万以下、より好ましくは3万以下）であるβ-1,3-グルカン（の集団）；ゲル浸透クロマトグラフィーで分離し、示差屈折率検出器で検出したときに、10万以上（好ましくは5万以上）の分子量のβ-1,3-グルカンのピーク面積が全体の50％以下（好ましくは40％以下、30％以下、20％以下、10％以下、5％以下）であるβ-1,3-グルカン（の集団）；又は重量平均分子量が、10万以下（好ましくは5万以下、より好ましくは3万以下）であり、ゲル浸透クロマトグラフィーで分離し、示差屈折率検出器で検出したときに、10万以上（好ましくは5万以上）の分子量のβ-1,3-グルカンのピーク面積が全体の50％以下（好ましくは40％以下、30％以下、20％以下、10％以下、5％以下）であるβ-1,3-グルカン（の集団）を原料として用いた場合には、高い収率で、1分子の複合体に含まれる核酸の分子数が1、2及び3からなる群から選択されるいずれか（好ましくは1）であるβ-1,3-グルカン／核酸複合体が形成されるので、上記精製工程がなくても、本発明の複合体集団A又はBを得ることができる。
　低分子化したβ-1,3-グルカンは、通常、様々な長さのβ-1,3-グルカンの混合物であるが、β-1,3-グルカンと水素結合を介して結合するホモポリヌクレオチド（例、ポリ（dA））を含む核酸と複合体を形成する過程で、該ホモポリヌクレオチド（例、ポリ（dA））が、鎖の長さの点で最も適切なβ-1,3-グルカンと優先的に複合化する（ホモポリヌクレオチド（例、ポリ（dA））を鋳型とする複合体形成）。その結果、1分子の複合体に含まれるβ-1,3-グルカンと水素結合を介して結合するホモポリヌクレオチドを含む核酸の分子数に基づき精製されたβ-1,3-グルカン／核酸複合体の集団は、1分子の複合体に含まれる、β-1,3-グルカンの主鎖グルコース単位数の、ホモポリヌクレオチドを構成するヌクレオチド単位数に対する比（主鎖グルコース単位数／ヌクレオチド単位数）の平均として、およそ化学量論量（即ち、2）、例えば1.5～2.5（好ましくは、1.6～2.4、より好ましくは1.7～2.3、更に好ましくは1.8～2.2）を与え得る。
　一態様において、混合に供するβ-1,3-グルカン（の集団）には、主鎖グルコース数が混合に供するβ-1,3-グルカンと水素結合を介して結合するホモポリヌクレオチドを含む核酸に含まれるホモポリヌクレオチドの長さ（塩基数）の0.75～1.25倍（好ましくは、0.8～1.2倍、より好ましくは0.85～1.15倍、更に好ましくは0.9～1.1倍）であるβ-1,3-グルカン及び／又は主鎖グルコース数が該ホモポリヌクレオチドの長さ（塩基数）の1.5～2.5倍（好ましくは、1.6～2.4倍、より好ましくは1.7～2.3倍、更に好ましくは1.8～2.2倍）であるβ-1,3-グルカンが含まれる。このβ-1,3-グルカン（の集団）と、β-1,3-グルカンと水素結合を介して結合するホモポリヌクレオチドを含む核酸とを混合することにより、図2のq1のA及びBに示される態様の複合体が優先的に形成され、これを単離・精製することにより、1分子の複合体に含まれる、β-1,3-グルカンの主鎖グルコース単位数の、ホモポリヌクレオチドを構成するヌクレオチド単位数に対する比（主鎖グルコース単位数／ヌクレオチド単位数）の平均が1.5～2.5（好ましくは、1.6～2.4倍、より好ましくは1.7～2.3倍、更に好ましくは1.8～2.2倍）である、β-1,3-グルカン／核酸複合体の集団を得ることができる。
　一態様において、混合に供するβ-1,3-グルカンに含まれる主鎖グルコース単位総数の、混合に供するβ-1,3-グルカンと水素結合を介して結合するホモポリヌクレオチドを含む核酸に含まれる、ホモポリヌクレオチドを構成するヌクレオチド単位総数に対する比（主鎖グルコース単位総数／ヌクレオチド単位総数）を4以上とする。主鎖グルコース単位総数／ヌクレオチド単位総数を4以上とすることにより、反応産物中に含まれる未反応の核酸の残存量を減らすことができる。
　反応産物中に含まれる未反応のβ-1,3-グルカンの残存量を減らす観点から、混合に供するβ-1,3-グルカンに含まれる主鎖グルコース単位総数の、混合に供する核酸に含まれる、ホモポリヌクレオチドを構成するヌクレオチド単位総数に対する比（主鎖グルコース単位総数／ヌクレオチド単位総数）は、好ましくは16以下（より好ましくは8以下）である。即ち、主鎖グルコース単位総数／ヌクレオチド単位総数は、好ましくは4～16、より好ましくは4～8である。
　複合体の形成は、例えばCD（円偏光二色性）スペクトルによるコンフォメーション変化、サイズ排除クロマトグラフィーによるUV吸収シフト、ゲル電気泳動、マイクロチップ電気泳動、キャピラリー電気泳動を測定することにより確認することができるが、これに限らない。未反応のβ-1,3-グルカンやβ-1,3-グルカンと水素結合を介して結合するホモポリヌクレオチドを含む核酸を陰イオンクロマトグラフィー等を用いて除去してもよい。
　複合体の製造に関しては、特開2008-100919号公報；WO2015/04131；特許第5605793号; Sakurai et al., Biomacromolecules 2, 641-650 (2001)； Shimada et al., Bioconjugate chemistry 18, 1280-1286 (2007)； Koyama et al., Science translational medicine 2, 25ra24 (2010)； Minari et al., Bioconjugate chemistry 22, 9-15 (2011)等も参照のこと。
　好ましい一態様において、本発明の製造方法は、以下の工程を含み；
　β-1,3-グルカンと水素結合を介して結合するホモポリヌクレオチド（例、ポリ（dA））を含む核酸と、β-1,3-グルカン（例、シゾフィラン）とを混合することにより、β-1,3-グルカン、及びβ-1,3-グルカンと水素結合を介して結合するホモポリヌクレオチドを含む核酸を含み、2本のβ-1,3-グルカン（例、シゾフィラン）鎖と該核酸に含まれるβ-1,3-グルカンと水素結合を介して結合するホモポリヌクレオチド（例、ポリ（dA））を含む1本の核酸鎖からなる3重らせん構造を有するβ-1,3-グルカン／核酸複合体を調製する工程、及び
　得られたβ-1,3-グルカン／核酸複合体をゲル浸透クロマトグラフィーに付し、1分子の複合体に含まれるβ-1,3-グルカンと水素結合を介して結合するホモポリヌクレオチドを含む核酸の分子数が1～3（好ましくは1～2）であるβ-1,3-グルカン／核酸複合体分画（q1+q2+q3、好ましくはq1+q2）を単離する工程；
　混合に供するβ-1,3-グルカンが、重量平均分子量が、10万以下（好ましくは5万以下、より好ましくは3万以下）であるβ-1,3-グルカン（の集団）；ゲル浸透クロマトグラフィーで分離し、示差屈折率検出器で検出したときに、10万以上（好ましくは5万以上）の分子量のβ-1,3-グルカンのピーク面積が全体の50％以下（好ましくは40％以下、30％以下、20％以下、10％以下、5％以下）であるβ-1,3-グルカン（の集団）；又は、重量平均分子量が、10万以下（好ましくは5万以下、より好ましくは3万以下）であり、ゲル浸透クロマトグラフィーで分離し、示差屈折率検出器で検出したときに、10万以上（好ましくは5万以上）の分子量のβ-1,3-グルカンのピーク面積が全体の50％以下（好ましくは40％以下、30％以下、20％以下、10％以下、5％以下）であるβ-1,3-グルカン（の集団）であり；
　混合に供するβ-1,3-グルカン（の集団）には、主鎖グルコース数がホモポリヌクレオチドの長さ（塩基数）の0.75～1.25倍（好ましくは、0.8～1.2倍、より好ましくは0.85～1.15倍、更に好ましくは0.9～1.1倍）であるβ-1,3-グルカン及び／又は主鎖グルコース数がホモポリヌクレオチドの長さ（塩基数）の1.5～2.5倍（好ましくは、1.6～2.4倍、より好ましくは1.7～2.3倍、更に好ましくは1.8～2.2倍）であるβ-1,3-グルカンが含まれていてもよく；且つ
　混合に供するβ-1,3-グルカンに含まれる主鎖グルコース単位総数の、混合に供するβ-1,3-グルカンと水素結合を介して結合するホモポリヌクレオチドを含む核酸に含まれる、ホモポリヌクレオチドを構成するヌクレオチド単位総数に対する比（主鎖グルコース単位総数／ヌクレオチド単位総数）が4～16（好ましくは4～8）であってもよい。
　好ましい一態様において、本発明の製造方法は、以下の工程を含み；
　β-1,3-グルカンと水素結合を介して結合するホモポリヌクレオチド（例、ポリ（dA））を含む核酸と、β-1,3-グルカン（例、シゾフィラン）とを混合することにより、β-1,3-グルカン、及びβ-1,3-グルカンと水素結合を介して結合するホモポリヌクレオチドを含む核酸を含み、2本のβ-1,3-グルカン（例、シゾフィラン）鎖と該核酸に含まれるβ-1,3-グルカンと水素結合を介して結合するホモポリヌクレオチド（例、ポリ（dA））を含む1本の核酸鎖からなる3重らせん構造を有するβ-1,3-グルカン／核酸複合体を調製する工程、及び
　得られたβ-1,3-グルカン／核酸複合体をゲル浸透クロマトグラフィーに付し、1分子の複合体に含まれるβ-1,3-グルカンと水素結合を介して結合するホモポリヌクレオチドを含む核酸の分子数が1、2及び3（好ましくは、1）からなる群から選択されるいずれかであるβ-1,3-グルカン／核酸複合体を単離する工程；
　混合に供するβ-1,3-グルカンが、重量平均分子量が、10万以下（好ましくは5万以下、より好ましくは3万以下）であるβ-1,3-グルカン（の集団）；ゲル浸透クロマトグラフィーで分離し、示差屈折率検出器で検出したときに、10万以上（好ましくは5万以上）の分子量のβ-1,3-グルカンのピーク面積が全体の50％以下（好ましくは40％以下、30％以下、20％以下、10％以下、5％以下）であるβ-1,3-グルカン（の集団）；又は、重量平均分子量が、10万以下（好ましくは5万以下、より好ましくは3万以下）であり、ゲル浸透クロマトグラフィーで分離し、示差屈折率検出器で検出したときに、10万以上（好ましくは5万以上）の分子量のβ-1,3-グルカンのピーク面積が全体の50％以下（好ましくは40％以下、30％以下、20％以下、10％以下、5％以下）であるβ-1,3-グルカン（の集団）であり；
　混合に供するβ-1,3-グルカン（の集団）には、主鎖グルコース数がホモポリヌクレオチドの長さ（塩基数）の0.75～1.25倍（好ましくは、0.8～1.2倍、より好ましくは0.85～1.15倍、更に好ましくは0.9～1.1倍）であるβ-1,3-グルカン及び／又は主鎖グルコース数がホモポリヌクレオチドの長さ（塩基数）の1.5～2.5倍（好ましくは、1.6～2.4倍、より好ましくは1.7～2.3倍、更に好ましくは1.8～2.2倍）であるβ-1,3-グルカンが含まれていてもよく；且つ
　混合に供するβ-1,3-グルカンに含まれる主鎖グルコース単位総数の、混合に供するβ-1,3-グルカンと水素結合を介して結合するホモポリヌクレオチドを含む核酸に含まれる、ホモポリヌクレオチドを構成するヌクレオチド単位総数に対する比（主鎖グルコース単位総数／ヌクレオチド単位総数）が4～16（好ましくは4～8）であってもよい。
　好ましい一態様において、本発明の製造方法は、以下の工程を含み：
　ポリデオキシアデニル酸を含む核酸と、β-1,3-グルカン（例、シゾフィラン）とを混合することにより、β-1,3-グルカン、ポリデオキシアデニル酸を含む核酸を含み、2本のβ-1,3-グルカン（例、シゾフィラン）鎖とポリデオキシアデニル酸を含む1本の核酸鎖からなる3重らせん構造を有するβ-1,3-グルカン／核酸複合体を調製する工程、及び
　得られたβ-1,3-グルカン／核酸複合体をゲル浸透クロマトグラフィーに付し、1分子の複合体に含まれるポリデオキシアデニル酸を含む核酸の分子数が1であるβ-1,3-グルカン／核酸複合体を単離する工程、
　混合に供するβ-1,3-グルカンの重量平均分子量が、10万以下（好ましくは5万以下、より好ましくは3万以下）であり、ゲル浸透クロマトグラフィーで分離し、示差屈折率検出器で検出したときに、10万以上（好ましくは5万以上）の分子量のβ-1,3-グルカンのピーク面積が全体の50％以下（好ましくは40％以下、30％以下、20％以下、10％以下、5％以下）であり；
　混合に供するβ-1,3-グルカン（の集団）には、主鎖グルコース数がポリデオキシアデニル酸の長さ（塩基数）の0.75～1.25倍（好ましくは、0.8～1.2倍、より好ましくは0.85～1.15倍、更に好ましくは0.9～1.1倍）であるβ-1,3-グルカン及び／又は主鎖グルコース数がポリデオキシアデニル酸の長さ（塩基数）の1.5～2.5倍（好ましくは、1.6～2.4倍、より好ましくは1.7～2.3倍、更に好ましくは1.8～2.2倍）であるβ-1,3-グルカンが含まれており；且つ
　混合に供するβ-1,3-グルカンに含まれる主鎖グルコース単位総数の、混合に供する核酸に含まれる、ポリデオキシアデニル酸を構成するヌクレオチド単位総数に対する比（主鎖グルコース単位総数／ヌクレオチド単位総数）が4～16、より好ましくは4～8である。
　本章における各用語の定義は、特に断りのない限り、上記「（1）均質なβ-1,3-グルカン／核酸複合体の集団」に記載した通りである。
（3）核酸導入用途
　本発明のβ-1,3-グルカン／核酸複合体の集団A及びBは、優れた核酸送達能力を有し、細胞内へ核酸を導入するためのキャリアーとして有用である。即ち、本発明は、上記本発明のβ-1,3-グルカン／核酸複合体の集団A又はBを含む、核酸を細胞内へ導入するための組成物を提供する。本発明のβ-1,3-グルカン／核酸複合体の集団を、in vivo又はin vitroにおいて細胞へ接触することにより、該細胞へ核酸が導入される。本発明の複合体集団A又はBの細胞内への導入量や方法は、従来の核酸導入の場合と同様である。なお、本発明の複合体集団A及びBは、単独でも優れた細胞内移行能を示すので、核酸の細胞内への導入に使用されている従来の遺伝子導入試薬を用いずに、或いは従来の遺伝子導入試薬の使用量を低減して、核酸を細胞内に導入することも可能である。本発明のβ-1,3-グルカン／核酸複合体の集団A又はBの有効量を、対象動物（例、ヒト等の哺乳動物）へ投与することにより、該対象動物内の細胞へ核酸を導入することができる。本発明は、本発明のβ-1,3-グルカン／核酸複合体の集団の、in vitroにおいて核酸を細胞内へ導入するための使用をも提供する。細胞内へ導入する核酸は、β-1,3-グルカン／核酸複合体に含まれるβ-1,3-グルカンと水素結合を介して結合するホモポリヌクレオチドを含む核酸である。
　細胞は、好ましくは、β-1,3-グルカンの受容体であるDectin-1を細胞表面に発現している細胞（Dectin-1陽性細胞）である。β-1,3-グルカン／核酸複合体に含まれるβ-1,3-グルカンが細胞表面上のDectin-1に結合することにより、β-1,3-グルカン／核酸複合体が細胞内へ取り込まれ、該複合体に含まれる核酸が細胞内へ導入される。Dectin-1陽性細胞としては、マクロファージ、樹状細胞、好中球等を挙げることができるが、これに限定されない。細胞は、好ましくは、ヒト等の哺乳動物のDectin-1陽性細胞である。
　本発明のβ-1,3-グルカン／核酸複合体の集団A又はBに含まれる核酸として、β-1,3-グルカンと水素結合を介して結合するホモポリヌクレオチド及び付加核酸を含み、該付加核酸が該ホモポリヌクレオチドの末端に連結されており、該付加核酸が標的遺伝子に対する発現抑制活性を有する核酸を用いることにより、細胞における該標的遺伝子の発現を抑制することが出来る。本発明は、上記本発明のβ-1,3-グルカン／核酸複合体の集団A又はBであって、複合体に含まれる核酸がβ-1,3-グルカンと水素結合を介して結合するホモポリヌクレオチド及び付加核酸を含み、該付加核酸が該ホモポリヌクレオチドの末端に連結されており、該付加核酸が標的遺伝子に対する発現抑制活性を有する集団を含有する、細胞における該標的遺伝子の発現を抑制するための組成物を提供する。本発明のβ-1,3-グルカン／核酸複合体の集団A又はBであって、複合体に含まれる核酸がβ-1,3-グルカンと水素結合を介して結合するホモポリヌクレオチド及び付加核酸を含み、該付加核酸が該ホモポリヌクレオチドの末端に連結されており、該付加核酸が標的遺伝子に対する発現抑制活性を有する集団を、in vivo又はin vitroにおいて細胞へ接触することにより、該細胞における該標的遺伝子の発現を抑制することができる。本発明のβ-1,3-グルカン／核酸複合体の集団A又はBであって、複合体に含まれる核酸がβ-1,3-グルカンと水素結合を介して結合するホモポリヌクレオチド及び付加核酸を含み、該付加核酸が該ホモポリヌクレオチドの末端に連結されており、該付加核酸が標的遺伝子に対する発現抑制活性を有する集団の有効量を、対象動物（例、ヒト等の哺乳動物）へ投与することにより、該対象動物内の細胞における該標的遺伝子の発現を抑制することができる。本発明は、本発明のβ-1,3-グルカン／核酸複合体の集団A又はBであって、複合体に含まれる核酸がβ-1,3-グルカンと水素結合を介して結合するホモポリヌクレオチド及び付加核酸を含み、該付加核酸が該ホモポリヌクレオチドの末端に連結されており、該付加核酸が標的遺伝子に対する発現抑制活性を有する集団の、in vitroにおいて細胞における標的遺伝子の発現を抑制するための使用をも提供する。細胞は、好ましくは、β-1,3-グルカンの受容体であるDectin-1を細胞表面に発現している細胞（Dectin-1陽性細胞）である。
　標的遺伝子としては、特に制限されるものではないが、医薬用途への使用という観点からは、病態に関与しており、その発現抑制が望まれている遺伝子が好適である。当該標的遺伝子の具体例としては、(a)外部からの刺激などを通じてその転写産物を過剰に産生することによって病態の発症または症状の悪化に関与する因子をコードする遺伝子、(b)標的遺伝子が変異した部位を有し、その転写産物が直接疾患の発症に関与する因子をコードする遺伝子が挙げられる。標的遺伝子は、好ましくはDectin-1陽性細胞が発現する遺伝子である。上記標的遺伝子としては、TNFα、インターロイキン、MIF等のサイトカイン等の炎症を誘導する因子をコードする遺伝子が挙げられる。また、(a)の標的遺伝子が、細胞内活性のオン・オフを左右する因子をコードする遺伝子である場合が包含される。このような遺伝子としては、プロテインキナーゼ（例えば、Raf、MEK、Jak2、KRAS等）、転写因子（例えばStat5、YB-1等）等が挙げられる。さらに、(a)の標的遺伝子としては、標的遺伝子が、細胞表面受容体をコードするものであり、且つ該細胞表面受容体により病体が発症または悪化に作用する因子をコードするものである場合も包含される。このような遺伝子としては、TNFR（腫瘍壊死因子受容体）、PDGFR（血小板由来成長因子受容体）、インターロイキン受容体等をコードする遺伝子が挙げられる。
　本発明の医薬組成物は、本発明のβ-1,3-グルカン／核酸複合体の集団A又はBに加えて、薬理学的に許容され得る担体を含み得る。このような医薬組成物は、経口又は非経口投与に適する剤形として提供される。
　非経口投与のための組成物としては、例えば、注射剤、坐剤等が用いられ、注射剤は静脈注射剤、皮下注射剤、皮内注射剤、筋肉注射剤、点滴注射剤等の剤形を包含しても良い。このような注射剤は、公知の方法に従って調製できる。注射剤の調製方法としては、例えば、本発明の複合体集団を通常注射剤に用いられる無菌の水性溶媒に溶解又は懸濁することによって調製できる。注射用の水性溶媒としては、例えば、蒸留水；生理的食塩水；リン酸緩衝液、炭酸緩衝液、トリス緩衝液、酢酸緩衝液等の緩衝液等が使用できる。このような水性溶媒のpHは5～10が挙げられ、好ましくは6～8である。調製された注射液は、適当なアンプルに充填されることが好ましい。
　また、本発明の複合体集団A又はBを含む溶液又は懸濁液を、真空乾燥、凍結乾燥等の処理に付すことにより、本発明の複合体集団を含む粉末製剤を調製することもできる。本発明の複合体集団A又はBを粉末状態で保存し、使用時に該粉末を注射用の水性溶媒で溶解又は分散することにより、使用に供することができる。
　医薬組成物中の本発明の複合体集団A又はBの含有量は、例えば、医薬組成物全体の約0.1～100重量%、好ましくは約1～99重量%、さらに好ましくは約10～90重量%程度である。
　本章における各用語の定義は、特に断りのない限り、上記「（1）均質なβ-1,3-グルカン／核酸複合体の集団」及び「（2）均質なβ-1,3-グルカン／核酸複合体の集団の製造」に記載した通りである。
　刊行物、特許文献等を含む、本明細書に引用されたすべての参考文献は、引用により、それらが個々に具体的に参考として援用されかつその内容全体が具体的に記載されているのと同程度まで、本明細書に援用される。
　以下に、実施例により本発明を更に具体的に説明するが、本発明はそれに限定されるものではない。
［試験例1］　β-1,3-グルカンの低分子化
　光散乱で測定した重量平均分子量150万の3重ラセンのシゾフィラン（SPG）を10mg/mLになるよう0.01N NaOH水溶液 8mL（三重螺旋を保つ）に溶解しリン酸バッファーで中性に調整したのち、S-4000-astrasonを用い超音波処理を2時間行った（周波数20kHz、出力600W）。その後、凍結乾燥を行い低分子SPGの固体を得た。この試料をSPG-S1aとした。また、重量平均分子量80万のSPGを同様の条件で処理し、得られた低分子SPGをSPG-S3aとした。
　重量平均分子量150万のSPG 5mgに対し2.5N NaOH 水溶液1mLを加え60℃で加熱し攪拌した。その後、塩酸で溶液を中和し、凍結乾燥を行い低分子SPGの固体を得た。この試料をSPG-S2aとした。さらに重量平均分子量80万のSPGを同様の条件で処理し、得られた低分子SPGをSPG-S4aとした。また、フジフィルム和光製のカードラン（4987481235458）（CUR）に対して同様のアルカリ処理をし、得られた低分子CURをCUR-S1aとした。
　SPG-S1～4aとCUR-S1aを、1mg/mLとなるように0.25N NaOH水溶液に加え、室温で1時間撹拌を行った。その後、得られた溶液を100kDaの限外ろ過膜に付すことにより、高分子量成分を除去した。得られた溶液はアルカリ性であるため、溶液を透析によって中性へと戻した。そして、最後に凍結乾燥を行い、白い固体を得た。これらを、SPG-S1～4とCUR-S1とした。図3のAにSPG-S3についてのGPC測定の例を示す。“Before”がSPG-S3aであり、“after”がSPG-S3である。高分子量側のショルダーが除去されていることが分かる。
　なお、本明細書の試験例におけるGPCの測定はProminence 501システムとDawn-Heleos-A（Wyatt）を結合した装置を用いて行った。1.0～3.3mg/mLの試料を含有する溶液100Lを、Shodex脱気ユニット(ERC-3125S)を備えたShodex HPLCポンプ(DU-H2130)からなるシステムに注入した。クロマトグラムは、RI-501干渉差屈折率（RI）検出器（Shodex社製）と紫外吸光度検出器（SPD-20A；島津製作所製）を用いて得た。これらの検出器はタンデムに接続した。多糖の測定では、上流から順にSB-806MHQおよびLB-803をタンデムに接続したカラムを使用した。移動相は、0.5M KCl（pH 7.4）とエチレンジアミン四酢酸（EDTA）を含む50mMリン酸緩衝液であり、流速は0.6mL/minであった。複合体の測定は、GF7MとGF510をタンデムに接続したカラムを用い、移動相として0.5M KClとEDTAを含む50mMリン酸緩衝液を用いた。ここで、EDTAは、GPCカラムによるホスホロチオエートDNAの好ましくない吸着を避けるために添加した。
［試験例2］　複合体の作成と分画、分子量測定
　凍結乾燥によって得たSPGを、100μMとなるように0.25N NaOHに加え、室温で1時間撹拌を行い、SPG溶液を得た。その後、リン酸バッファー、100μM核酸溶液(オリゴ核酸分子全体を1分子として計算)、SPG溶液の順に溶液を混ぜあわせた後、4℃で一晩静置させた。なお、3液を混合後のpHは6-7であった。図3Bに、高分子量成分を除去する前と後の比較をSPG-S3aとSPG-S3について示した。ここで核酸としては分子内に含まれるホスホジエステル結合の全てがホスホロチオエート結合に置換されたdA60を用いた。本明細書の試験例において使用した全てのポリデオキシアデニル酸（dAx）においては、分子内に含まれるホスホジエステル結合の全てがホスホロチオエート結合に置換されている。本明細書の試験例においては、分子内に含まれるホスホジエステル結合の全てがホスホロチオエート結合に置換されたdAxを、単に「dAx」と略記する場合がある。除去前（before）では複合体でも高分子量成分が観測されるが、除去後のSPG-S3を使った試料では3つのピークが明確に観測され、20分あたりの画分の高分子量成分は完全に除去されていた。
　次に、HPLCのフラクションコレクターを用いて、作成した複合体の各ピークを単離した。例えば、SPG-S3とdA60から作成した複合体ならば、24.3-24.6 min、23.2-23.7 min、及び21.8-22.3 minで溶離液を取り出した。低分子量側からq1,q2,q3と名前をつけた。この操作を繰り返して、十分な量の液を回収したのちに、凍結乾燥を行い、白い固体を得た。図3CにはSPG-S3とdA60から作成した複合体から得た3つのピークの試料のおのおののGPCクロマトグラムを示す。ピークは単峰性であり、単離が成功したことが分かる。次にこのピークの頂点での分子量を光散乱から測定した。その結果を表1に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000001
　q2とq3の分子量をq1で割った値を3段目に示す。この値が1：2：3の比になっている。また、得られた分子量から、q1にはdA60が1分子、q2には2分子、q3には3分子含まれていると考えられた。これに基づき、主鎖グルコースのモル数と塩基のモル数の比を計算した。結果を4段目に示す。これ以後、分子量が小さい、且つ、化学量論比でdAと主鎖グルコースの比がおよそ1：2となっているこれらの複合体を「低分子複合体」と記載する。また、核酸を一分子含む低分子複合体をq1、2分子含むものをq2などと記載する。
　これらの結果より、以下のことが示唆される。dA60とSPGを複合化させたとき、dAは様々な長さが存在するSPG鎖の中から、自身の長さに合ったSPG鎖と複合体を形成する。DNAが鋳型として働いていると考えられるため、このモデルは、DNA鋳型モデルと呼ぶことができる（図4）。dAが2本の時は、単一のdAの時の2倍の長さのSPG鎖と複合化する。このため、q1とq2の分子量比が2となり、q1とq2中に含まれるDNAとグルコースの比が等しくなったと考えられる。
［試験例3］　多様な長さのホスホロチオエートdAオリゴマーとSPGとの複合体形成
　試験例2と同様に、dA30、dA40及びdA60のそれぞれとSPG-S3とから複合体を形成し、得られた複合体をゲル浸透クロマトグラフィーにより分離し、形成された低分子複合体（q1、q2、q3）の各ピークを単離し、分子量等の物性を光散乱測定器等により測定した。結果を表2に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000002
　表2は分画した低分子複合体の分子量及び回転半径等の物性を示す。(a) q1-dA60-SPGのMwをq1-dA30-SPGで除した。(b) Eq8から計算した主鎖グルコースの数を示す。カッコ内の数値は、dAの数との差を示す。(c) SLSで計測するには小さすぎたので、SAXSは実施しなかった。
　驚くべきことに、Mw（重量平均分子量）/Mn（数平均分子量）で表される分散指数が、オリジナルのSPGと比較して極めて小さく、およそ1.01 ± 0.01であった。Mw/Mnは、光散乱測定器に付属している解析プログラムで計測した。同じdAxから作成された複合体のMwの比、例えばq2-dA30-SPG又はq3-dA30-SPGのMwを、q1-dA30-SPGのMwで除して得た比は、いつも、それぞれ2又は3であった。計算結果を表にqx/q1として示す。q1-dA60-SPGに対するq1-dA30-SPGの比を取った場合でさえ、2.0であった。これらの結果から、複合体を形成する際に、dAxが、鎖の長さの点で最も適切なSPGを優先的に集めることが示唆された。1つのdAx分子が含まれる場合、dAxは適切な短いsSPGのみを集めてq1の複合体を形成する（図4）。2つのdAx分子が含まれる場合、それらはq1の2倍の長さのsSPGを集める。3つのdAx分子が含まれる場合、sSPGは3倍の長さとなる。観察されたqx/q1の関係から、そのような優先的な選択が複合化の過程で起こることが示唆された。これを「dA-鋳型量子化複合化」ということができる。複合体は2本のSPG鎖と1本のDNA鎖から形成された三重らせん構造を呈することが知られているので、測定したMW.dAx-SPGの分子量と以下の式から、主鎖グルコースの数（NmG）を計算することができる。
Figure JPOXMLDOC01-appb-M000003
　ここで、MSPGは、以下の化学式で表される、SPGの繰り返し単位の分子量、即ち666.58である。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000004
　また、NはdAx鎖の数であり、MW.dAxは、dAxの分子量である。得られたNmG値を表の最後の列に示す。また1本のsSPG鎖の分子量、即ち、(MW.dAxSPG-NMW.dAx)/2も併せて示す。驚くべきことに、NmG値は、dA単位の数とほとんど一致した。以前の報告（Biomacromolecules 2001, 2 (3), 641-650）において、化学量論比が[mG]/[dA]=2.0であることが決定されているが、この値はコンピューター化学によって支持された。本発明に係る小さな複合体はこの化学量論を満たす。
［試験例4］　dA60とSPG-S-3の混合比の検討
　試験例3において、混合するdA60と分画したS-3の分子数比([mG]/[dA])mixを1.5から16まで変化させたときの、RI及びUVクロマトグラムを測定した。dA60の量が同一で固定されるように、試料を注入した。
　結果を図5に示す。([mG]/[dA])mixが1.5及び2.0の場合、複合化されていないdA60が、25.7分の溶出時間（t）に認められた。([mG]/[dA])mixが4を超えると、複合化されていないdA60は観察されなかった。SPGを更に増加させると、RIにおいてのみ、q1、q2及びq3のピークが同時に増加した。UVでは、([mG]/[dA])mixが8の場合と16の場合との間で大きな差異はなかった。これは、UVがdA60のみを検出したのに対して、RIがdA60とSPGの両方を検出したからである。8及び16のように([mG]/[dA])mixを増加させるに伴ってRIが増加したのは、複合化されていないSPGが増加したためである。
　図5にはいくつかの興味深い現象が存在する。第一に、UVにおいて、24.9分の溶出時間にて等吸収点が認められる（図5B）。これは、反応物と生成物の1対1相互変換の証拠を提供する。第二に、q1、q2、及びq3のピークの位置が全く変わらない。これは、SPGを増加させてもこれらの複合体の分子量は変化しないことを示唆する。これは、幅の広い単峰性のピークが認められ、([mG]／[dA])mixを増加させると、そのピークの先端の位置がより大きな分子側へ向かってシフトするより大きなSPGとの複合体とは際立った対照をなす。第三に、([mG]／[dA])mixが4のような、SPG豊富な組成物においてさえ、未反応のdA60が存在した。これは、sSPGの鎖の長さがdAxと一致しない場合は、dA60はsSPGと複合体を形成しないことを意味する。この結果は、dAxは適切な長さのsSPGのみを精密に選択して結合し、それが尽きるとdAxは複合体を形成しないことを示唆するものであるから、極めて驚くべきことである。図5Cは、予想通り、各分画について([mG]／[dA])fが2.0で維持されることを示している。多量の未反応SPGにより誤った結果が導かれてしまうので、([mG]／[dA])mixが16の場合を除いている。
［試験例5］　dA60との複合体形成は多糖の種類に依存する
　SPG-S1～4とCUR-S1に加えて、セルロールとプルラン（富士フイルム和光から購入）に関して同様の操作を行い、図3に示したような現象が観測されるか調べた。また、DNAが複合化によって形態が変わり、これが円偏向2色性スペクトル（CD）に鋭敏に反映されることから、CD測定により複合体形成の有無を調べた。結果を表3に示す。この結果から、本現象はβ-1,3-グルカンに特有のものであることが示唆された。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000005
［試験例6］　dAxとSPGとの低分子複合体の効率的な製造
　3重ラセンで分子量が80万のSPG 30mgを0.25N NaOH 30mLに溶解し（1 mg/mL）、スクリュー管瓶中で1時間攪拌することにより、SPGを1本鎖の状態にした。得られた1本鎖SPGを含む溶液をQsonica社 Q700 超音波ホモジナイザーを用いて超音波処理し、SPGを低分子化した。1サイクルの超音波処理条件を以下に示す。
超音波処理条件
　Amplitude 30（Amplitude100を装置の最大値とした超音波出力）
　Pulse on time 1 min（超音波照射時間）
　Pulse off time 3 min（超音波照射停止時間）
　Process time 30 min（合計超音波照射時間）
　合計2時間超音波が照射されるよう、上記の条件を4サイクル行った。SPGの低分子化は、1本鎖の状態での分子量が5万から3万以下となるまで行った。反応を早めるために、加熱処理をしてもよい。
　超音波処理後の試料を0.45 μm Filterに通した。試料をAmicon Ultra-0.5 Ultracel 50限外ろ過膜（50 kDa）を用いて、限外ろ過に付した。下澄み液を1kDaの透析膜で一日透析し、凍結乾燥器にて二日間凍結乾燥を行い、固体を得た。得られた固体を再度0.25N NaOH水溶液に溶かし、1時間撹拌を行い、GPC-MALSにて測定を行った。SPGのGPC-MALS測定には以下のシステムを使用した。
クロマトシステム
送液ユニット : LC-20AD (SHIMADZU)
オートサンプラー : SIL-20A HT (SHIMADZU)
紫外吸光度検出器 : SPD-20A (SHIMADZU)
カラムオーブン : CTO-20A (SHIMADZU)
光散乱検出器 (Multi Angle Light Scattering Detector) : Wyatt DAWN HELEOS-II (18角度式) (Wyatt)
示差屈折率検出器 (Refractive Index Detector): Shodex RI-501 interferometric differential refractive-index
　測定条件は以下の通りである。
流速 : 0.6 mL/min
温度 : 40 ℃
カラム : （SPG測定時）SB-806M-HQ+SB-802.5M-HQ (Shodex)
溶離液 : PBS + 10 mM EDTA
インジェクション量：100μL(サンプル濃度 1mg/mL)
　測定結果を図6Aに示す。大部分のSPGの分子量が5～3万以下であった。
　低分子化したSPGとdA40sを([mG]/[dA])mixが8.0となるように混合し、試験例2の方法に準じて複合体を調製し、1晩、4℃で静置させた。得られた複合体を、GPC-MALSにて測定した。測定条件は以下の通りである。
流速 : 0.6 mL/min
温度 : 40 ℃
カラム : GF-7M HQ+GF-510 (Shodex)
UV波長 : 260 nm
溶離液 : PBS + 10 mM EDTA
インジェクション量：核酸量7μg相当の試料をインジェクションした。
　結果を図6Bに示す。1分子の複合体に1分子の核酸が含まれるq1複合体が、面積比で80％以上の収率で得られた。
［試験例7］　アンチセンス核酸を連結したポリdAの低分子SPGとの複合体形成
　dA40の5’端にYB-1タンパクの発現を抑制するアンチセンス配列を付加した以下の配列を有する核酸を用いた。以後、YB-1ASと記載する。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000006
　試験例2の方法に準じ、SPG-S3とYB-1ASから低分子複合体を得た。q1、q2及びq3が混在する分画前の状態のクロマトグラムと、各ピークを単離して得た、q1、q2,q3のクロマトグラムを図7に示す。この結果から、ポリデオキシアデニン（dAx）の末端に付加配列が存在する場合であっても、ポリデオキシアデニンのみの場合と同様に、様々な長さが存在するSPG鎖の中から、dAxの長さに合ったSPG鎖と複合体を形成することが示唆された。
［試験例8］　アンチセンス核酸を連結したポリdAと低分子SPGの複合体の生理活性
　ヒト由来肺がん細胞であるPC9細胞を96ウェルプレートに各ウェル1000cellsになるように播種し、一晩37℃、5%CO2でインキュベートを行った。その後、各複合体サンプルを核酸濃度が0.4μM、1.0μMとなるように各ウェルに添加し、72h、37℃、5%CO2でインキュベートを行った。インキュベート後、各ウェルの細胞生存率を測定した。なお、PC9細胞は多糖核酸複合体の受容体（Dectin-1）が存在し、これによって核酸を選択的に取り込むことが明らかになっている（Cancer Gene Therapy volume 26, pages32-40(2019)）。
　結果を図8に示す。驚くべきことに、多分散複合体や低分子複合体の混合物と比較して、単離された低分子複合体（q1、q2、q3）を用いた場合に、細胞生存率がより大きく低下した。細胞生存率抑制効果は、q1が最も高かった。複合体の受容体（Dectin-1）を発現しないA549細胞では、細胞生存率の低下は認められなかった。
［試験例9］　siRNA(miR-145)への適用
　dA40の5’端にヒトc-Mycを標的にしたsiRNA（2本鎖）を付加した以下の配列を有する核酸を用いた。以後、この核酸をmiR-145と呼ぶ。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000007
　センス鎖とアンチセンス鎖をハイブリダイゼーションし、試験例2の方法に準じ、SPG-S3とmiR-145から低分子複合体を調製し、試験例4に準じて、q1、q2、q3を単離した。次に、PC9細胞を96ウェルプレートに各ウェル1000cellsになるように播種し、一晩37℃、5%CO2でインキュベートを行った。その後、各複合体サンプルを核酸濃度が、200nM,500nMとなるように各ウェルに添加し、72h、37℃、5%CO2でインキュベートを行った。インキュベート後、各ウェルの細胞生存率を測定した。試験例7と同様に、A549細胞での比較をした。
　結果を図9に示す。ポリdAの5’末端に二本鎖siRNAを連結した場合も、多分散複合体や低分子複合体の混合物と比較して、単離された低分子複合体（q1、q2、q3）を用いた場合に、細胞生存率がより大きく低下した。複合体の受容体（Dectin-1）を発現しないA549細胞では、細胞生存率の低下は認められなかった。
［試験例10］　ミスマッチ含有マイクロRNA(miR-143)への適用
　dA40の5’端にヒトKRASを標的にしたマイクロRNA（2本鎖）を付加した以下の配列を有する核酸を合成した。以後、この核酸をmiR-143と呼ぶ。この核酸はRNA二重鎖領域に複数のミスマッチを有する。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000008
　センス鎖とアンチセンス鎖をハイブリダイゼーションし、試験例2の方法に準じ、SPG-S3とmiR-143から低分子複合体を調製し、試験例4に準じて、q1、q2、q3を単離した。試験例9に準じ、各複合体の細胞生存率低下効果を比較した。
　結果を図10に示す。ポリdAの5’末端にミスマッチを含む二本鎖miRNAを連結した場合も、多分散複合体や低分子複合体の混合物と比較して、単離された低分子複合体（q1、q2、q3）を用いた場合に、細胞生存率がより大きく低下した。複合体の受容体（Dectin-1）を発現しないA549細胞では、細胞生存率の低下は認められなかった。
［試験例11］　他の細胞を用いた評価
　PC-9細胞にかえて、ヒトのミクログリオーマ由来の細胞であるCCF-STTG1細胞を用いて、試験例9及び10に準じてmiR-143及びmiR-145の細胞生存率に対する効果を評価した。
　結果を図11に示す。CCF-STTG1細胞を用いた場合であっても、多分散複合体や低分子複合体の混合物と比較して、単離された低分子複合体（q1、q2、q3）を用いた場合に、細胞生存率がより大きく低下した。
［試験例12］　標的タンパク質発現低下の確認
　6ウェルプレートにPC-9、A549細胞を1.0×105cells/mlとなるように播種し24h、37℃、5%CO2でインキュベートを行った。その後、複合体サンプルを添加しYB-1 ASは36h後、miR-145及びmiR-143は72h後に細胞を回収した。回収した細胞を10 mM Tris-HCl（pH 7.9）、150 mM NaCl、0.5% NP40、1 mM PMSFを含む溶解バッファーに懸濁し、10秒間超音波処理を行った。細胞溶解液(タンパク量：YB-1:10μg、c-Myc:50μg,K-RAS:30μg)を10%又は15%SDS-PAGEゲルで分離し、PVDF膜にタンパクを転写した。その後、抗体を用いて転写したタンパクを化学的に発光させた。結果を図12に示す。各標的タンパクの発現が低下したことが分かる。
［試験例13］アンチセンス核酸を連結したポリdAと低分子SPGの複合体の生理活性
　dA40の5’端にK-rasタンパクの発現を抑制するアンチセンス配列を付加した以下の配列を有する核酸を用いた。以後、K-ras-ASと記載する。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000009
　試験例2の方法に準じ、一本鎖SPGとK-ras-ASから低分子複合体を調製し、HPLCのフラクションコネクターを用いてq1を単離した（q1-K-ras-AS）。コントロールとして、低分子化していないSPGとK-ras-ASから調製した多分散複合体を用いた（L-SPG/K-ras-AS）。
　PC9細胞を96ウェルプレートに各ウェル1000cellsになるように播種し、一晩37℃、5%CO2でインキュベートを行った。その後、各複合体サンプルを核酸濃度が、0.4μM、1.0μMとなるように各ウェルに添加し、37℃、5%CO2で72時間インキュベートを行った。インキュベート後、WST-8-assayにより各ウェルの細胞生存率を測定した。結果を図13に示す。多分散複合体と比較して、単離された低分子複合体（q1-K-ras-AS）を用いた場合に、細胞生存率がより大きく低下した。
［試験例14］アンチセンス核酸を連結したポリdAと低分子SPGの複合体の生理活性
　6ウェルプレートにPC-9細胞を1.0×105個/mlとなるように播種し、24時間、37℃、5%CO2でインキュベートを行った。その後、試験例13で調製した複合体サンプル（L-SPG/K-ras-AS、q1-K-ras-AS）を添加し、72時間後に細胞を回収した。回収した細胞を10mM Tris-HCl（pH 7.9）、150mM NaCl、0.5% NP40及び1mM PMSFを含む溶解バッファーに懸濁し、10秒間超音波処理を行った。細胞溶解液(タンパク量:30μg)を15%SDS-PAGEゲルで分離し、PVDF膜にタンパクを転写した。その後、K-rasに対する抗体を用いたウェスタンブロットにより、K-rasタンパク質を検出した。結果を図14に示す。多分散複合体と比較して、単離された低分子複合体（q1-K-ras-AS）を用いた場合に、K-rasタンパク質の発現量がより大きく低下した。
［試験例15］CPG DNAを連結したポリdAと低分子SPGの複合体の生理活性
　dA40の5’端にCpG配列を付加した以下の配列を有する核酸を用いた。以後、K3と記載する。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000010
　試験例2の方法に準じ、一本鎖SPGとK3から低分子複合体を調製し、HPLCのフラクションコネクターを用いてq1、q2、q3を単離した（q1-K3、q2-K3、q3-K3）。コントロールとして、低分子化していないSPGとK3から調製した多分散複合体（L-SPG/K3）及びSPGと複合体を形成していないK3（naked K3）を用いた。
　6週齢雄のC57BL/6JJmsSlcマウスから脾臓細胞を回収し、96ウェルプレートに1.0×106個となるように播種した。さらに各複合体を核酸濃度で20 nMとなるように添加し、24hインキュベートした。そのあと、培地を回収しIL-6濃度をELISAで測定した。結果を図15に示す。アンチセンス核酸やmiRNAとは異なり、CpG DNAの場合、q1複合体（q1-K3）は多分散複合体（L-SPG/K3）と比べて誘導するIL-6産生量はむしろ低く、裸のCpG DNAと変わらない値を示した。
　本発明により、化学的に均質なβ-1,3-グルカン／核酸複合体の集団が提供される。本発明のβ-1,3-グルカン／核酸複合体の集団は、1つの複合体中に含まれる核酸分子の数、主鎖グルコースのモル数で表したときのβ-1,3-グルカンの大きさ、複合体の大きさ等の点で均質であり、化学的な「同等性の保証」の観点から医薬として開発する上で有利である。また、本発明のβ-1,3-グルカン／核酸複合体の集団は、優れた核酸送達能力を有し、細胞内へ核酸を送達するためのキャリアーとして有用である。また、本発明により、優れた核酸送達能力をする低分子量β-1,3-グルカン／核酸複合体の豊富なβ-1,3-グルカン／核酸複合体の集団が提供される。
　本出願は日本で出願された特願2020-171532（出願日：2020年10月9日）を基礎としており、その内容は本明細書に全て包含されるものである。

Claims (40)

  1. 　β-1,3-グルカン、及びβ-1,3-グルカンと水素結合を介して結合するホモポリヌクレオチドを含む核酸を含み、2本のβ-1,3-グルカン鎖と該核酸に含まれるβ-1,3-グルカンと水素結合を介して結合するホモポリヌクレオチドを含む1本の核酸鎖からなる3重らせん構造を有するβ-1,3-グルカン／核酸複合体の集団であって、
    該集団に含まれるβ-1,3-グルカン／核酸複合体の30%以上が、以下の条件を満たす、β-1,3-グルカン／核酸複合体の集団：
    （i）複合体を構成するβ-1,3-グルカンと水素結合を介して結合するホモポリヌクレオチドを含む核酸に含まれるホモポリヌクレオチドの長さが均一であり、且つ
    （ii-a）1分子の複合体に含まれるβ-1,3-グルカンと水素結合を介して結合するホモポリヌクレオチドを含む核酸の分子数が1、2又は3である。
  2. 　該集団に含まれるβ-1,3-グルカン／核酸複合体の40%以上が、(i)及び(ii-a)の条件を満たす、請求項1記載のβ-1,3-グルカン／核酸複合体の集団。
  3. 　該集団に含まれるβ-1,3-グルカン／核酸複合体の50%以上が、(i)及び(ii-a)の条件を満たす、請求項1記載のβ-1,3-グルカン／核酸複合体の集団。
  4. 　該集団に含まれるβ-1,3-グルカン／核酸複合体の60%以上が、(i)及び(ii-a)の条件を満たす、請求項1記載のβ-1,3-グルカン／核酸複合体の集団。
  5. 　該集団に含まれるβ-1,3-グルカン／核酸複合体の70%以上が、(i)及び(ii-a)の条件を満たす、請求項1記載のβ-1,3-グルカン／核酸複合体の集団。
  6. 　該集団に含まれるβ-1,3-グルカン／核酸複合体の80%以上が、(i)及び(ii-a)の条件を満たす、請求項1記載のβ-1,3-グルカン／核酸複合体の集団。
  7. 　該集団に含まれるβ-1,3-グルカン／核酸複合体の90%以上が、(i)及び(ii-a)の条件を満たす、請求項1記載のβ-1,3-グルカン／核酸複合体の集団。
  8. 　（ii-a）の1分子の複合体に含まれるβ-1,3-グルカンと水素結合を介して結合するホモポリヌクレオチドを含む核酸の分子数が1又は2である、請求項1～7のいずれか1項記載のβ-1,3-グルカン／核酸複合体の集団。
  9. 　（i）及び（ii-a）の条件を満たすβ-1,3-グルカン／核酸複合体の総和の50%以上が、1分子の複合体に含まれるβ-1,3-グルカンと水素結合を介して結合するホモポリヌクレオチドを含む核酸の分子数が1のβ-1,3-グルカン／核酸複合体である、請求項1～8のいずれか1項記載のβ-1,3-グルカン／核酸複合体の集団。
  10. 　β-1,3-グルカン、及びβ-1,3-グルカンと水素結合を介して結合するホモポリヌクレオチドを含む核酸を含み、2本のβ-1,3-グルカン鎖と該核酸に含まれるβ-1,3-グルカンと水素結合を介して結合するホモポリヌクレオチドを含む1本の核酸鎖からなる3重らせん構造を有するβ-1,3-グルカン／核酸複合体の集団であって、
    該集団に含まれるβ-1,3-グルカン／核酸複合体の30%以上が、以下の条件を満たす、β-1,3-グルカン／核酸複合体の集団：
    （i）複合体を構成するβ-1,3-グルカンと水素結合を介して結合するホモポリヌクレオチドを含む核酸に含まれるホモポリヌクレオチドの長さが均一であり、且つ
    （ii-b）1分子の複合体に含まれるβ-1,3-グルカンと水素結合を介して結合するホモポリヌクレオチドを含む核酸の分子数が均一であり、該分子数が1、2及び3からなる群から選択されるいずれかである。
  11. 　該集団に含まれるβ-1,3-グルカン／核酸複合体の40%以上が、(i)及び(ii-b)の条件を満たす、請求項10記載のβ-1,3-グルカン／核酸複合体の集団。
  12. 　該集団に含まれるβ-1,3-グルカン／核酸複合体の50%以上が、(i)及び(ii-b)の条件を満たす、請求項10記載のβ-1,3-グルカン／核酸複合体の集団。
  13. 　該集団に含まれるβ-1,3-グルカン／核酸複合体の60%以上が、(i)及び(ii-b)の条件を満たす、請求項10記載のβ-1,3-グルカン／核酸複合体の集団。
  14. 　該集団に含まれるβ-1,3-グルカン／核酸複合体の70%以上が、(i)及び(ii-b)の条件を満たす、請求項10記載のβ-1,3-グルカン／核酸複合体の集団。
  15. 　該集団に含まれるβ-1,3-グルカン／核酸複合体の80%以上が、(i)及び(ii-b)の条件を満たす、請求項10記載のβ-1,3-グルカン／核酸複合体の集団。
  16. 　該集団に含まれるβ-1,3-グルカン／核酸複合体の90%以上が、(i)及び(ii-b)の条件を満たす、請求項10記載のβ-1,3-グルカン／核酸複合体の集団。
  17. 　（ii-b）の1分子の複合体に含まれるβ-1,3-グルカンと水素結合を介して結合するホモポリヌクレオチドを含む核酸の分子数が1である、請求項10～16のいずれか1項記載のβ-1,3-グルカン／核酸複合体の集団。
  18. 　1分子の複合体に含まれる、β-1,3-グルカンの主鎖グルコース単位数の、ホモポリヌクレオチドを構成するヌクレオチド単位数に対する比（主鎖グルコース単位数／ヌクレオチド単位数）の平均が1.5～2.5である、請求項1～17のいずれか1項記載のβ-1,3-グルカン／核酸複合体の集団。
  19. 　該集団に含まれるβ-1,3-グルカン／核酸複合体の30%以上が、更に以下の条件を満たす、請求項1～18のいずれか1項記載のβ-1,3-グルカン／核酸複合体の集団：
    （iii）1分子の複合体に含まれるβ-1,3-グルカンの分子数が1又は2である。
  20. 　該集団に含まれるβ-1,3-グルカン／核酸複合体の80%以上が、更に(iii)の条件を満たす、請求項19記載のβ-1,3-グルカン／核酸複合体の集団。
  21. 　（i）の複合体を構成するβ-1,3-グルカンと水素結合を介して結合するホモポリヌクレオチドを含む核酸に含まれるホモポリヌクレオチドの長さが、20～100塩基である、請求項1～20のいずれか1項記載のβ-1,3-グルカン／核酸複合体の集団。
  22. 　ホモポリヌクレオチドがポリデオキシアデニル酸である、請求項1～21のいずれか1項記載のβ-1,3-グルカン／核酸複合体の集団。
  23. 　β-1,3-グルカンがシゾフィラン又はカードランである、請求項1～22のいずれか1項記載のβ-1,3-グルカン／核酸複合体の集団。
  24. 　β-1,3-グルカンがシゾフィランである、請求項23記載のβ-1,3-グルカン／核酸複合体の集団。
  25. 　β-1,3-グルカンと水素結合を介して結合するホモポリヌクレオチドを含む核酸が付加核酸を含み、該付加核酸がホモポリヌクレオチドの末端に連結されている、請求項1～24のいずれか1項記載のβ-1,3-グルカン／核酸複合体の集団。
  26. 　付加核酸がホモポリヌクレオチドの5’末端に連結されている、請求項25記載のβ-1,3-グルカン／核酸複合体の集団。
  27. 　付加核酸が標的遺伝子に対する発現抑制活性を有する、請求項25又は26記載のβ-1,3-グルカン／核酸複合体の集団。
  28. 　付加核酸が、アンチセンス核酸、siRNA又はmiRNAである、請求項25～27のいずれか1項記載のβ-1,3-グルカン／核酸複合体の集団。
  29. 　請求項1～28のいずれか1項記載のβ-1,3-グルカン／核酸複合体の集団を製造する方法であって、
    　β-1,3-グルカンと水素結合を介して結合するホモポリヌクレオチドを含む核酸と、β-1,3-グルカンとを混合することにより、β-1,3-グルカン、及びβ-1,3-グルカンと水素結合を介して結合するホモポリヌクレオチドを含む核酸を含み、2本のβ-1,3-グルカン鎖と該核酸に含まれるβ-1,3-グルカンと水素結合を介して結合するホモポリヌクレオチドを含む1本の核酸鎖からなる3重らせん構造を有するβ-1,3-グルカン／核酸複合体を調製する工程を含み、
    　混合に供するβ-1,3-グルカンの重量平均分子量が10万以下であり、ゲル浸透クロマトグラフィーで分離し、示差屈折率検出器で検出したときに、10万以上の分子量のβ-1,3-グルカンのピーク面積が全体の50％以下である、β-1,3-グルカン／核酸複合体の集団を製造する方法。
  30. 　混合に供するβ-1,3-グルカンに含まれる主鎖グルコース単位総数の、混合に供するβ-1,3-グルカンと水素結合を介して結合するホモポリヌクレオチドを含む核酸に含まれる、ホモポリヌクレオチドを構成するヌクレオチド単位総数に対する比（主鎖グルコース単位総数／ヌクレオチド単位総数）が4以上である、請求項29記載の製造方法。
  31. 　主鎖グルコース単位総数／ヌクレオチド単位総数が16以下である、請求項30記載の製造方法。
  32. 　得られたβ-1,3-グルカン／核酸複合体をゲル透過クロマトグラフィーに付し、1分子の複合体に含まれるβ-1,3-グルカンと水素結合を介して結合するホモポリヌクレオチドを含む核酸の分子数が1、2及び3からなる群から選択されるいずれかであるβ-1,3-グルカン／核酸複合体を単離する工程を更に含む、請求項29～31のいずれか1項記載のβ-1,3-グルカン／核酸複合体の集団を製造する方法。
  33. 　請求項1～28のいずれか1項記載のβ-1,3-グルカン／核酸複合体の集団を含む、核酸を細胞内へ導入するための組成物。
  34. 　細胞がDectin-1陽性細胞である、請求項33記載の組成物。
  35. 　請求項1～28のいずれか1項記載のβ-1,3-グルカン／核酸複合体の集団を、細胞へ接触することを含む、核酸を細胞内へ導入する方法。
  36. 　請求項1～28のいずれか1項記載のβ-1,3-グルカン／核酸複合体の集団の、核酸を細胞内へ導入するための使用。
  37. 　請求項27又は28記載のβ-1,3-グルカン／核酸複合体の集団を含む、細胞における標的遺伝子の発現を抑制するための組成物。
  38. 　細胞がDectin-1陽性細胞である、請求項37記載の組成物。
  39. 　請求項27又は28記載のβ-1,3-グルカン／核酸複合体の集団を、細胞へ接触することを含む、該細胞における標的遺伝子の発現を抑制する方法。
  40. 　請求項27又は28記載のβ-1,3-グルカン／核酸複合体の集団の、細胞における標的遺伝子の発現を抑制するための使用。

     
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