CN117264949A - 抑制Apo(a)基因表达的siRNA及其组合物 - Google Patents

抑制Apo(a)基因表达的siRNA及其组合物 Download PDF

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CN117264949A CN202310634738.2A CN202310634738A CN117264949A CN 117264949 A CN117264949 A CN 117264949A CN 202310634738 A CN202310634738 A CN 202310634738A CN 117264949 A CN117264949 A CN 117264949A
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Abstract

本发明提供了抑制Apo(a)基因表达的siRNA及其组合物，属于生物医药技术领域。抑制Apo(a)基因表达的siRNA及其组合物，属于生物医药技术领域。本发明siRNA包含正义链和反义链；其中，所述反义链包含与SEQ ID NO:2～SEQ ID NO:45、SEQ ID NO:138～SEQ ID NO:179中任一所示的核苷酸序列差异不多于4个核苷酸的至少17个连续核苷酸，所述反义链长度为17～30个核苷酸；所述正义链长度为17～30个核苷酸，且与反义链至少部分互补。本发明提供的siRNA及含该siRNA的药物组合物通过对Apo(a)基因的抑制，能够预防或治疗与Apo(a)基因有关的疾病。并且，本发明提供的siRNA及含该siRNA的药物组合物具有良好的稳定性、令人满意的细胞毒性和免疫刺激性，使用安全。

Description

抑制Apo(a)基因表达的siRNA及其组合物
技术领域
本发明属于生物医药技术领域，具体涉及抑制Apo(a)基因表达的siRNA及其组合物。
背景技术
载脂蛋白(a)[apolipoprotein(a),Apo(a)]是脂蛋白(a)[lipoprotein(a),Lp(a)]的组成成分之一。Lp(a)由低密度脂蛋白(LDL)样微粒和Apo(a)组成。作为LP(a)的主要组成成分，Apo(a)主要在肝脏中合成，然后分泌到血液中。Lp(a)的主要功能几乎都与Apo(a)的存在有关。
Apo(a)由十个纤溶酶原类似物IV(KIV)结构、一个纤溶酶原类似物V(KV)结构、一个不活跃的蛋白酶区组成。Lp(a)大小与其血浆浓度呈负相关。KIV2结构单体的数量变化决定了Lp(a)复合体的体积差异，Lp(a)的分子量为300～800kDa，由于体积较小的Lp(a)复合体降解少且合成时间更短，因此较少的KIV2结构数量常伴随血液中较高的Lp(a)水平。
Lp(a)是动脉粥样硬化性心血管疾病(ASCVD)的一个独立的危险因素(包括心肌梗死和缺血性卒中，以及钙化主动脉狭窄)。Lp(a)水平升高使得Apo(a)引起的促凝作用增强，在ApoB的促粥样硬化和促炎作用辅助下，ASCVD的风险大大增加。Apo(a)在该风险发生中起主要作用。
全基因组关联研究发现，低Lp(a)水平与低心血管疾病风险相关。Lp(a)水平降低一个标准差(332nmol/L)，可降低29％冠心病风险、降低31％的外周血管疾病风险、降低13％中风风险、降低17％的心力衰竭风险、降低37％主动脉狭窄的风险(95％ CI,p＜0.05)。Lp(a)＞120nmol/L时，心血管疾病风险随Lp(a)的升高呈线性上升。
人体内理想的Lp(a)水平应低于120nmol/L(50mg/dL)。流行病学统计结果显示，全球20％以上的人Lp(a)＞120nmol/L。不同人种/地区人群的Lp(a)水平存在较大差异。
目前没有直接针对高Lp(a)的上市药物。高Lp(a)的当前最有效疗法是脂蛋白a血浆置换(lipoprotein apheresis,LA)。其次是使用他汀类药物(低密度脂蛋白降解药物)，但不会减少Lp(a)，甚至可能导致Lp(a)轻微增加。烟酸(维生素B3)可以提供适度的降低Lp(a)，但它不批准治疗Lp(a)。烟酸可能导致一些患者出现严重的副作用，并且目前无研究能证明烟酸可降低心脏病风险。
因此，本领域中存在对患有高Lp(a)相关疾病的受试者的替代/改进治疗的需求。一些生物抑制剂和化学药物通过直接或间接靶向Apo(a)发挥有益作用(Nature Medicine，2022，VOL 28，96–103)。多国疾病预防中心均将Lp(a)的含量列为动脉粥样硬化性心血管疾病发病的重要危害因素(https://www.cdc.gov/genomics/disease/lipoprotein_a.htm)。因此，抑制Apo(a)基因表达对于动脉粥样硬化性心血管疾病将有有效治疗效果。
其中，小干扰RNA(small interfering RNA，siRNA)是一种新兴且极具潜力的候选研究对象，其可基于RNA干扰机制，以序列特异性的方式抑制或阻断感兴趣的目的基因的表达，从而达到治疗疾病的目的。具体而言，siRNA通过装载入RNA诱导沉默复合体(RNA-induced silencing complex，RISC)，其引导链(guide strand)、也称为反义链(antisensestrand)与靶基因的mRNA中的靶核酸互补配对，使靶基因的mRNA降解，从而抑制或阻断靶基因的表达。对此，由于siRNA是通过碱基互补配对而序列特异性地识别靶RNA，从而实现靶RNA的切割，达到下调靶RNA水平、抑制靶基因表达的目的，因此，siRNA具有极广阔的应用前景。不过，虽然相对于传统候选药物(例如小分子化合物以及蛋白和抗体)的开发，siRNA的进展速度已经十分惊人，但相比siRNA在理论上趋于无限的价值，在将其强大的基因沉默能力转化为应用手段(主要是疾病治疗)这一方面，转化效率仍然不够让人满意。
然而，考虑到Apo(a)的靶核酸存在种属间差异，增加了针对靶核酸的siRNA药物研发的困难；同时，相比传统药物，siRNA的稳定性较差，系统给药存在易被核酸酶降解的缺点；此外，还需要尝试在进一步提高活性的同时，避免引发脱靶效应、免疫刺激、细胞毒性等副作用。因此，开发出更多在血液中稳定、具有良好生物活性且细胞毒性较低的抑制Apo(a)基因表达的候选siRNA成为迫切需要解决的问题；同时，利用上述抑制Apo(a)基因表达的候选siRNA开发出能够有效预防和/或治疗高血脂蛋白(a)相关疾病的药物存在临床研究的必要性和商业化的现实性。
发明内容
本发明的目的是提供抑制Apo(a)基因表达的siRNA及其组合物。
本发明提供了一种用于抑制Apo(a)基因表达的siRNA，所述siRNA包含正义链和反义链；其中，所述反义链包含与SEQ ID NO:2～SEQ ID NO:45、SEQ ID NO:138～SEQ ID NO:179中任一所示的核苷酸序列差异不多于4个核苷酸的至少17个连续核苷酸，所述反义链长度为17～30个核苷酸；所述正义链长度为17～30个核苷酸，且与反义链至少部分互补。
进一步地，所述反义链长度为19～27个核苷酸；所述正义链长度为17～25个核苷酸；
优选地，所述反义链长度为21～23个核苷酸；所述正义链长度为19～21个核苷酸。
进一步地，所述反义链与SEQ ID NO:2～SEQ ID NO:45、SEQ ID NO:138～SEQ IDNO:179中所示的任一核苷酸序列差异不多于4个核苷酸；
优选地，所述反义链与SEQ ID NO:2～SEQ ID NO:45、SEQ ID NO:138～SEQ IDNO:179中所示的任一核苷酸序列差异不多于3个核苷酸；
更优选地，所述反义链与SEQ ID NO:2～SEQ ID NO:45、SEQ ID NO:138～SEQ IDNO:179中所示的任一核苷酸序列差异不多于2个核苷酸；
进一步优选地，所述反义链与SEQ ID NO:2～SEQ ID NO:45、SEQ ID NO:138～SEQID NO:179中所示的任一核苷酸序列差异不多于1个核苷酸；
最优选地，所述反义链为SEQ ID NO:2～SEQ ID NO:45、SEQ ID NO:138～SEQ IDNO:179中所示的任一核苷酸序列。
进一步地，所述正义链与反义链有不超过3个核苷酸的错配；
优选地，所述正义链与反义链有不超过2个核苷酸的错配；
更优选地，所述正义链与反义链有不超过1个核苷酸的错配；
最优选地，所述正义链与反义链完全互补。
进一步地，所述siRNA选自双链体1～双链体86中任意一个；所述双链体1～双链体86的反义链序列如SEQ ID NO:2～45、138～179所示，正义链序列如SEQ ID NO:46～89、180～221所示。
进一步地，所述siRNA选自：
双链体10，所述双链体10的反义链序列如SEQ ID NO:11所示，正义链序列如SEQID NO:55所示；
双链体13，所述双链体13的反义链序列如SEQ ID NO:14所示，正义链序列如SEQID NO:58所示；
双链体15，所述双链体15的反义链序列如SEQ ID NO:16所示，正义链序列如SEQID NO:60所示；
双链体18，所述双链体18的反义链序列如SEQ ID NO:19所示，正义链序列如SEQID NO:63所示；
双链体19，所述双链体19的反义链序列如SEQ ID NO:20所示，正义链序列如SEQID NO:64所示；
双链体22，所述双链体19的反义链序列如SEQ ID NO:23所示，正义链序列如SEQID NO:67所示。
进一步地，所述siRNA至少含有一个修饰的核苷酸。
进一步地，
所述正义链的3'端至5'端方向的至少第11、12、13位的核苷酸为2’-氟核苷酸，其他位点的核苷酸为2’-甲氧基核苷酸；
或者，所述正义链的3'端至5'端方向的第11、12、13位的核苷酸为2’-氟核苷酸，其他位点的核苷酸为2’-甲氧基核苷酸；
或者，所述正义链的3'端至5'端方向的第11、12、13、15位的核苷酸为2’-氟核苷酸，其他位点的核苷酸为2’-甲氧基核苷酸；
或者，所述正义链的3'端至5'端方向的第1、3、5、7、9、11、12、13、15、17、19、任选的21位的核苷酸为2’-氟核苷酸，其他位点的核苷酸为2’-甲氧基核苷酸；
或者，所述反义链的5'端至3'端方向的至少第2、6、14、16位的核苷酸为2’-氟核苷酸，其他位点的核苷酸为2’-甲氧基核苷酸；
或者，所述反义链的5'端至3'端方向的第2、6、14、16位的核苷酸为2’-氟核苷酸，其他位点的核苷酸为2’-甲氧基核苷酸；
或者，所述反义链的5'端至3'端方向的第2、6、8、9、14、16位的核苷酸为2’-氟核苷酸，其他位点的核苷酸为2’-甲氧基核苷酸；
或者，所述反义链的5'端至3'端方向的第2、4、6、8、10、14、16、18、任选的22位的核苷酸为2’-氟核苷酸，其他位点的核苷酸为2’-甲氧基核苷酸；
或者，所述正义链的3'端至5'端方向的第11、12、13、15位的核苷酸为2’-氟核苷酸，其他位点的核苷酸为2’-甲氧基核苷酸，反义链的5'端至3'端方向的第2、6、8、9、14、16位的核苷酸为2’-氟核苷酸，其他位点的核苷酸为2’-甲氧基核苷酸；
或者，所述正义链的3'端至5'端方向的第11、12、13位的核苷酸为2’-氟核苷酸，其他位点的核苷酸为2’-甲氧基核苷酸，反义链的5'端至3'端方向的第2、6、14、16位的核苷酸为2’-氟核苷酸，其他位点的核苷酸为2’-甲氧基核苷酸；
或者，所述正义链的3'端至5'端方向的第5、6、11、12、13、15位的核苷酸为2’-氟核苷酸，其他位点的核苷酸为2’-甲氧基核苷酸，反义链的5'端至3'端方向的第2、6、8、9、14、16位的核苷酸为2’-氟核苷酸，其他位点的核苷酸为2’-甲氧基核苷酸；
或者，所述正义链的5'端的第1位和第2位的核苷酸之间、正义链的5'端的第2位和第3位的核苷酸之间、反义链的3'端的第1位和第2位的核苷酸之间、反义链的3'端的第2位和第3位的核苷酸之间、反义链的5'端的第1位和第2位的核苷酸之间、以及反义链的5'端的第2位和第3位的核苷酸之间，至少有一个为硫代磷酸酯基连接，优选为至少有四个或六个为硫代磷酸酯基连接；
或者，所述正义链的5'端的第1位和第2位的核苷酸之间、第2位和第3位的核苷酸之间为硫代磷酸酯基连接；
或者，所述正义链的5'端的第1位和第2位的核苷酸之间、第2位和第3位的核苷酸之间为硫代磷酸酯基连接，且3'端的第1位和第2位的核苷酸之间、第2位和第3位的核苷酸之间为硫代磷酸酯基连接；
或者，所述反义链的3'端的第1位和第2位的核苷酸之间、第2位和第3位的核苷酸之间为硫代磷酸酯基连接，且5'端的第1位和第2位的核苷酸之间、第2位和第3位的核苷酸之间为硫代磷酸酯基连接。
进一步地，所述siRNA选自：
修饰双链体1，所述修饰双链体1的反义链序列如SEQ ID NO:90所示，正义链序列如SEQ ID NO:114所示；
修饰双链体2，所述修饰双链体2的反义链序列如SEQ ID NO:91所示，正义链序列如SEQ ID NO:115所示；
修饰双链体3，所述修饰双链体3的反义链序列如SEQ ID NO:92所示，正义链序列如SEQ ID NO:116所示；
修饰双链体4，所述修饰双链体4的反义链序列如SEQ ID NO:93所示，正义链序列如SEQ ID NO:117所示；
修饰双链体5，所述修饰双链体5的反义链序列如SEQ ID NO:94所示，正义链序列如SEQ ID NO:118所示；
修饰双链体6，所述修饰双链体6的反义链序列如SEQ ID NO:95所示，正义链序列如SEQ ID NO:119所示；
修饰双链体7，所述修饰双链体7的反义链序列如SEQ ID NO:96所示，正义链序列如SEQ ID NO:120所示；
修饰双链体8，所述修饰双链体8的反义链序列如SEQ ID NO:97所示，正义链序列如SEQ ID NO:121所示；
修饰双链体9，所述修饰双链体9的反义链序列如SEQ ID NO:98所示，正义链序列如SEQ ID NO:122所示；
修饰双链体10，所述修饰双链体10的反义链序列如SEQ ID NO:99所示，正义链序列如SEQ ID NO:123所示；
修饰双链体11，所述修饰双链体11的反义链序列如SEQ ID NO:100所示，正义链序列如SEQ ID NO:124所示；
修饰双链体12，所述修饰双链体12的反义链序列如SEQ ID NO:101所示，正义链序列如SEQ ID NO:125所示；
修饰双链体13，所述修饰双链体13的反义链序列如SEQ ID NO:102所示，正义链序列如SEQ ID NO:126所示；
修饰双链体14，所述修饰双链体14的反义链序列如SEQ ID NO:103所示，正义链序列如SEQ ID NO:127所示；
修饰双链体15，所述修饰双链体15的反义链序列如SEQ ID NO:104所示，正义链序列如SEQ ID NO:128所示；
修饰双链体16，所述修饰双链体16的反义链序列如SEQ ID NO:105所示，正义链序列如SEQ ID NO:129所示；
修饰双链体17，所述修饰双链体17的反义链序列如SEQ ID NO:106所示，正义链序列如SEQ ID NO:130所示；
修饰双链体18，所述修饰双链体18的反义链序列如SEQ ID NO:107所示，正义链序列如SEQ ID NO:131所示；
修饰双链体19，所述修饰双链体19的反义链序列如SEQ ID NO:108所示，正义链序列如SEQ ID NO:132所示；
修饰双链体20，所述修饰双链体20的反义链序列如SEQ ID NO:109所示，正义链序列如SEQ ID NO:133所示；
修饰双链体21，所述修饰双链体21的反义链序列如SEQ ID NO:110所示，正义链序列如SEQ ID NO:134所示；
修饰双链体22，所述修饰双链体22的反义链序列如SEQ ID NO:111所示，正义链序列如SEQ ID NO:135所示；
修饰双链体23，所述修饰双链体23的反义链序列如SEQ ID NO:112所示，正义链序列如SEQ ID NO:136所示；
修饰双链体24，所述修饰双链体24的反义链序列如SEQ ID NO:113所示，正义链序列如SEQ ID NO:137所示；
修饰双链体25，所述修饰双链体25的反义链序列如SEQ ID NO:222所示，正义链序列如SEQ ID NO:259所示；
修饰双链体26，所述修饰双链体26的反义链序列如SEQ ID NO:223所示，正义链序列如SEQ ID NO:260所示；
修饰双链体27，所述修饰双链体27的反义链序列如SEQ ID NO:224所示，正义链序列如SEQ ID NO:261所示；
修饰双链体28，所述修饰双链体28的反义链序列如SEQ ID NO:225所示，正义链序列如SEQ ID NO:262所示；
修饰双链体29，所述修饰双链体29的反义链序列如SEQ ID NO:226所示，正义链序列如SEQ ID NO:263所示；
修饰双链体30，所述修饰双链体30的反义链序列如SEQ ID NO:227所示，正义链序列如SEQ ID NO:264所示；
修饰双链体31，所述修饰双链体31的反义链序列如SEQ ID NO:228所示，正义链序列如SEQ ID NO:265所示；
修饰双链体32，所述修饰双链体32的反义链序列如SEQ ID NO:229所示，正义链序列如SEQ ID NO:266所示；
修饰双链体33，所述修饰双链体33的反义链序列如SEQ ID NO:230所示，正义链序列如SEQ ID NO:267所示；
修饰双链体34，所述修饰双链体34的反义链序列如SEQ ID NO:231所示，正义链序列如SEQ ID NO:268所示；
修饰双链体35，所述修饰双链体35的反义链序列如SEQ ID NO:232所示，正义链序列如SEQ ID NO:269所示；
修饰双链体36，所述修饰双链体36的反义链序列如SEQ ID NO:233所示，正义链序列如SEQ ID NO:270所示；
修饰双链体37，所述修饰双链体37的反义链序列如SEQ ID NO:234所示，正义链序列如SEQ ID NO:271所示；
修饰双链体38，所述修饰双链体38的反义链序列如SEQ ID NO:235所示，正义链序列如SEQ ID NO:272所示；
修饰双链体39，所述修饰双链体39的反义链序列如SEQ ID NO:236所示，正义链序列如SEQ ID NO:273所示；
修饰双链体40，所述修饰双链体40的反义链序列如SEQ ID NO:237所示，正义链序列如SEQ ID NO:274所示；
修饰双链体41，所述修饰双链体41的反义链序列如SEQ ID NO:238所示，正义链序列如SEQ ID NO:275所示；
修饰双链体42，所述修饰双链体42的反义链序列如SEQ ID NO:239所示，正义链序列如SEQ ID NO:276所示；
修饰双链体43，所述修饰双链体43的反义链序列如SEQ ID NO:240所示，正义链序列如SEQ ID NO:277所示；
修饰双链体44，所述修饰双链体44的反义链序列如SEQ ID NO:241所示，正义链序列如SEQ ID NO:278所示；
修饰双链体45，所述修饰双链体45的反义链序列如SEQ ID NO:242所示，正义链序列如SEQ ID NO:279所示；
修饰双链体46，所述修饰双链体46的反义链序列如SEQ ID NO:243所示，正义链序列如SEQ ID NO:280所示；
修饰双链体47，所述修饰双链体47的反义链序列如SEQ ID NO:244所示，正义链序列如SEQ ID NO:281所示；
修饰双链体48，所述修饰双链体48的反义链序列如SEQ ID NO:245所示，正义链序列如SEQ ID NO:282所示；
修饰双链体49，所述修饰双链体49的反义链序列如SEQ ID NO:246所示，正义链序列如SEQ ID NO:283所示；
修饰双链体50，所述修饰双链体50的反义链序列如SEQ ID NO:247所示，正义链序列如SEQ ID NO:284所示；
修饰双链体51，所述修饰双链体51的反义链序列如SEQ ID NO:248所示，正义链序列如SEQ ID NO:285所示；
修饰双链体52，所述修饰双链体52的反义链序列如SEQ ID NO:249所示，正义链序列如SEQ ID NO:286所示；
修饰双链体53，所述修饰双链体53的反义链序列如SEQ ID NO:250所示，正义链序列如SEQ ID NO:287所示；
修饰双链体54，所述修饰双链体54的反义链序列如SEQ ID NO:251所示，正义链序列如SEQ ID NO:288所示；
修饰双链体55，所述修饰双链体55的反义链序列如SEQ ID NO:252所示，正义链序列如SEQ ID NO:289所示；
修饰双链体56，所述修饰双链体56的反义链序列如SEQ ID NO:253所示，正义链序列如SEQ ID NO:290所示；
修饰双链体57，所述修饰双链体57的反义链序列如SEQ ID NO:254所示，正义链序列如SEQ ID NO:291所示；
修饰双链体58，所述修饰双链体58的反义链序列如SEQ ID NO:255所示，正义链序列如SEQ ID NO:292所示；
修饰双链体59，所述修饰双链体59的反义链序列如SEQ ID NO:256所示，正义链序列如SEQ ID NO:293所示；
修饰双链体60，所述修饰双链体60的反义链序列如SEQ ID NO:257所示，正义链序列如SEQ ID NO:294所示；
修饰双链体61，所述修饰双链体61的反义链序列如SEQ ID NO:258所示，正义链序列如SEQ ID NO:295所示。
本发明还提供了一种siRNA缀合物，它是由靶向配体通过接头连接前述的siRNA，而得；
优选地，所述siRNA缀合物中靶向配体-接头的结构选自：
处连接前述的siRNA。
进一步地，所述靶向配体通过接头连接前述的siRNA的正义链的3’末端。
本发明还提供了一种药物组合物，该药物组合物包含前述的siRNA和/或前述的siRNA缀合物和药学上可接受的载体。
本发明还提供了前述的siRNA和/或前述的siRNA缀合物和/或前述的药物组合物在制备Apo(a)抑制剂中的用途。
本发明还提供了前述的siRNA和/或前述的siRNA缀合物和/或前述的药物组合物在制备用于治疗和/或预防与Apo(a)基因过表达相关的病理状况或疾病的药物中的用途。
进一步地，所述病理状况或疾病为与高Apo(a)相关的疾病；
优选地，所述与高Apo(a)相关的疾病为动脉粥样硬化性心血管疾病。
在本发明中，如无特别说明，大写字母C、G、U、A表示修饰或未修饰的核苷酸的碱基组成；dC、dG、dT、dA表示脱氧核糖核苷酸的碱基组成；小写字母m表示与该字母m右侧相邻的一个核苷酸为2’-甲氧基修饰的核苷酸；标识f表示与该标识f右侧相邻的一个核苷酸为2’-氟修饰的核苷酸；标识*表示与该标识*左右相邻的两个核苷酸之间为硫代磷酸酯基连接；字母VP表示与该标识VP右侧相邻的一个核苷酸为乙烯基磷酸酯修饰的核苷酸。
在本发明中，如无特别说明，术语“互补”是指第一序列的寡核苷酸在一定条件下和第二序列的寡核苷酸杂交并形成双链结构的能力。“至少部分互补”是指两条序列可以是完全互补的，或者总体上不多于5个、4个、3个或2个错配碱基配对，同时保留了在相关条件下杂交的能力。另外在两个寡核苷酸设计成杂交时形成一个或多个单链突出端的情况下，就确定互补性而言，这类突出端不应当视作错配。在本发明中，就满足以上杂交能力的要求时，“互补”序列还可以包括或完全形成自非Watson(沃森)-Crick(克里克)碱基对和/或从非天然的以及经修饰的核苷酸形成的碱基对。此类非Watson(沃森)-Crick(克里克)碱基对包括但不局限于G：U摇摆碱基配对或Hoogstein(胡格斯腾)碱基配对。对应地，在本发明中，如无特别说明，“错配”是指在siRNA双链体分子中，对应位置的碱基并未以互补的形式配对存在。
在本发明中，如无特别说明，“核苷酸序列的差异”是指相比于原核苷酸序列，在相同或相对应位置处的核苷酸的碱基种类发生了改变。例如，在原核苷酸序列中的一个核苷酸碱基为A时，在相同或相对应位置处的核苷酸碱基改变为U、C、G或dT、dC、dG等的情况下，认为该位置处存在核苷酸序列的差异。此处需要说明的是，在相比于原核苷酸序列，在相同或相对应位置处的核苷酸仅在是否存在修饰或修饰类型方面存在区别的情况下，不认为该位置处存在核苷酸序列的差异。
在本发明中，如无特别说明，术语“药学上可接受的”是指载体、运载体、稀释剂、辅料和/或其所形成的盐/酯/水合物等通常在化学上或物理上与构成某药物剂型的其它成分相兼容，并在生理上与受体相兼容。
在本发明中，如无特别说明，术语“抑制”是指由于siRNA介导的靶基因的mRNA降解而使靶基因表达得以下调(down-regulation)的情况。所述“下调”是指相对于无siRNA处理时，靶基因表达水平下降5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％或99％以上或甚至100％的情况。其中，靶基因表达水平下降100％是指无可检测水平的靶基因表达。
在本发明中，术语“siRNA”意指能够序列特异性地诱导RNAi现象、由正义链和反义链构成、并具有部分或完全互补的双链结构的RNA分子。本发明所涉及的siRNA中，互补双链结构的长度可以为17-30个碱基对，例如19个、20个、21个、22个、23个、24个或25个碱基对。
在本发明的一些实施方式中，所述siRNA还可根据需要含有修饰的核苷酸，所述修饰的核苷酸不会导致所述siRNA抑制Apo(a)基因表达的功能明显削弱或丧失。目前，本领域存在多种可用于修饰siRNA的方式，包括例如骨架修饰(如磷酸基团修饰)、核糖基团修饰及碱基修饰等(Watts,J.K.,G.F.Deleavey,and M.J.Damha,Chemically modified siRNA:tools and applications.Drug Discov Today,2008.13(19-20):p.842-55)。在本发明的一些实施方式中，所述siRNA的正义链或反义链中的至少一个核苷酸为修饰的核苷酸，例如，所述修饰的核苷酸为核糖基团以及任选的磷酸基团被修饰的核苷酸基团，但不限于此。
在本发明的一些实施方式中，所述修饰的核苷酸选自：2’-甲氧基核苷酸、2’-氟核苷酸、2’-脱氧核苷酸、2’,3’-裂环核苷酸类似物、2’-氟阿糖核苷酸、2’-甲氧基乙基核苷酸、2’-氨基修饰核苷酸、2’-烷基修饰核苷酸、3’-甲氧基核苷酸，但本发明不限于此。在本发明的一些实施方式中，所述修饰的核苷酸选自2’-甲氧基核苷酸或2’-氟核苷酸。
在本发明的一些实施方式中，所述修饰的核苷酸为磷酸基团被硫代磷酸酯基团修饰的核苷酸。即，用一个硫原子取代磷酸二酯键中的非桥氧原子，从而以硫代磷酸二酯键替换磷酸二酯键。
在本发明中，如无特别说明，“缀合”是指两个或多个化学部分之间通过共价连接的方式彼此连接；“缀合物”是指各个化学部分之间通过共价连接而形成的化合物；“缀合分子”理解为可通过反应缀合至寡核苷酸，最终形成本公开的寡核苷酸缀合物的特定化合物。
在本发明的一些实施方式中，本发明的siRNA与药学上可接受的缀合分子可以缀合得到siRNA缀合物。在本发明的一些实施方式中，所述siRNA共价缀合至所述缀合分子。为降低缀合对siRNA活性可能带来的影响，siRNA与缀合分子的缀合位点可以在siRNA正义链的3’端或5’端，也可在反义链的5’端。在一些实施方式中，siRNA与缀合分子的缀合位点还可以在siRNA的内部序列中。
所述药学上可接受的靶向配体可以是siRNA给药领域常规使用的靶向配体，例如但不限于以下靶向配体或其衍生物中的一种或多种：亲脂分子，例如胆固醇、胆汁酸、维生素(例如维生素E)、不同链长的脂质分子；聚合物，例如聚乙二醇；多肽，例如透膜肽；适配体；抗体；量子点；糖类，例如乳糖、聚乳糖、甘露糖、半乳糖、N-乙酰半乳糖胺(GalNAc)；叶酸(folate)；或肝实质细胞表达的受体配体，例如去唾液酸糖蛋白、去唾液酸糖残基、脂蛋白(如高密度脂蛋白、低密度脂蛋白等)、胰高血糖素、神经递质(如肾上腺素)、生长因子、转铁蛋白等。
在本发明的一些实施方式中，所述靶向配体为N-乙酰半乳糖胺。
在本发明的一些实施方式中，所述靶向配体直接连接至siRNA正义链的3’末端。在本发明的一些实施方式中，所述靶向配体通过接头连接至siRNA正义链的3’末端。
本发明提供了一种具有优异的Apo(a)基因抑制活性的siRNA及含该siRNA的药物组合物，通过对Apo(a)基因的抑制，能够预防或治疗与Apo(a)基因有关的疾病，如预防或治疗动脉粥样硬化性心血管疾病、降低血脂等。并且，本发明提供的siRNA及含该siRNA的药物组合物具有良好的稳定性、令人满意的细胞毒性和免疫刺激性，使用安全。本发明提供的siRNA及含该siRNA的药物组合物可用于制备Apo(a)基因抑制剂或治疗与Apo(a)基因有关的疾病的药物，具有良好的应用前景。
显然，根据本发明的上述内容，按照本领域的普通技术知识和惯用手段，在不脱离本发明上述基本技术思想前提下，还可以做出其它多种形式的修改、替换或变更。
以下通过实施例形式的具体实施方式，对本发明的上述内容再作进一步的详细说明。但不应将此理解为本发明上述主题的范围仅限于以下的实例。凡基于本发明上述内容所实现的技术均属于本发明的范围。
具体实施方式
本领域技术人员知晓的是，通过本领域的常规siRNA制备方法(例如固相合成和液相合成)可以得到本发明所述的siRNA，其中，固相合成和液相合成均已有商业化订制服务。本领域技术人员也清楚知晓，通过使用具有相应修饰的核苷酸单体可以将修饰的核苷酸基团引入本发明所述的siRNA中。制备具有相应修饰的核苷酸单体的方法是本领域技术人员所熟知的，市场上也有商业化的单体供应。
本发明中siRNA靶向的Apo(a)基因的序列如SEQ ID NO:1所示：GTAAGTCAACAATGTCCTGGGATTGGGACACACTTTCTGGGCACTGCTGGCCAGTCCCAAAATGGAACATAAGGAAGTGGTTCTTCTACTTCTTTTATTTCTGAAATCAGCAGCACCTGAGCAAAGCCATGTGGTCCAGGATTGCTACCATGGTGATGGACAGAGTTATCGAGGCACGTACTCCACCACTGTCACAGGAAGGACCTGCCAAGCTTGGTCATCTATGACACCACATCAACATAATAGGACCACAGAAAACTACCCAAATGCTGGCTTGATCATGAACTACTGCAGGAATCCAGATGCTGTGGCAGCTCCTTATTGTTATACGAGGGATCCCGGTGTCAGGTGGGAGTACTGCAACCTGACGCAATGCTCAGACGCAGAAGGGACTGCCGTCGCGCCTCCGACTGTTACCCCGGTTCCAAGCCTAGAGGCTCCTTCCGAACAAGCACCGACTGAGCAAAGGCCTGGGGTGCAGGAGTGCTACCATGGTAATGGACAGAGTTATCGAGGCACATACTCCACCACTGTCACAGGAAGAACCTGCCAAGCTTGGTCATCTATGACACCACACTCGCATAGTCGGACCCCAGAATACTACCCAAATGCTGGCTTGATCATGAACTACTGCAGGAATCCAGATGCTGTGGCAGCTCCTTATTGTTATACGAGGGATCCCGGTGTCAGGTGGGAGTACTGCAACCTGACGCAATGCTCAGACGCAGAAGGGACTGCCGTCGCGCCTCCGACTGTTACCCCGGTTCCAAGCCTAGAGGCTCCTTCCGAACAAGCACCGACTGAGCAAAGGCCTGGGGTGCAGGAGTGCTACCATGGTAATGGACAGAGTTATCGAGGCACATACTCCACCACTGTCACAGGAAGAACCTGCCAAGCTTGGTCATCTAT
GACACCACACTCGCATAGTCGGACCCCAGAATACTACCCAAATGCTGG
CTTGATCATGAACTACTGCAGGAATCCAGATGCTGTGGCAGCTCCTTA
TTGTTATACGAGGGATCCCGGTGTCAGGTGGGAGTACTGCAACCTGAC
GCAATGCTCAGACGCAGAAGGGACTGCCGTCGCGCCTCCGACTGTTAC
CCCGGTTCCAAGCCTAGAGGCTCCTTCCGAACAAGCACCGACTGAGCA
GAGGCCTGGGGTGCAGGAGTGCTACCACGGTAATGGACAGAGTTATC
GAGGCACATACTCCACCACTGTCACTGGAAGAACCTGCCAAGCTTGGT
CATCTATGACACCACACTCGCATAGTCGGACCCCAGAATACTACCCAA
ATGCTGGCTTGATCATGAACTACTGCAGGAATCCAGATGCTGTGGCAG
CTCCTTATTGTTATACGAGGGATCCCGGTGTCAGGTGGGAGTACTGCA
ACCTGACGCAATGCTCAGACGCAGAAGGGACTGCCGTCGCGCCTCCG
ACTGTTACCCCGGTTCCAAGCCTAGAGGCTCCTTCCGAACAAGCACCG
ACTGAGCAAAGGCCTGGGGTGCAGGAGTGCTACCATGGTAATGGACA
GAGTTATCGAGGCACATACTCCACCACTGTCACAGGAAGAACCTGCCA
AGCTTGGTCATCTATGACACCACACTCGCATAGTCGGACCCCAGAATA
CTACCCAAATGCTGGCTTGATCATGAACTACTGCAGGAATCCAGATGC
TGTGGCAGCTCCTTATTGTTATACGAGGGATCCCGGTGTCAGGTGGGA
GTACTGCAACCTGACGCAATGCTCAGACGCAGAAGGGACTGCCGTCG
CGCCTCCGACTGTTACCCCGGTTCCAAGCCTAGAGGCTCCTTCCGAAC
AAGCACCGACTGAGCAAAGGCCTGGGGTGCAGGAGTGCTACCATGGT
AATGGACAGAGTTATCGAGGCACATACTCCACCACTGTCACAGGAAG
AACCTGCCAAGCTTGGTCATCTATGACACCACACTCGCATAGTCGGAC
CCCAGAATACTACCCAAATGCTGGCTTGATCATGAACTACTGCAGGAA
TCCAGATGCTGTGGCAGCTCCTTATTGTTATACGAGGGATCCCGGTGT
CAGGTGGGAGTACTGCAACCTGACGCAATGCTCAGACGCAGAAGGGA
CTGCCGTCGCGCCTCCGACTGTTACCCCGGTTCCAAGCCTAGAGGCTC
CTTCCGAACAAGCACCGACTGAGCAAAGGCCTGGGGTGCAGGAGTGC
TACCATGGTAATGGACAGAGTTATCGAGGCACATACTCCACCACTGTC
ACAGGAAGAACCTGCCAAGCTTGGTCATCTATGACACCACACTCGCAT
AGTCGGACCCCAGAATACTACCCAAATGCTGGCTTGATCATGAACTAC
TGCAGGAATCCAGATGCTGTGGCAGCTCCTTATTGTTATACGAGGGAT
CCCGGTGTCAGGTGGGAGTACTGCAACCTGACGCAATGCTCAGACGCA
GAAGGGACTGCCGTCGCGCCTCCGACTGTTACCCCGGTTCCAAGCCTA
GAGGCTCCTTCCGAACAAGCACCGACTGAGCAGAGGCCTGGGGTGCA
GGAGTGCTACCACGGTAATGGACAGAGTTATCGAGGCACATACTCCAC
CACTGTCACTGGAAGAACCTGCCAAGCTTGGTCATCTATGACACCACA
CTCGCATAGTCGGACCCCAGAATACTACCCAAATGCTGGCTTGATCAT
GAACTACTGCAGGAATCCAGATCCTGTGGCAGCCCCTTATTGTTATAC
GAGGGATCCCAGTGTCAGGTGGGAGTACTGCAACCTGACACAATGCTC
AGACGCAGAAGGGACTGCCGTCGCGCCTCCAACTATTACCCCGATTCC
AAGCCTAGAGGCTCCTTCTGAACAAGCACCAACTGAGCAAAGGCCTG
GGGTGCAGGAGTGCTACCACGGAAATGGACAGAGTTATCAAGGCACA
TACTTCATTACTGTCACAGGAAGAACCTGCCAAGCTTGGTCATCTATG
ACACCACACTCGCATAGTCGGACCCCAGCATACTACCCAAATGCTGGC
TTGATCAAGAACTACTGCCGAAATCCAGATCCTGTGGCAGCCCCTTGG
TGTTATACAACAGATCCCAGTGTCAGGTGGGAGTACTGCAACCTGACA
CGATGCTCAGATGCAGAATGGACTGCCTTCGTCCCTCCGAATGTTATT
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ACCCCCGGGGTACAGGACTGCTACTACCATTATGGACAGAGTTACCGA
GGCACATACTCCACCACTGTCACAGGAAGAACTTGCCAAGCTTGGTCA
TCTATGACACCACACCAGCATAGTCGGACCCCAGAAAACTACCCAAAT
GCTGGCCTGACCAGGAACTACTGCAGGAATCCAGATGCTGAGATTCGC
CCTTGGTGTTACACCATGGATCCCAGTGTCAGGTGGGAGTACTGCAAC
CTGACACAATGCCTGGTGACAGAATCAAGTGTCCTTGCAACTCTCACG
GTGGTCCCAGATCCAAGCACAGAGGCTTCTTCTGAAGAAGCACCAACG
GAGCAAAGCCCCGGGGTCCAGGATTGCTACCATGGTGATGGACAGAG
TTATCGAGGCTCATTCTCTACCACTGTCACAGGAAGGACATGTCAGTC
TTGGTCCTCTATGACACCACACTGGCATCAGAGGACAACAGAATATTA
TCCAAATGGTGGCCTGACCAGGAACTACTGCAGGAATCCAGATGCTGA
GATTAGTCCTTGGTGTTATACCATGGATCCCAATGTCAGATGGGAGTA
CTGCAACCTGACACAATGTCCAGTGACAGAATCAAGTGTCCTTGCGAC
GTCCACGGCTGTTTCTGAACAAGCACCAACGGAGCAAAGCCCCACAGT
CCAGGACTGCTACCATGGTGATGGACAGAGTTATCGAGGCTCATTCT
CCACCACTGTTACAGGAAGGACATGTCAGTCTTGGTCCTCTATGACAC
CACACTGGCATCAGAGAACCACAGAATACTACCCAAATGGTGGCCTG
ACCAGGAACTACTGCAGGAATCCAGATGCTGAGATTCGCCCTTGGTGT
TATACCATGGATCCCAGTGTCAGATGGGAGTACTGCAACCTGACGCAA
TGTCCAGTGATGGAATCAACTCTCCTCACAACTCCCACGGTGGTCCCA
GTTCCAAGCACAGAGCTTCCTTCTGAAGAAGCACCAACTGAAAACAGC
ACTGGGGTCCAGGACTGCTACCGAGGTGATGGACAGAGTTATCGAGG
CACACTCTCCACCACTATCACAGGAAGAACATGTCAGTCTTGGTCGTC
TATGACACCACATTGGCATCGGAGGATCCCATTATACTATCCAAATGC
TGGCCTGACCAGGAACTACTGCAGGAATCCAGATGCTGAGATTCGCCC
TTGGTGTTACACCATGGATCCCAGTGTCAGGTGGGAGTACTGCAACCT
GACACGATGTCCAGTGACAGAATCGAGTGTCCTCACAACTCCCACAGT
GGCCCCGGTTCCAAGCACAGAGGCTCCTTCTGAACAAGCACCACCTGA
GAAAAGCCCTGTGGTCCAGGATTGCTACCATGGTGATGGACGGAGTTA
TCGAGGCATATCCTCCACCACTGTCACAGGAAGGACCTGTCAATCTTG
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AGAGTTATCGAGGCACATTCTCCACCACTGTCACAGGAAGGACATGTC
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ACTACCCAAATGATGGCCTGACAATGAACTACTGCAGGAATCCAGATG
CCGATACAGGCCCTTGGTGTTTTACCATGGACCCCAGCATCAGGTGGG
AGTACTGCAACCTGACGCGATGCTCAGACACAGAAGGGACTGTGGTC
GCTCCTCCGACTGTCATCCAGGTTCCAAGCCTAGGGCCTCCTTCTGAAC
AAGACTGTATGTTTGGGAATGGGAAAGGATACCGGGGCAAGAAGGCA
ACCACTGTTACTGGGACGCCATGCCAGGAATGGGCTGCCCAGGAGCCC
CATAGACACAGCACGTTCATTCCAGGGACAAATAAATGGGCAGGTCT
GGAAAAAAATTACTGCCGTAACCCTGATGGTGACATCAATGGTCCCTG
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TCTCTGTGCATCCTCTTCATTTGATTGTGGGAAGCCTCAAGTGGAGCCG
AAGAAATGTCCTGGAAGCATTGTAGGGGGGTGTGTGGCCCACCCACAT
TCCTGGCCCTGGCAAGTCAGTCTCAGAACAAGGTTTGGAAAGCACTTC
TGTGGAGGCACCTTAATATCCCCAGAGTGGGTGCTGACTGCTGCTCAC
TGCTTGAAGAAGTCCTCAAGGCCTTCATCCTACAAGGTCATCCTGGGT
GCACACCAAGAAGTGAACCTCGAATCTCATGTTCAGGAAATAGAAGT
GTCTAGGCTGTTCTTGGAGCCCACACAAGCAGATATTGCCTTGCTAAA
GCTAAGCAGGCCTGCCGTCATCACTGACAAAGTAATGCCAGCTTGTCT
GCCATCCCCAGACTACATGGTCACCGCCAGGACTGAATGTTACATCAC
TGGCTGGGGAGAAACCCAAGGTACCTTTGGGACTGGCCTTCTCAAGGA
AGCCCAGCTCCTTGTTATTGAGAATGAAGTGTGCAATCACTATAAGTA
TATTTGTGCTGAGCATTTGGCCAGAGGCACTGACAGTTGCCAGGGTGA
CAGTGGAGGGCCTCTGGTTTGCTTCGAGAAGGACAAATACATTTTACA
AGGAGTCACTTCTTGGGGTCTTGGCTGTGCACGCCCCAATAAGCCTGG
TGTCTATGCTCGTGTTTCAAGGTTTGTTACTTGGATTGAGGGAATGATG
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AGAAGCTGAAACGTGGGTAAGGATTTAGCATGCTGGAAATAATAGAC
AGCAATCAAACGAAGACACTGTTCCCAGCTACCAGCTATGCCAAACCT
TGGCATTTTTGGTATTTTTGTGTATAAGCTTTTAAGGTCTGACTGACAA
ATTCTGTATTAAGGTGTCATAGCTATGACATTTGTTAAAAATAAACTCTGCACTTATTTTGATTTGAA(SEQ ID NO:1)
实施例1：siRNA合成
对于本发明的siRNA序列的正义链和反义链以及修饰双链体的正义链和反义链，使用脱氧核苷CPG作为固相支持物；使用固相支持物合成正义链，使用通用CPG合成反义链。
48通道合成仪使用0.2μmol的规模进行序列合成。亚磷酰胺单体使用0.05M浓度，活化剂使用0.3M BTT。每条序列按照3’端到5’端方向逐一连接核苷单体，当两个核苷酸之间采用磷酸酯连接时，连接后一个核苷酸时，包括脱保护、偶联、盖帽、氧化四个步骤；当两个核苷酸之间采用硫代磷酸酯连接时，连接后一个核苷酸时，包括脱保护、偶联、盖帽、硫化四个步骤。上述合成核苷酸序列的方法均为本领域常规方法。
连接反应完成以后，在1.5ml管中进行序列的切割和脱保护，第一步使用AMA，第二步使用三乙胺三氟化氢脱二位保护基。对于包含二位全部修饰的序列，需要用氨水氨解。使用丙酮:乙醇(80:20，体积比)混合物对切割和脱保护之后的序列进行沉淀并用无RNA酶水溶解。将各序列通过LC-MS进行分析确定序列准确性、通过分光光度计定量并通过HPLC确定纯度。
在HPLC纯化、冻干并质检后，用醋酸钠醇沉换盐，用3KD的超滤管脱盐，脱盐后通过分光光度计定量确定正义链和反义链，按1:1混合退火形成siRNA双链体。合成的未修饰siRNA的正义链序列和反义链序列如表1所示，siRNA的正义链修饰序列和反义链修饰序列如表2所示。
表1.未修饰siRNA的正义链序列和反义链序列
/>
/>
/>
上述表1中所述A、C、G、U均为未修饰的核苷酸的碱基组成。
表2.siRNA的正义链修饰序列和反义链修饰序列
/>
/>
/>
/>
/>
对正义链和反义链进行修饰后，双链体的稳定性会增加。
实施例2：体外活性检测
细胞培养和转染
细胞培养：将RT-4细胞(ATCC)在37℃，5％ CO2的环境中使用MC完全培养基(Gibco，添加10％ FBS)培养至接近融合，然后使用胰酶消化细胞进行铺板，使用12孔板，每孔加入2.0×105个RT-4细胞及1.0mL MCCOY’S 5A培养基(Gibco，添加10％ FBS)，在37℃，5％ CO2的环境中培养16-24h后进行转染。
细胞转染：按每孔48.5μL opti-MEM加入1.5μL lipofectamine RNAiMax(Invitrogen)，再加入50μL实施例1表1、表2中的siRNA双链体或siRNA修饰双链体进行混合，添加至PCR管中且室温孵育5分钟，最后将该siRNA混合物添加至上述细胞中，继续培养24h后进行RNA提取。单剂量实验以10nM和0.1nM或者0.1nM和0.01nM siRNA双链体浓度进行。IC50测试实验以10nM、1.0nM、0.1nM、0.01nM、0.001nM、0.0001nM和0.00001nM siRNA双链体浓度进行。根据不同浓度双链体对靶点mRNA的抑制效果，IC50计算方式采用Prism 8.0软件中‘log(inhibitor)vs.response--Variable slope(four parameters)’模式进行。
RNA提取
使用total RNA分离试剂盒(omega公司，cat:R6834-02)：收集细胞，1％PBS清洗，然后加入400μL裂解液(含2％β-巯基乙醇)裂解细胞，后续步骤按照该RNA分离试剂盒说明书进行，最后加入30μL无RNA酶水，静置2分钟后14000g离心2分钟收集RNA即可。
cDNA合成
使用全式金的gDNA去除cDNA合成试剂盒(北京全式金生物技术有限公司，北京，中国Cat#AE311-03)进行cDNA合成。每个样品添加1μg总RNA，使用梯度热循环仪(LongGene，A600)按照说明书的步骤进行cDNA合成。
实时荧光定量PCR
将合成好的cDNA和混合母液(包含引物、qPCR预混液和超纯水)添加到384孔板(博康美华Cat#PC-0040-9U)中，使最终实时荧光定量PCR体系中含靶基因(Apo(a))或内参基因(GADPH)上下游引物各0.25μM、1×SYBR Green预混液(Applied Biosystem Cat#A25742)。Apo(a)正向引物：5’-CAGCACGTTCATTCCAGGGA-3’(SEQ ID NO:296)；Apo(a)反向引物：5’-CACCAGGGACCATTGATGTCA-3’(SEQ ID NO:297)；GADPH正向引物：5’-ATGGGGAAGGTGAAGGTCG-3’(SEQ ID NO:298)；GADPH反向引物：5’-GGGGTCATTGATGGCAACAATA-3’(SEQ ID NO:299)。
使用ΔΔCt测定法在ABI QuantStudioTM6实时荧光PCR系统中进行实时荧光PCR。每种双链体进行3-4次独立的转染测试，每次转染进行一式3-4份测定。
siRNA双链体和siRNA修饰双链体的体外活性测试结果如表1和表2所示。其中，使用已知具有Apo(a)基因抑制效果的PC A作为阳性对照。
PC A：
正义链：5'-CAGCCCCUUAUUGUUAUACGA-3'(SEQ ID NO:300)
反义链：5'-UCGUAUAACAAUAAGGGGCUG-3'(SEQ ID NO:301)
表3.siRNA双链体单剂量测试结果
/>
*：该数值Apo(a)mRNA与空白对照相比的相对表达量
表3结果说明：本发明双链体对于Apo(a)基因表达具有显著的抑制作用。其中双链体10、双链体13、双链体15、双链体18、双链体19、双链体22的抑制效果最优。
表4.siRNA双链体IC50测试结果
双链体编号 IC50 in RT4 cells KD max R square
双链体13 59.03pM 0.8344 0.9747
双链体15 94.80pM 0.8062 0.99
双链体18 50.98pM 0.7955 0.9753
双链体19 54.11pM 0.5761 0.9675
表5.siRNA修饰双链体单剂量测试结果
/>
表6.siRNA修饰双链体单剂量测试结果
由表5和表6可知：本发明siRNA修饰双链体对于Apo(a)基因表达具有显著的抑制作用。
本发明提供了一种具有优异的Apo(a)基因抑制活性的siRNA及含该siRNA的药物组合物，通过对Apo(a)基因的抑制，能够预防或治疗与Apo(a)基因有关的疾病，如预防或治疗动脉粥样硬化性心血管疾病、降低血脂等。并且，本发明提供的siRNA及含该siRNA的药物组合物具有良好的稳定性、令人满意的细胞毒性和免疫刺激性，使用安全。本发明提供的siRNA及含该siRNA的药物组合物可用于制备Apo(a)基因抑制剂或治疗与Apo(a)基因有关的疾病的药物，具有良好的应用前景。

Claims (15)

1.一种用于抑制Apo(a)基因表达的siRNA，其特征在于：所述siRNA包含正义链和反义链；其中，所述反义链包含与SEQ ID NO:2～SEQ ID NO:45、SEQ ID NO:138～SEQ ID NO:179中任一所示的核苷酸序列差异不多于4个核苷酸的至少17个连续核苷酸，所述反义链长度为17～30个核苷酸；所述正义链长度为17～30个核苷酸，且与反义链至少部分互补。
2.根据权利要求1所述的siRNA，其特征在于：所述反义链长度为19～27个核苷酸；所述正义链长度为17～25个核苷酸；
优选地，所述反义链长度为21～23个核苷酸；所述正义链长度为19～21个核苷酸。
3.根据权利要求1所述的siRNA，其特征在于：所述反义链与SEQ ID NO:2～SEQ ID NO:45、SEQ ID NO:138～SEQ ID NO:179中所示的任一核苷酸序列差异不多于4个核苷酸；
优选地，所述反义链与SEQ ID NO:2～SEQ ID NO:45、SEQ ID NO:138～SEQ ID NO:179中所示的任一核苷酸序列差异不多于3个核苷酸；
更优选地，所述反义链与SEQ ID NO:2～SEQ ID NO:45、SEQ ID NO:138～SEQ ID NO:179中所示的任一核苷酸序列差异不多于2个核苷酸；
进一步优选地，所述反义链与SEQ ID NO:2～SEQ ID NO:45、SEQ ID NO:138～SEQ IDNO:179中所示的任一核苷酸序列差异不多于1个核苷酸；
最优选地，所述反义链为SEQ ID NO:2～SEQ ID NO:45、SEQ ID NO:138～SEQ ID NO:179中所示的任一核苷酸序列。
4.根据权利要求1所述的siRNA，其特征在于：所述正义链与反义链有不超过3个核苷酸的错配；
优选地，所述正义链与反义链有不超过2个核苷酸的错配；
更优选地，所述正义链与反义链有不超过1个核苷酸的错配；
最优选地，所述正义链与反义链完全互补。
5.根据权利要求1-4任一项所述的siRNA，其特征在于：所述siRNA选自双链体1～双链体86中任意一个；所述双链体1～双链体86的反义链序列如SEQ ID NO:2～45、138～179所示，正义链序列如SEQ ID NO:46～89、180～221所示。
6.根据权利要求1-4任一项所述的siRNA，其特征在于：所述siRNA选自：
双链体10，所述双链体10的反义链序列如SEQ ID NO:11所示，正义链序列如SEQ IDNO:55所示；
双链体13，所述双链体13的反义链序列如SEQ ID NO:14所示，正义链序列如SEQ IDNO:58所示；
双链体15，所述双链体15的反义链序列如SEQ ID NO:16所示，正义链序列如SEQ IDNO:60所示；
双链体18，所述双链体18的反义链序列如SEQ ID NO:19所示，正义链序列如SEQ IDNO:63所示；
双链体19，所述双链体19的反义链序列如SEQ ID NO:20所示，正义链序列如SEQ IDNO:64所示；
双链体22，所述双链体19的反义链序列如SEQ ID NO:23所示，正义链序列如SEQ IDNO:67所示。
7.根据权利要求1-4任一项所述的siRNA，其特征在于：所述siRNA至少含有一个修饰的核苷酸。
8.根据权利要求7所述的siRNA，其特征在于：
所述正义链的3'端至5'端方向的至少第11、12、13位的核苷酸为2’-氟核苷酸，其他位点的核苷酸为2’-甲氧基核苷酸；
或者，所述正义链的3'端至5'端方向的第11、12、13位的核苷酸为2’-氟核苷酸，其他位点的核苷酸为2’-甲氧基核苷酸；
或者，所述正义链的3'端至5'端方向的第11、12、13、15位的核苷酸为2’-氟核苷酸，其他位点的核苷酸为2’-甲氧基核苷酸；
或者，所述正义链的3'端至5'端方向的第1、3、5、7、9、11、12、13、15、17、19、任选的21位的核苷酸为2’-氟核苷酸，其他位点的核苷酸为2’-甲氧基核苷酸；
或者，所述反义链的5'端至3'端方向的至少第2、6、14、16位的核苷酸为2’-氟核苷酸，其他位点的核苷酸为2’-甲氧基核苷酸；
或者，所述反义链的5'端至3'端方向的第2、6、14、16位的核苷酸为2’-氟核苷酸，其他位点的核苷酸为2’-甲氧基核苷酸；
或者，所述反义链的5'端至3'端方向的第2、6、8、9、14、16位的核苷酸为2’-氟核苷酸，其他位点的核苷酸为2’-甲氧基核苷酸；
或者，所述反义链的5'端至3'端方向的第2、4、6、8、10、14、16、18、任选的22位的核苷酸为2’-氟核苷酸，其他位点的核苷酸为2’-甲氧基核苷酸；
或者，所述正义链的3'端至5'端方向的第11、12、13、15位的核苷酸为2’-氟核苷酸，其他位点的核苷酸为2’-甲氧基核苷酸，反义链的5'端至3'端方向的第2、6、8、9、14、16位的核苷酸为2’-氟核苷酸，其他位点的核苷酸为2’-甲氧基核苷酸；
或者，所述正义链的3'端至5'端方向的第11、12、13位的核苷酸为2’-氟核苷酸，其他位点的核苷酸为2’-甲氧基核苷酸，反义链的5'端至3'端方向的第2、6、14、16位的核苷酸为2’-氟核苷酸，其他位点的核苷酸为2’-甲氧基核苷酸；
或者，所述正义链的3'端至5'端方向的第5、6、11、12、13、15位的核苷酸为2’-氟核苷酸，其他位点的核苷酸为2’-甲氧基核苷酸，反义链的5'端至3'端方向的第2、6、8、9、14、16位的核苷酸为2’-氟核苷酸，其他位点的核苷酸为2’-甲氧基核苷酸；
或者，所述正义链的5'端的第1位和第2位的核苷酸之间、正义链的5'端的第2位和第3位的核苷酸之间、反义链的3'端的第1位和第2位的核苷酸之间、反义链的3'端的第2位和第3位的核苷酸之间、反义链的5'端的第1位和第2位的核苷酸之间、以及反义链的5'端的第2位和第3位的核苷酸之间，至少有一个为硫代磷酸酯基连接，优选为至少有四个或六个为硫代磷酸酯基连接；
或者，所述正义链的5'端的第1位和第2位的核苷酸之间、第2位和第3位的核苷酸之间为硫代磷酸酯基连接；
或者，所述正义链的5'端的第1位和第2位的核苷酸之间、第2位和第3位的核苷酸之间为硫代磷酸酯基连接，且3'端的第1位和第2位的核苷酸之间、第2位和第3位的核苷酸之间为硫代磷酸酯基连接；
或者，所述反义链的3'端的第1位和第2位的核苷酸之间、第2位和第3位的核苷酸之间为硫代磷酸酯基连接，且5'端的第1位和第2位的核苷酸之间、第2位和第3位的核苷酸之间为硫代磷酸酯基连接。
9.根据权利要求7所述的siRNA，其特征在于：所述siRNA选自：
修饰双链体1，所述修饰双链体1的反义链序列如SEQ ID NO:90所示，正义链序列如SEQID NO:114所示；
修饰双链体2，所述修饰双链体2的反义链序列如SEQ ID NO:91所示，正义链序列如SEQID NO:115所示；
修饰双链体3，所述修饰双链体3的反义链序列如SEQ ID NO:92所示，正义链序列如SEQID NO:116所示；
修饰双链体4，所述修饰双链体4的反义链序列如SEQ ID NO:93所示，正义链序列如SEQID NO:117所示；
修饰双链体5，所述修饰双链体5的反义链序列如SEQ ID NO:94所示，正义链序列如SEQID NO:118所示；
修饰双链体6，所述修饰双链体6的反义链序列如SEQ ID NO:95所示，正义链序列如SEQID NO:119所示；
修饰双链体7，所述修饰双链体7的反义链序列如SEQ ID NO:96所示，正义链序列如SEQID NO:120所示；
修饰双链体8，所述修饰双链体8的反义链序列如SEQ ID NO:97所示，正义链序列如SEQID NO:121所示；
修饰双链体9，所述修饰双链体9的反义链序列如SEQ ID NO:98所示，正义链序列如SEQID NO:122所示；
修饰双链体10，所述修饰双链体10的反义链序列如SEQ ID NO:99所示，正义链序列如SEQ ID NO:123所示；
修饰双链体11，所述修饰双链体11的反义链序列如SEQ ID NO:100所示，正义链序列如SEQ ID NO:124所示；
修饰双链体12，所述修饰双链体12的反义链序列如SEQ ID NO:101所示，正义链序列如SEQ ID NO:125所示；
修饰双链体13，所述修饰双链体13的反义链序列如SEQ ID NO:102所示，正义链序列如SEQ ID NO:126所示；
修饰双链体14，所述修饰双链体14的反义链序列如SEQ ID NO:103所示，正义链序列如SEQ ID NO:127所示；
修饰双链体15，所述修饰双链体15的反义链序列如SEQ ID NO:104所示，正义链序列如SEQ ID NO:128所示；
修饰双链体16，所述修饰双链体16的反义链序列如SEQ ID NO:105所示，正义链序列如SEQ ID NO:129所示；
修饰双链体17，所述修饰双链体17的反义链序列如SEQ ID NO:106所示，正义链序列如SEQ ID NO:130所示；
修饰双链体18，所述修饰双链体18的反义链序列如SEQ ID NO:107所示，正义链序列如SEQ ID NO:131所示；
修饰双链体19，所述修饰双链体19的反义链序列如SEQ ID NO:108所示，正义链序列如SEQ ID NO:132所示；
修饰双链体20，所述修饰双链体20的反义链序列如SEQ ID NO:109所示，正义链序列如SEQ ID NO:133所示；
修饰双链体21，所述修饰双链体21的反义链序列如SEQ ID NO:110所示，正义链序列如SEQ ID NO:134所示；
修饰双链体22，所述修饰双链体22的反义链序列如SEQ ID NO:111所示，正义链序列如SEQ ID NO:135所示；
修饰双链体23，所述修饰双链体23的反义链序列如SEQ ID NO:112所示，正义链序列如SEQ ID NO:136所示；
修饰双链体24，所述修饰双链体24的反义链序列如SEQ ID NO:113所示，正义链序列如SEQ ID NO:137所示；
修饰双链体25，所述修饰双链体25的反义链序列如SEQ ID NO:222所示，正义链序列如SEQ ID NO:259所示；
修饰双链体26，所述修饰双链体26的反义链序列如SEQ ID NO:223所示，正义链序列如SEQ ID NO:260所示；
修饰双链体27，所述修饰双链体27的反义链序列如SEQ ID NO:224所示，正义链序列如SEQ ID NO:261所示；
修饰双链体28，所述修饰双链体28的反义链序列如SEQ ID NO:225所示，正义链序列如SEQ ID NO:262所示；
修饰双链体29，所述修饰双链体29的反义链序列如SEQ ID NO:226所示，正义链序列如SEQ ID NO:263所示；
修饰双链体30，所述修饰双链体30的反义链序列如SEQ ID NO:227所示，正义链序列如SEQ ID NO:264所示；
修饰双链体31，所述修饰双链体31的反义链序列如SEQ ID NO:228所示，正义链序列如SEQ ID NO:265所示；
修饰双链体32，所述修饰双链体32的反义链序列如SEQ ID NO:229所示，正义链序列如SEQ ID NO:266所示；
修饰双链体33，所述修饰双链体33的反义链序列如SEQ ID NO:230所示，正义链序列如SEQ ID NO:267所示；
修饰双链体34，所述修饰双链体34的反义链序列如SEQ ID NO:231所示，正义链序列如SEQ ID NO:268所示；
修饰双链体35，所述修饰双链体35的反义链序列如SEQ ID NO:232所示，正义链序列如SEQ ID NO:269所示；
修饰双链体36，所述修饰双链体36的反义链序列如SEQ ID NO:233所示，正义链序列如SEQ ID NO:270所示；
修饰双链体37，所述修饰双链体37的反义链序列如SEQ ID NO:234所示，正义链序列如SEQ ID NO:271所示；
修饰双链体38，所述修饰双链体38的反义链序列如SEQ ID NO:235所示，正义链序列如SEQ ID NO:272所示；
修饰双链体39，所述修饰双链体39的反义链序列如SEQ ID NO:236所示，正义链序列如SEQ ID NO:273所示；
修饰双链体40，所述修饰双链体40的反义链序列如SEQ ID NO:237所示，正义链序列如SEQ ID NO:274所示；
修饰双链体41，所述修饰双链体41的反义链序列如SEQ ID NO:238所示，正义链序列如SEQ ID NO:275所示；
修饰双链体42，所述修饰双链体42的反义链序列如SEQ ID NO:239所示，正义链序列如SEQ ID NO:276所示；
修饰双链体43，所述修饰双链体43的反义链序列如SEQ ID NO:240所示，正义链序列如SEQ ID NO:277所示；
修饰双链体44，所述修饰双链体44的反义链序列如SEQ ID NO:241所示，正义链序列如SEQ ID NO:278所示；
修饰双链体45，所述修饰双链体45的反义链序列如SEQ ID NO:242所示，正义链序列如SEQ ID NO:279所示；
修饰双链体46，所述修饰双链体46的反义链序列如SEQ ID NO:243所示，正义链序列如SEQ ID NO:280所示；
修饰双链体47，所述修饰双链体47的反义链序列如SEQ ID NO:244所示，正义链序列如SEQ ID NO:281所示；
修饰双链体48，所述修饰双链体48的反义链序列如SEQ ID NO:245所示，正义链序列如SEQ ID NO:282所示；
修饰双链体49，所述修饰双链体49的反义链序列如SEQ ID NO:246所示，正义链序列如SEQ ID NO:283所示；
修饰双链体50，所述修饰双链体50的反义链序列如SEQ ID NO:247所示，正义链序列如SEQ ID NO:284所示；
修饰双链体51，所述修饰双链体51的反义链序列如SEQ ID NO:248所示，正义链序列如SEQ ID NO:285所示；
修饰双链体52，所述修饰双链体52的反义链序列如SEQ ID NO:249所示，正义链序列如SEQ ID NO:286所示；
修饰双链体53，所述修饰双链体53的反义链序列如SEQ ID NO:250所示，正义链序列如SEQ ID NO:287所示；
修饰双链体54，所述修饰双链体54的反义链序列如SEQ ID NO:251所示，正义链序列如SEQ ID NO:288所示；
修饰双链体55，所述修饰双链体55的反义链序列如SEQ ID NO:252所示，正义链序列如SEQ ID NO:289所示；
修饰双链体56，所述修饰双链体56的反义链序列如SEQ ID NO:253所示，正义链序列如SEQ ID NO:290所示；
修饰双链体57，所述修饰双链体57的反义链序列如SEQ ID NO:254所示，正义链序列如SEQ ID NO:291所示；
修饰双链体58，所述修饰双链体58的反义链序列如SEQ ID NO:255所示，正义链序列如SEQ ID NO:292所示；
修饰双链体59，所述修饰双链体59的反义链序列如SEQ ID NO:256所示，正义链序列如SEQ ID NO:293所示；
修饰双链体60，所述修饰双链体60的反义链序列如SEQ ID NO:257所示，正义链序列如SEQ ID NO:294所示；
修饰双链体61，所述修饰双链体61的反义链序列如SEQ ID NO:258所示，正义链序列如SEQ ID NO:295所示。
10.一种siRNA缀合物，其特征在于：它是由靶向配体通过接头连接权利要求1～9任一项所述的siRNA，而得；
优选地，所述siRNA缀合物中靶向配体-接头的结构选自：
处连接权利要求1～9任一项所述的siRNA。
11.根据权利要求10所述的siRNA缀合物，其特征在于：所述靶向配体通过接头连接权利要求1～9任一项所述的siRNA的正义链的3’末端。
12.一种药物组合物，其特征在于：该药物组合物包含权利要求1～9任一项所述的siRNA和/或权利要求10或11所述的siRNA缀合物和药学上可接受的载体。
13.权利要求1～9任一所述的siRNA和/或权利要求10或11所述的siRNA缀合物和/或权利要求12所述的药物组合物在制备Apo(a)抑制剂中的用途。
14.权利要求1～9任一所述的siRNA和/或权利要求10或11所述的siRNA缀合物和/或权利要求12所述的药物组合物在制备用于治疗和/或预防与Apo(a)基因过表达相关的病理状况或疾病的药物中的用途。
15.根据权利要求14所述的用途，其特征在于：所述病理状况或疾病为与高Apo(a)相关的疾病；
优选地，所述与高Apo(a)相关的疾病为动脉粥样硬化性心血管疾病。
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