本発明は、インビボまたはインビトロでのα1アンチトリプシン遺伝子のレベル及び/または発現を減少させることができる核酸、例えば二本鎖RNA(「dsRNA」)を含有する組成物、及びそれらを調製する方法を対象とする。dsRNAの鎖の1つは、標的とするα1アンチトリプシン転写産物の破壊及び/または翻訳阻害を指示し得る19〜35ヌクレオチドの範囲の長さを有するヌクレオチド配列の領域を含む。
定義
他に別様に定義がなければ、本明細書で用いられる全ての技術的及び科学的用語は、本発明が属する技術分野の当業者に共通して理解される意味を有する。以下の参考文献は、本発明で用いられる用語の多くの一般的定義を当業者に示している:Singleton et al., Dictionary of Microbiology and Molecular Biology (2nd ed. 1994); The Cambridge Dictionary of Science and Technology (Walker ed., 1988); The Glossary of Genetics, 5th Ed., R. Rieger et al. (eds.), Springer Verlag (1991);及びHale & Marham, The Harper Collins Dictionary of Biology (1991)。本明細書で用いられる次の用語は、他に断りがなければ、以下にそれらに与えられた意味を有する。
本発明は、α1アンチトリプシン発現を調整(例えば、阻害)し得る1種または複数のDsiRNA分子を特色とする。本発明のDsiRNAは、任意で、α1アンチトリプシン誤制御(例えば、腫瘍の形成及び/または成長など)に関連する疾患または障害の維持または発達に関連する他の遺伝子及び/または遺伝子産物のモジュレータと併せて用いることができる。本発明のDsiRNA剤は、本明細書では概して「α1アンチトリプシン」と称されるGenBank 登録番号NM_000295.4(ヒトα1アンチトリプシン)及びNM_009246.3(マウスセルピナ1d)により参照されるcDNA配列に対応するものなどのα1アンチトリプシンRNAを調整する。
本発明の様々な態様及び実施形態の以下の記述は、本明細書では概してα1アンチトリプシンと称される、例示的α1アンチトリプシンRNAに関連して提供されている。しかしそのような参照は、例示に過ぎないことを意図しており、本発明の様々な態様及び実施形態は、変異体α1アンチトリプシンRNAまたは追加のα1アンチトリプシンスプライスバリアントなど、代替のα1アンチトリプシンRNAも対象とする。ある特定の態様及び実施形態は、誤制御がα1アンチトリプシンのものと関連して作用して(または、α1アンチトリプシン制御の影響を受け、もしくはα1アンチトリプシン制御に影響を及ぼして)、処置のためのターゲットとなり得る表現型への影響(例えば、腫瘍の形成及び/または成長など)を生じる遺伝子など、α1アンチトリプシン経路に関与する他の遺伝子も対象とする。BAK1、Noxa、BCL2L11、Bcl−2関連デスプロモータ、PCNA、DAD1、TNKS及びBH3共役ドメインデスアゴニストが、α1アンチトリプシンと相互作用する遺伝子の例である。α1アンチトリプシンと連携して作用する経路の遺伝子をはじめとするそのような追加の遺伝子は、dsRNA、及びα1アンチトリプシン標的化dsRNAの使用に関して本明細書に記載された方法を利用して、標的とされ得る。つまり他の遺伝子の阻害及びそのような阻害の効果を、本明細書に記載された通り実施することができる。
「α1アンチトリプシン」という用語は、α1アンチトリプシンタンパク質、ペプチド、またはポリペプチドをコードする核酸配列(例えば、α1アンチトリプシンGenbank登録番号NM_000295.4及びNM_009246.3の配列などのα1アンチトリプシン転写産物)を指す。ある特定の実施形態において、「α1アンチトリプシン」という用語は、他のα1アンチトリプシンアイソフォーム、突然変異体α1アンチトリプシン遺伝子、α1アンチトリプシン遺伝子のスプライスバリアント、及びα1アンチトリプシン遺伝子多型などの他のα1アンチトリプシンコード配列も含むことを意味する。「α1アンチトリプシン」という用語は、α1アンチトリプシンGenbank登録番号NP_000286.3及びNP_033272.1によりコードされるものなど、α1アンチトリプシン遺伝子/転写産物のポリペプチド遺伝子産物、例えばα1アンチトリプシンタンパク質、ペプチド、またはポリペプチドを指すのにも用いられる。
本明細書で用いられる「α1アンチトリプシン関連疾患または障害」は、改変されたα1アンチトリプシン発現、レベル及び/または活性に関連することが当該技術分野で知られている疾患または障害を指す。特に「α1アンチトリプシン関連疾患または障害」は、非限定的に慢性肝臓疾患、肝臓の炎症、肝硬変、肝線維症、及び/または肝細胞癌をはじめとする肝臓の疾患または障害を包含する。
本発明の抗α1アンチトリプシンdsRNAが系(例えば、無細胞のインビトロ系)、細胞、組織または臓器に投与された場合に、選択された対照と比較してα1アンチトリプシンRNAの(またはα1アンチトリプシンタンパク質が評価される場合にはα1アンチトリプシンタンパク質レベルの)統計学的に有意な減少が認められれば、本発明の抗α1アンチトリプシンdsRNAは、「α1アンチトリプシン阻害活性」を有すると見なされる。実験値の分布及び行われる反復アッセイの数が、α1アンチトリプシンRNAの減少レベル(%として、または絶対的用語のいずれかで)を統計学的に有意(当該技術分野で知られる統計学的有意差を決定する標準的方法による評価で)と見なされるパラメータを決定する傾向があろう。しかしある特定の実施形態において、「α1アンチトリプシン阻害活性」は、系、細胞、組織または臓器内のα1アンチトリプシンレベル低下の%または絶対値に基づいて定義される。例えばある特定の実施形態において、α1アンチトリプシンRNAの少なくとも5%の減少または少なくとも10%の減少が、適切な対照で認められたα1アンチトリプシンレベルに比較して本発明のdsRNAの存在下で観察されれば、本発明のdsRNAは、α1アンチトリプシン阻害活性を有すると見なされる。(例えば、ある特定の実施形態において、例えばα1アンチトリプシンレベルの5%または10%低下が対照に比較して観察されれば、組織及び/または対象のインビボα1アンチトリプシンレベルは、本発明のdsRNA剤により阻害されると見なされる。)ある特定の他の実施形態において、α1アンチトリプシンRNAレベルが選択された対照に比較して少なくとも15%、選択された対照に比較して少なくとも20%、選択された対照に比較して少なくとも25%、選択された対照に比較して少なくとも30%、選択された対照に比較して少なくとも35%、選択された対照に比較して少なくとも40%、選択された対照に比較して少なくとも45%、選択された対照に比較して少なくとも50%、選択された対照に比較して少なくとも55%、選択された対照に比較して少なくとも60%、選択された対照に比較して少なくとも65%、選択された対照に比較して少なくとも70%、選択された対照に比較して少なくとも75%、選択された対照に比較して少なくとも80%、選択された対照に比較して少なくとも85%、選択された対照に比較して少なくとも90%、選択された対照に比較して少なくとも95%、選択された対照に比較して少なくとも96%、選択された対照に比較して少なくとも97%、選択された対照に比較して少なくとも98%、または選択された対照に比較して少なくとも99%低下することが観察されれば、本発明のdsRNAは、α1アンチトリプシン阻害活性を有すると見なされる。幾つかの実施形態において、α1アンチトリプシンの完全な阻害が、dsRNAがα1アンチトリプシン阻害活性を有すると見なされるのに必要となる。ある特定のモデル(例えば、細胞培養)において、適切な対照に比較してα1アンチトリプシンレベルの少なくとも50%の低下が観察された場合には、dsRNAは、α1アンチトリプシン阻害活性を有すると見なされる。特定の他の実施形態において、適切な対照に比較してα1アンチトリプシンレベルの少なくとも80%の低下が観察された場合には、dsRNAは、α1アンチトリプシン阻害活性を有すると見なされる。
具体的な例として、以下の実施例2において、α1アンチトリプシンを標的とする一連のDsiRNAが、インビトロでのヒトHuh7またはマウスAML12細胞内のα1アンチトリプシンmRNAレベルを、そのような細胞環境及びトランスフェクション剤(リポフェクタミン(商標)RNAiMAX、インビトロジェン)の存在下の1nM濃度で低下させる能力について試験された。以下の実施例2では、α1アンチトリプシン阻害活性は、アッセイ条件下、α1アンチトリプシンmRNAレベルの少なくとも70%の低下をもたらすことが観察されたDsiRNAに起因する。同一または類似のアッセイ及び条件が用いられた場合であっても、α1アンチトリプシン阻害活性が以下の実施例2で用いられるものよりも高または低ストリンジェント条件のいずれかでdsRNAに起因し得ることも、企図される。例えばある特定の実施形態において、α1アンチトリプシンmRNAレベルの少なくとも10%の低下、少なくとも20%の低下、少なくとも30%の低下、少なくとも40%の低下、少なくとも50%の低下、少なくとも60%の低下、少なくとも75%の低下、少なくとも80%の低下、少なくとも85%の低下、少なくとも90%の低下、または少なくとも95%の低下が、適切な対照に比較して、細胞環境での1nM dsRNA濃度以下で、インビトロの哺乳動物細胞株で観察された場合には、試験された本発明のdsRNAは、α1アンチトリプシン阻害活性を有すると見なされる。
本発明の二本鎖RNAがα1アンチトリプシン阻害活性を有するかどうかを決定するための他のエンドポイントの利用も、企図される。具体的には一実施形態において、α1アンチトリプシンmRNAレベルの評価に加えて、またはその代わりに、試験されるdsRNAがα1アンチトリプシンタンパク質レベルを低下させる能力を評価し(例えば、インビトロまたはインビボで哺乳動物細胞と接触した後48時間目に)、適切な対照に比較してα1アンチトリプシンタンパク質レベルの少なくとも10%の低下、少なくとも20%の低下、少なくとも30%の低下、少なくとも40%の低下、少なくとも50%の低下、少なくとも60%の低下、少なくとも70%の低下、少なくとも75%の低下、少なくとも80%の低下、少なくとも85%の低下、少なくとも90%の低下、または少なくとも95%の低下が、インビトロまたはインビボでアッセイされた二本鎖RNAと接触された哺乳動物細胞で観察されれば、試験されたdsRNAは、α1アンチトリプシン阻害活性を有すると見なされる。企図される追加のエンドポイントには、例えばα1アンチトリプシンレベルに関連する表現型の評価、例えば慢性肝臓疾患、肝臓の炎症、肝硬変、肝線維症、及び/または肝細胞癌の、直接の評価、またはそのような肝臓疾患もしくは障害の適当なマーカ及び/もしくは指示薬の評価による退縮がある。
α1アンチトリプシン阻害活性は、投与される濃度及び投与後の期間に従って適合されたα1アンチトリプシン阻害活性を有するdsRNAを構成するものの評価で、時間(期間)及び濃度範囲(能力)に応じて評価することもできる。つまり、ある特定の実施形態において、α1アンチトリプシン活性の少なくとも50%の低下が、細胞または臓器へのdsRNAの投与後2時間、5時間、10時間、1日間、2日、3日、4日、5日、6日、7日、8日、9日、10日、またはそれを超える期間、観察/持続されれば、本発明のdsRNAは、α1アンチトリプシン阻害活性を有すると見なされる。追加の実施形態において、α1アンチトリプシン阻害活性(例えば、ある特定の実施形態において、α1アンチトリプシンの少なくとも50%の阻害)が、細胞環境において、例えば本明細書に記載されたα1アンチトリプシン阻害活性のためのインビトロアッセイで、1nM以下、500pM以下、200pM以下、100pM以下、50pM以下、20pM以下、10pM以下、5pM以下、2pM以下、またはさらには1pM以下の濃度で観察されれば、本発明のdsRNAは、強力なα1アンチトリプシン阻害活性剤であると見なされる。ある特定の実施形態において、本発明の強力なα1アンチトリプシン阻害性dsRNAは、効果的送達ビヒクル(例えば、効果的な脂質ナノ粒子配合剤)中で対象に投与される場合に、10mg/kg以下の配合濃度で、α1アンチトリプシン阻害活性(例えば、ある特定の実施形態において、α1アンチトリプシンレベルの少なくとも20%の低下)が可能なものと定義される。好ましくは本発明の強力なα1アンチトリプシン阻害性dsRNAは、効果的送達ビヒクル中で対象に投与される場合に、5mg/kg以下の配合濃度で、α1アンチトリプシン阻害活性(例えば、ある特定の実施形態において、α1アンチトリプシンレベルの少なくとも50%の低下)が可能なものと定義される。より好ましくは本発明の強力なα1アンチトリプシン阻害性dsRNAは、効果的送達ビヒクル中で対象に投与される場合に、5mg/kg以下の配合濃度で、α1アンチトリプシン阻害活性(例えば、ある特定の実施形態において、α1アンチトリプシンレベルの少なくとも50%の低下)が可能なものと定義される。任意で本発明の強力なα1アンチトリプシン阻害性dsRNAは、効果的送達ビヒクル中で対象に投与される場合に、2mg/kg以下または1mg/kg以下の配合濃度で、α1アンチトリプシン阻害活性(例えば、ある特定の実施形態において、α1アンチトリプシンレベルの少なくとも50%の低下)が可能なものと定義される。本発明のα1アンチトリプシン標的化RNAi剤の例示的な不連続の配合濃度としては、約5mg/kg、約2mg/kg、約1mg/kg、約500μg/kg、約250μg/kg、約100μg/kg、約50μg/kg、約25μg/kg、約10μg/kg、約5μg/kg、約2.5μg/kg、約1μg/kg、約500ng/kg、約250ng/kg、約100ng/kg、約50ng/kg、約25ng/kg、約10ng/kg、約5ng/kg、約2.5ng/kg、約1ng/kg、及び約500pg/kgが挙げられる。
約:本明細書で用いられる「約」という用語は、引用された値の±10%を意味する。「約」の使用は、本明細書で引用された全ての範囲及び値に関して企図される。
ある特定の実施形態において、「本質的に〜からなる」という表現は、本発明の抗α1アンチトリプシンdsRNAに関連して用いられる。幾つかのそのような実施形態において、「本質的に〜からなる」は、少なくとも特定レベルのα1アンチトリプシン阻害活性(例えば、少なくとも50%のα1アンチトリプシン阻害活性)を有する本発明のdsRNAを含み、dsRNAのα1アンチトリプシン阻害活性に有意な影響を及ぼさない1種または複数の追加の成分及び/または修飾も含む組成物を指す。例えばある特定の実施形態において、本発明のdsRNA及び/または該組成物のdsRNA関連成分の修飾が単離された本発明のdsRNAに比較して3%より大きく、5%より大きく、10%より大きく、15%より大きく、20%より大きく、25%より大きく、30%より大きく、35%より大きく、40%より大きく、45%より大きく、または50%より大きく、α1アンチトリプシン阻害活性(任意で、α1アンチトリプシン阻害活性の能力または期間など)を改変しなければ、該組成物は、「本質的に本発明のdsRNAからなる」。ある特定の実施形態において、α1アンチトリプシン阻害活性のより劇的な低下(例えば、効力、期間及び/または能力の80%の低下、90%の低下など)が追加の成分または修飾の存在下で起こる場合でも、α1アンチトリプシン阻害活性が追加の成分及び/または修飾の存在下で有意に上昇していなければ(例えば、α1アンチトリプシン阻害活性の観察レベルが本発明のdsRNAで観察されたレベルの10%以内であれば)、該組成物は本質的に本発明のdsRNAからなると見なされる。
本明細書で用いられる「核酸」という用語は、一本鎖または二本鎖形態の、デオキシリボヌクレオチド、リボヌクレオチド、または修飾ヌクレオチド、及びそれらのポリマーを指す。その用語は、合成、天然由来及び非天然由来であり、参照核酸と類似の結合特性を有し、参照ヌクレオチドと類似の手法で代謝される、公知のヌクレオチドアナログまたは修飾バックボーン残基もしくは結合を含む核酸を包含する。そのようなアナログの例としては、ホスホロチオアート、ホスホルアミダート、ホスホン酸メチル、キラルホスホン酸メチル、2−O−メチルリボヌクレオチド、ペプチド核酸(PNA)及びアンロック核酸(UNAまたはアンロックヌクレオ塩基類似体;例えばJensen et al. Nucleic Acids Symposium Series 52: 133−4参照)、ならびにそれらの誘導体が挙げられるが、これらに限定されない。
本明細書で用いられる「ヌクレオチド」は、当該技術分野で認識される通り、天然塩基(標準)、及び当該技術分野で周知の修飾塩基を有するものを含んで用いられる。そのような塩基は、一般に、ヌクレオチド糖部分の1’位に配置する。ヌクレオチドは、一般に、塩基、糖及びリン酸基を含む。ヌクレオチドは、糖、リン酸及び/または塩基部分が非修飾であるか、または修飾され得る(互換的にヌクレオチドアナログ、修飾ヌクレオチド、非天然ヌクレオチド、非標準ヌクレオチドなどとも称される;例えばUsman及びMcSwiggen、上記参照; Eckstein他、国際特許PCT公告WO92/07065号;Usman他、国際特許PCT公告WO93/15187号;Uhlman & Peyman、上記参照。全てが参照により本明細書に取り込まれる)。Limbach, et al, Nucleic Acids Res. 22:2183, 1994に概説される通り、当該技術分野で知られる修飾核酸塩基には複数の例が存在する。核酸分子に導入され得る塩基修飾の非限定的例の幾つかには、ヒポキサンチン、プリン、ピリジン−4−オン、ピリジン−2−オン、フェニル、シュードウラシル、2,4,6−トリメトキシベンゼン、3−メチルウラシル、ジヒドロウラシル、ナフチル、アミノフェニル、5−アルキルシチジン(例えば、5−メチルシチジン)、5−アルキルウリジン(例えば、リボチミジン)、5−ハロウリジン(例えば、5−ブロモウリジン)または6−アザピリミジンまたは6−アルキルピリミジン(例えば、6−メチルウリジン)、プロピンなどが挙げられる(Burgin, et al., Biochemistry 35:14090, 1996; Uhlman & Peyman、上記参照)。この態様における「修飾塩基」は、1’位のアデニン、グアニン、シトシン及びウラシル以外、またはそれらの均等物以外のヌクレオチド塩基を意味する。
本明細書で用いられる「修飾ヌクレオチド」は、ヌクレオシド、ヌクレオ塩基、ペントース環、またはリン酸基への1つまたは複数の修飾を有するヌクレオチドを指す。例えば修飾ヌクレオチドは、アデノシン一リン酸、グアノシン一リン酸、ウリジン一リン酸及びシチジン一リン酸を含むリボヌクレオチド、ならびにデオキシアデノシン一リン酸、デオキシグアノシン一リン酸、デオキシチミジン一リン酸及びデオキシシチジン一リン酸を含むデオキシリボヌクレオチドを排除する。修飾は、メチルトランスフェラーゼなど、ヌクレオチドを修飾する酵素による修飾から生じる天然由来のものを包含する。修飾ヌクレオチドとしては、合成または非天然由来ヌクレオチドも挙げられる。ヌクレオチドにおける合成または天然由来の修飾には、2’ 修飾を有するもの、例えば2’−メトキシエトキシ、2’−フルオロ、2’−アリル、2’−O−[2−(メチルアミノ)−2−オキシエチル]、4’−チオ、4’−CH2−O−2’−架橋、4’−(CH2)2−O−2’−架橋、2’−LNA、または他の二環式もしくは「架橋」ヌクレオシドアナログ、及び2’−O−(N−メチルカルバマート)、または塩基類似体を含むものがある。本開示に関して記載された2’修飾ヌクレオチドに関連して、「アミノ」は、2’−NH2または2’−O−NH2を意味し、それらは修飾であっても、または非修飾でもあり得る。そのような修飾基は、例えばEcksteinらの米国特許第5,672,695号、及びMatulic−Adamicらの米国特許第6,248,878号に記載される。本発明の「修飾ヌクレオチド」は、先に記載されたヌクレオチドアナログも包含し得る。
本開示の核酸分子に関して、修飾は、二本鎖リボ核酸(dsRNA)の一方または両方の鎖上でこれらの薬剤にパターンとして存在していてもよい。本明細書で用いられる「交互の位置」は、1つおきのヌクレオチドが修飾ヌクレオチドであるパターン、またはdsRNAの鎖の決まった長さでそれぞれの修飾ヌクレオチドの間に非修飾ヌクレオチド(例えば、非修飾リボヌクレオチド)が存在するパターン(例えば、5’−MNMNMN−3’;3’−MNMNMN−5’;(ここでMは、修飾ヌクレオチドであり、Nは、非修飾ヌクレオチドである))を指す。修飾パターンは、例えば本明細書に記載された通り、位置付番の慣例に従って5’または3’末端のいずれかの最初のヌクレオチド位置から出発する(ある特定の実施形態において、1位は、本発明のDsiRNA剤の予測されたダイサー切断事象に続く鎖の末端残基に関連して割り当てられ、つまり1位は、いつも本発明の前処理剤の3’末端または5’末端残基を構成するとは限らない)。交互位置にある修飾ヌクレオチドのパターンは、鎖の全長に存在し得るが、ある特定の実施形態においては、それぞれ少なくとも2、3、4、5、6または7の修飾ヌクレオチドを含む少なくとも4、6、8、10、12、14のヌクレオチドを含む。本明細書で用いられる「位置の交互の対」は、2つの連続する修飾ヌクレオチドが、dsRNAの鎖の決まった長さで2つの連続する非修飾ヌクレオチドにより分離されたパターン(例えば、5’−MMNNMMNNMMNN−3’;3’−MMNNMMNNMMNN−5’;(ここでMは、修飾ヌクレオチドであり、Nは、非修飾ヌクレオチドである))を指す。修飾パターンは、本明細書に記載されたものなど、位置付番の慣例に従って5’または3’末端のいずれかの最初のヌクレオチド位置から出発する。交互位置にある修飾ヌクレオチドのパターンは、鎖の全長に存在し得るが、好ましくは、それぞれ少なくとも4、6、8、10、12、または14の修飾ヌクレオチドを含む少なくとも8、12、16、20、24、28のヌクレオチドを含む。先の修飾パターンは例示であり、本発明の範囲の限定を意図しないことを強調する。
本明細書で用いられる「塩基類似体」は、核酸二重鎖に組み込まれ得る修飾ヌクレオチド内のヌクレオチド糖部分の1’位(または核酸二重鎖に組み込まれ得るヌクレオチド糖部分置換の同等位置)に位置する複素環部分を指す。本発明のdsRNAにおいて、塩基類似体は、概して、一般的な塩基のグアニン(G)、シトシン(C)、アデニン(A)、チミン(T)、及びウラシル(U)を除くプリンまたはピリミジン塩基のいずれかである。塩基類似体は、dsRNAにおいて他の塩基または塩基類似体と二重鎖を形成し得る。塩基類似体としては、本発明の化合物及び方法において有用なもの、例えば参照により本明細書に取り込まれる、Bennerへの米国特許第5,432,272号及び同第6,001,983号、ならびにManoharanへの米国特許出願公開第20080213891号に開示されたものが挙げられる。塩基の非限定的な例としては、ヒポキサンチン(I)、キサンチン(X)、3β−D−リボフラノシル−(2,6−ジアミノピリミジン)(K)、3−β−D−リボフラノシル−(1−メチル−ピラゾロ[4,3−d]ピリミジン−5,7(4H,6H)−ジオン)(P)、イソ−シトシン(イソ−C)、イソグアニン(イソ−G)、1−β−D−リボフラノシル−(5−ニトロインドール)、1−β−D−リボフラノシル−(3−ニトロピロール)、5−ブロモウラシル、2−アミノプリジン、4−チオ−dT、7−(2−チエニル)−イミダゾ[4,5−b]ピリジン(Ds)及びピロール−2−カルバルデヒド(Pa)、2−アミノ−6−(2−チエニル)プリン(S)、2−オキソピリジン(Y)、ジフルオロトリル、4−フルオロ−6−メチルベンゾイミダゾール、4−メチルベンゾイミダゾール、3−メチルイソカルボスチリル(3−methyl isocarbostyrilyl)、5−メチルイソカルボスチリル(5−methyl isocarbostyrilyl)、及び3−メチル−7−プロピニルイソカルボスチリル(3−methyl−7−isocarbostyrilyl)、7−アザインドリル、6−メチル−7−アザインドリル、イミジゾピリジニル、9−メチル−イミジゾピリジニル、ピロロピリジニル、イソカルボスチリル(isocarbostyrilyl)、7−プロピニルイソカルボスチリル(propynyl isocarbostyrilyl)、ピロピニル−7−アザインドリル、2,4,5−トリメチルフェニル、4−メチルインドリル、4,6−ジメチルインドリル、フェニル、ナフタレニル、アントラセニル、フェナントラセニル、ピレニル、スチルベンジル、テトラセニル、ペンタセニル、及びそれらの構造誘導体が挙げられる(Schweitzer et al., J. Org. Chem., 59:7238−7242 (1994); Berger et al., Nucleic Acids Research, 28(15):2911−2914 (2000); Moran et al., J. Am. Chem. Soc., 119:2056−2057 (1997); Morales et al., J. Am. Chem. Soc., 121:2323−2324 (1999); Guckian et al., J. Am. Chem. Soc., 118:8182−8183 (1996); Morales et al., J. Am. Chem. Soc., 122(6):1001−1007 (2000); McMinn et al., J. Am. Chem. Soc., 121:11585−11586 (1999); Guckian et al., J. Org. Chem., 63:9652−9656 (1998); Moran et al., Proc. Natl. Acad. Sci., 94:10506−10511 (1997); Das et al., J. Chem. Soc., Perkin Trans., 1:197−206 (2002); Shibata et al., J. Chem. Soc., Perkin Trans., 1: 1605−1611 (2001); Wu et al., J. Am. Chem. Soc., 122(32):7621−7632 (2000); O’Neill et al., J. Org. Chem., 67:5869−5875 (2002); Chaudhuri et al., J. Am. Chem. Soc., 117:10434−10442 (1995);及び米国特許第6,218,108号)。塩基類似体は、ユニバーサル塩基であってもよい。
本明細書で用いられる「ユニバーサル塩基」は、核酸二重鎖内に存在する場合には二重らせん構造(例えば、リン酸バックボーンの構造)を改変せずに1タイプを超える塩基と向き合って配置され得る、修飾ヌクレオチド内のヌクレオチド糖部分の1’位、またはヌクレオチド糖部分置換内の同等の位置にある複素環部分を指す。加えて、ユニバーサル塩基は、標的核酸に対して二重鎖を形成するように存在する一本鎖核酸の能力を破壊しない。標的核酸と二重鎖を形成するユニバーサル塩基を含む一本鎖核酸の能力は、当業者に明白な方法(例えば、UV吸収、円偏光二色性、ゲルシフト、一本鎖ヌクレアーゼ感受性など)によりアッセイすることができる。加えて、二重鎖形成が観察される条件、例えば温度は、融解温度(Tm)が核酸二重鎖の安定性と相関するために、二重鎖安定性または形成を計測するために変動され得る。標的核酸に厳密に相補性がある参照一本鎖核酸と比較すると、ユニバーサル塩基を含む一本鎖核酸は、相補性核酸を用いて形成された二重鎖よりも低いTmを有する標的核酸と二重鎖を形成する。しかしユニバーサル塩基が塩基と置換されて単一のミスマッチを生成する参照一本鎖核酸と比較すると、ユニバーサル塩基を含む一本鎖核酸は、ミスマッチ塩基を有する核酸を用いて形成された二重鎖よりも高いTmを有する標的核酸と二重鎖を形成する。
幾つかのユニバーサル塩基は、塩基対形成条件下で、ユニバーサル塩基と、塩基のグアニン(G)、シトシン(C)、アデニン(A)、チミン(T)、及びウラシル(U)の全てとの間に水素結合を形成することにより塩基対合ができる。ユニバーサル塩基は、1つだけの単一相補性塩基で塩基対を形成する塩基ではない。二重鎖では、ユニバーサル塩基は、二重鎖の逆鎖上の塩基と向き合うG、C、A、T、及びUそれぞれと水素結合を全く形成しないか、1つの水素結合を形成するか、または1つを超える水素結合を形成することができる。好ましくは、ユニバーサル塩基は、二重鎖の逆鎖上の塩基と向き合う塩基と相互作用しない。二重鎖では、ユニバーサル塩基間の塩基対合は、リン酸バックボーンの二重らせん構造を改変せずに生じる。ユニバーサル塩基は、スタッキング相互作用により同じ核酸鎖上の隣接するヌクレオチド内の塩基とも相互作用し得る。特にユニバーサル塩基が二重鎖の逆鎖上の塩基に向き合って配置された塩基と任意の水素結合を形成しない状況では、そのようなスタッキング相互作用は、二重鎖を安定化させる。ユニバーサル結合するヌクレオチドの非限定的例としては、イノシン、1−β−D−リボフラノシル−5−ニトロインドール、及び/または1−β−D−リボフラノシル−3−ニトロピロールが挙げられる(Quanyらへの米国特許出願公開第20070254362号;Van Aerschot et al., An acyclic 5−nitroindazole nucleoside analogue as ambiguous nucleoside. Nucleic Acids Res. 1995 Nov 11;23(21):4363−70; Loakes et al., 3−Nitropyrrole and 5−nitroindole as universal bases in primers for DNA sequencing and PCR. Nucleic Acids Res. 1995 Jul 11;23(13):2361−6; Loakes and Brown, 5−Nitroindole as an universal base analogue. Nucleic Acids Res. 1994 Oct 11;22(20):4039−43)。
本明細書で用いられる「ループ」は、特定の一本鎖ヌクレオチド領域に隣接する相補性領域が、相補性領域の間の一本鎖ヌクレオチド領域が二重鎖形成またはワトソン・クリック型塩基対合から除外されるようにハイブリダイズする、一本鎖の核酸により形成された構造を指す。ループは、任意の長さの一本鎖ヌクレオチド領域である。ループの例としては、ヘアピン、ステムループ、または伸長ループのような構造の中に存在する不対ヌクレオチドが挙げられる
本明細書で用いられる、dsRNAに関連する「伸長ループ」は、一本鎖ループと、それに加えてループに隣接する1、2、3、4、5、6または最大20の塩基対または二重鎖を指す。伸長されたループでは、5’側のループに隣接するヌクレオチドは、3’側のループに隣接するヌクレオチドと二重鎖を形成する。伸長ループは、ヘアピンまたはステムループを形成し得る。
本明細書で用いられる、dsRNAに関連する「テトラループ」は、隣接のワトソン・クリック型ハイブリダイズドヌクレオチドの安定性に寄与する安定した二次構造を形成する4つのヌクレオチドからなるループ(一本鎖領域)を指す。理論に限定されるわけではなく、テトラループは、スタッキング相互作用により隣接のワトソン・クリック型塩基対を安定化させることができる。加えて、テトラループ内の4つのヌクレオチド間の相互作用には、非ワトソン・クリック型塩基対合、スタッキング相互作用、水素結合、及び接触相互作用があるが、これらに限定されない(Cheong et al., Nature 1990 Aug 16;346(6285):680−2; Heus and Pardi, Science 1991 Jul 12;253(5016):191−4)。テトラループは、4つのランダム塩基からなる簡単なモデルループ配列から予測されるよりも高い隣接二重鎖の融解温度(Tm)の上昇を付与する。例えばテトラループは、少なくとも2塩基の長さの二重鎖を含むヘアピンに、10mM NaHPO4中での少なくとも55℃の融解温度を付与し得る。テトラループは、リボヌクレオチド、デオキシリボヌクレオチド、修飾ヌクレオチド、及びそれらの組み合わせを含み得る。RNAテトラループの例としては、テトラループのUNCGファミリー(例えば、UUCG)、テトラループのGNRAファミリー(例えば、GAAA)、及びCUUGテトラループが挙げられる。(Woese et al., Proc Natl Acad Sci U S A. 1990 Nov;87(21):8467−71; Antao et al., Nucleic Acids Res. 1991 Nov 11;19(21):5901−5)。DNAテトラループの例としては、テトラループのd(GNNA)ファミリー(例えば、d(GTTA)、テトラループのd(GNRA))ファミリー、テトラループのd(GNAB)ファミリー、テトラループのd(CNNG)ファミリー、テトラループのd(TNCG)ファミリー(例えば、d(TTCG))が挙げられる。(Nakano et al. Biochemistry, 41 (48), 14281 −14292, 2002.; SHINJI et al. 日本化学会講演予稿集第78 NO.2;p731 (2000).)
本明細書で用いられる「siRNA」という用語は、それぞれの鎖がRNA、RNA類似体(複数可)またはRNAとDNAを含む、二本鎖核酸を指す。siRNAは、19〜23のヌクレオチドを含むか、または21のヌクレオチドを含む。siRNAは、典型的にはsiRNA内の二重鎖領域が17〜21のヌクレオチド、または19のヌクレオチドを含むように、各鎖の3’末端に2bpのオーバーハングを有する。典型的にはsiRNAのアンチセンス鎖は、α1アンチトリプシン遺伝子/RNAの標的配列に十分に相補性がある。
第一の配列が、本明細書の第二の配列に関して「実質的に相補性がある」と呼ばれる場合、その2つの配列は、最終使用に最も関連する条件下でハイブリダイズする能力を保持しながら、完全に相補性であり得るか、またはそれらは、ハイブリダイゼーションの際に1つまたは複数、しかし一般には4、3、または2以下のミスマッチ塩基対を形成し得ない。しかし、2つのオリゴヌクレオチドが、ハイブリダイゼーションの際に1つまたは複数の一本鎖オーバーハングを形成するように設計されていれば、そのようなオーバーハングは、相補性の決定に関してミスマッチと見なされないであろう。例えば21ヌクレオチド長の一方のオリゴヌクレオチドと、23ヌクレオチド長の他方のオリゴヌクレオチドを含むdsRNAは、長いほうのオリゴヌクレオチドが短い方のオリゴヌクレオチドに完全に相補性がある21ヌクレオチドの配列を含む場合でも、本発明の目的では「完全に相補性」と呼ぶことができる。
本明細書で用いられる用語「二本鎖RNA」または「dsRNA」は、2つのアンチパラレルで先に定義された通り実質的に相補性がある核酸鎖を含む二重鎖構造を有するリボ核酸分子の複合体を指す。二重鎖構造を形成する2つの鎖は、1つのより大きなRNA分子の異なる部分であってもよく、またはそれらは、別個のRNA分子であってもよい。別個のRNA分子であれば、そのようなdsRNAは、多くの場合、siRNA(「低分子干渉RNA」)またはDsiRNA(「ダイサー基質siRNA」)と称される。2つの鎖がひとつのより大きな分子の一部であり、それゆえ、二重鎖構造を形成する一方の鎖の3’末端と各他方の鎖の5’末端の間の連続したヌクレオチド鎖により連結されている場合には、連結するRNA鎖は、「ヘアピンループ」、「小ヘアピンRNA」または「shRNA」と称される。2つの鎖が、二重鎖構造を形成する一方の鎖の3’末端と各他方の鎖の5’末端の間の連続したヌクレオチド鎖以外の手段により共有結合で連結される場合、連結する構造は、「リンカー」と称される。RNA鎖は、同一または異なる数のヌクレオチドを有し得る。塩基対の最大数は、dsRNAの最短鎖のヌクレオチド数から二重鎖内に存在する任意のオーバーハング数を引いた数である。二重鎖構造に加えて、dsRNAは、1つまたは複数のヌクレオチドオーバーハングを含み得る。加えて、本明細書で用いられる「dsRNA」は、複数のヌクレオチドに実質的な修飾を含み、本明細書に開示された、または当該技術分野で知られる全てのタイプの修飾を含む、リボヌクレオチド、インターヌクレオシド結合、末端基、キャップ、及びコンジュゲート部分への化学修飾を含み得る。siRNA型またはDsiRNA型分子中で用いられる任意のそのような修飾は、本明細書及び特許請求の範囲の目的では「dsRNA」に包含される。
「二重鎖領域」という表現は、相補性または実質的に相補性があるオリゴヌクレオチド鎖間の二重鎖を可能にするワトソン・クリック型塩基対合または他の様式のいずれかにより互いに塩基対を形成する、2つの相補性または実質的に相補性があるオリゴヌクレオチド内の領域を指す。例えば21のヌクレオチド単位を有するオリゴヌクレオチド鎖は、21のヌクレオチド単位の別のオリゴヌクレオチドと塩基対合し得るが、各鎖の19塩基だけが相補性または実質的に相補性があれば、「二重鎖領域」は19の塩基対からなる。残りの塩基対は、例えば5’及び3’オーバーハングとして存在し得る。さらに二重鎖領域内では、100%の相補性は必要とならず、実質的相補性が、二重鎖領域内で許容され得る。実質的相補性は、生物学的条件下でアニーリングが可能であるような鎖間の相補性を指す。2つの鎖が生物学的条件下でアニーリングが可能であるかどうかを経験的に決定する技法は、当該技術分野で周知である。あるいは2つの鎖を合成して、生物学的条件下で共に付加して、それらが互いにアニーリングするかどうかを決定することができる。
定義上、「十分に相補性がある」(例えば、「100%相補性」と対比させて)は、dsRNAがRNAi機構(例えば、RISC複合体)またはプロセスにより標的RNAの破壊を惹起するのに十分な相補性を有することを条件に、本発明のdsRNAと標的RNAまたはcDNA配列(例えば、α1アンチトリプシンmRNA)の間に存在する1つまたは複数のミスマッチを可能にする。ある特定の実施形態において、本発明の「十分に相補性がある」dsRNAは、dsRNA配列と標的RNAまたはcDNA配列の間に1、2、3または4またはそれを超えるミスマッチを抱えること可能である(例えば、特定のそのような実施形態において、dsRNAのアンチセンス鎖は、標的RNAまたはcDNA配列とアライメントされた場合に1、2、3、4、5または6またはそれを超えるミスマッチを抱える)。本発明の特定のdsRNA内のそのようなミスマッチの好ましい位置のさらなる検討は、以下により詳細に検討される。
本明細書で用いられる「DsiRNAmm」は、DsiRNAのセンス及びアンチセンス鎖により形成された二重鎖の1、2、3または4のミスマッチ塩基対を含む「ミスマッチ耐性領域」を有するDsiRNAを指し、そのようなミスマッチがDsiRNAのどちらかの末端の2つの末端塩基対の間に存在する(つまり、それを含まない)位置(複数可)のDsiRNA内に配置されている。DsiRNAmm組成物の例示的形態の構造及びミスマッチ配置を、以下により詳細に記載する。
多数の塩基で塩基対合する一本鎖核酸は、「ハイブリダイズする」と言われる。ハイブリダイゼーションは、典型的には生理学的または生物学的に適切な条件下(例えば、細胞内ではpH7.2、140mMカリウムイオン;細胞外ではpH7.4、145mMナトリウムイオン)で計測される。ハイブリダイゼーション条件は、一般に、一価カチオン及び生物学的に許容し得る緩衝剤を含み、二価カチオン、複合体アニオン、例えばグルコン酸カリウムのグルコン酸イオン、スクロースなどの非電荷種、及び試料中の水の活性を低下させる不活性ポリマー、例えばPEGを含んでいても、または含んでいなくてもよい。そのような条件は、塩基対が形成し得る条件を包含する。
ハイブリダイゼーションは、二重鎖を形成している一本鎖核酸を解離するのに必要とされる温度、即ち、(融解温度:Tm)により測定される。ハイブリダイゼーション条件は、塩基対が形成し得る条件でもある、様々なストリンジェンシーの条件を用いて、ハイブリダイゼーションを計測することができる(例えば、Wahl, G. M. and S. L. Berger (1987) Methods Enzymol. 152:399; Kimmel, A. R. (1987) Methods Enzymol. 152:507参照)。ストリンジェントな温度条件は、通常、少なくとも約30℃、より好ましくは少なくとも約37℃、最も好ましくは少なくとも約42℃の温度を含むであろう。50塩基対長未満であると予期されるハイブリッドのハイブリダイゼーション温度は、ハイブリッドの融解温度(Tm)よりも5〜10℃低くなければならず、ここでTmは、以下の式に従って計測される。18塩基対長未満のハイブリッドでは、Tm(℃)=2(A塩基+T塩基の数)+4(G塩基+C塩基の数)。18〜49塩基対長のハイブリッドでは、Tm(℃)=81.5+16.6(log10[Na+])+0.41(%G+C)−(600/N)であり、ここでNは、ハイブリッド内の塩基の数であり、[Na+]は、ハイブリダイゼーション緩衝液中のナトリウムイオンの濃度である(1×SSCでの[Na+]=0.165M)。例えばハイブリダイゼーション計測緩衝液を、表1に示す。
ハイブリダイゼーション条件の有用な変形は、当業者に容易に明白となろう。ハイブリダイゼーション技術は、当業者に周知であり、例えばBenton and Davis (Science 196:180, 1977); Grunstein and Hogness (Proc. Natl. Acad. Sci., USA 72:3961, 1975); Ausubel et al. (Current Protocols in Molecular Biology, Wiley Interscience, New York, 2001); Berger and Kimmel (Antisense to Molecular Cloning Techniques, 1987, Academic Press, New York);及びSambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, New Yorkに記載される。
本明細書で用いられる「オリゴヌクレオチド鎖」は、一本鎖核酸分子である。オリゴヌクレオチドは、リボヌクレオチド、デオキシリボヌクレオチド、修飾ヌクレオチド(例えば、2’ 修飾を有するヌクレオチド、合成塩基類似体など)またはそれらの組み合わせを含み得る。そのような修飾オリゴヌクレオチドは、例えば細胞内取込みの増加及びヌクレアーゼ存在下での安定性上昇などの特性により自然形態よりも好ましくあり得る。
本明細書で用いられる「リボヌクレオチド」という用語は、天然及び合成の非修飾及び修飾リボヌクレオチドを包含する。修飾には、オリゴヌクレオチド内の糖部分への変化、塩基部分への変化及び/またはリボヌクレオチド間の結合への変化がある。本明細書で用いられる「リボヌクレオチド」という用語は専ら、2’リボース環位置に単一プロトン基を有するヌクレオチドであるデオキシリボヌクレオチドを排除する。
本明細書で用いられる「デオキシリボヌクレオチド」という用語は、天然及び合成の非修飾及び修飾デオキシリボヌクレオチドを包含する。修飾には、オリゴヌクレオチド内の糖部分への変化、塩基部分への変化及び/またはデオキシリボヌクレオチド間の結合への変化がある。本明細書で用いられる「デオキシリボヌクレオチド」という用語は、dsRNA剤のダイサー切断が可能でない修飾リボヌクレオチド、例えばダイサー切断により残基の結合を生じることが可能でない2’−O−メチルリボヌクレオチド、ホスホロチオアート修飾リボヌクレオチド残基なども包含する。
本明細書で用いられる「PS−NA」という用語は、ホスホロチオアート修飾ヌクレオチド残基を指す。それゆえ「PS−NA」という用語は、ホスホロチオアート修飾リボヌクレオチド(「PS−RNA」)とホスホロチオアート修飾デオキシリボヌクレオチド(「PS−DNA」)の両方を包含する。
本明細書で用いられる「ダイサー」は、dsRNAまたはdsRNA含有分子、例えば二本鎖RNA(dsRNA)またはプレマイクロRNA(miRNA)を、通常は3’末端に二塩基オーバーハングを有する、19〜25ヌクレオチド長の二本鎖核酸フラグメントに切断するRNaseIIIファミリー内のエンドリボヌクレアーゼを指す。本発明の特定のdsRNA(例えば、「DsiRNA」)に関して、本発明の薬剤のdsRNA領域により形成される二重鎖は、ダイサーにより認識され、該二重鎖の少なくとも1つの鎖上のダイサー基質である。ダイサーは、RNA干渉経路の最初のステップを触媒し、その結果、標的RNAの分解をもたらす。ヒトダイサーのタンパク質配列は、参照により本明細書に取り込まれる登録番号NP_085124号の下、NCBIデータベースで提供される。
ダイサー「切断」は、以下の通り計測することができる(例えば、Collingwood et al., Oligonucleotides 18:187−200 (2008)参照)。ダイサー切断アッセイにおいて、RNA二重鎖(100pmol)を、20mMトリスpH8.0、200mM NaCl、2.5mM MgCl2の20μLを、1単位の組換えヒトダイサー(ストラタジーン、カリフォルニア州ラホヤ所在)と共に、またはそれを含まずに、37℃で18〜24時間インキュベートする。パフォーマSR(Performa SR)96ウェルプレート(エッジ・バイオシステムズ、メリーランド州ゲイザースバーグ所在)を用いて、試料を脱塩する。ダイサー処理前及び処理後に二重鎖RNAのエレクトロスプレーイオン化液体クロマトグラフィー質量分析(ESI−LCMS)を、サーモフィニガンTSQ7000、エクスキャリバー(Xcalibur)データシステム、プロマス(ProMass)データ処理ソフトウエア及びパラダイムMS4 HPLC(ミクロム・バイオリソーシズ、カリフォルニア州オーバーン所在)からなるオリゴHTCSシステム(ノバティア(Novatia)、ニュージャージー州プリンストン所在;Hail et al., 2004)を用いて実施する。このアッセイにおいて、ダイサー切断が起こり、ダイサー基質dsRNA(即ち、25〜30bp dsRNA、好ましくは26〜30bp dsRNA)の少なくとも5%、10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、95%または100%が、より短いdsRNA(即ち、19〜23bp dsRNA、好ましくは21〜23bp dsRNA)に切断される。
本明細書で用いられる「ダイサー切断部位」は、ダイサーがdsRNAを切断する部位(例えば、本発明のDsiRNA剤のdsRNA領域)を指す。ダイサーは、典型的にはdsRNAのセンス及びアンチセンス鎖の両方を切断する2つのRNaseIIIドメインを含む。RNaseIIIドメインとPAZドメインとの平均距離が、生成する短い二本鎖核酸フラグメントの長さを決定し、この距離は変動し得る(Macrae et al. (2006) Science 311: 195−8)。図1に示される通り、ダイサーは、アンチセンス鎖の3’末端から除去される21番目のヌクレオチドと22番目のヌクレオチドの間の一部位と、センス鎖の5’末端から除去される21番目のヌクレオチドと22番目のヌクレオチドの間の対応する部位と、にある2ヌクレオチドの3’オーバーハングを有するアンチセンス鎖を有する本発明の特定の二本鎖リボ核酸を切断すると予測される。図1に示されたものとは異なるdsRNA分子の予測された、そして/または優先的なダイサー切断部位(複数可)は、Macraeらに記載されたものなど、技術的に認識された方法により同様に特定され得る。図1に示されたダイサー切断事象は、21ヌクレオチドsiRNAを生成するが、dsRNA(例えば、DsiRNA)のダイサー切断が、19〜23ヌクレオチド長のダイサー処理されたsiRNA長を生成し得ることが注目される。実際に、ある特定の実施形態において、二本鎖DNA領域は、21量体よりもむしろ典型的には非好適な19量体または20量体siRNAの優先的ダイサー切除を指示する目的で、dsRNA内に含まれ得る。
ある特定の実施形態において、本発明のdsRNAは、ダイサー基質siRNA(「DsiRNA」)である。DsiRNAは、ダイサー基質でない阻害性核酸(「非DsiRNA」)に比較して特定の利点を有し得る。そのような利点としては、各阻害核酸が同じ濃度の哺乳動物細胞の阻害活性に向けて適切に配合及び評価された場合に、非DsiRNAに比較した場合のDsiRNAによる効果期間の増加、及び非DsiRNA(例えば、19〜23量体 siRNA)に比較した場合のDsiRNAによる阻害活性の上昇が挙げられるが、これらに限定されない(後者のシナリオでは、DsiRNAは、非DsiRNAよりも効力があると特定されるであろう)。非DsiRNAに比較したDsiRNAの能力増強の検出は、多くの場合、標的RNA(例えば、mRNA)へおよそ30〜70%のノックダウン活性を誘発するDsiRNAをもたらす配合濃度(例えば、dsRNAのトランスフェクション濃度)で最も容易に実現される。活性DsiRNAでは、そのようなレベルのノックダウン活性は、最も多くの場合、適切に配合された1nM以下のインビトロ哺乳動物細胞DsiRNAトランスフェクション濃度で実現され、ある特定の例において、200pM以下、100pM以下、50pM以下、20pM以下、10pM以下、5pM以下、または1pM以下のDsiRNAトランスフェクション濃度で観察される。実際に、標的RNAの30〜70%ノックダウンが観察される正確な濃度のDsiRNA間の変動性により、有効濃度範囲でDsiRNA及び非DsiRNAの阻害活性を評価することによるIC50曲線の構成が、非DsiRNA阻害剤に比較したDsiRNAの能力増強を検出する好ましい方法である。
本明細書で用いられる「オーバーハング」は、dsRNAの5’末端または3’末端に1または複数の自由末端を有する二重鎖の状況での不対合ヌクレオチドを指す。ある特定の実施形態において、オーバーハングは、アンチセンス鎖またはセンス鎖上の3’または5’オーバーハングである。幾つかの実施形態において、オーバーハングは、1〜6ヌクレオチド、任意で1〜5、1〜4、1〜3、1〜2、2〜6、2〜5、2〜4、2〜3、3〜6、3〜5、3〜4、4〜6、4〜5、5〜6ヌクレオチド、または1、2、3、4、5もしくは6ヌクレオチドの長さを有する3’オーバーハングである。「平滑」または「平滑末端」は、dsRNAのそのような末端に不対合ヌクレオチドを有さないこと、即ちヌクレオチドオーバーハングを有さないことを意味する。明瞭にするために、siRNAの3’末端または5’末端にコンジュゲートされた化学的キャップまたは非ヌクレオチド化学部分は、siRNAがオーバーハングを有するか、または平滑末端であるかを決定する上では考慮されない。ある特定の実施形態において、本発明は、細胞内または哺乳動物体内のα1アンチトリプシン標的遺伝子の発現を阻害するdsRNA分子であって、該dsRNAが、α1アンチトリプシン標的遺伝子の発現において形成されたmRNAの少なくとも一部に相補性がある相補性の領域を含むアンチセンス鎖を含み、該相補性の領域が、35ヌクレオチド長未満、任意で19〜24ヌクレオチド長、または25〜30ヌクレオチド長であり、該dsRNAが、α1アンチトリプシン標的遺伝子を発現する細胞と接触すると、α1アンチトリプシン標的遺伝子の発現を少なくとも10%、25%、または40%阻害する、該dsRN分子を提供する。
本明細書で用いられる用語「RNAプロセシング」は、以下により詳細に記載される、siRNA、miRNA、またはRNase H経路の成分(例えば、ドローシャ、ダイサー、アルゴノート2または他のRISCエンドリボヌクレアーゼ、及びRNase H)により実施されるプロセシング活性を指す(以下の「RNAプロセシング」の節を参照)。この用語は、非RISCまたは非RNase H媒介プロセスを通したRNAの5’キャッピング及びRNA分解の転写後プロセスと明白に識別される。そのようなRNAの「分解」は、いくつかの形態、例えば複数のエンド−またはエキソ−ヌクレアーゼ(例えば、RNaseIII、RNase P、RNase T1、RNase A(1、2、3、4/5)、オリゴヌクレオチダーゼなど)の1つまたは複数によるRNA本体の一部または全ての脱アデニル化(3’ポリ(A)テールの除去)及び/またはヌクレアーゼ消化で実施することができる。
「相同配列」は、遺伝子、遺伝子転写産物及び/または非コーディングポリヌクレオチドなどの1種または複数のポリヌクレオチド配列により共有されるヌクレオチド配列を意味する。例えば相同配列は、関連するが異なるタンパク質をコードする2つ以上の遺伝子、例えば遺伝子ファミリーの異なるメンバー、異なるタンパク質エピトープ、異なるタンパク質アイソフォーム、または完全に異なる遺伝子、例えばサイトカイン及びその対応するレセプターなどにより共有されるヌクレオチド配列であり得る。相同配列は、非コーディングDNAまたはRNA、調節配列、イントロン、及び転写制御または調節の部位などの2つ以上の非コーディングポリヌクレオチドにより共有されたヌクレオチド配列であり得る。相同配列は、1を超えるポリヌクレオチド配列により共有された保存配列領域も含み得る。部分的に相同性の配列もまた本発明により企図されるので(例えば、99%、98%、97%、96%、95%、94%、93%、92%、91%、90%、89%、88%、87%、86%、85%、84%、83%、82%、81%、80など)、相同性が完全な相同性(例えば、100%)である必要はない。実際に、本発明のdsRNA剤の設計及び使用は、本明細書に記載されたdsRNAと完全な相補性を有するα1アンチトリプシンの標的RNAに対してのみならず、例えば99%、98%、97%、96%、95%、94%、93%、92%、91%、90%、89%、88%、87%、86%、85%、84%、83%、82%、81%、80%などでも前記dsRNAに対して相補性がある配列を有する標的α1アンチトリプシンRNAに対しても、そのようなdsRNA剤を用いることの可能性を企図する。同様に、本明細書に記載された本発明のdsRNA剤が、当業者により容易に改変されて、例えばα1アンチトリプシンの特定の対立遺伝子バリアント(例えば、治療的関心の高い対立遺伝子)の、前記dsRNA剤と標的α1アンチトリプシンRNAとの相補性の程度を上昇させ得ることが企図される。実際に、標的α1アンチトリプシン配列に対して挿入、欠失、及び単一点突然変異を含むdsRNA剤配列もまた、阻害に効果的になり得る。あるいはヌクレオチドアナログの置換または挿入を含むdsRNA剤配列が、阻害に効果的になり得る。
配列同一性は、当該技術分野で知られる配列比較及びアライメントアルゴリズムにより計測することができる。2つの核酸配列(または2つのアミノ酸配列)の同一性%を計測するために、配列を比較目的でアライメントする(例えば、最適なアライメントのために第一の配列または第二の配列にギャップを導入することができる)。対応するヌクレオチド(またはアミノ酸)位置のヌクレオチド(またはアミノ酸残基)を、その後、比較する。第一の配列のある位置が、第二の配列の対応する位置と同じ残基で占有されていれば、その分子はその位置で同一である。2つの配列間の同一性%は、それらの配列が共有する同一位置の数の関数であり(即ち、相同性%=同一位置の数/位置の総数×100)、任意で、導入されたギャップの数及び/または導入されたギャップの長さに合わせてそのスコアを減数する。
2つの配列間の配列比較及び同一性%計測は、数学的アルゴリズムを利用して完遂することができる。一実施形態において、アライメントが、十分な同一性を有するようにアライメントされた配列の特定部分で生成したが、低い同一性を有する部分では生成されなかった(即ち、ローカルアライメント)。配列比較のために用いられるローカルアライメントアルゴリズムの好ましい非限定的例は、Karlin and Altschul (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:5873−77にあるように改良されたKarlin and Altschul (1990) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87:2264−68のアルゴリズムである。そのようなアルゴリズムは、Altschul, et al. (1990) J. Mol. Biol. 215:403−10のBLASTプログラム(バージョン2.0)に組み込まれている。
別の実施形態、すなわちギャップアライメントにおいて、アライメントは、適当なギャップを導入することにより最適化され、同一性%は、アライメントされた配列(すなあわち、ギャップアライメント)の長さについて計測される。比較目的でギャップアライメントを得るために、ギャップのあるBLASTを、Altschul et al., (1997) Nucleic Acids Res. 25(17):3389−3402に記載された通り利用することができる。別の実施形態、すなわちグローバルアライメントにおいて、アライメントは、適当なギャップを導入することにより最適化され、同一性%は、アライメントされた配列の全長について計測される(即ち、グローバルアライメント)。配列の全体的比較に用いられる数学的アルゴリズムの好ましい非限定的例は、Myers and Miller, CABIOS (1989)のアルゴリズムである。そのようなアルゴリズムは、GCG配列アライメントソフトウエアパッケージの一部であるALIGNプログラム(バージョン2.0)に組み込まれている。アミノ酸配列を比較するのにALIGNプログラムを利用する場合、PAM120重量残基表(PAM120 weight residue table)、12のギャップ長ペナルティ、及び4のギャップペナルティを用いることができる。
dsRNAアンチセンス鎖とα1アンチトリプシンRNA配列の部分の間には、80%を超える配列同一性、例えば80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%またはさらには100%の配列同一性が好ましい。あるいはdsRNAは、α1アンチトリプシンRNAの一部とハイブリダイズすること(例えば、400mM NaCl、40mM PIPES pH6.4、1mM EDTA、50℃または70℃で12〜16時間ハイブリダイゼーションした後、洗浄)が可能なヌクレオチド配列(またはオリゴヌクレオチド配列)として機能的に定義され得る。追加の好ましいハイブリダイゼーション条件は、1×SSC中で70℃、もしくは1×SSC、50%ホルムアルデヒド中で50℃でハイブリダイゼーションした後、0.3×SSC中で70℃で洗浄するか、または4×SSC中で70℃、もしくは4×SSC、50%ホルムアルデヒド中で50℃でハイブリダイゼーションした後、1×SSC中で67℃で洗浄することを含む。50塩基対長未満であることが予期されるハイブリッドの場合のハイブリダイゼーション温度は、ハイブリッドの融解温度(Tm)よりも5〜10℃低くなければならず、Tmは、以下の式により決定される。18塩基対長未満のハイブリッドでは、Tm(℃)=2(A+T塩基の数)+4(G+C塩基の数)。18〜49塩基対長のハイブリッドでは、Tm(℃)=81.5+16.6(log10[Na+])+0.41(%G+C)−(600/N)であり、ここでNは、ハイブリッド内の塩基の数であり、[Na+]は、ハイブリダイゼーション緩衝液中のナトリウムイオンの濃度である(1×SSCでの[Na+]=0.165M)。ポリヌクレオチドハイブリダイゼーションのストリンジェンシーな条件の追加の例は、Sambrook, J., E. F. Fritsch, and T. Maniatis, 1989, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y., chapters 9 and 11、ならびにCurrent Protocols in Molecular Biology, 1995, F. M. Ausubel et al., eds., John Wiley & Sons, Inc., sections 2.10及び6.3−6.4に示されている。同一ヌクレオチド配列の長さは、少なくとも10、12、15、17、20、22、25、27または30塩基であり得る。
「保存された配列領域」は、ポリヌクレオチド内の1つまたは複数の領域のヌクレオチド配列が作製の間で、または1つの生体系、対象もしくは生物体と別の生体系、対象もしくは生物体の間で有意に変動しないことを意味する。ポリヌクレオチドは、コーディングDNA及びRNAと非コーディングDNA及びRNAの両方を含み得る。
「センス領域」は、dsRNA分子のアンチセンス領域への相補性を有するdsRNA分子のヌクレオチド配列を意味する。加えて、dsRNA分子のセンス領域は、標的核酸配列と相同性を有する核酸配列を含み得る。
「アンチセンス領域」は、標的核酸配列への相補性を有するdsRNA分子のヌクレオチド配列を意味する。加えて、dsRNA分子のアンチセンス領域は、dsRNA分子のセンス領域への相補性を有する核酸配列を含む。
本明細書で用いられる「アンチセンス鎖」は、標的RNAの配列に相補性がある配列を有する一本鎖核酸分子を指す。アンチセンス鎖が、塩基類似体を有する修飾ヌクレオチドを含む場合、それは、必ずしも全長で相補性があるわけでないが、少なくとも標的RNAとハイブリダイズしなければならない。
本明細書で用いられる「センス鎖」は、アンチセンス鎖の配列に相補性がある配列を有する一本鎖核酸分子を指す。アンチセンス鎖が、塩基類似体を有する修飾ヌクレオチドを含む場合、センス鎖は、アンチセンス鎖の全長で相補性がある必要はないが、少なくともアンチセンス鎖と二重鎖を形成しなければならない。
本明細書で用いられる「ガイド鎖」は、標的RNAの配列に対して十分に相補性がある配列を有し、RNA干渉をもたらすdsRNAまたはdsRNA含有分子の一本鎖核酸分子を指す。ダイサーによるdsRNAまたはdsRNA含有分子の切断後に、ガイド鎖のフラグメントが、RISCと会合されたままで、RISC複合体の成分として標的RNAに結合し、RISCによる標的RNAの切断を促進する。本明細書で用いられるガイド鎖は、必ずしも連続する一本鎖核酸を指すわけでなく、好ましくはダイサーにより切断された部位に、不連続性を含み得る。ガイド鎖は、アンチセンス鎖である。
本明細書における「パッセンジャー鎖」は、ガイド鎖の配列に相補性がある配列を有するdsRNAまたはdsRNA含有分子のオリゴヌクレオチド鎖を指す。本明細書で用いられるパッセンジャー鎖は、必ずしも連続する一本鎖核酸を指すわけでなく、好ましくはダイサーにより切断された部位に、不連続性を含み得る。パッセンジャー鎖は、センス鎖である。
「標的核酸」は、発現、レベルまたは活性が調節される核酸配列を意味する。標的核酸は、DNAまたはRNAであり得る。α1アンチトリプシンを標的とする薬剤では、ある特定の実施形態において、該標的核酸は、α1アンチトリプシンRNAであり、例えばある特定の実施形態において、α1アンチトリプシンmRNAである。α1アンチトリプシンRNAの標的部位は、互換的に対応するcDNA配列によっても参照され得る。α1アンチトリプシンのレベルは、α1アンチトリプシンの上流エフェクターを標的とすることを通して、標的とすることができ、または調節もしくは誤制御されたα1アンチトリプシンの影響は、α1アンチトリプシンシグナル伝達経路におけるα1アンチトリプシンの下流分子の標的化により調節することもできる。
「相補性」は、ある核酸が伝統的なワトソン・クリック型または他の非従来タイプのいずれかにより別の核酸配列と水素結合(複数可)を形成し得ることを意味する。本発明の核酸分子に関連して、核酸分子とその相補性配列との結合自由エネルギーは、核酸の関連機能、例えばRNAi活性を進行させるのに十分である。核酸分子の結合自由エネルギーの計測は、当該技術分野で周知である(例えば、Turner et al., 1987, CSH Symp. Quant. Biol. LII pp. 123−133; Frier et al., 1986, Proc. Nat. Acad. Sci. USA 83:9373−9377; Turner et al., 1987, J. Am. Chem. Soc. 109:3783−3785参照)。相補性%は、第二の核酸配列と水素結合(例えば、ワトソン・クリック型塩基対合)を形成し得る核酸分子内の隣接残基の%率を示す(例えば、10ヌクレオチドを有する第二の核酸配列に塩基対合している第一のオリゴヌクレオチド内の合計10ヌクレオチドのうち5、6、7、8、9、または10ヌクレオチドは、それぞれ50%、60%、70%、80%、90%、及び100%の相補性を表す)。「完全に相補性がある」は、核酸配列の隣接残基の全てが、第二の核酸配列内の隣接残基の同数と水素結合することを意味する。一実施形態において、本発明のdsRNA分子は、1つまたは複数の標的核酸分子またはその一部に相補性がある19〜30(例えば、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、または30またはそれを超える)ヌクレオチドを含む。
本明細書で用いられる、標的RNAまたはcDNA配列(例えば、α1アンチトリプシンmRNA)に対して「十分に相補性がある」配列を有するdsRNA、例えばDsiRNAまたはsiRNAは、そのdsRNAがRNAi機構(例えば、RISC複合体)またはプロセスによる標的RNA(cDNAが引用される場合には、引用されたcDNA配列に対応するRNA配列)の破壊を惹起するのに十分な配列を有することを意味する。例えばRNAi機構もしくはプロセスによる標的RNAの破壊を惹起する標的RNAもしくはcDNA配列に対して「十分に相補性がある」dsRNAは、dsRNA活性の適当なアッセイ(例えば、以下の実施例2に記載されたインビトロアッセイ)において標的RNAレベルの検出可能な低下を誘発するdsRNAとして特定され得、またはさらなる例において、RNAi機構もしくはプロセスによる標的RNAの破壊を惹起する標的RNAもしくはcDNA配列に十分に相補性があるdsRNAは、dsRNA活性の適当なアッセイにおいて標的RNAレベルの少なくとも5%、少なくとも10%、少なくとも15%、少なくとも20%、少なくとも25%、少なくとも30%、少なくとも35%、少なくとも40%、少なくとも45%、少なくとも50%、少なくとも55%、少なくとも60%、少なくとも65%、少なくとも70%、少なくとも75%、少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも98%、もしくは少なくとも99%の低下を生じるdsRNAとして特定され得る。追加の例において、RNAi機構またはプロセスによる標的RNAの破壊を惹起する標的RNAまたはcDNA配列に十分に相補性があるdsRNAは、細胞または生物体における標的RNAまたはタンパク質レベルに関連して特定レベルの阻害活性の期間の評価に基づいて特定され得る。例えばRNAi機構またはプロセスによる標的RNAの破壊を惹起する標的RNAまたはcDNA配列に十分に相補性があるdsRNAは、標的mRNAレベルを、細胞または生物体への前記dsRNAの投与後少なくとも48時間少なくとも20%低下させることができるdsRNAとして特定され得る。好ましくはRNAi機構またはプロセスによる標的RNAの破壊を惹起する標的RNAまたはcDNA配列に十分に相補性があるdsRNAは、標的mRNAレベルを、細胞もしくは生物体への前記dsRNAの投与後少なくとも72時間少なくとも40%、細胞もしくは生物体への前記dsRNAの投与後少なくとも4日、5日もしくは7日間少なくとも40%、細胞もしくは生物体への前記dsRNAの投与後少なくとも48時間少なくとも50%、細胞もしくは生物体への前記dsRNAの投与後少なくとも72時間少なくとも50%、細胞もしくは生物体への前記dsRNAの投与後少なくとも4日、5日もしくは7日間少なくとも50%、細胞もしくは生物体への前記dsRNAの投与後少なくとも48時間少なくとも80%、細胞もしくは生物体への前記dsRNAの投与後少なくとも72時間少なくとも80%、または細胞もしくは生物体への前記dsRNAの投与後少なくとも4日、5日もしくは7日間少なくとも80%低下させることが可能なdsRNAとして特定される。
ある特定の実施形態において、本発明の核酸(例えば、DsiRNAまたはsiRNA)は、標的RNAまたはcDNA配列に「ハイブリダイズするのに十分に相補性がある」配列を有し、それにより標的RNAへの阻害作用を実現する。ハイブリダイゼーション、及び1つの核酸が別の核酸に対して十分に相補性があることでそれら2つの配列をハイブリダイズさせることが可能であるかを決定するために利用可能な条件を、以下により詳細に記載する。
本明細書で用いられる「細胞」は、通常の生物学的意味で用いられ、多細胞生物全体を指さず、例えば具体的にヒトは指さない。細胞は、生物体、例えば鳥類、植物、ならびに哺乳動物、例えばヒト、ウシ、ヒツジ、類人猿、サル、ブタ、イヌ、及びネコの体内に存在し得る。該細胞は、原核生物(例えば、細菌細胞)または真核生物(例えば、哺乳動物または植物の細胞)のものであり得る。該細胞は、全能性または多能性で分裂または非分裂の体細胞または生殖細胞株のものであり得る。該細胞は、配偶子もしくは胎芽、幹細胞、または完全に分化した細胞に由来することもでき、あるいはそれを含むことができる。ある特定の態様において、「細胞」という用語は、具体的には本開示の1つまたは複数のdsRNA分子を含む哺乳動物細胞、例えばヒト細胞を指す。特定の態様において、細胞は、dsRNAまたはdsRNA含有分子を処理して標的核酸のRNA干渉をもたらし、RNAiに必要なタンパク質及びタンパク質複合体、例えばダイサー及びRISCを含む。
「RNA」は、少なくとも1、好ましくは少なくとも4、8及び12のリボヌクレオチド残基を含む分子を意味する。少なくとも4、8または12のRNA残基は、隣接し得る。「リボヌクレオチド」は、β−D−リボフラノース部分の2’位にヒドロキシル基を有するヌクレオチドを意味する。この用語は、二本鎖RNA、一本鎖RNA、部分的に精製されたRNA,本質的に純粋なRNA、合成RNA、組換え技術で生成されたRNA、ならびに1つまたは複数のヌクレオチドの付加、置換及び/または改変により天然由来RNAとは異なる改変RNAなどのRNAを包含する。そのような改変は、例えばRNAの1つまたは複数のヌクレオチドの、dsRNAの末端(複数可)または内部などへの非ヌクレオチド物質の付加を包含し得る。本発明のRNA分子内のヌクレオチドは、非天然由来ヌクレオチドまたは化学合成されたヌクレオチドもしくはデオキシヌクレオチドなどの非標準的なヌクレオチドも含み得る。これらの改変されたRNAは、類似体、または天然由来RNAの類似体と呼ぶことができる。
ある特定の実施形態において、本発明のRNAi剤(例えば、dsRNA)は、「単離された」RNAi剤であり得、該RNAi剤が自然環境から単離(除去及び/または精製)されることを意味する。
幾つかの実施形態において、本発明のRNAi剤(例えば、dsRNA)は、「合成」RNAi剤であり得る。「合成」または「非天然」という用語は、(i)機械を用いて合成されるか、または(ii)通常通りRNAi剤を産生する細胞もしくは生物体に由来しない、RNAi剤(例えば、本開示のdsRNA)を指す。
「対象」は、移植細胞のドナーもしくはレシピエントである生物体、またはそれらの細胞自体を意味する。「対象」は、本発明のdsRNA剤が投与され得る生物体も指す。対象は、ヒトまたはヒト細胞をはじめとする哺乳動物または哺乳動物細胞であり得る。
「医薬的に許容し得る担体」という表現は、治療剤の投与のための担体を指す。例示的担体としては、生理食塩水、緩衝生理食塩水、デキストロース、水、グリセロール、エタノール、及びそれらの組み合わせが挙げられる。経口投与される薬物では、医薬的に許容し得る担体としては、不活性希釈剤、崩壊剤、結合剤、滑沢剤、甘味剤、香味剤、着色剤及び防腐剤などの医薬的に許容し得る賦形剤が挙げられるが、これらに限定されない。適切な不活性希釈剤としては、炭酸ナトリウム及び炭酸カルシウム、リン酸ナトリウム及びリン酸カルシウム、ならびにラクトースが挙げられ、コーンスターチ及びアルギン酸が、適切な崩壊剤である。結合剤としては、デンプン及びゼラチンを挙げることができ、滑沢剤は、存在するならば、一般にはステアリン酸マグネシウム、ステアリン酸またはタルクであろう。所望なら錠剤は、胃腸管での吸収を遅延させるために、モノステアリン酸グリセリルまたは除ステアリン酸グリセリルなどの材料でコーティングされていてもよい。開示されたdsRNA組成物の医薬的に許容し得る担体は、リポソーム、カプシド、カプソイド、ポリマーナノカプセル、またはポリマーマイクロカプセルなどのミセル構造であり得る。
ポリマーナノカプセルまたはマイクロカプセルは、細胞内へのカプセル化または結合されたdsRNAの輸送及び放出を容易にする。それらは、特にポリブチルシアノアクリラートをはじめとする、ポリマー及びモノマー材料を包含する。材料及び作製方法の概要は、公表されている(Kreuter, 1991参照)。重合/ナノ粒子生成ステップにおいてモノマー及び/またはオリゴマー前駆体から形成されるポリマー材料は、それ自体が先行技術から公知であり、ナノ粒子製造の分野の当業者が通常の技能により適切に選択し得るポリマー材料の分子量及び分子量分布も同様に公知である。
「インビトロ」という用語は、当該技術分野で認識された意味を有し、例えば精製された試薬または抽出物、例えば細胞抽出物などが関与する。「インビボ」という用語もまた、当該技術分野で認識された意味を有し、例えば生存している細胞、例えば不死化細胞、初代細胞、細胞株、及び/または生物体内の細胞などが関与する。
本明細書で用いられる「処置」または「処置すること」は、疾患もしくは障害、または疾患もしくは障害の症状を治癒、療養、軽減、緩和、改変、矯正、寛解、改善する、またはそれらに影響を与えることを目的として、障害を有する患者への治療剤(例えば、dsRNA剤、またはそれをコードするベクターもしくはトランスジーン)の適用もしくは投与、または患者から単離された組織または細胞株への治療剤の適用もしくは投与として定義される。「処置」または「処置すること」という用語は、薬剤を予防的に投与することに関連しても本明細書で用いられる。「有効用量」または「有効投与量」という用語は、所望の効果を実行する、または少なくとも部分的に実行するのに十分な量として定義される。「治療有効用量」という用語は、該疾患に既に罹患している患者の該疾患及びその合併症を治癒または少なくとも部分的に停止させるのに十分な量として定義される。「患者」という用語は、予防的または治療的処置のいずれかを受けるヒト及び他の哺乳動物対象を包含する。
本発明の様々な手法は、値、レベル、特色、特徴、特性などを、本明細書で互換的に「適当な対照」と称される「適切な対照」と比較することを含む少なくとも1つのステップを含む。「適切な対照」または「適当な対照」は、比較目的で有用である、当業者に熟知された対照または標準である。一実施形態において、「適切な対照」または「適当な対照」は、本明細書に記載されたRNAi方法論を実施する前に計測される値、レベル、特色、特徴、特性などである。例えば、細胞または生物体への本発明のRNAサイレンシング剤(例えば、DsiRNA)を導入する前に、転写速度、mRNAレベル、翻訳速度、タンパク質レベル、生物学的活性、細胞の特徴または特性、遺伝子型、表現型などを計測することができる。別の実施形態において、「適切な対照」または「適当な対照」は、例えば正常な形質を示す、細胞または生物体、例えば対照または正常細胞もしくは生物体において決定される値、レベル、特色、特徴、特性などである。さらに別の実施形態において、「適切な対照」または「適当な対照」は、予め定義された値、レベル、特色、特徴、特性などである。
RNAiの標的としてのα1アンチトリプシン
α1アンチトリプシン(AATまたはSerpina1)は、セルピンスーパーファミリーに属するプロテアーゼ阻害剤である。それは、一般に、血清トリプシン阻害剤として知られる。α1アンチトリプシンは、非常に様々なプロテアーゼを阻害することから、α1プロテアーゼ阻害剤(A1PI)とも称される(Gettins PG. Chem Rev 102: 4751−804)。それは、組織を炎症細胞の酵素、特に好中球エラスターゼから防御し、1.5〜3.5グラム/リットルの血中の基準範囲を有するが、急性炎症の際に、何倍ものレベル上昇が起こり得る(Kushner, Mackiewicz. Acute−phase glycoproteins: molecular biology, biochemistry and clinical applications (CRC Press). pp. 3−19)。ATTがなければ、好中球エラスターゼは、肺の弾性に寄与するエラスチンを無制限に破壊し、成人の気腫またはCOPD(慢性閉塞性肺疾患)、及び成人または小児の肝硬変などの呼吸器合併症を生じる。AAT遺伝子の一方または両方のコピーに突然変異を有する個体は、α1アンチトリプシン欠損症に罹患する可能性があり、それは、肺及び肝臓の正常なエラスターゼ活性よりも大きいことによる、肺気腫または慢性肝臓疾患発症のリスクとして現れる。
上述の通り、α1アンチトリプシン発現に関連する特定の疾患状態において、個体は、かなりの量のα1アンチトリプシンを産生するが、産生されたα1アンチトリプシンタンパク質のかなりの割合が、ミスフォールドされているか、またはタンパク質の機能を損なう突然変異を含む。ある特定のそのような例において、該個体は、体内の合成部位から作用部位に適宜、輸送され得ないミスフォールドタンパク質を産生している。
α1アンチトリプシン欠損症により生じる肝疾患は、そのようなミスフォールドタンパク質により誘発される可能性がある。α1アンチトリプシンの突然変異形態(例えば、342位(前処理された形態では366位)にグルタミン酸からリシンへの突然変異を抱える一般的なPiZバリアント)が、肝臓細胞内で産生され(一般には肝臓内の肝細胞が多量の循環AATを産生する)、ミスフォールド構成では、そのような形態は細胞から容易に輸送されない。これにより、肝臓細胞内にミスフォールドタンパク質が蓄積され、非限定的に慢性肝臓疾患、肝臓の炎症、肝硬変、肝線維症、及び/または肝細胞癌をはじめとする1種または複数の肝臓の疾患または障害を誘発する可能性がある。
RNAi治療薬は、α1アンチトリプシンの突然変異形態の影響を分子レベルで処置する魅力的な標的化手段を提供することが、新たに確認された。特に、本明細書で具体的に例示されるdsRNAなどのRNAi治療薬は、インビボで(例えば、脂質ナノ粒子及び/またはダイナミックポリコンジュゲート(dynamic polyconjugates)もしくはGalNAcコンジュゲートなどのコンジュゲートを通して)肝臓の細胞に送達される、特に良好な能力を示している。このように、本明細書に記載されたものなどの配合RNAi治療薬は、α1アンチトリプシンの突然変異形態に関連する疾患または障害(特に肝臓特有の疾患または障害、例えば慢性肝臓疾患、肝臓の炎症、肝硬変、肝線維症、及び/または肝細胞癌)を処置または予防するための魅力的な様式である。
他の組織における分子レベルのα1アンチトリプシンを標的とするRNAi治療薬の使用も、企図される。最も注目すべきこととして、肺では、血清中のα1アンチトリプシンの突然変異した不活性形態の存在が、活性α1アンチトリプシンの血清レベルの欠損を引き起こして、好中球プロテアーゼによる障害を受けやすい宿主組織をもたらす可能性がある。その結果、そのような肺組織は、特に喫煙による損傷のリスクに見舞われ、本明細書に記載されたような肺に向けたRNAi治療薬が、魅力的で正確な治療を提供する。
α1アンチトリプシンcDNA及びポリペプチドの配列
公知のヒト及びマウスα1アンチトリプシンcDNA及びポリペプチドの配列は、以下のものを含む:ヒトα1アンチトリプシンNM_000295.4及び対応するヒトα1アンチトリプシンポリペプチド配列GenBank登録番号NP_000286.3;ならびにマウス野生型α1アンチトリプシン配列GenBank登録番号NM_009246.3(ハツカネズミC57BL/6セルピナ1d)及び対応するマウスセルピナ1d配列GenBank登録番号NP_033272.1。
α1アンチトリプシンレベルの評価
ある特定の実施形態において、α1アンチトリプシン標的配列のdsRNAを介した阻害が評価される。そのような実施形態において、α1アンチトリプシンRNAレベルは、当該技術分野で認識された方法(例えば、RT−PCR、ノーザンブロット、発現アレイなど)により、任意で本発明の抗α1アンチトリプシンdsRNAの非存在への、そのような抗α1アンチトリプシンdsRNAの存在下でのα1アンチトリプシンレベルの比較を通して、評価することができる。ある特定の実施形態において、抗α1アンチトリプシンdsRNAの存在下でのα1アンチトリプシンレベルは、ビヒクル単独の存在下、無関係の標的RNAに向けられるdsRNAの存在下、または任意の処置の非存在下で、観察されるレベルと比較される。
α1アンチトリプシンタンパク質のレベルが評価され得ること、ならびにα1アンチトリプシンタンパク質レベルが、異なる条件下で、α1アンチトリプシンRNAレベル及び/またはdsRNAがα1アンチトリプシン発現レベルを阻害する程度に直接的または間接的に関係し、このためα1アンチトリプシンタンパク質レベルを評価する当該技術分野で認識された方法(例えば、ウェスタンブロット、免疫沈降法、他の抗体に基づく方法など)もまた本発明のdsRNAの阻害作用を検査するのに用いられ得ることも、認識される。
ある特定の実施形態において、本発明のdsRNAの効力は、特定レベルの標的遺伝子ノックダウンを実現するのに必要な標的細胞の細胞質内に存在するdsRNAのコピー数を参照して決定される。例えばある特定の実施形態において、強力なdsRNAは、細胞あたりのRISC負荷アンチセンス鎖1000以下のコピー数で標的細胞の細胞質内に存在する場合に、標的mRNAの50%以上のノックダウンを誘発し得るものである。より好ましくは強力なdsRNAは、細胞あたりのRISC負荷アンチセンス鎖500以下のコピー数で標的細胞の細胞質内に存在する場合に、標的mRNAの50%以上のノックダウンを誘発し得るものである。任意で、強力なdsRNAは、細胞あたりのRISC負荷アンチセンス鎖300以下のコピー数で標的細胞の細胞質内に存在する場合に、標的mRNAの50%以上のノックダウンを誘発し得るものである。
さらなる実施形態において、本発明のDsiRNAの効力は、同じ標的遺伝子内の同じ標的配列に向けた19〜23量体dsRNAに関連して定義することができる。例えば、対応する19〜23量体dsRNAに関して高い効力を有する本発明のDsiRNAは、能力差の検出が可能なほど十分に低濃度(例えば、本明細書に記載されたインビトロアッセイにおいて、細胞環境で1nM以下、細胞環境で100pM以下、細胞環境で10pM以下、細胞環境で1nM以下のトランスフェクション濃度;特に、用量反応曲線を作成すること、及びDsiRNA/dsRNAに関連するIC50値を特定することが目的であれば、一定濃度範囲、例えば0.1pM〜10nMでのそのようなアッセイの性能により能力差が最良に検出され得ることが認識されている)で本明細書に記載されたインビトロアッセイでアッセイされた場合に、対応する19〜23量体dsRNAに比較して、標的遺伝子をさらに5%以上、さらに10%以上、さらに20%以上、さらに30%以上、さらに40%以上、またはさらに50%以上減少させるDsiRNAであり得る。
ある特定の実施形態において、本発明の核酸は、該核酸が哺乳動物細胞に導入される場合に、α1アンチトリプシン標的mRNA発現を減少させるのに十分な量で投与される。例示的実施形態において、本発明のα1アンチトリプシン標的核酸を含まない適当な対照を投与された対応する哺乳動物細胞に比較して、α1アンチトリプシン標的mRNAレベルが少なくとも5%以上、10%以上、20%以上、30%以上、40%以上、50%以上、60%以上、70%以上、80%以上、90%以上低下した場合に、α1アンチトリプシン標的mRNA発現の低下が生じたことが評価される。例示的実施形態において、α1アンチトリプシン標的mRNA発現の減少が適当な対照に比較して生じたかどうかを決定するのに用いられる哺乳動物細胞は、Huh7細胞であり、本発明のα1アンチトリプシン標的化核酸は、任意で本明細書に記載されたインビトロアッセイにおいて、細胞環境で1nM以下、細胞環境で100pM以下、細胞環境で10pM以下、細胞環境で1nM以下の濃度でのトランスフェクション(例えば、リポフェクタミン(商標)を用いる)を通して投与される。
α1アンチトリプシン阻害レベル及び/またはα1アンチトリプシンレベルが、間接的に評価されてもよく、例えば対象におけるポリープまたは腫瘍のサイズ、数及び/または成長もしくは拡大速度の低下の測定を利用して、本発明の二本鎖核酸のα1アンチトリプシンレベル及び/またはα1アンチトリプシン阻害効力を評価してもよい。
α1アンチトリプシンmRNAレベル及び発現の下方制御を評価するのに有用なモデル
治療剤を、選択された動物モデル(複数可)において試験することができる。例えば本明細書に記載されたdsRNA剤(または発現ベクターもしくはそれをコードするトランスジーン)を動物モデルに用いて、前記薬剤での処置の効力、毒性、または副作用を決定することができる。あるいは薬剤(例えば、治療剤)を動物モデルに用いて、そのような薬剤の作用機序を決定することができる。
細胞培養
本発明のdsRNA剤は、例えば以下の手順を利用して、インビボでの切断活性について試験することができる。本発明のdsRNA剤の標的となるα1アンチトリプシンcDNA内のヌクレオチド配列は、先のα1アンチトリプシン配列内に示される。
本発明のdsRNA試薬を、Huh7または他の哺乳動物細胞(例えば、ヒト細胞株Hep3B、HepG2、DU145、Calu3、SW480、T84、PL45、HeLaなど、及びマウス細胞株ALM12、Neuro2aなど)を用いた細胞培養で試験して、α1アンチトリプシンRNA及びα1アンチトリプシンタンパク質の阻害の程度を計測することができる。ある特定の実施形態において、DsiRNA試薬(例えば、図1、及び本明細書の他の箇所で引用された例示的構造を参照)は、本明細書に記載されるように、α1アンチトリプシンターゲットに向けて選択される。例えば培養されたHuh7細胞または培養での他の形質転換もしくは非形質転換哺乳動物細胞への、適切なトランスフェクション剤によるこれらの試薬の送達後に、α1アンチトリプシンRNA阻害が測定される。標的α1アンチトリプシンRNAの相対量が、リアルタイムPCRによる増幅のモニタリング(例えば、ABI7700 TAQMAN(登録商標))を利用したHPRT1、アクチンまたは他の適切な対照に対比させて測定される。同じ全長及び化学的性質を有する無関係の標的もしくは無作為化されたDsiRNA対照に対して、または単に適当なビヒクル処置もしくは未処置対照に対して作製されたオリゴヌクレオチド配列の活性に対して、比較が行われる。一次または二次リード試薬が、ターゲット及び実施された最適化のために選択される。
TAQMAN(登録商標)(リアルタイムPCRによる増幅のモニタリング)及びmRNAのライトサイクラー定量
例えば大規模抽出用のアンビオンRNAクエアス(Rnaqueous)4−PCR精製キット、または96ウェルアッセイ用のプロメガSV96を用いて、全RNAをDsiRNA送達後の細胞から調製する。タックマン分析では、例えば5’末端に共有結合されたレポーター色素FAMまたはVIC、及び3’末端にコンジュゲートされたクエンチャー色素TAMRAを用いて、二重標識プローブを合成する。例えば10μLの全RNA、100nMの順プライマー、100mMの逆プライマー、100nMのプローブ、1×タックマンPCR反応緩衝液(PE−アプライド・バイオシステムズ)、5.5mMのMgCl2、100μMのdATP、dCTP、dGTP及びdTTP、0.2U RNase阻害剤(プロメガ)、0.025U アンプリタックゴールド(PE−アプライド・バイオシステムズ)のそれぞれならびに0.2U M−MLV逆転写酵素(プロメガ)からなる50μL反応物を用いて、ABI PRISM7700 シークエンスディテクターで、PCR増幅を実施する。熱サイクル条件は、48℃で30分、95℃で10分、その後、95℃で15秒と60℃で1分を40サイクルからなり得る。標的α1アンチトリプシンmRNAレベルの定量は、系列希釈された細胞トータルRNAから生成された標準(300、100、30、10ng/rxn)に比較し、そして例えば並行して実施された反応、または同じ試験管のタックマン反応のいずれかのHPRT1 mRNAに対して正規化することにより計測される。
ウェスタンブロット
細胞タンパク質抽出物は、標準のマイクロ調製技術を用いて(例えば、RIPA緩衝液を使用する)、または好ましくはNE−PER核及び細胞質抽出キット(NE−PER Nuclear and Cytoplasmic Extraction)キット(サーモ・フィッシャー・サイエンティフィック)などの方法により核タンパク質を抽出することにより、調製することができる。細胞タンパク質抽出物をトリス−グリシンポリアクリルアミドゲルに添加し、膜上で移動させる。例えば5%脱脂乳と共に1時間、その後一次抗体と共に4℃で16時間インキュベーションすることにより、非特異的結合を遮断することができる。洗浄後に二次抗体を、例えば室温で1時間適用し(1:10,000希釈)、バーサドック(VersaDoc)画像システムでシグナルを検出する。
いくつかの細胞培養システムにおいて、カチオン性脂質が培養細胞へのオリゴヌクレオチドの生物学的利用度を向上させることが示されている(Bennet, et al., 1992, Mol. Pharmacology, 41, 1023−1033)。一実施形態において、本発明のdsRNA分子は、細胞培養実験のためにカチオン性脂質と複合体化される。dsRNAとカチオン性脂質との混合物を、細胞に添加する直前に無血清OptiMEM(インビトロジェン)で調製する。OptiMEMを室温(約20〜25℃)まで加温し、カチオン性脂質を最終的な所望の濃度まで添加する。dsRNA分子をOptiMEMに所望の濃度まで添加して、該溶液を希釈されたdsRNAに添加し、室温で15分間インキュベートする。用量反応実験では、RNA複合体を、カチオン性脂質の添加前にOptiMEMに系列希釈する。
動物モデル
抗α1アンチトリプシンdsRNA剤の効力を、動物モデルで評価することができる。当該技術分野で知られる肝臓の疾患、病状、または障害の動物モデルを、抗α1アンチトリプシンdsRNAの効力、能力、毒性などの評価に用いることができる。α1アンチトリプシンによる肝臓疾患の例示的動物モデルは、ヒトα1アンチトリプシン突然変異体Zタンパク質PiZを発現するトランスジェニックマウスであり、それは、ヒト肝臓疾患を再現し、炎症、高レベルのアポトーシス及びオートファジー、増殖促進、ならびに肝臓前駆細胞の発達促進を示す(そのようなモデルの挙動は、肝臓疾患の処置において抗α1アンチトリプシンdsRNAと併用した抗酸化剤の使用も示唆する;Marcus et al. Exper Biol Med 237: 1163−1172; Teckman et al. Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol 286: G851−62; Rudnick et al. Hepatology 39: 1048−55; Brunt et al. J Pediatr Gastroenterol Nutr 51: 626−30)。そのようなマウスは、例えばセントルイス大学から入手可能である。これらの動物モデルは、本発明の組成物のアッセイのための供給源細胞または組織として用いることができる。そのようなモデルは、α1アンチトリプシン遺伝子発現を治療使用に向けて調整する上で、本発明のdsRNA組成物の効力の前臨床評価に使用すること、またはその使用に向けて適合させることもできる。
そのようなモデル及び/または野生型マウスを、α1アンチトリプシンレベル、発現、α1アンチトリプシン関連の表現型、疾患または障害などの発生を阻害する本発明のdsRNA分子の効力を評価する際に用いることができる。これらのモデル、野生型マウス及び/または他のモデルを、前臨床試験で本発明のdsRNA分子の安全性/毒性及び効力を評価するのに同様に用いることができる。
本発明のα1アンチトリプシン標的化dsRNAの評価に有用な動物モデル系の具体的例としては、野生型マウス及びトランスジェニックPiZ突然変異体モデルマウスが挙げられる。例示的インビボ実験では、本発明のdsRNAが、1〜10mg/kgの範囲内の用量でそのようなマウスモデルに尾静脈注射され、あるいは反復用量が単一用量のIC50レベルで投与され、臓器試料(例えば、肝臓であるが、前立腺、腎臓、肺、膵臓、結腸、皮膚、脾臓、骨髄、リンパ節、乳房脂肪体などを挙げることもできる)が最終用量の投与後24時間目に採取される。そのような臓器は、その後、用いられたモデルに応じて、マウス及び/またはヒトα1アンチトリプシンレベルについて評価される。作用期間もまた、例えば最後のdsRNA投与の1、4、7、14、21日目、またはそれ以降に検査することもできる。
α1アンチトリプシンを標的とするdsRNA
ある特定の実施形態において、本発明の抗α1アンチトリプシンDsiRNAは、少なくとも25ヌクレオチドの鎖長を有する。したがってある特定の実施形態において、抗α1アンチトリプシンDsiRNAは、少なくとも25ヌクレオチド長で35ヌクレオチド以下、または最大50ヌクレオチドまたはそれを超える長さの1オリゴヌクレオチド配列である第一の配列を含む。このRNA配列は、26〜35、26〜34、26〜33、26〜32、26〜31、26〜30、及び26〜29ヌクレオチド長であり得る。この配列は、27もしくは28ヌクレオチド長、または27ヌクレオチド長であり得る。DsiRNA剤の第二の配列は、生物学的条件下、例えば真核細胞の細胞質内で、第一の配列にアニーリングする配列であり得る。一般に第二のオリゴヌクレオチド配列は、第一のオリゴヌクレオチド配列と少なくとも19の相補性塩基対を有し、より典型的には第二のオリゴヌクレオチド配列は、第一のオリゴヌクレオチド配列と21以上の相補性塩基対、または25以上の相補性塩基対を有する。一実施形態において、第二の配列は、第一の配列と同一の長さであり、DsiRNA剤は、平滑末端である。別の実施形態において、DsiRNA剤の末端は、1つまたは複数のオーバーハングを有する。
ある特定の実施形態において、該DsiRNA剤の第一及び第二のオリゴヌクレオチド配列は、別個のオリゴヌクレオチド鎖上に存在し、それらの鎖は化学合成することができ、典型的には化学合成される。幾つかの実施形態において、両方の鎖は、26〜35ヌクレオチド長である。別の実施形態において、両方の鎖は、25〜30または26〜30ヌクレオチド長である。一実施形態において、両方の鎖は、27ヌクレオチド長で、完全に相補性であり、平滑末端を有する。本発明のある特定の実施形態において、抗α1アンチトリプシンDsiRNAの第一及び第二の配列は、別個のRNAオリゴヌクレオチド(鎖)上に存在する。一実施形態において、一方または両方のオリゴヌクレオチド鎖は、ダイサーの基質として働くことができる。別の実施形態において、遺伝子発現を阻害する際に二本鎖RNA構造の効果を最大限にする方向に二本鎖RNA構造に結合するようにダイサーを促す、少なくとも1つの修飾が存在する。本発明のある特定の実施形態において、抗α1アンチトリプシンDsiRNA剤は、異なる長さの2つのオリゴヌクレオチド鎖で構成され、該抗α1アンチトリプシンDsiRNAは、第一の鎖(センス鎖)の3’末端に平滑末端を、そして第二の鎖(アンチセンス鎖)の3’末端に3’オーバーハングを有する。DsiRNAは、1つまたは複数のデオキシリボ核酸(DNA)塩基置換を含み得る。
2つの別個のオリゴヌクレオチドを含む適切なDsiRNA組成物は、化学結合基によりそれらのアニーリング領域の外側で化学結合され得る。多くの適切な化学結合基が、当該技術分野で知られており、使用することができる。適切な基は、DsiRNA上でのダイサー活性を遮断せず、標的遺伝子から転写されたRNAの指示された破壊を妨害しないであろう。あるいは、DsiRNA組成物を構成する2つのオリゴヌクレオチドをアニーリングする際にヘアピン構造が生成されるように、該2つの別個のオリゴヌクレオチドを第三のオリゴヌクレオチドによって結合させることができる。該ヘアピン構造は、DsiRNA上でのダイサー活性を遮断せず、標的遺伝子から転写されたRNAの支持された破壊を妨害しないであろう。
アンチセンス鎖の各残基が標的分子内の残基と相補性になるように、dsRNA分子を設計することができる。あるいは置換を分子内に生成して、前記分子の安定性を上昇させ、そして/または処理活性を増強することができる。置換は、鎖内に生成することができ、または鎖の末端の残基に生成することができる。ある特定の実施形態において、置換及び/または修飾は、DsiRNA剤中の特異的残基に生成される。そのような置換及び/または修飾としては、例えばDsiRNA剤のセンス鎖の3’末端位置から数えて1、2及び3位の1つまたは複数の残基でのデオキシ修飾;ならびにDsiRNA剤のアンチセンス鎖の3’末端残基での2’−O−アルキル(例えば、2’−O−メチル)修飾の導入を挙げることができるが、そのような修飾は、活性siRNA剤を形成するために処理されるDsiRNA剤の領域内に含まれるDsiRNAのアンチセンス鎖の3’部分のオーバーハング位置、及び該アンチセンス鎖の別の残基でも実施される。前述の修飾は、例示として示されており、いかなる様式でも限定を意図するものではない。本発明の抗α1アンチトリプシンDsiRNA剤で実施され得る修飾及び置換のさらなる記述をはじめとする、好ましいDsiRNA剤の構造のさらなる考察は、以下に見出され得る。
本発明のdsRNAは、ハイブリダイズして二重鎖構造を形成するのに十分な相補性がある2つのRNA鎖を含む。dsRNAの一方の鎖(アンチセンス鎖)は、標的配列に実質的に相補性があって概ね完全に相補性がある相補性の領域を含み、その領域はα1アンチトリプシン標的遺伝子の発現の際に形成されるmRNAの配列から得られ、他方の鎖(センス鎖)は、適切な条件下で混和された時に2つの鎖がハイブリダイズして二重鎖構造を形成するように、アンチセンス鎖に相補性がある領域を含む。一般にこの二重鎖構造は、15〜35、任意で25〜30、26〜30、18〜25、19〜24、または19〜21の塩基対長である。同様に、標的配列に相補性がある領域は、15〜35、任意で18〜30、25〜30、19〜24、または19〜21のヌクレオチド長である。本発明のdsRNAは、1つまたは複数の一本鎖ヌクレオチドオーバーハング(複数可)をさらに含み得る。DsiRNA(一般に少なくとも25塩基対長)及びsiRNA(ある特定の実施形態において、siRNAの二重鎖構造は20〜23塩基対長、任意で、具体的には21塩基対である(Elbashir et al., EMBO 20: 6877−6888))をはじめとする15〜35塩基対長の二重鎖構造を含むdsRNAがRNA干渉を誘導するのに効果的であり得ることが、確認されている。20塩基対よりも短い二重鎖(例えば、15、16、17、18または19塩基対の二重鎖)を有するdsRNAが同様に効果的になる得ることも、確認されている。ある特定の実施形態において、本発明のdsRNAは、19ヌクレオチド以上の長さの鎖を少なくとも1つ含み得る。ある特定の実施形態において、一方または両方の末端に表5、10、15または20の配列の1つに相補性がある配列から数ヌクレオチドだけ引いた配列を含むより短いdsRNAが、前記及び表2〜3、7〜8、12〜13及び17〜18に記載されたdsRNAに比較して同じく効果的になり得ることも、合理的に予期され得る。このため、表5、10、15または20の配列の1つに十分に相補性がある少なくとも15、16、17、18、19、20またはそれを超える隣接するヌクレオチドの部分配列を含み、本明細書に記載されたアッセイにおいて完全な配列を含むdsRNAからの5、10、20、25、または30%以下の阻害でα1アンチトリプシン標的遺伝子の発現を阻害する能力が異なる、dsRNAが本発明により企図される。一実施形態において、dsRNAの少なくとも一方の末端は、1〜5、任意で1〜4、ある特定の実施形態において1または2ヌクレオチドの一本鎖ヌクレオチドオーバーハングを有する。少なくとも1つのヌクレオチドオーバーハングを有するある特定のdsRNA構造は、dsRNA分子の両端に塩基対合した平滑末端を有する相当物に比較して優れた阻害特性を有する。
一実施形態において、α1アンチトリプシン遺伝子発現をダウンレギュレートまたは低減する本発明のdsRNA分子は、対象または生物体のα1アンチトリプシン関連疾患または障害(例えば、肝臓疾患)治療、予防または減少させるのに用いられる。
本発明の一実施形態において、本発明のDsiRNA分子の各配列は、独立して25〜35ヌクレオチド長、具体的な実施形態において、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34または35ヌクレオチド長である。別の実施形態において、本発明のDsiRNA二重鎖は、独立して25〜30塩基対(例えば、25、26、27、28、29、または30)を含む。別の実施形態において、本発明のDsiRNA分子の1つまたは複数の鎖は、独立して標的(α1アンチトリプシン)核酸分子に相補性がある19〜35ヌクレオチド(例えば、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34または35)を含む。ある特定の実施形態において、本発明のDsiRNA分子は、25〜34ヌクレオチド長(例えば、25、26、27、28、29、30、31、32、33または34ヌクレオチド長;任意で、対向する鎖の同族ヌクレオチドとのそのようなヌクレオチド塩基対の全て)の二重鎖ヌクレオチドの長さを有する。(本発明の例示的DsiRNA分子を、図1及び以下に示す)。
本発明のある特定の追加的実施形態において、本発明のDsiRNA分子の各オリゴヌクレオチドは、独立して25〜53ヌクレオチド長、具体的な実施形態において25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52または53ヌクレオチド長である。30ヌクレオチド長を超える鎖を有するDsiRNAでは、利用可能な構造としては、1つの鎖だけが30ヌクレオチド長を超えるもの(例えば、米国特許第8,349,809号参照)、または両方の鎖が30ヌクレオチド長を超えるもの(例えば、WO2010/080129号参照)が挙げられる。安定化させる修飾(例えば、2’−O−メチル、ホスホロチオアート、dNTP塩基対をはじめとするデオキシリボヌクレオチドなど)を、本発明の任意の二本鎖核酸内に組み込むことができ、特に30ヌクレオチド長を超える一方または両方の鎖を有するDsiRNA内で、用いることができる。本発明の二本鎖核酸のガイド鎖は、例えば標的RNA(例えば、mRNA)に相補性がある15、16、17、18または19ヌクレオチドの配列を有さなければならないが、ガイド鎖の追加的配列(複数可)は、標的RNAに相補性がある必要はない。30ヌクレオチドを超える鎖長を少なくとも1つ有する二本鎖核酸の末端構造は、機能的dsNAを生成し続けながら変動する可能性があり、例えばガイド鎖の5’末端及びパッセンジャー鎖の3’末端は、5’−オーバーハング、平滑末端または3’オーバーハングを形成する場合があり(特定のdsNA、例えば「一本鎖伸長」dsNAでは、そのような5’または3’オーバーハングの長さは、1〜4、1〜5、1〜6、1〜10、1〜15、1〜20または1〜25またはそれを超え得る);同様にガイド鎖の3’末端及びパッセンジャー鎖の5’末端は、5’−オーバーハング、平滑末端または3’オーバーハングを形成する場合がある(特定のdsNA、例えば「一本鎖伸長」dsNAでは、そのような5’または3’オーバーハングの長さは、1〜4、1〜5、1〜6、1〜10、1〜15、1〜20または1〜25またはそれを超え得る)。ある特定の実施形態において、パッセンジャー鎖の長さは、31〜49ヌクレオチドであり、ガイド鎖の長さは、31〜53ヌクレオチドであり、任意でガイド鎖の5’末端は、パッセンジャー鎖の3’末端と共に平滑末端(任意で塩基対合した平滑末端)を形成し、任意でガイド鎖の3’末端及びパッセンジャー鎖の5’末端が、1〜4ヌクレオチド長の3’オーバーハングを形成している。例示的な「伸長」ダイサー基質構造は、例えば、米国特許出願公開第2010/0173974号及び米国特許第8,349,809号に示されており、それらは両者とも、参照により本明細書に取り込まれる。ある特定の実施形態において、本発明のdsNA分子の1つまたは複数の鎖は、独立して、標的(α1アンチトリプシン)核酸分子に相補性がある19〜35のヌクレオチド(例えば、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34または35)を含む。ある特定の実施形態において、本発明のDsiRNA分子は、25〜49ヌクレオチド長(例えば、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48または49ヌクレオチド長;任意で、逆鎖の同族ヌクレオチドとのそのようなヌクレオチド塩基対の全て)の二重鎖ヌクレオチドの長さを有する。
ある特定の実施形態において、DsiRNA(ダイサー切断の前の、最初に形成されたままの状態)は、内部に含まれる19、20、21、22または23塩基対配列よりも哺乳動物細胞内でのα1アンチトリプシン標的遺伝子発現を減少させる点でより効力がある。ある特定のそのような実施形態において、ダイサー切断前のDsiRNAは、内部に含まれる19〜21量体よりも効力がある。任意で、ダイサー切断前のDsiRNAは、対称なdTdTオーバーハングで合成された(それによりdTdTオーバーハングを有する21ヌクレオチド鎖長を有するsiRNAを形成する)、内部に含まれる19塩基対二重鎖よりも効力がある。ある特定の実施形態において、DsiRNAは、本発明のDsiRNAに関して引用された21ヌクレオチド標的配列の少なくとも19ヌクレオチドを標的とする19〜23量体siRNA(例えば、dTdTオーバーハングを有する19塩基対二重鎖)よりも効力がある(理論に束縛されるのを望むものではないが、DsiRNAに関するそのような標的部位の識別は、DsiRNAに関するAgo2切断部位の特定を通して特定され、DsiRNAのAgo2切断部位が、DsiRNAに関して決定されたら、任意の他の阻害性dsRNAについてのAgo2切断部位の特定を実施することができ、これらのAgo2切断部位をアライメントし、それにより複数のdsRNAについて予測された標的ヌクレオチド配列のアライメントを決定することができる)。ある特定の関連する実施形態において、DsiRNAは、本発明のDsiRNAに関して引用された21ヌクレオチド標的配列の少なくとも20ヌクレオチドを標的とする19〜23量体siRNAよりも効力がある。任意で、DsiRNAは、本発明のDsiRNAに関して引用された同じ21ヌクレオチド標的配列を標的とする19〜23量体siRNAよりも効力がある。ある特定の実施形態において、DsiRNAは、本発明のDsiRNAに関して引用された同じ21ヌクレオチド標的配列を標的とする任意の21量体siRNAよりも効力がある。任意で、DsiRNAは、本発明のDsiRNAに関して引用された同じ21ヌクレオチド標的配列を標的とする任意の21または22量体siRNAよりも効力がある。ある特定の実施形態において、DsiRNAは、本発明のDsiRNAに関して引用された同じ21ヌクレオチド標的配列を標的とする任意の21、22または23量体siRNAよりも効力がある。先に記載された通り、そのような効力の評価は、1nM以下の濃度で適切に配合された(例えば、適当なトランスフェクション試薬と共に配合された)dsRNAで最も効果的に実施される。任意で、IC50評価が、効果的な阻害濃度の範囲で活性を評価するのに実施され、それによりそのようにアッセイされたdsRNAの相対的能力のロバストな比較が可能になる。
本発明のdsRNA分子を直接添加するか、あるいは脂質(例えば、カチオン性脂質)と複合体化すること、リポソームに封入すること、または他の方法で標的細胞もしくは組織へ送達することができる。核酸または核酸複合体は、バイオポリマーに組み込んで、または組み込まずに、エクスビボ、またはインビボで直接の皮膚適用、経皮適用、または注射により、関連組織へ局所投与することができる。特定の実施形態において、本発明の核酸分子は、図1に示された配列及び以下の例示的構造を含む。そのような核酸分子の例は、本質的にこれらの図及び例示的構造において定義された配列からなる。さらに、そのような薬剤がDsiRNA剤の修飾様式を示す以下の記載に従って修飾される場合、図1に記載された構成及び以下の例示的構造の化学修飾形態を、図1及び以下の例示的構造のdsRNA剤に関して記載された全ての用途において使用することができる。
別の態様において、本発明は、本発明の1種または複数のdsRNA分子を含む哺乳動物細胞を提供する。1種または複数のdsRNA分子は、独立して同一または異なる部位を標的とすることができる。
α1アンチトリプシンDsiRNA剤の修飾構造
特定の実施形態において、本発明の抗α1アンチトリプシンDsiRNA剤は、以下の構造を有し得る。
1つのそのような実施形態において、該DsiRNAは、
を含み、ここで、「X」=RNA、「Y」は、任意で2’−O−メチルRNAモノマーであるRNAモノマー1〜4個で構成されたオーバーハングドメインである。関連の実施形態において、該DsiRNAは、
を含み、ここで、「X」=RNA、「Y」は、任意で2’−O−メチルRNAモノマーであるRNAモノマー1〜4個で構成されたオーバーハングドメインであり、「D」=DNAである。一実施形態において、上の鎖は、センス鎖であり、下の鎖は、アンチセンス鎖である。あるいは下の鎖は、センス鎖であり、上の鎖は、アンチセンス鎖である。
本発明のDsiRNAは、広範囲の修飾パターン(例えば伸長DsiRNA剤の中の、例えば2’−O−メチルRNAパターン)を含み得る。本発明のDsiRNAの第二の鎖の特定の修飾パターンを、以下に表す。
一実施形態において、該DsiRNAは、
を含み、ここで、「X」=RNA、「X」=2’−O−メチルRNA、「Y」は、任意で2’−O−メチルRNAモノマーであるRNAモノマー1〜4個で構成されたオーバーハングドメインであり、下線の引かれた残基は、2’−O−メチルRNAモノマーである。関連の実施形態において、該DsiRNAは、
を含み、ここで、「X」=RNA、「X」=2’−O−メチルRNA、「Y」は、任意で2’−O−メチルRNAモノマーであるRNAモノマー1〜4個で構成されたオーバーハングドメインであり、下線の引かれた残基は、2’−O−メチルRNAモノマーであり、「D」=DNAである。上の鎖は、センス鎖であり、下の鎖は、アンチセンス鎖である。
別のそのような実施形態において、該DsiRNAは、
を含み、ここで、「X」=RNA、「X」=2’−O−メチルRNA、「Y」は、任意で2’−O−メチルRNAモノマーであるRNAモノマー1〜4個で構成されたオーバーハングドメインであり、下線の引かれた残基は、2’−O−メチルRNAモノマーである。関連の実施形態において、該DsiRNAは、
を含み、ここで、「X」=RNA、「X」=2’−O−メチルRNA、「Y」は、任意で2’−O−メチルRNAモノマーであるRNAモノマー1〜4個で構成されたオーバーハングドメインであり、下線の引かれた残基は、2’−O−メチルRNAモノマーであり、「D」=DNAである。上の鎖は、センス鎖であり、下の鎖は、アンチセンス鎖である。
別のそのような実施形態において、該DsiRNAは、
を含み、ここで、「X」=RNA、「X」=2’−O−メチルRNA、「Y」は、任意で2’−O−メチルRNAモノマーであるRNAモノマー1〜4個で構成されたオーバーハングドメインであり、下線の引かれた残基は、2’−O−メチルRNAモノマーである。関連の実施形態において、該DsiRNAは、
を含み、ここで、「X」=RNA、「X」=2’−O−メチルRNA、「Y」は、任意で2’−O−メチルRNAモノマーであるRNAモノマー1〜4個で構成されたオーバーハングドメインであり、下線の引かれた残基は、2’−O−メチルRNAモノマーであり、「D」=DNAである。上の鎖は、センス鎖であり、下の鎖は、アンチセンス鎖である。
さらなる実施形態において、該DsiRNAは、
を含み、ここで、「X」=RNA、「X」=2’−O−メチルRNA、「Y」は、任意で2’−O−メチルRNAモノマーであるRNAモノマー1〜4個で構成されたオーバーハングドメインであり、下線の引かれた残基は、2’−O−メチルRNAモノマーである。関連の実施形態において、該DsiRNAは、
を含み、ここで、「X」=RNA、「X」=2’−O−メチルRNA、「Y」は、任意で2’−O−メチルRNAモノマーであるRNAモノマー1〜4個で構成されたオーバーハングドメインであり、下線の引かれた残基は、2’−O−メチルRNAモノマーであり、「D」=DNAである。上の鎖は、センス鎖であり、下の鎖は、アンチセンス鎖である。1つの関連の実施形態において、該DsiRNAは、
を含み、ここで、「X」=RNA、「X」=2’−O−メチルRNAである。さらなる関連の実施形態において、該DsiRNAは、
を含み、ここで、「X」=RNA、「X」=2’−O−メチルRNA、「D」=DNAである。上の鎖は、センス鎖であり、下の鎖は、アンチセンス鎖である。この修飾パターンは、本明細書では「AS−M7」または「M7」修飾パターンとも称される。
追加の実施形態において、該DsiRNAは、
を含み、ここで、「X」=RNA、「X」=2’−O−メチルRNA、「Y」は、任意で2’−O−メチルRNAモノマーであるRNAモノマー1〜4個で構成されたオーバーハングドメインであり、下線の引かれた残基は、2’−O−メチルRNAモノマーである。関連の実施形態において、該DsiRNAは、
を含み、ここで、「X」=RNA、「X」=2’−O−メチルRNA、「Y」は、任意で2’−O−メチルRNAモノマーであるRNAモノマー1〜4個で構成されたオーバーハングドメインであり、下線の引かれた残基は、2’−O−メチルRNAモノマーであり、「D」=DNAである。上の鎖は、センス鎖であり、下の鎖は、アンチセンス鎖である。上の鎖は、センス鎖であり、下の鎖は、アンチセンス鎖である。別の関連の実施形態において、該DsiRNAは、
を含み、ここで、「X」=RNA、「X」=2’−O−メチルRNAである。上の鎖は、センス鎖であり、下の鎖は、アンチセンス鎖である。更なる関連の実施形態において、該DsiRNAは、
を含み、ここで、「X」=RNA、「X」=2’−O−メチルRNA、「D」=DNAである。上の鎖は、センス鎖であり、下の鎖は、アンチセンス鎖である。この修飾パターンは、本明細書では「AS−M6」または「M6」修飾パターンとも称される。
別の実施形態において、該DsiRNAは、
を含み、ここで、「X」=RNA、「X」=2’−O−メチルRNA、「Y」は、任意で2’−O−メチルRNAモノマーであるRNAモノマー1〜4個で構成されたオーバーハングドメインであり、下線の引かれた残基は、2’−O−メチルRNAモノマーである。上の鎖は、センス鎖であり、下の鎖は、アンチセンス鎖である。関連の実施形態において、該DsiRNAは、
を含み、ここで、「X」=RNA、「X」=2’−O−メチルRNA、「Y」は、任意で2’−O−メチルRNAモノマーであるRNAモノマー1〜4個で構成されたオーバーハングドメインであり、下線の引かれた残基は、2’−O−メチルRNAモノマーであり、「D」=DNAである。上の鎖は、センス鎖であり、下の鎖は、アンチセンス鎖である。1つの関連の実施形態において、該DsiRNAは、
を含み、ここで、「X」=RNA、「X」=2’−O−メチルRNAである。上の鎖は、センス鎖であり、下の鎖は、アンチセンス鎖である。別の関連の実施形態において、該DsiRNAは、
を含み、ここで、「X」=RNA、「X」=2’−O−メチルRNA、「D」=DNAである。上の鎖は、センス鎖であり、下の鎖は、アンチセンス鎖である。この修飾パターンは、本明細書では「AS−M5」または「M5」修飾パターンとも称される。
さらなる実施形態において、該DsiRNAは、
を含み、ここで、「X」=RNA、「X」=2’−O−メチルRNA、「Y」は、任意で2’−O−メチルRNAモノマーであるRNAモノマー1〜4個で構成されたオーバーハングドメインであり、下線の引かれた残基は、2’−O−メチルRNAモノマーである。上の鎖は、センス鎖であり、下の鎖は、アンチセンス鎖である。関連の実施形態において、該DsiRNAは、
を含み、ここで、「X」=RNA、「X」=2’−O−メチルRNA、「Y」は、任意で2’−O−メチルRNAモノマーであるRNAモノマー1〜4個で構成されたオーバーハングドメインであり、下線の引かれた残基は、2’−O−メチルRNAモノマーであり、「D」=DNAである。上の鎖は、センス鎖であり、下の鎖は、アンチセンス鎖である。1つの関連の実施形態において、該DsiRNAは、
を含み、ここで、「X」=RNA、「X」=2’−O−メチルRNAである。上の鎖は、センス鎖であり、下の鎖は、アンチセンス鎖である。さらなる関連の実施形態において、該DsiRNAは、
を含み、ここで、「X」=RNA、「X」=2’−O−メチルRNA、「D」=DNAである。上の鎖は、センス鎖であり、下の鎖は、アンチセンス鎖である。この修飾パターンは、本明細書では「AS−M4」または「M4」修飾パターンとも称される。
追加の実施形態において、該DsiRNAは、
を含み、ここで、「X」=RNA、「X」=2’−O−メチルRNA、「Y」は、任意で2’−O−メチルRNAモノマーであるRNAモノマー1〜4個で構成されたオーバーハングドメインであり、下線の引かれた残基は、2’−O−メチルRNAモノマーである。上の鎖は、センス鎖であり、下の鎖は、アンチセンス鎖である。関連の実施形態において、該DsiRNAは、
を含み、ここで、「X」=RNA、「X」=2’−O−メチルRNA、「Y」は、任意で2’−O−メチルRNAモノマーであるRNAモノマー1〜4個で構成されたオーバーハングドメインであり、下線の引かれた残基は、2’−O−メチルRNAモノマーであり、「D」=DNAである。上の鎖は、センス鎖であり、下の鎖は、アンチセンス鎖である。別の関連の実施形態において、該DsiRNAは、
を含み、ここで、「X」=RNA、「X」=2’−O−メチルRNAである。上の鎖は、センス鎖であり、下の鎖は、アンチセンス鎖である。さらなる関連の実施形態において、該DsiRNAは、
を含み、ここで、「X」=RNA、「X」=2’−O−メチルRNA、「D」=DNAである。上の鎖は、センス鎖であり、下の鎖は、アンチセンス鎖である。この修飾パターンは、本明細書では「AS−M8」または「M8」修飾パターンとも称される。
別の実施形態において、該DsiRNAは、
を含み、ここで、「X」=RNA、「X」=2’−O−メチルRNA、「Y」は、任意で2’−O−メチルRNAモノマーであるRNAモノマー1〜4個で構成されたオーバーハングドメインであり、下線の引かれた残基は、2’−O−メチルRNAモノマーである。上の鎖は、センス鎖であり、下の鎖は、アンチセンス鎖である。1つの関連の実施形態において、該DsiRNAは、
を含み、ここで、「X」=RNA、「X」=2’−O−メチルRNA、「Y」は、任意で2’−O−メチルRNAモノマーであるRNAモノマー1〜4個で構成されたオーバーハングドメインであり、下線の引かれた残基は、2’−O−メチルRNAモノマーであり、「D」=DNAである。上の鎖は、センス鎖であり、下の鎖は、アンチセンス鎖である。別の関連の実施形態において、該DsiRNAは、
を含み、ここで、「X」=RNA、「X」=2’−O−メチルRNAである。上の鎖は、センス鎖であり、下の鎖は、アンチセンス鎖である。さらなる関連の実施形態において、該DsiRNAは、
を含み、ここで、「X」=RNA、「X」=2’−O−メチルRNA、「D」=DNAである。上の鎖は、センス鎖であり、下の鎖は、アンチセンス鎖である。この修飾パターンは、本明細書では「AS−M3」または「M3」修飾パターンとも称される。
追加の実施形態において、該DsiRNAは、
を含み、ここで、「X」=RNA、「X」=2’−O−メチルRNA、「Y」は、任意で2’−O−メチルRNAモノマーであるRNAモノマー1〜4個で構成されたオーバーハングドメインであり、下線の引かれた残基は、2’−O−メチルRNAモノマーである。上の鎖は、センス鎖であり、下の鎖は、アンチセンス鎖である。関連の実施形態において、該DsiRNAは、
を含み、ここで、「X」=RNA、「X」=2’−O−メチルRNA、「Y」は、任意で2’−O−メチルRNAモノマーであるRNAモノマー1〜4個で構成されたオーバーハングドメインであり、下線の引かれた残基は、2’−O−メチルRNAモノマーであり、「D」=DNAである。上の鎖は、センス鎖であり、下の鎖は、アンチセンス鎖である。別の関連の実施形態において、該DsiRNAは、
を含み、ここで、「X」=RNA、「X」=2’−O−メチルRNAである。上の鎖は、センス鎖であり、下の鎖は、アンチセンス鎖である。さらなる関連の実施形態において、該DsiRNAは、
を含み、ここで、「X」=RNA、「X」=2’−O−メチルRNA、「D」=DNAである。上の鎖は、センス鎖であり、下の鎖は、アンチセンス鎖である。この修飾パターンは、本明細書では「AS−M2」または「M2」修飾パターンとも称される。
さらなる実施形態において、該DsiRNAは、
を含み、ここで、「X」=RNA、「X」=2’−O−メチルRNA、「Y」は、任意で2’−O−メチルRNAモノマーであるRNAモノマー1〜4個で構成されたオーバーハングドメインであり、下線の引かれた残基は、2’−O−メチルRNAモノマーである。上の鎖は、センス鎖であり、下の鎖は、アンチセンス鎖である。関連の実施形態において、該DsiRNAは、
を含み、ここで、「X」=RNA、「X」=2’−O−メチルRNA、「Y」は、任意で2’−O−メチルRNAモノマーであるRNAモノマー1〜4個で構成されたオーバーハングドメインであり、下線の引かれた残基は、2’−O−メチルRNAモノマーであり、「D」=DNAである。上の鎖は、センス鎖であり、下の鎖は、アンチセンス鎖である。別の関連の実施形態において、該DsiRNAは、
を含み、ここで、「X」=RNA、「X」=2’−O−メチルRNAである。上の鎖は、センス鎖であり、下の鎖は、アンチセンス鎖である。さらなる関連の実施形態において、該DsiRNAは、
を含み、ここで、「X」=RNA、「X」=2’−O−メチルRNA、「D」=DNAである。上の鎖は、センス鎖であり、下の鎖は、アンチセンス鎖である。この修飾パターンは、本明細書では「AS−M1」または「M1」修飾パターンとも称される。
追加の実施形態において、該DsiRNAは、
を含み、ここで、「X」=RNA、「X」=2’−O−メチルRNA、「Y」は、任意で2’−O−メチルRNAモノマーであるRNAモノマー1〜4個で構成されたオーバーハングドメインであり、下線の引かれた残基は、2’−O−メチルRNAモノマーである。上の鎖は、センス鎖であり、下の鎖は、アンチセンス鎖である。1つの関連の実施形態において、該DsiRNAは、
を含み、ここで、「X」=RNA、「X」=2’−O−メチルRNA、「Y」は、任意で2’−O−メチルRNAモノマーであるRNAモノマー1〜4個で構成されたオーバーハングドメインであり、下線の引かれた残基は、2’−O−メチルRNAモノマーであり、「D」=DNAである。上の鎖は、センス鎖であり、下の鎖は、アンチセンス鎖である。別の関連の実施形態において、該DsiRNAは、
を含み、ここで、「X」=RNA、「X」=2’−O−メチルRNAである。上の鎖は、センス鎖であり、下の鎖は、アンチセンス鎖である。さらなる関連の実施形態において、該DsiRNAは、
を含み、ここで、「X」=RNA、「X」=2’−O−メチルRNA、「D」=DNAである。上の鎖は、センス鎖であり、下の鎖は、アンチセンス鎖である。この修飾パターンは、本明細書では「AS−M9」または「M9」修飾パターンとも称される。
別の実施形態において、該DsiRNAは、
を含み、ここで、「X」=RNA、「X」=2’−O−メチルRNA、「Y」は、任意で2’−O−メチルRNAモノマーであるRNAモノマー1〜4個で構成されたオーバーハングドメインであり、下線の引かれた残基は、2’−O−メチルRNAモノマーである。上の鎖は、センス鎖であり、下の鎖は、アンチセンス鎖である。関連の実施形態において、該DsiRNAは、
を含み、ここで、「X」=RNA、「X」=2’−O−メチルRNA、「Y」は、任意で2’−O−メチルRNAモノマーであるRNAモノマー1〜4個で構成されたオーバーハングドメインであり、下線の引かれた残基は、2’−O−メチルRNAモノマーであり、「D」=DNAである。上の鎖は、センス鎖であり、下の鎖は、アンチセンス鎖である。別の関連の実施形態において、該DsiRNAは、
を含み、ここで、「X」=RNA、「X」=2’−O−メチルRNAである。上の鎖は、センス鎖であり、下の鎖は、アンチセンス鎖である。さらなる関連の実施形態において、該DsiRNAは、
を含み、ここで、「X」=RNA、「X」=2’−O−メチルRNA、「D」=DNAである。上の鎖は、センス鎖であり、下の鎖は、アンチセンス鎖である。この修飾パターンは、本明細書では「AS−M10」または「M10」修飾パターンとも称される。
さらなる実施形態において、該DsiRNAは、
を含み、ここで、「X」=RNA、「X」=2’−O−メチルRNA、「Y」は、任意で2’−O−メチルRNAモノマーであるRNAモノマー1〜4個で構成されたオーバーハングドメインであり、下線の引かれた残基は、2’−O−メチルRNAモノマーである。上の鎖は、センス鎖であり、下の鎖は、アンチセンス鎖である。1つの関連の実施形態において、該DsiRNAは、
を含み、ここで、「X」=RNA、「X」=2’−O−メチルRNA、「Y」は、任意で2’−O−メチルRNAモノマーであるRNAモノマー1〜4個で構成されたオーバーハングドメインであり、下線の引かれた残基は、2’−O−メチルRNAモノマーであり、「D」=DNAである。上の鎖は、センス鎖であり、下の鎖は、アンチセンス鎖である。別の関連の実施形態において、該DsiRNAは、
を含み、ここで、「X」=RNA、「X」=2’−O−メチルRNAである。上の鎖は、センス鎖であり、下の鎖は、アンチセンス鎖である。さらなる関連の実施形態において、該DsiRNAは、
を含み、ここで、「X」=RNA、「X」=2’−O−メチルRNA、「D」=DNAである。上の鎖は、センス鎖であり、下の鎖は、アンチセンス鎖である。この修飾パターンは、本明細書では「AS−M11」または「M11」修飾パターンとも称される。
追加の実施形態において、該DsiRNAは、
を含み、ここで、「X」=RNA、「X」=2’−O−メチルRNA、「Y」は、任意で2’−O−メチルRNAモノマーであるRNAモノマー1〜4個で構成されたオーバーハングドメインであり、下線の引かれた残基は、2’−O−メチルRNAモノマーである。上の鎖は、センス鎖であり、下の鎖は、アンチセンス鎖である。1つの関連の実施形態において、該DsiRNAは、
を含み、ここで、「X」=RNA、「X」=2’−O−メチルRNA、「Y」は、任意で2’−O−メチルRNAモノマーであるRNAモノマー1〜4個で構成されたオーバーハングドメインであり、下線の引かれた残基は、2’−O−メチルRNAモノマーであり、「D」=DNAである。上の鎖は、センス鎖であり、下の鎖は、アンチセンス鎖である。別の関連の実施形態において、該DsiRNAは、
を含み、ここで、「X」=RNA、「X」=2’−O−メチルRNAである。上の鎖は、センス鎖であり、下の鎖は、アンチセンス鎖である。さらなる関連の実施形態において、該DsiRNAは、
を含み、ここで、「X」=RNA、「X」=2’−O−メチルRNA、「D」=DNAである。上の鎖は、センス鎖であり、下の鎖は、アンチセンス鎖である。この修飾パターンは、本明細書では「AS−M12」または「M12」修飾パターンとも称される。
さらなる実施形態において、該DsiRNAは、
を含み、ここで、「X」=RNA、「X」=2’−O−メチルRNA、「Y」は、任意で2’−O−メチルRNAモノマーであるRNAモノマー1〜4個で構成されたオーバーハングドメインであり、下線の引かれた残基は、2’−O−メチルRNAモノマーである。上の鎖は、センス鎖であり、下の鎖は、アンチセンス鎖である。1つの関連の実施形態において、該DsiRNAは、
を含み、ここで、「X」=RNA、「X」=2’−O−メチルRNA、「Y」は、任意で2’−O−メチルRNAモノマーであるRNAモノマー1〜4個で構成されたオーバーハングドメインであり、下線の引かれた残基は、2’−O−メチルRNAモノマーであり、「D」=DNAである。上の鎖は、センス鎖であり、下の鎖は、アンチセンス鎖である。別の関連の実施形態において、該DsiRNAは、
を含み、ここで、「X」=RNA、「X」=2’−O−メチルRNAである。上の鎖は、センス鎖であり、下の鎖は、アンチセンス鎖である。さらなる関連の実施形態において、該DsiRNAは、
を含み、ここで、「X」=RNA、「X」=2’−O−メチルRNA、「D」=DNAである。上の鎖は、センス鎖であり、下の鎖は、アンチセンス鎖である。この修飾パターンは、本明細書では「AS−M13」または「M13」修飾パターンとも称される。
別の実施形態において、該DsiRNAは、
を含み、ここで、「X」=RNA、「X」=2’−O−メチルRNA、「Y」は、任意で2’−O−メチルRNAモノマーであるRNAモノマー1〜4個で構成されたオーバーハングドメインであり、下線の引かれた残基は、2’−O−メチルRNAモノマーである。上の鎖は、センス鎖であり、下の鎖は、アンチセンス鎖である。別の関連の実施形態において、該DsiRNAは、
を含み、ここで、「X」=RNA、「X」=2’−O−メチルRNA、「Y」は、任意で2’−O−メチルRNAモノマーであるRNAモノマー1〜4個で構成されたオーバーハングドメインであり、下線の引かれた残基は、2’−O−メチルRNAモノマーであり、「D」=DNAである。上の鎖は、センス鎖であり、下の鎖は、アンチセンス鎖である。別の関連の実施形態において、該DsiRNAは、
を含み、ここで、「X」=RNA、「X」=2’−O−メチルRNAである。上の鎖は、センス鎖であり、下の鎖は、アンチセンス鎖である。さらなる関連の実施形態において、該DsiRNAは、
を含み、ここで、「X」=RNA、「X」=2’−O−メチルRNA、「D」=DNAである。上の鎖は、センス鎖であり、下の鎖は、アンチセンス鎖である。この修飾パターンは、本明細書では「AS−M21」または「M21」修飾パターンとも称される。
さらなる実施形態において、該DsiRNAは、
を含み、ここで、「X」=RNA、「X」=2’−O−メチルRNA、「Y」は、任意で2’−O−メチルRNAモノマーであるRNAモノマー1〜4個で構成されたオーバーハングドメインであり、下線の引かれた残基は、2’−O−メチルRNAモノマーである。上の鎖は、センス鎖であり、下の鎖は、アンチセンス鎖である。1つの関連の実施形態において、該DsiRNAは、
を含み、ここで、「X」=RNA、「X」=2’−O−メチルRNA、「Y」は、任意で2’−O−メチルRNAモノマーであるRNAモノマー1〜4個で構成されたオーバーハングドメインであり、下線の引かれた残基は、2’−O−メチルRNAモノマーであり、「D」=DNAである。上の鎖は、センス鎖であり、下の鎖は、アンチセンス鎖である。別の関連の実施形態において、該DsiRNAは、
を含み、ここで、「X」=RNA、「X」=2’−O−メチルRNAである。上の鎖は、センス鎖であり、下の鎖は、アンチセンス鎖である。さらなる関連の実施形態において、該DsiRNAは、
を含み、ここで、「X」=RNA、「X」=2’−O−メチルRNA、「D」=DNAである。上の鎖は、センス鎖であり、下の鎖は、アンチセンス鎖である。この修飾パターンは、本明細書では「AS−M14」または「M14」修飾パターンとも称される。
追加の実施形態において、該DsiRNAは、
を含み、ここで、「X」=RNA、「X」=2’−O−メチルRNA、「Y」は、任意で2’−O−メチルRNAモノマーであるRNAモノマー1〜4個で構成されたオーバーハングドメインであり、下線の引かれた残基は、2’−O−メチルRNAモノマーである。上の鎖は、センス鎖であり、下の鎖は、アンチセンス鎖である。1つの関連の実施形態において、該DsiRNAは、
を含み、ここで、「X」=RNA、「X」=2’−O−メチルRNA、「Y」は、任意で2’−O−メチルRNAモノマーであるRNAモノマー1〜4個で構成されたオーバーハングドメインであり、下線の引かれた残基は、2’−O−メチルRNAモノマーであり、「D」=DNAである。上の鎖は、センス鎖であり、下の鎖は、アンチセンス鎖である。別の関連の実施形態において、該DsiRNAは、
を含み、ここで、「X」=RNA、「X」=2’−O−メチルRNAである。上の鎖は、センス鎖であり、下の鎖は、アンチセンス鎖である。さらなる関連の実施形態において、該DsiRNAは、
を含み、ここで、「X」=RNA、「X」=2’−O−メチルRNA、「D」=DNAである。上の鎖は、センス鎖であり、下の鎖は、アンチセンス鎖である。この修飾パターンは、本明細書では「AS−M15」または「M15」修飾パターンとも称される。
さらなる実施形態において、該DsiRNAは、
を含み、ここで、「X」=RNA、「X」=2’−O−メチルRNA、「Y」は、任意で2’−O−メチルRNAモノマーであるRNAモノマー1〜4個で構成されたオーバーハングドメインであり、下線の引かれた残基は、2’−O−メチルRNAモノマーである。上の鎖は、センス鎖であり、下の鎖は、アンチセンス鎖である。関連の実施形態において、該DsiRNAは、
を含み、ここで、「X」=RNA、「X」=2’−O−メチルRNA、「Y」は、任意で2’−O−メチルRNAモノマーであるRNAモノマー1〜4個で構成されたオーバーハングドメインであり、下線の引かれた残基は、2’−O−メチルRNAモノマーであり、「D」=DNAである。上の鎖は、センス鎖であり、下の鎖は、アンチセンス鎖である。別の関連の実施形態において、該DsiRNAは、
を含み、ここで、「X」=RNA、「X」=2’−O−メチルRNAである。上の鎖は、センス鎖であり、下の鎖は、アンチセンス鎖である。さらなる関連の実施形態において、該DsiRNAは、
を含み、ここで、「X」=RNA、「X」=2’−O−メチルRNA、「D」=DNAである。上の鎖は、センス鎖であり、下の鎖は、アンチセンス鎖である。この修飾パターンは、本明細書では「AS−M16」または「M16」修飾パターンとも称される。
追加の実施形態において、該DsiRNAは、
を含み、ここで、「X」=RNA、「X」=2’−O−メチルRNA、「Y」は、任意で2’−O−メチルRNAモノマーであるRNAモノマー1〜4個で構成されたオーバーハングドメインであり、下線の引かれた残基は、2’−O−メチルRNAモノマーである。上の鎖は、センス鎖であり、下の鎖は、アンチセンス鎖である。1つの関連の実施形態において、該DsiRNAは、
を含み、ここで、「X」=RNA、「X」=2’−O−メチルRNA、「Y」は、任意で2’−O−メチルRNAモノマーであるRNAモノマー1〜4個で構成されたオーバーハングドメインであり、下線の引かれた残基は、2’−O−メチルRNAモノマーであり、「D」=DNAである。上の鎖は、センス鎖であり、下の鎖は、アンチセンス鎖である。別の関連の実施形態において、該DsiRNAは、
を含み、ここで、「X」=RNA、「X」=2’−O−メチルRNAである。上の鎖は、センス鎖であり、下の鎖は、アンチセンス鎖である。さらなる関連の実施形態において、該DsiRNAは、
を含み、ここで、「X」=RNA、「X」=2’−O−メチルRNA、「D」=DNAである。上の鎖は、センス鎖であり、下の鎖は、アンチセンス鎖である。この修飾パターンは、本明細書では「AS−M17」または「M17」修飾パターンとも称される。
さらなる実施形態において、該DsiRNAは、
を含み、ここで、「X」=RNA、「X」=2’−O−メチルRNA、「Y」は、任意で2’−O−メチルRNAモノマーであるRNAモノマー1〜4個で構成されたオーバーハングドメインであり、下線の引かれた残基は、2’−O−メチルRNAモノマーである。上の鎖は、センス鎖であり、下の鎖は、アンチセンス鎖である。1つの関連の実施形態において、該DsiRNAは、
を含み、ここで、「X」=RNA、「X」=2’−O−メチルRNA、「Y」は、任意で2’−O−メチルRNAモノマーであるRNAモノマー1〜4個で構成されたオーバーハングドメインであり、下線の引かれた残基は、2’−O−メチルRNAモノマーであり、「D」=DNAである。上の鎖は、センス鎖であり、下の鎖は、アンチセンス鎖である。別の関連の実施形態において、該DsiRNAは、
を含み、ここで、「X」=RNA、「X」=2’−O−メチルRNAである。上の鎖は、センス鎖であり、下の鎖は、アンチセンス鎖である。さらなる関連の実施形態において、該DsiRNAは、
を含み、ここで、「X」=RNA、「X」=2’−O−メチルRNA、「D」=DNAである。上の鎖は、センス鎖であり、下の鎖は、アンチセンス鎖である。この修飾パターンは、本明細書では「AS−M18」または「M18」修飾パターンとも称される。
追加の実施形態において、該DsiRNAは、
を含み、ここで、「X」=RNA、「X」=2’−O−メチルRNA、「Y」は、任意で2’−O−メチルRNAモノマーであるRNAモノマー1〜4個で構成されたオーバーハングドメインであり、下線の引かれた残基は、2’−O−メチルRNAモノマーである。上の鎖は、センス鎖であり、下の鎖は、アンチセンス鎖である。1つの関連の実施形態において、該DsiRNAは、
を含み、ここで、「X」=RNA、「X」=2’−O−メチルRNA、「Y」は、任意で2’−O−メチルRNAモノマーであるRNAモノマー1〜4個で構成されたオーバーハングドメインであり、下線の引かれた残基は、2’−O−メチルRNAモノマーであり、「D」=DNAである。上の鎖は、センス鎖であり、下の鎖は、アンチセンス鎖である。別の関連の実施形態において、該DsiRNAは、
を含み、ここで、「X」=RNA、「X」=2’−O−メチルRNAである。上の鎖は、センス鎖であり、下の鎖は、アンチセンス鎖である。さらなる関連の実施形態において、該DsiRNAは、
を含み、ここで、「X」=RNA、「X」=2’−O−メチルRNA、「D」=DNAである。上の鎖は、センス鎖であり、下の鎖は、アンチセンス鎖である。この修飾パターンは、本明細書では「AS−M19」または「M19」修飾パターンとも称される。
さらなる実施形態において、該DsiRNAは、
を含み、ここで、「X」=RNA、「X」=2’−O−メチルRNA、「Y」は、任意で2’−O−メチルRNAモノマーであるRNAモノマー1〜4個で構成されたオーバーハングドメインであり、下線の引かれた残基は、2’−O−メチルRNAモノマーである。上の鎖は、センス鎖であり、下の鎖は、アンチセンス鎖である。1つの関連の実施形態において、該DsiRNAは、
を含み、ここで、「X」=RNA、「X」=2’−O−メチルRNA、「Y」は、任意で2’−O−メチルRNAモノマーであるRNAモノマー1〜4個で構成されたオーバーハングドメインであり、下線の引かれた残基は、2’−O−メチルRNAモノマーであり、「D」=DNAである。上の鎖は、センス鎖であり、下の鎖は、アンチセンス鎖である。別の関連の実施形態において、該DsiRNAは、
を含み、ここで、「X」=RNA、「X」=2’−O−メチルRNAである。上の鎖は、センス鎖であり、下の鎖は、アンチセンス鎖である。さらなる関連の実施形態において、該DsiRNAは、
を含み、ここで、「X」=RNA、「X」=2’−O−メチルRNA、「D」=DNAである。上の鎖は、センス鎖であり、下の鎖は、アンチセンス鎖である。この修飾パターンは、本明細書では「AS−M20」または「M20」修飾パターンとも称される。
追加の実施形態において、該DsiRNAは、
を含み、ここで、「X」=RNA、「X」=2’−O−メチルRNA、「Y」は、任意で2’−O−メチルRNAモノマーであるRNAモノマー1〜4個で構成されたオーバーハングドメインであり、下線の引かれた残基は、2’−O−メチルRNAモノマーである。上の鎖は、センス鎖であり、下の鎖は、アンチセンス鎖である。1つの関連の実施形態において、該DsiRNAは、
を含み、ここで、「X」=RNA、「X」=2’−O−メチルRNA、「Y」は、任意で2’−O−メチルRNAモノマーであるRNAモノマー1〜4個で構成されたオーバーハングドメインであり、下線の引かれた残基は、2’−O−メチルRNAモノマーであり、「D」=DNAである。上の鎖は、センス鎖であり、下の鎖は、アンチセンス鎖である。別の関連の実施形態において、該DsiRNAは、
を含み、ここで、「X」=RNA、「X」=2’−O−メチルRNAである。上の鎖は、センス鎖であり、下の鎖は、アンチセンス鎖である。さらなる関連の実施形態において、該DsiRNAは、
を含み、ここで、「X」=RNA、「X」=2’−O−メチルRNA、「D」=DNAである。上の鎖は、センス鎖であり、下の鎖は、アンチセンス鎖である。この修飾パターンは、本明細書では「AS−M22」または「M22」修飾パターンとも称される。
さらなる実施形態において、該DsiRNAは、
を含み、ここで、「X」=RNA、「X」=2’−O−メチルRNA、「Y」は、任意で2’−O−メチルRNAモノマーであるRNAモノマー1〜4個で構成されたオーバーハングドメインであり、下線の引かれた残基は、2’−O−メチルRNAモノマーである。上の鎖は、センス鎖であり、下の鎖は、アンチセンス鎖である。1つの関連の実施形態において、該DsiRNAは、
を含み、ここで、「X」=RNA、「X」=2’−O−メチルRNA、「Y」は、任意で2’−O−メチルRNAモノマーであるRNAモノマー1〜4個で構成されたオーバーハングドメインであり、下線の引かれた残基は、2’−O−メチルRNAモノマーであり、「D」=DNAである。上の鎖は、センス鎖であり、下の鎖は、アンチセンス鎖である。別の関連の実施形態において、該DsiRNAは、
を含み、ここで、「X」=RNA、「X」=2’−O−メチルRNAである。上の鎖は、センス鎖であり、下の鎖は、アンチセンス鎖である。さらなる関連の実施形態において、該DsiRNAは、
を含み、ここで、「X」=RNA、「X」=2’−O−メチルRNA、「D」=DNAである。上の鎖は、センス鎖であり、下の鎖は、アンチセンス鎖である。この修飾パターンは、本明細書では「AS−M24」または「M24」修飾パターンとも称される。
追加の実施形態において、該DsiRNAは、
を含み、ここで、「X」=RNA、「X」=2’−O−メチルRNA、「Y」は、任意で2’−O−メチルRNAモノマーであるRNAモノマー1〜4個で構成されたオーバーハングドメインであり、下線の引かれた残基は、2’−O−メチルRNAモノマーである。上の鎖は、センス鎖であり、下の鎖は、アンチセンス鎖である。1つの関連の実施形態において、該DsiRNAは、
を含み、ここで、「X」=RNA、「X」=2’−O−メチルRNA、「Y」は、任意で2’−O−メチルRNAモノマーであるRNAモノマー1〜4個で構成されたオーバーハングドメインであり、下線の引かれた残基は、2’−O−メチルRNAモノマーであり、「D」=DNAである。上の鎖は、センス鎖であり、下の鎖は、アンチセンス鎖である。別の関連の実施形態において、該DsiRNAは、
を含み、ここで、「X」=RNA、「X」=2’−O−メチルRNAである。上の鎖は、センス鎖であり、下の鎖は、アンチセンス鎖である。さらなる関連の実施形態において、該DsiRNAは、
を含み、ここで、「X」=RNA、「X」=2’−O−メチルRNA、「D」=DNAである。上の鎖は、センス鎖であり、下の鎖は、アンチセンス鎖である。この修飾パターンは、本明細書では「AS−M25」または「M25」修飾パターンとも称される。
さらなる実施形態において、該DsiRNAは、
を含み、ここで、「X」=RNA、「X」=2’−O−メチルRNA、「Y」は、任意で2’−O−メチルRNAモノマーであるRNAモノマー1〜4個で構成されたオーバーハングドメインであり、下線の引かれた残基は、2’−O−メチルRNAモノマーである。上の鎖は、センス鎖であり、下の鎖は、アンチセンス鎖である。1つの関連の実施形態において、該DsiRNAは、
を含み、ここで、「X」=RNA、「X」=2’−O−メチルRNA、「Y」は、任意で2’−O−メチルRNAモノマーであるRNAモノマー1〜4個で構成されたオーバーハングドメインであり、下線の引かれた残基は、2’−O−メチルRNAモノマーであり、「D」=DNAである。上の鎖は、センス鎖であり、下の鎖は、アンチセンス鎖である。別の関連の実施形態において、該DsiRNAは、
を含み、ここで、「X」=RNA、「X」=2’−O−メチルRNAである。上の鎖は、センス鎖であり、下の鎖は、アンチセンス鎖である。さらなる関連の実施形態において、該DsiRNAは、
を含み、ここで、「X」=RNA、「X」=2’−O−メチルRNA、「D」=DNAである。上の鎖は、センス鎖であり、下の鎖は、アンチセンス鎖である。この修飾パターンは、本明細書では「AS−M26」または「M26」修飾パターンとも称される。
追加の実施形態において、該DsiRNAは、
を含み、ここで、「X」=RNA、「X」=2’−O−メチルRNA、「Y」は、任意で2’−O−メチルRNAモノマーであるRNAモノマー1〜4個で構成されたオーバーハングドメインであり、下線の引かれた残基は、2’−O−メチルRNAモノマーである。上の鎖は、センス鎖であり、下の鎖は、アンチセンス鎖である。1つの関連の実施形態において、該DsiRNAは、
を含み、ここで、「X」=RNA、「X」=2’−O−メチルRNA、「Y」は、任意で2’−O−メチルRNAモノマーであるRNAモノマー1〜4個で構成されたオーバーハングドメインであり、下線の引かれた残基は、2’−O−メチルRNAモノマーであり、「D」=DNAである。上の鎖は、センス鎖であり、下の鎖は、アンチセンス鎖である。別の関連の実施形態において、該DsiRNAは、
を含み、ここで、「X」=RNA、「X」=2’−O−メチルRNAである。上の鎖は、センス鎖であり、下の鎖は、アンチセンス鎖である。さらなる関連の実施形態において、該DsiRNAは、
を含み、ここで、「X」=RNA、「X」=2’−O−メチルRNA、「D」=DNAである。上の鎖は、センス鎖であり、下の鎖は、アンチセンス鎖である。この修飾パターンは、本明細書では「AS−M27」または「M27」修飾パターンとも称される。
さらなる実施形態において、該DsiRNAは、
を含み、ここで、「X」=RNA、「X」=2’−O−メチルRNA、「Y」は、任意で2’−O−メチルRNAモノマーであるRNAモノマー1〜4個で構成されたオーバーハングドメインであり、下線の引かれた残基は、2’−O−メチルRNAモノマーである。上の鎖は、センス鎖であり、下の鎖は、アンチセンス鎖である。1つの関連の実施形態において、該DsiRNAは、
を含み、ここで、「X」=RNA、「X」=2’−O−メチルRNA、「Y」は、任意で2’−O−メチルRNAモノマーであるRNAモノマー1〜4個で構成されたオーバーハングドメインであり、下線の引かれた残基は、2’−O−メチルRNAモノマーであり、「D」=DNAである。上の鎖は、センス鎖であり、下の鎖は、アンチセンス鎖である。別の関連の実施形態において、該DsiRNAは、
を含み、ここで、「X」=RNA、「X」=2’−O−メチルRNAである。上の鎖は、センス鎖であり、下の鎖は、アンチセンス鎖である。さらなる関連の実施形態において、該DsiRNAは、
5'-XXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXDD-3'
3’-XXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXX-5’
を含み、ここで、「X」=RNA、「X」=2’−O−メチルRNA、「D」=DNAである。上の鎖は、センス鎖であり、下の鎖は、アンチセンス鎖である。この修飾パターンは、本明細書では「AS−M28」または「M28」修飾パターンとも称される。
さらなる実施形態において、該DsiRNAは、
を含み、ここで、「X」=RNA、「X」=2’−O−メチルRNA、「Y」は、任意で2’−O−メチルRNAモノマーであるRNAモノマー1〜4個で構成されたオーバーハングドメインであり、下線の引かれた残基は、2’−O−メチルRNAモノマーである。上の鎖は、センス鎖であり、下の鎖は、アンチセンス鎖である。1つの関連の実施形態において、該DsiRNAは、
を含み、ここで、「X」=RNA、「X」=2’−O−メチルRNA、「Y」は、任意で2’−O−メチルRNAモノマーであるRNAモノマー1〜4個で構成されたオーバーハングドメインであり、下線の引かれた残基は、2’−O−メチルRNAモノマーであり、「D」=DNAである。上の鎖は、センス鎖であり、下の鎖は、アンチセンス鎖である。別の関連の実施形態において、該DsiRNAは、
を含み、ここで、「X」=RNA、「X」=2’−O−メチルRNAである。上の鎖は、センス鎖であり、下の鎖は、アンチセンス鎖である。さらなる関連の実施形態において、該DsiRNAは、
を含み、ここで、「X」=RNA、「X」=2’−O−メチルRNA、「D」=DNAである。上の鎖は、センス鎖であり、下の鎖は、アンチセンス鎖である。この修飾パターンは、本明細書では「AS−M29」または「M29」修飾パターンとも称される。
追加の実施形態において、該DsiRNAは、
を含み、ここで、「X」=RNA、「X」=2’−O−メチルRNAである。上の鎖は、センス鎖であり、下の鎖は、アンチセンス鎖である。さらなる関連の実施形態において、該DsiRNAは、
を含み、ここで、「X」=RNA、「X」=2’−O−メチルRNA、「D」=DNAである。上の鎖は、センス鎖であり、下の鎖は、アンチセンス鎖である。この修飾パターンは、本明細書では「AS−M30」または「M30」修飾パターンとも称される。
さらなる実施形態において、該DsiRNAは、
を含み、ここで、「X」=RNA、「X」=2’−O−メチルRNAである。上の鎖は、センス鎖であり、下の鎖は、アンチセンス鎖である。さらなる関連の実施形態において、該DsiRNAは、
を含み、ここで、「X」=RNA、「X」=2’−O−メチルRNA、「D」=DNAである。上の鎖は、センス鎖であり、下の鎖は、アンチセンス鎖である。この修飾パターンは、本明細書では「AS−M31」または「M31」修飾パターンとも称される。
追加の実施形態において、該DsiRNAは、
を含み、ここで、「X」=RNA、「X」=2’−O−メチルRNAである。上の鎖は、センス鎖であり、下の鎖は、アンチセンス鎖である。さらなる関連の実施形態において、該DsiRNAは、
を含み、ここで、「X」=RNA、「X」=2’−O−メチルRNA、「D」=DNAである。上の鎖は、センス鎖であり、下の鎖は、アンチセンス鎖である。この修飾パターンは、本明細書では「AS−M32」または「M32」修飾パターンとも称される。
さらなる実施形態において、該DsiRNAは、
を含み、ここで、「X」=RNA、「X」=2’−O−メチルRNA、「Y」は、任意で2’−O−メチルRNAモノマーであるRNAモノマー1〜4個で構成されたオーバーハングドメインであり、下線の引かれた残基は、2’−O−メチルRNAモノマーである。上の鎖は、センス鎖であり、下の鎖は、アンチセンス鎖である。1つの関連の実施形態において、該DsiRNAは、
を含み、ここで、「X」=RNA、「X」=2’−O−メチルRNA、「Y」は、任意で2’−O−メチルRNAモノマーであるRNAモノマー1〜4個で構成されたオーバーハングドメインであり、下線の引かれた残基は、2’−O−メチルRNAモノマーであり、「D」=DNAである。上の鎖は、センス鎖であり、下の鎖は、アンチセンス鎖である。別の関連の実施形態において、該DsiRNAは、
を含み、ここで、「X」=RNA、「X」=2’−O−メチルRNAである。上の鎖は、センス鎖であり、下の鎖は、アンチセンス鎖である。さらなる関連の実施形態において、該DsiRNAは、
を含み、ここで、「X」=RNA、「X」=2’−O−メチルRNA、「D」=DNAである。上の鎖は、センス鎖であり、下の鎖は、アンチセンス鎖である。この修飾パターンは、本明細書では「AS−M34」または「M34」修飾パターンとも称される。
追加の実施形態において、該DsiRNAは、
を含み、ここで、「X」=RNA、「X」=2’−O−メチルRNA、「Y」は、任意で2’−O−メチルRNAモノマーであるRNAモノマー1〜4個で構成されたオーバーハングドメインであり、下線の引かれた残基は、2’−O−メチルRNAモノマーである。上の鎖は、センス鎖であり、下の鎖は、アンチセンス鎖である。1つの関連の実施形態において、該DsiRNAは、
を含み、ここで、「X」=RNA、「X」=2’−O−メチルRNA、「Y」は、任意で2’−O−メチルRNAモノマーであるRNAモノマー1〜4個で構成されたオーバーハングドメインであり、下線の引かれた残基は、2’−O−メチルRNAモノマーであり、「D」=DNAである。上の鎖は、センス鎖であり、下の鎖は、アンチセンス鎖である。別の関連の実施形態において、該DsiRNAは、
を含み、ここで、「X」=RNA、「X」=2’−O−メチルRNAである。上の鎖は、センス鎖であり、下の鎖は、アンチセンス鎖である。さらなる関連の実施形態において、該DsiRNAは、
を含み、ここで、「X」=RNA、「X」=2’−O−メチルRNA、「D」=DNAである。上の鎖は、センス鎖であり、下の鎖は、アンチセンス鎖である。この修飾パターンは、本明細書では「AS−M35」または「M35」修飾パターンとも称される。
さらなる実施形態において、該DsiRNAは、
を含み、ここで、「X」=RNA、「X」=2’−O−メチルRNA、「Y」は、任意で2’−O−メチルRNAモノマーであるRNAモノマー1〜4個で構成されたオーバーハングドメインであり、下線の引かれた残基は、2’−O−メチルRNAモノマーである。上の鎖は、センス鎖であり、下の鎖は、アンチセンス鎖である。1つの関連の実施形態において、該DsiRNAは、
を含み、ここで、「X」=RNA、「X」=2’−O−メチルRNA、「Y」は、任意で2’−O−メチルRNAモノマーであるRNAモノマー1〜4個で構成されたオーバーハングドメインであり、下線の引かれた残基は、2’−O−メチルRNAモノマーであり、「D」=DNAである。上の鎖は、センス鎖であり、下の鎖は、アンチセンス鎖である。別の関連の実施形態において、該DsiRNAは、
を含み、ここで、「X」=RNA、「X」=2’−O−メチルRNAである。上の鎖は、センス鎖であり、下の鎖は、アンチセンス鎖である。さらなる関連の実施形態において、該DsiRNAは、
を含み、ここで、「X」=RNA、「X」=2’−O−メチルRNA、「D」=DNAである。上の鎖は、センス鎖であり、下の鎖は、アンチセンス鎖である。この修飾パターンは、本明細書では「AS−M37」または「M37」修飾パターンとも称される。
追加の実施形態において、該DsiRNAは、
を含み、ここで、「X」=RNA、「X」=2’−O−メチルRNA、「Y」は、任意で2’−O−メチルRNAモノマーであるRNAモノマー1〜4個で構成されたオーバーハングドメインであり、下線の引かれた残基は、2’−O−メチルRNAモノマーである。上の鎖は、センス鎖であり、下の鎖は、アンチセンス鎖である。1つの関連の実施形態において、該DsiRNAは、
を含み、ここで、「X」=RNA、「X」=2’−O−メチルRNA、「Y」は、任意で2’−O−メチルRNAモノマーであるRNAモノマー1〜4個で構成されたオーバーハングドメインであり、下線の引かれた残基は、2’−O−メチルRNAモノマーであり、「D」=DNAである。上の鎖は、センス鎖であり、下の鎖は、アンチセンス鎖である。別の関連の実施形態において、該DsiRNAは、
を含み、ここで、「X」=RNA、「X」=2’−O−メチルRNAである。上の鎖は、センス鎖であり、下の鎖は、アンチセンス鎖である。さらなる関連の実施形態において、該DsiRNAは、
を含み、ここで、「X」=RNA、「X」=2’−O−メチルRNA、「D」=DNAである。上の鎖は、センス鎖であり、下の鎖は、アンチセンス鎖である。この修飾パターンは、本明細書では「AS−M38」または「M38」修飾パターンとも称される。
さらなる実施形態において、該DsiRNAは、
を含み、ここで、「X」=RNA、「X」=2’−O−メチルRNA、「Y」は、任意で2’−O−メチルRNAモノマーであるRNAモノマー1〜4個で構成されたオーバーハングドメインであり、下線の引かれた残基は、2’−O−メチルRNAモノマーである。上の鎖は、センス鎖であり、下の鎖は、アンチセンス鎖である。1つの関連の実施形態において、該DsiRNAは、
を含み、ここで、「X」=RNA、「X」=2’−O−メチルRNA、「Y」は、任意で2’−O−メチルRNAモノマーであるRNAモノマー1〜4個で構成されたオーバーハングドメインであり、下線の引かれた残基は、2’−O−メチルRNAモノマーであり、「D」=DNAである。上の鎖は、センス鎖であり、下の鎖は、アンチセンス鎖である。別の関連の実施形態において、該DsiRNAは、
を含み、ここで、「X」=RNA、「X」=2’−O−メチルRNAである。上の鎖は、センス鎖であり、下の鎖は、アンチセンス鎖である。さらなる関連の実施形態において、該DsiRNAは、
を含み、ここで、「X」=RNA、「X」=2’−O−メチルRNA、「D」=DNAである。上の鎖は、センス鎖であり、下の鎖は、アンチセンス鎖である。この修飾パターンは、本明細書では「AS−M40」または「M40」修飾パターンとも称される。
追加の実施形態において、該DsiRNAは、
を含み、ここで、「X」=RNA、「X」=2’−O−メチルRNA、「Y」は、任意で2’−O−メチルRNAモノマーであるRNAモノマー1〜4個で構成されたオーバーハングドメインであり、下線の引かれた残基は、2’−O−メチルRNAモノマーである。上の鎖は、センス鎖であり、下の鎖は、アンチセンス鎖である。1つの関連の実施形態において、該DsiRNAは、
を含み、ここで、「X」=RNA、「X」=2’−O−メチルRNA、「Y」は、任意で2’−O−メチルRNAモノマーであるRNAモノマー1〜4個で構成されたオーバーハングドメインであり、下線の引かれた残基は、2’−O−メチルRNAモノマーであり、「D」=DNAである。上の鎖は、センス鎖であり、下の鎖は、アンチセンス鎖である。別の関連の実施形態において、該DsiRNAは、
を含み、ここで、「X」=RNA、「X」=2’−O−メチルRNAである。上の鎖は、センス鎖であり、下の鎖は、アンチセンス鎖である。さらなる関連の実施形態において、該DsiRNAは、
を含み、ここで、「X」=RNA、「X」=2’−O−メチルRNA、「D」=DNAである。上の鎖は、センス鎖であり、下の鎖は、アンチセンス鎖である。この修飾パターンは、本明細書では「AS−M41」または「M41」修飾パターンとも称される。
さらなる実施形態において、該DsiRNAは、
を含み、ここで、「X」=RNA、「X」=2’−O−メチルRNA、「Y」は、任意で2’−O−メチルRNAモノマーであるRNAモノマー1〜4個で構成されたオーバーハングドメインであり、下線の引かれた残基は、2’−O−メチルRNAモノマーである。上の鎖は、センス鎖であり、下の鎖は、アンチセンス鎖である。1つの関連の実施形態において、該DsiRNAは、
を含み、ここで、「X」=RNA、「X」=2’−O−メチルRNA、「Y」は、任意で2’−O−メチルRNAモノマーであるRNAモノマー1〜4個で構成されたオーバーハングドメインであり、下線の引かれた残基は、2’−O−メチルRNAモノマーであり、「D」=DNAである。上の鎖は、センス鎖であり、下の鎖は、アンチセンス鎖である。別の関連の実施形態において、該DsiRNAは、
を含み、ここで、「X」=RNA、「X」=2’−O−メチルRNAである。上の鎖は、センス鎖であり、下の鎖は、アンチセンス鎖である。さらなる関連の実施形態において、該DsiRNAは、
を含み、ここで、「X」=RNA、「X」=2’−O−メチルRNA、「D」=DNAである。上の鎖は、センス鎖であり、下の鎖は、アンチセンス鎖である。この修飾パターンは、本明細書では「AS−M36」または「M36」修飾パターンとも称される。
追加の実施形態において、該DsiRNAは、
を含み、ここで、「X」=RNA、「X」=2’−O−メチルRNA、「Y」は、任意で2’−O−メチルRNAモノマーであるRNAモノマー1〜4個で構成されたオーバーハングドメインであり、下線の引かれた残基は、2’−O−メチルRNAモノマーである。上の鎖は、センス鎖であり、下の鎖は、アンチセンス鎖である。1つの関連の実施形態において、該DsiRNAは、
を含み、ここで、「X」=RNA、「X」=2’−O−メチルRNA、「Y」は、任意で2’−O−メチルRNAモノマーであるRNAモノマー1〜4個で構成されたオーバーハングドメインであり、下線の引かれた残基は、2’−O−メチルRNAモノマーであり、「D」=DNAである。上の鎖は、センス鎖であり、下の鎖は、アンチセンス鎖である。別の関連の実施形態において、該DsiRNAは、
を含み、ここで、「X」=RNA、「X」=2’−O−メチルRNAである。上の鎖は、センス鎖であり、下の鎖は、アンチセンス鎖である。さらなる関連の実施形態において、該DsiRNAは、
を含み、ここで、「X」=RNA、「X」=2’−O−メチルRNA、「D」=DNAである。上の鎖は、センス鎖であり、下の鎖は、アンチセンス鎖である。この修飾パターンは、本明細書では「AS−M42」または「M42」修飾パターンとも称される。
さらなる実施形態において、該DsiRNAは、
を含み、ここで、「X」=RNA、「X」=2’−O−メチルRNA、「Y」は、任意で2’−O−メチルRNAモノマーであるRNAモノマー1〜4個で構成されたオーバーハングドメインであり、下線の引かれた残基は、2’−O−メチルRNAモノマーである。上の鎖は、センス鎖であり、下の鎖は、アンチセンス鎖である。1つの関連の実施形態において、該DsiRNAは、
を含み、ここで、「X」=RNA、「X」=2’−O−メチルRNA、「Y」は、任意で2’−O−メチルRNAモノマーであるRNAモノマー1〜4個で構成されたオーバーハングドメインであり、下線の引かれた残基は、2’−O−メチルRNAモノマーであり、「D」=DNAである。上の鎖は、センス鎖であり、下の鎖は、アンチセンス鎖である。別の関連の実施形態において、該DsiRNAは、
を含み、ここで、「X」=RNA、「X」=2’−O−メチルRNAである。上の鎖は、センス鎖であり、下の鎖は、アンチセンス鎖である。さらなる関連の実施形態において、該DsiRNAは、
を含み、ここで、「X」=RNA、「X」=2’−O−メチルRNA、「D」=DNAである。上の鎖は、センス鎖であり、下の鎖は、アンチセンス鎖である。この修飾パターンは、本明細書では「AS−M43」または「M43」修飾パターンとも称される。
追加の実施形態において、該DsiRNAは、
を含み、ここで、「X」=RNA、「X」=2’−O−メチルRNA、「Y」は、任意で2’−O−メチルRNAモノマーであるRNAモノマー1〜4個で構成されたオーバーハングドメインであり、下線の引かれた残基は、2’−O−メチルRNAモノマーである。上の鎖は、センス鎖であり、下の鎖は、アンチセンス鎖である。1つの関連の実施形態において、該DsiRNAは、
を含み、ここで、「X」=RNA、「X」=2’−O−メチルRNA、「Y」は、任意で2’−O−メチルRNAモノマーであるRNAモノマー1〜4個で構成されたオーバーハングドメインであり、下線の引かれた残基は、2’−O−メチルRNAモノマーであり、「D」=DNAである。上の鎖は、センス鎖であり、下の鎖は、アンチセンス鎖である。別の関連の実施形態において、該DsiRNAは、
を含み、ここで、「X」=RNA、「X」=2’−O−メチルRNAである。上の鎖は、センス鎖であり、下の鎖は、アンチセンス鎖である。さらなる関連の実施形態において、該DsiRNAは、
を含み、ここで、「X」=RNA、「X」=2’−O−メチルRNA、「D」=DNAである。上の鎖は、センス鎖であり、下の鎖は、アンチセンス鎖である。この修飾パターンは、本明細書では「AS−M44」または「M44」修飾パターンとも称される。
さらなる実施形態において、該DsiRNAは、
を含み、ここで、「X」=RNA、「X」=2’−O−メチルRNA、「Y」は、任意で2’−O−メチルRNAモノマーであるRNAモノマー1〜4個で構成されたオーバーハングドメインであり、下線の引かれた残基は、2’−O−メチルRNAモノマーである。上の鎖は、センス鎖であり、下の鎖は、アンチセンス鎖である。1つの関連の実施形態において、該DsiRNAは、
を含み、ここで、「X」=RNA、「X」=2’−O−メチルRNA、「Y」は、任意で2’−O−メチルRNAモノマーであるRNAモノマー1〜4個で構成されたオーバーハングドメインであり、下線の引かれた残基は、2’−O−メチルRNAモノマーであり、「D」=DNAである。上の鎖は、センス鎖であり、下の鎖は、アンチセンス鎖である。別の関連の実施形態において、該DsiRNAは、
を含み、ここで、「X」=RNA、「X」=2’−O−メチルRNAである。上の鎖は、センス鎖であり、下の鎖は、アンチセンス鎖である。さらなる関連の実施形態において、該DsiRNAは、
を含み、ここで、「X」=RNA、「X」=2’−O−メチルRNA、「D」=DNAである。上の鎖は、センス鎖であり、下の鎖は、アンチセンス鎖である。この修飾パターンは、本明細書では「AS−M45」または「M45」修飾パターンとも称される。
追加の実施形態において、該DsiRNAは、
を含み、ここで、「X」=RNA、「X」=2’−O−メチルRNA、「Y」は、任意で2’−O−メチルRNAモノマーであるRNAモノマー1〜4個で構成されたオーバーハングドメインであり、下線の引かれた残基は、2’−O−メチルRNAモノマーである。上の鎖は、センス鎖であり、下の鎖は、アンチセンス鎖である。1つの関連の実施形態において、該DsiRNAは、
を含み、ここで、「X」=RNA、「X」=2’−O−メチルRNA、「Y」は、任意で2’−O−メチルRNAモノマーであるRNAモノマー1〜4個で構成されたオーバーハングドメインであり、下線の引かれた残基は、2’−O−メチルRNAモノマーであり、「D」=DNAである。上の鎖は、センス鎖であり、下の鎖は、アンチセンス鎖である。別の関連の実施形態において、該DsiRNAは、
を含み、ここで、「X」=RNA、「X」=2’−O−メチルRNAである。上の鎖は、センス鎖であり、下の鎖は、アンチセンス鎖である。さらなる関連の実施形態において、該DsiRNAは、
を含み、ここで、「X」=RNA、「X」=2’−O−メチルRNA、「D」=DNAである。上の鎖は、センス鎖であり、下の鎖は、アンチセンス鎖である。この修飾パターンは、本明細書では「AS−M46」または「M46」修飾パターンとも称される。
さらなる実施形態において、該DsiRNAは、
を含み、ここで、「X」=RNA、「X」=2’−O−メチルRNA、「Y」は、任意で2’−O−メチルRNAモノマーであるRNAモノマー1〜4個で構成されたオーバーハングドメインであり、下線の引かれた残基は、2’−O−メチルRNAモノマーである。上の鎖は、センス鎖であり、下の鎖は、アンチセンス鎖である。1つの関連の実施形態において、該DsiRNAは、
を含み、ここで、「X」=RNA、「X」=2’−O−メチルRNA、「Y」は、任意で2’−O−メチルRNAモノマーであるRNAモノマー1〜4個で構成されたオーバーハングドメインであり、下線の引かれた残基は、2’−O−メチルRNAモノマーであり、「D」=DNAである。上の鎖は、センス鎖であり、下の鎖は、アンチセンス鎖である。別の関連の実施形態において、該DsiRNAは、
を含み、ここで、「X」=RNA、「X」=2’−O−メチルRNAである。上の鎖は、センス鎖であり、下の鎖は、アンチセンス鎖である。さらなる関連の実施形態において、該DsiRNAは、
を含み、ここで、「X」=RNA、「X」=2’−O−メチルRNA、「D」=DNAである。上の鎖は、センス鎖であり、下の鎖は、アンチセンス鎖である。この修飾パターンは、本明細書では「AS−M47」または「M47」修飾パターンとも称される。
追加の実施形態において、該DsiRNAは、
を含み、ここで、「X」=RNA、「X」=2’−O−メチルRNA、「Y」は、任意で2’−O−メチルRNAモノマーであるRNAモノマー1〜4個で構成されたオーバーハングドメインであり、下線の引かれた残基は、2’−O−メチルRNAモノマーである。上の鎖は、センス鎖であり、下の鎖は、アンチセンス鎖である。1つの関連の実施形態において、該DsiRNAは、
を含み、ここで、「X」=RNA、「X」=2’−O−メチルRNA、「Y」は、任意で2’−O−メチルRNAモノマーであるRNAモノマー1〜4個で構成されたオーバーハングドメインであり、下線の引かれた残基は、2’−O−メチルRNAモノマーであり、「D」=DNAである。上の鎖は、センス鎖であり、下の鎖は、アンチセンス鎖である。別の関連の実施形態において、該DsiRNAは、
を含み、ここで、「X」=RNA、「X」=2’−O−メチルRNAである。上の鎖は、センス鎖であり、下の鎖は、アンチセンス鎖である。さらなる関連の実施形態において、該DsiRNAは、
を含み、ここで、「X」=RNA、「X」=2’−O−メチルRNA、「D」=DNAである。上の鎖は、センス鎖であり、下の鎖は、アンチセンス鎖である。この修飾パターンは、本明細書では「AS−M48」または「M48」修飾パターンとも称される。
さらなる実施形態において、該DsiRNAは、
を含み、ここで、「X」=RNA、「X」=2’−O−メチルRNA、「Y」は、任意で2’−O−メチルRNAモノマーであるRNAモノマー1〜4個で構成されたオーバーハングドメインであり、下線の引かれた残基は、2’−O−メチルRNAモノマーである。上の鎖は、センス鎖であり、下の鎖は、アンチセンス鎖である。1つの関連の実施形態において、該DsiRNAは、
を含み、ここで、「X」=RNA、「X」=2’−O−メチルRNA、「Y」は、任意で2’−O−メチルRNAモノマーであるRNAモノマー1〜4個で構成されたオーバーハングドメインであり、下線の引かれた残基は、2’−O−メチルRNAモノマーであり、「D」=DNAである。上の鎖は、センス鎖であり、下の鎖は、アンチセンス鎖である。別の関連の実施形態において、該DsiRNAは、
を含み、ここで、「X」=RNA、「X」=2’−O−メチルRNAである。上の鎖は、センス鎖であり、下の鎖は、アンチセンス鎖である。さらなる関連の実施形態において、該DsiRNAは、
を含み、ここで、「X」=RNA、「X」=2’−O−メチルRNA、「D」=DNAである。上の鎖は、センス鎖であり、下の鎖は、アンチセンス鎖である。この修飾パターンは、本明細書では「AS−M52」または「M52」修飾パターンとも称される。
さらなる実施形態において、該DsiRNAは、
を含み、ここで、「X」=RNA、「X」=2’−O−メチルRNA、「Y」は、任意で2’−O−メチルRNAモノマーであるRNAモノマー1〜4個で構成されたオーバーハングドメインであり、下線の引かれた残基は、2’−O−メチルRNAモノマーである。上の鎖は、センス鎖であり、下の鎖は、アンチセンス鎖である。1つの関連の実施形態において、該DsiRNAは、
を含み、ここで、「X」=RNA、「X」=2’−O−メチルRNA、「Y」は、任意で2’−O−メチルRNAモノマーであるRNAモノマー1〜4個で構成されたオーバーハングドメインであり、下線の引かれた残基は、2’−O−メチルRNAモノマーであり、「D」=DNAである。上の鎖は、センス鎖であり、下の鎖は、アンチセンス鎖である。別の関連の実施形態において、該DsiRNAは、
を含み、ここで、「X」=RNA、「X」=2’−O−メチルRNAである。上の鎖は、センス鎖であり、下の鎖は、アンチセンス鎖である。さらなる関連の実施形態において、該DsiRNAは、
を含み、ここで、「X」=RNA、「X」=2’−O−メチルRNA、「D」=DNAである。上の鎖は、センス鎖であり、下の鎖は、アンチセンス鎖である。この修飾パターンは、本明細書では「AS−M54」または「M54」修飾パターンとも称される。
追加の実施形態において、該DsiRNAは、
を含み、ここで、「X」=RNA、「X」=2’−O−メチルRNA、「Y」は、任意で2’−O−メチルRNAモノマーであるRNAモノマー1〜4個で構成されたオーバーハングドメインであり、下線の引かれた残基は、2’−O−メチルRNAモノマーである。上の鎖は、センス鎖であり、下の鎖は、アンチセンス鎖である。1つの関連の実施形態において、該DsiRNAは、
を含み、ここで、「X」=RNA、「X」=2’−O−メチルRNA、「Y」は、任意で2’−O−メチルRNAモノマーであるRNAモノマー1〜4個で構成されたオーバーハングドメインであり、下線の引かれた残基は、2’−O−メチルRNAモノマーであり、「D」=DNAである。上の鎖は、センス鎖であり、下の鎖は、アンチセンス鎖である。別の関連の実施形態において、該DsiRNAは、
を含み、ここで、「X」=RNA、「X」=2’−O−メチルRNAである。上の鎖は、センス鎖であり、下の鎖は、アンチセンス鎖である。さらなる関連の実施形態において、該DsiRNAは、
を含み、ここで、「X」=RNA、「X」=2’−O−メチルRNA、「D」=DNAである。上の鎖は、センス鎖であり、下の鎖は、アンチセンス鎖である。この修飾パターンは、本明細書では「AS−M55」または「M55」修飾パターンとも称される。
さらなる実施形態において、該DsiRNAは、
を含み、ここで、「X」=RNA、「X」=2’−O−メチルRNA、「Y」は、任意で2’−O−メチルRNAモノマーであるRNAモノマー1〜4個で構成されたオーバーハングドメインであり、下線の引かれた残基は、2’−O−メチルRNAモノマーである。上の鎖は、センス鎖であり、下の鎖は、アンチセンス鎖である。1つの関連の実施形態において、該DsiRNAは、
を含み、ここで、「X」=RNA、「X」=2’−O−メチルRNA、「Y」は、任意で2’−O−メチルRNAモノマーであるRNAモノマー1〜4個で構成されたオーバーハングドメインであり、下線の引かれた残基は、2’−O−メチルRNAモノマーであり、「D」=DNAである。上の鎖は、センス鎖であり、下の鎖は、アンチセンス鎖である。別の関連の実施形態において、該DsiRNAは、
を含み、ここで、「X」=RNA、「X」=2’−O−メチルRNAである。上の鎖は、センス鎖であり、下の鎖は、アンチセンス鎖である。さらなる関連の実施形態において、該DsiRNAは、
を含み、ここで、「X」=RNA、「X」=2’−O−メチルRNA、「D」=DNAである。上の鎖は、センス鎖であり、下の鎖は、アンチセンス鎖である。この修飾パターンは、本明細書では「AS−M56」または「M56」修飾パターンとも称される。
追加の実施形態において、該DsiRNAは、
を含み、ここで、「X」=RNA、「X」=2’−O−メチルRNA、「Y」は、任意で2’−O−メチルRNAモノマーであるRNAモノマー1〜4個で構成されたオーバーハングドメインであり、下線の引かれた残基は、2’−O−メチルRNAモノマーである。上の鎖は、センス鎖であり、下の鎖は、アンチセンス鎖である。1つの関連の実施形態において、該DsiRNAは、
を含み、ここで、「X」=RNA、「X」=2’−O−メチルRNA、「Y」は、任意で2’−O−メチルRNAモノマーであるRNAモノマー1〜4個で構成されたオーバーハングドメインであり、下線の引かれた残基は、2’−O−メチルRNAモノマーであり、「D」=DNAである。上の鎖は、センス鎖であり、下の鎖は、アンチセンス鎖である。別の関連の実施形態において、該DsiRNAは、
を含み、ここで、「X」=RNA、「X」=2’−O−メチルRNAである。上の鎖は、センス鎖であり、下の鎖は、アンチセンス鎖である。さらなる関連の実施形態において、該DsiRNAは、
を含み、ここで、「X」=RNA、「X」=2’−O−メチルRNA、「D」=DNAである。上の鎖は、センス鎖であり、下の鎖は、アンチセンス鎖である。この修飾パターンは、本明細書では「AS−M57」または「M57」修飾パターンとも称される。
さらなる実施形態において、該DsiRNAは、
を含み、ここで、「X」=RNA、「X」=2’−O−メチルRNA、「Y」は、任意で2’−O−メチルRNAモノマーであるRNAモノマー1〜4個で構成されたオーバーハングドメインであり、下線の引かれた残基は、2’−O−メチルRNAモノマーである。上の鎖は、センス鎖であり、下の鎖は、アンチセンス鎖である。1つの関連の実施形態において、該DsiRNAは、
を含み、ここで、「X」=RNA、「X」=2’−O−メチルRNA、「Y」は、任意で2’−O−メチルRNAモノマーであるRNAモノマー1〜4個で構成されたオーバーハングドメインであり、下線の引かれた残基は、2’−O−メチルRNAモノマーであり、「D」=DNAである。上の鎖は、センス鎖であり、下の鎖は、アンチセンス鎖である。別の関連の実施形態において、該DsiRNAは、
を含み、ここで、「X」=RNA、「X」=2’−O−メチルRNAである。上の鎖は、センス鎖であり、下の鎖は、アンチセンス鎖である。さらなる関連の実施形態において、該DsiRNAは、
を含み、ここで、「X」=RNA、「X」=2’−O−メチルRNA、「D」=DNAである。上の鎖は、センス鎖であり、下の鎖は、アンチセンス鎖である。この修飾パターンは、本明細書では「AS−M58」または「M58」修飾パターンとも称される。
追加の実施形態において、該DsiRNAは、
を含み、ここで、「X」=RNA、「X」=2’−O−メチルRNA、「Y」は、任意で2’−O−メチルRNAモノマーであるRNAモノマー1〜4個で構成されたオーバーハングドメインであり、下線の引かれた残基は、2’−O−メチルRNAモノマーである。上の鎖は、センス鎖であり、下の鎖は、アンチセンス鎖である。1つの関連の実施形態において、該DsiRNAは、
を含み、ここで、「X」=RNA、「X」=2’−O−メチルRNA、「Y」は、任意で2’−O−メチルRNAモノマーであるRNAモノマー1〜4個で構成されたオーバーハングドメインであり、下線の引かれた残基は、2’−O−メチルRNAモノマーであり、「D」=DNAである。上の鎖は、センス鎖であり、下の鎖は、アンチセンス鎖である。別の関連の実施形態において、該DsiRNAは、
を含み、ここで、「X」=RNA、「X」=2’−O−メチルRNAである。上の鎖は、センス鎖であり、下の鎖は、アンチセンス鎖である。さらなる関連の実施形態において、該DsiRNAは、
を含み、ここで、「X」=RNA、「X」=2’−O−メチルRNA、「D」=DNAである。上の鎖は、センス鎖であり、下の鎖は、アンチセンス鎖である。この修飾パターンは、本明細書では「AS−M59」または「M59」修飾パターンとも称される。
さらなる実施形態において、該DsiRNAは、
を含み、ここで、「X」=RNA、「X」=2’−O−メチルRNA、「Y」は、任意で2’−O−メチルRNAモノマーであるRNAモノマー1〜4個で構成されたオーバーハングドメインであり、下線の引かれた残基は、2’−O−メチルRNAモノマーである。上の鎖は、センス鎖であり、下の鎖は、アンチセンス鎖である。1つの関連の実施形態において、該DsiRNAは、
を含み、ここで、「X」=RNA、「X」=2’−O−メチルRNA、「Y」は、任意で2’−O−メチルRNAモノマーであるRNAモノマー1〜4個で構成されたオーバーハングドメインであり、下線の引かれた残基は、2’−O−メチルRNAモノマーであり、「D」=DNAである。上の鎖は、センス鎖であり、下の鎖は、アンチセンス鎖である。別の関連の実施形態において、該DsiRNAは、
を含み、ここで、「X」=RNA、「X」=2’−O−メチルRNAである。上の鎖は、センス鎖であり、下の鎖は、アンチセンス鎖である。さらなる関連の実施形態において、該DsiRNAは、
を含み、ここで、「X」=RNA、「X」=2’−O−メチルRNA、「D」=DNAである。上の鎖は、センス鎖であり、下の鎖は、アンチセンス鎖である。この修飾パターンは、本明細書では「AS−M60」または「M60」修飾パターンとも称される。
追加の実施形態において、該DsiRNAは、
を含み、ここで、「X」=RNA、「X」=2’−O−メチルRNA、「Y」は、任意で2’−O−メチルRNAモノマーであるRNAモノマー1〜4個で構成されたオーバーハングドメインであり、下線の引かれた残基は、2’−O−メチルRNAモノマーである。上の鎖は、センス鎖であり、下の鎖は、アンチセンス鎖である。1つの関連の実施形態において、該DsiRNAは、
を含み、ここで、「X」=RNA、「X」=2’−O−メチルRNA、「Y」は、任意で2’−O−メチルRNAモノマーであるRNAモノマー1〜4個で構成されたオーバーハングドメインであり、下線の引かれた残基は、2’−O−メチルRNAモノマーであり、「D」=DNAである。上の鎖は、センス鎖であり、下の鎖は、アンチセンス鎖である。別の関連の実施形態において、該DsiRNAは、
を含み、ここで、「X」=RNA、「X」=2’−O−メチルRNAである。上の鎖は、センス鎖であり、下の鎖は、アンチセンス鎖である。さらなる関連の実施形態において、該DsiRNAは、
を含み、ここで、「X」=RNA、「X」=2’−O−メチルRNA、「D」=DNAである。上の鎖は、センス鎖であり、下の鎖は、アンチセンス鎖である。この修飾パターンは、本明細書では「AS−M61」または「M61」修飾パターンとも称される。
さらなる実施形態において、該DsiRNAは、
を含み、ここで、「X」=RNA、「X」=2’−O−メチルRNA、「Y」は、任意で2’−O−メチルRNAモノマーであるRNAモノマー1〜4個で構成されたオーバーハングドメインであり、下線の引かれた残基は、2’−O−メチルRNAモノマーである。上の鎖は、センス鎖であり、下の鎖は、アンチセンス鎖である。1つの関連の実施形態において、該DsiRNAは、
を含み、ここで、「X」=RNA、「X」=2’−O−メチルRNA、「Y」は、任意で2’−O−メチルRNAモノマーであるRNAモノマー1〜4個で構成されたオーバーハングドメインであり、下線の引かれた残基は、2’−O−メチルRNAモノマーであり、「D」=DNAである。上の鎖は、センス鎖であり、下の鎖は、アンチセンス鎖である。別の関連の実施形態において、該DsiRNAは、
を含み、ここで、「X」=RNA、「X」=2’−O−メチルRNAである。上の鎖は、センス鎖であり、下の鎖は、アンチセンス鎖である。さらなる関連の実施形態において、該DsiRNAは、
を含み、ここで、「X」=RNA、「X」=2’−O−メチルRNA、「D」=DNAである。上の鎖は、センス鎖であり、下の鎖は、アンチセンス鎖である。この修飾パターンは、本明細書では「AS−M62」または「M62」修飾パターンとも称される。
追加の実施形態において、該DsiRNAは、
を含み、ここで、「X」=RNA、「X」=2’−O−メチルRNA、「Y」は、任意で2’−O−メチルRNAモノマーであるRNAモノマー1〜4個で構成されたオーバーハングドメインであり、下線の引かれた残基は、2’−O−メチルRNAモノマーである。上の鎖は、センス鎖であり、下の鎖は、アンチセンス鎖である。1つの関連の実施形態において、該DsiRNAは、
を含み、ここで、「X」=RNA、「X」=2’−O−メチルRNA、「Y」は、任意で2’−O−メチルRNAモノマーであるRNAモノマー1〜4個で構成されたオーバーハングドメインであり、下線の引かれた残基は、2’−O−メチルRNAモノマーであり、「D」=DNAである。上の鎖は、センス鎖であり、下の鎖は、アンチセンス鎖である。別の関連の実施形態において、該DsiRNAは、
を含み、ここで、「X」=RNA、「X」=2’−O−メチルRNAである。上の鎖は、センス鎖であり、下の鎖は、アンチセンス鎖である。さらなる関連の実施形態において、該DsiRNAは、
を含み、ここで、「X」=RNA、「X」=2’−O−メチルRNA、「D」=DNAである。上の鎖は、センス鎖であり、下の鎖は、アンチセンス鎖である。この修飾パターンは、本明細書では「AS−M63」または「M63」修飾パターンとも称される。
さらなる実施形態において、該DsiRNAは、
を含み、ここで、「X」=RNA、「X」=2’−O−メチルRNA、「Y」は、任意で2’−O−メチルRNAモノマーであるRNAモノマー1〜4個で構成されたオーバーハングドメインであり、下線の引かれた残基は、2’−O−メチルRNAモノマーである。上の鎖は、センス鎖であり、下の鎖は、アンチセンス鎖である。1つの関連の実施形態において、該DsiRNAは、
を含み、ここで、「X」=RNA、「X」=2’−O−メチルRNA、「Y」は、任意で2’−O−メチルRNAモノマーであるRNAモノマー1〜4個で構成されたオーバーハングドメインであり、下線の引かれた残基は、2’−O−メチルRNAモノマーであり、「D」=DNAである。上の鎖は、センス鎖であり、下の鎖は、アンチセンス鎖である。別の関連の実施形態において、該DsiRNAは、
を含み、ここで、「X」=RNA、「X」=2’−O−メチルRNAである。上の鎖は、センス鎖であり、下の鎖は、アンチセンス鎖である。さらなる関連の実施形態において、該DsiRNAは、
を含み、ここで、「X」=RNA、「X」=2’−O−メチルRNA、「D」=DNAである。上の鎖は、センス鎖であり、下の鎖は、アンチセンス鎖である。この修飾パターンは、本明細書では「AS−M64」または「M64」修飾パターンとも称される。
追加の実施形態において、該DsiRNAは、
を含み、ここで、「X」=RNA、「X」=2’−O−メチルRNA、「Y」は、任意で2’−O−メチルRNAモノマーであるRNAモノマー1〜4個で構成されたオーバーハングドメインであり、下線の引かれた残基は、2’−O−メチルRNAモノマーである。上の鎖は、センス鎖であり、下の鎖は、アンチセンス鎖である。1つの関連の実施形態において、該DsiRNAは、
を含み、ここで、「X」=RNA、「X」=2’−O−メチルRNA、「Y」は、任意で2’−O−メチルRNAモノマーであるRNAモノマー1〜4個で構成されたオーバーハングドメインであり、下線の引かれた残基は、2’−O−メチルRNAモノマーであり、「D」=DNAである。上の鎖は、センス鎖であり、下の鎖は、アンチセンス鎖である。別の関連の実施形態において、該DsiRNAは、
を含み、ここで、「X」=RNA、「X」=2’−O−メチルRNAである。上の鎖は、センス鎖であり、下の鎖は、アンチセンス鎖である。さらなる関連の実施形態において、該DsiRNAは、
を含み、ここで、「X」=RNA、「X」=2’−O−メチルRNA、「D」=DNAである。上の鎖は、センス鎖であり、下の鎖は、アンチセンス鎖である。この修飾パターンは、本明細書では「AS−M65」または「M65」修飾パターンとも称される。
さらなる実施形態において、該DsiRNAは、
を含み、ここで、「X」=RNA、「X」=2’−O−メチルRNA、「Y」は、任意で2’−O−メチルRNAモノマーであるRNAモノマー1〜4個で構成されたオーバーハングドメインであり、下線の引かれた残基は、2’−O−メチルRNAモノマーである。上の鎖は、センス鎖であり、下の鎖は、アンチセンス鎖である。1つの関連の実施形態において、該DsiRNAは、
を含み、ここで、「X」=RNA、「X」=2’−O−メチルRNA、「Y」は、任意で2’−O−メチルRNAモノマーであるRNAモノマー1〜4個で構成されたオーバーハングドメインであり、下線の引かれた残基は、2’−O−メチルRNAモノマーであり、「D」=DNAである。上の鎖は、センス鎖であり、下の鎖は、アンチセンス鎖である。別の関連の実施形態において、該DsiRNAは、
を含み、ここで、「X」=RNA、「X」=2’−O−メチルRNAである。上の鎖は、センス鎖であり、下の鎖は、アンチセンス鎖である。さらなる関連の実施形態において、該DsiRNAは、
を含み、ここで、「X」=RNA、「X」=2’−O−メチルRNA、「D」=DNAであ る。上の鎖は、センス鎖であり、下の鎖は、アンチセンス鎖である。この修飾パターンは、本明細書では「AS−M66」または「M66」修飾パターンとも称される。
追加の実施形態において、該DsiRNAは、
を含み、ここで、「X」=RNA、「X」=2’−O−メチルRNA、「Y」は、任意で2’−O−メチルRNAモノマーであるRNAモノマー1〜4個で構成されたオーバーハングドメインであり、下線の引かれた残基は、2’−O−メチルRNAモノマーである。上の鎖は、センス鎖であり、下の鎖は、アンチセンス鎖である。1つの関連の実施形態において、該DsiRNAは、
を含み、ここで、「X」=RNA、「X」=2’−O−メチルRNA、「Y」は、任意で2’−O−メチルRNAモノマーであるRNAモノマー1〜4個で構成されたオーバーハングドメインであり、下線の引かれた残基は、2’−O−メチルRNAモノマーであり、「D」=DNAである。上の鎖は、センス鎖であり、下の鎖は、アンチセンス鎖である。別の関連の実施形態において、該DsiRNAは、
を含み、ここで、「X」=RNA、「X」=2’−O−メチルRNAである。上の鎖は、センス鎖であり、下の鎖は、アンチセンス鎖である。さらなる関連の実施形態において、該DsiRNAは、
を含み、ここで、「X」=RNA、「X」=2’−O−メチルRNA、「D」=DNAである。上の鎖は、センス鎖であり、下の鎖は、アンチセンス鎖である。この修飾パターンは、本明細書では「AS−M67」または「M67」修飾パターンとも称される。
さらなる実施形態において、該DsiRNAは、
を含み、ここで、「X」=RNA、「X」=2’−O−メチルRNA、「Y」は、任意で2’−O−メチルRNAモノマーであるRNAモノマー1〜4個で構成されたオーバーハングドメインであり、下線の引かれた残基は、2’−O−メチルRNAモノマーである。上の鎖は、センス鎖であり、下の鎖は、アンチセンス鎖である。1つの関連の実施形態において、該DsiRNAは、
を含み、ここで、「X」=RNA、「X」=2’−O−メチルRNA、「Y」は、任意で2’−O−メチルRNAモノマーであるRNAモノマー1〜4個で構成されたオーバーハングドメインであり、下線の引かれた残基は、2’−O−メチルRNAモノマーであり、「D」=DNAである。上の鎖は、センス鎖であり、下の鎖は、アンチセンス鎖である。別の関連の実施形態において、該DsiRNAは、
を含み、ここで、「X」=RNA、「X」=2’−O−メチルRNAである。上の鎖は、センス鎖であり、下の鎖は、アンチセンス鎖である。さらなる関連の実施形態において、該DsiRNAは、
を含み、ここで、「X」=RNA、「X」=2’−O−メチルRNA、「D」=DNAである。上の鎖は、センス鎖であり、下の鎖は、アンチセンス鎖である。この修飾パターンは、本明細書では「AS−M68」または「M68」修飾パターンとも称される。
追加の実施形態において、該DsiRNAは、
を含み、ここで、「X」=RNA、「X」=2’−O−メチルRNA、「Y」は、任意で2’−O−メチルRNAモノマーであるRNAモノマー1〜4個で構成されたオーバーハングドメインであり、下線の引かれた残基は、2’−O−メチルRNAモノマーである。上の鎖は、センス鎖であり、下の鎖は、アンチセンス鎖である。1つの関連の実施形態において、該DsiRNAは、
を含み、ここで、「X」=RNA、「X」=2’−O−メチルRNA、「Y」は、任意で2’−O−メチルRNAモノマーであるRNAモノマー1〜4個で構成されたオーバーハングドメインであり、下線の引かれた残基は、2’−O−メチルRNAモノマーであり、「D」=DNAである。上の鎖は、センス鎖であり、下の鎖は、アンチセンス鎖である。別の関連の実施形態において、該DsiRNAは、
を含み、ここで、「X」=RNA、「X」=2’−O−メチルRNAである。上の鎖は、センス鎖であり、下の鎖は、アンチセンス鎖である。さらなる関連の実施形態において、該DsiRNAは、
を含み、ここで、「X」=RNA、「X」=2’−O−メチルRNA、「D」=DNAである。上の鎖は、センス鎖であり、下の鎖は、アンチセンス鎖である。この修飾パターンは、本明細書では「AS−M69」または「M69」修飾パターンとも称される。
さらなる実施形態において、該DsiRNAは、
を含み、ここで、「X」=RNA、「X」=2’−O−メチルRNA、「Y」は、任意で2’−O−メチルRNAモノマーであるRNAモノマー1〜4個で構成されたオーバーハングドメインであり、下線の引かれた残基は、2’−O−メチルRNAモノマーである。上の鎖は、センス鎖であり、下の鎖は、アンチセンス鎖である。1つの関連の実施形態において、該DsiRNAは、
を含み、ここで、「X」=RNA、「X」=2’−O−メチルRNA、「Y」は、任意で2’−O−メチルRNAモノマーであるRNAモノマー1〜4個で構成されたオーバーハングドメインであり、下線の引かれた残基は、2’−O−メチルRNAモノマーであり、「D」=DNAである。上の鎖は、センス鎖であり、下の鎖は、アンチセンス鎖である。別の関連の実施形態において、該DsiRNAは、
を含み、ここで、「X」=RNA、「X」=2’−O−メチルRNAである。上の鎖は、センス鎖であり、下の鎖は、アンチセンス鎖である。さらなる関連の実施形態において、該DsiRNAは、
を含み、ここで、「X」=RNA、「X」=2’−O−メチルRNA、「D」=DNAである。上の鎖は、センス鎖であり、下の鎖は、アンチセンス鎖である。この修飾パターンは、本明細書では「AS−M70」または「M70」修飾パターンとも称される。
追加の実施形態において、該DsiRNAは、
を含み、ここで、「X」=RNA、「X」=2’−O−メチルRNA、「Y」は、任意で2’−O−メチルRNAモノマーであるRNAモノマー1〜4個で構成されたオーバーハングドメインであり、下線の引かれた残基は、2’−O−メチルRNAモノマーである。上の鎖は、センス鎖であり、下の鎖は、アンチセンス鎖である。1つの関連の実施形態において、該DsiRNAは、
を含み、ここで、「X」=RNA、「X」=2’−O−メチルRNA、「Y」は、任意で2’−O−メチルRNAモノマーであるRNAモノマー1〜4個で構成されたオーバーハングドメインであり、下線の引かれた残基は、2’−O−メチルRNAモノマーであり、「D」=DNAである。上の鎖は、センス鎖であり、下の鎖は、アンチセンス鎖である。別の関連の実施形態において、該DsiRNAは、
を含み、ここで、「X」=RNA、「X」=2’−O−メチルRNAである。上の鎖は、センス鎖であり、下の鎖は、アンチセンス鎖である。さらなる関連の実施形態において、該DsiRNAは、
を含み、ここで、「X」=RNA、「X」=2’−O−メチルRNA、「D」=DNAである。上の鎖は、センス鎖であり、下の鎖は、アンチセンス鎖である。この修飾パターンは、本明細書では「AS−M71」または「M71」修飾パターンとも称される。
さらなる実施形態において、該DsiRNAは、
を含み、ここで、「X」=RNA、「X」=2’−O−メチルRNA、「Y」は、任意で2’−O−メチルRNAモノマーであるRNAモノマー1〜4個で構成されたオーバーハングドメインであり、下線の引かれた残基は、2’−O−メチルRNAモノマーである。上の鎖は、センス鎖であり、下の鎖は、アンチセンス鎖である。1つの関連の実施形態において、該DsiRNAは、
を含み、ここで、「X」=RNA、「X」=2’−O−メチルRNA、「Y」は、任意で2’−O−メチルRNAモノマーであるRNAモノマー1〜4個で構成されたオーバーハングドメインであり、下線の引かれた残基は、2’−O−メチルRNAモノマーであり、「D」=DNAである。上の鎖は、センス鎖であり、下の鎖は、アンチセンス鎖である。別の関連の実施形態において、該DsiRNAは、
を含み、ここで、「X」=RNA、「X」=2’−O−メチルRNAである。上の鎖は、センス鎖であり、下の鎖は、アンチセンス鎖である。さらなる関連の実施形態において、該DsiRNAは、
を含み、ここで、「X」=RNA、「X」=2’−O−メチルRNA、「D」=DNAである。上の鎖は、センス鎖であり、下の鎖は、アンチセンス鎖である。この修飾パターンは、本明細書では「AS−M72」または「M72」修飾パターンとも称される。
追加の実施形態において、該DsiRNAは、
を含み、ここで、「X」=RNA、「X」=2’−O−メチルRNA、「Y」は、任意で2’−O−メチルRNAモノマーであるRNAモノマー1〜4個で構成されたオーバーハングドメインであり、下線の引かれた残基は、2’−O−メチルRNAモノマーである。上の鎖は、センス鎖であり、下の鎖は、アンチセンス鎖である。1つの関連の実施形態において、該DsiRNAは、
を含み、ここで、「X」=RNA、「X」=2’−O−メチルRNA、「Y」は、任意で2’−O−メチルRNAモノマーであるRNAモノマー1〜4個で構成されたオーバーハングドメインであり、下線の引かれた残基は、2’−O−メチルRNAモノマーであり、「D」=DNAである。上の鎖は、センス鎖であり、下の鎖は、アンチセンス鎖である。別の関連の実施形態において、該DsiRNAは、
を含み、ここで、「X」=RNA、「X」=2’−O−メチルRNAである。上の鎖は、センス鎖であり、下の鎖は、アンチセンス鎖である。さらなる関連の実施形態において、該DsiRNAは、
を含み、ここで、「X」=RNA、「X」=2’−O−メチルRNA、「D」=DNAである。上の鎖は、センス鎖であり、下の鎖は、アンチセンス鎖である。この修飾パターンは、本明細書では「AS−M73」または「M73」修飾パターンとも称される。
追加の実施形態において、該DsiRNAは、
を含み、ここで、「X」=RNA、「X」=2’−O−メチルRNAである。さらなる関連の実施形態において、該DsiRNAは、
を含み、ここで、「X」=RNA、「X」=2’−O−メチルRNA、「D」=DNAである。上の鎖は、センス鎖であり、下の鎖は、アンチセンス鎖である。この修飾パターンは、本明細書では「AS−M7*」または「M7*」修飾パターンとも称される。
さらなる実施形態において、該DsiRNAは、
を含み、ここで、「X」=RNA、「X」=2’−O−メチルRNAである。上の鎖は、センス鎖であり、下の鎖は、アンチセンス鎖である。さらなる関連の実施形態において、該DsiRNAは、
を含み、ここで、「X」=RNA、「X」=2’−O−メチルRNA、「D」=DNAである。上の鎖は、センス鎖であり、下の鎖は、アンチセンス鎖である。この修飾パターンは、本明細書では「AS−M6*」または「M6*」修飾パターンとも称される。
別の実施形態において、該DsiRNAは、
を含み、ここで、「X」=RNA、「X」=2’−O−メチルRNAである。上の鎖は、センス鎖であり、下の鎖は、アンチセンス鎖である。別の関連の実施形態において、該DsiRNAは、
を含み、ここで、「X」=RNA、「X」=2’−O−メチルRNA、「D」=DNAである。上の鎖は、センス鎖であり、下の鎖は、アンチセンス鎖である。この修飾パターンは、本明細書では「AS−M5*」または「M5*」修飾パターンとも称される。
さらなる実施形態において、該DsiRNAは、
を含み、ここで、「X」=RNA、「X」=2’−O−メチルRNAである。上の鎖は、センス鎖であり、下の鎖は、アンチセンス鎖である。さらなる関連の実施形態において、該DsiRNAは、
を含み、ここで、「X」=RNA、「X」=2’−O−メチルRNA、「D」=DNAである。上の鎖は、センス鎖であり、下の鎖は、アンチセンス鎖である。この修飾パターンは、本明細書では「AS−M4*」または「M4*」修飾パターンとも称される。
追加の実施形態において、該DsiRNAは、
を含み、ここで、「X」=RNA、「X」=2’−O−メチルRNAである。上の鎖は、センス鎖であり、下の鎖は、アンチセンス鎖である。さらなる関連の実施形態において、該DsiRNAは、
を含み、ここで、「X」=RNA、「X」=2’−O−メチルRNA、「D」=DNAである。上の鎖は、センス鎖であり、下の鎖は、アンチセンス鎖である。この修飾パターンは、本明細書では「AS−8*」または「M8*」修飾パターンとも称される。
さらなる実施形態において、該DsiRNAは、
を含み、ここで、「X」=RNA、「X」=2’−O−メチルRNAである。上の鎖は、センス鎖であり、下の鎖は、アンチセンス鎖である。さらなる関連の実施形態において、該DsiRNAは、
を含み、ここで、「X」=RNA、「X」=2’−O−メチルRNA、「D」=DNAである。上の鎖は、センス鎖であり、下の鎖は、アンチセンス鎖である。この修飾パターンは、本明細書では「AS−M2*」または「M2*」修飾パターンとも称される。
別の実施形態において、該DsiRNAは、
を含み、ここで、「X」=RNA、「X」=2’−O−メチルRNAである。上の鎖は、センス鎖であり、下の鎖は、アンチセンス鎖である。さらなる関連の実施形態において、該DsiRNAは、
を含み、ここで、「X」=RNA、「X」=2’−O−メチルRNA、「D」=DNAである。上の鎖は、センス鎖であり、下の鎖は、アンチセンス鎖である。この修飾パターンは、本明細書では「AS−M10*」または「M10*」修飾パターンとも称される。
さらなる実施形態において、該DsiRNAは、
を含み、ここで、「X」=RNA、「X」=2’−O−メチルRNAである。上の鎖は、センス鎖であり、下の鎖は、アンチセンス鎖である。さらなる関連の実施形態において、該DsiRNAは、
を含み、ここで、「X」=RNA、「X」=2’−O−メチルRNA、「D」=DNAである。上の鎖は、センス鎖であり、下の鎖は、アンチセンス鎖である。この修飾パターンは、本明細書では「AS−M11*」または「M11*」修飾パターンとも称される。
さらなる実施形態において、該DsiRNAは、
を含み、ここで、「X」=RNA、「X」=2’−O−メチルRNAである。上の鎖は、センス鎖であり、下の鎖は、アンチセンス鎖である。さらなる関連の実施形態において、該DsiRNAは、
を含み、ここで、「X」=RNA、「X」=2’−O−メチルRNA、「D」=DNAである。上の鎖は、センス鎖であり、下の鎖は、アンチセンス鎖である。この修飾パターンは、本明細書では「AS−M13*」または「M13*」修飾パターンとも称される。
さらなる実施形態において、該DsiRNAは、
を含み、ここで、「X」=RNA、「X」=2’−O−メチルRNAである。上の鎖は、センス鎖であり、下の鎖は、アンチセンス鎖である。さらなる関連の実施形態において、該DsiRNAは、
を含み、ここで、「X」=RNA、「X」=2’−O−メチルRNA、「D」=DNAである。上の鎖は、センス鎖であり、下の鎖は、アンチセンス鎖である。この修飾パターンは、本明細書では「AS−M14*」または「M14*」修飾パターンとも称される。
追加の実施形態において、該DsiRNAは、
を含み、ここで、「X」=RNA、「X」=2’−O−メチルRNAである。上の鎖は、センス鎖であり、下の鎖は、アンチセンス鎖である。さらなる関連の実施形態において、該DsiRNAは、
を含み、ここで、「X」=RNA、「X」=2’−O−メチルRNA、「D」=DNAである。上の鎖は、センス鎖であり、下の鎖は、アンチセンス鎖である。この修飾パターンは、本明細書では「AS−M15*」または「M15*」修飾パターンとも称される。
さらなる実施形態において、該DsiRNAは、
を含み、ここで、「X」=RNA、「X」=2’−O−メチルRNAである。上の鎖は、センス鎖であり、下の鎖は、アンチセンス鎖である。さらなる関連の実施形態において、該DsiRNAは、
を含み、ここで、「X」=RNA、「X」=2’−O−メチルRNA、「D」=DNAである。上の鎖は、センス鎖であり、下の鎖は、アンチセンス鎖である。この修飾パターンは、本明細書では「AS−M16*」または「M16*」修飾パターンとも称される。
追加の実施形態において、該DsiRNAは、
を含み、ここで、「X」=RNA、「X」=2’−O−メチルRNAである。上の鎖は、センス鎖であり、下の鎖は、アンチセンス鎖である。さらなる関連の実施形態において、該DsiRNAは、
を含み、ここで、「X」=RNA、「X」=2’−O−メチルRNA、「D」=DNAである。上の鎖は、センス鎖であり、下の鎖は、アンチセンス鎖である。この修飾パターンは、本明細書では「AS−M17*」または「M17*」修飾パターンとも称される。
さらなる実施形態において、該DsiRNAは、
を含み、ここで、「X」=RNA、「X」=2’−O−メチルRNAである。上の鎖は、センス鎖であり、下の鎖は、アンチセンス鎖である。さらなる関連の実施形態において、該DsiRNAは、
を含み、ここで、「X」=RNA、「X」=2’−O−メチルRNA、「D」=DNAである。上の鎖は、センス鎖であり、下の鎖は、アンチセンス鎖である。この修飾パターンは、本明細書では「AS−M18*」または「M18*」修飾パターンとも称される。
追加の実施形態において、該DsiRNAは、
を含み、ここで、「X」=RNA、「X」=2’−O−メチルRNAである。上の鎖は、センス鎖であり、下の鎖は、アンチセンス鎖である。さらなる関連の実施形態において、該DsiRNAは、
を含み、ここで、「X」=RNA、「X」=2’−O−メチルRNA、「D」=DNAである。上の鎖は、センス鎖であり、下の鎖は、アンチセンス鎖である。この修飾パターンは、本明細書では「AS−M19*」または「M19*」修飾パターンとも称される。
さらなる実施形態において、該DsiRNAは、
を含み、ここで、「X」=RNA、「X」=2’−O−メチルRNA、「Y」は、任意で2’−O−メチルRNAモノマーであるRNAモノマー1〜4個で構成されたオーバーハングドメインであり、下線の引かれた残基は、2’−O−メチルRNAモノマーであり、「D」=DNAである。上の鎖は、センス鎖であり、下の鎖は、アンチセンス鎖である。別の関連の実施形態において、該DsiRNAは、
を含み、ここで、「X」=RNA、「X」=2’−O−メチルRNAである。上の鎖は、センス鎖であり、下の鎖は、アンチセンス鎖である。さらなる関連の実施形態において、該DsiRNAは、
を含み、ここで、「X」=RNA、「X」=2’−O−メチルRNA、「D」=DNAである。上の鎖は、センス鎖であり、下の鎖は、アンチセンス鎖である。この修飾パターンは、本明細書では「AS−M20*」または「M20*」修飾パターンとも称される。
追加の実施形態において、該DsiRNAは、
を含み、ここで、「X」=RNA、「X」=2’−O−メチルRNAである。上の鎖は、センス鎖であり、下の鎖は、アンチセンス鎖である。さらなる関連の実施形態において、該DsiRNAは、
を含み、ここで、「X」=RNA、「X」=2’−O−メチルRNA、「D」=DNAである。上の鎖は、センス鎖であり、下の鎖は、アンチセンス鎖である。この修飾パターンは、本明細書では「AS−M22*」または「M22*」修飾パターンとも称される。
さらなる実施形態において、該DsiRNAは、
を含み、ここで、「X」=RNA、「X」=2’−O−メチルRNAである。上の鎖は、センス鎖であり、下の鎖は、アンチセンス鎖である。さらなる関連の実施形態において、該DsiRNAは、
を含み、ここで、「X」=RNA、「X」=2’−O−メチルRNA、「D」=DNAである。上の鎖は、センス鎖であり、下の鎖は、アンチセンス鎖である。この修飾パターンは、本明細書では「AS−M24*」または「M24*」修飾パターンとも称される。
追加の実施形態において、該DsiRNAは、
を含み、ここで、「X」=RNA、「X」=2’−O−メチルRNAである。上の鎖は、センス鎖であり、下の鎖は、アンチセンス鎖である。さらなる関連の実施形態において、該DsiRNAは、
を含み、ここで、「X」=RNA、「X」=2’−O−メチルRNA、「D」=DNAである。上の鎖は、センス鎖であり、下の鎖は、アンチセンス鎖である。この修飾パターンは、本明細書では「AS−M25*」または「M25*」修飾パターンとも称される。
さらなる実施形態において、該DsiRNAは、
を含み、ここで、「X」=RNA、「X」=2’−O−メチルRNAである。上の鎖は、センス鎖であり、下の鎖は、アンチセンス鎖である。さらなる関連の実施形態において、該DsiRNAは、
を含み、ここで、「X」=RNA、「X」=2’−O−メチルRNA、「D」=DNAである。上の鎖は、センス鎖であり、下の鎖は、アンチセンス鎖である。この修飾パターンは、本明細書では「AS−M26*」または「M26*」修飾パターンとも称される。
追加の実施形態において、該DsiRNAは、
を含み、ここで、「X」=RNA、「X」=2’−O−メチルRNAである。上の鎖は、センス鎖であり、下の鎖は、アンチセンス鎖である。さらなる関連の実施形態において、該DsiRNAは、
を含み、ここで、「X」=RNA、「X」=2’−O−メチルRNA、「D」=DNAである。上の鎖は、センス鎖であり、下の鎖は、アンチセンス鎖である。この修飾パターンは、本明細書では「AS−M27*」または「M27*」修飾パターンとも称される。
追加の実施形態において、該DsiRNAは、
を含み、ここで、「X」=RNA、「X」=2’−O−メチルRNAである。上の鎖は、センス鎖であり、下の鎖は、アンチセンス鎖である。さらなる関連の実施形態において、該DsiRNAは、
を含み、ここで、「X」=RNA、「X」=2’−O−メチルRNA、「D」=DNAである。上の鎖は、センス鎖であり、下の鎖は、アンチセンス鎖である。この修飾パターンは、本明細書では「AS−M28*」または「M28*」修飾パターンとも称される。
さらなる実施形態において、該DsiRNAは、
を含み、ここで、「X」=RNA、「X」=2’−O−メチルRNAである。上の鎖は、センス鎖であり、下の鎖は、アンチセンス鎖である。さらなる関連の実施形態において、該DsiRNAは、
を含み、ここで、「X」=RNA、「X」=2’−O−メチルRNA、「D」=DNAである。上の鎖は、センス鎖であり、下の鎖は、アンチセンス鎖である。この修飾パターンは、本明細書では「AS−M29*」または「M29*」修飾パターンとも称される。
追加の実施形態において、該DsiRNAは、
を含み、ここで、「X」=RNA、「X」=2’−O−メチルRNAである。上の鎖は、センス鎖であり、下の鎖は、アンチセンス鎖である。さらなる関連の実施形態において、該DsiRNAは、
を含み、ここで、「X」=RNA、「X」=2’−O−メチルRNA、「D」=DNAである。上の鎖は、センス鎖であり、下の鎖は、アンチセンス鎖である。この修飾パターンは、本明細書では「AS−M34*」または「M34*」修飾パターンとも称される。
さらなる実施形態において、該DsiRNAは、
を含み、ここで、「X」=RNA、「X」=2’−O−メチルRNAである。上の鎖は、センス鎖であり、下の鎖は、アンチセンス鎖である。さらなる関連の実施形態において、該DsiRNAは、
を含み、ここで、「X」=RNA、「X」=2’−O−メチルRNA、「D」=DNAである。上の鎖は、センス鎖であり、下の鎖は、アンチセンス鎖である。この修飾パターンは、本明細書では「AS−M35*」または「M35*」修飾パターンとも称される。
追加の実施形態において、該DsiRNAは、
を含み、ここで、「X」=RNA、「X」=2’−O−メチルRNAである。上の鎖は、センス鎖であり、下の鎖は、アンチセンス鎖である。さらなる関連の実施形態において、該DsiRNAは、
を含み、ここで、「X」=RNA、「X」=2’−O−メチルRNA、「D」=DNAである。上の鎖は、センス鎖であり、下の鎖は、アンチセンス鎖である。この修飾パターンは、本明細書では「AS−M37*」または「M37*」修飾パターンとも称される。
さらなる実施形態において、該DsiRNAは、
を含み、ここで、「X」=RNA、「X」=2’−O−メチルRNAである。上の鎖は、センス鎖であり、下の鎖は、アンチセンス鎖である。さらなる関連の実施形態において、該DsiRNAは、
を含み、ここで、「X」=RNA、「X」=2’−O−メチルRNA、「D」=DNAである。上の鎖は、センス鎖であり、下の鎖は、アンチセンス鎖である。この修飾パターンは、本明細書では「AS−M38*」または「M38*」修飾パターンとも称される。
さらなる実施形態において、該DsiRNAは、
を含み、ここで、「X」=RNA、「X」=2’−O−メチルRNAである。上の鎖は、センス鎖であり、下の鎖は、アンチセンス鎖である。さらなる関連の実施形態において、該DsiRNAは、
を含み、ここで、「X」=RNA、「X」=2’−O−メチルRNA、「D」=DNAである。上の鎖は、センス鎖であり、下の鎖は、アンチセンス鎖である。この修飾パターンは、本明細書では「AS−M40*」または「M40*」修飾パターンとも称される。
追加の実施形態において、該DsiRNAは、
を含み、ここで、「X」=RNA、「X」=2’−O−メチルRNAである。上の鎖は、センス鎖であり、下の鎖は、アンチセンス鎖である。さらなる関連の実施形態において、該DsiRNAは、
を含み、ここで、「X」=RNA、「X」=2’−O−メチルRNA、「D」=DNAである。上の鎖は、センス鎖であり、下の鎖は、アンチセンス鎖である。この修飾パターンは、本明細書では「AS−M41*」または「M41*」修飾パターンとも称される。
さらなる実施形態において、該DsiRNAは、
を含み、ここで、「X」=RNA、「X」=2’−O−メチルRNAである。上の鎖は、センス鎖であり、下の鎖は、アンチセンス鎖である。さらなる関連の実施形態において、該DsiRNAは、
を含み、ここで、「X」=RNA、「X」=2’−O−メチルRNA、「D」=DNAである。上の鎖は、センス鎖であり、下の鎖は、アンチセンス鎖である。この修飾パターンは、本明細書では「AS−M36*」または「M36*」修飾パターンとも称される。
追加の実施形態において、該DsiRNAは、
5'-XXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXX-3'
3’-XXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXX-5’
を含み、ここで、「X」=RNA、「X」=2’−O−メチルRNAである。上の鎖は、センス鎖であり、下の鎖は、アンチセンス鎖である。さらなる関連の実施形態において、該DsiRNAは、
を含み、ここで、「X」=RNA、「X」=2’−O−メチルRNA、「D」=DNAである。上の鎖は、センス鎖であり、下の鎖は、アンチセンス鎖である。この修飾パターンは、本明細書では「AS−M42*」または「M42*」修飾パターンとも称される。
さらなる実施形態において、該DsiRNAは、
を含み、ここで、「X」=RNA、「X」=2’−O−メチルRNAである。上の鎖は、センス鎖であり、下の鎖は、アンチセンス鎖である。さらなる関連の実施形態において、該DsiRNAは、
を含み、ここで、「X」=RNA、「X」=2’−O−メチルRNA、「D」=DNAである。上の鎖は、センス鎖であり、下の鎖は、アンチセンス鎖である。この修飾パターンは、本明細書では「AS−M43*」または「M43*」修飾パターンとも称される。
追加の実施形態において、該DsiRNAは、
を含み、ここで、「X」=RNA、「X」=2’−O−メチルRNAである。上の鎖は、センス鎖であり、下の鎖は、アンチセンス鎖である。さらなる関連の実施形態において、該DsiRNAは、
を含み、ここで、「X」=RNA、「X」=2’−O−メチルRNA、「D」=DNAである。上の鎖は、センス鎖であり、下の鎖は、アンチセンス鎖である。この修飾パターンは、本明細書では「AS−M44*」または「M44*」修飾パターンとも称される。
さらなる実施形態において、該DsiRNAは、
を含み、ここで、「X」=RNA、「X」=2’−O−メチルRNAである。上の鎖は、センス鎖であり、下の鎖は、アンチセンス鎖である。さらなる関連の実施形態において、該DsiRNAは、
を含み、ここで、「X」=RNA、「X」=2’−O−メチルRNA、「D」=DNAである。上の鎖は、センス鎖であり、下の鎖は、アンチセンス鎖である。この修飾パターンは、本明細書では「AS−M46*」または「M46*」修飾パターンとも称される。
追加の実施形態において、該DsiRNAは、
を含み、ここで、「X」=RNA、「X」=2’−O−メチルRNAである。上の鎖は、センス鎖であり、下の鎖は、アンチセンス鎖である。さらなる関連の実施形態において、該DsiRNAは、
を含み、ここで、「X」=RNA、「X」=2’−O−メチルRNA、「D」=DNAである。上の鎖は、センス鎖であり、下の鎖は、アンチセンス鎖である。この修飾パターンは、本明細書では「AS−M47*」または「M47*」修飾パターンとも称される。
さらなる実施形態において、該DsiRNAは、
を含み、ここで、「X」=RNA、「X」=2’−O−メチルRNAである。上の鎖は、センス鎖であり、下の鎖は、アンチセンス鎖である。さらなる関連の実施形態において、該DsiRNAは、
を含み、ここで、「X」=RNA、「X」=2’−O−メチルRNA、「D」=DNAである。上の鎖は、センス鎖であり、下の鎖は、アンチセンス鎖である。この修飾パターンは、本明細書では「AS−M48*」または「M48*」修飾パターンとも称される。
追加の実施形態において、該DsiRNAは、
を含み、ここで、「X」=RNA、「X」=2’−O−メチルRNAである。上の鎖は、センス鎖であり、下の鎖は、アンチセンス鎖である。さらなる関連の実施形態において、該DsiRNAは、
を含み、ここで、「X」=RNA、「X」=2’−O−メチルRNA、「D」=DNAである。上の鎖は、センス鎖であり、下の鎖は、アンチセンス鎖である。この修飾パターンは、本明細書では「AS−M52*」または「M52*」修飾パターンとも称される。
さらなる実施形態において、該DsiRNAは、
を含み、ここで、「X」=RNA、「X」=2’−O−メチルRNAである。上の鎖は、センス鎖であり、下の鎖は、アンチセンス鎖である。さらなる関連の実施形態において、該DsiRNAは、
を含み、ここで、「X」=RNA、「X」=2’−O−メチルRNA、「D」=DNAである。上の鎖は、センス鎖であり、下の鎖は、アンチセンス鎖である。この修飾パターンは、本明細書では「AS−M54*」または「M54*」修飾パターンとも称される。
追加の実施形態において、該DsiRNAは、
を含み、ここで、「X」=RNA、「X」=2’−O−メチルRNAである。上の鎖は、センス鎖であり、下の鎖は、アンチセンス鎖である。さらなる関連の実施形態において、該DsiRNAは、
を含み、ここで、「X」=RNA、「X」=2’−O−メチルRNA、「D」=DNAである。上の鎖は、センス鎖であり、下の鎖は、アンチセンス鎖である。この修飾パターンは、本明細書では「AS−M55*」または「M55*」修飾パターンとも称される。
さらなる実施形態において、該DsiRNAは、
を含み、ここで、「X」=RNA、「X」=2’−O−メチルRNAである。上の鎖は、センス鎖であり、下の鎖は、アンチセンス鎖である。さらなる関連の実施形態において、該DsiRNAは、
を含み、ここで、「X」=RNA、「X」=2’−O−メチルRNA、「D」=DNAである。上の鎖は、センス鎖であり、下の鎖は、アンチセンス鎖である。この修飾パターンは、本明細書では「AS−M56*」または「M56*」修飾パターンとも称される。
追加の実施形態において、該DsiRNAは、
を含み、ここで、「X」=RNA、「X」=2’−O−メチルRNAである。上の鎖は、センス鎖であり、下の鎖は、アンチセンス鎖である。さらなる関連の実施形態において、該DsiRNAは、
を含み、ここで、「X」=RNA、「X」=2’−O−メチルRNA、「D」=DNAである。上の鎖は、センス鎖であり、下の鎖は、アンチセンス鎖である。この修飾パターンは、本明細書では「AS−M57*」または「M57*」修飾パターンとも称される。
さらなる実施形態において、該DsiRNAは、
を含み、ここで、「X」=RNA、「X」=2’−O−メチルRNAである。上の鎖は、センス鎖であり、下の鎖は、アンチセンス鎖である。さらなる関連の実施形態において、該DsiRNAは、
を含み、ここで、「X」=RNA、「X」=2’−O−メチルRNA、「D」=DNAである。上の鎖は、センス鎖であり、下の鎖は、アンチセンス鎖である。この修飾パターンは、本明細書では「AS−M58*」または「M58*」修飾パターンとも称される。
追加の実施形態において、該DsiRNAは、
を含み、ここで、「X」=RNA、「X」=2’−O−メチルRNAである。上の鎖は、センス鎖であり、下の鎖は、アンチセンス鎖である。さらなる関連の実施形態において、該DsiRNAは、
を含み、ここで、「X」=RNA、「X」=2’−O−メチルRNA、「D」=DNAである。上の鎖は、センス鎖であり、下の鎖は、アンチセンス鎖である。この修飾パターンは、本明細書では「AS−M59*」または「M59*」修飾パターンとも称される。
さらなる実施形態において、該DsiRNAは、
を含み、ここで、「X」=RNA、「X」=2’−O−メチルRNAである。上の鎖は、センス鎖であり、下の鎖は、アンチセンス鎖である。さらなる関連の実施形態において、該DsiRNAは、
を含み、ここで、「X」=RNA、「X」=2’−O−メチルRNA、「D」=DNAである。上の鎖は、センス鎖であり、下の鎖は、アンチセンス鎖である。この修飾パターンは、本明細書では「AS−M60*」または「M60*」修飾パターンとも称される。
追加の実施形態において、該DsiRNAは、
を含み、ここで、「X」=RNA、「X」=2’−O−メチルRNAである。上の鎖は、センス鎖であり、下の鎖は、アンチセンス鎖である。さらなる関連の実施形態において、該DsiRNAは、
を含み、ここで、「X」=RNA、「X」=2’−O−メチルRNA、「D」=DNAである。上の鎖は、センス鎖であり、下の鎖は、アンチセンス鎖である。この修飾パターンは、本明細書では「AS−M61*」または「M61*」修飾パターンとも称される。
さらなる実施形態において、該DsiRNAは、
を含み、ここで、「X」=RNA、「X」=2’−O−メチルRNAである。上の鎖は、センス鎖であり、下の鎖は、アンチセンス鎖である。さらなる関連の実施形態において、該DsiRNAは、
を含み、ここで、「X」=RNA、「X」=2’−O−メチルRNA、「D」=DNAである。上の鎖は、センス鎖であり、下の鎖は、アンチセンス鎖である。この修飾パターンは、本明細書では「AS−M62*」または「M62*」修飾パターンとも称される。
追加の実施形態において、該DsiRNAは、
を含み、ここで、「X」=RNA、「X」=2’−O−メチルRNAである。上の鎖は、センス鎖であり、下の鎖は、アンチセンス鎖である。さらなる関連の実施形態において、該DsiRNAは、
を含み、ここで、「X」=RNA、「X」=2’−O−メチルRNA、「D」=DNAである。上の鎖は、センス鎖であり、下の鎖は、アンチセンス鎖である。この修飾パターンは、本明細書では「AS−M63*」または「M63*」修飾パターンとも称される。
さらなる実施形態において、該DsiRNAは、
を含み、ここで、「X」=RNA、「X」=2’−O−メチルRNAである。上の鎖は、センス鎖であり、下の鎖は、アンチセンス鎖である。さらなる関連の実施形態において、該DsiRNAは、
を含み、ここで、「X」=RNA、「X」=2’−O−メチルRNA、「D」=DNAである。上の鎖は、センス鎖であり、下の鎖は、アンチセンス鎖である。この修飾パターンは、本明細書では「AS−M64*」または「M64*」修飾パターンとも称される。
追加の実施形態において、該DsiRNAは、
を含み、ここで、「X」=RNA、「X」=2’−O−メチルRNAである。上の鎖は、センス鎖であり、下の鎖は、アンチセンス鎖である。さらなる関連の実施形態において、該DsiRNAは、
を含み、ここで、「X」=RNA、「X」=2’−O−メチルRNA、「D」=DNAである。上の鎖は、センス鎖であり、下の鎖は、アンチセンス鎖である。この修飾パターンは、本明細書では「AS−M65*」または「M65*」修飾パターンとも称される。
さらなる実施形態において、該DsiRNAは、
を含み、ここで、「X」=RNA、「X」=2’−O−メチルRNAである。上の鎖は、センス鎖であり、下の鎖は、アンチセンス鎖である。さらなる関連の実施形態において、該DsiRNAは、
を含み、ここで、「X」=RNA、「X」=2’−O−メチルRNA、「D」=DNAである。上の鎖は、センス鎖であり、下の鎖は、アンチセンス鎖である。この修飾パターンは、本明細書では「AS−M66*」または「M66*」修飾パターンとも称される。
追加の実施形態において、該DsiRNAは、
を含み、ここで、「X」=RNA、「X」=2’−O−メチルRNAである。上の鎖は、センス鎖であり、下の鎖は、アンチセンス鎖である。さらなる関連の実施形態において、該DsiRNAは、
を含み、ここで、「X」=RNA、「X」=2’−O−メチルRNA、「D」=DNAである。上の鎖は、センス鎖であり、下の鎖は、アンチセンス鎖である。この修飾パターンは、本明細書では「AS−M67*」または「M67*」修飾パターンとも称される。
さらなる実施形態において、該DsiRNAは、
を含み、ここで、「X」=RNA、「X」=2’−O−メチルRNAである。上の鎖は、センス鎖であり、下の鎖は、アンチセンス鎖である。さらなる関連の実施形態において、該DsiRNAは、
を含み、ここで、「X」=RNA、「X」=2’−O−メチルRNA、「D」=DNAである。上の鎖は、センス鎖であり、下の鎖は、アンチセンス鎖である。この修飾パターンは、本明細書では「AS−M68*」または「M68*」修飾パターンとも称される。
追加の実施形態において、該DsiRNAは、
を含み、ここで、「X」=RNA、「X」=2’−O−メチルRNAである。上の鎖は、センス鎖であり、下の鎖は、アンチセンス鎖である。さらなる関連の実施形態において、該DsiRNAは、
を含み、ここで、「X」=RNA、「X」=2’−O−メチルRNA、「D」=DNAである。上の鎖は、センス鎖であり、下の鎖は、アンチセンス鎖である。この修飾パターンは、本明細書では「AS−M69*」または「M69*」修飾パターンとも称される。
さらなる実施形態において、該DsiRNAは、
を含み、ここで、「X」=RNA、「X」=2’−O−メチルRNAである。上の鎖は、センス鎖であり、下の鎖は、アンチセンス鎖である。さらなる関連の実施形態において、該DsiRNAは、
を含み、ここで、「X」=RNA、「X」=2’−O−メチルRNA、「D」=DNAである。上の鎖は、センス鎖であり、下の鎖は、アンチセンス鎖である。この修飾パターンは、本明細書では「AS−M70*」または「M70*」修飾パターンとも称される。
追加の実施形態において、該DsiRNAは、
を含み、ここで、「X」=RNA、「X」=2’−O−メチルRNAである。上の鎖は、センス鎖であり、下の鎖は、アンチセンス鎖である。さらなる関連の実施形態において、該DsiRNAは、
を含み、ここで、「X」=RNA、「X」=2’−O−メチルRNA、「D」=DNAである。上の鎖は、センス鎖であり、下の鎖は、アンチセンス鎖である。この修飾パターンは、本明細書では「AS−M71*」または「M71*」修飾パターンとも称される。
さらなる実施形態において、該DsiRNAは、
を含み、ここで、「X」=RNA、「X」=2’−O−メチルRNAである。上の鎖は、センス鎖であり、下の鎖は、アンチセンス鎖である。さらなる関連の実施形態において、該DsiRNAは、
を含み、ここで、「X」=RNA、「X」=2’−O−メチルRNA、「D」=DNAである。上の鎖は、センス鎖であり、下の鎖は、アンチセンス鎖である。この修飾パターンは、本明細書では「AS−M72*」または「M72*」修飾パターンとも称される。
追加の実施形態において、該DsiRNAは、
を含み、ここで、「X」=RNA、「X」=2’−O−メチルRNAである。上の鎖は、センス鎖であり、下の鎖は、アンチセンス鎖である。さらなる関連の実施形態において、該DsiRNAは、
を含み、ここで、「X」=RNA、「X」=2’−O−メチルRNA、「D」=DNAである。上の鎖は、センス鎖であり、下の鎖は、アンチセンス鎖である。この修飾パターンは、本明細書では「AS−M73*」または「M73*」修飾パターンとも称される。
追加の例示的アンチセンス鎖修飾としては、以下のものが挙げられ:
ここで、「X」=RNA、「X」=2’−O−メチルRNA、「D」=DNA、「F」=2’−フルオロNA、「p」=ホスホロチオアート結合である。
特定の追加の実施形態において、本発明の選択されたdsRNAのアンチセンス鎖は、任意で5’末端で、伸長しており、それぞれ以下の通り表される、塩基「AS−M8」、「AS−M17」及び「AS−M48」修飾パターンの例示的な5’伸長を有し:
ここで、「X」=RNA、「X」=2’−O−メチルRNA、「F」=2’−フルオロNA、太字で斜体の「A」は、2’−フルオロアデニン残基を示す。
特定の実施形態において、本発明のDsiRNAのセンス鎖は、修飾されており、センス鎖修飾の具体的な例示形態を以下に示し、そのような修飾センス鎖が先に示されたDsiRNAのいずれかのセンス鎖の代わりに用いられて、上記のアンチセンス鎖でアニーリングした下記のセンス鎖を含むDsiRNAを作製する可能性が企図される。例示的なセンス鎖修飾パターンとしては、
が挙げられ、ここで、「X」=RNA、「X」=2’−O−メチルRNA、「D」=DNA、「F」=2’−フルオロNA、「p」=ホスホロチオアート結合である。
先の修飾パターンは、例えば伸長DsiRNA構造及びミスマッチ、ならびに/または下記のほどけたDsiRNA構造に、組み込むこともできる。
別の実施形態において、該DsiRNAは、ダイサー切断を方向づける働きがあるミスマッチ残基を1〜3個有する同じ長さの鎖を含む(具体的には、第一及び第二の鎖が互いにアニーリングされる際に、3’末端残基から数えてDsiRNAの第一の鎖の1、2または3位の1つまたは複数が、第二の鎖の5’末端領域の対応する残基とミスマッチする)。2つの末端ミスマッチ残基を有する例示的な27量体DsiRNA剤を示す:
ここで、「X」=RNA、「M」=鎖がアニーリングされる際、相補性鎖の「M」残基に対応する核酸残基と塩基対合(水素結合)しない核酸残基(RNA、DNAまたは非天然もしくは修飾核酸))。そのような薬剤の残基のいずれも、任意で2’−O−メチルRNAモノマーになり得る、つまり上記の非対称の薬剤に関して示される通り、下の(第二の)鎖の3’末端残基から開始する2’−O−メチルRNAモノマーの交互配置が、先の「平滑/ほぐれた」DsiRNA剤の中でも用いられ得る。一実施形態において、上の鎖は、センス鎖であり、下の鎖は、アンチセンス鎖である。あるいは下の鎖は、センス鎖であり、上の鎖は、アンチセンス鎖である。
特定の追加の実施形態において、本発明は、予測されるセンス鎖ダイサー切断部位の3’位及び予測されるアンチセンス鎖ダイサー切断部位の対応する5’位にある二本鎖リボ核酸(dsRNA)の領域内に1つまたは複数の塩基対合したデオキシリボヌクレオチドを有するRNA干渉(RNAi)のための組成物を提供する。本発明の組成物は、前駆分子であるdsRNAを含み、即ち本発明のdsRNAは、インビボで処理されて、活性の低分子干渉核酸(siRNA)を生成する。該dsRNAは、ダイサーにより活性siRNAに処理されて、RISCに取り込まれる。
特定の実施形態において、本発明のDsiRNA剤は、以下の例示的構造を有し得る(以下の例示的構造のいずれも、例えば上記構造の下の鎖の修飾パターンと組み合わせ得ることに留意されたい、つまり1つの具体的実施例において、上記構造のいずれかに示された下の鎖の修飾パターンが、下記構造のいずれかにある下の鎖の最も3’側の27残基に適用され、別の具体的実施例において、下の鎖の最も3’側の23残基にある上記構造のいずれかに示された下の鎖の修飾パターンが、下記構造のいずれかにある下の鎖の最も3’側の23残基に適用される)。
1つのそのような実施形態において、該DsiRNAは、以下のもの(例示的な「右に伸長した」、「DNAが伸長した」DsiRNA):
を含み、ここで、「X」=RNA、「Y」は、任意で2’−O−メチルRNAモノマーであるRNAモノマー0〜10個で構成された任意のオーバーハングドメインであり、ある特定の実施形態において、「Y」は、任意で2’−O−メチルRNAモノマーであるRNAモノマー1〜4個で構成されたオーバーハングドメインであり、「D」=DNA、「N」=1〜50またはそれを超える数値であるが、任意で1〜8または1〜10である。「N*」=0〜15またはそれを超える数値であるが、任意で0、1、2、3、4、5または6である。一実施形態において、上の鎖は、センス鎖であり、下の鎖は、アンチセンス鎖である。あるいは下の鎖は、センス鎖であり、上の鎖は、アンチセンス鎖である。
関連の実施形態において、該DsiRNAは、
を含み、ここで、「X」=RNA、「Y」は、任意で2’−O−メチルRNAモノマーであるRNAモノマー0〜10個で構成された任意のオーバーハングドメインであり、ある特定の実施形態において、「Y」は、任意で2’−O−メチルRNAモノマーであるRNAモノマー1〜4個で構成されたオーバーハングドメインであり、「D」=DNA、「N」=1〜50またはそれを超える数値であるが、任意で1〜8または1〜10である。「N*」=0〜15またはそれを超える数値であるが、任意で0、1、2、3、4、5または6である。一実施形態において、上の鎖は、センス鎖であり、下の鎖は、アンチセンス鎖である。あるいは下の鎖は、センス鎖であり、上の鎖は、アンチセンス鎖である。
追加の実施形態において、該DsiRNAは、
を含み、ここで、「X」=RNA、「X」=2’−O−メチルRNA、「Y」は、任意で2’−O−メチルRNAモノマーであるRNAモノマー0〜10個で構成された任意のオーバーハングドメインであり、ある特定の実施形態において、「Y」は、任意で2’−O−メチルRNAモノマーであるRNAモノマー1〜4個で構成されたオーバーハングドメインであり、「D」=DNA、「Z」=DNAまたはRNA、「N」=1〜50またはそれを超える数値であるが、任意で1〜8または1〜10である。「N*」=0〜15またはそれを超える数値であるが、任意で0、1、2、3、4、5または6である。一実施形態において、上の鎖は、センス鎖であり、下の鎖は、アンチセンス鎖である。あるいは下の鎖は、センス鎖であり、上の鎖は、アンチセンス鎖であり、2’−O−メチルRNAモノマーが、本明細書において先の図に示された下の鎖ではなくむしろ上の鎖に沿って交互の残基に配置される。
別のそのような実施形態において、該DsiRNAは、
を含み、ここで、「X」=RNA、「X」=2’−O−メチルRNA、「Y」は、任意で2’−O−メチルRNAモノマーであるRNAモノマー0〜10個で構成された任意のオーバーハングドメインであり、ある特定の実施形態において、「Y」は、任意で2’−O−メチルRNAモノマーであるRNAモノマー1〜4個で構成されたオーバーハングドメインであり、「D」=DNA、「Z」=DNAまたはRNA、「N」=1〜50またはそれを超える数値であるが、任意で1〜8または1〜10である。「N*」=0〜15またはそれを超える数値であるが、任意で0、1、2、3、4、5または6である。一実施形態において、上の鎖は、センス鎖であり、下の鎖は、アンチセンス鎖である。あるいは下の鎖は、センス鎖であり、上の鎖は、アンチセンス鎖であり、2’−O−メチルRNAモノマーが、本明細書において先の図に示された下の鎖ではなくむしろ上の鎖に沿って交互の残基に配置される。
別のそのような実施形態において、該DsiRNAは、
を含み、ここで、「X」=RNA、「X」=2’−O−メチルRNA、「Y」は、任意で2’−O−メチルRNAモノマーであるRNAモノマー0〜10個で構成された任意のオーバーハングドメインであり、ある特定の実施形態において、「Y」は、任意で2’−O−メチルRNAモノマーであるRNAモノマー1〜4個で構成されたオーバーハングドメインであり、「D」=DNA、「Z」=DNAまたはRNA、「N」=1〜50またはそれを超える数値であるが、任意で1〜8または1〜10である。「N*」=0〜15またはそれを超える数値であるが、任意で0、1、2、3、4、5または6である)を含む。一実施形態において、上の鎖は、センス鎖であり、下の鎖は、アンチセンス鎖である。あるいは下の鎖は、センス鎖であり、上の鎖は、アンチセンス鎖であり、2’−O−メチルRNAモノマーが、本明細書において先の図に示された下の鎖ではなくむしろ上の鎖に沿って交互の残基に配置される。
別の実施形態において、該DsiRNAは、
を含み、ここで、「X」=RNA、「Y」は、任意で2’−O−メチルRNAモノマーであるRNAモノマー0〜10個で構成された任意のオーバーハングドメインであり、ある特定の実施形態において、「Y」は、任意で2’−O−メチルRNAモノマーであるRNAモノマー1〜4個で構成されたオーバーハングドメインであり、「D」=DNA、「Z」=DNAまたはRNA、「N」=1〜50またはそれを超える数値であるが、任意で1〜8または1〜10であり、少なくとも1つのD1Nが、上の鎖に存在して下の鎖の対応するD2Nと塩基対合している。任意でD1N及びD1N+1が、対応するD2N及びD2N+1と塩基対合しており、D1N、D1N+1及びD1N+2が、対応するD2N、D1N+1及びD1N+2と塩基対合している、などとなっている。「N*」=0〜15またはそれを超える数値であるが、任意で0、1、2、3、4、5または6である。一実施形態において、上の鎖は、センス鎖であり、下の鎖は、アンチセンス鎖である。あるいは下の鎖は、センス鎖であり、上の鎖は、アンチセンス鎖であり、2’−O−メチルRNAモノマーが、本明細書において先の図に示された下の鎖ではなくむしろ上の鎖に沿って交互の残基に配置される。
本明細書に示された構造において、センス鎖またはアンチセンス鎖のいずれかの5’末端は、任意でリン酸基を含み得る。
別の実施形態において、DNA:DNAが伸長したDsiRNAは、ダイサー切断を方向づける働きがあるミスマッチ残基を1〜3個有する同じ長さの鎖を含む(具体的には、第一及び第二の鎖が互いにアニーリングされる際、3’末端残基から数えてDsiRNAの第一の鎖の1、2または3位の1つまたは複数が、第二の鎖の5’末端領域の対応する残基とミスマッチする)。2つの末端ミスマッチ残基を有する例示的なDNA:DNAが伸長したDsiRNA剤を示す:
ここで、「X」=RNA、「M」=鎖がアニーリングされる際にそれ以外では相補性鎖の「M」残基に対応する核酸残基と塩基対合(水素結合)しない核酸残基(RNA、DNAまたは非天然もしくは修飾核酸)、「D」=DNA、「N」=1〜50またはそれを超える数値であるが、任意で1〜15または1〜8である。「N*」=0〜15またはそれを超える数値であるが、任意で0、1、2、3、4、5または6である。そのような薬剤の残基のいずれも、任意で2’−O−メチルRNAモノマーになり得る、つまり上記の非対称の薬剤に関して示される通り、下の(第二の)鎖の3’末端残基から開始する2’−O−メチルRNAモノマーの交互配置が、先の「平滑/ほぐれた」DsiRNA剤の中でも用いられ得る。一実施形態において、上の鎖(第一の鎖)は、センス鎖であり、下の鎖(第二の鎖)は、アンチセンス鎖である。あるいは下の鎖は、センス鎖であり、上の鎖は、アンチセンス鎖である。非対称/オーバーハングの薬剤に関して先に示されたものに匹敵する修飾及びDNA:DNA伸長パターンもまた、そのような「平滑/ほぐれた」薬剤に組み込むことができる。
一実施形態において、特定方向のダイサー切断により機能するようにモデル化された部位に位置するデオキシリボヌクレオチドを含むが、dsRNA構造内の塩基対合したデオキシリボヌクレオチドの存在を必要としない、長いDsiRNA剤が提供される。そのような分子の例示的構造を示す:
ここで、「X」=RNA、「Y」は、任意で2’−O−メチルRNAモノマーであるRNAモノマー0〜10個で構成された任意のオーバーハングドメインであり、ある特定の実施形態において、「Y」は、任意で2’−O−メチルRNAモノマーであるRNAモノマー1〜4個で構成されたオーバーハングドメインであり、「D」=DNA)。一実施形態において、上の鎖は、センス鎖であり、下の鎖は、アンチセンス鎖である。あるいは下の鎖は、センス鎖であり、上の鎖は、アンチセンス鎖である。上記構造は、主な処理後形態としてダイサーに最小で21量体の二重鎖を切断させるようにモデル化させている。上記構造の下の鎖がアンチセンス鎖である実施形態において、アンチセンス鎖の5’末端の最後及び最後から二番目の残基にある2つのデオキシリボヌクレオチド残基の位置づけが、オフターゲット効果の低減を助けることになる(以前の研究で、アンチセンス鎖の5’末端の少なくとも最後から2番目の2’−O−メチル修飾が、オフターゲット効果を低減することが示されたため。例えばUS2007/0223427参照)。
一実施形態において、該DsiRNAは、以下のもの(例示的な「左が伸長した」、「DNAが伸長した」DsiRNA):
を含み、ここで、「X」=RNA、「Y」は、任意で2’−O−メチルRNAモノマーであるRNAモノマー0〜10個で構成された任意のオーバーハングドメインであり、ある特定の実施形態において、「Y」は、任意で2’−O−メチルRNAモノマーであるRNAモノマー1〜4個で構成されたオーバーハングドメインであり、「D」=DNA、「N」=1〜50またはそれを超える数値であるが、任意で1〜8または1〜10である。「N*」=0〜15またはそれを超える数値であるが、任意で0、1、2、3、4、5または6である)を含む。一実施形態において、上の鎖は、センス鎖であり、下の鎖は、アンチセンス鎖である。あるいは下の鎖は、センス鎖であり、上の鎖は、アンチセンス鎖である。
関連の実施形態において、該DsiRNAは、
を含み、ここで、「X」=RNA、任意で2’−O−メチルRNAモノマーであり、「D」=DNA、「N」=1〜50またはそれを超える数値であるが、任意で1〜8または1〜10である。「N*」=0〜15またはそれを超える数値であるが、任意で0、1、2、3、4、5または6である。一実施形態において、上の鎖は、センス鎖であり、下の鎖は、アンチセンス鎖である。あるいは下の鎖は、センス鎖であり、上の鎖は、アンチセンス鎖である。
追加の実施形態において、該DsiRNAは、
を含み、ここで、「X」=RNA、任意で2’−O−メチルRNAモノマーであり、「D」=DNA、「N」=1〜50またはそれを超える数値であるが、任意で1〜8または1〜10である。「N*」=0〜15またはそれを超える数値であるが、任意で0、1、2、3、4、5または6である。「Z」=DNAまたはRNAである。一実施形態において、上の鎖は、センス鎖であり、下の鎖は、アンチセンス鎖である。あるいは下の鎖は、センス鎖であり、上の鎖は、アンチセンス鎖であり、2’−O−メチルRNAモノマーが、本明細書において先の図に示された下の鎖ではなくむしろ上の鎖に沿って交互の残基に配置される。
別のそのような実施形態において、該DsiRNAは、
を含み、ここで、「X」=RNA、任意で2’−O−メチルRNAモノマーであり、「D」=DNA、「N」=1〜50またはそれを超える数値であるが、任意で1〜8または1〜10である。「N*」=0〜15またはそれを超える数値であるが、任意で0、1、2、3、4、5または6である。「Z」=DNAまたはRNAである。一実施形態において、上の鎖は、センス鎖であり、下の鎖は、アンチセンス鎖である。あるいは下の鎖は、センス鎖であり、上の鎖は、アンチセンス鎖であり、2’−O−メチルRNAモノマーが、本明細書において先の図に示された下の鎖ではなくむしろ上の鎖に沿って交互の残基に配置される。
別のそのような実施形態において、該DsiRNAは、
を含み、ここで、「X」=RNA、「X」=2’−O−メチルRNA、「D」=DNA、「Z」=DNAまたはRNA、「N」=1〜50またはそれを超える数値であるが、任意で1〜8または1〜10である。「N*」=0〜15またはそれを超える数値であるが、任意で0、1、2、3、4、5または6である。一実施形態において、上の鎖は、センス鎖であり、下の鎖は、アンチセンス鎖である。あるいは下の鎖は、センス鎖であり、上の鎖は、アンチセンス鎖であり、2’−O−メチルRNAモノマーが、本明細書において先の図に示された下の鎖ではなくむしろ上の鎖に沿って交互の残基に配置される。
別のそのような実施形態において、該DsiRNAは、
を含み、ここで、「X」=RNA、「X」=2’−O−メチルRNA、「D」=DNA、「Z」=DNAまたはRNA、「N」=1〜50またはそれを超える数値であるが、任意で1〜8または1〜10である。「N*」=0〜15またはそれを超える数値であるが、任意で0、1、2、3、4、5または6である。「Y」は、任意で2’−O−メチルRNAモノマーであるRNAモノマー0〜10個で構成された任意のオーバーハングドメインであり、特定の実施形態において、「Y」は、任意で2’−O−メチルRNAモノマーであるRNAモノマー1〜4個で構成されたオーバーハングドメインである。一実施形態において、上の鎖は、センス鎖であり、下の鎖は、アンチセンス鎖である。あるいは下の鎖は、センス鎖であり、上の鎖は、アンチセンス鎖であり、2’−O−メチルRNAモノマーが、本明細書において先の図に示された下の鎖ではなくむしろ上の鎖に沿って交互の残基に配置される。
別の実施形態において、該DsiRNAは、
を含み、ここで、「X」=RNA、「D」=DNA、「Z」=DNAまたはRNA、「N」=1〜50またはそれを超える数値であるが、任意で1〜8または1〜10であり、少なくとも1つのD1Nが、上の鎖に存在して下の鎖の対応するD2Nと塩基対合している。任意でD1N及びD1N+1が、対応するD2N及びD2N+1と塩基対合しており;D1N、D1N+1及びD1N+2が、対応するD2N、D1N+1及びD1N+2と塩基対合している、などとなっている。「N*」=0〜15またはそれを超える数値であるが、任意で0、1、2、3、4、5または6である。一実施形態において、上の鎖は、センス鎖であり、下の鎖は、アンチセンス鎖である。あるいは下の鎖は、センス鎖であり、上の鎖は、アンチセンス鎖であり、2’−O−メチルRNAモノマーが、本明細書において先の図に示された下の鎖ではなくむしろ上の鎖に沿って交互の残基に配置される。
関連の実施形態において、該DsiRNAは、
を含み、ここで、「X」=RNA、「D」=DNA、「Y」は、任意で2’−O−メチルRNAモノマーであるRNAモノマー0〜10個で構成された任意のオーバーハングドメインであり、ある特定の実施形態において、「Y」は、任意で2’−O−メチルRNAモノマーであるRNAモノマー1〜4個で構成されたオーバーハングドメインであり、「N」=1〜50またはそれを超える数値であるが、任意で1〜8または1〜10であり、少なくとも1つのD1Nが、上の鎖に存在して下の鎖の対応するD2Nと塩基対合している。任意でD1N及びD1N+1が、対応するD2N及びD2N+1と塩基対合しており;D1N、D1N+1及びD1N+2が、対応するD2N、D1N+1及びD1N+2と塩基対合している、などとなっている。「N*」=0〜15またはそれを超える数値であるが、任意で0、1、2、3、4、5または6である。一実施形態において、上の鎖は、センス鎖であり、下の鎖は、アンチセンス鎖である。あるいは下の鎖は、センス鎖であり、上の鎖は、アンチセンス鎖であり、2’−O−メチルRNAモノマーが、本明細書において先の図に示された下の鎖ではなくむしろ上の鎖に沿って交互の残基に配置される。
別の実施形態において、DNA:DNAが伸長したDsiRNAは、ダイサー切断を方向づける働きがあるミスマッチ残基を1〜3個有する同じ長さの鎖を含む(具体的には、第一及び第二の鎖が互いにアニーリングされる際、3’末端残基から数えてDsiRNAの第一の鎖の1、2または3位の1つまたは複数が、第二の鎖の5’末端領域の対応する残基とミスマッチする)。2つの末端ミスマッチ残基を有する例示的なDNA:DNAが伸長したDsiRNA剤を示す:
ここで、「X」=RNA、「M」=鎖がアニーリングされる際にそれ以外では相補性鎖の「M」残基に対応する核酸残基と塩基対合(水素結合)しない核酸残基(RNA、DNAまたは非天然もしくは修飾核酸)、「D」=DNA、「N」=1〜50またはそれを超える数値であるが、任意で1〜8または1〜10である。「N*」=0〜15またはそれを超える数値であるが、任意で0、1、2、3、4、5または6である。そのような薬剤の残基のいずれも、任意で2’−O−メチルRNAモノマーになり得る、つまり上記の非対称の薬剤に関して示される通り、下の(第二の)鎖の3’末端残基から開始する2’−O−メチルRNAモノマーの交互配置が、先の「平滑/ほぐれた」DsiRNA剤の中でも用いられ得る。一実施形態において、上の鎖(第一の鎖)は、センス鎖であり、下の鎖(第二の鎖)は、アンチセンス鎖である。あるいは下の鎖は、センス鎖であり、上の鎖は、アンチセンス鎖である。非対称/オーバーハングの薬剤に関して先に示されたものに匹敵する修飾及びDNA:DNA伸長パターンもまた、そのような「平滑/ほぐれた」薬剤に組み込むことができる。
別の実施形態において、特定方向のダイサー切断により機能するようにモデル化された部位に位置するデオキシリボヌクレオチドを含むが、dsRNA構造内の塩基対合したデオキシリボヌクレオチドの存在を必要としない、長いDsiRNA剤が提供される。そのような分子の例示的構造を示す:
ここで、「X」=RNA、「Y」は、任意で2’−O−メチルRNAモノマーであるRNAモノマー0〜10個で構成された任意のオーバーハングドメインであり、ある特定の実施形態において、「Y」は、任意で2’−O−メチルRNAモノマーであるRNAモノマー1〜4個で構成されたオーバーハングドメインであり、「D」=DNAである。「N*」=0〜15またはそれを超える数値であるが、任意で0、1、2、3、4、5または6である)。一実施形態において、上の鎖は、センス鎖であり、下の鎖は、アンチセンス鎖である。あるいは下の鎖は、センス鎖であり、上の鎖は、アンチセンス鎖である。
上記構造の下の鎖がアンチセンス鎖である上記実施形態のいずれかにおいも、アンチセンス鎖の5’末端の最後及び最後から二番目の残基にある2つのデオキシリボヌクレオチド残基の位置づけが、オフターゲット効果の低減を助けることになる(以前の研究で、アンチセンス鎖の5’末端の少なくとも最後から2番目の位置の2’−O−メチル修飾がオフターゲット効果を低減することが示されたため。例えばUS2007/0223427参照)。
ある特定の実施形態において、上記構造の「D」残基は、少なくとも1つのPS−DNAまたはPS−RNAを含む。任意で、上記構造の「D」残基は、ダイサー切断を阻害する少なくとも1つの修飾ヌクレオチドを含む。
上記の「DNAが伸長した」DsiRNA剤は、「左伸長」または「右伸長」のいずれかに分類することができるが、1つの薬剤中に左伸長及び右伸長の両方のDNAを含有する配列(例えば、コアdsRNA構造を取り囲む両方の隣接部分がdsDNA伸長である)を含むDsiRNA剤を、「右伸長」剤及び「左伸長」剤に関して本明細書に記載されたものと類似の手法で作製及び使用することもできる。
幾つかの実施形態において、本発明のDsiRNAは、DNA:DNAが伸長したDsiRNA剤のセンス鎖とアンチセンス鎖をつなぐ連結部分またはドメインをさらに含む。任意で、そのような連結部分のドメインは、センス鎖の3’末端とアンチセンス鎖の5’末端をつなぐ。該連結部分は、オリゴメチレンジオールリンカー、オリゴエチレングリコールリンカー、または他の当該技術分野で認識されたリンカー部分など、化学的(非ヌクレオチド)リンカーであってもよい。あるいは該リンカーは、任意で伸長ループ及び/またはテトラループをはじめとする、ヌクレオチドリンカーであり得る。
一実施形態において、該DsiRNA剤は、非対称構造を有し、センス鎖が25塩基対長、そしてアンチセンス鎖が27塩基対長で1〜4塩基の3’−オーバーハング(例えば、1塩基の3’−オーバーハング、2塩基の3’−オーバーハング、3塩基の3’−オーバーハング、または4塩基の3’−オーバーハング)を有する。別の実施形態において、このDsiRNA剤は、センス鎖の3’末端に2つのデオキシヌクレオチド(deoxynucleotides)をさらに含む非対称構造を有する。
別の実施形態において、該DsiRNA剤は、非対称構造を有し、アンチセンス鎖が25塩基対長、そしてセンス鎖が27塩基対長で1〜4塩基の3’−オーバーハング(例えば、1塩基の3’−オーバーハング、2塩基の3’−オーバーハング、3塩基の3’−オーバーハング、または4塩基の3’−オーバーハング)を有する。別の実施形態において、このDsiRNA剤は、アンチセンス鎖の3’末端に2つのデオキシリボヌクレオチドをさらに含む非対称構造を有する。
本発明の例示的なα1アンチトリプシンを標的とするDsiRNA剤、及びそれらに関連するα1アンチトリプシン標的配列は、下の一連の表に表された以下のものを含む:
表番号:
(2) 選択されたヒト抗α1アンチトリプシンDsiRNA剤(非対称);
(3) 選択されたヒト抗α1アンチトリプシンDsiRNA − 非修飾二重鎖(非対称);
(4) α1アンチトリプシンmRNA内のDsiRNA標的配列(21量体);
(5) 選択されたヒト抗α1アンチトリプシン「平滑/平滑」DsiRNA;及び
(6) α1アンチトリプシンmRNA内のDsiRNA成分の19ヌクレオチド標的配列;
(7) 追加のヒト抗α1アンチトリプシンDsiRNA剤(非対称);
(8) 追加のヒト抗α1アンチトリプシンDsiRNA − 非修飾二重鎖(非対称);
(9) α1アンチトリプシンmRNA内の追加のDsiRNA標的配列(21量体);
(10) 追加のヒト抗α1アンチトリプシン「平滑/平滑」DsiRNA;及び
(11) α1アンチトリプシンmRNA内の追加のDsiRNA成分の19ヌクレオチド標的配列;
(12) さらなるヒト抗α1アンチトリプシンDsiRNA剤(非対称);
(13) さらなるヒト抗α1アンチトリプシンDsiRNA − 非修飾二重鎖(非対称);
(14) α1アンチトリプシンmRNA内のさらなるDsiRNA標的配列(21量体);
(15) さらなるヒト抗α1アンチトリプシン「平滑/平滑」DsiRNA;及び
(16) α1アンチトリプシンmRNA内のさらなるDsiRNA成分の19ヌクレオチド標的配列;
(17) 他のヒト抗α1アンチトリプシンDsiRNA剤(非対称);
(18) 他のヒト抗α1アンチトリプシンDsiRNA − 非修飾二重鎖(非対称);
(19) α1アンチトリプシンmRNA内の他のDsiRNA標的配列(21量体);
(20) 他のヒト抗α1アンチトリプシン「平滑/平滑」DsiRNA;及び
(21) α1アンチトリプシンmRNA内の他のDsiRNA成分の19ヌクレオチド標的配列。
先の表2、3、5、7、8、10、12、13、15、17、18及び20において、下線が引かれた残基は、2’−O−メチル残基を示し、大文字は、リボヌクレオチドを、そして小文字は、デオキシリボヌクレオチドを示す。先の表2〜3、7〜8、12〜13及び17〜18のDsiRNA剤は、平滑末端を有する25/27量体の薬剤である。先の表2〜3、7〜8、12〜13及び17〜18の該薬剤の構造及び/または修飾パターンを、先の一般的な配列構造に容易に適合させることができ、例えば第二の鎖の3’オーバーハングを拡張または短縮させることができ、第二の鎖の2’−O−メチル化を、任意で交互の部位などで、第二の鎖の5’末端に向かって拡張させることができる。そのようなさらなる修飾を有する25/27量体DsiRNAは、先のDsiRNA剤からも容易に設計することができ、α1アンチトリプシン発現の機能的阻害剤にもなると予測されるため、そのようなさらなる修飾は、選択肢になる。同様に先の表5、10、15及び20の薬剤の27量体「平滑/平滑」DsiRNA構造及び/または修飾パターンもまた、例えばそのような構造にアンチセンス鎖の修飾パターンを適用するため、そして/または先の一般的構造にそのような配列を適合させるために、先の一般的な配列構造に容易に適合させることができる。
ある特定の実施形態において、それぞれが27ヌクレオチドの独立した鎖長を有する27量体DsiRNAが、本明細書の表2〜3、7〜8、12〜13及び17〜18に示された非対称「25/27」構造と同じ、α1アンチトリプシン転写産物内の部位を標的化するように設計及び合成される。例示的な「27/27」DsiRNAが、任意で先の表5、10、15及び20のDsiRNAに関して示された「平滑/平滑」構造を含んで設計される。
ある特定の実施形態において、本発明のdsRNA剤は、例えば第二の鎖の対応する残基に相補性がある第一の鎖の少なくとも19、少なくとも20、少なくとも21、少なくとも22、少なくとも23、少なくとも24、少なくとも25または少なくとも26の残基を必要とする。ある特定の関連の実施形態において、第二の鎖の対応する残基に相補性があるこれらの第一の鎖の残基は、任意で連続した残基である。
本発明のある特定のDsiRNAmm(「DsiRNAミスマッチ」)の実施形態において、ミスマッチ塩基対は、対応する標的核酸の予測されるAgo2切断部位の場所に関して、本明細書で定義された「ミスマッチ耐性領域」内に配置される。ミスマッチ耐性領域は、標的鎖の予測されるAgo2切断部位の「上流」に配置される。この文脈の「上流」は、DsiRNAmm二重鎖の最も5’側の部分と理解され、ここでの5’は、DsiRNA二重鎖のセンス鎖の方向を指す。それゆえミスマッチ耐性領域は、標的核酸の予測されるAgo2切断部位に対応するセンス(パッセンジャー)鎖の塩基の上流であり(図1参照)、あるいはDsiRNAmmのアンチセンス(ガイド)鎖を参照する場合には、ミスマッチ耐性領域は、標的核酸の予測されるAgo2切断部位に相補性がある塩基の下流、即ちDsiRNAmmのアンチセンス鎖の最も3’側の部分に位置すると記載することもできる(ここでのアンチセンス鎖の1位は、アンチセンス鎖の5’末端ヌクレオチドである。図1参照)。
一実施形態において、例えば図1に示された通り付番すると、ミスマッチ耐性領域は、二重鎖のセンス鎖の5’末端から開始するヌクレオチドのナンバリングでは塩基対3〜9の間に(これらの数を含む)位置する。それゆえ本発明のDsiRNAmmは、右伸長DsiRNAのセンス鎖の3、4、5、6、7、8または9位のいずれか一箇所に1つのミスマッチ塩基対を有する(ここでの1位は、センス鎖の5’末端ヌクレオチドであり、9位は、センス鎖配列に対応する標的α1アンチトリプシンRNA配列の予測されるAgo2切断部位の直ぐ5’側にあるセンス鎖のヌクレオチド残基である)。ある特定の実施形態において、センス鎖の3、4、5、6、7、8または9位のいずれかにミスマッチ塩基対ヌクレオチドを有するDsiRNAmmの場合、アンチセンス鎖の対応するミスマッチ塩基対ヌクレオチドは、DsiRNAmmセンス鎖配列とミスマッチ塩基対を形成するだけでなく、DsiRNAmm標的α1アンチトリプシンRNA配列ともミスマッチ塩基対を形成する(したがってアンチセンス鎖配列とセンス鎖配列との相補性が、DsiRNAmm内のミスマッチ塩基対で破壊され、DsiRNAmmのアンチセンス鎖配列と標的α1アンチトリプシンRNA配列の間でも、同様に相同性が破壊される)。代わりの実施形態において、DsiRNAmmのアンチセンス鎖のミスマッチ塩基対ヌクレオチドは、DsiRNAmmのセンス鎖配列の対応するヌクレオチドのみとミスマッチ塩基対を形成するが、対応する標的α1アンチトリプシンRNA配列ヌクレオチドとは塩基対を形成する(したがってアンチセンス鎖配列とセンス鎖配列との相補性は、DsiRNAmm内のミスマッチ塩基対で破壊されるが、DsiRNAmmのアンチセンス鎖配列と標的α1アンチトリプシンRNA配列の間は、相補性が維持される)。
上に記載されたミスマッチ耐性領域(ミスマッチ領域)内に1つのミスマッチ塩基対を有する本発明のDsiRNAmm(例えば、センス鎖の3、4、5、6、7、8または9位のいずれか一箇所に1つのミスマッチヌクレオチド残基を抱えるDsiRNAmm)は、1、2またはさらに3個の追加のミスマッチ塩基対をさらに含み得る。好ましい実施形態において、DsiRNAmmのこれらの1、2または3個の追加のミスマッチ塩基対は、センス鎖の3、4、5、6、7、8及び/または9位(複数可)(及びアンチセンス鎖の対応する残基)に生じる。1つの追加のミスマッチ塩基対がDsiRNAmm内に存在する一実施形態において、センス鎖の2つのミスマッチ塩基対が、例えばセンス鎖の4及び6位の両方のヌクレオチドに生じ得る(ミスマッチがアンチセンス鎖の対応するヌクレオチド残基にも生じる)。
2つのミスマッチ塩基対を有するDsiRNAmm剤において、ミスマッチは、連続して(例えば、センス鎖ヌクレオチド配列に沿って連続した位置に)生じ得る。あるいは、アンチセンス鎖配列とミスマッチ塩基対を形成するセンス鎖ヌクレオチドに、アンチセンス鎖配列と塩基対合するヌクレオチドが散在し得る(例えば、3及び6位にミスマッチヌクレオチドを有すが4及び5位に有さないDsiRNAmmの場合、3及び6位のセンス鎖のミスマッチ残基に、アンチセンス鎖の対応する残基とミスマッチ塩基対を形成する2つのヌクレオチドが散在する)。例えば、対応するアンチセンス鎖配列とミスマッチ塩基対を形成するセンス鎖の2つの残基(センス鎖のミスマッチ耐性領域内に配置される)は、これらのミスマッチ塩基対の間に配置された0、1、2、3、4または5個のミスマッチ塩基対と共に生じ得る。
3つのミスマッチ塩基対を有するある特定のDsiRNAmm剤の場合、ミスマッチは、連続して(例えば、センス鎖ヌクレオチド配列に沿って三連で)生じ得る。あるいはアンチセンス鎖配列とミスマッチ塩基対を形成するセンス鎖ヌクレオチドに、アンチセンス鎖配列とミスマッチ塩基対を形成するヌクレオチドが散在し得る(例えば、3、4及び8位にミスマッチヌクレオチドを有し5、6及び7位に有さないDsiRNAmmの場合、3及び4位のセンス鎖のミスマッチ残基が、互いに隣接し、一方でセンス鎖の4及び8位のミスマッチ残基に、アンチセンス鎖の対応する残基とミスマッチ塩基対を形成する3つのヌクレオチドが散在する)。例えば、対応するアンチセンス鎖配列とミスマッチ塩基対を形成するセンス鎖の3つの残基(センス鎖のミスマッチ耐性領域内に配置される)は、これらのミスマッチ塩基対の任意の2つの間に配置された0、1、2、3、または4個のミスマッチ塩基対と共に生じ得る。
4つのミスマッチ塩基対を有するある特定のDsiRNAmm剤の場合、ミスマッチは、連続して(例えば、センス鎖ヌクレオチド配列に沿って四連で)生じ得る。あるいはアンチセンス鎖配列とミスマッチ塩基対を形成するセンス鎖のヌクレオチドに、アンチセンス鎖配列とミスマッチ塩基対を形成するヌクレオチドが散在し得る(例えば、3、5、7及び8位にミスマッチヌクレオチドを有するが4及び6位に有さないDsiRNAmmの場合、7及び8位のセンス鎖のミスマッチ残基が、互いに隣接し、一方でセンス鎖の3及び5位のミスマッチ残基に、アンチセンス鎖の対応する残基とミスマッチ塩基対を形成する1つのヌクレオチドが散在し、同様に5及び7位のセンス鎖のミスマッチ残基にはまた、アンチセンス鎖の対応する残基とミスマッチ塩基対を形成する1つのヌクレオチドが散在する)。例えば、対応するアンチセンス鎖配列とミスマッチ塩基対を形成するセンス鎖の4つの残基(センス鎖のミスマッチ耐性領域内に配置される)は、これらのミスマッチ塩基対の任意の2つの間に配置された0、1、2または3個のミスマッチ塩基対と共に生じ得る。
別の実施形態において、例えば図1に示された通り付番すると、本発明のDsiRNAmmは、DsiRNAのアンチセンス鎖の17、18、19、20、21、22または23位のいずれか一箇所に1つのミスマッチ塩基対ヌクレオチドを有するミスマッチ耐性領域を含む(ここでは1位は、アンチセンス鎖の5’末端ヌクレオチドであり、17位は、アンチセンス鎖配列に十分に相補性がある標的α1アンチトリプシンRNA配列の予測されるAgo2切断部位のアンチセンス鎖の直ぐ3’側(下流)にあるアンチセンス鎖のヌクレオチド残基である)。ある特定の実施形態において、DsiRNAmmのセンス鎖に関して、アンチセンス鎖の17、18、19、20、21、22または23位のいずれかにミスマッチ塩基対ヌクレオチドを有するDsiRNAmmの場合、アンチセンス鎖のミスマッチ塩基対ヌクレオチドは、DsiRNAmmセンス鎖配列とミスマッチ塩基対を形成するだけでなく、DsiRNAmm標的α1アンチトリプシンRNA配列ともミスマッチ塩基対を形成する(したがってアンチセンス鎖配列とセンス鎖配列との相補性が、DsiRNAmm内のミスマッチ塩基対で破壊され、DsiRNAmmのアンチセンス鎖配列と標的α1アンチトリプシンRNA配列の間でも同様に相同性が破壊される)。代わりの実施形態において、DsiRNAmmのアンチセンス鎖のミスマッチ塩基対ヌクレオチドは、DsiRNAmmのセンス鎖配列の対応するヌクレオチドだけとミスマッチ塩基対を形成し、対応する標的α1アンチトリプシンRNA配列ヌクレオチドとは塩基対を形成する(したがってアンチセンス鎖配列とセンス鎖配列との相補性は、DsiRNAmm内のミスマッチ塩基対で破壊されるが、DsiRNAmmのアンチセンス鎖配列と標的α1アンチトリプシンRNA配列の間には、相補性が維持される)。
うえに記載されたミスマッチ耐性領域内に1つのミスマッチ塩基対を有する本発明のDsiRNAmm(例えば、アンチセンス鎖の17、18、19、20、21、22または23位に1つのミスマッチヌクレオチド残基を抱えるDsiRNAmm)は、1、2または3個の追加のミスマッチ塩基対をさらに含み得る。好ましい実施形態において、DsiRNAmmのこれらの1、2または3個の追加のミスマッチ塩基対は、アンチセンス鎖の17、18、19、20、21、22及び/または23位(複数可)(ならびにセンス鎖の対応する残基)に生じる。1つの追加のミスマッチ塩基対がDsiRNAmm内に存在する一実施形態において、アンチセンス鎖の2つのミスマッチ塩基対が、例えばアンチセンス鎖の18及び20位の両方のヌクレオチドに生じ得る(ミスマッチはセンス鎖の対応するヌクレオチド残基にも生じる)。
2つのミスマッチ塩基対を有するDsiRNAmm剤において、ミスマッチは、連続して(例えば、アンチセンス鎖ヌクレオチド配列に沿って連続した位置に)生じ得る。あるいは、センス鎖配列とミスマッチ塩基対を形成するアンチセンス鎖のヌクレオチドに、センス鎖配列と塩基対合するヌクレオチドが散在し得る(例えば、17及び20位にミスマッチヌクレオチドを有するが18及び19位に有さないDsiRNAmmの場合、17及び20位のアンチセンス鎖のミスマッチ残基に、センス鎖の対応する残基とミスマッチ塩基対を形成する2つのヌクレオチドが散在する)。例えば、対応するセンス鎖配列とミスマッチ塩基対を形成するアンチセンス鎖の2つの残基(センス鎖のミスマッチ耐性領域内に配置される)は、これらのミスマッチ塩基対の間に配置された0、1、2、3、4、5、6または7個のミスマッチ塩基対と共に生じ得る。
3つのミスマッチ塩基対を有するある特定のDsiRNAmm剤の場合、ミスマッチは、連続して(例えば、アンチセンス鎖ヌクレオチド配列に沿って三連で)生じ得る。あるいはセンス鎖配列とミスマッチ塩基対を形成するアンチセンス鎖のヌクレオチドに、センス鎖配列とミスマッチ塩基対を形成するヌクレオチドが散在し得る(例えば、17、18及び22位にミスマッチヌクレオチドを有するが19、20及び21位に有さないDsiRNAmmでは、17及び18位のアンチセンス鎖のミスマッチ残基が、互いに隣接し、一方でアンチセンス鎖の18及び122位のミスマッチ残基に、センス鎖の対応する残基とミスマッチ塩基対を形成する3つのヌクレオチドが散在する)。例えば、対応するセンス鎖配列とミスマッチ塩基対を形成するアンチセンス鎖の3つの残基(アンチセンス鎖のミスマッチ耐性領域内に配置される)は、これらのミスマッチ塩基対の任意の2つの間に配置された0、1、2、3、4、5または6個のミスマッチ塩基対と共に生じ得る。
4つのミスマッチ塩基対を有するある特定のDsiRNAmm剤の場合、ミスマッチは、連続して(例えば、アンチセンス鎖ヌクレオチド配列に沿って四連で)生じ得る。あるいはセンス鎖配列とミスマッチ塩基対を形成するアンチセンス鎖のヌクレオチドに、センス鎖配列とミスマッチ塩基対を形成するヌクレオチドが散在し得る(例えば、18、20、22及び23位にミスマッチヌクレオチドを有するが19及び21位に有さないDsiRNAmmの場合、22及び23位のアンチセンス鎖のミスマッチ残基が、互いに隣接し、一方でアンチセンス鎖の18及び20位のミスマッチ残基に、センス鎖の対応する残基とミスマッチ塩基対を形成する1つのヌクレオチドが散在し、同様に20及び22位のアンチセンス鎖のミスマッチ残基にはまた、センス鎖の対応する残基とミスマッチ塩基対を形成する1つのヌクレオチドが散在する)。例えば、対応するセンス鎖配列とミスマッチ塩基対を形成するアンチセンス鎖の4つの残基(アンチセンス鎖のミスマッチ耐性領域内に配置される)は、これらのミスマッチ塩基対の任意の2つの間に配置された0、1、2、3、4または5個のミスマッチ塩基対と共に生じ得る。
明瞭にするために、上記DsiRNAmm剤の中のミスマッチヌクレオチド残基の場所(複数可)を、DsiRNAmmのセンス鎖またはアンチセンス鎖のいずれかの5’末端残基に関して付番する。アンチセンス鎖のミスマッチ耐性領域(ミスマッチ領域)内に配置された位置の付番を、センス鎖またはアンチセンス鎖の5’末端付近で変動させながら予測されるAgo2切断部位にシフトさせることができる。したがってアンチセンス鎖またはセンス鎖のいずれかの中の好ましいミスマッチ部位の場所(複数可)を、予測されるAgo2切断部位へのそのようなミスマッチの許容し得る近接として特定することもできる。したがって1つの好ましい実施形態において、DsiRNAmmのセンス鎖のミスマッチヌクレオチドの位置は、対応する標的α1アンチトリプシンRNA配列の予測されるAgo2切断部位の直ぐ5’側(上流)に配置されたセンス鎖のヌクレオチド残基である。別の好ましい実施形態において、DsiRNAmmのセンス鎖のミスマッチヌクレオチドは、予測されるAgo2切断部位の2ヌクレオチド5’側(上流)、予測されるAgo2切断部位の3ヌクレオチド5’側(上流)、予測されるAgo2切断部位の4ヌクレオチドの5’側(上流)、予測されるAgo2切断部位の5ヌクレオチド5’側(上流)、予測されるAgo2切断部位の6ヌクレオチドの5’側(上流)、予測されるAgo2切断部位の7ヌクレオチドの5’側(上流)、予測されるAgo2切断部位の8ヌクレオチドの5’側(上流)、または予測されるAgo2切断部位の9ヌクレオチドの5’側(上流)に配置されたセンス鎖のヌクレオチド残基に位置する。
例示的な1つのミスマッチを含有する25/27量体DsiRNA(DsiRNAmm)として、以下の構造が挙げられる(そのようなミスマッチ含有構造を、本明細書に示された他の例示的DsiRNA構造に組み込んでもよい)。
ここで、「X」=RNA、「D」=DNA、「M」=鎖がアニーリングされる際にそれ以外では相補性鎖の「M」残基に対応する核酸残基と塩基対合(水素結合)しない核酸残基(RNA、DNAまたは非天然もしくは修飾核酸)である。そのような薬剤の残基のいずれも、任意で2’−O−メチルRNAモノマーになり得る、つまり先に示される通り、下の(第二の)鎖の3’末端残基から開始する2’−O−メチルRNAモノマーの交互配置が、先のDsiRNAmm剤の中でも用いられ得る。先のミスマッチ構造の場合、上の鎖は、センス鎖であり、下の鎖は、アンチセンス鎖である。
ある特定の実施形態において、本発明のDsiRNAは、標的α1アンチトリプシンRNA配列に関して存在するミスマッチを含み得るが、DsiRNAの2つの鎖の中に必ずしもミスマッチ塩基対として存在するわけではなく、したがってDsiRNAは、DsiRNAの第一の鎖と第二の鎖の間に完全な相補性を有し得るが、それでも標的α1アンチトリプシンRNAに関してミスマッチ残基を有する(それは、ある特定の実施形態において、有効性及び/または効力及び/または作用期間を増進する上で有利になり得る)。ミスマッチがアンチセンス鎖と標的α1アンチトリプシンRNA配列の間に生じるある特定の実施形態において、ミスマッチの位置は、標的領域の予測されるAgo2切断部位の5’側にあるセンス鎖の配列に対応する位置(複数可)のアンチセンス鎖、例えば標的配列の予測されるAgo2切断部位に相補性があるアンチセンス残基の3’のアンチセンス鎖内に位置するアンチセンス鎖残基(複数可)、の中に配置される。
標的配列に関して1つのミスマッチ残基を抱える例示的な25/27量体DsiRNAは、以下の構造を含む。
ここで、「X」=RNA、「D」=DNA、「E」=鎖がアニーリングされる際にそれ以外では相補性(標的)鎖の対応する「A」RNA残基と塩基対合しないが、任意で対応する「B」残基とは塩基対合する核酸残基(RNA、DNAまたは非天然もしくは修飾核酸)である(「B」残基もまた、RNA、DNAまたは非天然もしくは修飾核酸である)。そのような薬剤の残基のいずれも、任意で2’−O−メチルRNAモノマーになり得る、つまり先に示される通り、下の(第二の)鎖の3’末端残基から開始する2’−O−メチルRNAモノマーの交互配置が、先のDsiRNA剤の中でも用いられ得る。
ある特定の実施形態において、標的遺伝子発現を低減するために標的遺伝子配列の少なくとも19ヌクレオチドに沿って標的RNA(例えば、mRNA)に対して十分に相補性がある本発明のdsRNAのガイド鎖は、少なくとも19ヌクレオチド長の標的遺伝子配列に対して完全に相補性があるわけではない。むしろ、標的遺伝子発現を低減するために標的RNA配列の少なくとも19ヌクレオチドに沿って標的mRNAに対して十分に相補性がある本発明のdsRNAのガイド鎖が、19ヌクレオチド長以上の標的鎖配列とミスマッチする1、2、3、または4個またはそれを超えるヌクレオチドを有し得ると認識される。したがって19ヌクレオチドの標的RNA配列の場合、本発明のdsRNAのガイド鎖は、ガイド鎖と標的RNA配列の間に例えば15/19、16/19、17/19または18/19のみのミスマッチヌクレオチド残基を有するが、標的遺伝子レベルを低減するために標的RNA配列に対して十分相補性があり得る。
本発明のdsRNAは、上の例示的構造に加えて、標的α1アンチトリプシンRNA配列とさらなるミスマッチを形成する1、2または3個の追加の残基も有し得る。そのようなミスマッチは、連続し得るが、または標的α1アンチトリプシンRNA配列とミスマッチ塩基対を形成するヌクレオチドが内部に散在し得る。ミスマッチ残基は、ミスマッチ塩基対を形成するヌクレオチドが散在する場合、1つの鎖の中で、そのようなミスマッチ形成残基間に1、2、3、4、5、6、7または8個の塩基対ヌクレオチドの間隔で、互いに分離され得る。
上に記載されたDsiRNA剤に関して、標的α1アンチトリプシンRNA配列とミスマッチ塩基対を形成する(しかし対応するセンス鎖ヌクレオチドとはミスマッチを形成しても、または形成しなくてもよい)アンチセンス鎖ヌクレオチドについてのdsRNA(例えば、DsiRNA)内の好ましい場所は、DsiRNAの予測されるAgo2切断部位に相補性があるアンチセンス鎖配列の3’(下流)に配置されたアンチセンス鎖領域内である(例えば、図1において、予測されるAgo2切断部位の3’にあるアンチセンス鎖の領域が、ミスマッチ形成残基に好ましく、図1に示される25/27量体の薬剤ではアンチセンス鎖の17〜23位に配置されるように生じる)。したがって一実施形態において、DsiRNAmmのアンチセンス鎖の(標的α1アンチトリプシンRNA配列に関する)ミスマッチヌクレオチドの位置は、対応する標的α1アンチトリプシンRNA配列の予測されるAgo2切断部位のアンチセンス鎖配列内の直ぐ3’側(下流)に配置されたアンチセンス鎖のヌクレオチド残基である。別の好ましい実施形態において、DsiRNAmmのアンチセンス鎖のミスマッチヌクレオチドは(標的α1アンチトリプシンRNA配列に関して)、対応する予測されるAgo2切断部位の2ヌクレオチド3’側(下流)、対応する予測されるAgo2切断部位の3ヌクレオチド3’側(下流)、対応する予測されるAgo2切断部位の4ヌクレオチド3’側(下流)、対応する予測されるAgo2切断部位の5ヌクレオチド3’側(下流)、対応する予測されるAgo2切断部位の6ヌクレオチド3’側(下流)、対応する予測されるAgo2切断部位の7ヌクレオチド3’側(下流)、対応する予測されるAgo2切断部位の8ヌクレオチド3’側(下流)、または対応する予測されるAgo2切断部位の9ヌクレオチド3’側(下流)に配置されたアンチセンス鎖のヌクレオチド残基に位置する。
アンチセンス鎖の2つのミスマッチ形成ヌクレオチドを有するdsRNA剤において(ミスマッチ形成ヌクレオチドが標的α1アンチトリプシンRNA配列に関してミスマッチを形成する場合)、ミスマッチは、連続して(例えば、アンチセンス鎖ヌクレオチド配列に沿って連続した位置に)生じ得る。あるいは標的α1アンチトリプシンRNA配列とミスマッチ塩基対を形成するアンチセンス鎖のヌクレオチドに、標的α1アンチトリプシンRNA配列と塩基対合するヌクレオチドが散在し得る(例えば、(図1に示された25/27量体の薬剤のアンチセンス鎖の5’末端(1位)から出発して)17及び20位にはミスマッチ形成ヌクレオチドを有するが18及び19位には有さないDsiRNAの場合、17及び20位のセンス鎖のミスマッチ残基に、標的α1アンチトリプシンRNA配列の対応する残基とミスマッチ塩基対を形成する2つのヌクレオチドが散在する)。例えば、対応する標的α1アンチトリプシンRNA配列とミスマッチ塩基対を形成するアンチセンス鎖の2つの残基(アンチセンス鎖のミスマッチ耐性領域内に配置される)は、これらのミスマッチ形成塩基対の間に配置された(標的α1アンチトリプシンRNA配列に関して)0、1、2、3、4または5個のミスマッチ塩基対と共に生じ得る。
3つのミスマッチ形成塩基対(標的α1アンチトリプシンRNA配列に関するミスマッチ形成)を有するある特定のdsRNA剤の場合、ミスマッチ形成ヌクレオチドは、連続して(例えば、アンチセンス鎖ヌクレオチド配列に沿って三連で)生じ得る。あるいは標的α1アンチトリプシンRNA配列とミスマッチ塩基対を形成するアンチセンス鎖ヌクレオチドに、標的α1アンチトリプシンRNA配列とミスマッチ塩基対を形成するヌクレオチドが散在し得る(例えば、17、18及び22位にミスマッチヌクレオチドを有し19、20及び21位に有さないDsiRNAの場合、アンチセンス鎖の17及び18位のミスマッチ形成残基が、互いに隣接し、一方でアンチセンス鎖の18及び22位のミスマッチ形成残基に、標的α1アンチトリプシンRNAの対応する残基とミスマッチ塩基対を形成する3つのヌクレオチドが散在する)。例えば、対応する標的α1アンチトリプシンRNA配列とミスマッチ塩基対を形成するアンチセンス鎖の3つの残基(アンチセンス鎖のミスマッチ耐性領域内に配置される)は、これらのミスマッチ形成塩基対の任意の2つの間に配置された0、1、2、3、または4個のミスマッチ塩基対と共に生じ得る。
4つのミスマッチ形成塩基対(標的α1アンチトリプシンRNA配列に関するミスマッチ形成)を有するある特定のDsiRNAの場合、ミスマッチ形成ヌクレオチドは、連続して(例えば、センス鎖ヌクレオチド配列に沿って四連で)生じ得る。あるいは標的α1アンチトリプシンRNA配列とミスマッチ塩基対を形成するアンチセンス鎖のヌクレオチドに、標的α1アンチトリプシンRNA配列とミスマッチ塩基対を形成するヌクレオチドが散在し得る(例えば、17、19、21及び22位にミスマッチ形成ヌクレオチドを有するが18及び20位に有さないDsiRNAでは、アンチセンス鎖の21及び22位のミスマッチ形成残基が、互いに隣接し、一方でアンチセンス鎖の17及び19位のミスマッチ形成残基に、標的α1アンチトリプシンRNA配列の対応する残基とミスマッチ塩基対を形成する1つのヌクレオチドが散在し、同様にアンチセンス鎖の19及び20位のミスマッチ形成残基にはまた、標的α1アンチトリプシンRNA配列の対応する残基とミスマッチ塩基対を形成する1つのヌクレオチドが散在する)。例えば、対応する標的α1アンチトリプシンRNA配列とミスマッチ塩基対を形成するアンチセンス鎖の4つの残基(アンチセンス鎖のミスマッチ耐性領域内に配置される)は、これらのミスマッチ形成塩基対の任意の2つの間に配置された0、1、2または3個のミスマッチ塩基対と共に生じ得る。
DsiRNAmm及びdsRNA剤のある特定の構造を例示するために、上のDsiRNAmm及び他のdsRNA構造を記載する。上のDsiRNAmm及びdsRNA構造の設計は、例えば下に示される他のDsiRNA構造のDsiRNAmm形態を作製するために、適合させることができる。上に例示された通り、dsRNAのアンチセンス鎖と標的配列の間に1つのミスマッチ(または2、3もしくは4個のミスマッチ)を有するが、任意でdsRNAのセンス鎖配列とアンチセンス鎖配列の間に完全な相補性を保持し得る、dsRNAを設計することもできる。
下に例示されるdsRNA剤が、二本鎖及び/または標的α1アンチトリプシンRNAにアレイメントされた構造の中に挿入/欠失(in/del)構造も有し得ることが、さらに注目される。したがって本発明のdsRNAは、例えば標的α1アンチトリプシンRNA配列に比較したアンチセンス鎖配列及び/またはセンス鎖配列に比較して、アンチセンス鎖配列において、in/del変動を有するよう設計することができ、そのようなin/delヌクレオチドの配置に好ましい場所(複数可)は、ミスマッチ塩基対及び/またはミスマッチ形成塩基対の位置づけに関して先に記載されたそれらの場所に対応する。
センス鎖の3’末端領域/アンチセンス鎖の5’末端領域は、ダイサーにより処理されて、RISCに導入されるガイド鎖配列から解離するようにモデル化されるため、本発明のDsiRNAが、この領域内のミスマッチに耐え得ることにも注目される。そのようなミスマッチを抱える本発明の例示的DsiRNA構造として、以下のものが挙げられる:
ここで、「X」=RNA、「D」=DNA、「I」及び「J」=互いに塩基対合(水素結合)しない核酸残基(RNA、DNAまたは非天然もしくは修飾核酸)であるが、任意で「J」は、標的RNA配列ヌクレオチド「H」に相補性がある。そのような薬剤の残基のいずれも、任意で2’−O−メチルRNAモノマーになり得る、つまり上に示される通り、下の(第二の)鎖の3’末端残基から開始する2’−O−メチルRNAモノマーの交互配置(または上記のメチル化パターンのいずれか)が、先のDsiRNA剤の中でも用いられ得る。上記ミスマッチも、本発明のDsiRNA内に組み込まれ得る。
以下の例示的構造において、そのようなミスマッチは、非対称AAT−506 DsiRNA内に導入される(新たに導入されたミスマッチ残基を斜体で示す):
AAT−506 25/27量体 DsiRNA、ミスマッチ位置=センス鎖の19位(5’末端から)
任意で、センス鎖の19位のミスマッチ「A」残基は、代替として「U」または「C」である。
AAT−506 25/27量体 DsiRNA、ミスマッチ位置=センス鎖の20位(5’末端から)
任意で、センス鎖の20位のミスマッチ「U」残基は、代替として「A」または「G」である。
AAT−506 25/27量体 DsiRNA、ミスマッチ位置=センス鎖の21位(5’末端から)
任意で、センス鎖の21位のミスマッチ「U」残基は、代替として「G」または「C」である。
AAT−506 25/27量体 DsiRNA、ミスマッチ位置=センス鎖の22位(5’末端から)
任意で、センス鎖の22位のミスマッチ「G」残基は、代替として「A」または「C」である。
AAT−506 25/27量体 DsiRNA、ミスマッチ位置=センス鎖の23位(5’末端から)
任意で、センス鎖の23位のミスマッチ「A」残基は、代替として「U」または「C」である。
AAT−506 25/27量体 DsiRNA、ミスマッチ位置=センス鎖の24位(5’末端から)
任意で、センス鎖の24位のミスマッチ「t」残基は、代替として「a」または「c」である。
AAT−506 25/27量体 DsiRNA、ミスマッチ位置=センス鎖の25位(5’末端から)
任意で、センス鎖の25位のミスマッチ「a」残基は、代替として「t」または「g」である。
AAT−506 25/27量体 DsiRNA、ミスマッチ位置=アンチセンス鎖の1位(5’末端から)
任意で、アンチセンス鎖の1位のミスマッチ「U」残基は、代替として「A」または「C」である。
AAT−506 25/27量体 DsiRNA、ミスマッチ位置=アンチセンス鎖の2位(5’末端から)
任意で、アンチセンス鎖の2位のミスマッチ「A」残基は、代替として「U」または「G」である。
AAT−506 25/27量体 DsiRNA、ミスマッチ位置=アンチセンス鎖の3位(5’末端から)
任意で、アンチセンス鎖の3位のミスマッチ「U」残基は、代替として「A」または「C」である
AAT−506 25/27量体 DsiRNA、ミスマッチ位置=アンチセンス鎖の4位(5’末端から)
任意で、アンチセンス鎖の4位のミスマッチ「C」残基は、代替として「U」または「G」である。
AAT−506 25/27量体 DsiRNA、ミスマッチ位置=アンチセンス鎖の5位(5’末端から)
任意で、アンチセンス鎖の5位のミスマッチ「A」残基は、代替として「C」または「G」である。
AAT−506 25/27量体 DsiRNA、ミスマッチ位置=アンチセンス鎖の6位(5’末端から)
任意で、アンチセンス鎖の6位のミスマッチ「A」残基は、代替として「U」または「C」である。
AAT−506 25/27量体 DsiRNA、ミスマッチ位置=アンチセンス鎖の7位(5’末端から)
任意で、アンチセンス鎖の7位のミスマッチ「U」残基は、代替として「A」または「G」である。
別の実施例として、以下の構造において、そのようなミスマッチは、非対称AAT−1059 DsiRNAに導入される(新たに導入されたミスマッチ残基を斜体で示す):
AAT−1059 25/27量体 DsiRNA、ミスマッチ位置=センス鎖の19位(5’末端から)
任意で、センス鎖の19位のミスマッチ「A」残基は、代替として「U」または「C」である。
AAT−1059 25/27量体 DsiRNA、ミスマッチ位置=センス鎖の20位(5’末端から)
任意で、センス鎖の20位のミスマッチ「U」残基は、代替として「A」または「G」である。
AAT−1059 25/27量体 DsiRNA、ミスマッチ位置=センス鎖の21位(5’末端から)
任意で、センス鎖の21位のミスマッチ「A」残基は、代替として「C」または「G」である。
AAT−1059 25/27量体 DsiRNA、ミスマッチ位置=センス鎖の22位(5’末端から)
任意で、センス鎖の22位のミスマッチ「U」残基は、代替として「A」または「C」である。
AAT−1059 25/27量体 DsiRNA、ミスマッチ位置=センス鎖の23位(5’末端から)
任意で、センス鎖の23位のミスマッチ「U」残基は、代替として「C」または「G」である。
AAT−1059 25/27量体 DsiRNA、ミスマッチ位置=センス鎖の24位(5’末端から)
任意で、センス鎖の24位のミスマッチ「g」残基は、代替として「a」または「c」である。
AAT−1059 25/27量体 DsiRNA、ミスマッチ位置=センス鎖の25位(5’末端から)
任意で、センス鎖の25位のミスマッチ「a」残基は、代替として「t」または「c」である。
AAT−1059 25/27量体 DsiRNA、ミスマッチ位置=アンチセンス鎖の1位(5’末端から)
任意で、アンチセンス鎖の1位のミスマッチ「U」残基は、代替として「A」または「G」である。
AAT−1059 25/27量体 DsiRNA、ミスマッチ位置=アンチセンス鎖の2位(5’末端から)
任意で、アンチセンス鎖の2位のミスマッチ「C」残基は、代替として「U」または「G」である。
AAT−1059 25/27量体 DsiRNA、ミスマッチ位置=アンチセンス鎖の3位(5’末端から)
任意で、アンチセンス鎖の3位のミスマッチ「A」残基は、代替として「C」または「G」である。
AAT−1059 25/27量体 DsiRNA、ミスマッチ位置=アンチセンス鎖の4位(5’末端から)
任意で、アンチセンス鎖の4位のミスマッチ「A」残基は、代替として「U」または「G」である。
AAT−1059 25/27量体 DsiRNA、ミスマッチ位置=アンチセンス鎖の5位(5’末端から)
任意で、アンチセンス鎖の5位のミスマッチ「U」残基は、代替として「C」または「G」である。
AAT−1059 25/27量体 DsiRNA、ミスマッチ位置=アンチセンス鎖の6位(5’末端から)
任意で、アンチセンス鎖の6位のミスマッチ「A」残基は、代替として「U」または「C」である。
AAT−1059 25/27量体 DsiRNA、ミスマッチ位置=アンチセンス鎖の7位(5’末端から)
任意で、アンチセンス鎖の7位のミスマッチ「U」残基は、代替として「A」または「G」である。
上のオリゴヌクレオチド鎖配列の場合、一方の描写された二重鎖のセンス鎖配列が他方の描写された二重鎖のアンチセンス鎖と組み合わされ、それにより異なる二重鎖を形成し得ることが企図され、ある特定の例において、そのような二重鎖は、α1アンチトリプシン標的転写産物配列に関してミスマッチ残基を含むが、そのようなセンス及びアンチセンス鎖配列は、互いに関してこの残基のミスマッチを表さない(例えば、SEQ ID NO:3326及び3339;SEQ ID NO:3327及び3338;SEQ ID NO:3328及び3337などを含む二重鎖が、そのような二重鎖の例示として企図される)。
上に記述された通り、ミスマッチの導入は、本明細書に記載されたDsiRNAのいずれかで実施され得る。
そのようなDsiRNA構造のミスマッチを組み合わせて、例えば、センス鎖の3’末端4〜7ヌクレオチド/アンチセンス鎖の5’末端4〜7ヌクレオチドの中に2、3または4個のミスマッチを有する、DsiRNAを作製することができる。
実際に、センス鎖の3’末端残基/アンチセンス鎖の5’末端残基のDsiRNAに組み込まれ得る配列の柔軟性を考慮すると、ある特定の実施形態において、本発明の非対称DsiRNAの配列要件は、以下の(最小)構造(例示的なα1アンチトリプシン−506DsiRNA配列について示される)として表すことができる:
ここで、n=1〜5、1〜10、1〜20、1〜30、1〜50、または1〜80またはそれを超える。
該α1アンチトリプシン標的部位は、相補性標的部位が所定の標的部位とオーバーラップする複数のオリゴヌクレオチドのうちの1つまたは複数により標的とされる部位でもあり得る。例えば例示的α1アンチトリプシン−506 DsiRNAの場合、ある特定のDsiRNA標的化オーバーラッピング及びほんのわずかなオフセットα1アンチトリプシン配列が、α1アンチトリプシン−506(例えば、上の図2のα1アンチトリプシン−500〜513)と類似の活性レベルを呈し得ることが注目される。したがってある特定の実施形態において、指定された標的配列領域は、大きくオーバーラップする配列を有する一連のDsiRNAにより効果的に標的とされ得る(例えば、α1アンチトリプシン−500〜α1アンチトリプシン−513の標的部位(複数可)のDsiRNAを考慮すれば、より多く含むα1アンチトリプシン転写産物標的配列を、例えば5’−CACCAAUAUCUUCUUCUCCCCAGUGAGCAUCGCU−3’(配列番号3357)として挙げることができ、その場合、任意の所与のDsiRNA(例えば、α1アンチトリプシン−500〜α1アンチトリプシン−513から選択されるDsiRNA)だけが、そのような配列領域内の部分配列を標的とするが、配列全体が、そのような一連のDsiRNAの実行可能な標的として考慮され得る。
追加及び/または代わりとして、センス鎖の3’末端7ヌクレオチド/アンチセンス鎖の5’末端 7ヌクレオチド内のミスマッチを、先に記載された通り、他のミスマッチ耐性位置にあるミスマッチと組み合わせることができる。
特定のα1アンチトリプシン配列を標的とすることを通してα1アンチトリプシンレベルの阻害剤としての、上に記載されたダイサー基質剤(DsiRNA)の本発明の識別を考慮すれば、NM_000295.4のα1アンチトリプシン配列中、またはその変形例の中の他の配列を標的とする(例えば、NM_000295.4の配列と80%の同一性、90%の同一性、95%の同一性、96%の同一性、97%の同一性、98%の同一性、99%またはそれを超える同一性を有する配列を標的とする)、本明細書に記載されたものと類似の構造を有するdsRNAも合成され得ることも認識される。
抗α1アンチトリプシンDsiRNAの設計/合成
25〜35ヌクレオチド(DsiRNA)及び特に25〜30ヌクレオチドの長いdsRNA種が、19〜23量体siRNA剤に比較して、効力及び作用期間に関して予想外に効果的な結果を与えることが、経験的に見出された。dsRNA処理メカニズムの基本理論に束縛されるのを望むものではないが、より長いdsRNA種が、細胞質中でダイサー酵素の基質として働くことが考えられる。ダイサーは、本発明のdsRNAをより短いセグメントに切断することに加え、切断されたdsRNAに由来する一本鎖切断産物の、α1アンチトリプシンの標的遺伝子(またはα1アンチトリプシン関連疾患もしくは障害に関連する他の遺伝子)の細胞質RNA(例えば、α1アンチトリプシンRNA)、またはそれに由来する細胞質RNAの破壊を担うRISC複合体への取り込みを促進することが考えられる。以前の研究(Rossiら、米国特許出願公開第2007/0265220号)で、ダイサーによるdsRNA種(特に、DsiRNA剤)の切断可能性が、dsRNA種の効力及び作用期間の増大と一致することが示されている。
ある特定の好ましい抗α1アンチトリプシンDsiRNA剤を、予備スクリーニングの集団から選択した。DsiRNAの設計は、任意で、配列領域にかかる複数の可能なDsiRNA剤の予測される活性/有効性のインシリコ評価を実施する予測スコアリングアルゴリズムの使用を含み得る。そのようなスコアリングアルゴリズムの設計に関する情報は、例えばGongらの文献(BMC Bioinformatics 2006, 7:516)に見出され得るが、より近年の「v4.3」アルゴリズムは、当該技術分野でこれまで入手可能であったsiRNAスコアリングアルゴリズムよりも理論的に改善されたアルゴリズムを表す(例えば、「v3」及び「v4」スコアリングアルゴリズムは、ヒトの配列にある任意のバイアスに頼らない機械学習アルゴリズムである。加えて「v3」及び「v4」アルゴリズムは、Gongらの文献に記載されたような古い「v2」アルゴリズムよりも数倍大きなデータセットに由来する)。
本発明のDsiRNA剤の第一及び第二のオリゴヌクレオチドは、完全に相補性がある必要はない。事実、一実施形態において、センス鎖の3’末端は、1つまたは複数のミスマッチを含む。一態様において、2つのミスマッチが、センス鎖の3’末端に組み込まれている。別の実施形態において、本発明のDsiRNAは、RNAオリゴヌクレオチドを2つ含む二本鎖RNA分子であり、該RNAオリゴヌクレオチドのそれぞれは、27ヌクレオチド長であり、互いにアニーリングされると、センス鎖の3’末端(アンチセンス鎖の5’末端)に平滑末端及び2つのヌクレオチドミスマッチを有する。おそらくRISCへのsiRNA導入と共に生じる幾つかの律速的な巻戻しステップに影響を及ぼすことにより、RISCへのアンチセンス導入を促進する、または好適にするために、ミスマッチまたは熱力学的安定性低減の利用(特に3’−センス/5’−アンチセンス位置で)が提案されている(Schwarz et al., 2003, Cell 115: 199−208; Khvorova et al., 2003, Cell 115: 209−216)。したがって末端塩基構成が、活性のある21量体siRNA二重鎖を選択するための設計アルゴリズムに含まれている(Ui−Tei et al., 2004, Nucleic Acids Res 32: 936−948; Reynolds et al., 2004, Nat Biotechnol 22: 326−330)。この実施形態のdsRNAのダイサー切断により、ミスマッチを含む小さな末端配列は、アンチセンス鎖と対合しないままである(3’−オーバーハングの一部になる)か、または最終的な21量体siRNAに完全に切断されるかのどちらかになろう。それゆえこれらの「ミスマッチ」は、RISCの最終的なRNA成分の中のミスマッチとして存続しない。おそらくダイサーによる処理を促進することにより、ダイサー基質のセンス鎖3’末端セグメントの塩基ミスマッチまたは不安定化が、RNAiにおける合成二重鎖の効力を改善したという発見は、25〜30量体dsRNA(本明細書では「DsiRNA」とも称する)の設計及び使用を記載する過去の研究の驚くべき発見であった(Rossiら、米国特許出願公開第2005/0277610号、同第2005/0244858号及び同第2007/0265220号)
α1アンチトリプシンdsRNAの修飾
二本鎖RNA(「dsRNA」)の効果を阻害する1つの重要な因子は、ヌクレアーゼによるdsRNA(例えば、siRNA及びDsiRNA)の分解である。3’−エキソヌクレアーゼは、血清中に存在する主要なヌクレアーゼ活性であり、アンチセンスDNAオリゴヌクレオチドの3’末端の修飾は、分解を予防するのに不可欠である(Eder et al., 1991, Antisense Res Dev, 1: 141−151)。siRNAの調節及び分解に関与する3’−5’エキソヌクレアーゼ活性を有するERI−1と呼ばれるRNase−Tファミリーヌクレアーゼが、同定されている(Kennedy et al., 2004, Nature 427: 645−649; Hong et al., 2005, Biochem J, 390: 675−679)。この遺伝子は、マウスにおいてThex1(NM_02067)、またはヒトにおいてTHEX1(NM_153332)としても公知であり、ヒストンmRNAの分解に関与し、siRNA内の3’−オーバーハングの分解も仲介するが、二重鎖RNAは分解しない(Yang et al., 2006, J Biol Chem, 281: 30447−30454)。それゆえ、本発明のDsiRNAをはじめとするdsRNAの3’末端安定化が安定性を改善するであろうという予測は、合理的である。
XRN1(NM_019001)は、Pボディ中に存在する5’−3’エキソヌクレアーゼであり、miRNAにより標的とされるmRNAの分解に関連づけられており(Rehwinkel et al., 2005, RNA 11: 1640−1647)、siRNAに誘導される内部切断により開始された分解の完了も担う可能性がある。XRN2(NM _012255)は、核RNA処理に関与する別の5’−3’エキソヌクレアーゼである。
RNase Aは、RNAを分解する哺乳動物体内の主要なエンドヌクレアーゼ活性である。それは、ssRNAに特異性があり、ピリミジン塩基の3’末端を切断する。RNase A切断と一致するsiRNA分解産物が、血清中でのインキュベーション後の質量分析により検出され得る(Turner et al., 2007, Mol Biosyst 3: 43−50)。3’−オーバーハングは、RNase分解へのsiRNAの感受性を増強する。血清からのRNase A枯渇により、siRNA分解が減少する(この分解は、幾つかの配列好適性を示し、末端にポリA/U配列を有する配列にとっては好ましくない(Haupenthal et al., 2006 Biochem Pharmacol 71: 702−710)。このことから、この二重鎖の低安定性領域が「よみがえり(breathe)」、RNase Aによる分解に利用可能な一過性の一本鎖種を提供する可能性が示唆される。RNase A阻害剤を血清に添加して、siRNAの寿命及び効力を改善することができる(Haupenthal et al., 2007, Int J. Cancer 121: 206−210)。
21量体において、ホスホロチオアートまたはボラノホスファート修飾は、ヌクレオシドリン酸間結合を直接安定化させる。ボラノホスファート修飾RNAは、高いヌクレアーゼ耐性があり、サイレンシング剤として効力があり、比較的非毒性である。ボラノホスファート修飾RNAは、標準的な化学合成法を用いて製造することができず、代わりにインビトロ転写(IVT)により作製される(Hall et al., 2004, Nucleic Acids Res 32: 5991−6000; Hall et al., 2006, Nucleic Acids Res 34: 2773−2781)。ホスホロチオアート(PS)修飾は、任意の所望の位置のRNA二重鎖に容易に配置することができ、標準的な化学合成法を利用して作製することができる。PS修飾は、用量依存的毒性を示し、そのためほとんどの研究者がsiRNAへの限定的組み込みを推奨しており、それはヌクレアーゼからの防御が最も重要となる3’末端が好適である(Harborth et al., 2003, Antisense Nucleic Acid Drug Dev 13: 83−105; Chiu and Rana, 2003, Mol Cell 10: 549−561; Braasch et al., 2003, Biochemistry 42: 7967−7975; Amarzguioui et al., 2003, Nucleic Acids Research 31: 589−595)。より広範囲のPS修飾が、強力なRNAi活性と適合し得るが、糖修飾(2’−O−メチルRNAなど)の利用がより優れている可能性がある(Choung et al., 2006, Biochem Biophys Res Commun 342: 919−927)。
様々な置換を、一般に二重鎖安定性(Tm)を上昇させるリボースの2’位に配置させることができ、それはヌクレアーゼ耐性を大きく改善する可能性がある。2’−O−メチルRNAは、哺乳動物リボソームRNA及びトランスファーRNA内に見出される天然由来の修飾である。siRNA内での2’−O−メチル修飾は、公知であるが、二重鎖内の修飾塩基の精密な位置が、効力を保持するのに重要であり、2’−O−メチルRNAによるRNAの完全な置換が、siRNAを不活性化するであろう。例えば交互配置の2’−O−メチルRNA塩基を利用するパターンは、非修飾RNAと同等の効力を有し得、血清中で極めて安定している(Choung et al., 2006, Biochem Biophys Res Commun 342: 919−927; Czauderna et al., 2003, Nucleic Acids Research 31: 2705−2716)。
2’−フルオロ(2’−F)修飾もまた、dsRNA(例えば、siRNA及びDsiRNA)の機能と適合性があり;それは、ピリミジン部位に最も一般的に配置され(試薬のコスト及び入手可能性による)、プリン位置の2’−O−メチル修飾を組み合わせることができ;2’−Fプリンが入手可能で、使用することもできる。この種の大きく修飾された二重鎖は、インビトロでRNAiの強力な惹起物質となり得て(Allerson et al., 2005, J Med Chem 48: 901−904; Prakash et al., 2005, J Med Chem 48: 4247−4253; Kraynack and Baker, 2006, RNA 12: 163−176)、インビボで用いられた場合には性能の改善及び作用期間の延長を可能にする(Morrissey et al., 2005, Hepatology 41: 1349−1356; Morrissey et al., 2005, Nat Biotechnol 23: 1002−1007)。非常に効力があり、ヌクレアーゼ安定性があり、平滑な19量体二重鎖含有の代替的2’−F及び2’−O−Me塩基が、Allersonにより教示されている。この設計において、交互配置の2’−O−Me残基が、Czaudernaにより用いられたものと同一パターンで位置しているが、残りのRNA残基は、2’−F修飾塩基に変換される。Morrisseyにより用いられた非常に強力でヌクレアーゼ耐性があるsiRNAは、インビボで非常に強力でヌクレアーゼ耐性のあるsiRNAを使用した。この二重鎖は、2’−O−Me RNA及び2’−F RNAに加えて、DNA、RNA、反転した脱塩基残基、及び3’末端のPSヌクレオシド間結合を含む。広範囲の修飾は、ある特定の利点を有するが、より限定的な二重鎖修飾もまた、インビボ性能を改善することができ、製造がより簡単で低コストである。Soutschekら(2004, Nature 432: 173−178)は、インビボで二重鎖を使用し、ほとんどが2つの2’−O−メチルRNA塩基及び限定された3’末端PSヌクレオシド間結合を有するRNAであった。
ロックされた核酸(LNA)は、dsRNA(例えば、siRNA及びDsiRNA)を安定化するために用いられ得る2’修飾の異なる分類である。効力を維持するLNA組み込みのパターンは、2’−O−メチルまたは2’−F塩基よりも制限されており、そのため限定的修飾が好ましい(Braasch et al., 2003, Biochemistry 42: 7967−7975; Grunweller et al., 2003, Nucleic Acids Res 31: 3185−3193; Elmen et al., 2005, Nucleic Acids Res 33: 439−447)。限定された組み込みであっても、LNA修飾の利用は、dsRNA性能をインビボで改善することができ、オフターゲット効果のプロファイルを変更または改善する場合もある(Mook et al., 2007, Mol Cancer Ther 6: 833−843)。
細胞または生きた動物中に導入される合成核酸は、「外来物質」として認識され、免疫応答を惹起する可能性がある。免疫刺激は、オフターゲット効果の主要な分類を構成し、実験結果を大幅に変化させて、細胞死を導く可能性さえある。生来の免疫系には、これらの応答を仲介するDNA及びRNAと特異的に相互作用する受容体分子の集合体が含まれ、それらの一部は細胞質中に配置され、一部はエンドソーム中に存在する(Marques and Williams, 2005, Nat Biotechnol 23: 1399−1405; Schlee et al., 2006, Mol Ther 14: 463−470)。カチオン性脂質またはリポソームによるsiRNAの送達は、siRNAを細胞質及びエンドソームコンパートメントの両方に暴露し、1型インターフェロン(IFN)応答をインビトロ及びインビボの両方で惹起するリスクを最大にする(Morrissey et al., 2005, Nat Biotechnol 23: 1002−1007; Sioud and Sorensen, 2003, Biochem Biophys Res Commun 312: 1220−1225; Sioud, 2005, J Mol Biol 348: 1079−1090; Ma et al., 2005, Biochem Biophys Res Commun 330: 755−759)。細胞内で転写されたRNAは、免疫原性がより低く(Robbins et al., 2006, Nat Biotechnol 24: 566−571)、脂質に基づく方法を利用して送達される場合に免疫原性となる合成RNAは、インビボであっても、機械的手法によって細胞に導入されれば、免疫刺激を回避することができる(Heidel et al., 2004, Nat Biotechnol 22: 1579−1582)。しかし、脂質に基づく送達方法は、簡便で効果的であり、広く使用されている。特に全ての細胞型が存在し、免疫応答を発生するリスクが最も高いインビボ適用では、免疫応答を防御する幾つかの一般的方策が必要とされる。化学修飾RNAの使用は、これらの問題のほとんど、または全てまでを解決し得る。
ある特定の実施形態において、修飾によってdsRNA剤がα1アンチトリプシン阻害活性を有するのを妨害しない限りは、修飾を抗α1アンチトリプシンdsRNA剤に含めることができる。一実施形態において、DsiRNA剤のダイサー処理を増強する、1つまたは複数の修飾が行われる(DsiRNAのダイサー処理を測定するアッセイが本明細書の他の箇所に記載される)。第二の実施形態において、より効果的なα1アンチトリプシン阻害をもたらす、1つまたは複数の修飾が行われる(本明細書に記載された通り、dsRNAのα1アンチトリプシン阻害/α1アンチトリプシン阻害活性は、RNAレベルを測定するため、またはα1アンチトリプシンポリペプチドレベルを測定するための当該技術分野で認識された方法によりアッセイすることができ、そのようなレベルを、例えばα1アンチトリプシンmRNAレベルの評価の代わり、またはそれに加えて、アッセイしなければならない)。第三の実施形態において、より大きなα1アンチトリプシン阻害活性を支援する1つまたは複数の修飾が行われる(α1アンチトリプシン阻害活性を測定する手段は、先に記載された)。第四の実施形態において、細胞に送達される各dsRNA剤分子あたりのα1アンチトリプシン阻害活性をより強力にする、1つまたは複数の修飾が行われる(α1アンチトリプシン阻害活性の効力は、先に記載された)。修飾は、3’末端領域、5’末端領域、3’末端と5’末端領域の両方、または幾つかの例においては配列内の様々な位置に組み込まれ得る。上述の制限を考慮した上で、複数の修飾及び修飾の組み合わせを、dsRNA剤に組み込むことができる。複数の修飾が存在する場合、それらは同一であっても、または異なっていてもよい。塩基、糖部分、リン酸バックボーン、及びそれらの組み合わせへの修飾が、企図される。5’末端のどちらかを、リン酸化することができる。
リン酸バックボーンに企図される修飾の例として、メチルホスホナートをはじめとするホスホナート、ホスホロチオアート、及びアルキルホスホトリエステルなどのホスホトリエステル修飾などが挙げられる。糖部分に企図される修飾の例としては、2’−O−メチルなどの2’−アルキルピリミジン、2’−フルオロ、アミノ、及びデオキシ修飾などが挙げられる(例えば、Amarzguioui et al., 2003, Nucleic Acids Research 31: 589−595参照)。塩基の基に企図される修飾の例としては、脱塩基糖、2−O−アルキル修飾ピリミジン、4−チオウラシル、5−ブロモウラシル、5−ヨードウラシル、及び5−(3−アミノアリル)−ウラシルなどが挙げられる。ロックされた核酸またはLNAもまた、組み込まれ得る。多くの他の修飾が公知であり、上記の基準が満たされる限り、利用することができる。修飾の例は、米国特許第5,684,143号、同第5,858,988号、及び同第6,291,438号、ならびに米国特許出願公開第2004/0203145 A1号にも開示される。他の修飾は、Herdewijn(2000, Antisense Nucleic Acid Drug Dev 10: 297−310)、Eckstein(2000, Antisense Nucleic Acid Drug Dev 10: 117−21)、Rusckowskiら(2000, Antisense Nucleic Acid Drug Dev 10: 333−345)、Steinら(2001, Antisense Nucleic Acid Drug Dev 11: 317−25)、Vorobjevら(2001, Antisense Nucleic Acid Drug Dev 11: 77−85)の文献に開示される。
企図される1つまたは複数の修飾を、どちらの鎖にも組み込むことができる。dsRNA剤における修飾の配置は、より大きな効力及び安定性を付与すること、毒性を減少させること、ダイサー処理を増進すること、ならびに免疫応答を最小限にすることをはじめとし、dsRNA剤の特徴に大きく影響を及ぼし得る。一実施形態において、アンチセンス鎖もしくはセンス鎖、またはそれらの両方は、1つまたは複数の2’−O−メチル修飾ヌクレオチドを有する。別の実施形態において、アンチセンス鎖は、2’−O−メチル修飾ヌクレオチドを含む。別の実施形態において、アンチセンス鎖は、2’−O−メチル修飾ヌクレオチドで構成された3’オーバーハングを含む。アンチセンス鎖は、追加の2’−O−メチル修飾ヌクレオチドを含むこともできる。
ある特定の実施形態において、本発明の抗α1アンチトリプシンDsiRNA剤は、ダイサーによる処理を増進する幾つかの特性を有する。そのような実施形態によれば、該DsiRNA剤は、ダイサーによって処理されてsiRNAを生成するのに十分な長さ、及び以下の特性の少なくとも1つを有する:(i)DsiRNA剤が非対称であり、例えばセンス鎖に3’オーバーハングを有すること、及び(ii)DsiRNA剤がダイサーによる結合およびdsRNAから活性siRNAへの処理の方向を指示するためにアンチセンス鎖の修飾3’末端を有すること。これらの実施形態によれば、DsiRNA剤の最長の鎖は、25〜30ヌクレオチドを含む。一実施形態において、センス鎖は、25〜30ヌクレオチドを含み、アンチセンス鎖は、25〜28ヌクレオチドを含む。したがって、得られたdsRNAは、センス鎖の3’末端にオーバーハングを有する。このオーバーハングは、2ヌクレオチドなどの1〜4ヌクレオチドである。アンチセンス鎖は、5’リン酸も有し得る。
ある特定の実施形態において、DsiRNA剤のセンス鎖は、センス鎖の3’末端に配置された適切な修飾因子により、ダイサー処理に向けて修飾される、即ち、DsiRNA剤は、ダイサー結合及び処理の方向を指示するように設計される。適切な修飾因子としては、デオキシリボヌクレオチド、ジデオキシリボヌクレオチド、アシクロヌクレオチドなどのヌクレオチド、及び蛍光分子などの立体障害分子が挙げられる。アシクロヌクレオチドは、dNMP内に通常存在する2’−デオキシリボフラノシル糖が2−ヒドロキシエトキシメチル基で置換されている。他のヌクレオチド修飾因子としては、3’−デオキアデノシン(コルジセピン)、3’−アジド−3’−デオキシチミジン(AZT)、2’,3’−ジデオキシイノシン(ddI)、2’,3’−ジデオキシ−3’−チアシチジン(3TC)、2’,3’−ジデヒドロ−2’,3’−ジデオキシチミジン(d4T)、ならびに3’−アジド−3’−デオキシチミジン(AZT)、2’,3’−ジデオキシ−3’−チアシチジン(3TC)及び2’,3’−ジデヒドロ−2’,3’−ジデオキシチミジン(d4T)の一リン酸ヌクレオチドを挙げることができる。一実施形態において、デオキシヌクレオチドが、修飾因子として使用される。ヌクレオチド修飾因子が使用される場合、1〜3ヌクレオチド修飾因子または2ヌクレオチド修飾因子が、センス鎖の3’末端上のリボヌクレオチドと置換される。立体障害分子が使用される場合、それらをアンチセンス鎖の3’末端のリボヌクレオチドに結合させる。したがって鎖の長さは、修飾因子の組み込みによって変化しない。別の実施形態において、本発明は、ダイサー処理の方向を指示するためにdsRNA内で2つのDNA塩基を置換することを企図する。さらなる発明において、2つの末端DNA塩基が、2つのリボヌクレオチドの代わりにセンス鎖の3’末端に配置されて、アンチセンス鎖の5’末端及びセンス鎖の3’末端の二重鎖に平滑末端を形成させ、2ヌクレオチドのRNAオーバーハングがアンチセンス鎖の3’末端に配置される。これは、平滑末端にDNA、そしてオーバーハング末端にRNA塩基を有する非対称構成となる。
ある特定の別の実施形態において、DsiRNA剤のアンチセンス鎖は、アンチセンス鎖の3’末端に配置された適切な修飾因子により、ダイサー処理に向けて修飾される、即ち、DsiRNA剤は、ダイサー結合及び処理の方向性を指示するように設計される。適切な修飾因子としては、デオキシリボヌクレオチド、ジデオキシリボヌクレオチド、アシクロヌクレオチドなどのヌクレオチド、及び蛍光分子などの立体障害分子が挙げられる。アシクロヌクレオチドは、dNMP中に通常存在する2’−デオキシリボフラノシル糖が2−ヒドロキシエトキシメチル基で置換されている。他のヌクレオチド修飾因子として、3’−デオキアデノシン(コルジセピン)、3’−アジド−3’−デオキシチミジン(AZT)、2’,3’−ジデオキシイノシン(ddI)、2’,3’−ジデオキシ−3’−チアシチジン(3TC)、2’,3’−ジデヒドロ−2’,3’−ジデオキシチミジン(d4T)、ならびに3’−アジド−3’−デオキシチミジン(AZT)、2’,3’−ジデオキシ−3’−チアシチジン(3TC)、及び2’,3’−ジデヒドロ−2’,3’−ジデオキシチミジン(d4T)の一リン酸ヌクレオチドを挙げることができる。一実施形態において、デオキシヌクレオチドが、修飾因子として使用される。ヌクレオチド修飾因子が使用される場合、1〜3ヌクレオチド修飾因子または2ヌクレオチド修飾因子が、アンチセンス鎖の3’末端上のリボヌクレオチドと置換される。立体的障害分子が使用される場合、それらをアンチセンス鎖の3’末端のリボヌクレオチドに結合させる。したがって鎖の長さは、修飾因子の組み込みによって変化しない。別の実施形態において、本発明は、ダイサー処理の方向を指示するためにdsRNA内で2つのDNA塩基を置換することを企図する。さらなる発明において、2つの末端DNA塩基が、2つのリボヌクレオチドの代わりにアンチセンス鎖の3’末端に配置されて、センス鎖の5’末端及びアンチセンス鎖の3’末端の二重鎖に平滑末端を形成させ、2ヌクレオチドのRNAオーバーハングがセンス鎖の3’末端に配置される。これもまた、平滑末端にDNA、そしてオーバーハング末端にRNA塩基を有する非対称の構成となる。
センス及びアンチセンス鎖は、細胞質中に見出される条件などの生物学的条件下でアニーリングする。加えて、dsRNAの、特にアンチセンス鎖の、配列の1つの領域は、少なくとも19ヌクレオチド長の配列を有し、これらのヌクレオチドは、アンチセンス鎖の3’末端に隣接し、標的α1アンチトリプシンRNAのヌクレオチド配列に十分に相補性がある。
加えて、ダイサー切断により生じたオリゴヌクレオチドセグメントが遺伝子発現を阻害する上で最も効果的であるオリゴヌクレオチドの部分になることが確実になるように、DsiRNA剤の構造が最適化され得る。例えば、本発明の一実施形態において、遺伝子発現を阻害する、予期される21〜22bpセグメントが、アンチセンス鎖の3’末端に配置された、DsiRNA剤の構造の27bpオリゴヌクレオチドが合成される。アンチセンス鎖の5’末端に配置された残りの塩基は、ダイサーにより切断され、廃棄されるであろう。この切断された部分は、相同性(即ち、標的配列の配列に基づく)または非相同性であってもよく、核酸鎖を伸長するために添加され得る。
US2007/0265220に、27量体DsiRNA剤が化学修飾を含まなくとも、同等の21量体siRNA組成物よりも改善された血清中安定性を示したことが開示されている。先に詳述されたようなパターンの、アンチセンス鎖中の2’−O−メチルRNAの含有などのDsiRNA剤の修飾が、5’リン酸の付加と併せると、DsiRNA剤の安定性を改善し得る。合成RNA二重鎖中の全ての鎖に5’リン酸を付加することは、若干限定されたヌクレアーゼ安定性を付与する安価な生理学的方法になり得る。
本発明のdsRNA剤の化学修飾パターンは、そのような薬剤の有効性を増強するように設計される。したがってそのような修飾は、dsRNA剤の効力低下を回避するように、DsiRNA剤とダイサー処理との干渉を回避するように、dsRNA剤の生体液中の安定性を改善するように(ヌクレアーゼ感受性を低下させるように)、または生来の免疫系により検出を遮断もしくは回避するように設計される。そのような修飾はまた、毒性になることを回避するように、そして本発明の本dsRNA剤の製造のコスト上昇を回避するように、または容易性に影響を及ぼすように設計される。
本発明のある特定の実施形態において、抗α1アンチトリプシンDsiRNA剤は、以下の特性の1つまたは複数を有する:(i)DsiRNA剤が非対称であり、例えばアンチセンス鎖上に3’オーバーハングを有すること、及び(ii)DsiRNA剤がダイサーによる結合及びdsRNAから活性siRNAへの処理の方向を指示するためのセンス鎖の修飾3’末端を有すること。これらの実施形態によれば、DsiRNA剤の最長の鎖は、25〜35ヌクレオチド(例えば、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34または35ヌクレオチド)を含む。ある特定のそのような実施形態において、該DsiRNA剤は、非対称であり、そのためセンス鎖は、25〜34ヌクレオチドを含み、センス鎖の3’末端は、アンチセンス鎖の5’末端と共に平滑末端を形成し、一方でアンチセンス鎖は、26〜35ヌクレオチドを含み、アンチセンス鎖の3’末端上にオーバーハングを形成する。一実施形態において、該DsiRNA剤は、非対称であり、センス鎖は、25〜28ヌクレオチドを含み、アンチセンス鎖は、25〜30ヌクレオチドを含む。したがって、得られたdsRNAは、アンチセンス鎖の3’末端にオーバーハングを有する。このオーバーハングは、1〜4ヌクレオチド、例えば2ヌクレオチドである。センス鎖は、5’リン酸も有し得る。
DsiRNA剤は、以下の追加の特性のうちの1つまたは複数も有し得る:(a)アンチセンス鎖が、典型的な21量体から右方シフトを有すること(例えば、DsiRNAは、DsiRNA内の予測されるダイサー切断部位の5’末端に伸長するアンチセンス鎖ヌクレオチドの長さを含み、そのようなアンチセンス鎖ヌクレオチドは、センス鎖内の予測されるダイサー切断部位の3’に伸長するセンス鎖の対応するヌクレオチドと対合している)、(b)鎖が、完全に相補性がなくてもよいこと、即ち、鎖が、簡単なミスマッチ塩基対を含んでいてもよいこと(特定の実施形態において、ミスマッチ塩基対を有するDsiRNAのα1アンチトリプシン阻害活性が十分なレベルで保持される(例えば、ミスマッチ塩基対を有さない対応するDsiRNAに比較して、少なくとも50%もしくはそれを超えるα1アンチトリプシン阻害活性、少なくとも60%もしくはそれを超えるα1アンチトリプシン阻害活性、少なくとも70%もしくはそれを超えるα1アンチトリプシン阻害活性、少なくとも80%もしくはそれを超えるα1アンチトリプシン阻害活性、少なくとも90%もしくはそれを超えるα1アンチトリプシン阻害活性、または少なくとも95%もしくはそれを超えるα1アンチトリプシン阻害活性を保持する)ことを条件として、本発明のDsiRNAが、1、2、3、4または5またはそれを超えるミスマッチ塩基対を有する。ある特定の実施形態において、ミスマッチ塩基対は、DsiRNAのアンチセンス鎖とセンス鎖の間に存在する。幾つかの実施形態において、ミスマッチ塩基対は、アンチセンス鎖と標的RNAの間に存在する(または存在すると予測される)。ある特定の実施形態において、アンチセンス鎖残基と、予測されるAgo2切断部位の標的RNA配列内の3’に配置された標的RNA内の対応する残基と、の間にミスマッチ塩基対(複数可)の存在が保持され、それが本発明のDsiRNAのα1アンチトリプシン阻害活性を増強し得る)、及び、(c)ロックされた核酸(複数可)などの塩基修飾が、センス鎖の5’末端に含まれていてもよいこと。「典型的な」21量体siRNAは、従来技術を使用して設計される。1つの技術において、一般的には様々な部位を、並行してテストするか、または同じ標的に特異的な複数の異なるsiRNA二重鎖を含むプールにおいて、試薬のうちの1つが効果的であることを期待してテストする(Ji et al., 2003, FEBS Lett 552: 247−252)。他の技術では、活性RNAiエフェクター分子を得る可能性を高めるための設計規則及びアルゴリズムが利用される(Schwarz et al., 2003, Cell 115: 199−208; Khvorova et al., 2003, Cell 115: 209−216; Ui−Tei et al., 2004, Nucleic Acids Res 32: 936−948; Reynolds et al., 2004, Nat Biotechnol 22: 326−330; Krol et al., 2004, J Biol Chem 279: 42230−42239; Yuan et al., 2004, Nucl Acids Res 32(Webserver issue):W130−134; Boese et al., 2005, Methods Enzymol 392: 73−96)。siRNAのハイスループット選択もまた、開発されている(米国特許出願公開第2005/0042641 A1号)。可能性のある標的部位を、二次構造予測によって解析することもできる(Heale et al., 2005, Nucleic Acids Res 33(3): e30)。この21量体を使用して、その後、21量体の5’末端の3〜9の追加のヌクレオチドを含むように右方シフトを設計する。これらの追加的ヌクレオチドの配列は、制限されない。一実施形態において、追加されたリボヌクレオチドは、標的遺伝子の配列に基づく。この実施形態であっても、標的配列とアンチセンスsiRNAの間の完全な相補性は、必要とされない。
本発明のDsiRNA剤の第一及び第二のオリゴヌクレオチドは、完全に相補性がある必要はない。それらは、生物学的条件下でアニーリングするため、そして標的配列に十分に相補性があるsiRNAを生成するダイサー基質を提供するために、十分に相補性があることのみを必要とする。ロックされた核酸、またはLNAは、当業者に周知である(Elmen et al., 2005, Nucleic Acids Res 33: 439−447; Kurreck et al., 2002, Nucleic Acids Res 30: 1911−1918; Crinelli et al., 2002, Nucleic Acids Res 30: 2435−2443; Braasch and Corey, 2001, Chem Biol 8: 1−7; Bondensgaard et al., 2000, Chemistry 6: 2687−2695; Wahlestedt et al., 2000, Proc Natl Acad Sci USA 97: 5633−5638)。一実施形態において、LNAが、センス鎖の5’末端に組み込まれる。別の実施形態において、LNAが、アンチセンス鎖に3’オーバーハングを含むように設計された、二重鎖のセンス鎖の5’末端に組み込まれる。
ある特定の実施形態において、本発明のDsiRNA剤は、25塩基対長を有するセンス鎖と、2塩基の3’オーバーハングを含む27塩基対長を有するアンチセンス鎖と、を含む非対称構造を有する。別の実施形態において、非対称構造を有するこのDsiRNA剤は、センス鎖の3’末端に2つのリボヌクレオチドの代わりに2つのデオキシヌクレオチドをさらに含む。
2つの別個のオリゴヌクレオチドを含むある特定のDsiRNA組成物を、第三の構造によって連結することができる。第三の構造は、DsiRNA剤上でのダイサー活性を遮断せず、標的遺伝子から転写されたRNAの指示された破壊と干渉しないであろう。一実施形態において、第三の構造は、化学的な連結基であり得る。多くの適切な化学的連結基が、当該技術分野で公知であり、用いられ得る。あるいは、dsRNA組成物を構成する2つのオリゴヌクレオチドをアニーリングする際にヘアピン構造が生成されるように、第三の構造が、DsiRNA剤の2つのオリゴヌクレオチドを連結するオリゴヌクレオチドであり得る。該ヘアピン構造は、DsiRNA剤上でのダイサー活性を遮断せず、α1アンチトリプシンRNAの指示された破壊と干渉しないであろう。
dsRNAα1アンチトリプシン阻害活性を評価するためのインビトロアッセイ
無細胞系でのRNAiを再現するインビトロアッセイを利用して、α1アンチトリプシンRNA配列(複数可)を標的とするdsRNA構築物を評価し、それによりdsRNAのα1アンチトリプシンに特異的な遺伝子阻害活性(本明細書ではα1アンチトリプシン阻害活性とも称される)を評価することができる。該アッセイは、α1アンチトリプシンRNAに向けたdsRNA(例えば、DsiRNA)剤と共に使用するように適合された、Tuschl et al., 1999, Genes and Development, 13, 3191−3197及びZamore et al., 2000, Cell, 101, 25−33に記載された系を含む。多核性胞胚に由来するショウジョウバエ抽出物を用いて、RNAi活性をインビトロで再構築する。標的RNAは、T7 RNAポリメラーゼを用いる選択されたα1アンチトリプシン発現プラスミドからのインビトロ転写により、または化学合成により、作製される。センス及びアンチセンスdsRNA鎖(例えば、それぞれ20μM)を、緩衝液(100mM酢酸カリウム、30mM pH7.4のHEPES−KOH、2mM酢酸マグネシウムなど)中、90℃で1分間、次に37℃で1時間インキュベーションし、その後、溶解緩衝液(例えば、100mM酢酸カリウム、30mM pH7.4のHEPES−KOH、2mM酢酸マグネシウム)で希釈することによりアニーリングする。アニーリングを、TBE緩衝液中のアガロースゲルでのゲル電気泳動によりモニタリングし、臭化エチジウムで染色することができる。酵母糖液入り寒天上に採取されたオレゴン−Rハエをコリオン除去及び溶解されて得られた、受精後0〜2時間目(zero to two−hour−old)の胚を用いて、ショウジョウバエ溶解物を調製する。溶解物を遠心分離し、上清を単離する。アッセイ物は、50%(v/v)溶解物、RNA(10〜50pM最終濃度)、及び10%(v/v)dsRNA(10nM最終濃度)含有溶解緩衝液を含有する反応混合物を含む。反応混合物は、10mMクレアチンリン酸、10μg/mlクレアチニンホスホキナーゼ、100μm GTP、100μM UTP、100μM CTP、500μM ATP、5mM DTT、0.1U/μL RNasin(プロメガ)、及び100μMの各アミノ酸も含有する。酢酸カリウムの最終濃度は、100mMに調整する。反応物を氷上に予め集め(pore−assembled)、25℃で10分間プレインキュベートした後、RNAを添加し、その後、25℃でさらに60分間インキュベートする。反応物を4倍体積の1.25×パッシブ・ライシス・バッファー(1.25xPassive Lysis Buffer)(プロメガ)でクエンチする。標的RNAの切断を、RT−PCR分析または他の当該技術分野で公知の方法によりアッセイし、dsRNAを反応物から省いた対照反応物と比較する。
あるいはアッセイのための内部標識された標的RNAを、[α−32P]CTPの存在下でのインビトロ転写により調製し、スピンクロマトグラフィーによりG50セファデックスカラムに通し、更なる精製を行わずに標的RNAとして用いる。任意で、標的RNAを、T4ポリヌクレオチドキナーゼ酵素を用いて5’−32Pで末端標識する。アッセイを上記の通り実施し、標的RNAと、RNAiにより作製された特異的RNA切断産物を、ゲルのオートラジオグラフで視覚化する。インタクト対照RNAまたはdsRNAを含まない対照反応物からのRNAと、アッセイにより作製された切断産物を表すバンドのホスホルイメージャ(PHOSPHOR IMAGER)(登録商標)(オートラジオグラフィー)定量により、切断の割合%を決定する。
一実施形態において、このアッセイを用いて、dsRNAを介したRNAi切断のためのα1アンチトリプシンRNAターゲット内の標的部位を決定するが、この場合、例えばアッセイ反応物を標識された標的RNAの電気泳動またはノーザンブロット、及び他の当該技術分野で周知の方法論で分析することにより、複数のdsRNA構築物をα1アンチトリプシンRNAターゲットのRNAiによる切断についてスクリーニングする。
ある特定の実施形態において、例えば適切な対照と比較して、α1アンチトリプシンRNAレベルの50%低下が系、細胞、組織または生物体において観察されれば、本発明のdsRNAは、α1アンチトリプシンRNA阻害活性を有すると見なされる。本発明のdsRNAのα1アンチトリプシン阻害活性の測定に関するさらなる計量及び範囲は、上に記載されている。
抗α1アンチトリプシンRNA剤のコンジュゲーション及び送達
ある特定の実施形態において、本発明は、α1アンチトリプシン関連疾患もしくは障害を有する対象、またはα1アンチトリプシン関連疾患もしくは障害を発症するリスクのある対象を処置する方法に関する。そのような実施形態において、該dsRNAは、α1アンチトリプシン関連疾患または障害を制御するための新規な治療薬として作用し得る。該方法は、本発明の医薬組成物を患者(例えば、ヒト)に投与して、α1アンチトリプシンRNAの発現、レベル及び/または活性を低減することを含む。α1アンチトリプシンRNAによりコードされたポリペプチドの発現、レベル及び/または活性もまた、本発明のdsRNAにより低減され得るが、前記dsRNAは、α1アンチトリプシン転写産物の非コード領域(例えば、標的とする5’UTRまたは3’UTR配列)を対象とする。本発明のdsRNAは、特異性が高いため、任意で多型対立遺伝子が個体及び/または集団に存在するような対立遺伝子特異性の手法で、細胞及び組織のα1アンチトリプシン配列を特異的に標的とすることができる。
α1アンチトリプシン関連疾患または障害の処置において、該dsRNAを、対象の細胞または組織、例えばα1アンチトリプシンの調節異常を示す対象の細胞もしくは組織及び/またはα1アンチトリプシンレベル低下のために標的とされる他のもの、と接触させることができる。例えばα1アンチトリプシンRNA配列の全てまたは一部と実質的に同一のdsRNAを、インビボまたはインビトロで、そのような細胞と接触させるか、またはそのような細胞に導入してもよい。同様に、α1アンチトリプシンRNA配列の全てまたは一部と実質的に同一のdsRNAを、α1アンチトリプシン関連疾患もしくは障害を有する対象、またはそれを発症するリスクのある対象に直接投与してもよい。
本発明のdsRNA剤の治療的使用は、複数の異なるdsRNA剤の配列を含むdsRNA剤の配合剤の使用を含み得る。例えば本明細書に記載された薬剤の2種以上、3種以上、4種以上、5種以上などを併用して、例えばα1アンチトリプシンRNAの複数の異なる領域をターゲットとする配合剤、またはα1アンチトリプシンRNAだけでなく例えばα1アンチトリプシン関連疾患もしくは障害に関連する細胞標的遺伝子も標的とする配合剤を生成することができる。本発明のdsRNA剤を、該dsRNA剤のいずれかの鎖が独立してα1アンチトリプシンRNAの2つ以上の領域を標的とするように、または該dsRNA剤の鎖の一方が当該技術分野で公知のα1アンチトリプシンの細胞標的遺伝子を標的とするように、構築することもできる。
標的核酸分子の1つより多い領域を標的とする多機能性dsRNA分子の使用もまた、α1アンチトリプシンRNAレベル及び発現の強力な阻害をもたらし得る。例えば本発明の1つの多機能性dsRNA構築物は、α1アンチトリプシン−506部位及びα1アンチトリプシン−1059部位の両方を同時に標的とし得、追加及び/または代わりとして、本発明の単機能または多機能性薬剤は、α1アンチトリプシンの一方のスプライスバリアントを、他よりも選択的に標的とするように設計することができる。
したがって本発明のdsRNA剤を、個別に、または他の薬物と併用もしくは一体化させて、α1アンチトリプシン関連疾患または障害を治療、阻害、低減または予防するために用いることができる。例えばdsRNA分子は、処置に適した条件下で個別に、または1種または複数の薬物と併用で、対象に投与すること、または当業者に明白な他の適当な細胞に投与することができる。
該dsRNA分子は、他の公知の処置と併用して、対象または生物体のα1アンチトリプシン関連疾患または障害を治療、阻害、低減または予防することもできる。例えば記載された分子は、1種または複数の公知化合物、処置、または手順と併用して、当該技術分野で公知の通り、対象または生物体におけるα1アンチトリプシン関連疾患または障害を治療、阻害、低減または予防することができる。
本発明のdsRNA剤は、別の部分(例えば、ペプチドなどの非核酸部分)、有機化合物(例えば、色素、コレステロールなど)にコンジュゲートさせても(例えば、センスまたはアンチセンス鎖の5’または3’末端で)、またはコンジュゲートさせなくてもよい。この方法でdsRNA剤を修飾することで、対応する非コンジュゲート化dsRNA剤と比較して得られたdsRNA剤誘導体の細胞取込みを改善するか、または細胞標的化活性を増強してもよく、それは、細胞内のdsRNA剤誘導体を追跡するのに有用になるか、または対応する非コンジュゲート化dsRNA剤に比較してdsRNA剤誘導体の安定性を改善する。
核酸、ベクター、及び宿主細胞を導入する方法
本発明のdsRNA剤を、細胞の中に直接(即ち、細胞内)導入してもよく、あるいは生物体の体腔、間質空間、循環内に細胞外導入しても、口内に導入しても、または核酸を含有する溶液に細胞もしくは生物体を浸漬することにより導入してもよい。血管または血管外循環、血液またはリンパ系、及び脳脊髄液が、核酸が導入され得る部位である。
本発明のdsRNA剤は、核酸を含む溶液の注射、核酸で覆われた粒子による衝撃、核酸溶液への細胞もしくは生物体の浸漬、または核酸存在下での細胞膜の電気穿孔など、当該技術分野で公知の核酸送達方法を利用して導入することができる。核酸を細胞に導入するために当該技術分野で公知の他の方法、例えば脂質による担体輸送、化学的な輸送、及びリン酸カルシウムなどのカチオン性リポソームトランスフェクションなどを用いてもよい。核酸を、以下の活性のうちの1つまたは複数を実施する他の成分と共に導入してもよい:細胞による核酸取り込みの増加、またはその他の方法による標的α1アンチトリプシンRNAの阻害増強。
標的α1アンチトリプシンRNAを有する細胞は、全能性または多能性の、分裂しているまたは分裂していない、柔組織または上皮の、不死化または形質転換された、生殖細胞系統または体細胞から得られてもよい。該細胞は、幹細胞または分化した細胞であってもよい。分化された細胞型としては、脂肪細胞、線維芽細胞、筋細胞、心筋細胞、内皮、ニューロン、グリア、血液細胞、メガカリオサイト、リンパ球、マクロファージ、好中球、好酸球、好塩基球、肥満細胞、白血球、顆粒球、ケラチノサイト、軟骨細胞、骨芽細胞、破骨細胞、肝細胞、及び内分泌腺または外分泌腺の細胞が挙げられる。
特定の標的α1アンチトリプシンRNA配列及び送達されるdsRNA剤材料の用量に応じて、このプロセスは、α1アンチトリプシンRNAの部分的または完全な機能損失をもたらし得る。標的細胞の少なくとも50%、60%、70%、80%、90%、95%または99%またはそれを超えるRNAレベルまたは発現(α1アンチトリプシンRNA発現またはコードされたポリペプチド発現のいずれか)の低下または損失が、例である。α1アンチトリプシンRNAレベルまたは発現の阻害は、α1アンチトリプシンRNAまたはα1アンチトリプシンRNAをコードするタンパク質のレベルの非存在(または観察可能な減少)を指す。特異性は、細胞の他の遺伝子に及ぼす明確な影響を有さずにα1アンチトリプシンRNAを阻害する能力を指す。阻害の結果は、細胞もしくは生物体の外向きの特性の検査により、またはRNA溶液ハイブリダイゼーション、ヌクレアーゼ保護、ノーザンハイブリダイゼーション、逆転写、マイクロアレイによる遺伝子発現モニタリング、抗体結合、酵素免疫法(ELISA)、ウェスタンブロット、放射免疫測定法(RIA)、他の免疫測定法、及び蛍光活性化細胞分析(FACS)などの生化学的技術により、確認することができる。本発明のdsRNA剤による標的α1アンチトリプシンRNA配列(複数可)の阻害は、α1アンチトリプシン関連疾患または障害、例えば慢性肝臓疾患、肝臓の炎症、肝硬変、肝線維症、及び/または肝細胞癌などの発症/進行に及ぼすそのようなdsRNA剤のインビボまたはインビトロのいずれかでの投与の影響に基づいて測定することもできる。これらの先行する肝臓病のいずれの処置も、肝機能に関する当該技術分野で認識されている試験、例えば適切な対照集団の平均的健常肝機能と比較して達成された肝機能の割合%(例えば、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、またはそれを超える)の測定により、評価することができる。ある特定の実施形態において、処置の成功は、肝臓疾患に関連する全体的な肝機能低下の減衰または停止をもたらす。幾つかの実施形態において、肝機能は、処置の成功によって改善する。肝細胞癌の腫瘍または癌細胞レベルの処置及び/または低減としては、腫瘍もしくは癌細胞レベルの成長の停止もしくは低下、または例えば10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、95%または99%またはそれを超える減少を挙げることができ、それは対数として測定することもでき、例えば癌細胞レベルの10倍、100倍、1000倍、105倍、106倍、107倍低下が、細胞、組織または対象への本発明のdsRNA剤投与により実現され得る。
細胞株または全生物体におけるRNAを介した阻害の場合、タンパク質生成物が容易にアッセイされる発現、レポーター、または薬物耐性遺伝子を測定することができる。そのようなレポーター遺伝子としては、アセトヒドロキシ酸合成酵素(AHAS)、アルカリホスファターゼ(AP)、βガラクトシダーゼ(LacZ)、βグルクロニダーゼ(β−glucoronidase)(GUS)、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ(CAT)、緑色蛍光タンパク質(GFP)、西洋ワサビペルオキシダーゼ(HRP)、ルシフェラーゼ(Luc)、ノパリンシンターゼ(NOS)、オクトピンシンターゼ(OCS)、及びその誘導体が挙げられる。アンピシリン、ブレオマイシン、クロラムフェニコール、ゲンタマイシン、ハイグロマイシン、カナマイシン、リンコマイシン、メトトレキサート、フォスフィノスリシン、ピューロマイシ、及びテトラサイクリンに対する耐性を付与する複数の選択マーカーが利用可能である。アッセイにもよるが、遺伝子発現量の定量で、本発明により処置されていない細胞と比較して10%、33%、50%、90%、95%または99%を超える阻害度を測定することが可能である。
注射材料が低用量である程、そしてRNAサイレンシング剤投与後の時間が長い程、より小さな割合の細胞が阻害され得る(例えば、標的細胞の少なくとも10%、20%、50%、75%、90%または95%)。細胞内での遺伝子発現の定量は、標的α1アンチトリプシンRNAの蓄積または標的タンパク質の翻訳のレベルで類似の阻害量を示し得る。例として、阻害の効率は、細胞内の遺伝子産物量を評価することにより決定することができ、RNAは、阻害性dsRNAに用いられた領域以外のヌクレオチド配列を有するハイブリダイゼーションプローブで検出してもよく、または翻訳されたポリペプチドを、その領域のポリペプチド配列に対して増加した抗体により検出してもよい。
dsRNA剤は、細胞あたりに少なくとも1コピーの送達を可能にする量で導入され得る。より高用量(例えば、細胞あたり少なくとも5、10、100、500または1000コピー)の材料は、より効果的な阻害を生じることができ、より低用量もまた、特異的適用に有用になり得る。
医薬組成物
ある特定の実施形態において、本発明は、本発明のdsRNA剤を含む医薬組成物を提供する。該dsRNA剤の試料を適切に配合し、十分な部分の試料を細胞に進入させて、起こるとすれば、遺伝子サイレンシングを誘導するための任意の手段により、細胞環境に導入させることができる。dsRNAの多くの配合剤が、当該技術分野で公知であり、dsRNAが標的細胞に進入して作用し得る限り、使用することができる。例えば、米国特許出願公開第2004/0203145 A1号及び同第2005/0054598 A1号を参照されたい。例えば、本発明のdsRNA剤は、リン酸緩衝生理食塩溶液、リポソーム、ミセル構造、及びカプシドなどの緩衝溶液に配合させることができる。dsRNA剤とカチオン性ペプチドとの配合剤を使用して、細胞内へのdsRNA剤のトランスフェクションを容易にすることができる。例えばリポフェクチンなどのカチオン性脂質(米国特許第5,705,188号)、カチオン性グリセロール誘導体、及びポリリシンなどのポリカチオン性分子(公開されたPCT国際出願WO97/30731号)を、用いることができる。適切な脂質としては、オリゴフェクタミン、リポフェクタミン(ライフ・テクノロジーズ)、NC388(リボザイム・ファーマシューティカルズInc.、コロラド州ボールダー所在)、またはFuGene 6(ロッシュ)が挙げられ、それらは全て、製造業者の使用説明書に従って使用することができる。
そのような組成物は、典型的には核酸分子及び医薬的に許容し得る担体を含む。本明細書で用いられる「医薬的に許容し得る担体」という表現は、医薬投与に適合し得る、生理食塩水、溶媒、分散媒体、コーティング剤、抗菌剤及び抗真菌剤、等張剤及び吸収遅延薬などを包含する。補助的活性化合物を、該組成物に組み込むこともできる。
医薬組成物は、意図する投与経路に適合するように配合させる。投与経路の例としては、非経口、例えば静脈内、皮内、皮下、経口(例えば、吸入)、経皮(外用)、経粘膜、及び経直腸投与が挙げられる。非経口、皮内、または皮下適用に用いられる溶液または懸濁液は、以下の成分を含み得る:滅菌希釈剤、例えば注射用水、生理食塩溶液、不揮発性油、ポリエチレングリコール、グリセリン、プロピレングリコール、または他の合成溶媒;ベンジルアルコールまたは他のメチルパラベンなどの抗菌剤;アスコルビン酸または亜硫酸水素ナトリウムなどの抗酸化剤;エチレンジアミン四酢酸などのキレート化剤;酢酸塩、クエン酸塩、またはリン酸塩などの緩衝剤、及び塩化ナトリウムまたはデキストロースなど浸透圧を調整するための薬剤。 pHは、塩酸または水酸化ナトリウムなどの酸または塩基で調整することができる。非経口調製剤は、ガラスもしくはプラスチック製のアンプル、使い捨てシリンジまたは反復投与用バイアル中に封入させることができる。
注射使用に適する医薬組成物は、滅菌水溶液(水溶性の場合)または分散剤、及び滅菌注射溶液または分散剤を即時調製するための滅菌粉末を含む。静脈内投与の場合、適切な担体としては、生理学的生理食塩水、制菌水、クレモホールEL(商標)(BASF、ニュージャージー州パーシッパニー所在)、またはリン酸緩衝生理食塩水(PBS)が挙げられる。全ての例において、該組成物は、滅菌されていなければならず、易注射性が存在する程度に流体でなければならない。該組成物は、製造及び貯蔵条件下で安定していなければならず、細菌及び真菌などの微生物の汚染作用が予防されなければならない。担体は、例えば水、エタノール、ポリオール(例えば、グリセロール、プロピレングリコール、及び液体ポリエチレングリコールなど)及びそれらの適切な混合物を含有する溶媒または分散媒体であり得る。例えばレシチンなどのコーティングの使用により、分散剤の場合には必要とされる粒子サイズの維持により、そして界面活性剤の使用により、適度な流動性を維持することができる。微生物の作用の予防は、様々な抗菌剤及び抗真菌剤、例えばパラベン、クロロブタノール、フェノール、アスコルビン酸、チオメルサールなどにより実現することができる。多くの場合、等張剤、例えば糖、マンニトール、ソルビトールなどのポリアルコール、塩化ナトリウムを組成物に含ませることが好ましいであろう。注射組成物の持続的吸収は、吸収を遅延させる薬剤、例えばモノステアリン酸アルミニウム及びゼラチンを組成物に含ませることによりもたらされ得る。
滅菌注射溶液は、選択された溶媒中の必要量の活性化合物に、上に列挙された一成分または成分の組み合わせを組み込み、必要に応じて次に濾過滅菌することにより、調製することができる。一般的に分散剤は、活性化合物を、基剤となる分散媒体及び先に列挙されたものから得られる必要な他成分を含む滅菌ビヒクルに組み込むことにより調製される。滅菌注射溶液の調製用の滅菌粉末の場合、好ましい調製方法は、予め滅菌濾過された溶液から有効成分+任意の更なる所望の成分の粉末を生成する真空乾燥及び凍結乾燥である。
経口組成物は、一般的に、不活性希釈剤または食用担体を含む。経口治療的投与の目的では、活性化合物は、賦形剤と共に組み込まれて、錠剤、トローチ、またはカプセル、例えばゼラチンカプセルの形態で用いることができる。経口組成物は、洗口液として使用するために流動担体を用いて調製することもできる。医薬的に適合し得る結合剤及び/またはアジュバント材料を、組成物の一部として含むことができる。錠剤、丸薬、カプセル、トローチなどは、以下の成分のいずれか、または同様の性質の化合物を含有することができる:結合剤、例えば微結晶セルロース、トラガカントガムもしくはゼラチン;賦形剤、例えばデンプンもしくはラクトース;崩壊剤、例えばアルギン酸、プリモジェル(Primogel)もしくはコーンスターチ;滑沢剤、例えばステアリン酸マグネシウムもしくはステロート(Sterotes);滑剤、例えばコロイド状二酸化ケイ素;甘味剤、例えばスクロースもしくはサッカリン;または香味剤、例えばペパーミント、サリチル酸メチルもしくはオレンジ香料。
吸入による投与の場合、該化合物は、適切な噴射剤、例えば二酸化炭素などの気体を含む加圧容器もしくはディスペンサーからのエアゾールスプレー、またはネブライザーの形態で送達される。そのような方法は、米国特許第6,468,798号に記載されたものを含む。
全身投与は、経粘膜または経皮手段によることもできる。経粘膜または経皮投与の場合、浸透されるバリアに適した透過剤が、配合剤中で使用される。そのような透過剤は、当該技術分野で概ね公知であり、例えば経粘膜投与では、洗浄剤、胆汁酸塩、及びフシジン酸誘導体が挙げられる。経粘膜投与は、鼻腔用スプレーまたは坐剤の使用により遂行することができる。経皮投与の場合、活性化合物は、当該技術分野で概ね公知の通り、軟膏、膏薬、ゲル、またはクリームに配合される。
該化合物は、坐剤(例えば、ココアバター及び他のグリセリドなど、従来の坐剤ベースを含む)または経直腸送達用の停留浣腸の形態で調製することもできる。
該化合物はまた、非限定的にMcCaffrey et al. (2002), Nature, 418(6893), 38−9 (流体力学的トランスフェクション); Xia et al. (2002), Nature Biotechnol., 20(10), 1006−10(ウイルスによる送達) ;またはPutnam (1996), Am. J. Health Syst. Pharm. 53(2), 151−160(Am. J. Health Syst. Pharm. 53(3), 325 (1996)に訂正掲載)に記載された方法をはじめとする、当該技術分野で公知の方法を利用して、トランスフェクションまたは感染により投与することができる。
該化合物はまた、DNAワクチンなどの核酸剤の投与に適した方法により投与することができる。これらの方法としては、遺伝子銃、バイオインジェクター、及び皮膚パッチ、ならびに米国特許第6,194,389号に開示されたマイクロ粒子DNAワクチン技術及び米国特許第6,168,587号に開示された粉末型ワクチンを用いる哺乳動物の経皮的無針ワクチン接種などの無針の方法が挙げられる。加えて、とりわけHamajima et al. (1998), Clin. Immunol. Immunopathol., 88(2), 205−10に記載されたものなど、鼻内送達が可能である。リポソーム(例えば、米国特許第6,472,375号に記載)及びマイクロカプセル化もまた、使用することができる。生分解性の標的化可能なマイクロ粒子送達系もまた、用いることができる(例えば、米国特許第6,471,996号に記載)。
一実施形態においては、該活性化合物を、移植片及びマイクロカプセル化送達系をはじめとする制御放出配合剤などの、該化合物が体から急速に排出することを防御し得る担体と共に調製する。エチレン酢酸ビニル、ポリ酸無水物、ポリグリコール酸、コラーゲン、ポリオルトエステル、及びポリ乳酸などの生分解性で生体適合性のポリマーを用いることができる。そのような配合剤を、標準技術を用いて調製することができる。該材料は、アルザ・コーポレーション及びノバ・ファーマシューティカルズIncから商業的に取得することもできる。リポソーム懸濁液(ウイルス抗原に対するモノクローナル抗体を有する感染細胞に標的化されたリポソームなど)を、医薬的に許容し得る担体として用いることもできる。これらを、例えば、米国特許第4,522,811号に記載された通り、当業者には公知の方法に従って調製することができる。
例えば、LD50(集団の50%に致死的となる用量)及びED50(集団の50%において治療有効性のある用量)を決定するために、そのような化合物の毒性及び治療有効性を、細胞培養物または実験動物における標準的医薬手順により決定することができる。毒性作用と治療作用の間の用量比は、治療指数であり、LD50/ED50比として表すことができる。高い治療指数を示す化合物が、好ましい。毒性副作用を示す化合物を用いる場合があるが、非感染細胞への潜在的な損傷を最小限に抑え、それにより副作用を低減するために、そのような化合物が罹患組織の部位を標的とする送達系を設計するように注意を払うべきである。
細胞培養アッセイ及び動物試験から得られたデータを、ヒトにおいて使用するための一定範囲の投与量を配合するのに用いることができる。そのような化合物の投与量は、好ましくはほとんどまたは全く毒性がないED50を含む循環濃度範囲内にある。投与量は、用いられる投与剤型及び利用される投与経路に応じて、この範囲内で変動し得る。本発明の方法で用いられる化合物の場合、治療有効用量は、最初、細胞培養アッセイから推定され得る。細胞培養で決定されるIC50(即ち、症状の最大半量阻害を実現する被験化合物の濃度)を含む循環血漿濃度範囲を実現する用量が、動物モデルにおいて配合され得る。そのような情報を利用して、ヒトにおいて有用な用量をより正確に決定することができる。血漿中レベルは、例えば高速液体クロマトグラフィーにより、測定してもよい。
本明細書で定義された通り、核酸分子の治療有効量(即ち、有効投与量)は、選択される核酸に依存する。例えば、およそ1pg〜1000mgの範囲内のdsRNA(または、例えばそのようなdsRNAをコードする構築物(複数可))の単一用量を投与してもよく、幾つかの実施形態において、10、30、100もしくは1000pg、または10、30、100もしくは1000ng、または10、30、100もしくは1000μg、または10、30、100もしくは1000mgが。投与されてもよい。幾つかの実施形態において、1〜5gの該組成物が、投与され得る。該組成物は、1日あたり1回または複数回〜1週間あたり1回または複数回(一日おきに1回など)のうちの1つで投与され得る。非限定的に疾患または障害の重症度、過去の処置、対象の一般的健康状態及び/または年齢、ならびに既存の他の疾患をはじめとするある特定の因子が、対象を効果的に処置するのに必要となる投与量及びタイミングに影響を及ぼし得ることは、当業者に認識されよう。その上、治療有効量の核酸(例えば、dsRNA)、タンパク質、ポリペプチド、または抗体による対象の処置は、単回の処置を含むことができ、または好ましくは一連の処置を含むことができる。
本発明の核酸分子は、例えば非限定的に上掲のXiaら(2002)に記載されたものなどの当該技術分野で公知の方法を用いて、発現構築物、例えばウイルスベクター、レトロウイルスベクター、発現カセット、またはプラスミドウイルスベクターに挿入することができる。発現構築物を、例えば吸入、経口、静脈注射、局所投与(米国特許第5,328,470号参照)または定位注射(例えば、Chen et al. (1994), Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 91, 3054−3057参照)により、対象に送達することができる。送達ベクターの医薬調製物は、許容し得る希釈剤中のベクターを含むことができ、または送達ビヒクルが埋め込まれた徐放性マトリックスを含むことができる。あるいは完全な送達ベクター、例えばレトロウイルスベクターを、組換え細胞から無傷で製造し得る場合、該医薬調製物は、遺伝子送達系を生成する1つまたは複数の細胞を含み得る。
発現構築物は、適切な発現系内での使用に適した構築物であってもよく、当該技術分野で公知の通り、レトロウイルスベクター、線形発現カセット、プラスミド及びウイルスまたはウイルス由来ベクターが挙げられるが、それらに限定されない。そのような発現構築物は、誘導性プロモータ、RNA Pol IIIプロモータ系、例えばU6 snRNAプロモータもしくはH1 RNAポリメラーゼIIIプロモータ、またはその他の当該技術分野で公知のプロモータを含み得る。該構築物は、siRNAの一方または両方の鎖を含み得る。両方の鎖を発現する発現構築物は、両方の鎖を連結するループ構造も含み得るが、または各鎖を同じ構築物内の別のプロモータから別個に転写し得る。各鎖は、別の発現構築物から転写することもできる(例えば、Tuschl (2002, Nature Biotechnol 20: 500−505))。
dsRNA剤を細胞環境に導入する方法が、細胞の型及びその環境の構造に依存するであろうことは、認識され得る。例えば細胞が液体中に見出される場合、1つの好ましい配合剤は、リポフェクタミンなどの脂質配合剤を含むもので、該dsRNA剤を、細胞の液体環境に直接添加することができる。脂質配合剤を、静脈内、筋肉内、もしくは腹腔内注射、または経口、吸入もしくは他の当該技術分野で公知の方法などにより、動物に投与することもできる。該配合剤が、哺乳動物、より具体的にヒトなどの動物への投与に適する場合、該配合剤は、医薬的にも許容し得る。オリゴヌクレオチドを投与するための医薬的に許容し得る配合剤は、公知であり、使用することができる。幾つかの例において、緩衝液または生理食塩溶液中にdsRNA剤を配合させること、及び卵母細胞での研究の通り細胞に配合dsRNA剤を直接注射することが、好ましくなり得る。dsRNA剤二重鎖の直接注射も、実施することができる。dsRNA(例えば、DsiRNA剤)を導入する適切な方法については、米国特許出願公開第2004/0203145 A1号を参照されたい。
dsRNA剤の適切な量が、導入されなければならず、これらの量は、標準法を利用して経験的に決定することができる。典型的には、細胞環境での個々のdsRNA剤種の有効濃度は、50ナノモル以下、10ナノモル以下であり、または1ナノモル以下の濃度の組成物を用いることができる。別の実施形態において、200ピコモル以下、100ピコモル以下、50ピコモル以下、20ピコモル以下の濃度、及び10ピコモル以下、5ピコモル以下、2ピコモル以下、または1ピコモル以下の濃度を利用する方法が、多くの状況で用いられ得る。
該方法は、十分量のdsRNA剤が細胞に進入してその効果を発揮し得るようにdsRNA剤組成物が配合されることを条件に、細胞が生存し得る細胞外マトリックスにdsRNA剤組成物を添加することにより実施され得る。例えば該方法は、液体培地もしくは細胞増殖培地などの液体中、組織外移植片、または哺乳動物、具体的にはヒトなどの動物をはじめとする全生物体の中に存在する細胞との使用に適している。
α1アンチトリプシンRNAのレベルまたは活性は、当該技術分野で現在知られている、または将来開発される適切な方法により決定することができる。標的RNA及び/または標的RNA発現を測定するのに用いられる方法が、標的RNAの性質に依存し得ることは、認識され得る。例えば、標的α1アンチトリプシンRNA配列が、タンパク質をコードしている場合、「発現」という用語は、タンパク質またはα1アンチトリプシンRNA/α1アンチトリプシン遺伝子(ゲノムまたは外来起源のいずれか)由来の転写産物を指すことができる。そのような例において、標的α1アンチトリプシンRNAの発現は、α1アンチトリプシンRNA/転写産物の量を直接測定することにより、またはα1アンチトリプシンタンパク質の量を測定することにより、決定することができる。タンパク質は、染色もしくは免疫ブロットなどによりタンパク質アッセイで、またはタンパク質が測定され得る反応を触媒する場合には反応速度を測定することにより、測定することができる。そのような方法の全てが、当該技術分野で公知であり、使用することができる。標的α1アンチトリプシンRNAレベルが、測定される場合、RNAレベルを検出するための当該技術分野で認識された方法を用いることができる(例えば、RT−PCR、ノーザンブロットなど)。本発明のdsRNA剤でα1アンチトリプシンRNAを標的化する場合、インビトロもしくはインビボのいずれかでの対象、組織、細胞内、または細胞抽出物中のα1アンチトリプシンRNAもしくはタンパク質のレベルを低下させることにおけるdsRNA剤の有効性の測定が、α1アンチトリプシン関連の表現型(例えば、疾患または障害、例えば慢性肝臓疾患、肝臓の炎症、肝硬変、肝線維症、及び/または肝細胞癌など)の低減の度合いを決定するのに用いることもできる。上記測定は、細胞、細胞抽出物、組織、組織抽出物または他の適切な供給材料で行うことができる。
α1アンチトリプシンRNAの発現が低減したかどうかの決定は、RNAレベルの変化を忠実に検出し得る適切な方法によりなされ得る。典型的には、該決定は、dsRNA剤の少なくとも一部が細胞質に進入するように、未消化のdsRNAを細胞環境に導入すること、及びその後、標的RNAのレベルを測定することにより行われる。同じ測定が、同一の未処理細胞で行われ、各測定から得られた結果が比較される。
該dsRNA剤は、薬理学的有効量のdsRNA剤及び医薬的に許容し得る担体を含む医薬組成物として配合され得る。薬理学的または治療的有効量は、意図する薬理学的、治療的または予防的結果を生じるのに効果的なdsRNA剤の量を指す。「薬理学的有効量」及び「治療的有効量」または単に「有効量」という表現は、薬理学的、治療的または予防的結果を生じるのに効果的なRNAの量を指す。例えば、疾患または障害に関連する測定可能なパラメータの少なくとも20%の低減が存在する場合に、所与の臨床的処理が効果的と見なされるならば、その疾患または障害の処置に関する薬物の治療的有効量は、そのパラメータの少なくとも20%低減を実行するのに必要となる量である。
本発明の適切に配合された医薬組成物を、当該技術分野で公知の手段により、例えば静脈内、筋肉内、腹腔内、皮下、経皮、気道(エアロゾル)、経直腸、経膣及び外用(口腔及び舌下など)投与をはじめとする非経口投与により投与することができる。幾つかの実施形態において、該医薬組成物は、静脈内または非経口内部(intraparenteral)輸液または注射により投与される。
一般に、dsRNAの適切な投与単位は、1日あたりにレシピエントの体重1kgあたり0.001〜0.25ミリグラムの範囲内、または1日あたりに体重1kgあたり0.01〜20マイクログラムの範囲内、または1日あたりに体重1kgあたり0.001〜5マイクログラムの範囲内、または1日あたりに体重1kgあたり1〜500ナノグラムの範囲内、または1日あたりに体重1kgあたり0.01〜10マイクログラムの範囲内、または1日あたりに体重1kgあたり0.10〜5マイクログラムの範囲内、または1日あたりに体重1kgあたり0.1〜2.5マイクログラムの範囲内である。dsRNAを含む医薬組成物を、1日1回投与することができる。しかし該治療薬は、2、3、4、5、6またはそれを超える分割用量を含む投与単位で、投与日に適切な間隔を入れて投与することもできる。その場合、各分割用量に含まれるdsRNAは、合計の日用量単位を実現するように、対応してより少量でなければならない。投与単位は、例えば数日間にdsRNAの持続的で一貫した放出をもたらす従来の持続放出配合剤を用いて、数日間に1回投与されるよう調剤することもできる。持続放出配合剤は、当該技術分野で周知である。この実施形態において、該投与単位は、対応する複数の日用量を含有する。配合にかかわらず、該医薬組成物は、処置される動物またはヒトの標的遺伝子の発現を阻害するのに十分な量のdsRNAを含有しなければならない。該組成物は、複数単位のdsRNAの合計が十分な用量を含むように、調剤され得る。
データを細胞培養アッセイ及び動物試験から得て、ヒトのための適切な投与範囲を配合することができる。本発明の組成物の投与量は、ほとんどまたは全く毒性がないED50(公知方法により決定)を含む循環濃度範囲内にある。投与量は、用いられる投与剤型及び利用される投与経路に応じて、この範囲内で変動し得る。本発明の方法で用いられる化合物の場合、治療有効用量は、最初、細胞培養アッセイから推定され得る。細胞培養で決定されるIC50(即ち、症状の最大半量阻害を実現する被験化合物の濃度)を含む化合物の循環血漿濃度範囲を実現するように、用量が動物モデルにおいて配合され得る。そのような情報を利用して、ヒトにおいて有用な用量をより正確に決定することができる。血漿中のdsRNAレベルは、標準法、例えば高速液体クロマトグラフィーにより、測定してもよい。
該医薬組成物は、投与用の使用説明書を伴って、キット、容器、パック、またはディスペンサー中に含まれ得る。
処置方法
本発明は、全体もしくは一部がα1アンチトリプシンにより誘発される疾患もしくは障害(例えば、α1アンチトリプシン転写産物及び/またはα1アンチトリプシンタンパク質レベルの誤制御及び/または上昇)、またはα1アンチトリプシンの選択的標的化により処置可能な疾患もしくは障害のリスクのある(またはそれに罹り易い)対象を処置する予防的及び治療的方法の両方を提供する。
ある特定の態様において、本発明は、対象に治療薬(例えば、dsRNA剤、またはそれをコードするベクターもしくはトランスジーン)を投与することにより、本明細書に記載された疾患または障害を対象において予防する方法(例えば、α1アンチトリプシン発現の阻害を通した対象のトランスフォーミング事象開始の予防など)を提供する。該疾患のリスクのある対象は、例えば本明細書に記載された診断または予知アッセイの1つまたは組み合わせにより、特定され得る。疾患または障害が予防されるか、あるいは進行が遅延されるように、予防剤の投与を、例えば対象における癌の検出前、または疾患もしくは障害に特徴的な症状の発現前に行うことができる。
本発明の別の態様は、対象を治療的に処置する方法、即ち疾患または障害の兆候を変化させる方法に関係する。これらの方法は、インビトロで(例えば、細胞をdsRNA剤と共に培養することにより)、あるいはインビボで(例えば、対象にdsRNA剤を投与することにより)実施することができる。
処置の予防及び治療方法の両方に関して、そのような処置は、ゲノム薬理学の分野から得られる知識に基づいて特有に適合または修正させてもよい。本明細書で用いられる「ゲノム薬理学」は、遺伝子配列決定、統計遺伝子学、及び遺伝子発現解析などのゲノム技術を臨床開発中、及び市場の薬物に適用することを指す。より具体的には該用語は、患者の遺伝子が薬物にどれほど応答したか(例えば、患者の「薬物応答表現型」または「薬物応答遺伝子型」)を決定する研究を指す。したがって本発明の別の態様は、個体の予防的または治療的処置を、本発明の標的α1アンチトリプシンRNA分子または個体の薬物応答遺伝子型にしたがって標的α1アンチトリプシンRNAモジュレータのいずれかと適合させる方法を提供する。ゲノム薬理学により、臨床医または内科医は、予防的または治療的処置を処置により最も利益を受ける患者に合わせることができ、そして有毒な薬物関連の副作用に見舞われる患者の処置を回避することができる。
本発明の実践は、他に断りがなければ、当該技術分野の技能にある化学、分子生物学、微生物学、組換えDNA、遺伝子学、免疫学、細胞生物学、細胞培養及びトランスジェニック生物学の従来の技術を用いる。例えば、Maniatis et al., 1982, Molecular Cloning (Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y.); Sambrook et al., 1989, Molecular Cloning, 2nd Ed. (Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y.); Sambrook and Russell, 2001, Molecular Cloning, 3rd Ed. (Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y.); Ausubel et al., 1992), Current Protocols in Molecular Biology (John Wiley & Sons、定期的な改訂を含む); Glover, 1985, DNA Cloning (IRL Press, Oxford); Anand, 1992; Guthrie and Fink, 1991; Harlow and Lane, 1988, Antibodies, (Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y.); Jakoby and Pastan, 1979; Nucleic Acid Hybridization (B. D. Hames & S. J. Higgins eds. 1984); Transcription And Translation (B. D. Hames & S. J. Higgins eds. 1984); Culture Of Animal Cells (R. I. Freshney, Alan R. Liss, Inc., 1987); Immobilized Cells And Enzymes (IRL Press, 1986); B. Perbal, A Practical Guide To Molecular Cloning (1984); the treatise, Methods In Enzymology (Academic Press, Inc., N.Y.); Gene Transfer Vectors For Mammalian Cells (J. H. Miller and M. P. Calos eds., 1987, Cold Spring Harbor Laboratory); Methods In Enzymology, Vols. 154 and 155 (Wu et al. eds.), Immunochemical Methods In Cell And Molecular Biology (Mayer and Walker, eds., Academic Press, London, 1987); Handbook Of Experimental Immunology, Volumes I−IV (D. M. Weir and C. C. Blackwell, eds., 1986); Riott, Essential Immunology, 6th Edition, Blackwell Scientific Publications, Oxford, 1988; Hogan et al., Manipulating the Mouse Embryo, (Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y., 1986); Westerfield, M., The zebrafish book. A guide for the laboratory use of zebrafish (Danio rerio), (4th Ed., Univ. of Oregon Press, Eugene, 2000)を参照されたい。
別様に定義しなければ、本明細書で用いられる全ての技術的及び科学的用語は、本発明が属する技術分野の当業者に共通して理解されるものと同じ意味を有する。本明細書に記載されたものと類似または同一の方法及び材料を、本発明の実践またはテストで用い得るが、適切な方法及び材料を以下に記載する。本明細書に列挙される全ての発行物、特許出願、特許、及び他の参考文献は、その全体が参照により本明細書に取り込まれる。矛盾する場合、定義を含み、本明細書が優先される。加えて、材料、方法、及び実施例は、例示に過ぎず、限定を意図するものではない。
本発明を、以下の実施例を参照して記載するが、実施例は、例として提示されており、本発明の限定を意図するものではない。当該技術分野で周知の標準技術または以下に具体的に記載された技術が用いられた。
実施例1:二本鎖RNAオリゴヌクレオチドの調製
オリゴヌクレオチドの合成及び精製
DsiRNA分子を、RNAメッセージ内の様々な部位、例えば本明細書に記載されるRNA配列内の標的配列、と相互作用するように設計することができる。本明細書に例示された薬剤において、384のヒト標的α1アンチトリプシンRNA配列を、評価のために選択した(384のヒト標的α1アンチトリプシン部位の選択物は、マウスα1アンチトリプシン転写産物の配列における対応する部位が保存されていると予測された)。DsiRNA分子の一方の鎖の配列は、先に記載された標的α1アンチトリプシン部位の配列と相補性があった。該DsiRNA分子を、本明細書に記載された方法を利用して化学合成した。概してDsiRNA構築物を、19〜23量体siRNAについて記載された固相オリゴヌクレオチド合成法を利用して合成した(例えば、Usmanらの米国特許第5,804,683号、同第5,831,071号、同第5,998,203号、同第6,117,657号、同第6,353,098号、同第6,362,323号、同第6,437,117号、同第6,469,158号;Scaringeらの米国特許第6,111,086号、同第6,008,400号、同第6,111,086号参照)。
標準法により、個々のRNA鎖を合成して、HPLCで精製した(インテグレーティッド・DNA・テクノロジーズ、アイオワ州コーラルビル所在)。例えば、RNAオリゴヌクレオチドを、固相ホスホロアミダイト化学を利用して合成し、標準的技術を利用して脱保護し、NAP−5カラム(アマシャム・ファルマシア・バイオテック、ニュージャージー州ピスカタウェイ所在)で脱塩した(Damha and Olgivie, 1993, Methods Mol Biol 20: 81−114; Wincott et al., 1995, Nucleic Acids Res 23: 2677−84)。15分の段階線形勾配を用いる、アマシャム・ソース15Qカラム(1.0cm×25cm;アマシャム・ファルマシア・バイオテック、ニュージャージー州ピスカタウェイ所在)上のイオン交換高速液体クロマトグラフィー(IE−HPLC)を利用して、該オリゴマーを精製した。勾配は、緩衝液A:Bを90:10から52:48に変化させたが、ここで緩衝液Aは、100mMのトリスpH8.5、緩衝液Bは、100mMのトリスpH8.5、1MのNaClであった。260nmで試料をモニタリングし、全長オリゴヌクレオチド種に相当するピークを回収してまとめ、NAP−5カラムで脱塩して凍結乾燥した。
各オリゴマーの純度をベックマンPACE5000(ベックマン・コールターInc.,カリフォルニア州フラトン所在)でのキャピラリー電気泳動(CE)により決定した。CEキャピラリーは、100μmの内径を有し、ssDNA 100Rゲル(ベックマン・コールター)を含有した。典型的には、約0.6ナノモルのオリゴヌクレオチドをキャピラリー中に注入し、444V/cmの電場中で泳動して、260nmでのUV吸光度によって検出した。変性トリス−ホウ酸−7M尿素泳動緩衝液は、ベックマン・コールターから購入した。以下に記述される実験で使用するためにCEによる評価で、少なくとも90%の純度のオリゴリボヌクレオチドが得られた。製造業者が推奨するプロトコルに従い、ボイジャーDE(商標)バイオスペクトメトリー・ワークステーション(アプライド・バイオシステムズ、カリフォルニア州フォスターシティ所在)でのマトリックス支援レーザー脱離イオン化飛行時間型(MALDI−TOF)質量分析法により、化合物の同一性を検証した。全てのオリゴマーの相対的分子量は、多くが期待される分子量の0.2%以内で得られた。
二重鎖の調製
一本鎖RNA(ssRNA)オリゴマーを、例えば100mM酢酸カリウム、30mM HEPES pH7.5からなる二重鎖緩衝液中の100μMの濃度で、再懸濁させた。相補的なセンス鎖及びアンチセンス鎖を、等モル量で混合して、例えば50μM二重鎖の、最終溶液を得た。試料をRNA緩衝液(IDT)中、100℃で5分間加熱し、使用前に室温まで放冷した。二本鎖RNA(dsRNA)オリゴマーを−20℃で貯蔵した。一本鎖RNAオリゴマーを凍結乾燥して貯蔵するか、またはヌクレアーゼを含まない水中、−80℃で貯蔵した。
命名法
一貫性のため、以下の命名法を本明細書で使用した。二重鎖に与えられた名称は、オリゴマーの長さ及びオーバーハングの有無を示す。「25/27」は、25塩基のセンス鎖及び27塩基のアンチセンス鎖と2塩基の3’オーバーハングを有する非対称二重鎖である。「27/25」は、27塩基のセンス鎖及び25塩基のアンチセンス鎖を有する非対称二重鎖である。
細胞培養及びRNAトランスフェクション
Huh7細胞を得て、10%ウシ胎仔血清(ハイクローン)を補充されたDMEM(ハイクローン)中、5%CO2の下、37℃で保持した。RNAトランスフェクションのために、リポフェクタミン(商標)RNAiMAX(インビトロジェン)及び以下の製造業者の使用説明書を用いて、細胞を最終濃度1nM、0.1nMまたは0.03nMのDsiRNAでトランスフェクトした。手短に述べると、例えば下記の実施例3の、0.1nMトランスフェクションでは、各DsiRNAの原液のアリコットを、Opti−MEM I(インビトロジェン)及びリポフェクタミン(商標)RNAiMAXと混合して、150μLの体積(0.3nM DsiRNA)にした。得られた150μLミックスを、室温で20分間インキュベートしてDsiRNA:リポフェクタミン(商標)RNAiMAX複合体を形成させた。その間に、標的細胞をトリプシン処理して、培地に再懸濁させた。20分間の複合体化の終了時に、DsiRNA:RNAiMAX混合物50μLで、96ウェルプレートのウェルに三箇所ずつ添加した。最後に、細胞懸濁液100μLを各ウェルに添加し(最終容量150μL)、プレートをインキュベータに24時間静置した。
α1アンチトリプシン阻害の評価
α1アンチトリプシン標的遺伝子ノックダウンをqRT−PCRにより計測し、値をHPRT及びSFRS9ハウスキーピング遺伝子と、対照DsiRNA及び/またはモックトランスフェクション対照でのトランスフェクションとに正規化した。
RNA単離及び分析
培地を吸引し、全RNAをSV96キット(プロメガ)を用いて抽出した。全RNAを、製造業者の使用説明書に従い、スーパースクリプトII、オリゴdT、及びランダムヘキサマーを用いて逆転写した。典型的には得られたcDNAを、α1アンチトリプシン遺伝子とヒト遺伝子HPRT−1及びSFRS9の両方に特異的なプライマー及びプローブを用いたqPCRにより分析した。ABI7700を増幅反応に用いた。各試料を、三重測定でテストした。相対的なα1アンチトリプシンRNAレベルを、HPRT1及びSFRS9 RNAレベルに正規化して、トランスフェクション対照試料中で得られたRNAレベルと比較した。
実施例2:α1アンチトリプシンのDsiRNA阻害
α1アンチトリプシンを標的とするDsiRNA分子を、先に記載された通り設計して合成し、ヒトHuh7細胞(あるいはHepG2または他のヒト細胞を用いることができた)において阻害効果についてテストした。トランスフェクションについては、アニーリングされたDsiRNAをトランスフェクション試薬(リポフェクタミン(商標)RNAiMAX、インビトロジェン)と混合して、室温で20分間インキュベートした。Huh7(ヒト)またはAML12(マウス)細胞(あるいはマウスHepa1−6または他のマウス細胞を用いることができ得た)をトリプシン処理して培地に再懸濁させ、ウェルに添加して(ウェルあたり100μL)、最終DsiRNA濃度1nMを150μlの体積で与えた。各DsiRNAトランスフェクション混合物を、三重測定でのDsiRNA処置のために3つのウェルに添加した。細胞を、DsiRNAトランスフェクション混合物の連続での存在下、37℃で24時間インキュベートした。24時間目に、RNAを処置細胞の各ウェルから調製した。トランスフェクション混合物を含む上清を最初に除去して廃棄し、その後、細胞を溶解して、RNAを各ウェルから調製した。処置後の標的α1アンチトリプシンRNAレベルを、α1アンチトリプシン標的遺伝子についてqRT−PCRにより評価し、値を対照で得られた値に正規化した。三重測定のデータを平均して、%誤差を各処置について決定した。正規化されたデータで表及びグラフの両方を作成し、対照と比較した、活性DsiRNAによる標的mRNAの減少を決定した(以下の表22及び図2A〜2D参照)。
実施例3:α1アンチトリプシンのDsiRNA阻害 − 第二のスクリーニング
その後、上記実験の96の非対称DsiRNA(Hsα1アンチトリプシンを標的とする96であり、そのうち7つはMmα1アンチトリプシンも標的とした)を、第二のアッセイ(「第二相」)で検査して、そのようなアッセイの結果を図3A〜3Hにヒストグラム形式で表した。具体的には先の通り試験されたものから選択された96の非対称DsiRNAを、ヒトα1アンチトリプシン阻害について、ヒトHuh7細胞の環境で1nM、0.1nM及び0.03nMで評価した(図3A〜3D)。これらの96の非対称DsiRNAを、マウスα1アンチトリプシン阻害についても、マウスAML12細胞の環境で1nM、0.1nM及び0.03nMで評価した(図3E〜3H)。図3A〜3Dに示される通り、ほとんどの非対称DsiRNAは、Huh7細胞の環境でアッセイされた場合に、ナノモル未満の濃度で有意なヒトα1アンチトリプシン阻害効果を、再現性を持って示した。加えて図3E〜3Hに示される通り、マウスAML12細胞の環境でアッセイされた場合に、ナノモル以下の濃度で有意なマウスα1アンチトリプシン阻害効果を有する限定数の非対称DsiRNAが同定された。
実施例4:α1アンチトリプシン標的化DsiRNAの修飾形態はインビトロでα1アンチトリプシンレベルを低下させた
上記の初期スクリーニングのα1アンチトリプシンと標的とする24種のDsiRNA(AAT−486、−490、−496、−508、−810、−898、−899、−911、−1069、−1360、−1361、−1449、−1450、−1453、−1458、−1459、−1460、−1461、−1462、−1463、−1465、−1471、−1476及び−1477)を、図4Aの図式に示された通り2’−O−メチルガイド鎖及びパッセンジャー鎖修飾パターンで調製した(個々の鎖の修飾パターンを図4Bにおいて分離して示した;修飾は、「M107」修飾パッセンジャー鎖及び上記のガイド鎖修飾パターン「M8」、「M17」、「M35」及び「M48」を含む)。24のDsiRNA配列のそれぞれについて、4つのガイド鎖修飾パターンM8、M17、M35及びM48のそれぞれを有するDsiRNAを、ヒトHuh7細胞のα1アンチトリプシン阻害について、Huh7細胞の環境で1nM、0.1nM及び0.03nM濃度でアッセイした。これらの実験の結果を、図4C〜4Fにヒストグラムとして表す。概して24のDsiRNA配列は、ガイド鎖の2’−O−メチル修飾の度合が増加するに従い、α1アンチトリプシン阻害効果が減少する傾向を示した。しかし、検査した全てのDsiRNA配列について、DsiRNAにインビトロで有意なα1アンチトリプシン阻害効果を保持させる修飾パターンを、特定することができた。これらDsiRNAのうちのいくつか(例えば、AAT−486、AAT−490、AAT−899、AAT−911、AAT−1361、AAT−1458、AAT−1459、AAT−1460、AAT−1462、AAT−1463、AAT−1465及びAAT−1477)が、検査された最も高い修飾状態であっても強いα1アンチトリプシン阻害効果を示したことも、注目に値した。したがってそのような高活性の修飾DsiRNA配列は、インビボで対象に治療的に投与された場合に、そのようなDsiRNAの安定化及び/またはそのようなDsiRNAの免疫原性低下を可能にすると考えられる修飾パターンを有した。
実施例5:ガイド鎖及びパッセンジャー鎖の両方の修飾を有するα1アンチトリプシン標的化DsiRNAのさらなる形態はインビトロでα1アンチトリプシンレベルを低下させた
上記実験のうちの、16種のα1アンチトリプシンを標的とするDsiRNA(AAT−490、AAT−496、AAT−810、AAT−898、AAT−899、AAT−1360、AAT−1361、AAT−1450、AAT−1453、AAT−1458、AAT−1459、AAT−1461、AAT−1462、AAT−1463、AAT−1471及びAAT−1477)を、上記及び図5A〜5Cに表されたような2’−O−メチルパッセンジャー鎖及びガイド鎖修飾パターンで調製した(パッセンジャー鎖修飾パターン「SM14」、「SM24」、「SM107」、「SM250」、「SM251」及び「SM252」と、ガイド鎖修飾パターン「M48」、「M8」及び「M17」を含む)。16のDsiRNA配列のそれぞれについて、6つのパッセンジャー鎖修飾パターンM14、M24、M107、M250、M251及びM252と、1つの好ましいガイド鎖修飾パターン(ガイド鎖修飾パターンM48、M8及びM17から選択)のそれぞれを有するDsiRNAを、ヒトHuh7細胞でのα1アンチトリプシン阻害について、Huh7細胞の環境で1.0nM、0.1nM及び0.03nM(30ピコモル)濃度でアッセイした。これらの実験の結果を、図5D〜5Hにヒストグラムとして表す。検査した全てのDsiRNA配列について、DsiRNAにインビトロで有意なα1アンチトリプシン阻害効果を保持させる、ガイド鎖及びパッセンジャー鎖の両方の広範囲な修飾を有する少なくとも1つの二重鎖を、特定することができた。これらのDsiRNAの多く(例えば、AAT−899、AAT−899、AAT−1461、AAT−1462、AAT−1463、AAT−1471及びAAT−1477)が、検査された全ての修飾状態で強いα1アンチトリプシン阻害効果を示すことは、注目に値した。そのような高活性の修飾DsiRNA配列は、インビボで対象に治療的に投与された場合に、そのようなDsiRNAの安定化及び/またはそのようなDsiRNAの免疫原性低下を可能にすると考えられる修飾パターンを有する。
実施例6:α1アンチトリプシン標的化dsRNAの一本鎖伸長形態の合成及び試験
以下のα1アンチトリプシン標的化dsRNAも合成し、それらはガイド鎖の一本鎖5’伸長を有した(図6Aにも示した)
ここで、下線は、2’−O−メチルRNAを示し、太字で斜体の「A」は、2’−フルオロアデニン残基を示す。
本発明のdsRNAの上記「一本鎖伸長」(または「ss伸長」)形態を、Huh7細胞におけるα1アンチトリプシンノックダウン活性についても試験し、図6Bに示された通り、全てが強いα1アンチトリプシン阻害効果を示し、測定されたIC50値が全て0.1〜20pMの範囲内であり、測定された最小のIC50値は、AAT−1477−M251−ExM48伸長dsNA(図6Bでは「SERPINA1 1477−M251−ExM48」とも称される)について得られた0.1pMであった。これらのdsNA伸長形態のそれぞれが、インビボ投与された場合、及び/またはインビボ免疫原性の予測もしくは評価のためのインビトロモデルもしくはアッセイ系において、免疫原性の欠如(例えば、IFN及び/またはPKR効果(複数可)を効果的に誘導しないこと)も示されると予想され、それがこれらのdsRNA配列の一本鎖伸長内に存在する修飾により提供されるマスキングに起因する可能性がある。そのようなdsRNA配列は、インビボで対象に治療的に投与された場合に、(そのような長さのdsRNAについても)そのようなdsRNAの安定化及び/またはそのようなdsRNAの免疫原性低下を可能にすると考えられる修飾パターンを有する。
実施例7:α1アンチトリプシンを標的とするDsiRNAのインビボ有効性の評価
ある特定の活性α1アンチトリプシン標的化DsiRNAがマウスの、任意で肝臓疾患のマウスモデルの、α1アンチトリプシンレベルを低下させる能力を検査する。動物を無作為化し、マーカレベルに基づいて群に割り付ける。DsiRNAを含む脂質ナノ粒子(LNP)(任意で、EnCore−2072という名称のLPN配合剤が用いられる)の動物への投薬を、0日目に開始する。動物に5mg/kg ivで1週間に3回ずつ2週間(合計6回)投与する。最後の投薬後48時間目に、動物を殺処分する。肝臓を摘出して計量して、α1アンチトリプシンレベルを評価する(任意で、肝臓疾患または障害のマウスモデルでは、該疾患または障害の低減及び/または予防の度合いを評価する)。
実施例8:適応症
α1アンチトリプシン研究における現在の知識体系から、研究、診断、及び治療使用のために、α1アンチトリプシン活性をアッセイする方法と、α1アンチトリプシン発現を調節し得る化合物と、の必要性が示される。本明細書に記載される通り、本発明の核酸分子は、α1アンチトリプシンレベルに関係する疾患状態を診断するアッセイで用いられ得る。加えて、該核酸分子は、α1アンチトリプシン誤制御、レベルなどに関係する疾患状態を処置するために用いられ得る。
α1アンチトリプシン発現のモジュレーションに関連し得る具体的な障害及び疾患状態としては、慢性肝臓疾患、肝臓の炎症、肝硬変、肝線維症、及び肝細胞癌が挙げられるが、それらに限定されない。
他の治療薬を、本発明の核酸分子(例えば、DsiRNA分子)と組み合わせること、またはそれとともに使用することができる。当業者は、本明細書に記載される疾患及び病状を処置するために用いられる他の化合物及び治療を、本発明の核酸分子(例えば、siNA分子)と併用することができ、それゆえそれが本発明の範囲内であることを認識するであろう。例えば併用療法では、本発明の核酸は、少なくとも2つの方法のうちの1つで調製され得る。第一の方法では、該薬剤を、核酸と他の薬剤との調製物、例えばリポソーム中にカプセル化された本発明の核酸と静脈投与用の溶液中の他の薬剤とが治療有効濃度で存在する混合物(例えば、1000〜1250mg/m2/日を送達する溶液中の他の薬剤、及び0.1〜100mg/kg/日を送達する前記溶液中の本発明のリポソーム結合核酸)に、物理的に混和する。あるいは該薬剤を、それぞれの有効用量で(例えば、1000〜1250mg/m2/日の他の薬剤、及び0.1〜100mg/kg/日の本発明の核酸)別個であるが同時に、または順次投与する。
実施例9:DsiRNAの血清安定性
50%ウシ胎仔血清中でDsiRNA剤を37℃で様々な期間(最大24時間)、インキュベートすることにより、DsiRNA剤の血清安定性を評価する。血清を抽出して、核酸を20%非変性PAGE上に分離し、ゲルスター(Gelstar)染色で視覚化することができる。ヌクレアーゼ分解からの相対的保護レベルを、DsiRNAについて評価する(任意で修飾して、または修飾せずに)。
実施例10:診断的使用
本発明のDsiRNA分子を、様々な適用、例えば臨床、工業、環境、農業及び/または研究での設定、における分子標的(例えば、RNA)の特定などの様々な診断的適用で用いることができる。DsiRNA分子のそのような診断的使用は、例えば細胞溶解物または部分的に精製された細胞溶解物を用い、再構成されたRNAi系を使用することを含む。本発明のDsiRNA分子は、罹患した細胞内の遺伝的浮動及び突然変異を検査する診断ツールとして用いることができる。DsiRNA活性と標的α1アンチトリプシンRNAの構造との密接な関連性により、標的α1アンチトリプシンRNAの塩基対合及び三次元構造を改変するα1アンチトリプシン分子の一領域内の突然変異を検出することができる。本発明に記載された複数のDsiRNA分子を使用することにより、インビトロならびに細胞及び組織内でのRNA構造及び機能に重要となるヌクレオチド変化をマッピングすることができる。DsiRNA分子による標的α1アンチトリプシンRNAの切断を利用して、遺伝子発現を阻害し、α1アンチトリプシン関連疾患または障害の進行における特定の遺伝子産物の役割を定義することができる。このようにして、他の遺伝子標的を、該疾患の重要な仲介因子として定義することができる。これらの実験は、併用療法(例えば、異なる遺伝子を標的とする複数のDsiRNA分子、公知の小分子阻害剤と結合させたDsiRNA分子、あるいはDsiRNA分子及び/または他の化学的もしくは生物学的分子と併用される間欠処置)の可能性を付与することにより、疾患進行のより良好な治療をもたらすであろう。本発明のDsiRNA分子の他のインビトロ使用は、当該技術分野で周知であり、疾患または関係の病状に関連するRNAの存在の検出を含む。そのようなRNAは、標準的な手法、例えば蛍光共鳴発光移動(fluorescence resonance emission transfer)(FRET)を利用して、DsiRNAでの処理後の切断産物の存在を計測することにより検出される。
具体的例において、標的α1アンチトリプシンRNAの野生型または突然変異体または多型のみを切断するDsiRNA分子を、アッセイに用いる。第一のDsiRNA分子(即ち、標的α1アンチトリプシンRNAの野生型のみを切断するもの)を用いて、試料中に存在する野生型α1アンチトリプシンRNAを特定し、第二のDsiRNA分子(即ち、標的RNAの突然変異体または多型のみを切断するもの)を用いて、試料中の突然変異型または多型α1アンチトリプシンRNAを特定する。反応対照として、野生型と突然変異型または多型の両方のα1アンチトリプシンRNAの合成基質を、両方のDsiRNA分子により切断して、反応物中及び「非標的」α1アンチトリプシンRNA種の切断の非存在下で、相対的DsiRNA効率を実証する。合成基質からの切断産物は、試料集団中の野生型及び突然変異型α1アンチトリプシンRNAの分析のためのサイズマーカを作製する働きもある。したがって各分析は、2種のDsiRNA分子、2種の基質及び1種の未知試料を必要とし、それが6種の反応物に混和される。切断産物の存在は、RNase保護アッセイを利用して決定され、それにより各α1アンチトリプシンRNAの全長及び切断フラグメントをポリアクリルアミドゲルの1レーンで分析することができる。標的細胞における突然変異型または多型α1アンチトリプシンRNAの発現と、α1アンチトリプシン関連表現型変化の推定リスクについての洞察を得るのに、結果を定量することが絶対に必要というわけではない。タンパク質産物が表現型(即ち、関係/関連する疾患)の発生に関連づけられるα1アンチトリプシンmRNAの発現が、リスクを確定するのに十分である。同等の特異的活性のプローブが、両方の転写産物に用いられれば、α1アンチトリプシンRNAレベルの定量的比較は十分であり、初期診断のコストを削減する。より高い突然変異型または多型形態の野生型に対する比は、α1アンチトリプシンRNAレベルが定性的に比較されるか、または定量的に比較するかにかかわらず、より高いリスクと相関する。
本明細書に挙げられる全ての特許及び発行物は、本発明が属する技術分野の当業者の技能レベルを示している。本開示に引用される全ての参考文献は、各参考資料が個別に全体として参照により取り込まれたのと同程度に、参照により取り込まれる。
本発明が、目的を実践し、挙げられた目的及び利点と本明細書に内在する目的及び利点を得るように十分適合されることは、当業者に容易に認識されよう。好ましい実施形態の目下の代表として本明細書に記載される方法及び組成物は、例示であり、本発明の範囲の限定を意図するものではない。本明細書内の変更及びその他の使用は、当業者に発想されると思われ、本発明の主旨に含まれ、特許請求の範囲により定義される。
様々な置換及び修正が、本発明の範囲及び主旨を逸脱することなく、本明細書に開示された本発明になされ得ることは、当業者に容易に明白となろう。したがってそのような追加の実施形態は、本発明の範囲及び以下の特許請求の範囲に含まれる。本発明は、RNAi活性を仲介するために改善された活性を有する核酸構築物を作製することに向けて、本明細書に記載された化学修飾の様々な組み合わせ及び/または置換を試験することを当業者に教示している。そのような改善された活性は、改善された安定性、改善された生物学的利用度、及び/またはRNAiを仲介する細胞応答の改善された活性を含み得る。それゆえ本明細書に記載された具体的実施形態は限定ではなく、そして改善されたRNAi活性を有するDsiRNA分子を特定することに向けた実験を過度に実施することなく、本明細書に記載された修正の特定の組み合わせが試験され得ることは、当業者に容易に理解され得る。
本明細書に例示的に記載された本発明は、本明細書に具体的に開示されていない任意の要素または複数の要素、限定または複数の限定がなくとも適宜、実践され得る。したがって、例えば本明細書の各例において、「含む」、「本質的に〜からなる」、及び「〜からなる」という用語のいずれも、他の2つの用語のいずれかと置き換えてもよい。用いられた用語及び表現は、説明の用語として用いられており、限定ではなく、そのような用語及び表現の使用において図示及び記述された特色またはその一部の任意の均等物の排除を意図するものではなく、様々な修正が請求された本発明の範囲内で可能であることが認識される。したがって、本発明は好ましい実施形態により具体的に開示されるが、本明細書に開示される概念の任意選択的な特色、修正及び変形が当業者によって再分類され得ること、ならびにそのような修正及び変形が本明細書及び添付の特許請求の範囲によって定義された本発明の範囲内のものと見なされることが、理解されなければならない。
加えて、本発明の特色または態様がマーカッシュ群または他の代替の群に関して記載されている場合、それにより本発明がマーカッシュ群または他の群の任意の個々の構成員または構成員の下位群に関しても記載されていることが、当業者に認識されよう。
本発明を記述する文脈において(特に、以下の特許請求の範囲の文脈において)、「a」及び「an」及び「the」及び同様の指示対象用語の使用は、本明細書中で他に断りがあるか、または文脈によって明らかに否定される場合を除き、単数形及び複数形の両方を含むと解釈されるべきである。「含む」、「有する」、「包含する」、及び「含有する」という用語は、別様に言及されない限り、制限のない用語(即ち、「非限定的に含む」を意味する)と解釈されるべきである。本明細書中の値の範囲の記述は、本明細書中で他に断りがなければ、単に範囲内に入るそれぞれ別の値を個別に言及する簡便な方法として機能するものであり、それぞれの別の値は、本明細書中で個別に列挙されているかのごとく、本明細書中に取り込まれる。本明細書に記述される全ての方法は、本明細書中で他に断りがあるか、または文脈によって明らかに否定される場合を除き、任意の適切な順序で行うことができる。ありとあらゆる実施例、または本明細書中で示される例示的表現(例えば「などの」)の使用は、本発明をより明解にすることのみが意図されており、他に請求されない限り、本発明の範囲の限定を述べてはいない。本明細書中のいかなる表現も、任意の請求されていない要素を本発明の実施に不可欠であるとして示すと解釈されるべきではない。
本発明を実行するための本発明者に知られる最良の様式を含む本発明の実施形態が、本明細書中に記載されている。それらの実施形態の変形は、前述の記載を読むことにより、当業者により明らかになり得る。
本発明者らは、当業者がそのような変形を適宜使用することを予期しており、本発明者らは、本明細書の具体的な記載とは異なる形で、本発明が実施されることを意図する。従って本発明は、適用可能な法律によって許可される、添付の特許請求の範囲に記述される対象の全ての修正及び均等物を含む。さらに、全ての可能性のある変形における上記要素のいかなる組み合わせも、本明細書中で他に断りがあるか、または文脈によって明らかに否定されている場合を除き、本発明に含まれる。当業者は、本明細書に記載された本発明の具体的実施形態の多くの均等物を、日常的であるものを超えない実験を用いて認識するか、または確認を可能にするであろう。そのような均等物は、以下の特許請求の範囲に含まれることが意図される。