TW202308660A - 用於抑制α－１抗胰蛋白酶表現之組合物及方法 - Google Patents

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Abstract

本發明係關於可用於經由使用dsRNA (例如，切丁酶受質siRNA (DsiRNA)劑)來降低α-1抗胰蛋白酶標靶RNA及蛋白質水準之化合物、組合物及方法。

Description

用於抑制α-1抗胰蛋白酶表現之組合物及方法
α1-抗胰蛋白酶(A1AT，或 SERPINA1，或Serpina1，或AAT)係屬於serpin超家族之蛋白酶抑制劑。其一般係稱作血清胰蛋白酶抑制劑。α1-抗胰蛋白酶亦稱作α-1蛋白酶抑制劑(A1PI)，因為其抑制多種蛋白酶(Gettins P.G.等人， Chem Rev 102: 4751-804)。其保護組織免受發炎細胞之酶、尤其嗜中性球彈性蛋白酶侵害，且在血液中之參考範圍為1.5-3.5公克/公升，但在急性發炎時可出現多倍升高之水準(Kushner及Mackiewicz, Acute-phase proteins: molecular biology, biochemistry and clinical applications(CRC Press); 1993, 第1章, 第3-19頁)。在AAT不存在下，AAT與該彈性蛋白酶之間的平衡被打破且可引起損害。通常，該彈性蛋白酶在對抗感染方面發揮重要作用，但該酶過多亦可傷害健康組織。在高濃度下，其對肺內膜及肺泡造成損害，更特定言之，在此類情況下，彈性蛋白酶自由分解促進肺彈性之彈性蛋白，從而引起呼吸倂發症，諸如成人肺氣腫或慢性阻塞性肺病(COPD)及成人或兒童肝硬化(Gadek JE等人， Lung, 1990, 168 增刊:552-64；Birrer P, Agents Actions Suppl., 1993, 40:3-12)。另外，AAT缺乏可影響肝臟，從而導致不良功能且增加肝硬化及肝癌風險。對於具有AAT缺乏之人，在生命之前三十年，肝臟疾病比肺病更常見(Gadek JE等人， Lung, 1990)。對於一些人，AAT缺乏可導致皮膚上頻繁出現紅色、使人疼痛的結節。在AAT基因之一或兩個複本中具有突變之個體可罹患α-1抗胰蛋白酶缺乏，其表現為由於肺及肝臟中高於正常的彈性蛋白酶活性而發展肺氣腫(DeMeo DL及Silverman EK (2004年3月), Alpha1-antitrypsin deficiency. 2: genetic aspects of alpha(1)-antitrypsin deficiency: phenotypes and genetic modifiers of emphysema risk, Thorax 59 (3): 259-64)或慢性肝臟疾病之風險。 SERPINA1已定位於染色體14q32處且已鑑別SERPINA1基因之超過75種突變，多種突變具有臨床顯著效應(Silverman E.K., Sandhaus RA (2009), Alpha1-Antitrypsin Deficiency, New England Journal of Medicine 360(26): 2749-57)。重度缺乏(PiZ)之最常見原因係單一鹼基對取代導致位置342處之麩胺酸至離胺酸突變(dbSNP: rs28929474)，而PiS係由位置264處之麩胺酸至纈胺酸突變引起的(dbSNP: rs17580)。
在受影響個體中，α-1抗胰蛋白酶缺乏係野生型、功能性α-1抗胰蛋白酶之缺乏。然而，在一些情況下，該個體產生大量α-1抗胰蛋白酶，但一部分所產生之α-1抗胰蛋白酶蛋白係經錯誤折疊，或者含有危害或消除該蛋白質之原生功能的突變。在一些情況下，該個體產生經錯誤折疊之蛋白質，該等蛋白質無法正確地自合成位點轉運至體內作用位點。
此類經錯誤折疊之蛋白質可引起由α-1抗胰蛋白酶缺乏導致的肝臟疾病。α-1抗胰蛋白酶之突變體形式(例如常見PiZ變異體，其在位置342 (預加工形式中之位置366)處具有麩胺酸至離胺酸突變)係在肝臟細胞中產生(肝臟中之肝細胞通常產生大量循環AAT)，且在經錯誤折疊之組態中，此類形式不容易自該等細胞中轉運出。這導致經錯誤折疊之蛋白質積累於肝臟細胞(肝細胞，其中具有突變型Z蛋白之最大負荷的彼等可經歷細胞內損害級聯，其最終導致細胞凋亡；肝細胞細胞凋亡及再生之此長期循環最終可引起纖維化及器官損傷)中且可引起一或多種肝臟疾病或病症，包括但不限於慢性肝臟疾病、肝臟發炎、肝硬化、肝臟纖維化及/或肝細胞癌(Rudnick DA及Perlmutter DH., Alpha-1-antitrypsin deficiency: a new paradigm for hepatocellular carcinoma in genetic liver disease, Hepatology; 2005, 42(3): 514-21)。具有AAT缺乏之個體中可出現其他症狀，其可包括：呼吸急促、過度咳嗽並伴有痰/唾液產生、喘息、運動能力下降及持續低能狀態或疲倦、吸氣時胸痛加劇。此等症狀可為長期的，或與諸如感冒或流感之急性呼吸道感染相伴出現。在極少數情況下，AAT可引起稱作脂層炎之皮膚病，從而導致硬化斑塊及紅色、使人疼痛的腫塊(Gadek JE等人， Lung, 1990)。
目前，成功治療具有與α-1抗胰蛋白酶缺乏相關之肝臟疾病之患者的選項很少，且此類選項包括肝炎疫苗接種、支持性照護及避免有害劑(例如酒精及NSAID)，其均不提供靶向療法。α-1抗胰蛋白酶之替代對此等患者之肝臟疾病無影響，但肝臟移植可能有效。因此，仍需要用於治療具有與α-1抗胰蛋白酶缺乏相關之肝臟疾病之患者的組合物及方法。
本發明部分地基於發現用於降低肝臟中之α-1抗胰蛋白酶(α-1抗胰蛋白酶或A1AT或 SERPINA1)表現之寡核苷酸(例如RNAi寡核苷酸)。特定言之，已鑑別α-1抗胰蛋白酶mRNA內之標靶序列且產生結合於此等標靶序列且抑制α-1抗胰蛋白酶mRNA表現之寡核苷酸。如本文所證明，該等寡核苷酸抑制肝臟中之鼠科動物α-1抗胰蛋白酶表現及/或猴及人類α-1抗胰蛋白酶表現。不受理論束縛，本文所述之寡核苷酸可用於治療與α-1抗胰蛋白酶表現相關之疾病、病症或疾患(例如肺部發炎、慢性阻塞性肺病(COPD)、肺氣腫及/或慢性肝臟疾病，例如慢性肝臟疾病、肝臟發炎、肝硬化、肝臟纖維化及/或肝細胞癌)。在一些實施例中，本文所述之寡核苷酸可用於治療與α-1抗胰蛋白酶突變相關之疾病、病症或疾患。降低α-1抗胰蛋白酶表現之寡核苷酸係描述於美國專利第9,458,457號(以引用之方式倂入本文中)中。
在一些態樣中，本發明提供一種用於降低α-1抗胰蛋白酶(A1AT)表現之寡核苷酸，該寡核苷酸包含15-30個核苷酸之反義鏈及15-50個核苷酸之有義鏈，其中該反義鏈包含選自SEQ ID No: 2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30及32之核苷酸序列，其中該有義鏈包含該反義鏈的互補區域，視情況其中該有義鏈包含選自SEQ ID No: 1、3、5、7、9、11、13、15、17、19、21、23、25、27、29及31之核苷酸序列。
在前述或相關態樣中之任一者中，有義鏈及反義鏈包含選自由以下組成之群的核苷酸序列： (a) 分別地，SEQ ID No: 1及2； (b) 分別地，SEQ ID No: 3及4； (c) 分別地，SEQ ID No: 5及6； (d) 分別地，SEQ ID No: 7及8； (e) 分別地，SEQ ID No: 9及10； (f) 分別地，SEQ ID No: 11及12； (g) 分別地，SEQ ID No: 13及14； (h) 分別地，SEQ ID No: 15及16； (i) 分別地，SEQ ID No: 17及18； (j) 分別地，SEQ ID No: 19及20； (k) 分別地，SEQ ID No: 21及22； (l) 分別地，SEQ ID No: 23及24； (m) 分別地，SEQ ID No: 25及26； (n) 分別地，SEQ ID No: 27及28； (o) 分別地，SEQ ID No: 29及30；及 (p) 分別地，SEQ ID No: 31及32。
在其他態樣中，本發明提供一種用於降低α-1抗胰蛋白酶(A1AT)表現之寡核苷酸，該寡核苷酸包含15-30個核苷酸之反義鏈及15-50個核苷酸之有義鏈，其中該反義鏈包含至少19個連續核苷酸，與以SEQ ID NO: 26陳述之核苷酸序列相差3個或更少核苷酸，且該有義鏈包含以SEQ ID NO: 25陳述之核苷酸序列。在其他態樣中，本發明提供一種用於降低α-1抗胰蛋白酶(A1AT)表現之寡核苷酸，該寡核苷酸包含15-30個核苷酸之反義鏈及15-50個核苷酸之有義鏈，其中該反義鏈包含至少19個連續核苷酸，與以SEQ ID NO: 26陳述之核苷酸序列相差3個或更少核苷酸，且該有義鏈包含以SEQ ID NO: 105陳述之核苷酸序列。
在前述或相關態樣中之任一者中，有義鏈及反義鏈形成雙鏈區域，其中該反義鏈為19至30個核苷酸長。在其他態樣中，該反義鏈包含至少19個連續核苷酸，與核苷酸序列SEQ ID NO: 26相差2個或更少核苷酸。
在前述或相關態樣中之任一者中，該寡核苷酸包含至少一個經修飾之核苷酸。在一些態樣中，該寡核苷酸之所有核苷酸均經修飾。在一些態樣中，經修飾之核苷酸包含2'-修飾。在一些態樣中，該2′-修飾係選自2′-氟修飾、2′-O-甲基修飾或兩者。
在前述或相關態樣中之任一者中，該反義鏈包含22個核苷酸且該有義鏈包含36個核苷酸，其中反義鏈及有義鏈係以5’至3’編號，且其中以下位置中之一或多者係經2′-O-甲基修飾：有義鏈之位置1、2、4、6、7、12、14、16、18-26或31-36及/或反義鏈之位置1、6、8、11-13、15、17或19-22。在其他態樣中，以下位置中之一或多者係經2′-氟修飾：有義鏈之位置3、5、8-11、13、15或17及/或反義鏈之位置2-5、7、9、10、14、16或18。在其他態樣中，以下位置中之一或多者係經2′-O-甲基修飾：有義鏈之位置1、2、4-7、11、14-16、18-26或31-36及/或反義鏈之位置1、4、6、8-11、13、15、17、18或20-22；且其中以下位置中之一或多者係經2′-氟修飾：有義鏈之位置3、8-10、12、13及17及/或反義鏈之位置2、3、5、7、12、14、16及19。在其他態樣中，以下位置中之一或多者係經2′-O-甲基修飾：有義鏈之位置1、2、4-7、11、14-16、18-26或31-36及/或反義鏈之位置1、4、6、8、9、11-13、15、18或20-22；且其中以下位置中之一或多者係經2′-氟修飾：有義鏈之位置3、8-10、12、13或17及/或反義鏈之位置2、3、5、7、10、14、16、17或19。
在前述或相關態樣中之任一者中，該寡核苷酸包含至少一個經修飾之核苷酸間鍵。在一些態樣中，至少一個經修飾之核苷酸間鍵為硫代磷酸酯鍵。在一些態樣中，該寡核苷酸在以下每一者之間具有硫代磷酸酯鍵：有義鏈之位置1及2、反義鏈之位置1及2、反義鏈之位置2及3、反義鏈之位置3及4、反義鏈之位置20及21以及反義鏈之位置21及22。
在前述或相關態樣中之任一者中，反義鏈之第一個位置處的尿苷包含磷酸酯類似物。在一些態樣中，該寡核苷酸包含在反義鏈之位置1處之以下結構：
Figure 02_image001
。
在前述或相關態樣中之任一者中，該寡核苷酸附接至一或多個N-乙醯基半乳糖胺(GalNAc)部分。
在前述或相關態樣中之任一者中，有義鏈包含如S1-L-S2所陳述之莖-環，其中S1與S2互補，其中L在S1與S2之間形成3-5個核苷酸長之環。在一些態樣中，L為四環。在一些態樣中，該四環包含序列5’-GAAA’3’。在一些態樣中，有義鏈上之-GAAA-序列的一或多個核苷酸結合於單價GalNAc部分。在一些態樣中，該-GAAA-序列包含以下結構：
Figure 02_image003
， 其中： L表示一鍵、點擊化學手柄或1至20 (包括1及20)個連續共價鍵結之原子長之連接體，該連接體選自由以下組成之群：經取代及未經取代之伸烷基、經取代及未經取代之伸烯基、經取代及未經取代之伸炔基、經取代及未經取代之伸雜烷基、經取代及未經取代之伸雜烯基、經取代及未經取代之伸雜炔基及其組合；且X為O、S或N。在一些態樣中，L為縮醛連接體。在一些態樣中，其中X為O。
在其他態樣中，該-GAAA-序列包含以下結構：
Figure 02_image005
。
在其他態樣中，本發明提供一種用於降低α-1抗胰蛋白酶(A1AT)表現之寡核苷酸，該寡核苷酸包含15-30個核苷酸之反義鏈及15-50個核苷酸之有義鏈，其中該反義鏈包含選自SEQ ID No: 34、36、38、40、42、44、46、48、50、52、54、56、58、60、62、64、66、68、70、72、74、76、78、80、82、84、86、88、90、92、94、96、98、100、102及104之核苷酸序列，其中該有義鏈包含該反義鏈的互補區域，視情況其中該有義鏈包含選自SEQ ID No: 33、35、37、39、41、43、45、47、49、51、53、55、57、59、61、63、65、67、69、71、73、75、77、79、81、83、85、87、89、91、93、95、97、99、101及103之核苷酸序列。
在前述或相關態樣中之任一者中，有義鏈及反義鏈包含選自由以下組成之群的核苷酸序列： (a) 分別地，SEQ ID No: 33及34； (b) 分別地，SEQ ID No: 35及36； (c) 分別地，SEQ ID No: 37及38； (d) 分別地，SEQ ID No: 39及40； (e) 分別地，SEQ ID No: 41及42； (f) 分別地，SEQ ID No: 43及44； (g) 分別地，SEQ ID No: 45及46； (h) 分別地，SEQ ID No: 47及48； (i) 分別地，SEQ ID No: 49及50； (j) 分別地，SEQ ID No: 51及52； (k) 分別地，SEQ ID No: 53及54； (l) 分別地，SEQ ID No: 55及56； (m) 分別地，SEQ ID No: 57及58； (n) _分別地，SEQ ID No: 59及60； (o) 分別地，SEQ ID No: 61及62； (p) 分別地，SEQ ID No: 63及64； (q) 分別地，SEQ ID No: 65及66； (r) 分別地，SEQ ID No: 67及68； (s) 分別地，SEQ ID No: 69及70； (t) 分別地，SEQ ID No: 71及72； (u) 分別地，SEQ ID No: 73及74； (v) 分別地，SEQ ID No: 75及76； (w) 分別地，SEQ ID No: 77及78； (x) 分別地，SEQ ID No: 79及80； (y) 分別地，SEQ ID No: 81及82； (z) 分別地，SEQ ID No: 83及84； (aa) 分別地，SEQ ID No: 85及86； (bb) 分別地，SEQ ID No: 87及88； (cc) 分別地，SEQ ID No: 89及90； (dd) 分別地，SEQ ID No: 91及92； (ee) 分別地，SEQ ID No: 93及94； (ff) 分別地，SEQ ID No: 95及96； (gg) 分別地，SEQ ID No: 97及98； (hh) 分別地，SEQ ID No: 99及100； (ii) 分別地，SEQ ID No: 101及102；及 (jj) 分別地，SEQ ID No: 103及104。
在其他態樣中，本發明提供一種用於降低A1AT表現之寡核苷酸，該寡核苷酸包含具有如SEQ ID NO: 26所陳述之序列的反義鏈及具有如SEQ ID NO: 105所陳述之序列的有義鏈， 其中有義鏈之位置1、2、4-7、11、14-16、18-26或31-36及反義鏈之位置1、4、6、8-11、13、15、17、18或20-22均係經2′-O-甲基修飾，且有義鏈之位置3、8-10、12、13及17及反義鏈之位置2、3、5、7、12、14、16及19均係經2′-氟修飾； 其中該寡核苷酸在以下每一者之間具有硫代磷酸酯鍵：有義鏈之位置1及2、反義鏈之位置1及2、反義鏈之位置2及3、反義鏈之位置3及4、反義鏈之位置20及21以及反義鏈之位置21及22； 其中該寡核苷酸包含在反義鏈之位置1處之以下結構：
Figure 02_image001
其中有義鏈上之-GAAA-序列的每一個核苷酸均結合於單價GalNAc部分，其中該-GAAA-序列包含以下結構：
Figure 02_image005
。
在其他態樣中，本發明提供一種用於降低A1AT表現之寡核苷酸，該寡核苷酸包含含有核苷酸序列SEQ ID NO: 103之有義鏈，及含有核苷酸序列SEQ ID NO: 104之反義鏈，該反義鏈包含 A1ATRNA轉錄物之互補區域，其中該寡核苷酸係呈具有以下結構之結合物形式：
Figure 02_image009
在其他態樣中，本發明提供一種包含本文所述之寡核苷酸之組合物。在一些態樣中，該組合物包含Na +相對離子。在其他態樣中，本發明提供一種包含本文所述之寡核苷酸及醫藥學上可接受之載劑或稀釋劑的組合物。
在其他態樣中，本發明提供一種用於抑制α1抗胰蛋白酶(A1AT)表現之雙鏈核糖核酸(dsRNA)劑，其中該dsRNA包含形成雙鏈區域之有義鏈及反義鏈，其中該反義鏈包含至少15個連續核苷酸，與核苷酸序列SEQ ID NO: 26相差4個或更少核苷酸，其中該反義鏈為19至35個核苷酸長。在一些態樣中，該雙鏈區域之所有核苷酸均為經修飾之核苷酸，且其中該等經修飾之核苷酸係選自由2'-O-甲基修飾之核苷酸及2'-氟修飾之核苷酸組成之群；且其中該dsRNA附接至一或多個N-乙醯基半乳糖胺(GalNAc)部分。在一些態樣中，該反義鏈為19至30個核苷酸長，且該有義鏈係在32與80個核苷酸長之間且包含四環。在一些態樣中，該有義鏈包含以SEQ ID NO: 25陳述之核苷酸序列。在一些態樣中，該有義鏈包含以SEQ ID NO: 105陳述之核苷酸序列。在一些態樣中，該反義鏈包含以SEQ ID NO: 104陳述之序列，且該有義鏈包含以SEQ ID NO: 103陳述之序列。
在其他態樣中，本發明提供一種包含本文所述之dsRNA劑之組合物。在一些態樣中，該組合物包含Na +相對離子。在其他態樣中，該組合物包含醫藥學上可接受之載劑或稀釋劑。
在一些態樣中，本發明提供一種將寡核苷酸遞送至個體之方法，該方法包括投與本文所述之寡核苷酸、dsRNA劑或組合物。在一些態樣中，遞送該寡核苷酸、組合物或dsRNA劑以治療或預防該個體之肝臟疾病或病症，其中該肝臟疾病或病症係選自由慢性肝臟疾病、肝臟發炎、肝硬化、肝臟纖維化及肝細胞癌組成之群。在一些態樣中，該個體為人類。在一些態樣中，經靜脈內或皮下將該寡核苷酸、組合物或dsRNA劑投與至個體。
在其他態樣中，本發明提供一種用於降低哺乳動物中之標靶α-1抗胰蛋白酶mRNA表現之方法，該方法包括投與本文所述之寡核苷酸、dsRNA劑或組合物，其量足以降低該哺乳動物中之標靶α-1抗胰蛋白酶mRNA表現。在一些態樣中，在脂質奈米粒子(LNP)中調配該寡核苷酸。
在前述或相關態樣中之任一者中，以選自由1微克至5毫克/公斤該哺乳動物/天、100微克至0.5毫克/公斤、0.001至0.25毫克/公斤、0.01至20微克/公斤、0.01至10微克/公斤、0.10至5微克/公斤及0.1至2.5微克/公斤組成之群之劑量投與該寡核苷酸或dsRNA劑。
在前述或相關態樣中之任一者中，在將該寡核苷酸、組合物或dsRNA劑投與至該哺乳動物之後至少3天，該哺乳動物之組織中的α-1抗胰蛋白酶mRNA水準降低達至少70%之量(以%表述)。在一些態樣中，該組織為肝臟組織。
在前述或相關態樣中之任一者中，該投與步驟包括選自由靜脈內注射、肌肉內注射、腹膜內注射、輸注、皮下注射、經皮、氣霧劑、直腸、陰道、表面、經口及吸入遞送組成之群之投與途徑。
在其他態樣中，本發明提供一種用於治療或預防動物之肝臟疾病或病症之方法，該方法包括向該個體投與足以治療或預防該個體之該肝臟疾病或病症之量的本文所述之寡核苷酸、dsRNA劑或組合物，其中該肝臟疾病或病症係選自由慢性肝臟疾病、肝臟發炎、肝硬化、COPD、肺氣腫肝臟纖維化及肝細胞癌組成之群。在一些態樣中，該動物為人類。
在其他態樣中，本發明提供一種套組，其包含本文所述之寡核苷酸、dsRNA劑或組合物，及關於降低有需要之個體的α-1抗胰蛋白酶表現之說明書。在一些態樣中，該個體具有肝臟疾病或病症。
在其他態樣中，本發明提供本文所述之寡核苷酸、dsRNA劑或組合物在製造用於降低有需要之個體的α-1抗胰蛋白酶表現之藥劑中之用途。在一些態樣中，該個體具有肝臟疾病或病症。
序列表
本申請案含有一個序列表，該序列表已呈ASCII格式以電子方式提交，且以引用之方式整體併入本文中。該ASCII複本創建於2021年11月22日，名為400930-030WO_(187028)_SL.txt，且大小為30,591位元組。
已將具有25至35個核苷酸之鏈長的雙鏈RNA (dsRNA)劑描述為哺乳動物細胞中之標靶基因表現之有效抑制劑(Rossi等人， 美國專利申請案第2005/0244858號及第US 2005/0277610號)。咸信此類長度之dsRNA劑由RNA干擾(RNAi)路徑之切丁酶加工，導致此類劑被稱作「切丁酶受質siRNA」(「DsiRNA」)劑。先前已描述DsiRNA劑之額外經修飾結構(Rossi等人， 美國專利申請案第2007/0265220號)。最近亦已描述切丁酶受質之有效延伸形式(Brown, 美國專利第8,349,809號、美國專利第10,370,655號及US 2010/0173974)。本文提供靶向α-1抗胰蛋白酶之經改良核酸劑。已特定地例示靶向α-1抗胰蛋白酶之彼等。
根據一些態樣，本發明提供降低肝臟中之α-1抗胰蛋白酶或 SERPINA1表現之寡核苷酸(例如，RNAi寡核苷酸)。在一些實施例中，本文所提供之寡核苷酸係經設計以治療與肝臟中之α-1抗胰蛋白酶表現相關之疾病。在一些態樣中，本發明提供藉由降低細胞(例如，肝臟細胞)中或器官(例如，肝臟)中之α-1抗胰蛋白酶表現來治療與α-1抗胰蛋白酶表現相關之疾病的方法。
在一些態樣中，本發明提供一種用於降低α-1抗胰蛋白酶(A1AT)表現之寡核苷酸，該寡核苷酸包含反義鏈及有義鏈，該等鏈分別具有自5’至3’如SEQ ID NO: 2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30及32以及SEQ ID NO: 1、3、5、7、9、11、13、15、17、19、21、23、25、27、29及31所陳述之序列。在某些實施例中，該寡核苷酸包含至少一個經修飾之核苷酸。在一些實施例中，該寡核苷酸之所有核苷酸均經修飾。在一些實施例中，經修飾之核苷酸包含2'-修飾。在一些實施例中，該2′-修飾為2′-氟或2′-O-甲基。
在一些態樣中，本發明提供一種用於降低α-1抗胰蛋白酶(A1AT)表現之寡核苷酸，該寡核苷酸包含具有自5’至3’以SEQ ID NO: 26陳述之序列的反義鏈及具有自5’至3’以SEQ ID NO: 25陳述之序列的有義鏈。在其他態樣中，本發明提供一種用於降低α-1抗胰蛋白酶(A1AT)表現之寡核苷酸，該寡核苷酸包含具有自5’至3’以SEQ ID NO: 26陳述之序列的反義鏈及具有自5’至3’以SEQ ID NO: 105陳述之序列的有義鏈。在某些實施例中，該寡核苷酸包含至少一個經修飾之核苷酸。在一些實施例中，該寡核苷酸之所有核苷酸均經修飾。在一些實施例中，經修飾之核苷酸包含2'-修飾。在一些實施例中，該2′-修飾為2′-氟或2′-O-甲基。
在一些實施例中，有義鏈包含以5’至3’編號之36個核苷酸，且反義鏈包含以5’至3’編號之22個核苷酸。在一些實施例中，以下位置處之一或多個核苷酸係經2′-O-甲基修飾：有義鏈之位置1、2、4、6、7、12、14、16、18-26或31-36及/或反義鏈之位置1、6、8、11-13、15、17或19-22。在一些實施例中，以下位置處之一或多個核苷酸係經2′-氟修飾：有義鏈之位置3、5、8-11、13、15或17及/或反義鏈之位置2-5、7、9、10、14、16或18。
在某些實施例中，以下位置處之一或多個核苷酸係經2′-O-甲基修飾：有義鏈之位置1、2、4、6、7、12、14、16、18-26或31-36及/或反義鏈之位置1-3、5、8、10-12、14、15、17、19或22。在一些實施例中，以下位置處之一或多個核苷酸係經2′-氟修飾：有義鏈之位置3、5、8-11、13、15或17及/或反義鏈之位置2-4、6、7、9、13、16、18、20或21。
在某些實施例中，以下位置處之一或多個核苷酸係經2′-O-甲基修飾：有義鏈之位置1、2、4-7、11、14-16、18-26或31-36及/或反義鏈之位置1、4、6、8、9、11-13、15、18或20-22。在一些實施例中，以下位置處之一或多個核苷酸係經2′-氟修飾：有義鏈之位置3、8-10、12、13或17及/或反義鏈之位置2、3、5、7、10、14、16、17或19。
在某些實施例中，以下位置處之一或多個核苷酸係經2′-O-甲基修飾：有義鏈之位置1、2、4-7、11、14-16、18-26或31-36及/或反義鏈之位置1、4、6、8-11、13、15、17、18或20-22。在一些實施例中，以下位置處之一或多個核苷酸係經2′-氟修飾：有義鏈之位置3、8-10、12、13或17及/或反義鏈之位置2、3、5、7、12、14、16或19。
在某些額外實施例中，以下位置處之一或多個核苷酸係經2′-O-甲基修飾：有義鏈之位置1-7及12-36及/或反義鏈之位置1、6、8-13及15-22。在一些實施例中，以下位置處之一或多個核苷酸係經2′-氟修飾：有義鏈之位置8-11及/或反義鏈之位置2-5、7及14。
在一些實施例中，以下位置處之一或多個核苷酸係經2′-O-甲基修飾：有義鏈之位置1、2、4-7、11、14-16、18-26或31-36及/或反義鏈之位置1、4、6、9、11、13、15、17、18或20-22。在一些實施例中，以下位置處之一或多個核苷酸係經2′-氟修飾：有義鏈之位置3、8-10、12、13及17及/或反義鏈之位置2、3、5、7、8、10、12、14、16及19
在某些實施例中，本發明提供一種用於降低α-1抗胰蛋白酶(A1AT)表現之寡核苷酸，該寡核苷酸包含反義鏈及有義鏈，該等鏈分別包含選自SEQ ID No: 34、36、38、40、42、44、46、48、50、52、54、56、58、60、62、64、66、68、70、72、74、76、78、80、82、84、86、88、90、92、94、96、98、100、102及104以及SEQ ID No: 33、35、37、39、41、43、45、47、49、51、53、55、57、59、61、63、65、67、69、71、73、75、77、79、81、83、85、87、89、91、93、95、97、99、101及103之序列。
在一些實施例中，本文所述之寡核苷酸包含至少一個經修飾之核苷酸間鍵。該至少一個經修飾之核苷酸間鍵為硫代磷酸酯鍵。
在一些實施例中，本文所述之寡核苷酸在以下每一者之間包含硫代磷酸酯鍵：有義鏈之位置1及2、反義鏈之位置1及2、反義鏈之位置2及3、反義鏈之位置3及4、反義鏈之位置20及21以及反義鏈之位置21及22。
在一些實施例中，反義鏈之第一個位置處的尿苷包含磷酸酯類似物。在某些實施例中，該寡核苷酸包含在反義鏈之位置1處之以下結構：
Figure 02_image001
。
在一些實施例中，本文所述之寡核苷酸包含含有如S1-L-S2所陳述之莖-環的有義鏈，其中S1與S2互補，其中L在S1與S2之間形成3-5個核苷酸長之環，且視情況其中L為四環。在一些實施例中，該四環包含序列5’ - GAAA - 3’。在一些實施例中，有義鏈上之-GAAA-序列的一或多個核苷酸結合於單價GalNAc部分。
在上文所揭示之實施例中之任一者中，該-GAAA-序列包含以下結構：
Figure 02_image003
， 其中： L表示一鍵、點擊化學手柄或1至20 (包括1及20)個連續共價鍵結之原子長之連接體，該連接體選自由以下組成之群：經取代及未經取代之伸烷基、經取代及未經取代之伸烯基、經取代及未經取代之伸炔基、經取代及未經取代之伸雜烷基、經取代及未經取代之伸雜烯基、經取代及未經取代之伸雜炔基及其組合；且 X為O、S或N。
在某些實施例中，L為縮醛連接體。在一些實施例中，X為O。
在一些實施例中，該-GAAA-序列包含以下結構：
Figure 02_image005
。
在一些態樣中，本發明提供一種包含本文所述之寡核苷酸及Na +相對離子之組合物。
在一些態樣中，本發明提供一種組合物，其具有如 圖 2A所描繪之化學結構。
在一些態樣中，本發明提供一種包含用於降低A1AT表現之寡核苷酸之組合物，該寡核苷酸包含具有以SEQ ID NO: 26陳述之序列的反義鏈及具有以SEQ ID NO: 105陳述之序列的有義鏈， 其中有義鏈之位置1、2、4-7、11、14-16、18-26或31-36及反義鏈之位置1、4、6、8-11、13、15、17、18或20-22均係經2′-O-甲基修飾，且有義鏈之位置3、8-10、12、13及17及反義鏈之位置2、3、5、7、12、14、16及19均係經2′-氟修飾； 其中該寡核苷酸在以下每一者之間具有硫代磷酸酯鍵：有義鏈之位置1及2、反義鏈之位置1及2、反義鏈之位置2及3、反義鏈之位置3及4、反義鏈之位置20及21以及反義鏈之位置21及22； 其中該寡核苷酸包含在反義鏈之位置1處之以下結構：
Figure 02_image001
其中有義鏈上之-GAAA-序列的每一個核苷酸均結合於單價GalNAc部分，該-GAAA-序列包含以下結構：
Figure 02_image005
；及醫藥學上可接受之載劑或稀釋劑。
在另一態樣中，本發明提供一種將寡核苷酸遞送至個體之方法，該方法包括向該個體投與本文所述之組合物或寡核苷酸。
在一些實施例中，遞送該寡核苷酸以治療或預防該個體之肝臟疾病或病症，其中該肝臟疾病或病症係選自由慢性肝臟疾病、肝臟發炎、肝硬化、肝臟纖維化及肝細胞癌組成之群。在某些實施例中，該個體為人類。在某些情況下，經靜脈內或皮下將該寡核苷酸或組合物投與至個體。
在一些態樣中，本發明提供一種用於降低A1AT表現之寡核苷酸，該寡核苷酸包含含有以SEQ ID NO: 26陳述之序列的反義鏈及含有以SEQ ID NO: 105陳述之序列的有義鏈， 其中有義鏈之位置1、2、4-7、11、14-16、18-26或31-36及反義鏈之位置1、4、6、8-11、13、15、17、18或20-22均係經2′-O-甲基修飾，且有義鏈之位置3、8-10、12、13及17及反義鏈之位置2、3、5、7、12、14、16及19均係經2′-氟修飾； 其中該寡核苷酸在以下每一者之間具有硫代磷酸酯鍵：有義鏈之位置1及2、反義鏈之位置1及2、反義鏈之位置2及3、反義鏈之位置3及4、反義鏈之位置20及21以及反義鏈之位置21及22； 其中該寡核苷酸包含在反義鏈之位置1處之以下結構：
Figure 02_image001
其中有義鏈上之-GAAA-序列的每一個核苷酸均結合於單價GalNAc部分，該-GAAA-序列包含以下結構：
Figure 02_image005
。
在另一態樣中，本發明提供一種用於降低A1AT表現之寡核苷酸，該寡核苷酸包含含有以SEQ ID NO: 26陳述之序列的反義鏈及含有以SEQ ID NO: 105陳述之序列的有義鏈， 其中有義鏈之位置1、2、4-7、11、14-16、18-26或31-36及/或反義鏈之位置1、4、6、8、9、11-13、15、18或20-22均係經2′-O-甲基修飾，且有義鏈之位置3、8-10、12、13或17及/或反義鏈之位置2、3、5、7、10、14、16、17或19均係經2′-氟修飾。 其中該寡核苷酸在以下每一者之間具有硫代磷酸酯鍵：有義鏈之位置1及2、反義鏈之位置1及2、反義鏈之位置2及3、反義鏈之位置3及4、反義鏈之位置20及21以及反義鏈之位置21及22； 其中該寡核苷酸包含在反義鏈之位置1處之以下結構：
Figure 02_image001
其中有義鏈上之-GAAA-序列的每一個核苷酸均結合於單價GalNAc部分，該-GAAA-序列包含以下結構：
Figure 02_image005
。
在某些實施例中，本發明提供一種包含本文所述之寡核苷酸之組合物。在一些實施例中，該組合物進一步包含Na +相對離子。
在某些實施例中，本發明提供一種用於降低哺乳動物中之標靶α-1抗胰蛋白酶mRNA表現之方法，該方法包括投與如本文所述，其量足以降低該哺乳動物中之標靶α-1抗胰蛋白酶mRNA表現。在某些實施例中，在脂質奈米粒子(LNP)中調配該寡核苷酸。在一些實施例中，以選自由1微克至5毫克/公斤該哺乳動物/天、100微克至0.5毫克/公斤、0.001至0.25毫克/公斤、0.01至20微克/公斤、0.10至10微克/公斤、0.01至5微克/公斤及0.1至2.5微克/公斤組成之群之劑量投與該寡核苷酸。
在一些實施例中，在將本文所述之寡核苷酸投與至該哺乳動物之後至少3天，該哺乳動物之組織中的α-1抗胰蛋白酶mRNA水準降低達至少70%之量(以%表述)。在一些實施例中，該組織為肝臟組織。
在某些實施例中，該投與步驟包括選自由靜脈內注射、肌肉內注射、腹膜內注射、輸注、皮下注射、經皮、氣霧劑、直腸、陰道、表面、經口及吸入遞送組成之群之投與模式。
在某些態樣中，本發明提供一種用於治療或預防個體之肝臟疾病或病症之方法，該方法包括向該個體投與一定量的本文所述之寡核苷酸或組合物，其量足以治療或預防該個體之該肝臟疾病或病症，其中該肝臟疾病或病症係選自由慢性肝臟疾病、肝臟發炎、肝硬化、肝臟纖維化及肝細胞癌組成之群。在某些實施例中，該個體為人類。 α-1 抗胰蛋白酶表現之寡核苷酸抑制劑 α -1 抗胰蛋白酶標靶序列
在一些實施例中，本文中之寡核苷酸(例如，RNAi寡核苷酸)靶向包含α-1抗胰蛋白酶mRNA之標靶序列。在一些實施例中，該寡核苷酸或其部分、片段或鏈(例如，雙鏈(ds) RNAi寡核苷酸之反義鏈或向導鏈)結合或黏著至包含α-1抗胰蛋白酶mRNA之標靶序列，由此抑制α-1抗胰蛋白酶表現。
在一些實施例中，該寡核苷酸靶向α-1抗胰蛋白酶標靶序列以達成抑制活體內α-1抗胰蛋白酶表現之目的。在一些實施例中，靶向α-1抗胰蛋白酶標靶序列之寡核苷酸抑制α-1抗胰蛋白酶表現之量或程度與該寡核苷酸之效能相關。在一些實施例中，靶向α-1抗胰蛋白酶標靶序列之寡核苷酸抑制α-1抗胰蛋白酶表現之量或程度與具有與α-1抗胰蛋白酶表現相關之疾病、病症或疾患的個體或患者在用該寡核苷酸治療時之治療益處之量或程度相關。
經由檢查編碼α-1抗胰蛋白酶之mRNA (包括多種不同物種(例如，人類、食蟹獼猴、小鼠及大鼠；參見例如實例2及3)之mRNA)的核苷酸序列且由於活體外及活體內測試(參見例如實例2-8)，已發現α-1抗胰蛋白酶mRNA之某些核苷酸序列比其他序列更易經受基於寡核苷酸之抑制作用且因此可用作本文中之寡核苷酸的標靶序列。在一些實施例中，本文所述之寡核苷酸(例如，RNAi寡核苷酸)的有義鏈包含α-1抗胰蛋白酶標靶序列。在一些實施例中，本文所述之寡核苷酸(例如，RNAi寡核苷酸)的有義鏈之一部分或一個區域包含α-1抗胰蛋白酶標靶序列。在一些實施例中，α-1抗胰蛋白酶標靶序列包含SEQ ID NO: 1、3、5、7、9、11、13、15、17、19、21、23、25、27、29及31中之任一者的序列，或由該序列組成。在一些實施例中，α-1抗胰蛋白酶標靶序列包含序列SEQ ID NO: 25，或由序列SEQ ID NO: 25組成。 α-1 抗胰蛋白酶靶向序列
在一些實施例中，本文中之寡核苷酸(例如，RNAi寡核苷酸)具有α-1抗胰蛋白酶mRNA之互補區域(例如，在α-1抗胰蛋白酶mRNA之標靶序列內)以達成靶向細胞中之α-1抗胰蛋白酶mRNA且抑制及/或降低α-1抗胰蛋白酶表現之目的。在一些實施例中，本文中之寡核苷酸包含α-1抗胰蛋白酶靶向序列(例如，dsRNAi寡核苷酸之反義鏈或向導鏈)，其具有藉由互補(Watson-Crick)鹼基配對結合或黏著至α-1抗胰蛋白酶標靶序列之互補區域。該靶向序列或互補區域一般具有合適長度及鹼基含量以使得該寡核苷酸(或其鏈)能夠結合或黏著至α-1抗胰蛋白酶mRNA，從而達成抑制及/或降低α-1抗胰蛋白酶表現之目的。在一些實施例中，該靶向序列或互補區域係至少約12個、至少約13個、至少約14個、至少約15個、至少約16個、至少約17個、至少約18個、至少約19個、至少約20個、至少約21個、至少約22個、至少約23個、至少約24個、至少約25個、至少約26個、至少約27個、至少約28個、至少約29個或至少約30個核苷酸長。在一些實施例中，該靶向序列或互補區域係約12個至約30個(例如，12個至30個、12個至22個、15個至25個、17個至21個、18個至27個、19個至27個或15個至30個)核苷酸長。在一些實施例中，該靶向序列或互補區域係約12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29或30個核苷酸長。在一些實施例中，該靶向序列或互補區域為18個核苷酸長。在一些實施例中，該靶向序列或互補區域為19個核苷酸長。在一些實施例中，該靶向序列或互補區域為20個核苷酸長。在一些實施例中，該靶向序列或互補區域為21個核苷酸長。在一些實施例中，該靶向序列或互補區域為22個核苷酸長。在一些實施例中，該靶向序列或互補區域為23個核苷酸長。在一些實施例中，該靶向序列或互補區域為24個核苷酸長。在一些實施例中，寡核苷酸包含與SEQ ID NO: 1、3、5、7、9、11、13、15、17、19、21、23、25、27、29及31中之任一者的序列互補之標靶序列或互補區域，且該靶向序列或互補區域為18個核苷酸長。在一些實施例中，寡核苷酸包含與SEQ ID NO: 1、3、5、7、9、11、13、15、17、19、21、23、25、27、29及31中之任一者的序列互補之標靶序列或互補區域，且該靶向序列或互補區域為19個核苷酸長。在一些實施例中，寡核苷酸包含與SEQ ID NO: 1、3、5、7、9、11、13、15、17、19、21、23、25、27、29及31中之任一者的序列互補之標靶序列或互補區域，且該靶向序列或互補區域為20個核苷酸長。在一些實施例中，寡核苷酸包含與SEQ ID NO: 1、3、5、7、9、11、13、15、17、19、21、23、25、27、29及31中之任一者的序列互補之標靶序列或互補區域，且該靶向序列或互補區域為21個核苷酸長。在一些實施例中，寡核苷酸包含與SEQ ID NO: 1、3、5、7、9、11、13、15、17、19、21、23、25、27、29及31中之任一者的序列互補之標靶序列或互補區域，且該靶向序列或互補區域為22個核苷酸長。
在一些實施例中，本文中之寡核苷酸(例如，RNAi寡核苷酸)包含與α-1抗胰蛋白酶標靶序列完全互補之靶向序列或互補區域(例如，雙鏈寡核苷酸之反義鏈或向導鏈)。在一些實施例中，該靶向序列或互補區域與α-1抗胰蛋白酶標靶序列部分地互補。在一些實施例中，該寡核苷酸包含與α-1抗胰蛋白酶序列完全互補之靶向序列或互補區域。在一些實施例中，該寡核苷酸包含與α-1抗胰蛋白酶序列部分地互補之靶向序列或互補區域。
在一些實施例中，該寡核苷酸包含與SEQ ID NO: 1、3、5、7、9、11、13、15、17、19、21、23、25、27、29及31中之任一者的序列完全互補之靶向序列或互補區域。在一些實施例中，該寡核苷酸包含與以SEQ ID NO: 25陳述之序列完全互補之靶向序列或互補區域。在一些實施例中，該寡核苷酸包含與SEQ ID NO: 1、3、5、7、9、11、13、15、17、19、21、23、25、27、29及31中之任一者的序列部分地互補之靶向序列或互補區域。在一些實施例中，該寡核苷酸包含與以SEQ ID NO: 25陳述之序列部分地互補之靶向序列或互補區域。
在一些實施例中，本文中之寡核苷酸(例如，RNAi寡核苷酸)包含與包含α-1抗胰蛋白酶mRNA之鄰接核苷酸序列互補的靶向序列或互補區域，其中該鄰接核苷酸序列係約12個至約30個核苷酸長(例如，12個至30個、12個至28個、12個至26個、12個至24個、12個至20個、12個至18個、12個至16個、14個至22個、16個至20個、18個至20個或18個至19個核苷酸長)。在一些實施例中，該寡核苷酸包含與包含α-1抗胰蛋白酶mRNA之鄰接核苷酸序列互補的靶向序列或互補區域，其中該鄰接核苷酸序列係10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20個核苷酸長。在一些實施例中，該寡核苷酸包含與包含α-1抗胰蛋白酶mRNA之鄰接核苷酸序列互補的靶向序列或互補區域，其中該鄰接核苷酸序列為19個核苷酸長。在一些實施例中，該寡核苷酸包含與包含α-1抗胰蛋白酶mRNA之鄰接核苷酸序列互補的靶向序列或互補區域，其中該鄰接核苷酸序列為20個核苷酸長。
在一些實施例中，本文中之寡核苷酸(例如，RNAi寡核苷酸)包含與鄰接核苷酸序列互補之靶向序列或互補區域，其中該靶向區域或互補區域係選自SEQ ID NO: 1、3、5、7、9、11、13、15、17、19、21、23、25、27、29及31，視情況其中該鄰接核苷酸序列為19個核苷酸長。在一些實施例中，該寡核苷酸包含與鄰接核苷酸序列互補之靶向序列或互補區域，其中該靶向區域或互補區域係選自SEQ ID NO: 1、3、5、7、9、11、13、15、17、19、21、23、25、27、29及31，其中該鄰接核苷酸序列為19個核苷酸長。在一些實施例中，該寡核苷酸包含與鄰接核苷酸序列互補之靶向序列或互補區域，其中該靶向區域或互補區域係選自SEQ ID NO: 1、3、5、7、9、11、13、15、17、19、21、23、25、27、29及31，其中該鄰接核苷酸序列為20個核苷酸長。
在一些實施例中，本文中之寡核苷酸(例如，RNAi寡核苷酸)之靶向序列或互補區域與鄰接核苷酸序列互補，其中該靶向區域或互補區域係選自SEQ ID NO: 1、3、5、7、9、11、13、15、17、19、21、23、25、27、29及31且跨越反義鏈之整個長度。在一些實施例中，該寡核苷酸之靶向序列或互補區域與鄰接核苷酸序列互補，其中該靶向區域或互補區域係選自SEQ ID NO: 1、3、5、7、9、11、13、15、17、19、21、23、25、27、29及31且跨越反義鏈之整個長度的一部分。在一些實施例中，本文中之寡核苷酸(例如，RNAi寡核苷酸)包含互補區域(例如，在dsRNA之反義鏈上)，該互補區域與跨越如SEQ ID NO: 1、3、5、7、9、11、13、15、17、19、21、23、25、27、29及31中之任一者所陳述的序列之核苷酸1-20之鄰接核苷酸段至少部分地(例如，完全)互補。
在一些實施例中，本文中之寡核苷酸(例如，RNAi寡核苷酸)包含與相應α-1抗胰蛋白酶標靶序列具有一或多個鹼基對(bp)錯配之靶向序列或互補區域。在一些實施例中，該靶向序列或互補區域可與相應α-1抗胰蛋白酶標靶序列具有多達約1個、多達約2個、多達約3個、多達約4個、多達約5個等錯配，其限制條件在於該靶向序列或互補區域在適當雜交條件下結合或黏著至α-1抗胰蛋白酶mRNA之能力及/或該寡核苷酸抑制α-1抗胰蛋白酶表現之能力得以維持。或者，該靶向序列或互補區域可與相應α-1抗胰蛋白酶標靶序列具有僅1個、僅2個、僅3個、僅4個或僅5個錯配，其限制條件在於該靶向序列或互補區域在適當雜交條件下結合或黏著至α-1抗胰蛋白酶mRNA之能力及/或該寡核苷酸抑制α-1抗胰蛋白酶表現之能力得以維持。在一些實施例中，該寡核苷酸包含與相應標靶序列具有1個錯配之靶向序列或互補區域。在一些實施例中，該寡核苷酸包含與相應標靶序列具有2個錯配之靶向序列或互補區域。在一些實施例中，該寡核苷酸包含與相應標靶序列具有3個錯配之靶向序列或互補區域。在一些實施例中，該寡核苷酸包含與相應標靶序列具有4個錯配之靶向序列或互補區域。在一些實施例中，該寡核苷酸包含與相應標靶序列具有5個錯配之靶向序列或互補區域。在一些實施例中，該寡核苷酸包含與相應標靶序列具有超過一個錯配(例如，2、3、4、5個或更多個錯配)之靶向序列或互補區域，其中該等錯配中之至少2者(例如，全部)係連續地定位(例如，一列中2、3、4、5個或更多個錯配)，或其中該等錯配散佈於整個靶向序列或互補區域中。在一些實施例中，該寡核苷酸包含與相應標靶序列具有超過一個錯配(例如，2、3、4、5個或更多個錯配)之靶向序列或互補區域，其中該等錯配中之至少2者(例如，全部)係連續地定位(例如，一列中2、3、4、5個或更多個錯配)，或其中至少一或多個非錯配鹼基對位於該等錯配之間，或其組合。在一些實施例中，該寡核苷酸包含與鄰接核苷酸序列互補之靶向序列或互補區域，其中該靶向區域或互補區域係選自SEQ ID NO: 1、3、5、7、9、11、13、15、17、19、21、23、25、27、29及31，其中該靶向序列或互補區域可與相應α-1抗胰蛋白酶標靶序列具有多達約1個、多達約2個、多達約3個、多達約4個、多達約5個等錯配。在一些實施例中，該寡核苷酸包含與鄰接核苷酸序列互補之靶向序列或互補區域，其中該靶向區域或互補區域係選自SEQ ID NO: 1、3、5、7、9、11、13、15、17、19、21、23、25、27、29及31，其中該靶向序列或互補區域可與相應α-1抗胰蛋白酶標靶序列具有僅1個、僅2個、僅3個、僅4個或僅5個錯配。在一些實施例中，該寡核苷酸包含與鄰接核苷酸序列互補之靶向序列或互補區域，其中該靶向區域或互補區域係選自SEQ ID NO: 1、3、5、7、9、11、13、15、17、19、21、23、25、27、29及31，其中該靶向序列或互補區域可與相應α-1抗胰蛋白酶標靶序列具有多達約1個、多達約2個、多達約3個、多達約4個、多達約5個等錯配。在一些實施例中，該寡核苷酸包含與鄰接核苷酸序列互補之靶向序列或互補區域，其中該靶向區域或互補區域係選自SEQ ID NO: 1、3、5、7、9、11、13、15、17、19、21、23、25、27、29及31，其中該靶向序列或互補區域可與相應α-1抗胰蛋白酶標靶序列具有僅1個、僅2個、僅3個、僅4個或僅5個錯配。 寡核苷酸之類型
多種寡核苷酸類型及/或結構可用於在本文中之方法中靶向α-1抗胰蛋白酶，包括但不限於RNAi寡核苷酸、反義寡核苷酸(ASO)、miRNA等。考慮將本文中或別處所述之任何寡核苷酸類型用作併入本文中之α-1抗胰蛋白酶靶向序列之框架，以達成抑制α-1抗胰蛋白酶表現之目的。
在一些實施例中，本文中之寡核苷酸藉由在切丁酶涉入之上游或下游參與RNA干擾(RNAi)路徑而抑制α-1抗胰蛋白酶表現。舉例而言，已開發RNAi寡核苷酸，其中各鏈具有約19-25個核苷酸之大小及至少一個1至5個核苷酸之3'懸垂物(參見例如美國專利第8,372,968號)。亦已開發更長之寡核苷酸，其由切丁酶加工以產生活性RNAi產物(參見例如美國專利第8,883,996號)。進一步工作產生延伸之dsRNA，其中至少一條鏈之至少一端延伸超出雙鏈體靶向區域，包括其中一條鏈包括熱力學穩定之四環結構的結構(參見例如美國專利第8,513,207號及第8,927,705號，以及國際專利申請公開案第WO 2010/033225號)。此類結構可包括單鏈(ss)延伸(在該分子之一側或兩側)以及雙鏈(ds)延伸。
在一些實施例中，本文中之寡核苷酸在切丁酶涉入(例如，切丁酶裂解)之下游參與RNAi路徑。在一些實施例中，該寡核苷酸在有義鏈之3′端具有懸垂物(例如，1、2或3個核苷酸長)。在一些實施例中，該寡核苷酸(例如，siRNA)包含與標靶RNA反義之21個核苷酸之向導鏈及互補過客鏈，其中兩條鏈黏著形成19-bp雙鏈體及在任一或兩個3'端的2個核苷酸之懸垂物。亦可用更長之寡核苷酸設計，包括具有23個核苷酸之向導鏈及21個核苷酸之過客鏈的寡核苷酸，其中在該分子之右側存在鈍端(過客鏈之3′端/向導鏈之5′端)且在該分子之左側存在兩個核苷酸之3′-向導鏈懸垂物(過客鏈之5′端/向導鏈之3′端)。在此類分子中，存在21 bp雙鏈體區域。參見例如美國專利第9,012,138號；第9,012,621號及第9,193,753號。
在一些實施例中，本文中之寡核苷酸包含有義鏈及反義鏈，該等鏈均在約17個至36個(例如，17個至36個、20個至25個或21-23個)核苷酸長之範圍內。在一些實施例中，本文中之寡核苷酸包含有義鏈及反義鏈，該等鏈均在約19-22個核苷酸長之範圍內。在一些實施例中，有義鏈及反義鏈具有相等長度。在一些實施例中，寡核苷酸包含有義鏈及反義鏈，使得在有義鏈或反義鏈上或者在有義鏈及反義鏈兩者上存在3′-懸垂物。在一些實施例中，對於具有均在約21-23個核苷酸長之範圍內的有義鏈及反義鏈之寡核苷酸，在有義鏈、反義鏈或有義鏈及反義鏈兩者上之3′懸垂物為1或2個核苷酸長。在一些實施例中，該寡核苷酸具有22個核苷酸之向導鏈及20個核苷酸之過客鏈，其中在該分子之右側存在鈍端(過客鏈之3′端/向導鏈之5′端)且在該分子之左側存在2個核苷酸之3′-向導鏈懸垂物(過客鏈之5′端/向導鏈之3′端)。在此類分子中，存在20 bp雙鏈體區域。
用於本文中之組合物及方法之其他寡核苷酸設計包括：16聚體siRNA (參見例如Nucleic Acids in Chemistry and Biology. Blackburn (編), Royal Society of Chemistry, 2006)、shRNA (例如，具有19 bp或更短的莖；參見例如Moore等人 (2010) Methods Mol. Biol .629:141-158)、鈍siRNA (例如，19 bp長；參見例如Kraynack及Baker (2006) RNA 12:163-176)、不對稱siRNA (aiRNA；參見例如Sun等人 (2008) Nat. Biotechnol .26:1379-1382)、不對稱較短雙鏈體siRNA (參見例如Chang等人 (2009) Mol. Ther .17:725-32)、叉形siRNA (參見例如Hohjoh (2004) FEBS Lett .557:193-198)、ss siRNA (Elsner (2012) Nat. Biotechnol .30:1063)、啞鈴形環狀siRNA (參見例如Abe等人 (2007) J. Am. Chem. Soc .129:15108-09)及小內部分段干擾RNA (siRNA；參見例如Bramsen等人 (2007) Nucleic Acids Res .35:5886-97)。在一些實施例中可用於降低或抑制α-1抗胰蛋白酶表現之寡核苷酸結構的其他非限制性實例為微小RNA (miRNA)、短髮夾RNA (shRNA)及短siRNA (參見例如Hamilton等人 (2002) EMBO J .21:4671-79；亦參見美國專利申請公開案第2009/0099115號)。
另外，在一些實施例中，本文中用於降低或抑制α-1抗胰蛋白酶表現之寡核苷酸為單鏈(ss)。此類結構可包括但不限於單鏈RNAi分子。最近之努力已證明ss RNAi分子之活性(參見例如Matsui等人 (2016) Mol. Ther. 24:946-55)。然而，在一些實施例中，本文中之寡核苷酸為反義寡核苷酸(ASO)。反義寡核苷酸係具有核鹼基序列之單鏈寡核苷酸，當以5'至3'方向書寫時，該核鹼基序列包含特定核酸之靶向區段的反向補體且經適當修飾(例如，作為間聚體)以誘導細胞中RNaseH介導之其標靶RNA之裂解，或(例如，作為混聚體)以便抑制細胞中標靶mRNA之轉譯。用於本文中之ASO可以此項技術中已知之任何合適方式進行修飾，包括例如美國專利第9,567,587號中所示(包括例如長度、核鹼基(嘧啶、嘌呤)之糖部分及核鹼基之雜環部分的改變)。此外，數十年來，ASO已用於降低特定標靶基因之表現(參見例如Bennett等人 (2017) Annu. Rev. Pharmacol. 57:81-105)。
在一些實施例中，該反義寡核苷酸與α-1抗胰蛋白酶mRNA共享互補區域。在一些實施例中，該反義寡核苷酸靶向SEQ ID NO: 1、3、5、7、9、11、13、15、17、19、21、23、25、27、29或31。在一些實施例中，該反義寡核苷酸為15-50個核苷酸長。在一些實施例中，該反義寡核苷酸為15-25個核苷酸長。在一些實施例中，該反義寡核苷酸為22個核苷酸長。在一些實施例中，該反義寡核苷酸與SEQ ID NO: 1、3、5、7、9、11、13、15、17、19、21、23、25、27、29或31中之任一者互補。在一些實施例中，該反義寡核苷酸係至少15個鄰接核苷酸長。在一些實施例中，該反義寡核苷酸係至少19個鄰接核苷酸長。在一些實施例中，該反義寡核苷酸係至少20個鄰接核苷酸長。在一些實施例中，該反義寡核苷酸與標靶序列相差1、2或3個核苷酸。 單鏈寡核苷酸
在一些態樣中，本發明提供用於靶向α-1抗胰蛋白酶mRNA且抑制α-1抗胰蛋白酶表現(例如，經由RNAi路徑)之雙鏈(ds) RNAi寡核苷酸，其包含有義鏈(本文中亦稱作過客鏈)及反義鏈(本文中亦稱作向導鏈)。在一些實施例中，有義鏈及反義鏈係分開之鏈且未共價連接。在一些實施例中，有義鏈及反義鏈係共價連接的。在一些實施例中，有義鏈及反義鏈形成雙鏈體區域，其中有義鏈及反義鏈或其部分以互補方式(例如，藉由Watson-Crick鹼基配對)彼此結合。
在一些實施例中，有義鏈具有第一區(R1)及第二區(R2)，其中R2包含第一亞區(S1)、四環(L)或三環(triL)及第二亞區(S2)，其中L或triL位於S1與S2之間，且其中S1及S2形成第二雙鏈體(D2)。D2可具有不同長度。在一些實施例中，D2係約1-6 bp長。在一些實施例中，D2係2-6、3-6、4-6、5-6、1-5、2-5、3-5或4-5 bp長。在一些實施例中，D2係1、2、3、4、5或6 bp長。在一些實施例中，D2係6 bp長。
在一些實施例中，有義鏈及反義鏈之R1形成第一雙鏈體(D1)。在一些實施例中，D1係至少約15個(例如，至少15個、至少16個、至少17個、至少18個、至少19個、至少20個或至少21個)核苷酸長。在一些實施例中，D1係在約12個至30個核苷酸長之範圍內(例如，12個至30個、12個至27個、15個至22個、18個至22個、18個至25個、18個至27個、18個至30個或21個至30個核苷酸長)。在一些實施例中，D1係至少12個核苷酸長(例如，至少12個、至少15個、至少20個、至少25個或至少30個核苷酸長)。在一些實施例中，D1係12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29或30個核苷酸長。在一些實施例中，D1為20個核苷酸長。在一些實施例中，包含有義鏈及反義鏈之D1未跨越有義鏈及/或反義鏈之整個長度。在一些實施例中，包含有義鏈及反義鏈之D1跨越有義鏈或反義鏈或兩者之整個長度。在一些實施例中，包含有義鏈及反義鏈之D1跨越有義鏈及反義鏈兩者之整個長度。
在一些實施例中，本文所提供之寡核苷酸(例如，RNAi寡核苷酸)包含具有SEQ ID NO: 1、3、5、7、9、11、13、15、17、19、21、23、25、27、29或31中之任一者的序列之有義鏈，及包含選自SEQ ID NO: 2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、24、26、28、30或32之互補序列之反義鏈，如 表 1中所安排。
在一些實施例中，本文所提供之寡核苷酸(例如，RNAi寡核苷酸)包含有義鏈及反義鏈，該等鏈包含選自以下之核苷酸序列： (a) 分別地，SEQ ID NO: 25及26； (b) 分別地，SEQ ID NO: 27及28； (c) 分別地，SEQ ID NO: 29及30； (d) 分別地，SEQ ID NO: 31及32； (e) 分別地，SEQ ID NO: 97及98； (f) 分別地，SEQ ID NO: 99及100； (g) 分別地，SEQ ID NO: 101及102；及 (h) 分別地，SEQ ID NO: 103及104。
在一些實施例中，該有義鏈包含序列SEQ ID NO: 31且該反義鏈包含序列SEQ ID NO: 32。在一些實施例中，該有義鏈包含序列SEQ ID NO: 25且該反義鏈包含序列SEQ ID NO: 26。在一些實施例中，該有義鏈包含序列SEQ ID NO: 25且該反義鏈包含序列SEQ ID NO: 105。
應理解，在一些實施例中，在描述寡核苷酸(例如，dsRNAi寡核苷酸)或其他核酸之結構時可參考序列表中呈遞之序列。在此類實施例中，當與指定序列相比時，實際寡核苷酸或其他核酸可具有一或多個替代核苷酸(例如，DNA核苷酸之RNA配對物或RNA核苷酸之DNA配對物)及/或一或多個經修飾之核苷酸及/或一或多個經修飾之核苷酸間鍵及/或一或多個其他修飾，同時保留與該指定序列基本上相同或相似之互補特性。
在一些實施例中，本文中之寡核苷酸(例如，RNAi寡核苷酸)包含25個核苷酸之有義鏈及27個核苷酸之反義鏈，當由切丁酶作用時，該寡核苷酸產生併入至成熟RISC中之反義鏈。在一些實施例中，該寡核苷酸之有義鏈長於27個核苷酸(例如，28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49或50個核苷酸)。在一些實施例中，該寡核苷酸之有義鏈長於25個核苷酸(例如，26、27、28、29或30個核苷酸)。在一些實施例中，該寡核苷酸之有義鏈包含選自SEQ ID NO: 1、3、5、7、9、11、13、15、17、19、21、23、25、27、29或31之核苷酸序列，其中該核苷酸序列長於27個核苷酸(例如，28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49或50個核苷酸)。在一些實施例中，該寡核苷酸之有義鏈包含選自SEQ ID NO: 1、3、5、7、9、11、13、15、17、19、21、23、25、27、29或31之核苷酸序列，其中該核苷酸序列長於25個核苷酸(例如，26、27、28、29或30個核苷酸)。
在一些實施例中，本文中之寡核苷酸(例如，RNAi寡核苷酸)具有一個5'端，當與另一5'端相比時，該5'端在熱力學上不太穩定。在一些實施例中，提供不對稱寡核苷酸，其包括在有義鏈之3'端的鈍端及在反義鏈之3'端的3′-懸垂物。在一些實施例中，反義鏈上之3′-懸垂物係約1-8個核苷酸長(例如，1、2、3、4、5、6、7或8個核苷酸長)。在一些實施例中，該寡核苷酸在反義(向導)鏈之3′端具有包含兩(2)個核苷酸之懸垂物。然而，可能存在其他懸垂物。在一些實施例中，懸垂物為3′-懸垂物，其包含1與6個核苷酸之間的長度，視情況為1至5、1至4、1至3、1至2、2至6、2至5、2至4、2至3、3至6、3至5、3至4、4至6、4至5、5至6個核苷酸，或1、2、3、4、5或6個核苷酸。然而，在一些實施例中，該懸垂物為5′-懸垂物，其包含1與6個核苷酸之間的長度，視情況為1至5、1至4、1至3、1至2、2至6、2至5、2至4、2至3、3至6、3至5、3至4、4至6、4至5、5至6個核苷酸，或1、2、3、4、5或6個核苷酸。在一些實施例中，該寡核苷酸包含含有選自SEQ ID NO: 1、3、5、7、9、11、13、15、17、19、21、23、25、27、29或31之核苷酸序列的有義鏈，其中該寡核苷酸包含5′-懸垂物，該懸垂物包含1與6個核苷酸之間的長度。在一些實施例中，該寡核苷酸包含含有選自SEQ ID NO: 2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、24、26、28、30或32之核苷酸序列的反義鏈，其中該寡核苷酸包含5′-懸垂物，該懸垂物包含1與6個核苷酸之間的長度。在一些實施例中，該寡核苷酸包含含有選自SEQ ID NO: 1、3、5、7、9、11、13、15、17、19、21、23、25、27、29或31之核苷酸序列的有義鏈及含有選自SEQ ID NO: 2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、24、26、28、30或32之核苷酸序列的反義鏈，其中該寡核苷酸包含5′-懸垂物，該懸垂物包含1與6個核苷酸之間的長度。
在一些實施例中，反義鏈之3'端的兩(2)個末端核苷酸係經修飾。在一些實施例中，反義鏈之3′端的兩(2)個末端核苷酸與標靶mRNA (例如，α-1抗胰蛋白酶mRNA)互補。在一些實施例中，反義鏈之3′端的兩(2)個末端核苷酸不與標靶mRNA互補。在一些實施例中，本文中之寡核苷酸的反義鏈之3′端的兩(2)個末端核苷酸未配對。在一些實施例中，本文中之寡核苷酸的反義鏈之3′端的兩(2)個末端核苷酸包含未配對GG。在一些實施例中，本文中之寡核苷酸的反義鏈之3′端的兩(2)個末端核苷酸不與標靶mRNA互補。在一些實施例中，寡核苷酸之各3′端的兩(2)個末端核苷酸為GG。在一些實施例中，本文中之寡核苷酸之各3′端的一或兩(2)個末端GG核苷酸不與標靶mRNA互補。在一些實施例中，該寡核苷酸包含與鄰接核苷酸序列互補之靶向序列或互補區域，其中該靶向區域或互補區域係選自SEQ ID NO: 1、3、5、7、9、11、13、15、17、19、21、23、25、27、29或31，其中本文中之寡核苷酸的反義鏈之3′端的兩(2)個末端核苷酸包含未配對GG。在一些實施例中，該寡核苷酸包含含有選自SEQ ID NO: 2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、24、26、28、30或32之核苷酸序列的反義鏈，其中該寡核苷酸之反義鏈之3′端的兩(2)個末端核苷酸包含未配對GG。在一些實施例中，該寡核苷酸包含含有選自SEQ ID NO: 1、3、5、7、9、11、13、15、17、19、21、23、25、27、29或31之核苷酸序列的有義鏈及含有選自SEQ ID NO: 2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、24、26、28、30或32之核苷酸序列的反義鏈，其中該寡核苷酸之反義鏈之3′端的兩(2)個末端核苷酸包含未配對GG。
在一些實施例中，在構成本文中之寡核苷酸(例如，RNAi寡核苷酸)之有義鏈與反義鏈之間存在一或多個(例如，1、2、3、4或5個)錯配。若在有義鏈與反義鏈之間存在超過一個錯配，則其可連續地定位(例如，一列中2、3個或更多個)，或散佈於整個互補區域中。在一些實施例中，有義鏈之3'端包含一或多個錯配。在一些實施例中，在有義鏈之3'端併入兩(2)個錯配。在一些實施例中，本文中之寡核苷酸之有義鏈的3′端之區段之鹼基錯配或去穩定化改良或增加該寡核苷酸之效能。
在一些實施例中，本文中之寡核苷酸之有義鏈及反義鏈包含選自由以下組成之群的核苷酸序列： (a) 分別地，SEQ ID NO: 25及26； (b) 分別地，SEQ ID NO: 27及28； (c) 分別地，SEQ ID NO: 29及30； (d) 分別地，SEQ ID NO: 31及32； (e) 分別地，SEQ ID NO: 97及98； (f) 分別地，SEQ ID NO: 99及100； (g) 分別地，SEQ ID NO: 101及102；及 (h) 分別地，SEQ ID NO: 103及104； 其中在有義鏈與反義鏈之間存在一或多個(例如，1、2、3、4或5個)錯配。 反義鏈
在一些實施例中，本文中之寡核苷酸(例如，RNAi寡核苷酸)之反義鏈係稱作「向導鏈」。舉例而言，若反義鏈參與RNA誘導之沈默複合物(RISC)且結合至 Argonaute蛋白(諸如Ago2)，或者參與或結合至一或多種相似因子，且引導標靶基因之沈默，則該反義鏈係稱作向導鏈。在一些實施例中，包含向導鏈之互補區域之有義鏈在本文中稱作「過客鏈」。
在一些實施例中，本文中之寡核苷酸(例如，RNAi寡核苷酸)包含多達約50個核苷酸長(例如，多達50個、多達40個、多達35個、多達30個、多達27個、多達25個、多達21個、多達19個、多達17個或多達12個核苷酸長)之反義鏈。在一些實施例中，寡核苷酸包含至少約12個核苷酸長(例如，至少12個、至少15個、至少19個、至少21個、至少22個、至少25個、至少27個、至少30個、至少35個或至少38個核苷酸長)之反義鏈。在一些實施例中，寡核苷酸包含在約12個至約40個(例如，12個至40個、12個至36個、12個至32個、12個至28個、15個至40個、15個至36個、15個至32個、15個至28個、17個至22個、17個至25個、19個至27個、19個至30個、20個至40個、22個至40個、25個至40個或32個至40個)核苷酸長之範圍內的反義鏈。在一些實施例中，寡核苷酸包含15個至30個核苷酸長之反義鏈。在一些實施例中，本文所揭示之寡核苷酸中之任一者的反義鏈均為12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39或40個核苷酸長。在一些實施例中，寡核苷酸包含22個核苷酸長之反義鏈。
在一些實施例中，本文所揭示之用於靶向α-1抗胰蛋白酶之寡核苷酸(例如，RNAi寡核苷酸)包含反義鏈，該反義鏈包含如SEQ ID NO: 2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、24、26、28、30或32中之任一者所陳述之序列，或由該序列組成。在一些實施例中，本文中之寡核苷酸包含反義鏈，該反義鏈包含如SEQ ID NO: 2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、24、26、28、30或32中之任一者所陳述之序列的至少約12個(例如，至少12個、至少13個、至少14個、至少15個、至少16個、至少17個、至少18個、至少19個、至少20個、至少21個、至少22個或至少23個)鄰接核苷酸。在一些實施例中，本文所揭示之用於靶向α-1抗胰蛋白酶之寡核苷酸包含反義鏈，該反義鏈包含如SEQ ID NO: 2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、24、26、28、30或32中之任一者所陳述之序列，或由該序列組成。 在一些實施例中，本文中之寡核苷酸包含反義鏈，該反義鏈包含如SEQ ID NO: 2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、24、26、28、30或32中之任一者所陳述之序列的至少約12個(例如，至少12個、至少13個、至少14個、至少15個、至少16個、至少17個、至少18個、至少19個、至少20個、至少21個、至少22個或至少23個)鄰接核苷酸。在一些實施例中，本文所揭示之用於靶向α-1抗胰蛋白酶之寡核苷酸包含反義鏈，該反義鏈包含如SEQ ID NO: 2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、24、26、28、30或32中之任一者所陳述之序列，或由該序列組成。在一些實施例中，本文中之寡核苷酸包含反義鏈，該反義鏈包含如SEQ ID No: 2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、24、26、28、30或32中之任一者所陳述之序列的至少約12個(例如，至少12個、至少13個、至少14個、至少15個、至少16個、至少17個、至少18個、至少19個、至少20個、至少21個、至少22個或至少23個)鄰接核苷酸。 有義鏈
在一些實施例中，本文所揭示之用於靶向α-1抗胰蛋白酶mRNA且抑制α-1抗胰蛋白酶表現之寡核苷酸(例如，RNAi寡核苷酸)包含如SEQ ID NO: 1、3、5、7、9、11、13、15、17、19、21、23、25、27、29或31中之任一者所陳述之有義鏈序列。在一些實施例中，本文中之寡核苷酸具有有義鏈，該有義鏈包含如SEQ ID NO: 1、3、5、7、9、11、13、15、17、19、21、23、25、27、29或31中之任一者所陳述之序列的至少約12個(例如，至少13個、至少14個、至少15個、至少16個、至少17個、至少18個、至少19個、至少20個、至少21個、至少22個或至少23個)鄰接核苷酸。在一些實施例中，本文所揭示之用於靶向α-1抗胰蛋白酶mRNA且抑制α-1抗胰蛋白酶表現之寡核苷酸包含如SEQ ID NO: 1、3、5、7、9、11、13、15、17、19、21、23、25、27、29或31中之任一者所陳述之有義鏈序列。在一些實施例中，本文中之寡核苷酸具有有義鏈，該有義鏈包含如SEQ ID NO: 1、3、5、7、9、11、13、15、17、19、21、23、25、27、29或31中之任一者所陳述之序列的至少約12個(例如，至少13個、至少14個、至少15個、至少16個、至少17個、至少18個、至少19個、至少20個、至少21個、至少22個或至少23個)鄰接核苷酸。在一些實施例中，本文所揭示之用於靶向α-1抗胰蛋白酶mRNA且抑制α-1抗胰蛋白酶表現之寡核苷酸包含如SEQ ID NO: 1、3、5、7、9、11、13、15、17、19、21、23、25、27、29或31中之任一者所陳述之有義鏈序列。在一些實施例中，本文中之寡核苷酸具有有義鏈，該有義鏈包含如SEQ ID NO: 1、3、5、7、9、11、13、15、17、19、21、23、25、27、29或31中之任一者所陳述之序列的至少約12個(例如，至少13個、至少14個、至少15個、至少16個、至少17個、至少18個、至少19個、至少20個、至少21個、至少22個或至少23個)鄰接核苷酸
在一些實施例中，本文所提供之寡核苷酸(例如，RNAi寡核苷酸)包含多達約50個核苷酸長(例如，多達50個、多達40個、多達36個、多達30個、多達27個、多達25個、多達21個、多達19個、多達17個或多達12個核苷酸長)之有義鏈(或過客鏈)。在一些實施例中，本文中之寡核苷酸包含至少約12個核苷酸長(例如，至少12個、至少15個、至少19個、至少21個、至少25個、至少27個、至少30個、至少36個或至少38個核苷酸長)之有義鏈。在一些實施例中，本文中之寡核苷酸包含在約12個至約50個(例如，12個至50個、12個至40個、12個至36個、12個至32個、12個至28個、15個至40個、15個至36個、15個至32個、15個至28個、17個至21個、17個至25個、19個至27個、19個至30個、20個至40個、22個至40個、25個至40個或32個至40個)核苷酸長之範圍內的有義鏈。在一些實施例中，本文中之寡核苷酸包含15個至50個核苷酸長之有義鏈。在一些實施例中，本文中之寡核苷酸包含18個至36個核苷酸長之有義鏈。在一些實施例中，本文中之寡核苷酸包含12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49或50個核苷酸長之有義鏈。在一些實施例中，本文中之寡核苷酸包含36個核苷酸長之有義鏈。
在一些實施例中，本文所提供之寡核苷酸(例如，RNAi寡核苷酸)包含有義鏈，該有義鏈在該有義鏈之3′端包含莖-環結構。在一些實施例中，該莖-環係藉由鏈內鹼基配對形成的。在一些實施例中，有義鏈在其5'端包含莖-環結構。在一些實施例中，該莖-環之莖包含2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13或14個核苷酸長之雙鏈體。在一些實施例中，該莖-環之莖包含2個核苷酸長之雙鏈體。在一些實施例中，該莖-環之莖包含3個核苷酸長之雙鏈體。在一些實施例中，該莖-環之莖包含4個核苷酸長之雙鏈體。在一些實施例中，該莖-環之莖包含5個核苷酸長之雙鏈體。在一些實施例中，該莖-環之莖包含6個核苷酸長之雙鏈體。在一些實施例中，該莖-環之莖包含7個核苷酸長之雙鏈體。在一些實施例中，該莖-環之莖包含8個核苷酸長之雙鏈體。在一些實施例中，該莖-環之莖包含9個核苷酸長之雙鏈體。在一些實施例中，該莖-環之莖包含10個核苷酸長之雙鏈體。在一些實施例中，該莖-環之莖包含11個核苷酸長之雙鏈體。在一些實施例中，該莖-環之莖包含12個核苷酸長之雙鏈體。在一些實施例中，該莖-環之莖包含13個核苷酸長之雙鏈體。在一些實施例中，該莖-環之莖包含14個核苷酸長之雙鏈體。
在一些實施例中，莖-環對寡核苷酸提供抵抗降解(例如，酶促降解)之保護，促進或改良靶向及/或遞送至標靶細胞、組織或器官(例如，肝臟)，或兩者。例如，在一些實施例中，莖-環之環包含含有一或多種修飾之核苷酸，該一或多種修飾促進、改良或增加靶向至標靶mRNA (例如，α-1抗胰蛋白酶mRNA)、抑制標靶基因表現(例如，α-1抗胰蛋白酶表現)及/或遞送、攝取及/或穿透至標靶細胞、組織或器官(例如，肝臟)或其組合。在一些實施例中，莖-環自身或對莖-環之修飾不影響或不實質上影響該寡核苷酸之固有基因表現抑制活性，但促進、改良或增加該寡核苷酸之穩定性(例如，提供抵抗降解之保護)及/或將其遞送、攝取及/或穿透至標靶細胞、組織或器官(例如，肝臟)。在一些實施例中，本文中之寡核苷酸包含有義鏈，該有義鏈包含(例如，在其3'端)如下所陳述之莖-環：S1-L-S2，其中S1與S2互補，且其中L在S1與S2之間形成多達約10個核苷酸長(例如，3、4、5、6、7、8、9或10個核苷酸長)的經連接核苷酸之單鏈環。在一些實施例中，該環(L)為3個核苷酸長。在一些實施例中，該環(L)為4個核苷酸長。在一些實施例中，該環(L)為5個核苷酸長。在一些實施例中，該環(L)為6個核苷酸長。在一些實施例中，該環(L)為7個核苷酸長。在一些實施例中，該環(L)為8個核苷酸長。在一些實施例中，該環(L)為9個核苷酸長。在一些實施例中，該環(L)為10個核苷酸長。
在一些實施例中，本文所提供之寡核苷酸(例如，RNAi寡核苷酸)包含與鄰接核苷酸序列互補之靶向序列或互補區域，其中該靶向區域或互補區域係選自SEQ ID NO: 1、3、5、7、9、11、13、15、17、19、21、23、25、27、29及31，且該寡核苷酸包含有義鏈，該有義鏈包含(例如，在其3'端)如下所陳述之莖-環：S1-L-S2，其中S1與S2互補，且其中L在S1與S2之間形成多達約10個核苷酸長(例如，3、4、5、6、7、8、9或10個核苷酸長)之單鏈環。在一些實施例中，該寡核苷酸包含與鄰接核苷酸序列互補之靶向序列或互補區域，其中該靶向區域或互補區域係選自SEQ ID NO: 1、3、5、7、9、11、13、15、17、19、21、23、25、27、29及31，且該寡核苷酸包含有義鏈，該有義鏈包含(例如，在其3'端)如下所陳述之莖-環：S1-L-S2，其中S1與S2互補，且其中L在S1與S2之間形成4個核苷酸長之單鏈環。
在一些實施例中，具有如本文所述之結構S1-L-S2之莖-環的環(L)為三環。在一些實施例中，該寡核苷酸包含與鄰接核苷酸序列互補之靶向序列或互補區域，其中該靶向區域或互補區域係選自SEQ ID NO: 1、3、5、7、9、11、13、15、17、19、21、23、25、27、29及31以及三環。在一些實施例中，該三環包含核糖核苷酸、去氧核糖核苷酸、經修飾之核苷酸、配位體(例如，遞送配位體)及其組合。
在一些實施例中，具有如上文所述之結構S1-L-S2之莖-環的環(L)為四環。在一些實施例中，本文中之寡核苷酸包含與鄰接核苷酸序列互補之靶向序列或互補區域，其中該靶向區域或互補區域係選自SEQ ID NO: 1、3、5、7、9、11、13、15、17、19、21、23、25、27、29及31以及四環。在一些實施例中，該四環包含核糖核苷酸、去氧核糖核苷酸、經修飾之核苷酸、配位體(例如，遞送配位體)及其組合。 雙鏈體長度
在一些實施例中，在有義鏈與反義鏈之間形成的雙鏈體為至少12個(例如，至少15個、至少16個、至少17個、至少18個、至少19個、至少20個或至少21個)核苷酸長。在一些實施例中，在有義鏈與反義鏈之間形成的雙鏈體係在12-30個核苷酸長(例如，12個至30個、12個至27個、12個至22個、15個至25個、18個至30個、18個至22個、18個至25個、18個至27個、18個至30個、19個至30個或21個至30個核苷酸長)之範圍內。在一些實施例中，在有義鏈與反義鏈之間形成的雙鏈體為12、13、14、15、16、17、18、19、29、21、22、23、24、25、26、27、28、29或30個核苷酸長。在一些實施例中，在有義鏈與反義鏈之間形成的雙鏈體為12個核苷酸長。在一些實施例中，在有義鏈與反義鏈之間形成的雙鏈體為13個核苷酸長。在一些實施例中，在有義鏈與反義鏈之間形成的雙鏈體為14個核苷酸長。在一些實施例中，在有義鏈與反義鏈之間形成的雙鏈體為15個核苷酸長。在一些實施例中，在有義鏈與反義鏈之間形成的雙鏈體為16個核苷酸長。在一些實施例中，在有義鏈與反義鏈之間形成的雙鏈體為17個核苷酸長。在一些實施例中，在有義鏈與反義鏈之間形成的雙鏈體為18個核苷酸長。在一些實施例中，在有義鏈與反義鏈之間形成的雙鏈體為19個核苷酸長。在一些實施例中，在有義鏈與反義鏈之間形成的雙鏈體為20個核苷酸長。在一些實施例中，在有義鏈與反義鏈之間形成的雙鏈體為21個核苷酸長。在一些實施例中，在有義鏈與反義鏈之間形成的雙鏈體為22個核苷酸長。在一些實施例中，在有義鏈與反義鏈之間形成的雙鏈體為23個核苷酸長。在一些實施例中，在有義鏈與反義鏈之間形成的雙鏈體為24個核苷酸長。在一些實施例中，在有義鏈與反義鏈之間形成的雙鏈體為25個核苷酸長。在一些實施例中，在有義鏈與反義鏈之間形成的雙鏈體為26個核苷酸長。在一些實施例中，在有義鏈與反義鏈之間形成的雙鏈體為27個核苷酸長。在一些實施例中，在有義鏈與反義鏈之間形成的雙鏈體為28個核苷酸長。在一些實施例中，在有義鏈與反義鏈之間形成的雙鏈體為29個核苷酸長。在一些實施例中，在有義鏈與反義鏈之間形成的雙鏈體為30個核苷酸長。在一些實施例中，在有義鏈與反義鏈之間形成的雙鏈體不跨越有義鏈及/或反義鏈之整個長度。在一些實施例中，在有義鏈與反義鏈之間的雙鏈體跨越有義鏈或反義鏈之整個長度。在一些實施例中，在有義鏈與反義鏈之間的雙鏈體跨越有義鏈及反義鏈兩者之整個長度。在一些實施例中，寡核苷酸之有義鏈及反義鏈分別包含選自SEQ ID No: 33、35、37、39、41、43、45、47、49、51、53、55、57、59、61、63、65、67、69、71、73、75、77、79、81、83、85、87、89、91、93、95、97、99、101及103以及SEQ ID NO: 34、36、38、40、42、44、46、48、50、52、54、56、58、60、62、64、66、68、70、72、74、76、78、80、82、84、86、88、90、92、94、96、98、100、102及104之核苷酸序列。在一些實施例中，寡核苷酸之有義鏈及反義鏈包含選自由以下組成之群的核苷酸序列： (a) 分別地，SEQ ID NO: 25及26； (b) 分別地，SEQ ID NO: 27及28； (c) 分別地，SEQ ID NO: 29及30； (d) 分別地，SEQ ID NO:31及32； (e) 分別地，SEQ ID NO: 97及98； (f) 分別地，SEQ ID NO: 99及100； (g) 分別地，SEQ ID NO: 101及102；及 (h) 分別地，SEQ ID NO: 103及104， 其中在有義鏈與反義鏈之間形成的雙鏈體係在12-30個核苷酸長(例如，12個至30個、12個至27個、12個至22個、15個至25個、18個至30個、18個至22個、18個至25個、18個至27個、18個至30個、19個至30個或21個至30個核苷酸長)之範圍內 寡核苷酸末端
在一些實施例中，本文所揭示之寡核苷酸(例如，RNAi寡核苷酸)包含有義鏈及反義鏈，其中任一或兩個鏈之末端包含鈍端。在一些實施例中，本文中之寡核苷酸包含有義鏈及反義鏈，其中任一或兩個鏈之末端包含含有一或多個核苷酸之懸垂物。在一些實施例中，構成該懸垂物之一或多個核苷酸係未配對核苷酸。在一些實施例中，本文中之寡核苷酸包含有義鏈及反義鏈，其中有義鏈之3’末端及反義鏈之5’末端包含鈍端。在一些實施例中，本文中之寡核苷酸包含有義鏈及反義鏈，其中有義鏈之5’末端及反義鏈之3’末端包含鈍端。
在一些實施例中，本文中之寡核苷酸包含有義鏈及反義鏈，其中任一或兩個鏈之3’末端包含含有一或多個核苷酸之3’-懸垂物。在一些實施例中，本文中之寡核苷酸包含有義鏈及反義鏈，其中該有義鏈包含含有一或多個核苷酸之3’-懸垂物。在一些實施例中，本文中之寡核苷酸包含有義鏈及反義鏈，其中該反義鏈包含含有一或多個核苷酸之3’-懸垂物。在一些實施例中，本文中之寡核苷酸包含有義鏈及反義鏈，其中有義鏈及反義鏈均包含含有一或多個核苷酸之3’-懸垂物。
在一些實施例中，該3’-懸垂物係約一(1)個至二十(20)個核苷酸長(例如，約1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19個或約20個核苷酸長)。在一些實施例中，該3’懸垂物係約一(1)個至十九(19)個、一(1)個至十八(18)個、一(1)個至十七(17)個、一(1)個至十六(16)個、一(1)個至十五(15)個、一(1)個至十四(14)個、一(1)個至十三(13)個、一(1)個至十二(12)個、一(1)個至十一(11)個、一(1)個至十(10)個、一(1)個至九(9)個、一(1)個至八(8)個、一(1)個至七(7)個、一(1)個至六(6)個、一(1)個至五(5)個、一(1)個至四(4)個、一(1)個至三(3)個或約一(1)個至兩(2)個核苷酸長。在一些實施例中，該3’-懸垂物係(1)個核苷酸長。在一些實施例中，該3’-懸垂物係兩(2)個核苷酸長。在一些實施例中，該3’-懸垂物係三(3)個核苷酸長。在一些實施例中，該3’-懸垂物係四(4)個核苷酸長。在一些實施例中，該3’-懸垂物係五(5)個核苷酸長。在一些實施例中，該3’-懸垂物係六(6)個核苷酸長。在一些實施例中，該3’-懸垂物係七(7)個核苷酸長。在一些實施例中，該3’-懸垂物係八(8)個核苷酸長。在一些實施例中，該3’-懸垂物係九(9)個核苷酸長。在一些實施例中，該3’-懸垂物係十(10)個核苷酸長。在一些實施例中，該3’-懸垂物係十一(11)個核苷酸長。在一些實施例中，該3’-懸垂物係十二(12)個核苷酸長。在一些實施例中，該3’-懸垂物係十三(13)個核苷酸長。在一些實施例中，該3’-懸垂物係十四(14)個核苷酸長。在一些實施例中，該3’-懸垂物係十五(15)個核苷酸長。在一些實施例中，該3’-懸垂物係十六(16)個核苷酸長。在一些實施例中，該3’-懸垂物係十七(17)個核苷酸長。在一些實施例中，該3’-懸垂物係十八(18)個核苷酸長。在一些實施例中，該3’-懸垂物係十九(19)個核苷酸長。在一些實施例中，該3’-懸垂物係二十(20)個核苷酸長。
在一些實施例中，本文所揭示之寡核苷酸(例如，RNAi寡核苷酸)包含有義鏈及反義鏈，其中該反義鏈包含3’-懸垂物，其中該寡核苷酸之有義鏈及反義鏈分別包含選自SEQ ID No: 33、35、37、39、41、43、45、47、49、51、53、55、57、59、61、63、65、67、69、71、73、75、77、79、81、83、85、87、89、91、93、95、97、99、101及103以及SEQ ID NO: 34、36、38、40、42、44、46、48、50、52、54、56、58、60、62、64、66、68、70、72、74、76、78、80、82、84、86、88、90、92、94、96、98、100、102及104之核苷酸序列。
在一些實施例中，本文所揭示之寡核苷酸(例如，RNAi寡核苷酸)包含有義鏈及反義鏈，其中該反義鏈包含3’-懸垂物，其中該寡核苷酸之有義鏈及反義鏈包含選自由以下組成之群的核苷酸序列： (a) 分別地，SEQ ID NO: 25及26； (b) 分別地，SEQ ID NO: 27及28； (c) 分別地，SEQ ID NO: 29及30；及 (d) 分別地，SEQ ID NO: 31及32， 且其中該反義鏈包含約一(1)個至二十(20)個核苷酸長(例如，約1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19個或約20個核苷酸長)之3’-懸垂物，視情況其中該3’-懸垂物係兩(2)個核苷酸長。
在一些實施例中，本文中之寡核苷酸包含有義鏈及反義鏈，其中任一或兩個鏈之5’末端包含含有一或多個核苷酸之5’-懸垂物。在一些實施例中，本文中之寡核苷酸包含有義鏈及反義鏈，其中該有義鏈包含含有一或多個核苷酸之5’-懸垂物。在一些實施例中，本文中之寡核苷酸包含有義鏈及反義鏈，其中該反義鏈包含含有一或多個核苷酸之5’-懸垂物。在一些實施例中，本文中之寡核苷酸包含有義鏈及反義鏈，其中有義鏈及反義鏈均包含含有一或多個核苷酸之5’-懸垂物。
在一些實施例中，該5’-懸垂物係約一(1)個至二十(20)個核苷酸長(例如，約1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19個或約20個核苷酸長)。在一些實施例中，該5’懸垂物係約一(1)個至十九(19)個、一(1)個至十八(18)個、一(1)個至十七(17)個、一(1)個至十六(16)個、一(1)個至十五(15)個、一(1)個至十四(14)個、一(1)個至十三(13)個、一(1)個至十二(12)個、一(1)個至十一(11)個、一(1)個至十(10)個、一(1)個至九(9)個、一(1)個至八(8)個、一(1)個至七(7)個、一(1)個至六(6)個、一(1)個至五(5)個、一(1)個至四(4)個、一(1)個至三(3)個或約一(1)個至兩(2)個核苷酸長。在一些實施例中，該5’-懸垂物係(1)個核苷酸長。在一些實施例中，該5’-懸垂物係兩(2)個核苷酸長。在一些實施例中，該5’-懸垂物係三(3)個核苷酸長。在一些實施例中，該5’-懸垂物係四(4)個核苷酸長。在一些實施例中，該5’-懸垂物係五(5)個核苷酸長。在一些實施例中，該5’-懸垂物係六(6)個核苷酸長。在一些實施例中，該5’-懸垂物係七(7)個核苷酸長。在一些實施例中，該5’-懸垂物係八(8)個核苷酸長。在一些實施例中，該5’-懸垂物係九(9)個核苷酸長。在一些實施例中，該5’-懸垂物係十(10)個核苷酸長。在一些實施例中，該5’-懸垂物係十一(11)個核苷酸長。在一些實施例中，該5’-懸垂物係十二(12)個核苷酸長。在一些實施例中，該5’-懸垂物係十三(13)個核苷酸長。在一些實施例中，該5’-懸垂物係十四(14)個核苷酸長。在一些實施例中，該5’-懸垂物係十五(15)個核苷酸長。在一些實施例中，該5’-懸垂物係十六(16)個核苷酸長。在一些實施例中，該5’-懸垂物係十七(17)個核苷酸長。在一些實施例中，該5’-懸垂物係十八(18)個核苷酸長。在一些實施例中，該5’-懸垂物係十九(19)個核苷酸長。在一些實施例中，該5’-懸垂物係二十(20)個核苷酸長。
在一些實施例中，本文所揭示之寡核苷酸(例如，RNAi寡核苷酸)包含有義鏈及反義鏈，其中該反義鏈包含5’-懸垂物，其中該寡核苷酸之有義鏈及反義鏈包含選自由以下組成之群的核苷酸序列： (a) 分別地，SEQ ID NO: 25及26； (b) 分別地，SEQ ID NO: 27及28； (c) 分別地，SEQ ID NO: 29及30；及 (d) 分別地，SEQ ID NO: 31及32， 且其中該反義鏈包含約一(1)個至二十(20)個核苷酸長(例如，約1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19個或約20個核苷酸長)之5’-懸垂物，視情況其中該5’-懸垂物係兩(2)個核苷酸長。
在一些實施例中，構成有義鏈及/或反義鏈之3’末端或5’末端的一或多個(例如，2、3、4、5個或更多個)核苷酸係經修飾。例如，在一些實施例中，反義鏈之3’末端的一或兩個末端核苷酸係經修飾。在一些實施例中，在反義鏈之3’末端的最後一個核苷酸係經修飾，例如包含2’修飾，例如2’-O-甲氧基乙基。在一些實施例中，在反義鏈之3’末端的最後一或兩個末端核苷酸與標靶互補。在一些實施例中，在反義鏈之3’末端的最後一或兩個核苷酸不與標靶互補。
在一些實施例中，本文所揭示之寡核苷酸(例如，RNAi寡核苷酸)包含有義鏈及反義鏈，其中該有義鏈之3’末端包含本文所述之莖-環且該反義鏈之3’末端包含本文所述之3’-懸垂物。在一些實施例中，本文中之寡核苷酸(例如，RNAi寡核苷酸)包含有義鏈及反義鏈，該等鏈形成本文所述之帶缺口四環結構，其中該有義鏈之3’末端包含莖-環，其中該環係本文所述之四環，且其中該反義鏈之3’末端包含本文所述之3’-懸垂物。在一些實施例中，該3’-懸垂物係兩(2)個核苷酸長。在一些實施例中，構成該3’-懸垂物之兩(2)個核苷酸均包含鳥嘌呤(G)核鹼基。典型地，構成該反義鏈之3’-懸垂物的核苷酸中之一或兩者與標靶mRNA不互補。例示性寡核苷酸結構提供於 圖 20中。 寡核苷酸修飾
在一些實施例中，本文所述之寡核苷酸(例如，RNAi寡核苷酸)包含修飾。寡核苷酸(例如，RNAi寡核苷酸)可以多種方式經修飾，以改良或控制特異性、穩定性、遞送、生物可用性、對核酸酶降解之抗性、免疫原性、鹼基配對特性、RNA分佈及細胞攝取以及與治療或研究用途相關之其他特徵。
在一些實施例中，該修飾係經修飾之糖。在一些實施例中，該修飾係5’-末端磷酸酯基。在一些實施例中，該修飾係經修飾之核苷酸間鍵。在一些實施例中，該修飾係經修飾之鹼基。在一些實施例中，本文所述之寡核苷酸可包含本文所述之修飾中的任一者或其任何組合。例如，在一些實施例中，本文所述之寡核苷酸包含至少一個經修飾之糖、5’-末端磷酸酯基、至少一個經修飾之核苷酸間鍵及至少一個經修飾之鹼基。在一些實施例中，寡核苷酸之有義鏈及反義鏈包含選自由以下組成之群的核苷酸序列： (a) 分別地，SEQ ID NO: 25及26； (b) 分別地，SEQ ID NO: 27及28； (c) 分別地，SEQ ID NO: 29及30；及 (d) 分別地，SEQ ID NO: 31及32， 其中該寡核苷酸包含至少一個經修飾之糖、5’-末端磷酸酯基、至少一個經修飾之核苷酸間鍵及至少一個經修飾之鹼基。
寡核苷酸(例如，RNAi寡核苷酸)上之修飾數目及彼等核苷酸修飾之位置可影響寡核苷酸之特性。舉例而言，可藉由使寡核苷酸結合於或使寡核苷酸包含於脂質奈米粒子(LNP)或類似載劑中而在活體內遞送寡核苷酸。然而，當寡核苷酸不受LNP或類似載劑保護時，可有利的是至少一些核苷酸經修飾。因此，在一些實施例中，寡核苷酸之所有或實質上所有核苷酸係經修飾。在一些實施例中，超過一半之核苷酸係經修飾。在一些實施例中，少於一半之核苷酸係經修飾。在一些實施例中，構成該寡核苷酸之所有核苷酸的糖部分均在2’位置經修飾。該等修飾可為可逆的或不可逆的。在一些實施例中，如本文所揭示之寡核苷酸具有足以促成所需特徵(例如，防止酶促降解之保護、在活體內投與之後靶向所需細胞之能力及/或熱力學穩定性)之數目及類型的經修飾之核苷酸。 糖修飾
在一些實施例中，本文所述之寡核苷酸(例如，RNAi寡核苷酸)包含經修飾之糖。在一些實施例中，經修飾之糖(本文中亦稱作糖類似物)包括經修飾之去氧核糖或核糖部分，其中例如一或多個修飾發生於該糖之2′、3′、4′及/或5′碳位置處。在一些實施例中，經修飾之糖亦可包括非天然替代性碳結構，諸如存在於以下中之彼等：鎖核酸(「LNA」；參見例如Koshkin等人 (1998) Tetrahedon 54:3607-30)、非鎖核酸(「UNA」；參見例如Snead等人 (2013) Mol. Ther-Nucl. Acids 2:e103)及橋接核酸(「BNA」；參見例如Imanishi及Obika (2002) Chem Commun. (Camb) 21:1653-59)。
在一些實施例中，糖中之核苷酸修飾包含2′-修飾。在一些實施例中，2′-修飾可為2′-O-炔丙基、2′-O-丙胺、2′-胺基、2′-乙基、2′-氟(2′-F)、2′-胺基乙基(EA)、2′-O-甲基(2′-OMe)、2′-O-甲氧基乙基(2′-MOE)、2′-O-[2-(甲基胺基)-2-側氧基乙基] (2′-O-NMA)或2′-去氧-2′-氟-β-d-阿拉伯糖核酸(2′-FANA)。在一些實施例中，該修飾為2′-F、2′-OMe或2′-MOE。在一些實施例中，糖中之修飾包含糖環之修飾，其可包含糖環之一或多個碳的修飾。例如，核苷酸之糖的修飾可包含糖之2′-氧連接至該糖之1′-碳或4′-碳，或2′-氧經由伸乙基或亞甲基橋連接至該1′-碳或4′-碳。在一些實施例中，經修飾之核苷酸具有缺乏2′-碳至3′-碳鍵之無環糖。在一些實施例中，經修飾之核苷酸例如在糖之4′位置處具有硫醇基。
在一些實施例中，本文所述之寡核苷酸(例如，RNAi寡核苷酸)包含至少約1個經修飾之核苷酸(例如，至少1個、至少5個、至少10個、至少15個、至少20個、至少25個、至少30個、至少35個、至少40個、至少45個、至少50個、至少55個、至少60個或更多個)。在一些實施例中，該寡核苷酸之有義鏈包含至少約1個經修飾之核苷酸(例如，至少1個、至少5個、至少10個、至少15個、至少20個、至少25個、至少30個、至少35個或更多個)。在一些實施例中，該寡核苷酸之反義鏈包含至少約1個經修飾之核苷酸(例如，至少1個、至少5個、至少10個、至少15個、至少20個或更多個)。
在一些實施例中，該寡核苷酸之有義鏈的所有核苷酸均經修飾。在一些實施例中，該寡核苷酸之反義鏈的所有核苷酸均經修飾。在一些實施例中，該寡核苷酸之所有核苷酸(亦即，有義鏈及反義鏈兩者)均經修飾。在一些實施例中，經修飾之核苷酸包含2′-修飾(例如，2′-F或2′-OMe、2′-MOE及2′-去氧-2′-氟-β-d-阿拉伯糖核酸)。
在一些實施例中，本發明提供具有不同修飾模式之寡核苷酸。在一些實施例中，本文中之寡核苷酸包含具有如實例及序列表中所陳述之修飾模式的有義鏈及具有如實例及序列表中所陳述之修飾模式的反義鏈。
在一些實施例中，本文所揭示之寡核苷酸(例如，RNAi寡核苷酸)包含具有經2′-F修飾之核苷酸的反義鏈。在一些實施例中，本文中之寡核苷酸包含含有經2′-F及2′-OMe修飾之核苷酸的反義鏈。在一些實施例中，本文所揭示之寡核苷酸包含具有經2′-F修飾之核苷酸的有義鏈。在一些實施例中，本文所揭示之寡核苷酸包含含有經2′-F及2′-OMe修飾之核苷酸的有義鏈。
在一些實施例中，該有義鏈之位置8、9、10或11中的一或多者係經2′-F基團修飾。在一些實施例中，該有義鏈之位置3、8、9、10、12、13及17中的一或多者係經2′-F基團修飾。在一些實施例中，該反義鏈之位置2、3、4、5、7、10及14中的一或多者係經2′-F基團修飾。在一些實施例中，位置2、3、4、5、7、8、10、14、16及19中的一或多者係經2′-F基團修飾。在一些實施例中，在該有義鏈中之位置1-7及12-20處的各核苷酸處之糖部分係經2′-OMe修飾。在一些實施例中，在該有義鏈中之位置1-7、12-27及31-36處的各核苷酸處之糖部分係經2′-OMe修飾。在一些實施例中，在該有義鏈中之位置6、9、11-13、15、17、18及20-22處的各核苷酸處之糖部分係經2′-OMe修飾。在一些實施例中，以下位置處之一或多者係經2′-O-甲基修飾：有義鏈之位置1、2、4、6、7、12、14、16、18-26或31-36及/或反義鏈之位置1、6、8、11-13、15、17或19-22。在一些實施例中，以下位置處之一或多者係經2′-氟修飾：有義鏈之位置3、5、8-11、13、15或17及/或反義鏈之位置2-5、7、9、10、14、16或18。
在一些實施例中，在該有義鏈之位置3、8-10、12、13及17處的核苷酸係經2′-F基團修飾。在一些實施例中，在該反義鏈之位置2、3、5、7、12、14、16及19處的核苷酸係經2′-F基團修飾。在一些實施例中，在該有義鏈之位置1、2、4-7、11、14-16、18-26及31-36處的核苷酸係經2′-OMe修飾。在一些實施例中，在該反義鏈之位置1、4、6、8-11、13、15、17、18及20-22處的核苷酸係經2′-OMe修飾。在一些實施例中，以下位置處之核苷酸係經2′-O-Me修飾：有義鏈之位置1、2、4-7、11、14-16、18-26及31-36及/或反義鏈之位置1、4、6、8-11、13、15、17、18及20-22。在一些實施例中，以下位置處之核苷酸係經2′-氟修飾：有義鏈之位置3、8、9、10、12、13及17及/或反義鏈之位置2、3、5、7、12、14、16及19。
在一些實施例中，以下位置之一或多者係經2′-O-甲基修飾：有義鏈之位置1-7及12-36及/或反義鏈之位置1、6、8-13及15-22。在一些實施例中，以下位置之一或多者係經2′-氟修飾：有義鏈之位置8-11及/或反義鏈之位置2-5、7及14。
在一些實施例中，以下位置之一或多者係經2′-O-甲基修飾：有義鏈之位置1、2、4-7、11、14-16、18-26或31-36及/或反義鏈之位置1、4、6、8-11、13、15、17、18或20-22。在一些實施例中，以下位置之一或多者係經2′-氟修飾：有義鏈之位置3、8-10、12、13及17及/或反義鏈之位置2、3、5、7、12、14、16及19。
在一些實施例中，以下位置之一或多者係經2′-O-甲基修飾：有義鏈之位置1、2、4-7、11、14-16、18-26或31-36及/或反義鏈之位置1、4、6、8、9、11-13、15、18或20-22。在一些實施例中，以下位置之一或多者係經2′-氟修飾：有義鏈之位置3、8-10、12、13或17及/或反義鏈之位置2、3、5、7、10、14、16、17或19。
在一些實施例中，寡核苷酸之有義鏈及反義鏈包含選自由以下組成之群的核苷酸序列： (a) 分別地，SEQ ID NO: 25及26； (b) 分別地，SEQ ID NO: 27及28； (c) 分別地，SEQ ID NO: 29及30；及 (d) 分別地，SEQ ID NO: 31及32， 其中以下位置中的一或多者係經2′-F基團修飾：該有義鏈之位置3、8-10、12、13或17。
在一些實施例中，本文所提供之寡核苷酸包含在一或多個核苷酸處具有糖部分之反義鏈。該糖部分係經2′-F或選自由以下組成之群的修飾修飾：2′-O-炔丙基、2′-O-丙胺、2′-胺基、2′-乙基、2′-胺基乙基(EA)、2’-O-甲基(2′-OMe)、2’-O-甲氧基乙基(2′-MOE)、2′-O-[2-(甲基胺基)-2-側氧基乙基] (2′-O-NMA)及2’-去氧-2’-氟-β-d-阿拉伯糖核酸(2′-FANA)。 5’- 末端磷酸酯
在一些實施例中，本文所述之寡核苷酸(例如，RNAi寡核苷酸)包含有義鏈及反義鏈，其中該反義鏈包含5’-末端磷酸酯。在一些實施例中，RNAi寡核苷酸之5′-末端磷酸酯基增強與Ago2之相互作用。然而，包含5′-磷酸酯基之寡核苷酸可易於經由磷酸酶或其他酶降解，這可限制其效能及/或活體內生物可用性。在一些實施例中，本文中之寡核苷酸包括抵抗此類降解之5'-磷酸酯類似物。在一些實施例中，磷酸酯類似物為氧甲基膦酸酯、乙烯基膦酸酯或丙二醯基膦酸酯或其組合。在一些實施例中，寡核苷酸鏈之5′末端附接至模擬天然5′-磷酸酯基之靜電及空間特性的化學部分(「磷酸酯模擬物」)。在一些實施例中，寡核苷酸之有義鏈及反義鏈分別包含選自SEQ ID No: 1、3、5、7、9、11、13、15、17、19、21、23、25、27、29及31以及SEQ ID NO: 2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30基32之核苷酸序列。
在一些實施例中，寡核苷酸之有義鏈及反義鏈包含選自由以下組成之群的核苷酸序列： (a) 分別地，SEQ ID NO: 25及26； (b) 分別地，SEQ ID NO: 27及28； (c) 分別地，SEQ ID NO: 29及30；及 (d) 分別地，SEQ ID NO: 31及32， 其中該寡核苷酸包含5’-末端磷酸酯，視情況包含5’-末端磷酸酯類似物。
在一些實施例中，本文中之寡核苷酸(例如，RNAi寡核苷酸)具有在糖之4′-碳位置處的磷酸酯類似物(稱作「4′-磷酸酯類似物」)。參見例如國際專利申請公開案第WO 2018/045317號。在一些實施例中，本文中之寡核苷酸在5′-末端核苷酸處包含4′-磷酸酯類似物。在一些實施例中，磷酸酯類似物為氧甲基膦酸酯，其中氧甲基之氧原子結合至糖部分(例如，在其4′-碳處)或其類似物。在其他實施例中，4′-磷酸酯類似物為硫甲基膦酸酯或胺基甲基膦酸酯，其中硫甲基之硫原子或胺基甲基之氮原子結合至糖部分或其類似物之4′-碳。在一些實施例中，4′-磷酸酯類似物為氧甲基膦酸酯。在一些實施例中，氧甲基膦酸酯係由式-O-CH 2-PO(OH) 2、-O-CH 2-PO(OR) 2或-O-CH2-POOH(R)表示，其中R獨立地選自H、CH 3、烷基、CH 2CH 2CN、CH 2OCOC(CH 3) 3、CH 2OCH 2CH 2Si (CH 3) 3或保護基。在一些實施例中，該烷基為CH 2CH 3。更典型地，R獨立地選自H、CH 3或CH 2CH 3。在一些實施例中，R為CH3。在一些實施例中，4’-磷酸酯類似物為4’-氧甲基膦酸酯。
在一些實施例中，4’-磷酸酯類似物為4’-(甲基甲氧基膦酸酯)。在一些實施例中，本文所提供之寡核苷酸包含在5′-末端核苷酸處包含4′-磷酸酯類似物之反義鏈，其中5′-末端核苷酸包含以下結構：
Figure 02_image016
4’-O-單甲基膦酸酯-2’O-甲基尿苷硫代磷酸酯[MePhosphonate-4O-mUs] [MeMOP] 經修飾之核苷酸間鍵
在一些實施例中，本文所提供之寡核苷酸(例如，RNAi寡核苷酸)包含經修飾之核苷酸間鍵。在一些實施例中，磷酸酯修飾或取代導致包含至少約1個(例如，至少1個、至少2個、至少3個或至少5個)經修飾之核苷酸間鍵的寡核苷酸。在一些實施例中，本文所揭示之寡核苷酸中的任一者均包含約1個至約10個(例如，1個至10個、2個至8個、4個至6個、3個至10個、5個至10個、1個至5個、1個至3個或1個至2個)經修飾之核苷酸間鍵。在一些實施例中，本文所揭示之寡核苷酸中的任一者均包含1、2、3、4、5、6、7、8、9或10個經修飾之核苷酸間鍵。
經修飾之核苷酸間鍵可為二硫代磷酸酯鍵、硫代磷酸酯鍵、磷酸三酯鍵、硫羰基烷基膦酸酯鍵、硫羰基烷基磷酸三酯鍵、亞磷醯胺鍵、膦酸酯鍵或硼烷磷酸酯鍵。在一些實施例中，如本文所揭示之寡核苷酸中的任一者之至少一個經修飾之核苷酸間鍵為硫代磷酸酯鍵。
在一些實施例中，本文所提供之寡核苷酸(例如，RNAi寡核苷酸)在以下一或多者之間具有硫代磷酸酯鍵：有義鏈之位置1及2、反義鏈之位置1及2、反義鏈之位置2及3、反義鏈之位置3及4、反義鏈之位置20及21以及反義鏈之位置21及22。在一些實施例中，本文所述之寡核苷酸在以下每一者之間具有硫代磷酸酯鍵：有義鏈之位置1及2、反義鏈之位置1及2、反義鏈之位置2及3、反義鏈之位置20及21以及反義鏈之位置21及22。在一些實施例中，寡核苷酸之有義鏈及反義鏈包含選自由以下組成之群的核苷酸序列： (a) 分別地，SEQ ID NO: 25及26； (b) 分別地，SEQ ID NO: 27及28； (c) 分別地，SEQ ID NO: 29及30；及 (d) 分別地，SEQ ID NO: 31及32， 且其中該寡核苷酸包含經修飾之核苷酸間鍵。 鹼基修飾
在一些實施例中，本文所提供之寡核苷酸(例如，RNAi寡核苷酸)包含一或多個經修飾之核鹼基。在一些實施例中，經修飾之核鹼基(本文中亦稱作鹼基類似物)在核苷酸糖部分之1′位置處經連接。在一些實施例中，經修飾之核鹼基為含氮鹼基。在一些實施例中，經修飾之核鹼基不含氮原子。參見例如美國專利申請公開案第2008/0274462號。在一些實施例中，經修飾之核苷酸包含通用鹼基。在一些實施例中，經修飾之核苷酸不含核鹼基(無鹼基)。在一些實施例中，寡核苷酸之有義鏈及反義鏈包含選自由以下組成之群的核苷酸序列： (a) 分別地，SEQ ID NO: 25及26； (b) 分別地，SEQ ID NO: 27及28； (c) 分別地，SEQ ID NO: 29及30；及 (d) 分別地，SEQ ID NO: 31及32， 其中該寡核苷酸包含一或多個經修飾之核鹼基。
在一些實施例中，通用鹼基係位於經修飾之核苷酸中的核苷酸糖部分之1′位置或核苷酸糖部分取代中之等效位置處的雜環部分，當存在於雙鏈體中時，其可與超過一種類型之鹼基相對定位而不會實質上改變該雙鏈體之結構。在一些實施例中，相較於與標靶核酸(例如，α-1抗胰蛋白酶mRNA)完全互補之參考單鏈核酸(例如，寡核苷酸)，含有通用鹼基之單鏈核酸與該標靶核酸形成雙鏈體，該雙鏈體具有低於與互補核酸形成之雙鏈體的T m。在一些實施例中，當與其中通用鹼基已經鹼基置換以產生單個錯配之參考單鏈核酸相比時，含有通用鹼基之單鏈核酸與該標靶核酸形成雙鏈體，該雙鏈體具有高於與包含錯配鹼基之核酸形成之雙鏈體的T m。
普遍結合核苷酸之非限制性實例包括但不限於肌苷、1-β-D-呋喃核糖基-5-硝基吲哚及/或1-β-D-呋喃核糖基-3-硝基吡咯(參見美國專利申請公開案第2007/0254362號；Van Aerschot等人 (1995) Nucleic Acids Res .23:4363-4370；Loakes等人 (1995) Nucleic Acids Res .23:2361-66；及Loakes及Brown (1994) Nucleic Acids Res. 22:4039-43)。 靶向配位體
在一些實施例中，可需要使本文所提供之寡核苷酸(例如，RNAi寡核苷酸)靶向一或多個細胞或細胞類型、組織、器官或解剖區域或隔室。此類策略可幫助避免非所需效應及/或避免該寡核苷酸在將不會受益於該寡核苷酸或其效應(例如，α-1抗胰蛋白酶表現之抑制或降低)之細胞、組織、器官或解剖區域或隔室中過度損失。因此，在一些實施例中，本文所揭示之寡核苷酸(例如，RNAi寡核苷酸)係經修飾以促進靶向及/或遞送至特定細胞或細胞類型、組織、器官或解剖區域或隔室(例如，以促進將該寡核苷酸遞送至肝臟)。在一些實施例中，寡核苷酸包含與一或多個靶向配位體結合之至少一個核苷酸(例如，1、2、3、4、5、6個或更多個核苷酸)。在一些實施例中，寡核苷酸之有義鏈及反義鏈包含選自由以下組成之群的核苷酸序列： (a) 分別地，SEQ ID NO: 25及26； (b) 分別地，SEQ ID NO: 27及28； (c) 分別地，SEQ ID NO: 29及30；及 (d) 分別地，SEQ ID NO: 31及32， 其中該寡核苷酸包含與至少一個核苷酸結合之靶向配位體。
在一些實施例中，該靶向配位體包含碳水化合物、胺基糖、膽固醇、肽、多肽、蛋白質或蛋白質之一部分(例如，抗體或抗體片段)或脂質。在一些實施例中，該靶向配位體係包含GalNAc部分之碳水化合物。
在一些實施例中，本文所提供之寡核苷酸(例如，RNAi寡核苷酸)的1或多個(例如，1、2、3、4、5或6個)核苷酸各自與獨立靶向配位體(例如，GalNAc部分)結合。在一些實施例中，寡核苷酸之2個至4個核苷酸各自與獨立靶向配位體結合。在一些實施例中，靶向配位體與有義鏈或反義鏈之任一端的2個至4個核苷酸結合(例如，靶向配位體與有義鏈或反義鏈之5′或3′末端的2個至4個核苷酸之懸垂物或延伸結合)，使得該等靶向配位體類似於牙刷之刷毛且該寡核苷酸類似於牙刷。舉例而言，寡核苷酸可在有義鏈之5′或3′末端包含莖-環，且該莖之環的1、2、3或4個核苷酸可個別地與靶向配位體結合。在一些實施例中，由本發明提供之寡核苷酸(例如，RNAi寡核苷酸)在有義鏈之3′末端包含莖-環，其中該莖-環之環包含三環或四環，且其中分別構成該三環或四環之3或4個核苷酸個別地與靶向配位體結合。
GalNAc係去唾液酸醣蛋白受體(ASGPR)之高親和力碳水化合物配位體，ASGPR主要在肝細胞之表面上表現，且在結合、內化及後續清除含有末端半乳糖或GalNAc殘基之循環醣蛋白(去唾液酸醣蛋白)時起主要作用。可使用GalNAc部分與本發明寡核苷酸之結合(間接或直接)使此等寡核苷酸靶向在細胞上表現之ASGPR。在一些實施例中，本發明寡核苷酸(例如，RNAi寡核苷酸)與至少一或多個GalNAc部分結合，其中該等GalNAc部分使該寡核苷酸靶向在人類肝臟細胞(例如，人類肝細胞)上表現之ASGPR。在一些實施例中，該GalNAc部分使該寡核苷酸靶向肝臟。
在一些實施例中，本發明寡核苷酸(例如，RNAi寡核苷酸)直接地或間接地與單價GalNAc部分結合。在一些實施例中，該寡核苷酸直接地或間接地與超過一個單價GalNAc結合(亦即，與2、3或4個單價GalNAc部分結合，且典型地與3或4個單價GalNAc部分結合)。在一些實施例中，寡核苷酸與一或多個二價GalNAc、三價GalNAc或四價GalNAc部分結合。
在一些實施例中，本文所述之寡核苷酸(例如，RNAi寡核苷酸)的一(1)或多個(例如，1、2、3、4、5或6個)核苷酸各自與GalNAc部分結合。在一些實施例中，四環之兩(2)個至四(4)個核苷酸各自與獨立GalNAc部分結合。在一些實施例中，三環之一(1)個至三(3)個核苷酸各自與獨立GalNAc部分結合。在一些實施例中，靶向配位體與有義鏈或反義鏈之任一端的兩(2)個至四(4)個核苷酸結合(例如，配位體與有義鏈或反義鏈之5′或3′末端的兩(2)個至四(4)個核苷酸之懸垂物或延伸結合)，使得該等GalNAc部分類似於牙刷之刷毛，且該寡核苷酸類似於牙刷。在一些實施例中，GalNAc部分與有義鏈之核苷酸結合。舉例而言，三(3)個或四(4)個GalNAc部分可與有義鏈之四環中之核苷酸結合，其中各GalNAc部分與一(1)個核苷酸結合。
在一些實施例中，本文所述之寡核苷酸(例如，RNAi寡核苷酸)包含四環，其中該四環(L)係腺嘌呤(A)及鳥嘌呤(G)核苷酸之任何組合。在一些實施例中，該四環(L)包含經由本文所述之任何連接體附接至該四環之任何一或多個鳥嘌呤(G)核苷酸的單價GalNAc部分，如下文所描繪(X=雜原子)：
Figure 02_image018
在一些實施例中，該四環(L)具有經由本文所述之任何連接體附接至該四環之任何一或多個腺嘌呤核苷酸的單價GalNAc，如下文所描繪(X=雜原子)：
Figure 02_image020
在一些實施例中，本文中之寡核苷酸(例如，RNAi寡核苷酸)包含附接至鳥嘌呤(G)核苷酸之單價GalNAc部分，稱作[ademG-GalNAc]或2′-胺基二乙氧基甲醇-鳥嘌呤-GalNAc，如下文所描繪：
Figure 02_image022
在一些實施例中，本文中之寡核苷酸包含附接至腺嘌呤核苷酸之單價GalNAc部分，稱作[ademA-GalNAc]或2′-胺基二乙氧基甲醇-腺嘌呤-GalNAc，如下文所描繪：
Figure 02_image024
對於自5′至3′包含核苷酸序列GAAA (L = 連接體，X = 雜原子)之環，下文顯示此類結合之實例。此類環可例如存在於本文所提供之有義鏈的位置27-30處，如 圖 20所示。在化學式中，使用
Figure 02_image026
來描述與寡核苷酸鏈之附接點。
Figure 02_image028
可使用適當方法或化學(例如，點擊化學)使靶向配位體連接至核苷酸。在一些實施例中，使用點擊連接體使靶向配位體與構成本文中之寡核苷酸(例如，RNAi寡核苷酸)的核苷酸結合。在一些實施例中，使用基於縮醛之連接體使靶向配位體與本文所述之寡核苷酸中的任一者之核苷酸結合。基於縮醛之連接體揭示於例如國際專利申請公開案第WO2016/100401號中。在一些實施例中，該連接體為不穩定連接體。然而，在其他實施例中，該連接體係穩定的。對於自5′至3′包含核苷酸GAAA之環，下文顯示實例，其中使用縮醛連接體使GalNAc部分附接至該環之核苷酸。此類環可例如存在於有義鏈中之任一者之位置27-30處，如 圖 20所示。在化學式中，
Figure 02_image026
係與寡核苷酸鏈之附接點。
在一些實施例中，本文中之寡核苷酸(例如，RNAi寡核苷酸)包含具有四環之有義鏈，其中四(4)個GalNAc部分與構成該四環之核苷酸結合，且其中各GalNAc部分與一(1)個核苷酸結合。在一些實施例中，本文中之寡核苷酸(例如，RNAi寡核苷酸)包含具有四環之有義鏈，該四環包含GalNAc結合之核苷酸，其中該四環包含以下結構：
Figure 02_image005
在一些實施例中，本文中之寡核苷酸(例如，RNAi寡核苷酸)包含具有四環之有義鏈，其中三(3)個GalNAc部分與構成該四環之核苷酸結合，且其中各GalNAc部分與一(1)個核苷酸結合。在一些實施例中，本文中之寡核苷酸(例如，RNAi寡核苷酸)包含具有四環之有義鏈，該四環包含GalNAc結合之核苷酸，其中該四環包含以下結構：
Figure 02_image032
如所提及，可使用多種適當方法或化學合成技術(例如，點擊化學)使靶向配位體連接至核苷酸。在一些實施例中，使用點擊連接體使靶向配位體與核苷酸結合。在一些實施例中，使用基於縮醛之連接體使靶向配位體與本文所述之寡核苷酸中的任一者之核苷酸結合。基於縮醛之連接體揭示於例如國際專利申請公開案第WO 2016/100401號中。在一些實施例中，該連接體為不穩定連接體。然而，在其他實施例中，該連接體為穩定連接體。
在一些實施例中，在靶向配位體(例如，GalNAc部分)與寡核苷酸之間提供雙鏈體延伸(例如，多達3、4、5或6 bp長)。在一些實施例中，本文中之寡核苷酸(例如，RNAi寡核苷酸)不具有結合於其之GalNAc。
在一些實施例中，寡核苷酸之有義鏈及反義鏈包含選自由以下組成之群的核苷酸序列：  (a) 分別地，SEQ ID NO: 25及26； (b) 分別地，SEQ ID NO: 27及28； (c) 分別地，SEQ ID NO: 29及30；及 (d) 分別地，SEQ ID NO: 31及32， 其中該寡核苷酸包含與核苷酸結合之至少一個GalNAc部分。 用於降低 α -1 抗胰蛋白酶表現之例示性寡核苷酸
在一些實施例中，本發明提供一種用於降低α-1抗胰蛋白酶表現之寡核苷酸(例如，RNAi寡核苷酸)，其中該寡核苷酸包含根據以下之有義鏈及反義鏈： 有義鏈：5’ -[mAs][mA][fA][mC][mC][mC][mU][fU][fU][fG][mU][fC][fU][mU][mC] [mU][fU][mA][mA][mA][mG][mC][mA][mG][mC][mC][ademG-GalNAc][ademA-GalNAc][ademA-GalNAc][ademA-GalNAc][mG][mG][mC][mU][mG][mC]- 3’ (SEQ ID NO: 101)； 雜交至： 反義鏈：5’ [MePhosphonate-4O-mUs][fUs][fUs][mA][fA][mG][fA][mA][mG][mA] [mC][fA][mA][fA][mG][fG][mG][mU][fU][mUs][mGs][mG]-3’ (SEQ ID NO: 104)； 其中mX= 2’- O-甲基修飾之核苷酸，fX =2’-氟修飾之核苷酸，- S-= 硫代磷酸酯鍵，- = 磷酸二酯鍵，[MePhosphonate-4O-mX] = 5’-甲氧基膦酸酯-4-氧基修飾之核苷酸，且ademA-GalNAc = 附接至腺嘌呤核苷酸之GalNAc，且ademG-GalNAc = 附接至鳥嘌呤核苷酸之GalNAc。
在一些實施例中，寡核苷酸之有義鏈及反義鏈包含選自以下之核苷酸序列： (a) 分別地，SEQ ID No: 33及34； (b) 分別地，SEQ ID No: 35及36； (c) 分別地，SEQ ID No: 37及38； (d) 分別地，SEQ ID No: 39及40； (e) 分別地，SEQ ID No: 41及42； (f) 分別地，SEQ ID No: 43及44； (g) 分別地，SEQ ID No: 45及46； (h) 分別地，SEQ ID No: 47及48； (i) 分別地，SEQ ID No: 49及50； (j) 分別地，SEQ ID No: 51及52； (k) 分別地，SEQ ID No: 53及54； (l) 分別地，SEQ ID No: 55及56； (m) 分別地，SEQ ID No: 57及58； (n) 分別地，SEQ ID No: 59及60； (o) 分別地，SEQ ID No: 61及62； (p) 分別地，SEQ ID No: 63及64； (q) 分別地，SEQ ID No: 65及66； (r) 分別地，SEQ ID No: 67及68； (s) 分別地，SEQ ID No: 69及70； (t) 分別地，SEQ ID No: 71及72； (u) 分別地，SEQ ID No: 73及74； (v) 分別地，SEQ ID No: 75及76； (w) 分別地，SEQ ID No: 77及78； (x) 分別地，SEQ ID No: 79及80； (y) 分別地，SEQ ID No: 81及82； (z) 分別地，SEQ ID No: 83及84； (aa) 分別地，SEQ ID No: 85及86； (bb) 分別地，SEQ ID No: 87及88； (cc) 分別地，SEQ ID No: 89及90； (dd) 分別地，SEQ ID No: 91及92； (ee) 分別地，SEQ ID No: 93及94； (ff) 分別地，SEQ ID No: 95及96； (gg) 分別地，SEQ ID No: 97及98； (hh) 分別地，SEQ ID No: 99及100； (ii) 分別地，SEQ ID No: 101及102；及 (jj) 分別地，SEQ ID No: 103及104。
在一些實施例中，本發明提供一種寡核苷酸，其包含含有核苷酸序列SEQ ID No: 103之有義鏈及含有核苷酸序列SEQ ID NO: 104之反義鏈。
在一些實施例中，本發明提供一種寡核苷酸(例如，及RNAi寡核苷酸)，其包含含有核苷酸序列SEQ ID NO: 103之有義鏈及含有核苷酸序列SEQ ID NO: 104之反義鏈，其中該寡核苷酸係呈具有以下結構之結合物形式：
Figure 02_image034
Figure 02_image036
調配物
已針對寡核苷酸使用開發了多種調配物(例如，醫藥調配物)。例如，可使用調配物將寡核苷酸(例如，RNAi寡核苷酸)遞送至個體或細胞環境，該調配物使降解減至最少，促進遞送及/或攝取，或向該調配物中之寡核苷酸提供另一有益特性。在一些實施例中，本文提供包含降低α-1抗胰蛋白酶表現之寡核苷酸(例如，RNAi寡核苷酸)之組合物。此類組合物可適當地經調配，使得當投與至個體時，無論投與至標靶細胞之直接環境中抑或全身性投與，充足部分之寡核苷酸進入該細胞以降低α-1抗胰蛋白酶表現。可使用任何種類之合適寡核苷酸調配物來遞送如本文所揭示之用於降低α-1抗胰蛋白酶之寡核苷酸。在一些實施例中，在諸如磷酸鹽緩衝生理食鹽水溶液、脂質體、微胞結構及殼體之緩衝溶液中調配寡核苷酸。本文所述之寡核苷酸中的任一者不僅可作為核酸，而且可呈醫藥學上可接受之鹽形式提供。
可使用具有陽離子脂質之寡核苷酸調配物來促進將寡核苷酸轉染至細胞中。舉例而言，可使用諸如lipofectin、陽離子甘油衍生物及聚陽離子分子(例如，聚離胺酸)之陽離子脂質。合適脂質包括Oligofectamine、Lipofectamine (Life Technologies)、NC388 (Ribozyme Pharmaceuticals, Inc., Boulder, Colo.)或FuGene 6 (Roche)，其均可根據製造商之說明書來使用。
因此，在一些實施例中，調配物包含脂質奈米粒子。在一些實施例中，賦形劑包含脂質體、脂質、脂質複合物、微球、微粒、奈米球或奈米粒子，或可以其他方式經調配以投與至有需要之個體的細胞、組織、器官或身體(參見例如Remington: THE SCIENCE AND PRACTICE OF PHARMACY, 第22版, Pharmaceutical Press, 2013)。
在一些實施例中，本文中之調配物包含賦形劑。在一些實施例中，賦形劑向組合物賦予經改良之穩定性、經改良之吸收、經改良之溶解度及/或活性成分之治療增強。在一些實施例中，賦形劑為緩衝劑(例如，檸檬酸鈉、磷酸鈉、tris鹼或氫氧化鈉)或媒劑(例如，緩衝溶液、石蠟脂、二甲亞砜或礦物油)。在一些實施例中，使寡核苷酸凍乾以延長其儲存期限且接著在使用(例如，投與至個體)之前將其製成溶液。因此，包含本文所述之寡核苷酸中的任一者之組合物中之賦形劑可為凍乾保護劑(例如，甘露糖醇、乳糖、聚乙二醇或聚乙烯吡咯啶酮)或崩塌溫度調節劑(例如，葡聚糖、Ficoll™或明膠)。
在一些實施例中，將醫藥組合物調配成可與其預期投與途徑相容。投與途徑之實例包括非經腸(例如，靜脈內、肌肉內、腹膜內、皮內、皮下)、經口(例如，吸入)、經皮(例如，表面)、經黏膜及直腸投與。
適用於可注射用途之醫藥組合物包括無菌水溶液(其中水可溶)或分散液及用於臨時製備無菌可注射溶液或分散液之無菌粉末。對於靜脈內投與，合適載劑包括生理食鹽水、抑菌水、Cremophor EL™ (BASF, Parsippany, N.J.)或磷酸鹽緩衝生理食鹽水(PBS)。該載劑可以係含有例如水、乙醇、多元醇(例如，甘油、丙二醇及液體聚乙二醇及其類似物)及其合適混合物之溶劑或分散介質。在多種情況下，將較佳在組合物中包括等張劑，例如糖、多元醇(諸如甘露糖醇、山梨糖醇)、氯化鈉。可藉由將所需量之寡核苷酸倂入視需要具有上文所列舉之一成分或成分組合之所選溶劑中，隨後過濾滅菌來製備無菌可注射溶液。
在一些實施例中，組合物可含有至少約0.1%或更多治療劑(例如，用於降低α-1抗胰蛋白酶表現之RNAi寡核苷酸)，不過活性成分之百分率可在總組合物之重量或體積的約1%至約80%或更多之間。熟習此項技術者在製備此類醫藥調配物時將考慮諸如溶解度、生物可用性、生物半衰期、投與途徑、產品儲存期限以及其他藥理學考慮之因素，且因而，可需要多種劑量及治療方案。 使用方法 降低 α-1 抗胰蛋白酶表現
在一些實施例中，本發明提供用於使有效量的本文所提供之寡核苷酸(例如，RNAi寡核苷酸)接觸或遞送至細胞或細胞群體以降低α-1抗胰蛋白酶表現之方法。在一些實施例中，藉由量測細胞中α-1抗胰蛋白酶mRNA、α-1抗胰蛋白酶蛋白或α-1抗胰蛋白酶活性之量或水準的降低來確定α-1抗胰蛋白酶表現之降低。該等方法包括本文所述且一般技術者已知之彼等。
本文所提供之方法可用於任何適當細胞類型。在一些實施例中，細胞係表現α-1抗胰蛋白酶mRNA之任何細胞(例如，肝細胞)。在一些實施例中，細胞係獲自個體之原代細胞。在一些實施例中，原代細胞已經歷有限次數之傳代，使得該細胞實質上維持其天然表型特性。在一些實施例中，經遞送寡核苷酸之細胞係離體或活體外的(亦即，可遞送至培養中的細胞或該細胞所處之生物體)。
在一些實施例中，使用此項技術中已知之核酸遞送方法將本文中之寡核苷酸(例如，RNAi寡核苷酸)遞送至細胞或細胞群體，該遞送方法包括但不限於注射含有寡核苷酸之溶液、藉由經寡核苷酸覆蓋之粒子轟擊、使細胞或細胞群體暴露於含有寡核苷酸之溶液或在寡核苷酸存在下使細胞膜電穿孔。可使用此項技術中已知用於將寡核苷酸遞送至細胞之其他方法，諸如脂質介導之載劑轉運、化學品介導之轉運及陽離子脂質體轉染(諸如磷酸鈣)及其他方法。
在一些實施例中，藉由評估細胞或細胞群體中與α-1抗胰蛋白酶表現相關之一或多種分子、特性或特徵的分析或技術，或藉由評估直接指示細胞或細胞群體中之α-1抗胰蛋白酶表現之分子(例如，α-1抗胰蛋白酶mRNA或α-1抗胰蛋白酶蛋白)的分析或技術來測定α-1抗胰蛋白酶表現之降低。在一些實施例中，藉由將與本文所提供之寡核苷酸接觸的細胞或細胞群體中之α-1抗胰蛋白酶表現與適當對照(例如，未與該寡核苷酸接觸或與對照寡核苷酸接觸的適當細胞或細胞群體)比較來評估該寡核苷酸降低α-1抗胰蛋白酶表現之程度。在一些實施例中，預先確定對照細胞或細胞群體中之α-1抗胰蛋白酶表現的對照量或水準，使得無需在執行該分析或技術之每一種情形中量測對照量或水準。該預先確定之水準或值可採取多種形式。在一些實施例中，預先確定之水準或值可為單一截止值，諸如中值或平均值。
在一些實施例中，使本文所述之寡核苷酸(例如，RNAi寡核苷酸)接觸或遞送至細胞或細胞群體導致未與該寡核苷酸接觸或與對照寡核苷酸接觸的細胞或細胞群體中之α-1抗胰蛋白酶表現降低。在一些實施例中，相對於α-1抗胰蛋白酶表現之對照量或水準，α-1抗胰蛋白酶表現之降低為約1%或更低、約5%或更低、約10%或更低、約15%或更低、約20%或更低、約25%或更低、約30%或更低、約35%或更低、約40%或更低、約45%或更低、約50%或更低、約55%或更低、約60%或更低、約70%或更低、約80%或更低或約90%或更低。在一些實施例中，α-1抗胰蛋白酶表現之對照量或水準係尚未與本文中之寡核苷酸接觸的細胞或細胞群體中之α-1抗胰蛋白酶mRNA及/或α-1抗胰蛋白酶蛋白之量或水準。在一些實施例中，在任何有限時期或時間量(例如，分鐘、小時、天、週、月)之後評價根據本文中之方法將本文中之寡核苷酸遞送至細胞或細胞群體的效應。舉例而言，在一些實施例中，在使寡核苷酸接觸或遞送至細胞或細胞群體之後至少約4小時、約8小時、約12小時、約18小時、約24小時；或至少約1天、約2天、約3天、約4天、約5天、約6天、約7天、約8天、約9天、約10天、約11天、約12天、約13天、約14天、約21天、約28天、約35天、約42天、約49天、約56天、約63天、約70天、約77天或約84天或更長時間測定細胞或細胞群體中之α-1抗胰蛋白酶表現。在一些實施例中，在使寡核苷酸接觸或遞送至細胞或細胞群體之後至少約1個月、約2個月、約3個月、約4個月、約5個月或約6個月或更長時間測定細胞或細胞群體中之α-1抗胰蛋白酶表現。
在一些實施例中，本文所提供之寡核苷酸(例如，RNAi寡核苷酸)係呈轉殖基因之形式遞送，該轉殖基因經工程改造以在細胞中表現該寡核苷酸或構成該寡核苷酸之鏈(例如，其有義鏈及反義鏈)。在一些實施例中，使用經工程改造以表現本文所揭示之任何寡核苷酸之轉殖基因來遞送本文中之寡核苷酸。可使用病毒載體(例如，腺病毒、逆轉錄病毒、痘瘡病毒、痘病毒、腺相關病毒或單純皰疹病毒)或非病毒載體(例如，質體或合成mRNA)來遞送轉殖基因。在一些實施例中，可將轉殖基因直接地注射至個體。 治療方法
本發明提供用作藥劑、用於治療與α-1抗胰蛋白酶表現相關之疾病、病症及疾患之方法中的寡核苷酸(例如，RNAi寡核苷酸)。本發明亦提供用於或可調適用於治療將受益於降低α-1抗胰蛋白酶表現之個體(例如，患有與α-1抗胰蛋白酶表現相關之疾病、病症或疾患的人類)之寡核苷酸。在一些方面，本發明提供用於或經調適用於治療患有與α-1抗胰蛋白酶表現相關之疾病、病症或疾患的個體之寡核苷酸。本發明亦提供用於或可調適用於製造用於治療與α-1抗胰蛋白酶表現相關之疾病、病症或疾患的藥劑或醫藥組合物之寡核苷酸。在一些實施例中，供使用或可調適使用之寡核苷酸靶向α-1抗胰蛋白酶mRNA且降低α-1抗胰蛋白酶表現(例如，經由RNAi路徑)。在一些實施例中，供使用或可調適使用之寡核苷酸靶向α-1抗胰蛋白酶mRNA且降低α-1抗胰蛋白酶mRNA、α-1抗胰蛋白酶蛋白及/或α-1抗胰蛋白酶活性之量或水準。
另外，在本文中之方法的一些實施例中，選擇患有與α-1抗胰蛋白酶表現相關之疾病、病症或疾患或者易患該疾病、病症或疾患之個體用本文所提供之寡核苷酸(例如，RNAi寡核苷酸)進行治療。在一些實施例中，該方法包括選擇具有與α-1抗胰蛋白酶表現相關之疾病、病症或疾患的標記物(例如，生物標記物)或易於具有該標記物(諸如但不限於α-1抗胰蛋白酶mRNA、α-1抗胰蛋白酶蛋白或其組合)之個體。同樣，且如下文所詳述，由本發明提供之方法的一些實施例包括如下步驟，諸如量測或獲得α-1抗胰蛋白酶表現之標記物(例如，α-1抗胰蛋白酶mRNA)之基線值，及接著將該獲得值與一或多個其他基線值或在向個體投與寡核苷酸之後獲得的值比較以評價治療之有效性。
本發明亦提供用本文所提供之寡核苷酸治療患有、疑似患有與α-1抗胰蛋白酶表現相關之疾病、病症或疾患或處於發展該疾病、病症或疾患的風險下之個體之方法。在一些態樣中，本發明提供使用本文中之寡核苷酸來治療或減弱與α-1抗胰蛋白酶表現相關之疾病、病症或疾患的發作或進展之方法。在其他態樣中，本發明提供使用本文所提供之寡核苷酸在患有與α-1抗胰蛋白酶表現相關之疾病、病症或疾患的個體中實現一或多種治療益處之方法。在本文中之方法的一些實施例中，藉由投與治療有效量之本文所提供之寡核苷酸中的任一者或多者來治療該個體。在一些實施例中，治療包括降低α-1抗胰蛋白酶表現。在一些實施例中，對該個體進行治療性治療。在一些實施例中，對該個體進行預防性治療。
在一些實施例中，患有與α-1抗胰蛋白酶表現相關之疾病、病症或疾患之患者包含至少一種突變型等位基因。突變型等位基因係遺傳的且因此，患者可具有編碼α-1抗胰蛋白酶之突變型等位基因的一或兩個複本。M基因/等位基因係α-1抗胰蛋白酶基因之最常見等位基因且其產生正常水準之α-1抗胰蛋白酶蛋白。Z基因/等位基因係該基因之最常見變異體且引起α-1抗胰蛋白酶缺乏。在一些實施例中，Z等位基因係歸因於E342K突變之存在。S基因/等位基因係引起α-1抗胰蛋白酶缺乏之另一種不太常見的變異體。在一些實施例中，S等位基因係歸因於E264V突變之存在。
在一些實施例中，與α-1抗胰蛋白酶表現相關之疾病、病症或疾患係歸因於Z等位基因之一複本及M等位基因之一複本的存在(亦即，Z等位基因雜合子，稱作PiMZ患者)。在一些實施例中，與α-1抗胰蛋白酶表現相關之疾病、病症或疾患係歸因於Z等位基因之兩個複本的存在(亦即，Z等位基因純合子，稱作PiZZ患者)。在一些實施例中，與α-1抗胰蛋白酶表現相關之疾病、病症或疾患係歸因於S等位基因之一複本及M等位基因之一複本的存在(亦即，S等位基因雜合子，稱作PiSZ患者)。
在本文中之方法的一些實施例中，將一或多種本文中之寡核苷酸(例如，RNAi寡核苷酸)或包含一或多種寡核苷酸之醫藥組合物投與至患有與α-1抗胰蛋白酶表現相關之疾病、病症或疾患的個體，使得該個體中之α-1抗胰蛋白酶表現降低，藉此治療該個體。在一些實施例中，該個體中之α-1抗胰蛋白酶mRNA之量或水準降低。在一些實施例中，該個體中之α-1抗胰蛋白酶蛋白之量或水準降低。在一些實施例中，該個體中之α-1抗胰蛋白酶活性之量或水準降低。
在本文中之方法的一些實施例中，將本文所提供之寡核苷酸(例如，RNAi寡核苷酸)或包含該寡核苷酸之醫藥組合物投與至患有與α-1抗胰蛋白酶相關之疾病、病症或疾患的個體，使得當與投與一或多種寡核苷酸或醫藥組合物之前的α-1抗胰蛋白酶表現相比時，該個體中之α-1抗胰蛋白酶表現降低達至少約30%、約35%、約40%、約45%、約50%、約55%、約60%、約65%、約70%、約75%、約80%、約85%、約90%、約95%、約99%或超過99%。在一些實施例中，當與未接受該一或多種寡核苷酸或醫藥組合物或接受一或多種對照寡核苷酸、醫藥組合物或治療之個體(例如，參考或對照個體)中的α-1抗胰蛋白酶表現相比時，該個體中之α-1抗胰蛋白酶表現降低達至少約30%、約35%、約40%、約45%、約50%、約55%、約60%、約65%、約70%、約75%、約80%、約85%、約90%、約95%、約99%或超過99%。
在本文中之方法的一些實施例中，將一或多種本文中之寡核苷酸(例如，RNAi寡核苷酸)或包含該一或多種寡核苷酸之醫藥組合物投與至患有與α-1抗胰蛋白酶表現相關之疾病、病症或疾患的個體，使得當與投與該寡核苷酸或醫藥組合物之前的α-1抗胰蛋白酶mRNA之量或水準相比時，該個體中之α-1抗胰蛋白酶mRNA之量或水準降低達至少約30%、約35%、約40%、約45%、約50%、約55%、約60%、約65%、約70%、約75%、約80%、約85%、約90%、約95%、約99%或超過99%。在一些實施例中，當與未接受該一或多種寡核苷酸或醫藥組合物或接受一或多種對照寡核苷酸、醫藥組合物或治療之個體(例如，參考或對照個體)中的α-1抗胰蛋白酶mRNA之量或水準相比時，該個體中之α-1抗胰蛋白酶mRNA之量或水準降低達至少約30%、約35%、約40%、約45%、約50%、約55%、約60%、約65%、約70%、約75%、約80%、約85%、約90%、約95%、約99%或超過99%。
在本文中之方法的一些實施例中，將一或多種本文中之寡核苷酸或包含該一或多種寡核苷酸之醫藥組合物投與至患有與α-1抗胰蛋白酶表現相關之疾病、病症或疾患的個體，使得當與投與該寡核苷酸或醫藥組合物之前的α-1抗胰蛋白酶蛋白之量或水準相比時，該個體中之α-1抗胰蛋白酶蛋白之量或水準降低達至少約30%、約35%、約40%、約45%、約50%、約55%、約60%、約65%、約70%、約75%、約80%、約85%、約90%、約95%、約99%或超過99%。在一些實施例中，當與未接受該一或多種寡核苷酸或醫藥組合物或接受一或多種對照寡核苷酸或醫藥組合物或治療之個體(例如，參考或對照個體)中的α-1抗胰蛋白酶蛋白之量或水準相比時，該個體中之α-1抗胰蛋白酶蛋白之量或水準降低達至少約30%、約35%、約40%、約45%、約50%、約55%、約60%、約65%、約70%、約75%、約80%、約85%、約90%、約95%、約99%或超過99%。
在本文中之方法的一些實施例中，將一或多種本文中之寡核苷酸(例如，RNAi寡核苷酸)或包含該一或多種寡核苷酸之醫藥組合物投與至患有與α-1抗胰蛋白酶相關之疾病、病症或疾患的個體，使得當與投與該寡核苷酸或醫藥組合物之前的α-1抗胰蛋白酶活性之量或水準相比時，該個體中之α-1抗胰蛋白酶活性/表現之量或水準降低達至少約30%、約35%、約40%、約45%、約50%、約55%、約60%、約65%、約70%、約75%、約80%、約85%、約90%、約95%、約99%或超過99%。在一些實施例中，當與未接受該寡核苷酸或醫藥組合物或接受對照寡核苷酸、醫藥組合物或治療之個體(例如，參考或對照個體)中的α-1抗胰蛋白酶活性之量或水準相比時，該個體中之α-1抗胰蛋白酶活性之量或水準降低達至少約30%、約35%、約40%、約45%、約50%、約55%、約60%、約65%、約70%、約75%、約80%、約85%、約90%、約95%、約99%或超過99%。
在本文中之方法的一些實施例中，將一或多種本文中之寡核苷酸(例如，RNAi寡核苷酸)或包含該一或多種寡核苷酸之醫藥組合物投與至患有與α-1抗胰蛋白酶相關之疾病、病症或疾患的個體，使得與投與之前的天冬胺酸轉胺酶(AST)水準相比，AST有所降低。在本文中之方法的一些實施例中，將一或多種本文中之寡核苷酸(例如，RNAi寡核苷酸)或包含該一或多種寡核苷酸之醫藥組合物投與至患有與α-1抗胰蛋白酶相關之疾病、病症或疾患的個體，使得與投與之前的丙胺酸轉胺酶(ALT)水準相比，ALT有所降低。在本文中之方法的一些實施例中，將一或多種本文中之寡核苷酸(例如，RNAi寡核苷酸)或包含該一或多種寡核苷酸之醫藥組合物投與至患有與α-1抗胰蛋白酶相關之疾病、病症或疾患的個體，使得與投與之前的鹼性磷酸酶水準相比，鹼性磷酸酶有所降低。
用於測定個體或來自個體之樣品中的α-1抗胰蛋白酶表現、α-1抗胰蛋白酶mRNA、α-1抗胰蛋白酶蛋白、α-1抗胰蛋白酶活性或與α-1抗胰蛋白酶表現之調節相關或受該調節影響之生物標記物(例如，血漿生物標記物)之量或水準的合適方法係此項技術中已知的。此外，本文所陳述之實例說明用於測定α-1抗胰蛋白酶表現之方法。
在一些實施例中，在自個體獲得或分離之細胞(例如，肝細胞)、細胞群體或組(例如，類器官)、器官(例如，肝臟)、血液或其一部分(例如，血漿)、組織(例如，肝臟組織)、樣品(例如，肝臟生檢樣品)或任何其他適當生物材料中，α-1抗胰蛋白酶表現、α-1抗胰蛋白酶mRNA、α-1抗胰蛋白酶蛋白、α-1抗胰蛋白酶活性或與α-1抗胰蛋白酶表現之調節相關或受該調節影響之生物標記物或其任何組合之量或水準有所降低。在一些實施例中，在超過一種類型之細胞(例如，肝細胞及一或多種其他類型之細胞)、超過一組細胞、超過一個器官(例如，肝臟及一或多個其他器官)、超過一部分血液(例如，血漿及一或多個其他血液部分)、超過一種類型之組織(例如，肝臟組織及一或多種其他類型之組織)或超過一種類型之樣品(例如，肝臟生檢樣品及一或多種其他類型之生檢樣品)中，α-1抗胰蛋白酶表現、α-1抗胰蛋白酶mRNA、α-1抗胰蛋白酶蛋白、α-1抗胰蛋白酶活性或與α-1抗胰蛋白酶表現之調節相關或受該調節影響之生物標記物或其任何組合之量或水準有所降低。
由於其高特異性，本文所提供之寡核苷酸(例如，dsRNAi寡核苷酸)特異性地靶向細胞及組織或器官(例如，肝臟)之標靶基因之mRNA (例如，α-1抗胰蛋白酶mRNA)。在預防疾病時，該標靶基因可以係起始或維持疾病所需之基因，或已經鑑別為與感染疾病之較高風險相關的基因。在治療疾病時，可使寡核苷酸與展現疾病或負責介導疾病之細胞、組織或器官(例如，肝臟)接觸。舉例而言，可使與病症或疾患(與α-1抗胰蛋白酶表現相關)所相關之野生型(亦即，原生)或突變基因之全部或一部分實質上一致的寡核苷酸(例如，RNAi寡核苷酸)與所關注之細胞或組織類型(諸如肝細胞或其他肝臟細胞)接觸或將該寡核苷酸引入其中。
在一些實施例中，標靶基因可為來自任何哺乳動物之標靶基因，諸如人類標靶。可根據本文所述之方法使任何標靶基因沈默。
本文所述之方法典型地涉及向個體投與有效量的本文中之寡核苷酸(例如，RNAi寡核苷酸)，即，產生或生成所需治療結果之量。治療學上可接受之量可為治療性地治療疾病或病症之量。用於任一個體之適當劑量將取決於某些因素，包括個體之體型、體表面積、年齡、欲投與之組合物、組合物中之活性成分、投與時間及途徑、一般健康狀況及並行地投與之其他藥物。
在一些實施例中，經腸(例如，經口、藉由胃飼管、藉由十二指腸飼管、經由胃造口術或經直腸)、非經腸(例如，皮下注射、靜脈內注射或輸注、動脈內注射或輸注、骨內輸注、肌肉內注射、腦內注射、腦室內注射、鞘內)、經表面(例如，經皮、吸入、經由滴眼劑或經由黏膜)或藉由直接注射至標靶器官(例如，個體之肝臟)中向個體投與本文所揭示之組合物中的任一者(例如，包含本文所述之RNAi寡核苷酸之組合物)。典型地，經靜脈內或皮下投與本文中之寡核苷酸。
在一些實施例中，單獨或組合投與本文中之寡核苷酸(例如，RNAi寡核苷酸)或包含該寡核苷酸之醫藥組合物。在一些實施例中，並行地、依序(以任何次序)或間歇地組合投與本文中之寡核苷酸。例如，可並行地共投與兩種寡核苷酸。或者，可投與一種寡核苷酸且在任何時間量(例如，一小時、一天、一週或一個月)之後，投與第二種寡核苷酸。
在一些實施例中，欲治療之個體為人類或非人類靈長類動物或其他哺乳動物個體。其他例示性個體包括馴養動物，諸如犬及貓；家畜，諸如馬、牛、豬、綿羊、山羊及雞；及動物，諸如小鼠、大鼠、豚鼠及倉鼠。 套組
在一些實施例中，本發明提供一種套組，其包含本文中之寡核苷酸(例如，RNAi寡核苷酸)及使用說明書。在一些實施例中，該套組包含本文中之寡核苷酸，及含有該套組及/或其任何組分之使用說明書之包裝插頁。在一些實施例中，該套組在合適容器中包含本文中之寡核苷酸、一或多種對照以及此項技術中熟知之多種緩衝液、試劑、酶及其他標準成分。在一些實施例中，該容器包含至少一個小瓶、孔、試管、燒瓶、瓶、注射器或其他容器構件，該寡核苷酸置於其中且在一些情況下適當地經等分。在其中提供額外組分之一些實施例中，該套組含有額外容器，此組分置於其中。該等套組亦可包括用於密封容納該寡核苷酸及任何其他試劑以供商業銷售之構件。此類容器可包括其中保留所需小瓶之注射或吹塑成型塑膠容器。容器及/或套組可包括帶有使用說明書及/或警告之標籤。
在一些實施例中，套組包含本文中之寡核苷酸(例如，RNAi寡核苷酸)及醫藥學上可接受之載劑或包含該寡核苷酸之醫藥組合物，以及關於治療有需要之個體的與α-1抗胰蛋白酶表現相關之疾病、病症或疾患或延遲其進展之說明書。 定義
如本文所用，術語「反義寡核苷酸」涵蓋基於核酸之分子，該分子具有與標靶mRNA之全部或一部分互補的序列，詳言之種子序列，由此能夠與mRNA形成雙鏈體。因此，如本文所用，術語「反義寡核苷酸」可稱作「基於互補核酸之抑制劑」。
如本文所用，如應用於一或多個所關注之值的「大約」或「約」係指類似於所陳述之參考值的值。在一些實施例中，除非另有規定或自上下文另外顯而易見(除非此類數字將超過可能值之100%)，否則「約」係指處於在任一方向上(大於或小於)所陳述之參考值之25%、20%、19%、18%、17%、16%、15%、14%、13%、12%、11%、10%、9%、8%、7%、6%、5%、4%、3%、2%、1%或更小值以內之值的範圍。
如本文所用，「投與(administer)」、「投與(administering)」、「投與(administration)」及其類似術語係指以藥理學上有用(例如，以治療個體之疾病、病症或疾患)之方式向個體提供物質(例如，寡核苷酸)。
如本文所用，「減弱(attenuate)」、「減弱(attenuating)」、「減弱(attenuation)」及其類似術語係指降低或有效地停止。作為非限制性實例，本文中之一或多種治療可降低或有效地停止肝臟及/或肺部疾病之發作或進展。肝臟疾病包括但不限於慢性肝臟疾病、肝臟發炎、肝硬化、肝臟纖維化及/或肝細胞癌，且肺部疾病包括但不限於個體之哮喘、支氣管擴張、呼吸衰竭、脈管炎、肺部發炎、慢性阻塞性肺病(COPD)、肺氣腫。此減弱可藉由以下例示：例如，慢性肝臟疾病、肝臟發炎、肝硬化、肝臟纖維化、肝細胞癌、肺部發炎、慢性阻塞性肺病(COPD)及/或肺氣腫之一或多個態樣(例如，症狀、組織特徵及細胞、發炎或免疫活性等)的減少，慢性肝臟疾病、肝臟發炎、肝硬化、肝臟纖維化、肝細胞癌、肺部發炎、慢性阻塞性肺病(COPD)及/或肺氣腫之一或多個態樣無可偵測進展(惡化)，或個體中無慢性肝臟疾病、肝臟發炎、肝硬化、肝臟纖維化、肝細胞癌、肺部發炎、慢性阻塞性肺病(COPD)及/或肺氣腫之可偵測態樣(當在其他方面可能期望該等態樣時)。
如本文所用，「互補」係指兩個核苷酸之間的結構關係(例如，在兩個相對核酸上或在單一核酸鏈之相對區域上)，其允許該兩個核苷酸彼此形成鹼基對。舉例而言，與相對核酸之嘧啶核苷酸互補的一個核酸之嘌呤核苷酸可藉由彼此形成氫鍵而一起鹼基配對。在一些實施例中，互補核苷酸可以Watson-Crick方式或以允許形成穩定雙鏈體之任何其他方式鹼基配對。在一些實施例中，如本文所述，兩個核酸可具有彼此互補以形成互補區域之多個核苷酸之區域。
如本文所用，「去氧核糖核苷酸」係指當與核糖核苷酸相比時，在其戊糖之2′位置具有替代羥基之氫的核苷酸。經修飾之去氧核糖核苷酸係除2'位置以外具有一或多個原子修飾或取代之去氧核糖核苷酸，包括糖、磷酸酯基或鹼基內部或本身之修飾或取代。
如本文所用，「雙鏈寡核苷酸」或「ds寡核苷酸」係指實質上呈雙鏈體形式之寡核苷酸。在一些實施例中，在共價分離之核酸鏈之核苷酸的反平行序列之間形成雙鏈寡核苷酸之雙鏈體區域的互補鹼基配對。在一些實施例中，在共價連接之核酸鏈之核苷酸的反平行序列之間形成雙鏈寡核苷酸之雙鏈體區域的互補鹼基配對。在一些實施例中，由折疊(例如，經由髮夾)之單一核酸鏈形成雙鏈寡核苷酸之雙鏈體區域的互補鹼基配對，以提供一起鹼基配對之核苷酸之互補反平行序列。在一些實施例中，雙鏈寡核苷酸包含彼此完全呈雙鏈之兩條共價分離之核酸鏈。然而，在一些實施例中，雙鏈寡核苷酸包含部分呈雙鏈(例如，在一端或兩端具有懸垂物)之兩條共價分離之核酸鏈。在一些實施例中，雙鏈寡核苷酸包含部分互補之核苷酸之反平行序列，且因此可具有一或多個錯配，其可包括內部錯配或末端錯配。
如本文所用，關於核酸(例如，寡核苷酸)之「雙鏈體」係指經由核苷酸之兩個反平行序列之互補鹼基配對形成的結構。
如本文所用，「賦形劑」係指可包括於組合物中之非治療劑，例如，以提供或有助於所需稠度或穩定效應。
如本文所用，「肝細胞(hepatocyte)」或「肝細胞(hepatocytes)」係指肝臟實質組織之細胞。此等細胞佔肝臟之質量的約70%-85%且製造血清白蛋白、FBN以及凝血因子(因子3及4除外)之凝血酶原組。肝細胞譜系細胞之標記物包括但不限於轉甲狀腺素蛋白(Ttr)、麩醯胺合成酶(Glul)、肝細胞核因子1a (Hnf1a)及肝細胞核因子4a (Hnf4a)。成熟肝細胞之標記物可包括但不限於細胞色素P450 (Cyp3a11)、反丁烯二醯乙醯乙酸水解酶(Fah)、葡萄糖6-磷酸(G6p)、白蛋白(Alb)及OC2-2F8。參見例如Huch等人 (2013) Nature 494:247-50。
如本文所用，「肝毒劑」係指本身對肝臟具有毒性或可經加工以形成對肝臟具有毒性之代謝物之化合物、病毒或其他物質。肝毒劑可包括但不限於四氯化碳(CCl 4)、乙醯胺酚(對乙醯胺基酚)、氯乙烯、砷、氯仿、非類固醇消炎藥(諸如阿司匹靈及苯丁唑酮)。
如本文所用，術語「SERPINA1」或「A1AT」或「α1-抗胰蛋白酶」係指屬於serpin超家族之蛋白酶抑制劑。除非另外規定，否則術語「SERPINA1」意欲指所有同功型。「SERPINA1」亦可指編碼該蛋白質之基因。其一般係稱作血清胰蛋白酶抑制劑。α1-抗胰蛋白酶亦稱作α-1蛋白酶抑制劑(A1PI)，因為其抑制多種蛋白酶(Gettins P G. Chem Rev 102: 4751-04)。其保護組織免受發炎細胞之酶、尤其嗜中性球彈性蛋白酶侵害，且在血液中之參考範圍為1.5-3.5公克/公升，但在急性發炎時可出現多倍升高之水準(Kushner, Mackiewicz, Acute-phase glycoproteins: molecular biology, biochemistry, and clinical applications,(CRC Press). 第3-19頁)。在AAT不存在下，嗜中性球彈性蛋白酶自由分解促進肺彈性之彈性蛋白，從而引起呼吸倂發症，諸如成人肺氣腫或慢性阻塞性肺病(COPD)及成人或兒童肝硬化。在AAT基因之一或兩個複本中具有突變之個體可罹患α-1抗胰蛋白酶缺乏，其表現為由於肺及肝臟中高於正常的彈性蛋白酶活性而發展肺氣腫或慢性肝臟疾病之風險。
如上文所提及，在與α-1抗胰蛋白酶表現相關之某些疾病狀態中，個體產生大量α-1抗胰蛋白酶，但一部分所產生之α-1抗胰蛋白酶蛋白係經錯誤折疊，或者含有危害該蛋白質之功能的突變。在某些此類情況下，該個體產生經錯誤折疊之蛋白質，該等蛋白質無法正確地自合成位點轉運至體內作用位點。
此類經錯誤折疊之蛋白質可引起由α-1抗胰蛋白酶缺乏導致的肝臟疾病。α-1抗胰蛋白酶之突變體形式(例如常見PiZ變異體，其在位置342 (預加工形式中之位置366)處具有麩胺酸至離胺酸突變)係在肝臟細胞中產生(肝臟中之肝細胞通常產生大量循環AAT)，且在經錯誤折疊之組態中，此類形式不容易自該等細胞中轉運出。這導致經錯誤折疊之蛋白質積累於肝臟細胞中且可引起一或多種肝臟疾病或病症，包括但不限於慢性肝臟疾病、肝臟發炎、肝硬化、肝臟纖維化及/或肝細胞癌。
如本文所用，「不穩定連接體」係指可裂解(例如，由酸性pH)之連接體。「相當穩定之連接體」係指無法裂解之連接體。
如本文所用，「肝臟發炎」或「肝炎」係指其中肝臟變得腫脹、功能障礙及/或疼痛之身體狀況，尤其由於損傷或感染而引起，如可能由暴露於肝毒劑而引起。症狀可包括黃疸(皮膚或眼睛變黃)、疲勞、虛弱、噁心、嘔吐、食慾減退及體重減輕。肝臟發炎若不進行治療，則可進展為纖維化、肝硬化、肝臟衰竭或肝癌。
如本文所用，「肝臟纖維化(liver fibrosis)」 「肝臟纖維化(Liver Fibrosis)」或「肝臟纖維化(fibrosis of the liver)」係指細胞外基質蛋白在肝臟中之過度積聚，該等蛋白可能包括膠原(I、III及IV)、FBN、粗纖維調節素、彈性蛋白、層連接蛋白、玻尿酸及由發炎及肝臟細胞死亡產生之蛋白多醣。肝臟纖維化若不進行治療，則可進展為肝硬化、肝臟衰竭或肝癌。
如本文所用，「環」係指核酸(例如，寡核苷酸)之未配對區域，該區域側接該核酸中彼此充分互補之兩個反平行區域，使得在適當雜交條件下(例如，在磷酸鹽緩衝液中、在細胞中)，側接該未配對區域之兩個反平行區域雜交形成雙鏈體(稱作「莖」)。
如本文所用，「代謝症候群』或「代謝肝臟疾病」係指以一組相關醫學疾患及相關病理為特徵之病症，包括但不限於以下醫學疾患：腹部肥胖、血壓升高、空腹血糖升高、高血清三酸甘油酯、肝臟纖維化及低水準之高密度脂蛋白(HDL)水準。如本文所用，術語代謝症候群或代謝肝臟疾病可涵蓋與代謝症候群及代謝肝臟疾病相關之多種直接及間接表現、疾病及病理，在整個文件中使用擴展之疾患清單。
如本文所用，「經修飾之核苷酸間鍵」係指當與包含磷酸二酯鍵之參考核苷酸間鍵相比時，具有一或多個化學修飾之核苷酸間鍵。在一些實施例中，經修飾之核苷酸係非天然存在之鍵。典型地，經修飾之核苷酸間鍵向其中存在該經修飾之核苷酸間鍵的核酸賦予一或多種所需特性。舉例而言，經修飾之核苷酸間鍵可改良熱穩定性、降解抗性、核酸酶抗性、溶解度、生物可用性、生物活性、降低之免疫原性等。
如本文所用，「經修飾之核苷酸」係指當與選自以下之相應參考核苷酸相比時具有一或多個化學修飾之核苷酸：腺嘌呤核糖核苷酸、鳥嘌呤核糖核苷酸、胞嘧啶核糖核苷酸、尿嘧啶核糖核苷酸、腺嘌呤去氧核糖核苷酸、鳥嘌呤去氧核糖核苷酸、胞嘧啶去氧核糖核苷酸及胸苷去氧核糖核苷酸。在一些實施例中，經修飾之核苷酸係非天然存在之核苷酸。在一些實施例中，經修飾之核苷酸在其糖、核鹼基及/或磷酸酯基中具有一或多個化學修飾。在一些實施例中，經修飾之核苷酸具有與相應參考核苷酸結合之一或多個化學部分。典型地，經修飾之核苷酸向其中存在該經修飾之核苷酸的核酸賦予一或多種所需特性。舉例而言，經修飾之核苷酸可改良熱穩定性、降解抗性、核酸酶抗性、溶解度、生物可用性、生物活性、降低之免疫原性等。
如本文所用，「帶缺口之四環結構」係指RNAi寡核苷酸之結構，其特徵在於分離之有義(過客)及反義(向導)鏈，其中有義鏈具有與反義鏈互補之區域，且其中該等鏈中之至少一者(一般為有義鏈)具有經組態以穩定在該至少一條鏈內形成之相鄰莖區域的四環。
如本文所用，「寡核苷酸」係指短核酸(例如，少於約100個核苷酸長)。寡核苷酸可為單鏈(ss)或ds。寡核苷酸可能具有或可能不具有雙鏈體區域。作為一組非限制性實例，寡核苷酸可為但不限於小干擾RNA (siRNA)、微小RNA (miRNA)、短髮夾RNA (shRNA)、切丁酶受質干擾RNA (DsiRNA)、反義寡核苷酸、短siRNA或ss siRNA。在一些實施例中，雙鏈(dsRNA)為RNAi寡核苷酸。
如本文所用，「懸垂物」係指由一條鏈或一個區域延伸超出與該一條鏈或一個區域形成雙鏈體之互補鏈之末端產生的末端非鹼基配對核苷酸。在一些實施例中，懸垂物包含自寡核苷酸之5′末端或3′末端之雙鏈體區域延伸的一或多個未配對核苷酸。在一些實施例中，該懸垂物係在寡核苷酸之反義鏈或有義鏈上的3′或5′懸垂物。
如本文所用，「磷酸酯類似物」係指模擬磷酸酯基之靜電及/或空間特性之化學部分。在一些實施例中，磷酸酯類似物位於寡核苷酸之5'末端核苷酸處以替代常常易於酶促移除之5'-磷酸酯。在一些實施例中，5'磷酸酯類似物含有磷酸酶抗性鍵。磷酸酯類似物之實例包括但不限於5'膦酸酯，諸如5'亞甲基膦酸酯(5′-MP)及5′-(E)-乙烯基膦酸酯(5′-VP)。在一些實施例中，寡核苷酸在5′-末端核苷酸處具有在糖之4′-碳位置處的磷酸酯類似物(稱作「4′-磷酸酯類似物」)。4′-磷酸酯類似物之實例為氧甲基膦酸酯，其中氧甲基之氧原子結合至糖部分(例如，在其4′-碳處)或其類似物。參見例如美國臨時專利申請案第62/383,207號(2016年9月2日申請)及第62/393,401號(2016年9月12日申請)。已開發針對寡核苷酸之5′端的其他修飾(參見例如國際專利申請案第WO 2011/133871號；美國專利第8,927,513號；及Prakash等人 (2015) Nucleic Acids Res.43:2993-3011)。
如本文所用，基因(例如，α-1抗胰蛋白酶)之「降低之表現」係指當與適當參考(例如，參考細胞、細胞群體、樣品或個體)相比時，細胞、細胞群體、樣品或個體中由該基因編碼的RNA轉錄物(例如，α-1抗胰蛋白酶mRNA)或蛋白質之量或水準減少及/或該基因的活性之量或水準減少。舉例而言，當與未經本文中之寡核苷酸(例如包含反義鏈之寡核苷酸，該反義鏈具有與包含α-1抗胰蛋白酶mRNA之核苷酸序列互補的核苷酸序列)處理之細胞相比時，使細胞與該寡核苷酸接觸之行為可導致α-1抗胰蛋白酶mRNA、蛋白質及/或活性之量或水準減少(例如，經由利用RNAi路徑使α-1抗胰蛋白酶mRNA降解)。同樣，且如本文所用，「降低表現」係指使基因(例如，α-1抗胰蛋白酶)之表現降低之行為。
如本文所用，「α-1抗胰蛋白酶表現降低」係指當與適當參考(例如，參考細胞、細胞群體、樣品或個體)相比時，細胞、細胞群體、樣品或個體中α-1抗胰蛋白酶mRNA、α-1抗胰蛋白酶蛋白及/或α-1抗胰蛋白酶活性之量或水準減少。
如本文所用，「互補區域」係指核酸(例如，寡核苷酸)之核苷酸序列，其與核苷酸之反平行序列充分互補，以允許在適當雜交條件下(例如，在磷酸鹽緩衝液中、在細胞中，等)，在核苷酸之兩個序列之間進行雜交。在一些實施例中，本文中之寡核苷酸包含具有與mRNA標靶序列互補之區域的靶向序列。
如本文所用，「核糖核苷酸」係指具有呈戊糖形式之核糖的核苷酸，在其2′位置處含有羥基。經修飾之核糖核苷酸係除2'位置以外具有一或多個原子修飾或取代之核糖核苷酸，包括核糖、磷酸酯基或鹼基內部或本身之修飾或取代。
如本文所用，「RNAi寡核苷酸」係指(a)具有有義鏈(過客)及反義鏈(向導)之雙鏈寡核苷酸，其中反義鏈或反義鏈之一部分由 Argonaute2 (Ago2)核酸內切酶用於標靶mRNA (例如，α-1抗胰蛋白酶mRNA)之裂解中，或(b)具有單一反義鏈之單鏈寡核苷酸，其中彼反義鏈(或彼反義鏈之一部分)由Ago2核酸內切酶用於標靶mRNA (例如，α-1抗胰蛋白酶mRNA)之裂解中。
如本文所用，「鏈」係指經由核苷酸間鍵(例如，磷酸二酯鍵或硫代磷酸酯鍵)連接在一起之單一相連核苷酸序列。在一些實施例中，鏈具有兩個自由端(例如，5′端及3′端)。
如本文所用，「個體」意謂任何哺乳動物，包括小鼠、兔及人類。在一些實施例中，該個體為人類或NHP。此外，「個體(individual)」或「患者」可與「個體(subject)」互換使用。
如本文所用，「合成」係指人工合成(例如，使用機器(例如，固態核酸合成器))或以其他方式不來源於通常產生分子之天然來源(例如，細胞或生物體)的核酸或其他分子。
如本文所用，「靶向配位體」係指選擇性地結合至所關注之組織或細胞的同源分子(例如，受體)，且可與另一物質結合以達成將該另一物質靶向至所關注之組織或細胞之目的之分子(例如，碳水化合物、胺基糖、膽固醇、多肽或脂質)。舉例而言，在一些實施例中，靶向配位體可與寡核苷酸結合以達成將該寡核苷酸靶向至所關注之特定組織或細胞之目的。在一些實施例中，靶向配位體選擇性地結合至細胞表面受體。因此，在一些實施例中，當與寡核苷酸結合時，靶向配位體經由選擇性結合至在特定細胞之表面上表現的受體及由該細胞內體內化包含該寡核苷酸、靶向配位體及受體之複合物而促進將該寡核苷酸遞送至該細胞。在一些實施例中，靶向配位體經由連接體與寡核苷酸結合，該連接體在細胞內化之後或期間裂解，使得自細胞中之靶向配位體釋放該寡核苷酸。
如本文所用，「四環」係指增加藉由核苷酸之側接序列之雜交形成的相鄰雙鏈體之穩定性之環。穩定性之增加可偵測為相鄰莖雙鏈體之熔融溫度(T m)的增加，該熔融溫度高於由隨機選擇之核苷酸序列組成的長度可相當之環之集合平均預期的相鄰莖雙鏈體之T m。舉例而言，四環可在10 mM Na 2HPO 4中向包含至少2個鹼基對(bp)長之雙鏈體的髮夾賦予至少約50℃、至少約55℃、至少約56℃、至少約58℃、至少約60℃、至少約65℃或至少約75℃之T m。在一些實施例中，四環可在10 mM NaH 2PO 4中向包含至少2個鹼基對(bp)長之雙鏈體的髮夾賦予至少約50℃、至少約55℃、至少約56℃、至少約58℃、至少約60℃、至少約65℃或至少約75℃之Tm。在一些實施例中，四環可藉由堆疊相互作用使相鄰莖雙鏈體中之bp穩定化。另外，四環中之核苷酸之間的相互作用包括但不限於非Watson-Crick鹼基配對、堆疊相互作用、氫鍵結及接觸相互作用(Cheong等人 (1990) Nature 346:680-82；Heus及Pardi (1991) Science 253:191-94)。在一些實施例中，四環包含3個至6個核苷酸或由3個至6個核苷酸組成且典型地為4個至5個核苷酸。在一些實施例中，四環包含3個、4個、5個或6個核苷酸或由3個、4個、5個或6個核苷酸組成，該等核苷酸可或可不經修飾(例如，其可或可不與靶向部分結合)。在一些實施例中，四環由4個核苷酸組成。任何核苷酸均可用於四環中且可如Cornish-Bowden (1985) Nucleic Acids Res. 13:3021-30中所述來使用針對此類核苷酸之標準IUPAC-IUB符號。例如，字母「N」可用於意謂任何鹼基均可處於彼位置中，字母「R」可用於顯示腺嘌呤(A)或鳥嘌呤(G)可處於彼位置中，且「B」可用於顯示胞嘧啶(C)、鳥嘌呤(G)或胸腺嘧啶(T)可處於彼位置中。四環之實例包括四環之UNCG家族(例如，UUCG)、四環之GNRA家族(例如，GAAA)及CUUG四環(Woese等人 (1990) Proc. Natl. Acad. Sci . USA87:8467-71；Antao等人 (1991) Nucleic Acids Res .19:5901-05)。DNA四環之實例包括四環之d(GNNA)家族(例如，d(GTTA)、四環之d(GNRA))家族、四環之d(GNAB)家族、四環之d(CNNG)家族及四環之d(TNCG)家族(例如，d(TTCG))。參見例如Nakano等人 (2002) Biochem .41:14281-92；Shinji等人 (2000) Nippon Kagakkai Koen Yokoshu 78:731。在一些實施例中，四環含於帶缺口之四環結構內。
如本文所用，「治療(treat)」或「治療(treating)」係指例如藉由向有需要之個體投與治療劑(例如，本文中之寡核苷酸)而向該個體提供照護的行為，以達成關於現有疾患(例如，疾病、病症)改良個體之健康及/或福祉之目的或者預防或減少疾患發生之可能性。在一些實施例中，治療涉及降低個體經歷之疾患(例如，疾病、病症)之至少一種徵象、症狀或促成因素之頻率或嚴重性。 實例 實例 1 ： RNAi 寡核苷酸之製備 寡核苷酸合成及純化
先前實例中所述之寡核苷酸(RNAi寡核苷酸)係使用本文所述之方法以化學方式合成的。一般地，使用如針對19-23聚體siRNA所述之固相寡核苷酸合成方法(參見例如Scaringe等人 (1990) Nucleic Acids Res .18:5433-41及Usman等人 (1987) J. Am. Chem. Soc .109:7845-45；亦參見美國專利第5,804,683號；第5,831,071號；第5,998,203號；第6,008,400號；第6,111,086號；第6,117,657號；第6,353,098號；第6,362,323號；第6,437,117號及第6,469,158號)，另外使用已知亞磷醯胺合成(參見例如Hughes及Ellington (2017) Cold Spring Harb Perspect Biol .9(1):a023812；以及Beaucage S.L.及Caruthers M.H., Studies on Nucleotide Chemistry V: Deoxynucleoside Phosphoramidites—A New Class of Key Intermediates for Deoxypolynucleotide Synthesis, Tetrahedron Lett. 1981;22:1859-62來合成RNAi寡核苷酸。
根據標準方法(Integrated DNA Technologies; Coralville, IA)合成個別RNA鏈且進行HPLC純化。舉例而言，使用固相亞磷醯胺化學來合成RNA寡核苷酸，使用標準技術(Damha及Olgivie (1993) Methods Mol. Biol .20:81-114；Wincott等人 (1995) Nucleic Acids Res. 23:2677-84)脫除保護基且在NAP-5管柱(Amersham Pharmacia Biotech; Piscataway, NJ)上去鹽。使用離子交換高效液相層析(IE-HPLC)，在Amersham Source 15Q管柱(1.0 cm×25 cm；Amersham Pharmacia Biotech)上使用15 min分步線性梯度來純化寡聚物。梯度自90:10緩衝液A:B至52:48緩衝液A:B變化，其中緩衝液A為100 mM Tris pH 8.5且緩衝液B為100 mM Tris pH 8.5、1 M NaCl。在260 nm下監測樣品且收集對應於全長寡核苷酸種類之峰，匯集，在NAP-5管柱上去鹽，且凍乾。
藉由毛細管電泳(CE)，在Beckman PACE 5000 (Beckman Coulter, Inc.; Fullerton, CA)上測定每種寡聚物之純度。CE毛細管具有100 μm內徑且含有ssDNA 100R凝膠(Beckman-Coulter)。典型地，將約0.6奈莫耳寡核苷酸注射至毛細管中，在444 V/cm之電場中電泳且藉由260 nm下之UV吸光度進行偵測。變性Tris-硼酸鹽-7 M-脲電泳緩衝液購自Beckman-Coulter。如藉由CE所評價，獲得至少90%純之寡核糖核苷酸，其用於下文所述之實驗中。根據製造商之推薦方案，在Voyager DE™ Biospectometry Work Station (Applied Biosystems; Foster City, CA)上藉由基質輔助雷射解吸附電離飛行時間(MALDI-TOF)質譜法驗證化合物身份。獲得所有寡聚物之相對分子質量，通常在預期分子質量之0.2%內。 雙鏈體之製備
將單鏈RNA寡聚物再懸浮(例如，以100 μM濃度)於由100 mM乙酸鉀、30 mM HEPES (pH 7.5)組成之雙鏈體緩衝液中。以等莫耳量混合互補有義鏈及反義鏈以產生例如50 μM雙鏈體之最終溶液。在RNA緩衝液(IDT)中將樣品加熱至100℃持續5′且在使用之前使其冷卻至室溫。將RNAi寡核苷酸儲存於-20℃下。將單鏈RNA寡聚物凍乾儲存或儲存於-80℃之無核酸酶水中。 表 1 ：靶向SERPINA1之DsiRNA (未經修飾)
SERPINA1 寡核苷酸名稱 描述 SEQ ID No.
SERPINA1-751 有義鏈 1
SERPINA1-751 反義鏈 2
SERPINA1-750 有義鏈 3
SERPINA1-750 反義鏈 4
SERPINA1-758 有義鏈 5
SERPINA1-758 反義鏈 6
SERPINA1-754 有義鏈 7
SERPINA1-754 反義鏈 8
SERPINA1-761 有義鏈 9
SERPINA1-761 反義鏈 10
SERPINA1-743 有義鏈 11
SERPINA1-743 反義鏈 12
SERPINA1-1036 有義鏈 13
SERPINA1-1036 反義鏈 14
SERPINA1-748 有義鏈 15
SERPINA1-748 反義鏈 16
SERPINA1-756 有義鏈 17
SERPINA1-756 反義鏈 18
SERPINA1-1035 有義鏈 19
SERPINA1-1035 反義鏈 20
SERPINA1-1228 有義鏈 21
SERPINA1-1228 反義鏈 22
SERPINA1-728 有義鏈 23
SERPINA1-728 反義鏈 24
SERPINA1-1459 有義鏈 25
SERPINA1-1459 反義鏈 26
SERPINA1-1416 有義鏈 27
SERPINA1-1416 反義鏈 28
SERPINA1-1096 有義鏈 29
SERPINA1-1096 反義鏈 30
SERPINA1-1471 有義鏈 31
SERPINA1-1471 反義鏈 32
使用 表 1中提供之寡核苷酸序列來產生包含帶缺口之四環結構之經修飾寡核苷酸，該帶缺口之四環結構具有36聚體過客鏈及22聚體向導鏈。特定言之， 表 3中提供之 SERPINA1RNAi寡核苷酸的過客鏈及向導鏈各自包含不同模式之經修飾核苷酸及硫代磷酸酯鍵(SEQ ID No: 33-102)。經修飾核苷酸及硫代磷酸酯鍵之模式說明如下： 模式 A(SM1047/ASM1508) 有義鏈：[mXs][mX][fX][mX][mX][mX][mX][fX][fX][fX][mX][fX][fX][mX][mX][mX][fX][mX][mX][mA][mG][mC][mA][mG][mC][mC][prgG-peg-GalNAc][prgA-peg-GalNAc][prgA-peg-GalNAc][prgA-peg-GalNAc][mG][mG][mC][mU][mG][mC] (SEQ ID NO: 112) 反義鏈：[Phosphonate-4O-mUs][fXs][fXs][mX][fX][mX][fX][fX][mX][fX][mX][fX][mX][fX] [mX][fX][mX][mX][fX][mXs][mGs][mG] 模式 B(SM988/ASM1266) 有義鏈：[mXs][mX][fX][mX][fX][mX][mX][fX][fX][fX][fX][mX][fX][mX][fX][mX][fX][mX][mX][mX][mG][mC][mA][mG][mC][mC][prgG-peg-GalNAc][prgA-peg-GalNAc][prgA-peg-GalNAc][prgA-peg-GalNAc][mG][mG][mC][mU][mG][mC] (SEQ ID NO: 113) 反義鏈：[Phosphonate-4O-mUs][fXs][fXs][mX][fX][mX][fX][mX][mX][fX][mX][mX] [mX][fX][mX][fX] [fX][mX][fX][mXs][mGs][mG] 模式 C(SM1218/ASM1508) 有義鏈：[mXs][mX][fX][mX][mX][mX][mX][fX][fX][fX][mX][fX][fX][mX] [mX][mX][fX][mX[mX][mA][mG][mC][mC][prgG-peg-GalNAc][prgA-peg-GalNAc][prgA-peg-GalNAc][prgA-peg-GalNAc][mG][mG][mC] (SEQ ID NO: 114) 反義鏈：[Phosphonate-4O-mUs][fXs][fXs][mX][fX][mX][fX][fX][mX][fX][mX][fX][mX] [fX][mX][fX][mX][mX][fX][mXs][mGs][mG] 模式 D(SM1178/ASM1266) 有義鏈：[mXs][mX][fX][mX][fX][mX][mX][fX][fX][fX][fX][mX][fX][mX][fX][mX][fX][mX][mX][mA][mG][mC][mC][prgG-peg-GalNAc][prgA-peg-GalNAc][prgA-peg-GalNAc][prgA-peg-GalNAc][mG][mG][mC] (SEQ ID NO: 115) 反義鏈：[Phosphonate-4O-mUs][fXs][fXs][mX][fX][mX][fX][mX][mX][fX][mX][mX] [mX][fX][mX][fX][fX][mX][fX][mXs][mGs][mG] 模式 E(SM1217/ASM1508) 有義鏈：[mXs][mX][fX][mX][mX][mX][mX][fX][fX][fX][mX][fX][fX][mX][mX][mX][fX][mX][mX][mX][mG][mC][mA][mG][mC][mC][ademG-GalNAc][ademA-GalNAc][ademA-GalNAc][ademA-GalNAc][mG][mG][mC][mU][mG][mC] (SEQ ID NO: 116) 反義鏈：[MePhosphonate-4O-mXs][fXs][fXs][mX][fX][mX][fX][fX][mX][fX][mX][fX][mX][fX][mX][fX][mX][mX][fX][mXs][mGs][mG] 模式 F(SM1217/ASM1704) 有義鏈：[mXs][mX][fX][mX][mX][mX][mX][fX][fX][fX][mX][fX][fX][mX][mX][mX][fX][mX][mX][mX][mG][mC][mA][mG][mC][mC][ademG-GalNAc][ademA-GalNAc][ademA-GalNAc][ademA-GalNAc][mG][mG][mC][mU][mG][mC] (SEQ ID NO: 116) 反義鏈：[MePhosphonate-4O-mXs][fXs][fXs][mX][fX][mX][fX][mX][mX][mX][mX][fX][mX][fX][mX][fX][mX][mX][fX][mXs][mGs][mG] 表 2.修飾鍵
符號 修飾 / 鍵
mX 2’- O-甲基修飾之核苷酸
fX 2’-氟修飾之核苷酸
-S- 硫代磷酸酯鍵
- 磷酸二酯鍵
[Phosphonate-4O-mX] 4’-膦酸酯-2’O-甲基修飾之核苷酸
[MePhosphonate-4O-mX] 4’-單甲基膦酸酯-2’-O-甲基修飾之核苷酸
[prgG-peg-GalNAc]或[prgA-peg-GalNAc] 經由聚乙二醇及炔丙基(炔)連接體與鳥嘌呤或腺嘌呤結合之N-乙醯基半乳糖胺(GalNAc)
[ademG-GalNAc]或[ademA-GalNAc] 經由胺基二乙氧基甲醇連接體與鳥嘌呤或腺嘌呤結合之GalNAc
表 3 ：靶向SERPINA1之經修飾寡核苷酸
SERPINA1 寡核苷酸 修飾模式 描述 SEQ ID NO.
SERPINA1-0751 模式A 有義鏈 33
反義鏈 34
SERPINA1-0750 模式A 有義鏈 35
反義鏈 36
SERPINA1-758 模式A 有義鏈 37
反義鏈 38
SERPINA1-0754 模式A 有義鏈 39
反義鏈 40
SERPINA1-0761 模式A 有義鏈 41
反義鏈 42
SERPINA1-0743 模式A 有義鏈 43
反義鏈 44
SERPINA1-1036 模式A 有義鏈 45
反義鏈 46
SERPINA1-0748 模式A 有義鏈 47
反義鏈 48
SERPINA1-0756 模式A 有義鏈 49
反義鏈 50
SERPINA1-1035 模式A 有義鏈 51
反義鏈 52
SERPINA1-1228 模式A 有義鏈 53
反義鏈 54
SERPINA1-0728 模式A 有義鏈 55
反義鏈 56
SERPINA1-1459 模式A 有義鏈 57
反義鏈 58
SERPINA1-1416 模式A 有義鏈 59
反義鏈 60
SERPINA1-1096 模式A 有義鏈 61
反義鏈 62
SERPINA1-1471 模式B 有義鏈 63
   反義鏈 64
SERPINA1-0728 模式B 有義鏈 65
反義鏈 66
SERPINA1-0743 模式B 有義鏈 67
反義鏈 68
SERPINA1-0748 模式B 有義鏈 69
反義鏈 70
SERPINA1-0750 模式B 有義鏈 71
反義鏈 72
SERPINA1-0751 模式B 有義鏈 73
反義鏈 74
SERPINA1-0754 模式B 有義鏈 75
反義鏈 76
SERPINA1-0756 模式B 有義鏈 77
反義鏈 78
SERPINA1-0758 模式B 有義鏈 79
反義鏈 80
SERPINA1-0761 模式B 有義鏈 81
反義鏈 82
SERPINA1-1035 模式B 有義鏈 83
反義鏈 84
SERPINA1-1036 模式B 有義鏈 85
反義鏈 86
SERPINA1-1228 模式B 有義鏈 87
反義鏈 88
SERPINA1-1096 模式B 有義鏈 89
反義鏈 90
SERPINA1-1416 模式B 有義鏈 91
反義鏈 92
SERPINA1-1459 模式B 有義鏈 106
反義鏈 107
SERPINA1-1459 模式C 有義鏈 93
反義鏈 94
SERPINA1-1096 模式C 有義鏈 108
反義鏈 109
SERPIN1A1-1416 模式C 有義鏈 110
反義鏈 111
SERPINA1-1096 模式D 有義鏈 95
反義鏈 96
SERPINA1-1416 模式D 有義鏈 97
反義鏈 98
SERPINA1-1459 模式D 有義鏈 99
反義鏈 100
SERPINA1-1459 模式E 有義鏈 101
反義鏈 102
SERPINA1-1459 模式F 有義鏈 103
反義鏈 104
實例 2 ： RNAi 寡核苷酸對活體外 A1AT/SERPINA1 表現之抑制
已開發與N-乙醯基半乳糖胺(GalNAc)結合之 SERPINA1特異性小干擾RNA (siRNA)。 SERPINA1RNAi寡核苷酸使用RNA干擾(RNAi)策略(McManus M. T.及P. A. Sharp. 2002. 'Gene silencing in mammals by small interfering RNAs', Nat Rev Genet, 3(10): 737-47)來降低具有α-1抗胰蛋白酶缺乏(A1ATD)之個體的肝臟中之 SERPINA1mRNA及突變型α-1抗胰蛋白酶(Z-AAT)蛋白積聚。此舉藉由使用與GalNAc結合之高度有效siRNA來實現，該siRNA在皮下(SC)投與之後由肝細胞選擇性地攝取以降低肝臟中之Z-AAT蛋白濃度。肝臟中聚集之Z-AAT蛋白的受損降解導致Z-AAT蛋白之毒性積聚及A1ATD相關肝臟疾病。藉由靶向 SERPINA1基因表現直接地降低Z-AAT蛋白水準因此具有提供治療益處之潛力。
此研究之目的係在人類肝癌細胞株HuH-7中比較活體外靶向人類 SERPINA1轉錄物之 SERPINA1RNAi寡核苷酸(具有修飾模式A-D)的活性。 材料及方法測試物件之製備
經由固相合成來製備 表 3中所述之 SERPINA1RNAi寡核苷酸，使用強陰離子交換層析(Chemgenes, Wilmington MA)進行純化。使用電噴霧電離質譜法(ESI MS)來確認序列一致性。藉由260 nm下之UV吸光度對RNA雙鏈體進行濃度標準化。 HuH-7 細胞之細胞培養及轉染
在具有10% FBS (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA)之DMEM (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA)中維持人類肝細胞癌細胞株HuH-7 (Japanese Collection of Research Bioresources JCRB, Japan)。使該等細胞維持於37℃及5% CO2下之潮濕培育箱中。在OptiMEM (ThermoFisher Scientific)中稀釋Lipofectamine RNAi MAX (ThermoFisher Scientific, Waltham, MA)及規定測試物件。使經稀釋之試劑與經稀釋之測試物件( 表 3)一起混合且在室溫下培育持續15分鐘以形成雙鏈體。將此複合物添加至細胞中且培育持續24小時。根據製造商之方案，使用Lipofectamine RNAiMAX (ThermoFisher Scientific)在OptiMEM培養基(ThermoFisher Scientific)中用3種濃度之規定測試物件對HuH-7細胞進行反向轉染。該等測試物件之最終濃度為1、0.1及0.01 nM。在96孔渠板(ThermoFisher Scientific)中，最終細胞濃度為2 × 10 4個細胞/孔。 RNA 提取及 cDNA 合成
在用轉染複合物進行24小時培育之後，用1X PBS洗滌細胞一次且接著使用iScript RT-qPCR溶解緩衝液(Bio-Rad, Hercules, CA)使其溶解。根據製造商之方案，使用高容量cDNA逆轉錄套組(Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA)對溶解產物中之RNA進行逆轉錄。 即時 qPCR 及數據分析
將合成cDNA用於使用iQ Power Mix (Bio-Rad, Hercules, CA)之定量PCR。引子及探針購自Integrated DNA Technology (Coralville, IA)。在CFX-384系統(Bio-Rad, Hercules, CA)上運行qPCR反應且使用DDC t)方法來分析數據。使基因表現數據針對模擬轉染之樣品標準化。 結果及結論
多種結合物在HuH-7細胞中顯示 SERPINA1表現之良好基因敲低( 圖 1)。 實例 3 ： SERPINA1-1459 在小鼠中之藥效學功效、劑量反應及持續時間之評估
基於 實例 2之結果，選擇具有有義鏈SEQ ID NO: 105及反義鏈SEQ ID NO: 25之SERPINA1-1459用於進一步研究。產生具有修飾模式F之SERPINA1-1459 (以SEQ ID NO: 103陳述之有義鏈及以SEQ ID NO: 104陳述之反義鏈，如 圖 2A中所描繪)。在此實例及以下實例中，「SERPINA1-1459」係指此等經修飾序列。特定言之，設計此研究以評估在單次皮下(SC)推注至α-1-抗胰蛋白酶缺乏(A1ATD)之PiZ小鼠模型之後經修飾SERPINA1-1459活性的藥效學功效、劑量反應及持續時間，該PiZ小鼠模型具有突變型人類 SERPINA1基因且表現人類Z-AAT蛋白。
特定言之，自使用小鼠建立之繁殖群落獲得表現肝人類Z-AAT蛋白之雄性PiZ小鼠，該等小鼠來自聖路易斯大學之J. Teckman博士實驗室所提供的菌株(Carlson等人， Accumulation of PiZ antitrypsin causes liver damage in transgenic mice, (1989年5月), Journal of Clinical Investigation 83(4):1183-90；Rudnick等人， HEPATOLOGY, 第39卷, 第4期, 2004)。使小鼠(4週齡)保持在特定無病原體之飼養條件下，可隨意取用實驗室食物及水。在研究開始時，將雄性PiZ小鼠隨機分為研究組(每組n=5)。
對於1、3或10 mg/kg劑量組，各測試物件分別在PBS中稀釋至0.1、0.3或1.0 mg/mL之濃度。基於在給藥當天(第1天)在SC投與之前得到的小鼠個體體重來計算劑量體積。使用拋棄式1.0 mL注射器將劑量調配物投與至小鼠背部。在研究第1天，小鼠接受0 (磷酸鹽緩衝生理食鹽水[PBS])、1、3或10 mg/kg SERPINA1-1459之單次皮下(SC)注射。以測試物件相等之體積及方法向媒劑對照小鼠投與PBS (10 mL/kg)。
在給藥之前且在整個研究中每週收集血液樣品(針對1及3 mg/kg劑量組持續8週且針對PBS及10 mg/kg劑量組持續10週)。控制參數係來自給藥前量測。自尾靜脈收集血液樣品。用來自人類A1AT SimpleStep ELISA套組(Abcam, Cambridge, MA)之98 μL稀釋劑NS預填充96孔v型底板之各孔。在加熱燈下對小鼠進行預加溫且接著將其置於限制器中。在尾靜脈中進行小穿刺且使用20 μL單一通道移液管來移除2 μL血液。使用200 μL單一通道移液管使樣品充分混合。等分樣品且儲存於-80℃下。藉由在血清樣品中進行酶聯免疫吸附劑分析(ELISA)來量測血清Z-AAT濃度(肝臟中之SERPINA1-1459活性的生物標記物)。
在分析當天，使血液樣品在冰上解凍且進一步稀釋於稀釋劑NS中(最終稀釋度：1:5,000)。根據製造商之說明書，使用用於偵測人類α1抗胰蛋白酶之市售ELISA套組(Abcam, Cambridge, MA, 目錄號ab189579)來量測Z-AAT蛋白在50 µL經稀釋血液中之濃度。藉由ELISA一式兩份分析樣品。在SERPINA1-1459處理之後循環Z-AAT蛋白濃度之降低係計算為循環Z-AAT蛋白濃度相對於給藥前及時間匹配之PBS Z-AAT蛋白濃度的減少百分比。
對於1 mg/kg 劑量組，SERPINA1-1459 ( 圖 2A)之投與導致循環Z-AAT蛋白濃度之強勁且劑量相關減少，其中在單一SC劑量之後1週出現最大降低，如 圖 2B所示。此時，與基線相比，循環Z-AAT蛋白濃度之最大減少為2.1倍(51%減少， P≤ 0.01)。對於3 mg/kg及10 mg/kg劑量組，循環Z-AAT蛋白濃度之最大降低係在單一SC劑量之後2週。此時，對於3 mg/kg及10 mg/kg劑量組，與基線相比，循環Z-AAT蛋白濃度之最大減少分別為6.6倍(85%減少)及33.3倍(97%減少) ( P＜ 0.0001，兩個組)。在1、3及10 mg/kg劑量組中，循環Z-AAT蛋白濃度在3、7或9週之後緩慢地恢復至基線濃度。據估計，SERPINA1-1459降低小鼠中之循環Z-AAT蛋白濃度之半最大有效劑量(ED 50)在PiZ小鼠中為1 mg/kg ( 圖 2C)。因此，就最大反應而言且就彼反應之持續時間而言，在SERPINA1-1459投與之後觀察到的循環Z-AAT水準降低均與劑量相關。
A1ATD患者之肝臟疾病的進展與Z-AAT在肝細胞中之進行性積聚有關。SERPINA1-1459具有產生有意義之治療介入的潛力以減慢、停止或可能逆轉PiZZ (重度α1-抗胰蛋白酶缺乏)患者之肝臟疾病之進展。因此，SERPINA1-1459可代表針對患有肝臟疾病之PiZZ患者的挽救生命之治療介入。 實例 4 ：在用 SERPINA1-1459 處理之後針對 A1ATD 相關肝臟疾病表型之肝人類 Z-AAT 基因敲低的功效之評估
為了評估針對A1ATD相關肝臟疾病表型之人類Z-AAT基因敲低的功效，在雄性及雌性PiZ小鼠中評估SERPINA1-1459功效(如 實例 3中所述)。
特定言之，使小鼠(5-49週齡)保持在特定無病原體之飼養條件下，可隨意取用實驗室食物及水。最初共有44隻PiZ小鼠經指派至該研究。對小鼠基因型之末期確認揭露九隻小鼠不表現人類 SERPINA1基因且因此自該研究中移出。在22週時期內每4週一次使小鼠服用六個3 mg/kg SC劑量之SERPINA1-1459 (亦即，第0天初始劑量，及第4週、第8週、第12週、第16週及第20週各一劑)。在5週齡、12週齡及49週齡雄性及雌性PiZ小鼠中起始給藥，其中分別在27、34或71週齡時終止研究。 材料及方法藉由RT-qPCR量測SERPINA1 mRNA
收集末期肝臟組織來量測針對先前在PiZ小鼠模型中顯示保守之A1ATD相關肝臟疾病特徵的 SERPINA1mRNA基因敲低及功效，該等特徵包括人類Z-AAT蛋白之細胞內保留、導致增加之細胞增生的相應再生刺激物以及進行性肝臟纖維化(Rudnick等人等人， HEPATOLOGY, 第39卷, 第4期, 2004；Marcus等人 Hepatol Res. 2010年6月 ; 40(6): 641-653.；Tang等人 Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol311: G156-G165, 2016.)。收集末期血清樣品來量測血清化學參數，包括轉胺酶。特定言之，使用Tissuelyser II (Qiagen, Valencia, CA)使大約50 mg樣品在0.75 mL基於苯酚/胍之QIAzol溶解試劑(Qiagen, Valencia, CA)中均質化。用1-溴-3-氯丙烷(Sigma-Aldrich, St. Louis, MO)提取勻漿。根據製造商之說明書，使用MagMax Technology (ThermoFisher Scientific, Waltham, MA)自0.2 mL水相中提取RNA。使用光譜法在260及280奈米下對RNA定量。使用來自Integrated DNA Technologies (Coralville, IA)之RT-qPCR引子及探針以及來自ThermoFisher Scientific (Waltham, MA)及BioRad Laboratories (Hercules, CA)之試劑來量測 SERPINA1mRNA水準，且針對持家基因次黃嘌呤-鳥嘌呤磷酸核糖轉移酶( Hprt)標準化。SERPINA1-1459處理組中之 SERPINA1mRNA降低程度係計算為表現(針對 Hprt標準化)相對於來自年齡匹配小鼠之生理食鹽水處理之對照組的平均表現水準之百分比，其中生理食鹽水處理之對照組中的 SERPIN1mRNA表現係設定為100%。生成平均值±標準偏差之圖形，且使用GraphPad Prism (GraphPad Software, La Jolla, CA)分析數據。執行未配對t測試以比較相對於來自年齡匹配小鼠之生理食鹽水處理之對照組，SERPINA1-1459處理組中的 SERPINA1mRNA水準(針對 Hprt標準化)。運行PCR兩次以進行確認。 A1AT ELISA
根據製造商之說明書，使用人類α1抗胰蛋白酶( SERPINA1) ELISA套組(Abcam, Cambridge, MA)一式兩份量測人類Z-AAT蛋白在50 µL經稀釋血液樣品(全血1:5,000稀釋於來自該ELISA套組之分析緩衝液中)中之濃度。PiZ小鼠僅表現人類Z-AAT蛋白，因此人類特異性抗A1AT ELISA係循環人類Z-AAT蛋白水準之量度。SERPINA1-1459處理組中之人類Z-AAT蛋白濃度降低係計算為表現相對於給藥前人類Z-AAT濃度且相對於同一天獨立地針對雄性及雌性之年齡匹配對照(生理食鹽水處理)組的平均表現水準之百分比，其中對照組中之人類Z-AAT蛋白濃度係設定為100%。生成平均值±標準偏差之圖形，且使用GraphPad Prism (GraphPad Software, La Jolla, CA)分析數據。執行未配對t測試以在同一時間點比較相對於來自年齡匹配小鼠之生理食鹽水處理之對照組，SERPINA1-1459處理組中的人類Z-AAT蛋白水準。 人類Z-AAT蛋白之西方墨點
使用具有T-PER組織蛋白提取試劑及蛋白酶抑制劑混合液(ThermoFisher Scientific, Waltham, MA)之TissueLyser II (Qiagen, Valencia, CA)來製備組織溶解產物。藉由BCA Protein Assay (ThermoFisher Scientific, Waltham, MA)量測總蛋白質濃度且藉由NuPAGE 4-12% Bis-Tris SDS-PAGE (ThermoFisher Scientific, Waltham, MA)來解析估計相等之蛋白質濃度。使用iBlot Dry Blotting System (ThermoFisher Scientific, Waltham, MA)將電泳之蛋白質轉移至硝基纖維素膜且用Odyssey阻斷緩衝液(Li-Cor Biosciences, Lincoln, NE)阻斷以預防非特異性結合。接著用兔抗人類A1AT抗體(Abcam, Cambridge, MA)且用小鼠抗甘油醛3-磷酸去氫酶抗體(Abcam, Cambridge, MA)培育膜。使用抗兔IRDye 680及抗小鼠IRDye 800第二抗體(Li-Cor Biosciences, Lincoln, NE)進行偵測且使用Odyssey紅外成像系統(Li-Cor Biosciences, Lincoln, NE)來量測信號強度。PiZ小鼠僅表現人類Z-AAT蛋白，因此人類特異性抗A1AT抗體係人類Z-AAT蛋白水準之量度。SERPINA1-1459處理組中之人類Z-AAT蛋白降低程度係計算為表現相對於來自年齡匹配小鼠之生理食鹽水處理之對照組的平均水準之百分比，其中生理食鹽水處理之對照組中的人類Z-AAT水準係設定為100%。生成平均值±標準偏差之圖形，且使用GraphPad Prism (GraphPad Software, La Jolla, CA)分析數據。執行未配對t測試以比較相對於來自年齡匹配小鼠之生理食鹽水處理之對照組，SERPINA1-1459處理組中的人類Z-AAT蛋白水準。 免疫組織化學
收集肝臟組織，在10%中性緩衝福馬林中固定隔夜，且接著轉移至70%乙醇。在Mass Histology Service (Worcester, MA)完成石蠟包埋及載玻片準備。根據製造商之說明書，用澱粉酶-消化(PAS-D)及Sirius Red (Abcam, Cambridge, MA)染色執行過碘酸席夫染色。對於免疫組織化學(IHC)實驗，使石蠟切片脫蠟且再水合。對A1AT、人類Z-AAT聚合物及Ki67 IHC樣品執行熱介導之抗原提取(檸檬酸鹽緩衝液，pH 6.0)。用BLOXALL溶液(Vector Laboratories, Burlingame, CA)阻斷內源性過氧化物酶及鹼性磷酸酶。將兔單株抗A1AT抗體(1:500稀釋度，Abcam, Cambridge, MA)、小鼠單株抗Z-AAT聚合物2C1抗體(1:50，Hycult Biotech, Wayne, PA)及兔單株抗Ki67抗體(1:100稀釋度，Abcam, Cambridge, MA)稀釋於SignalStain®抗體稀釋劑(Cell Signaling Technology, Danvers, MA)中且在4℃下培育隔夜。PiZ小鼠僅表現人類Z-AAT蛋白，因此人類特異性抗A1AT抗體係人類Z-AAT蛋白水準之量度。使用山羊抗兔IgG HRP抗體(Antibodies-online, Atlanta, GA)或山羊抗小鼠IgG HRP抗體(Abcam, Cambridge, MA)用SignalStain® DAB受質套組(Cell Signaling Technology, Danvers, MA)偵測初級抗體之結合。使用OlympusBX61VS幻燈片掃描器，使用Olympus VS-ASW圖像分析軟體使結果可視化。 肝臟酶分析
將末期血液收集加工為血清以量測血液化學參數。藉由IDEXX BioResearch Laboratories (Grafton, MA)量測丙胺酸轉胺酶(ALT)、天冬胺酸轉胺酶(AST)及鹼性磷酸酶水準。生成平均值±標準偏差之圖形且使用GraphPad Prism (GraphPad Software, La Jolla, CA)分析數據。執行未配對t測試以比較相對於來自年齡匹配小鼠之生理食鹽水處理之對照組，SERPINA1-1459處理組中的ALT、AST或ALP水準。 結果
SERPINA1-1459之重複給藥顯著降低PiZ小鼠中之 SERPINA1mRNA表現(如 圖 3所示)。每四週投與之六劑SERPINA1-1459顯著降低五週齡( P＜ 0.0001)及十二( P≤ 0.05)週齡PiZ小鼠中之 SERPINA1mRNA表現。由於每組小鼠數目較少，無法計算49週齡PiZ小鼠之統計學顯著性。
SERPINA1-1459之重複給藥顯著降低PiZ小鼠中之循環人類Z-AAT蛋白水準(如藉由ELISA所量測， 圖 4)。在單一劑量之SERPINA1-1459之後，人類Z-AAT水準降低，且在5週齡、12週齡及49週齡PiZ小鼠中，藉由每四週五個額外劑量之SERPINA1-1459維持此降低。
SERPINA1-1459之重複給藥顯著降低自五週齡至27週齡經處理的PiZ小鼠中之肝人類Z-AAT蛋白水準，如肝臟組織樣品之西方墨點及IHC所證明。在SERPINA1-1459處理小鼠中，人類Z-AAT蛋白無法藉由西方墨點( 圖 5 及圖 6)偵測到且在肝臟組織之IHC ( 圖 7)中有效地降低。在12及49週齡起始處理之小鼠中觀察到相似降低，其中分別在34及71週時收集組織(數據未顯示)。 用 SERPINA1-1459 處理 PiZ 小鼠會降低 A1AT 相關之肝臟病理學
在PiZZ患者中，突變型人類Z-AAT蛋白易於在肝細胞中錯誤折疊且聚集為均聚物。此聚集之蛋白的受損降解導致人類Z-AAT在一些患者之肝臟中的毒性積聚，從而引起A1ATD相關肝臟疾病。使用人類Z-AAT聚合物特異性抗體之IHC (Tan等人 Int J Biochem Cell Biol.2015年1月; 58: 81-91)證明在五週齡時開始用SERPINA1-1459處理PiZ小鼠可有效地降低肝臟中之人類Z-AAT聚合物負載( 圖 8)。
另外，SERPINA1-1459處理有效地降低在49週齡時開始處理之PiZ小鼠之肝臟中的高人類Z-AAT聚合物負載( 圖 9)。
如人類中可見，突變型人類Z-AAT在PiZ小鼠肝細胞之內質網(ER)中的組織病理學特徵係用具有澱粉酶抗性之過碘酸席夫(PAS-D)染色之細胞內小球(Rudnick等人， 等人， HEPATOLOGY, 第39卷, 第4期, 2004；Perlmutter等人， PEDIATRIC RESEARCH 第60卷, 第2期, 2006)。在五週齡時開始用SERPINA1-1459處理PiZ小鼠導致對肝小球形成之有效抑制( 圖 10)。
突變型人類Z-AAT蛋白在PiZ小鼠肝臟中之細胞內保留與導致增加之細胞增生的再生刺激物有關(Rudnick等人， 等人，HEPATOLOGY, 第39卷, 第4期, 2004)。與對照處理之小鼠相比，在五週齡時開始用SERPINA1-1459處理之PiZ小鼠顯示細胞增生的有效減少，如藉由增生之細胞標記物Ki-67之免疫組織化學所評價( 圖 11)。
PiZ小鼠肝臟之慢性損傷已顯示與隨年齡增長出現之進行性肝纖維化有關(Brunt等人， J Pediatr Gastroenterol Nutr. 2010年11月 ; 51(5): 626-630)。27週齡PiZ小鼠肝臟之Sirius Red染色顯示肝纖維化之發展，肝纖維化在經SERPINA1-1459處理之小鼠的肝臟中顯著減少( 圖 12)
PiZ小鼠已充分耐受 SERPINA1mRNA之持續基因敲低。在5、12或49週齡時開始用SERPINA1-1459處理之PiZ小鼠不會引起包括ALT、AST或鹼性磷酸酶在內的重要血清生物化學參數之水準升高( 圖 13)。
總之，此等結果證明PiZ小鼠已充分耐受 SERPINA1mRNA之持續基因敲低，其中包括轉胺酶活性在內的血清生物化學參數無異常。 實例 5 ：經 SERPINA1-1459 處理之 PiZ 小鼠中的 SERPINA1 mRNA 及人類 Z-AAT 蛋白之劑量依賴性基因敲低與肝小球減少有關
此研究之目的係評價藉由SERPINA1-1459使表現突變型人類Z-AAT蛋白之PiZ小鼠中的肝小球減少至少50%所需之 SERPINA1mRNA基因敲低水準。特定言之，每4週一次使小鼠(5週齡)服用0、0.3、1或3 mg/kg SERPINA1-1459之4個SC劑量。
在最終劑量之SERPINA1-1459之後一週， SERPINA1mRNA以及循環及肝人類Z-AAT蛋白水準以劑量依賴性方式顯著降低( 圖 14)。在最終劑量之SERPINA1-1459之後一週，觀察到肝小球之相似劑量依賴性降低( 圖 14)。在1或3 mg/kg SERPINA1-1459之四個劑量之後，觀察到肝小球之至少50%降低。
如人類中可見，突變型人類Z-AAT在PiZ小鼠肝細胞之ER中的組織病理學特徵係用具有澱粉酶抗性之過碘酸席夫(PAS-D)染色之細胞內小球(Rudnick等人，2004, Analyses of hepatocellular proliferation in a mouse model of alpha-1-antitrypsin deficiency, Hepatology, 39: 1048-55.；Perlmutter等人， 2006, Pathogenesis of chronic liver injury and hepatocellular carcinoma in alpha-1-antitrypsin deficiency, Pediatr Res 60(2):233-8)。在五週齡時開始用SERPINA1-1459處理PiZ小鼠導致肝小球形成之劑量依賴性抑制( 圖 15)。 實例 6 ：在對食蟹獼猴進行單次皮下 (SC) 推注之後 SERPINA1-1459 之藥效學功效、劑量反應及持續時間之評估
此研究之主要目的係在對食蟹獼猴進行單次皮下(SC)推注之後測定SERPINA1-1459之藥效學功效、劑量反應及持續時間。次要目的係藉由在適當時間點監測標準血液學及臨床血液化學(CBC)參數、體重及潛在注射位點反應來獲得對耐受性之初步評價。
在Charles River Laboratories (Shrewsbury, MA)接收雌性食蟹獼猴，在進行研究程序之前將其馴化至少一週。除在指定程序期間外，每天兩次向動物提供PMI Nutrition International認證之靈長類動物飲食。所有動物均可自由取用水。社會性圈養動物且向其提供豐富環境。在方案規定之結束研究(第169天)時，所有猴均健康且返回其測試群落。
簡言之，三組介於2歲至4歲範圍內之非初級雌性食蟹獼猴(n=5，每組)接受1 mg/kg (組1)、3 mg/kg (組2)或10 mg/kg (組3) SERPINA1-1459之單次SC推注。密切監測注射位點之發炎持續給藥後3天。每天記錄臨床觀察結果。
在整個24週研究中每週收集血液樣品且加工為血清及血漿。特定言之，所有動物均在血液收集程序之前禁食隔夜。在Charles River，使用給藥前及48小時樣品進行臨床血液化學(CBC)及血液學參數。在Charles River，由2 mL血液樣品加工血清及血漿且分離至多個儲存小瓶中且在液氮中速凍。除了用於CBC及血液學之彼等樣品外，所有樣品均在乾冰上裝運至戴瑟納製藥股份有限公司(Dicerna Pharmaceuticals)。在戴瑟納製藥股份有限公司，藉由ELISA定量血清A1AT蛋白濃度。所有其他樣品均在-80℃下存檔。
控制參數係來自第-5天、第-3天及正好在第1天注射之前的給藥前量測。藉由在血清樣品中進行ELISA來量測血清α-1抗胰蛋白酶(A1AT)濃度(肝臟中之SERPINA1-1459活性的生物標記物)。
每天臨床觀察結果、臨床血液化學及血液學參數均不顯著且與給藥前對照並無不同(數據未顯示)。在整個研究中體重增加之方式與此年齡之雌性猴的正常歷史生長範圍一致且在任何時間點，各組均無不同( 圖 16 ：左側圖顯示平均變化百分比± SEM且右側圖顯示個別動物值)。在注射位點，在任何劑量水準下在任何動物中均未觀察到發炎反應或其他反應。總之，此等結果表明費人類靈長類動物充分耐受高達10 mg/kg SERPINA1-1459之單一SC劑量。
根據製造商之說明書，使用用於偵測人類α1抗胰蛋白酶之市售ELISA套組(Abcam, Cambridge, MA)來量測A1AT蛋白在25 µL血清中之濃度。藉由ELISA一式兩份分析樣品。在SERPINA1-1459處理之後血清A1AT蛋白濃度之降低係計算為給藥前A1AT血清蛋白濃度之減少百分比。
在所有組中，SERPINA1-1459之投與均導致循環A1AT蛋白濃度之強勁且劑量相關減少，其中在單一SC劑量之後4週出現最大降低。此時，與基線相比，循環A1AT蛋白濃度之最大減少在1 mg/kg組中為2.2倍(55%減少)，在3 mg/kg組中為4.8倍(79%減少)且在10 mg/kg組中為6.7倍(84%減少) ( P＜ 0.0001，所有組) ( 圖 17A)。在第4週觀察到的最大藥效學效應在1 mg/kg組中維持至第7週且在3 mg/kg及10 mg/kg組中維持至第8週，之後循環A1AT濃度緩慢地恢復至基線濃度。在1 mg/kg劑量組中，A1AT蛋白濃度在給藥後大約18週恢復至基線。在3 mg/kg及10 mg/kg劑量組中，在研究之最後一天(第24週)未達到基線濃度，在研究終止時分別達到基線血清A1AT濃度之86%及62%。據報道70-80%循環A1AT係由肝細胞產生的(Janciauskiene等人 Respiratory Medicine(2011) 105, 1129e1139)，因此在10 mg/kg組中實現之84%降低有可能接近可實現的最大效應( 圖 17A 及 17B)。這由以下觀察結果進一步支持：對於3 mg/kg及10 mg/kg劑量組，藥效學反應係小於劑量比例。然而，1 mg/kg劑量組之結果表明SERPINA1-1459之半最大有效劑量(ED50)在非人類靈長類動物中大約為1 mg/kg。 論述及結論
每天臨床觀察結果、CBC及血液學均不顯著且與給藥前對照並無不同。在整個研究中，各劑量組之體重均增加且在任何時間點，各組均無不同。在注射後72小時之後，在任何劑量水準下在任何動物中均未觀察到注射位點反應。總之，此等觀察結果表明費人類靈長類動物充分耐受高達10 mg/kg SERPINA1-1459之單一SC劑量。另外，在來自所有劑量組之猴中，SERPINA1-1459之投與均導致循環A1AT蛋白濃度之強勁且劑量相關降低。
在一部分PiZZ患者中觀察到的肝臟病理學之有效治療代表高度未滿足之醫療需求(Lomas, DA. New therapeutic targets for alpha-1 antitrypsin deficiency. Chronic obstructive pulmonary diseases (Miami, Fla.). 2018;5(4): 233-43)。SERPINA1-1459係經設計以選擇性降低 SERPINA1mRNA及A1AT蛋白水準，由此降低肝Z-AAT蛋白積聚之siRNA治療劑。由肝細胞產生之A1AT經分泌至循環中，因此A1AT血清濃度代表一種用於在直接肝臟取樣不存在下評價SERPINA1-1459之功效的可用生物標記物。
A1ATD患者之肝臟疾病的進展與Z-AAT在肝細胞中之進行性積聚有關(Teckman, J.H., 2013 COPD. 2013年3月;10增刊1:35-43)。SERPINA1-1459具有產生有意義之治療介入的潛力以減慢、停止或可能逆轉PiZZ患者之肝臟疾病之進展。因此，SERPINA1-1459可代表針對患有肝臟疾病及相關症狀之PiZZ患者的挽救生命之治療介入。 實例 7 ：經 SERPINA1-1459 處理之食蟹獼猴中的 A1AT 蛋白質劑量依賴性基因敲低
該研究之此階段的目的係測定SERPINA1-1459之藥效學效應，如藉由在此重複劑量毒性研究中，在給予30、100或300 mg/kg SERPINA1-1459之四次SC投與的食蟹獼猴中，循環A1AT蛋白濃度在第87天及第141天之降低所評價。在該研究之第1天對成年幼猴(大約42月齡)及幼猴(大約15月齡)投與SERPINA1-1459且每28天再次投與。
根據製造商之說明書，使用人類α1抗胰蛋白酶( SERPINA1) ELISA套組(Abcam, Cambridge, MA)一式兩份量測A1AT蛋白在25 µL血清樣品中之濃度。SERPINA1-1459處理組中之A1AT蛋白濃度降低係計算為表現相對於同一天獨立地針對雄性及雌性之年齡匹配對照(生理食鹽水處理)組的平均表現水準之百分比，其中對照組中之A1AT蛋白濃度係設定為100%。
生成平均值±平均值之標準誤差的圖形且使用GraphPad Prism (GraphPad Software, La Jolla, CA)分析數據。執行未配對t測試以比較SERPINA1-1459處理組中之A1AT蛋白濃度與同一時間點的年齡匹配對照組中之彼等濃度。僅在具有3隻或3隻以上猴之組中計算統計學顯著性。
SERPINA1-1459對A1AT蛋白濃度之抑制效應顯示於 圖 18中。對第87天收集之血液中的循環A1AT蛋白濃度之藥效學分析分別顯示成年幼猴及幼猴中之57.3%至83.8%降低。在無處理期結束時，幼猴中之循環A1AT蛋白濃度持續57.8%至75.8%降低。在雄性與雌性幼猴之間未注意到循環A1AT蛋白濃度之降低的有意義差異；然而，與雄性成年幼猴相比，雌性中之循環A1AT蛋白濃度以更大程度降低。SERPINA1-1459處理導致與雄性成年幼猴相比，雄性幼猴中之循環A1AT蛋白濃度的更大減少。無明顯劑量反應。
對3個月給藥期結束時(第87天)收集之血液中的循環A1AT蛋白濃度之藥效學分析顯示成年幼猴及幼猴中之大約70%至80%降低。在無處理期結束時(第141天)，幼猴中之循環A1AT蛋白濃度持續大約65%降低。藥效學效應無明顯有意義之劑量相關、性別相關或年齡相關差異。 實例 8 ：長期 SERPINA1-1459 處理之劑量反應證明 SERPINA1 mRNA 基因敲低及處理耐受性
此研究之目的係測定SERPINA1-1459之9個月重複劑量(每4週；10個劑量)皮下注射在食蟹獼猴中之藥效學效應。
對雄性及雌性食蟹獼猴之組經皮下(SC)注射對照(生理食鹽水)或20、60或180 mg/kg SERPINA1-1459。各組含有在第255天進行尸體剖檢之主要研究動物及在第253天給藥之後停止處理之恢復動物(R)。在第309天(給藥後8週)對此等動物進行尸體剖檢。在整個九個月期間每28天經皮下投與SERPINA1-1459，持續共計10個劑量。每個月之SC劑量係基於在各給藥時段之前2天收集之體重。
在所有劑量組之主要研究及恢復尸體剖檢中，藉由使用非驗證方法使用定量逆轉錄聚合酶鏈反應(RT-qPCR)量測 SERPINA1mRNA表現來分析雄性及雌性肝臟樣品。
分析SERPINA1-1459在來自所有處理組之雄性及雌性食蟹獼猴的肝臟中之藥效學(PD) ( 圖 19)。在所有SERPINA1-1459投與組之末期(主要研究)及恢復時間點， SERPINA1mRNA表現降低至小於對照中發現之水準的5%。儘管對照動物中存在可變性(18 - 188%範圍)，但在末期及恢復時間點， SERPINA1mRNA表現在食蟹獼猴中之所有SERPINA1-1459劑量水準下之顯著降低證明了SERPINA1-1459的有效活性，除了投與20 mg/kg之恢復動物。在雄性與雌性猴之間無表現或活性之明顯差異。在主要與恢復時間點之間無 SERPINA1mRNA之顯著差異，表明mRNA表現未恢復。在高達180 mg/kg之水準下，食蟹獼猴充分耐受歷經9個月的SERPINA1-1459之皮下重複劑量投與(10個劑量)。 額外引用
Figure 02_image038
Figure 02_image040
序列表
SEQ ID NO 描述 序列
1 SERPINA1-751有義鏈 GAGGAUGUUAAAAAGUUGUA
2 SERPINA1-751 反義鏈 UACAACUUUUUAACAUCCUCGG
3 SERPINA1-750 有義鏈 GGAGGAUGUUAAAAAGUUGA
4 SERPINA1-750 反義鏈 UCAACUUUUUAACAUCCUCCGG
5 SERPINA1-758 有義鏈 UUAAAAAGUUGUACCACUCA
6 SERPINA1-758 反義鏈 UGAGUGGUACAACUUUUUAAGG
7 SERPINA1-754 有義鏈 GAUGUUAAAAAGUUGUACCA
8 SERPINA1-754 反義鏈 UGGUACAACUUUUUAACAUCGG
9 SERPINA1-761 有義鏈 AAAAGUUGUACCACUCAGAA
10 SERPINA1-761 反義鏈 UUCUGAGUGGUACAACUUUUGG
11 SERPINA1-743 有義鏈 AGUUUUUGGAGGAUGUUAAA
12 SERPINA1-743 反義鏈 UUUAACAUCCUCCAAAAACUGG
13 SERPINA1-1036 有義鏈 UUUAACAUCCAGCACUGUAA
14 SERPINA1-1036 反義鏈 UUACAGUGCUGGAUGUUAAAGG
15 SERPINA1-748 有義鏈 UUGGAGGAUGUUAAAAAGUA
16 SERPINA1-748 反義鏈 UACUUUUUAACAUCCUCCAAGG
17 SERPINA1-756 有義鏈 UGUUAAAAAGUUGUACCACA
18 SERPINA1-756 反義鏈 UGUGGUACAACUUUUUAACAGG
19 SERPINA1-1035 有義鏈 GUUUAACAUCCAGCACUGUA
20 SERPINA1-1035 反義鏈 UACAGUGCUGGAUGUUAAACGG
21 SERPINA1-1228 有義鏈 CUGUCCAUUACUGGAACCUA
22 SERPINA1-1228 反義鏈 UAGGUUCCAGUAAUGGACAGGG
23 SERPINA1-728 有義鏈 UGAAGCUAGUGGAUAAGUUA
24 SERPINA1-728 反義鏈 UAACUUAUCCACUAGCUUCAGG
25 SERPINA1-1459 有義鏈 AAACCCUUUGUCUUCUUAAA
26 SERPINA1-1459 反義鏈 UUUAAGAAGACAAAGGGUUUGG
27 SERPINA1-1416 有義鏈 AGAGGCCAUACCCAUGUCUA
28 SERPINA1-1416 反義鏈 UAGACAUGGGUAUGGCCUCUGG
29 SERPINA1-1096 有義鏈 UUCUUAAUGAUUGAACAAAA
30 SERPINA1-1096 反義鏈 UAGAAGAUGGCGGUGGCAUUGG
31 SERPINA1-1471 有義鏈 UUCUUAAUGAUUGAACAAAA
32 SERPINA1-1471 反義鏈 UUUUGUUCAAUCAUUAAGAAGG
33 SERPINA1-0751有義鏈模式A [mGs][mA][fG][mG][mA][mU][mG][fU][fU][fA][mA][fA][fA][mA][mG][mU][fU][mG][mU][mA][mG][mC][mA][mG][mC][mC][prgG-peg-GalNAc][prgA-peg-GalNAc][prgA-peg-GalNAc][prgA-peg-GalNAc][mG][mG][mC][mU][mG][mC]
34 SERPINA1-0751反義鏈模式A [Phosphonate-4O-mUs][fAs][fCs][mA][fA][mC][fU][fU] [mU][fU][mU][fA][mA][fC][mA][fU][mC][mC][fU][mCs][mGs][mG]
35 SERPINA1-0750 有義鏈模式A [mGs][mG][fA][mG][mG][mA][mU][fG][fU][fU][mA][fA][fA][mA][mA][mG][fU][mU][mG][mA][mG][mC][mA][mG][mC][mC][prgG-peg-GalNAc][prgA-peg-GalNAc][prgA-peg-GalNAc][prgA-peg-GalNAc][mG][mG][mC][mU][mG][mC]
36 SERPINA1-0750反義鏈模式A [Phosphonate-4O-mUs][fCs][fAs][mA][fC][mU][fU][fU] [mU][fU][mA][fA][mC][fA][mU][fC][mC][mU][fC][mCs][mGs][mG]
37 SERPINA1-0758 有義鏈模式A [mUs][mU][fA][mA][mA][mA][mA][fG][fU][fU][mG][fU][fA][mC][mC][mA][fC][mU][mC][mA][mG][mC][mA][mG][mC][mC][prgG-peg-GalNAc][prgA-peg-GalNAc][prgA-peg-GalNAc][prgA-peg-GalNAc][mG][mG][mC][mU][mG][mC]
38 SERPINA1-0758反義鏈模式A [Phosphonate-4O-mUs][fGs][fAs][mG][fU][mG][fG][fU] [mA][fC][mA][fA][mC][fU][mU][fU][mU][mU][fA][mAs][mGs][mG]
39 SERPINA1-0754 有義鏈模式A [mGs][mA][fU][mG][mU][mU][mA][fA][fA][fA][mA][fG][fU][mU][mG][mU][fA][mC][mC][mA][mG][mC][mA][mG][mC][mC][prgG-peg-GalNAc][prgA-peg-GalNAc][prgA-peg-GalNAc][prgA-peg-GalNAc][mG][mG][mC][mU][mG][mC]
40 SERPINA1-0754反義鏈模式A [Phosphonate-4O-mUs][fGs][fGs][mU][fA][mC][fA][fA] [mC][fU][mU][fU][mU][fU][mA][fA][mC][mA][fU][mCs][mGs][mG]
41 SERPINA1-0761 有義鏈模式A [mAs][mA][fA][mA][mG][mU][mU][fG][fU][fA][mC][fC][fA][mC][mU][mC][fA][mG][mA][mA][mG][mC][mA][mG][mC][mC][prgG-peg-GalNAc][prgA-peg-GalNAc][prgA-peg-GalNAc][prgA-peg-GalNAc][mG][mG][mC][mU][mG][mC]
42 SERPINA1-0761反義鏈模式A [Phosphonate-4O-mUs][fUs][fCs][mU][fG][mA][fG][fU] [mG][fG][mU][fA][mC][fA][mA][fC][mU][mU][fU][mUs][mGs][mG]
43 SERPINA1-0743 有義鏈模式A [mAs][mG][fU][mU][mU][mU][mU][fG][fG][fA][mG][fG][fA][mU][mG][mU][fU][mA][mA][mA][mG][mC][mA][mG][mC][mC][prgG-peg-GalNAc][prgA-peg-GalNAc][prgA-peg-GalNAc][prgA-peg-GalNAc][mG][mG][mC][mU][mG][mC]
44 SERPINA1-0743反義鏈模式A [Phosphonate-4O-mUs][fCs][fAs][mA][fC][mU][fU][fU] [mU][fU][mA][fA][mC][fA][mU][fC][mC][mU][fC][mCs][mGs][mG]
45 SERPINA1-1036 有義鏈模式A [mUs][mU][fU][mA][mA][mC][mA][fU][fC][fC][mA][fG][fC][mA][mC][mU][fG][mU][mA][mA][mG][mC][mA][mG][mC][mC][prgG-peg-GalNAc][prgA-peg-GalNAc][prgA-peg-GalNAc][prgA-peg-GalNAc][mG][mG][mC][mU][mG][mC]
46 SERPINA1-1036反義鏈模式A [Phosphonate-4O-mUs][fUs][fAs][mC][fA][mG][fU][fG] [mC][fU][mG][fG][mA][fU][mG][fU][mU][mA][fA][mAs][mGs][mG]
47 SERPINA1-0748 有義鏈模式A [mUs][mU][fG][mG][mA][mG][mG][fA][fU][fG][mU][fU][fA][mA][mA][mA][fA][mG][mU][mA][mG][mC][mA][mG][mC][mC][prgG-peg-GalNAc][prgA-peg-GalNAc][prgA-peg-GalNAc][prgA-peg-GalNAc][mG][mG][mC][mU][mG][mC]
48 SERPINA1-0748反義鏈模式A [Phosphonate-4O-mUs][fAs][fCs][mU][fU][mU][fU][fU] [mA][fA][mC][fA][mU][fC][mC][fU][mC][mC][fA][mAs][mGs][mG]
49 SERPINA1-0756 有義鏈模式A [mUs][mG][fU][mU][mA][mA][mA][fA][fA][fG][mU][fU][fG][mU][mA][mC][fC][mA][mC][mA][mG][mC][mA][mG][mC][mC][prgG-peg-GalNAc][prgA-peg-GalNAc][prgA-peg-GalNAc][prgA-peg-GalNAc][mG][mG][mC][mU][mG][mC]
50 SERPINA1-0756反義鏈模式A [Phosphonate-4O-mUs][fGs][fUs][mG][fG][mU][fA][fC] [mA][fA][mC][fU][mU][fU][mU][fU][mA][mA][fC][mAs][mGs][mG]
51 SERPINA1-1035 有義鏈模式A [mGs][mU][fU][mU][mA][mA][mC][fA][fU][fC][mC][fA][fG][mC][mA][mC][fU][mG][mU][mA][mG][mC][mA][mG][mC][mC][prgG-peg-GalNAc][prgA-peg-GalNAc][prgA-peg-GalNAc][prgA-peg-GalNAc][mG][mG][mC][mU][mG][mC]
52 SERPINA1-1035反義鏈模式A [Phosphonate-4O-mUs][fAs][fCs][mA][fG][mU][fG][fC] [mU][fG][mG][fA][mU][fG][mU][fU][mA][mA][fA][mCs][mGs][mG]
53 SERPINA1-1228 有義鏈模式A [mCs][mU][fG][mU][mC][mC][mA][fU][fU][fA][mC][fU][fG][mG][mA][mA][fC][mC][mU][mA][mG][mC][mA][mG][mC][mC][prgG-peg-GalNAc][prgA-peg-GalNAc][prgA-peg-GalNAc][prgA-peg-GalNAc][mG][mG][mC][mU][mG][mC]
54 SERPINA1-1228反義鏈模式A [Phosphonate-4O-mUs][fAs][fGs][mG][fU][mU][fC][fC] [mA][fG][mU][fA][mA][fU][mG][fG][mA][mC][fA][mGs][mGs][mG]
55 SERPINA1-0728 有義鏈模式A [mUs][mG][fA][mA][mG][mC][mU][fA][fG][fU][mG][fG][fA][mU][mA][mA][fG][mU][mU][mA][mG][mC][mA][mG][mC][mC][prgG-peg-GalNAc][prgA-peg-GalNAc][prgA-peg-GalNAc][prgA-peg-GalNAc][mG][mG][mC][mU][mG][mC]
56 SERPINA1-0728反義鏈模式A [Phosphonate-4O-mUs][fAs][fAs][mC][fU][mU][fA][fU] [mC][fC][mA][fC][mU][fA][mG][fC][mU][mU][fC][mAs][mGs][mG]
57 SERPINA1-1459 有義鏈模式A [mAs][mA][fA][mC][mC][mC][mU][fU][fU][fG][mU][fC][fU][mU][mC][mU][fU][mA][mA][mA][mG][mC][mA][mG][mC][mC][prgG-peg-GalNAc][prgA-peg-GalNAc][prgA-peg-GalNAc][prgA-peg-GalNAc][mG][mG][mC][mU][mG][mC]
58 SERPINA1-1459反義鏈模式A [mAs][mA][fA][mC][mC][mC][mU][fU][fU][fG][mU][fC][fU][mU][mC][mU][fU][mA][mA][mA][mG][mC][mA][mG][mC][mC][prgG-peg-GalNAc][prgA-peg-GalNAc][prgA-peg-GalNAc][prgA-peg-GalNAc][mG][mG][mC][mU][mG][mC]
59 SERPINA1-1416 有義鏈模式A [mAs][mG][fA][mG][mG][mC][mC][fA][fU][fA][mC][fC][fC][mA][mU][mG][fU][mC][mU][mA][mG][mC][mA][mG][mC][mC][prgG-peg-GalNAc][prgA-peg-GalNAc][prgA-peg-GalNAc][prgA-peg-GalNAc][mG][mG][mC][mU][mG][mC]
60 SERPINA1-1416反義鏈模式A [Phosphonate-4O-mUs][fAs][fGs][mA][fC][mA][fU] [fG][mG][fG][mU][fA][mU][fG][mG][fC][mC][mU][fC][mUs][mGs][mG]
61 SERPINA1-1096 有義鏈模式A [mAs][mA][fU][mG][mC][mC][mA][fC][fC][fG][mC][fC][fA][mU][mC][mU][fU][mC][mU][mA][mG][mC][mA][mG][mC][mC][prgG-peg-GalNAc][prgA-peg-GalNAc][prgA-peg-GalNAc][prgA-peg-GalNAc][mG][mG][mC][mU][mG][mC]
62 SERPINA1-1096反義鏈模式A [Phosphonate-4O-mUs][fAs][fGs][mA][fA][mG][fA] [fU][mG][fG][mC][fG][mG][fU][mG][fG][mC][mA][fU][mUs][mGs][mG]
63 SERPINA1-1471 有義鏈模式B [mUs][mU][fC][mU][fU][mA][mA][fU][fG][fA][fU][mU][fG][mA][fA][mC][fA][mA][mA][mA][mG][mC][mA][mG][mC][mC][prgG-peg-GalNAc][prgA-peg-GalNAc][prgA-peg-GalNAc][prgA-peg-GalNAc][mG][mG][mC][mU][mG][mC]
64 SERPINA1-1471反義鏈模式B [Phosphonate-4O-mUs][fUs][fUs][mU][fG][mU][fU][mC] [mA][fA][mU][mC][mA][fU][mU][fA][fA][mG][fA][mAs][mGs][mG]
65 SERPINA1-0728 有義鏈模式B [mUs][mG][fA][mA][fG][mC][mU][fA][fG][fU][fG][mG][fA][mU][fA][mA][fG][mU][mU][mA][mG][mC][mA][mG][mC][mC][prgG-peg-GalNAc][prgA-peg-GalNAc][prgA-peg-GalNAc][prgA-peg-GalNAc][mG][mG][mC][mU][mG][mC]
66 SERPINA1-0728反義鏈模式B [Phosphonate-4O-mUs][fAs][fAs][mC][fU][mU][fA][mU] [mC][fC][mA][mC][mU][fA][mG][fC][fU][mU][fC][mAs][mGs][mG]
67 SERPINA1-0743有義鏈模式B [mAs][mG][fU][mU][fU][mU][mU][fG][fG][fA][fG][mG][fA][mU][fG][mU][fU][mA][mA][mA][mG][mC][mA][mG][mC][mC][prgG-peg-GalNAc][prgA-peg-GalNAc][prgA-peg-GalNAc][prgA-peg-GalNAc][mG][mG][mC][mU][mG][mC]
68 SERPINA1-0743反義鏈模式B [Phosphonate-4O-mUs][fUs][fUs][mA][fA][mC][fA][mU] [mC][fC][mU][mC][mC][fA][mA][fA][fA][mA][fC][mUs][mGs][mG]
69 SERPINA1-0748有義鏈模式B [mUs][mU][fG][mG][fA][mG][mG][fA][fU][fG][fU][mU][fA][mA][fA][mA][fA][mG][mU][mA][mG][mC][mA][mG][mC][mC][prgG-peg-GalNAc][prgA-peg-GalNAc][prgA-peg-GalNAc][prgA-peg-GalNAc][mG][mG][mC][mU][mG][mC]
70 SERPINA1-0748反義鏈模式B [Phosphonate-4O-mUs][fAs][fCs][mU][fU][mU][fU][mU] [mA][fA][mC][mA][mU][fC][mC][fU][fC][mC][fA][mAs][mGs][mG]
71 SERPINA1-0750有義鏈模式B [mGs][mG][fA][mG][fG][mA][mU][fG][fU][fU][fA][mA][fA][mA][fA][mG][fU][mU][mG][mA][mG][mC][mA][mG][mC][mC][prgG-peg-GalNAc][prgA-peg-GalNAc][prgA-peg-GalNAc][prgA-peg-GalNAc][mG][mG][mC][mU][mG][mC]
72 SERPINA1-0750反義鏈模式B [Phosphonate-4O-mUs][fCs][fAs][mA][fC][mU][fU][mU] [mU][fU][mA][mA][mC][fA][mU][fC][fC][mU][fC][mCs][mGs][mG]
73 SERPINA1-0751有義鏈模式B [mGs][mA][fG][mG][fA][mU][mG][fU][fU][fA][fA][mA][fA][mA][fG][mU][fU][mG][mU][mA][mG][mC][mA][mG][mC][mC][prgG-peg-GalNAc][prgA-peg-GalNAc][prgA-peg-GalNAc][prgA-peg-GalNAc][mG][mG][mC][mU][mG][mC]
74 SERPINA1-0751反義鏈模式B [Phosphonate-4O-mUs][fAs][fCs][mA][fA][mC][fU][mU] [mU][fU][mU][mA][mA][fC][mA][fU][fC][mC][fU][mCs][mGs][mG]
75 SERPINA1-0754有義鏈模式B [mGs][mA][fU][mG][fU][mU][mA][fA][fA][fA][fA][mG][fU][mU][fG][mU][fA][mC][mC][mA][mG][mC][mA][mG][mC][mC][prgG-peg-GalNAc][prgA-peg-GalNAc][prgA-peg-GalNAc][prgA-peg-GalNAc][mG][mG][mC][mU][mG][mC]
76 SERPINA1-0754反義鏈模式B [Phosphonate-4O-mUs][fGs][fGs][mU][fA][mC][fA][mA] [mC][fU][mU][mU][mU][fU][mA][fA][fC][mA][fU][mCs][mGs][mG]
77 SERPINA1-0756有義鏈模式B [mUs][mG][fU][mU][fA][mA][mA][fA][fA][fG][fU][mU][fG][mU][fA][mC][fC][mA][mC][mA][mG][mC][mA][mG][mC][mC][prgG-peg-GalNAc][prgA-peg-GalNAc][prgA-peg-GalNAc][prgA-peg-GalNAc][mG][mG][mC][mU][mG][mC]
78 SERPINA1-0756反義鏈模式B [Phosphonate-4O-mUs][fGs][fUs][mG][fG][mU][fA][mC] [mA][fA][mC][mU][mU][fU][mU][fU][fA][mA][fC][mAs][mGs][mG]
79 SERPINA1-0758有義鏈模式B [mUs][mU][fA][mA][fA][mA][mA][fG][fU][fU][fG][mU][fA][mC][fC][mA][fC][mU][mC][mA][mG][mC][mA][mG][mC][mC][prgG-peg-GalNAc][prgA-peg-GalNAc][prgA-peg-GalNAc][prgA-peg-GalNAc][mG][mG][mC][mU][mG][mC]
80 SERPINA1-0758反義鏈模式B [Phosphonate-4O-mUs][fGs][fAs][mG][fU][mG][fG][mU] [mA][fC][mA][mA][mC][fU][mU][fU][fU][mU][fA][mAs][mGs][mG]
81 SERPINA1-0761有義鏈模式B [mAs][mA][fA][mA][fG][mU][mU][fG][fU][fA][fC][mC][fA][mC][fU][mC][fA][mG][mA][mA][mG][mC][mA][mG][mC][mC][prgG-peg-GalNAc][prgA-peg-GalNAc][prgA-peg-GalNAc][prgA-peg-GalNAc][mG][mG][mC][mU][mG][mC]
82 SERPINA1-0761反義鏈模式B [Phosphonate-4O-mUs][fUs][fCs][mU][fG][mA][fG][mU] [mG][fG][mU][mA][mC][fA][mA][fC][fU][mU][fU][mUs][mGs][mG]
83 SERPINA1-1035有義鏈模式B [mGs][mU][fU][mU][fA][mA][mC][fA][fU][fC][fC][mA][fG][mC][fA][mC][fU][mG][mU][mA][mG][mC][mA][mG][mC][mC][prgG-peg-GalNAc][prgA-peg-GalNAc][prgA-peg-GalNAc][prgA-peg-GalNAc][mG][mG][mC][mU][mG][mC]
84 SERPINA1-1035反義鏈模式B [Phosphonate-4O-mUs][fAs][fCs][mA][fG][mU][fG][mC] [mU][fG][mG][mA][mU][fG][mU][fU][fA][mA][fA][mCs][mGs][mG]
85 SERPINA1-1036有義鏈模式B [mUs][mU][fU][mA][fA][mC][mA][fU][fC][fC][fA][mG][fC][mA][fC][mU][fG][mU][mA][mA][mG][mC][mA][mG][mC][mC][prgG-peg-GalNAc][prgA-peg-GalNAc][prgA-peg-GalNAc][prgA-peg-GalNAc][mG][mG][mC][mU][mG][mC]
86 SERPINA1-1036反義鏈模式B [Phosphonate-4O-mUs][fUs][fAs][mC][fA][mG][fU][mG] [mC][fU][mG][mG][mA][fU][mG][fU][fU][mA][fA][mAs][mGs][mG]
87 SERPINA1-1228有義鏈模式B [mCs][mU][fG][mU][fC][mC][mA][fU][fU][fA][fC][mU][fG][mG][fA][mA][fC][mC][mU][mA][mG][mC][mA][mG][mC][mC][prgG-peg-GalNAc][prgA-peg-GalNAc][prgA-peg-GalNAc][prgA-peg-GalNAc][mG][mG][mC][mU][mG][mC]
88 SERPINA1-1228反義鏈模式B [Phosphonate-4O-mUs][fAs][fGs][mG][fU][mU][fC][mC] [mA][fG][mU][mA][mA][fU][mG][fG][fA][mC][fA][mGs][mGs][mG]
89 SERPINA1-1096有義鏈模式B [mAs][mA][fU][mG][fC][mC][mA][fC][fC][fG][fC][mC][fA][mU][fC][mU][fU][mC][mU][mA][mG][mC][mA][mG][mC][mC][prgG-peg-GalNAc][prgA-peg-GalNAc][prgA-peg-GalNAc][prgA-peg-GalNAc][mG][mG][mC][mU][mG][mC]
90 SERPINA1-1096反義鏈模式B [Phosphonate-4O-mUs][fAs][fGs][mA][fA][mG][fA][mU] [mG][fG][mC][mG][mG][fU][mG][fG][fC][mA][fU][mUs][mGs][mG]
91 SERPINA1-1416有義鏈模式B [mAs][mG][fA][mG][fG][mC][mC][fA][fU][fA][fC][mC][fC][mA][fU][mG][fU][mC][mU][mA][mG][mC][mA][mG][mC][mC][prgG-peg-GalNAc][prgA-peg-GalNAc][prgA-peg-GalNAc][prgA-peg-GalNAc][mG][mG][mC][mU][mG][mC]
92 SERPINA1-1416反義鏈模式B [Phosphonate-4O-mUs][fAs][fGs][mA][fC][mA][fU][mG] [mG][fG][mU][mA][mU][fG][mG][fC][fC][mU][fC][mUs][mGs][mG]
93 SERPINA1-1459-有義鏈模式C [mAs][mA][fA][mC][mC][mC][mU][fU][fU][fG][mU][fC][fU][mU][mC][mU][fU][mA][mA][mA][mG][mC][mC][prgG-peg-GalNAc][prgA-peg-GalNAc][prgA-peg-GalNAc][prgA-peg-GalNAc][mG][mG][mC]
94 SERPINA1-1459反義鏈模式C [Phosphonate-4O-mUs][fUs][fUs][mA][fA][mG][fA][fA] [mG][fA][mC][fA][mA][fA][mG][fG][mG][mU][fU][mUs][mGs][mG]
95 SERPINA1-1096有義鏈模式D [mAs][mA][fU][mG][fC][mC][mA][fC][fC][fG][fC][mC][fA][mU][fC][mU][fU][mC][mU][mA][mG][mC][mC][prgG-peg-GalNAc][prgA-peg-GalNAc][prgA-peg-GalNAc][prgA-peg-GalNAc][mG][mG][mC]
96 SERPINA1-1096反義鏈模式D [Phosphonate-4O-mUs][fAs][fGs][mA][fA][mG][fA][mU] [mG][fG][mC][mG][mG][fU][mG][fG][fC][mA][fU][mUs][mGs][mG]
97 SERPINA1-1416有義鏈模式D [mAs][mG][fA][mG][fG][mC][mC][fA][fU][fA][fC][mC][fC][mA][fU][mG][fU][mC][mU][mA][mG][mC][mC][prgG-peg-GalNAc][prgA-peg-GalNAc][prgA-peg-GalNAc][prgA-peg-GalNAc][mG][mG][mC]
98 SERPINA1-1416反義鏈模式D [Phosphonate-4O-mUs][fAs][fGs][mA][fC][mA][fU][mG] [mG][fG][mU][mA][mU][fG][mG][fC][fC][mU][fC][mUs][mGs][mG]
99 SERPINA1-1459有義鏈模式D [mAs][mA][fA][mC][fC][mC][mU][fU][fU][fG][fU][mC][fU][mU][fC][mU][fU][mA][mA][mA][mG][mC][mC][prgG-peg-GalNAc][prgA-peg-GalNAc][prgA-peg-GalNAc][prgA-peg-GalNAc][mG][mG][mC]
100 SERPINA1-1459反義鏈模式D [Phosphonate-4O-mUs][fUs][fUs][mA][fA][mG][fA][mA] [mG][fA][mC][mA][mA][fA][mG][fG][fG][mU][fU][mUs][mGs][mG]
101 SERPINA1-1459-有義鏈模式E [mAs][mA][fA][mC][mC][mC][mU][fU][fU][fG][mU][fC][fU][mU][mC][mU][fU][mA][mA][mA][mG][mC][mA][mG][mC][mC][ademG-GalNAc][ademA-GalNAc][ademA-GalNAc][ademA-GalNAc][mG][mG][mC][mU][mG][mC]
102 SERPINA1-1459反義鏈模式E [MePhosphonate-4O-mUs][fUs][fUs][mA][fA][mG][fA][fA] [mG][fA][mC][fA][mA][fA][mG][fG][mG][mU][fU][mUs][mGs][mG]
103 SERPINA1-1459 有義鏈模式F [mAs][mA][fA][mC][mC][mC][mU][fU][fU][fG][mU][fC][fU][mU][mC][mU][fU][mA][mA][mA][mG][mC][mA][mG][mC][mC][ademG-GalNAc][ademA-GalNAc][ademA-GalNAc][ademA-GalNAc][mG][mG][mC][mU][mG][mC]
104 SERPINA1-1459反義鏈模式F [MePhosphonate-4O-mUs][fUs][fUs][mA][fA][mG][fA][mA] [mG][mA][mC][fA][mA][fA][mG][fG][mG][mU][fU][mUs][mGs][mG]
105 SERPINA1-1459 有義鏈(36聚體) AAACCCUUUGUCUUCUUAAAGCAGCCGAAAGGCUGC
106 SERPINA1-1459有義鏈模式B [mAs][mA][fA][mC][fC][mC][mU][fU][fU][fG][fU][mC][fU][mU][fC][mU][fU][mA][mA][mA][mG][mC][mA][mG][mC][mC][prgG-peg-GalNAc][prgA-peg-GalNAc][prgA-peg-GalNAc][prgA-peg-GalNAc][mG][mG][mC][mU][mG][mC]
107 SERPINA1-1459反義鏈模式B [Phosphonate-4O-mUs][fUs][fUs][mA][fA][mG][fA][mA] [mG][fA][mC][mA][mA][fA][mG][fG][fG][mU][fU][mUs][mGs][mG]
108 SERPINA1-1096有義鏈模式C [mAs][mA][fU][mG][mC][mC][mA][fC][fC][fG][mC][fC][fA][mU][mC][mU][fU][mC][mU][mA][mG][mC][mC][prgG-peg-GalNAc][prgA-peg-GalNAc][prgA-peg-GalNAc][prgA-peg-GalNAc][mG][mG][mC]
109 SERPINA1-1096反義鏈模式C [Phosphonate-4O-mUs][fAs][fGs][mA][fA][mG][fA] [fU][mG][fG][mC][fG][mG][fU][mG][fG][mC][mA][fU][mUs][mGs][mG]
110 SERPINA1-1416有義鏈模式C [mAs][mG][fA][mG][mG][mC][mC][fA][fU][fA][mC][fC][fC][mA][mU][mG][fU][mC][mU][mA][mG][mC][mC][prgG-peg-GalNAc][prgA-peg-GalNAc][prgA-peg-GalNAc][prgA-peg-GalNAc][mG][mG][mC]
111 SERPINA1-1416反義鏈模式C [Phosphonate-4O-mUs][fAs][fGs][mA][fC][mA][fU] [fG][mG][fG][mU][fA][mU][fG][mG][fC][mC][mU][fC][mUs][mGs][mG]
圖 1提供圖形，該圖形描繪在用如 表 2所提供之1、0.1或0.01 nM所指示的 SERPINA1RNAi寡核苷酸處理之後24小時留在Huh7細胞中之剩餘人類 SERPINA1mRNA百分比(%)。使樣品標準化以模擬經轉染對照。 圖 2A提供示意圖，該示意圖描繪N-乙醯基半乳糖胺(GalNAc)結合之雙鏈RNAi (dsRNAi)寡核苷酸SERPINA1-1459之序列及化學修飾模式。2’-OMe = 2′-O-甲基；2’-F = 2′-氟。圖2A以出現順序分別揭示SEQ ID NO 103-104。 圖 2B-2C提供圖形，該等圖形描繪SERPINA1- 1459 寡核苷酸(如 圖 2A中所描繪)之劑量反應( 圖 2B)及測定之半最大有效劑量(ED50) ( 圖 2C)。在用PBS中調配之1、3或10 mg/kg (n=5) SERPINA1-1459皮下(SC)注射之後的所指示時間，相對於PBS處理之小鼠中的Z-AAT蛋白%，量測留在PiZ小鼠之血清中的人類Z-AAT蛋白百分比(%)。*= P≤ 0.05，藉由非配對t測試；**= P≤ 0.01，藉由非配對t測試；*** = P≤ 0.001，藉由非配對t測試；****= P＜ 0.0001，藉由非配對t測試 圖 3提供圖形，該圖形描繪在22週時期內每4週一次投與六劑3 mg/kg SERPINA1-1459 (亦即，第0天初始劑量，及第4週、第8週、第12週、第16週及第20週各一劑)之後留在PiZ小鼠之肝臟中的人類 SERPINA1mRNA百分比(%)。在5、12或49週齡時起始處理且在研究完成時(分別為27、34或71周齡)收集末期肝臟樣品。生理食鹽水處理之小鼠用作對照。* = P＜ 0.05，與生理食鹽水處理之對照相比；**** = P≤ 0.0001，與生理食鹽水處理之對照相比。 圖 4提供圖形，該等圖形描繪留在如 圖 3所述經處理之PiZ小鼠的血液中之人類Z-AAT蛋白百分比(%)。在研究第4週、第8週、第12週、第16週、第20週及在研究終止時收集血液。生理食鹽水處理之小鼠用作對照。* = P＜ 0.05，與生理食鹽水處理之對照相比；*** = P≤ 0.001，與生理食鹽水處理之對照相比；**** = P≤ 0.0001，與生理食鹽水處理之對照相比。 圖 5提供西方墨點圖像，該圖像量測在22週時期內每4週一次投與六劑3 mg/kg SERPINA1-1459 (亦即，第0天初始劑量，及第4週、第8週、第12週、第16週及第20週各一劑)之後在PiZ小鼠之肝臟中的剩餘人類Z-AAT蛋白。在5週齡時起始處理且在研究完成時(27周齡)收集末期肝臟樣品。生理食鹽水處理之小鼠用作對照。 圖 6提供圖形，該等圖形對基於 圖 5中之西方墨點量測之人類Z-AAT蛋白水準定量。* = P＜ 0.05，與生理食鹽水處理之對照相比；**** = P≤ 0.0001，與生理食鹽水處理之對照相比。 圖 7提供免疫組織化學圖像，該等圖像量測在22週時期內每4週一次投與六劑3 mg/kg SERPINA1-1459 (亦即，第0天初始劑量，及第4週、第8週、第12週、第16週及第20週各一劑)之後在PiZ小鼠之肝臟中的剩餘總人類Z-AAT蛋白(如使用總A1AT蛋白抗體所量測)。在5週齡時起始處理且在研究完成時(27周齡)收集肝臟樣品。生理食鹽水處理之小鼠用作對照。自5週齡小鼠收集基線樣品。 圖 8提供免疫組織化學圖像，該等圖像量測在22週時期內每4週一次投與六劑3 mg/kg SERPINA1-1459 (亦即，第0天初始劑量，及第4週、第8週、第12週、第16週及第20週各一劑)之後在PiZ小鼠之肝臟中的人類Z-AAT聚合物負載。在5週齡時起始處理且在研究完成時(27周齡)收集末期肝臟樣品。生理食鹽水處理之小鼠用作對照。自5週齡小鼠收集基線樣品。 圖 9提供免疫組織化學圖像，該等圖像量測在22週時期內每4週一次投與六劑3 mg/kg SERPINA1-1459 (亦即，第0天初始劑量，及第4週、第8週、第12週、第16週及第20週各一劑)之後在PiZ小鼠之肝臟中的人類Z-AAT聚合物負載。在49週齡時起始處理且在研究完成時(71周齡)收集末期肝臟樣品。生理食鹽水處理之小鼠用作對照。自49週齡小鼠收集基線樣品。 圖 10提供過碘酸-席夫-澱粉酶(PAS-D)圖像，該等圖像量測在22週時期內每4週一次投與六劑3 mg/kg SERPINA1-1459 (亦即，第0天初始劑量，及第4週、第8週、第12週、第16週及第20週各一劑)之後在PiZ小鼠之肝臟中的肝細胞內小球形成。在5週齡時起始處理且在研究完成時(27周齡)收集末期肝臟樣品。生理食鹽水處理之小鼠用作對照。自5週齡小鼠收集基線樣品。 圖 11提供免疫組織化學圖像，該等圖像量測在22週時期內每4週一次投與六劑3 mg/kg SERPINA1-1459 (亦即，第0天初始劑量，及第4週、第8週、第12週、第16週及第20週各一劑)之後在PiZ小鼠之肝臟中的細胞增生(Ki67)。在5週齡時起始處理且在研究完成時(27周齡)收集末期肝臟樣品。生理食鹽水處理之小鼠用作對照。自5週齡小鼠收集基線樣品。 圖 12提供在22週時期內每4週一次投與六劑3 mg/kg SERPINA1-1459 (亦即，第0天初始劑量，及第4週、第8週、第12週、第16週及第20週各一劑)之後在PiZ小鼠之肝臟中的肝纖維化(Sirius Red染色)之免疫組織化學圖像。在5週齡時起始處理且在研究完成時(27周齡)收集末期肝臟樣品。生理食鹽水處理之小鼠用作對照。自5週齡小鼠收集基線樣品。 圖 13提供圖形，該等圖形描繪在22週時期內每4週一次投與六劑3 mg/kg SERPINA1-1459 (亦即，第0天初始劑量，及第4週、第8週、第12週、第16週及第20週各一劑)之後在PiZ小鼠之肝臟中的丙胺酸轉胺酶(ALT)、天冬胺酸轉胺酶(AST)及鹼性磷酸酶水準。在5、12或49週齡時起始處理且在研究完成時(分別為27、34或71周齡)收集末期血液樣品。生理食鹽水處理之小鼠用作對照。* = P＜ 0.05，與生理食鹽水處理之對照相比；**** = P≤ 0.0001，與生理食鹽水處理之對照相比。 圖 14顯示圖形，該等圖形描繪經SERPINA1-1459處理之PiZ小鼠中的 SERPINA1mRNA、血清Z-AAT蛋白、肝Z-AAT蛋白及肝小球之劑量依賴性基因敲低。在5週齡時起始處理且在0、0.3、1或3 mg/kg SERPINA1-1459之4個劑量之後，在18週齡時收集樣本。生理食鹽水處理之小鼠用作對照。 圖 15提供肝臟組織樣品之圖像，該等圖像藉由過碘酸-席夫-澱粉酶(PAS-D)染色量測每4週一次投與0、0.3、1或3 mg/kg SERPINA1-1459之4個劑量之後PiZ小鼠之肝臟的劑量依賴性肝細胞內小球形成。在5週齡時起始處理且在研究完成時(18周齡)收集末期肝臟樣品。生理食鹽水處理之小鼠用作對照。 圖 16提供圖形，該等圖形描繪經單一1、3或10 mg/kg皮下(SC)劑量之SERPINA1-1459處理的非人類靈長類動物(NHP)之平均及個別體重。 圖 17A提供圖形，該圖形描繪在單一1、3或10 mg/kg皮下(SC)劑量之SERPINA1-1459之後留在NHP之血液中的A1AT蛋白(亦即，循環A1AT蛋白)百分比(%)。 圖 17B提供圖形，該等圖形描繪在單一1、3或10 mg/kg皮下(SC)劑量之SERPINA1-1459之後留在NHP之血液中的A1AT蛋白(亦即，循環A1AT蛋白)百分比(%)。在第29天、第57天、第85天及第127天收集血清。使用對照血清(給藥前收集)。 圖 18顯示圖形，該等圖形描繪在重複投與0、30、100或300 mg/kg SERPINA1-1459 (每4週；4個劑量)之後在食蟹獼猴中之循環A1AT蛋白濃度。在幼猴及成年幼猴中在第87天且在幼猴中在第141天量測A1AT蛋白。使用對照血清(無處理)。 圖 19提供圖形，該圖形描繪在重複投與0、20、60或180 mg/kg SERPINA1-1459 (每4週；10劑)之後在食蟹獼猴之肝臟中的剩餘 SERPINA1mRNA百分比(%)。在投與最終劑量之後兩天對「主要研究組」進行尸體剖檢且「R」表示恢復尸體剖檢，其中在SERPINA1-1459之最後劑量後8週對個體進行尸體剖檢。 圖 20提供帶缺口之四環結構的示意圖。 

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          uguuaaaaag uuguaccaca                                                   20
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          ugugguacaa cuuuuuaaca gg                                                22
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          uuuaagaaga caaaggguuu gg                                                22
          <![CDATA[<210> 108]]>
          <![CDATA[<211> 30]]>
          <![CDATA[<212> RNA]]>
          <![CDATA[<213> 人工序列(Artificial Sequence)]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<221> 來源]]>
          <![CDATA[<223> /注意=「人工序列之描述：合成寡核苷酸」]]>
          <![CDATA[<400> 108]]>
          aaugccaccg ccaucuucua gccgaaaggc                                        30
          <![CDATA[<210> 109]]>
          <![CDATA[<211> 22]]>
          <![CDATA[<212> RNA]]>
          <![CDATA[<213> 人工序列(Artificial Sequence)]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<221> 來源]]>
          <![CDATA[<223> /注意=「人工序列之描述：合成寡核苷酸」]]>
          <![CDATA[<400> 109]]>
          uagaagaugg cgguggcauu gg                                                22
          <![CDATA[<210> 110]]>
          <![CDATA[<211> 30]]>
          <![CDATA[<212> RNA]]>
          <![CDATA[<213> 人工序列(Artificial Sequence)]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<221> 來源]]>
          <![CDATA[<223> /注意=「人工序列之描述：合成寡核苷酸」]]>
          <![CDATA[<400> 110]]>
          agaggccaua cccaugucua gccgaaaggc                                        30
          <![CDATA[<210> 111]]>
          <![CDATA[<211> 22]]>
          <![CDATA[<212> RNA]]>
          <![CDATA[<213> 人工序列(Artificial Sequence)]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<221> 來源]]>
          <![CDATA[<223> /注意=「人工序列之描述：合成寡核苷酸」]]>
          <![CDATA[<400> 111]]>
          uagacauggg uauggccucu gg                                                22
          <![CDATA[<210> 112]]>
          <![CDATA[<211> 36]]>
          <![CDATA[<212> RNA]]>
          <![CDATA[<213> 人工序列(Artificial Sequence)]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<221> 來源]]>
          <![CDATA[<223> /注意=「人工序列之描述：合成寡核苷酸」]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<221> 經修飾之鹼基]]>
          <![CDATA[<222> (1)..(19)]]>
          <![CDATA[<223> a、c、u、g、未知或其他]]>
          <![CDATA[<400> 112]]>
          nnnnnnnnnn nnnnnnnnna gcagccgaaa ggcugc                                 36
          <![CDATA[<210> 113]]>
          <![CDATA[<211> 36]]>
          <![CDATA[<212> RNA]]>
          <![CDATA[<213> 人工序列(Artificial Sequence)]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<221> 來源]]>
          <![CDATA[<223> /注意=「人工序列之描述：合成寡核苷酸」]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<221> 經修飾之鹼基]]>
          <![CDATA[<222> (1)..(20)]]>
          <![CDATA[<223> a、c、u、g、未知或其他]]>
          <![CDATA[<400> 113]]>
          nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn gcagccgaaa ggcugc                                 36
          <![CDATA[<210> 114]]>
          <![CDATA[<211> 30]]>
          <![CDATA[<212> RNA]]>
          <![CDATA[<213> 人工序列(Artificial Sequence)]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<221> 來源]]>
          <![CDATA[<223> /注意=「人工序列之描述：合成寡核苷酸」]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<221> 經修飾之鹼基]]>
          <![CDATA[<222> (1)..(19)]]>
          <![CDATA[<223> a、c、u、g、未知或其他]]>
          <![CDATA[<400> 114]]>
          nnnnnnnnnn nnnnnnnnna gccgaaaggc                                        30
          <![CDATA[<210> 115]]>
          <![CDATA[<211> 30]]>
          <![CDATA[<212> RNA]]>
          <![CDATA[<213> 人工序列(Artificial Sequence)]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<221> 來源]]>
          <![CDATA[<223> /注意=「人工序列之描述：合成寡核苷酸」]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<221> 經修飾之鹼基]]>
          <![CDATA[<222> (1)..(19)]]>
          <![CDATA[<223> a、c、u、g、未知或其他]]>
          <![CDATA[<400> 115]]>
          nnnnnnnnnn nnnnnnnnna gccgaaaggc                                        30
          <![CDATA[<210> 116]]>
          <![CDATA[<211> 36]]>
          <![CDATA[<212> RNA]]>
          <![CDATA[<213> 人工序列(Artificial Sequence)]]>
          <![CDATA[<220>]]>
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          <![CDATA[<221> 經修飾之鹼基]]>
          <![CDATA[<222> (1)..(20)]]>
          <![CDATA[<223> a、c、u、g、未知或其他]]>
          <![CDATA[<400> 116]]>
          nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn gcagccgaaa ggcugc                                 36
Figure 12_A0101_SEQ_0001
Figure 12_A0101_SEQ_0002
Figure 12_A0101_SEQ_0003
Figure 12_A0101_SEQ_0004
Figure 12_A0101_SEQ_0005
Figure 12_A0101_SEQ_0006
Figure 12_A0101_SEQ_0007
Figure 12_A0101_SEQ_0008
Figure 12_A0101_SEQ_0009
Figure 12_A0101_SEQ_0010
Figure 12_A0101_SEQ_0011
Figure 12_A0101_SEQ_0012
Figure 12_A0101_SEQ_0013
Figure 12_A0101_SEQ_0014
Figure 12_A0101_SEQ_0015
Figure 12_A0101_SEQ_0016
Figure 12_A0101_SEQ_0017
Figure 12_A0101_SEQ_0018
Figure 12_A0101_SEQ_0019
Figure 12_A0101_SEQ_0020
Figure 12_A0101_SEQ_0021
Figure 12_A0101_SEQ_0022
Figure 12_A0101_SEQ_0023
Figure 12_A0101_SEQ_0024
Figure 12_A0101_SEQ_0025
Figure 12_A0101_SEQ_0026
Figure 12_A0101_SEQ_0027
Figure 12_A0101_SEQ_0028
Figure 12_A0101_SEQ_0029
Figure 12_A0101_SEQ_0030
Figure 12_A0101_SEQ_0031
Figure 12_A0101_SEQ_0032

Claims (56)

  1. 一種用於降低α-1抗胰蛋白酶(A1AT)表現之寡核苷酸，該寡核苷酸包含15-30個核苷酸之反義鏈及15-50個核苷酸之有義鏈，其中該反義鏈包含選自SEQ ID No: 2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30及32之核苷酸序列，其中該有義鏈包含該反義鏈的互補區域，視情況其中該有義鏈包含選自SEQ ID No: 1、3、5、7、9、11、13、15、17、19、21、23、25、27、29及31之核苷酸序列。
  2. 如請求項1之寡核苷酸，其中該等有義鏈及反義鏈包含選自由以下組成之群的核苷酸序列： (a) 分別地，SEQ ID No: 1及2； (b) 分別地，SEQ ID No: 3及4； (c) 分別地，SEQ ID No: 5及6； (d) 分別地，SEQ ID No: 7及8； (e) 分別地，SEQ ID No: 9及10； (f) 分別地，SEQ ID No: 11及12； (g) 分別地，SEQ ID No: 13及14； (h) 分別地，SEQ ID No: 15及16； (i) 分別地，SEQ ID No: 17及18； (j) 分別地，SEQ ID No: 19及20； (k) 分別地，SEQ ID No: 21及22； (l) 分別地，SEQ ID No: 23及24； (m) 分別地，SEQ ID No: 25及26； (n) _分別地，SEQ ID No: 27及28； (o) 分別地，SEQ ID No: 29及30；及 (p) 分別地，SEQ ID No: 31及32。
  3. 一種用於降低α-1抗胰蛋白酶(A1AT)表現之寡核苷酸，該寡核苷酸包含15-30個核苷酸之反義鏈及15-50個核苷酸之有義鏈，其中該反義鏈包含至少19個連續核苷酸，與以SEQ ID NO: 26陳述之核苷酸序列相差3個或更少核苷酸，且該有義鏈包含以SEQ ID NO: 25陳述之核苷酸序列。
  4. 如請求項3之寡核苷酸，其中該有義鏈及反義鏈形成雙鏈區域，其中該反義鏈為19個至30個核苷酸長。
  5. 如請求項3之寡核苷酸，其中該反義鏈包含至少19個連續核苷酸，與核苷酸序列SEQ ID NO: 26相差2個或更少核苷酸。
  6. 如請求項1至5中任一項之寡核苷酸，其中該寡核苷酸包含至少一個經修飾之核苷酸。
  7. 如請求項6之寡核苷酸，其中該寡核苷酸之所有核苷酸均經修飾。
  8. 如請求項6或7之寡核苷酸，其中該經修飾之核苷酸包含2′-修飾。
  9. 如請求項8之寡核苷酸，其中該2′-修飾係選自2′-氟修飾、2′-O-甲基修飾或兩者。
  10. 如請求項1至6中任一項之寡核苷酸，其中該反義鏈包含22個核苷酸且該有義鏈包含36個核苷酸，其中該反義鏈及該有義鏈係以5’至3’編號，且其中以下位置中之一或多者係經2′-O-甲基修飾：該有義鏈之位置1、2、4、6、7、12、14、16、18-26或31-36及/或該反義鏈之位置1、6、8、11-13、15、17或19-22。
  11. 如請求項1至6中任一項之寡核苷酸，其中該反義鏈包含22個核苷酸且該有義鏈包含36個核苷酸，其中該反義鏈及該有義鏈係以5’至3’編號，且其中以下位置中之一或多者係經2′-氟修飾：該有義鏈之位置3、5、8-11、13、15或17及/或該反義鏈之位置2-5、7、9、10、14、16或18。
  12. 如請求項1至6中任一項之寡核苷酸，其中該反義鏈包含22個核苷酸且該有義鏈包含36個核苷酸，其中該反義鏈及該有義鏈係以5’至3’編號，且其中以下位置中之一或多者係經2′-O-甲基修飾：該有義鏈之位置1、2、4-7、11、14-16、18-26或31-36及/或該反義鏈之位置1、4、6、8-11、13、15、17、18或20-22；且其中以下位置中之一或多者係經2′-氟修飾：該有義鏈之位置3、8-10、12、13及17及/或該反義鏈之位置2、3、5、7、12、14、16及19。
  13. 如請求項1至6中任一項之寡核苷酸，其中該反義鏈包含22個核苷酸且該有義鏈包含36個核苷酸，其中該反義鏈及該有義鏈係以5’至3’編號，且其中以下位置中之一或多者係經2′-O-甲基修飾：該有義鏈之位置1、2、4-7、11、14-16、18-26或31-36及/或該反義鏈之位置1、4、6、8、9、11-13、15、18或20-22；且其中以下位置中之一或多者係經2′-氟修飾：該有義鏈之位置3、8-10、12、13或17及/或該反義鏈之位置2、3、5、7、10、14、16、17或19。
  14. 如前述請求項中任一項之寡核苷酸，其中該寡核苷酸包含至少一個經修飾之核苷酸間鍵。
  15. 如請求項14之寡核苷酸，其中該至少一個經修飾之核苷酸間鍵為硫代磷酸酯鍵。
  16. 如請求項1至15中任一項之寡核苷酸，其中該寡核苷酸在以下每一者之間具有硫代磷酸酯鍵：該有義鏈之位置1及2、該反義鏈之位置1及2、該反義鏈之位置2及3、該反義鏈之位置3及4、該反義鏈之位置20及21以及該反義鏈之位置21及22。
  17. 如前述請求項中任一項之寡核苷酸，其中該反義鏈之第一個位置處的尿苷包含磷酸酯類似物。
  18. 如請求項17之寡核苷酸，其包含在該反義鏈之位置1處之以下結構：
    Figure 03_image001
    。
  19. 如前述請求項中任一項之寡核苷酸，其中該有義鏈包含如S1-L-S2所陳述之莖-環，其中S1與S2互補，且其中L在S1與S2之間形成3-5個核苷酸長之環，且視情況其中L為四環。
  20. 如請求項19之寡核苷酸，其中該四環包含序列5’-GAAA’3’。
  21. 如請求項1至20中任一項之寡核苷酸，其中該寡核苷酸附接至一或多個N-乙醯基半乳糖胺(GalNAc)部分。
  22. 如請求項20之寡核苷酸，其中該有義鏈上之-GAAA-序列的一或多個核苷酸結合於單價GalNAc部分。
  23. 如請求項22或22之寡核苷酸，其中該-GAAA-序列包含以下結構：
    Figure 03_image003
    ， 其中： L表示一鍵、點擊化學手柄或1至20 (包括1及20)個連續共價鍵結之原子長之連接體，該連接體選自由以下組成之群：經取代及未經取代之伸烷基、經取代及未經取代之伸烯基、經取代及未經取代之伸炔基、經取代及未經取代之伸雜烷基、經取代及未經取代之伸雜烯基、經取代及未經取代之伸雜炔基及其組合；且 X為O、S或N。
  24. 如請求項23之寡核苷酸，其中L為縮醛連接體。
  25. 如請求項23或請求項24之寡核苷酸，其中X為O。
  26. 如請求項20及22至25中任一項之寡核苷酸，其中該-GAAA-序列包含以下結構：
    Figure 03_image005
    。
  27. 一種用於降低α-1抗胰蛋白酶(A1AT)表現之寡核苷酸，該寡核苷酸包含15-30個核苷酸之反義鏈及15-50個核苷酸之有義鏈，其中該反義鏈包含選自SEQ ID No: 34、36、38、40、42、44、46、48、50、52、54、56、58、60、62、64、66、68、70、72、74、76、78、80、82、84、86、88、90、92、94、96、98、100、102及104之核苷酸序列，其中該有義鏈包含該反義鏈的互補區域，視情況其中該有義鏈包含選自SEQ ID No: 33、35、37、39、41、43、45、47、49、51、53、55、57、59、61、63、65、67、69、71、73、75、77、79、81、83、85、87、89、91、93、95、97、99、101及103之核苷酸序列。
  28. 如請求項27之寡核苷酸，其中該等有義鏈及反義鏈包含選自由以下組成之群的核苷酸序列： (a) 分別地，SEQ ID No: 33及34； (b) 分別地，SEQ ID No: 35及36； (c) 分別地，SEQ ID No: 37及38； (d) 分別地，SEQ ID No: 39及40； (e) 分別地，SEQ ID No: 41及42； (f) 分別地，SEQ ID No: 43及44； (g) 分別地，SEQ ID No: 45及46； (h) 分別地，SEQ ID No: 47及48； (i) 分別地，SEQ ID No: 49及50； (j) 分別地，SEQ ID No: 51及52； (k) 分別地，SEQ ID No: 53及54； (l) 分別地，SEQ ID No: 55及56； (m) 分別地，SEQ ID No: 57及58； (n) 分別地，SEQ ID No: 59及60； (o) 分別地，SEQ ID No: 61及62； (p) 分別地，SEQ ID No: 63及64； (q) 分別地，SEQ ID No: 65及66； (r) 分別地，SEQ ID No: 67及68； (s) 分別地，SEQ ID No: 69及70； (t) 分別地，SEQ ID No: 71及72； (u) 分別地，SEQ ID No: 73及74； (v) 分別地，SEQ ID No: 75及76； (w) 分別地，SEQ ID No: 77及78； (x) 分別地，SEQ ID No: 79及80； (y) 分別地，SEQ ID No: 81及82； (z) 分別地，SEQ ID No: 83及84； (aa) 分別地，SEQ ID No: 85及86； (bb) 分別地，SEQ ID No: 87及88； (cc) 分別地，SEQ ID No: 89及90； (dd) 分別地，SEQ ID No: 91及92； (ee) 分別地，SEQ ID No: 93及94； (ff) 分別地，SEQ ID No: 95及96； (gg) 分別地，SEQ ID No: 97及98； (hh) 分別地，SEQ ID No: 99及100； (ii) 分別地，SEQ ID No: 101及102；及 (jj) 分別地，SEQ ID No: 103及104。
  29. 一種用於降低A1AT表現之寡核苷酸，該寡核苷酸包含具有如SEQ ID NO: 26所陳述之序列的反義鏈及具有如SEQ ID NO: 105所陳述之序列的有義鏈， 其中該有義鏈之位置1、2、4-7、11、14-16、18-26或31-36及該反義鏈之位置1、4、6、8-11、13、15、17、18或20-22均係經2′-O-甲基修飾，且該有義鏈之位置3、8-10、12、13及17及該反義鏈之位置2、3、5、7、12、14、16及19均係經2′-氟修飾； 其中該寡核苷酸在以下每一者之間具有硫代磷酸酯鍵：該有義鏈之位置1及2、該反義鏈之位置1及2、該反義鏈之位置2及3、該反義鏈之位置3及4、該反義鏈之位置20及21以及該反義鏈之位置21及22； 其中該寡核苷酸包含在該反義鏈之位置1處之以下結構：
    Figure 03_image001
    其中該有義鏈上之-GAAA-序列的每一個核苷酸均結合於單價GalNac部分，其中該-GAAA-序列包含以下結構：
    Figure 03_image005
    。
  30. 一種用於降低A1AT表現之寡核苷酸，該寡核苷酸包含含有核苷酸序列SEQ ID NO: 103之有義鏈，及含有核苷酸序列SEQ ID NO: 104之反義鏈，該反義鏈包含 A1ATRNA轉錄物之互補區域，其中該寡核苷酸係呈具有以下結構之結合物形式：
    Figure 03_image047
    。
  31. 一種組合物，其包含如前述請求項中任一項之寡核苷酸。
  32. 如請求項31之組合物，其進一步包含Na +相對離子。
  33. 一種組合物，其包含如請求項1至30中任一項之寡核苷酸及醫藥學上可接受之載劑或稀釋劑。
  34. 一種用於抑制α1抗胰蛋白酶(A1AT)表現之雙鏈核糖核酸(dsRNA)劑，其中該dsRNA包含形成雙鏈區域之有義鏈及反義鏈，其中該反義鏈包含至少15個連續核苷酸，與核苷酸序列SEQ ID NO: 26相差4個或更少核苷酸，其中該反義鏈為19個至35個核苷酸長。
  35. 如請求項34之dsRNA劑，其中該雙鏈區域之所有核苷酸均為經修飾之核苷酸，且其中該等經修飾之核苷酸係選自由2'-O-甲基修飾之核苷酸及2'-氟修飾之核苷酸組成之群；且其中該dsRNA附接至一或多個N-乙醯基半乳糖胺(GalNAc)部分。
  36. 如請求項34或35之dsRNA劑，其中該反義鏈為19個至30個核苷酸長，且其中該有義鏈係在32個與80個核苷酸長之間且包含四環。
  37. 如請求項34至36中任一項之dsRNA劑，其中該有義鏈包含以SEQ ID NO: 25陳述之核苷酸序列。
  38. 如請求項34至37中任一項之dsRNA劑，其中該反義鏈包含以SEQ ID NO: 104陳述之序列，且該有義鏈包含以SEQ ID NO: 103陳述之序列。
  39. 一種組合物，其包含如請求項34至38中任一項之dsRNA劑。
  40. 如請求項39之組合物，其進一步包含Na +相對離子。
  41. 一種組合物，其包含如請求項34至38中任一項之dsRNA劑及醫藥學上可接受之載劑或稀釋劑。
  42. 一種將寡核苷酸遞送至個體之方法，該方法包括投與如請求項1至30中任一項之寡核苷酸、如請求項31至33中任一項之組合物、如請求項34至38中任一項之dsRNA劑或如請求項39至41中任一項之組合物。
  43. 如請求項42之方法，其中遞送該寡核苷酸、組合物或dsRNA劑以治療或預防該個體之肝臟疾病或病症，其中該肝臟疾病或病症係選自由慢性肝臟疾病、肝臟發炎、肝硬化、肝臟纖維化及肝細胞癌組成之群。
  44. 如請求項42或43之方法，其中該個體為人類。
  45. 如請求項42至44中任一項之方法，其中經靜脈內或皮下將該寡核苷酸、組合物或dsRNA劑投與至該個體。
  46. 一種用於降低哺乳動物中之標靶α-1抗胰蛋白酶mRNA表現之方法，該方法包括投與如請求項1至30中任一項之寡核苷酸、如請求項31至33中任一項之組合物、如請求項34至38中任一項之dsRNA劑或如請求項39至41中任一項之組合物，其量足以降低該哺乳動物中之標靶α-1抗胰蛋白酶mRNA表現。
  47. 如請求項46之方法，其中在脂質奈米粒子(LNP)中調配該寡核苷酸。
  48. 如請求項42至47中任一項之方法，其中以選自由1微克至5毫克/公斤該哺乳動物/天、100微克至0.5毫克/公斤、0.001至0.25毫克/公斤、0.01至20微克/公斤、0.01至10微克/公斤、0.10至5微克/公斤及0.1至2.5微克/公斤組成之群之劑量投與該寡核苷酸或dsRNA劑。
  49. 如請求項46至48中任一項之方法，其中在將該寡核苷酸、組合物或dsRNA劑投與至該哺乳動物之後至少3天，該哺乳動物之組織中的α-1抗胰蛋白酶mRNA水準降低達至少70%之量(以%表述)。
  50. 如請求項49之方法，其中該組織為肝臟組織。
  51. 如請求項42至44及46至50中任一項之方法，其中該投與步驟包括選自由靜脈內注射、肌肉內注射、腹膜內注射、輸注、皮下注射、經皮、氣霧劑、直腸、陰道、表面、經口及吸入遞送組成之群之投與途徑。
  52. 一種用於治療或預防動物之肝臟疾病或病症之方法，該方法包括向該個體投與足以治療或預防該個體之該肝臟疾病或病症之量的如請求項1至30中任一項之寡核苷酸、如請求項31至33中任一項之組合物、如請求項34至38中任一項之dsRNA劑或如請求項39至41中任一項之組合物，其中該肝臟疾病或病症係選自由慢性肝臟疾病、肝臟發炎、肝硬化、COPD、肺氣腫肝臟纖維化及肝細胞癌組成之群。
  53. 如請求項52之方法，其中該動物為人類。
  54. 一種套組，其包含如請求項1至30中任一項之寡核苷酸、如請求項31至33中任一項之組合物、如請求項34至38中任一項之dsRNA劑或如請求項39至41中任一項之組合物，及關於降低有需要之個體的α-1抗胰蛋白酶表現之說明書。
  55. 一種如請求項1至30中任一項之寡核苷酸、如請求項31至33中任一項之組合物、如請求項34至38中任一項之dsRNA劑或如請求項39至41中任一項之組合物的用途，其用於製造用於降低有需要之個體的α-1抗胰蛋白酶表現之藥劑。
  56. 如請求項54之套組或如請求項55之用途，其中該個體患有肝臟疾病或病症。
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