CN117897483A - 用于抑制α-1抗胰蛋白酶表达的组合物和方法 - Google Patents

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Abstract

本公开涉及可用于通过使用dsRNA，例如切酶底物siRNA(DsiRNA)剂，降低α‑1抗胰蛋白酶靶RNA和蛋白质水平的化合物、组合物和方法。

Description

用于抑制α-1抗胰蛋白酶表达的组合物和方法
背景技术
α1-抗胰蛋白酶(A1AT或SERPINA1或Serpina1或AAT)是属于丝氨酸蛋白酶抑制剂(serpin)超家族的蛋白酶抑制剂。它通常被称为血清胰蛋白酶抑制剂。α1-抗胰蛋白酶也称为α-1蛋白酶抑制剂(A1PI)，因为它抑制种类多样的蛋白酶(Gettins P.G.等人，CHEM REV102：4751-804)。它保护组织免受炎性细胞的酶(尤其是嗜中性粒细胞弹性蛋白酶)的影响，并且在血液中的参考范围为1.5-3.5克/升，但在急性炎症时其水平可升高数倍(Kushner和Mackiewicz，ACUTE-PHASEPROTEINS：MOLECULAR BIOLOGY，BIOCHEMISTRY AND CLINICALAPPLICATIONS(CRC Press)；1993，第1章，pp.3-19)。如果不存在AAT，AAT与弹性蛋白酶之间的平衡就会被破坏，并可能造成损害。在正常情况下，弹性蛋白酶在对抗感染方面发挥重要作用，但过多的话也会损害健康组织。在高浓度下，它对肺的内层和肺泡造成损害，更具体地说，在这样的情况下，弹性蛋白酶可以自由分解弹性蛋白(弹性蛋白有助于肺的弹性)，从而导致呼吸系统并发症，如肺气肿，或成人的COPD(慢性阻塞性肺病)和成人或儿童的硬化(Gadek JE等人，LUNG，1990，168Suppl：552-64；Birrer P，AGENTS ACTIONS SUPPL.，1993，40：3-12)。另外，AAT缺乏可影响肝脏，导致功能不良并增加肝硬化和肝癌的风险。对于AAT缺乏的人来说，在生命的前三十年，肝病比肺病更常见(Gadek JE等人，LUNG，1990)。在一些个体中，AAT缺乏可导致皮肤上频繁出现红色、疼痛的结节。在AAT基因的一个或两个拷贝中发生突变的个体可能会罹患α-1抗胰蛋白酶缺乏症，由于肺和肝脏中的弹性蛋白酶活性高于正常水平，这会表现为发生肺气肿(DeMeo DL和Silverman EK(2004年3月)，Alpha1-antitrypsin deficiency.2：genetic aspects of alpha(1)-antitrypsin deficiency：phenotypes and genetic modifiers of emphysema risk，THORAX 59(3)：259-64)或慢性肝病的风险。SERPINA1已定位于染色体14q32，并且已鉴定出SERPINA1基因的超过75个突变，其中许多具有临床上显著的影响(Silverman E.K.，Sandhaus RA(2009)，Alpha1-Antitrypsin Deficiency，NEW ENGLAND JOURNAL OF MEDICINE 360(26)：2749-57)。严重缺乏症PiZ的最常见原因是单碱基对置换，导致第342位谷氨酸突变为赖氨酸(dbSNP：rs28929474)，而PiS则是由第264位谷氨酸突变为缬氨酸(dbSNP：rs17580)引起的。
在受影响的个体中，α-1抗胰蛋白酶的缺乏是野生型、功能性α-1抗胰蛋白酶的缺乏。然而，在某些情况下，个体产生大量的α-1抗胰蛋白酶，但所产生的α-1抗胰蛋白酶蛋白质的一部分是错折叠的或包含损害或消除该蛋白质的天然功能的突变。在某些情况下，个体产生错折叠的蛋白质，这些蛋白质无法正确地从体内合成部位转运到作用部位。
α-1抗胰蛋白酶缺乏导致的肝病可能是由此类错折叠的蛋白质引起的。α-1抗胰蛋白酶的突变形式(例如，常见的PiZ变体，其在位置342(加工前形式中的位置366)处携带谷氨酸到赖氨酸的突变)在肝细胞中产生(肝脏中的肝细胞通常产生大量循环AAT)，并且在错折叠的构型下，这类形式不容易被转运出细胞。这导致肝脏细胞中错折叠的蛋白质的积累(肝细胞，其中具有最大突变Z蛋白负担的细胞可遭受一连串细胞内损伤，最终导致凋亡；这种肝细胞凋亡和再生的慢性循环最终可导致纤维化和器官损伤)，并且可引起一种或多种肝脏疾病或病症，包括但不限于慢性肝病、肝脏炎症、肝硬化、肝纤维化和/或肝细胞癌(Rudnick DA和Perlmutter DH.，Alpha-1-antitrypsin deficiency：a new paradigm forhepatocellular carcinoma in genetic liver disease，HEPATOLOGY；2005，42(3)：514-21)。患有AAT缺乏症的个体可出现其他症状，其中可包括：呼吸短促、咳嗽过多伴痰产生、哮鸣、运动能力下降以及持续的低能量状态或疲倦、吸气时胸痛加剧。这些症状可能是慢性的，或者伴随急性呼吸道感染如感冒或流感而发生。在极少数情况下，AAT可引起被称为脂膜炎的皮肤病，导致硬化斑块和红色、疼痛的肿块(Gadek JE等人，LUNG，1990)。
目前，成功治疗患有与α-1抗胰蛋白酶缺乏相关的肝病的患者的选择很少，这些选择包括肝炎疫苗接种、支持性医护和避免有害物质(例如，酒精和NSAID)，其中没有一个提供靶向治疗。α-1抗胰蛋白酶的替代对这些患者的肝病没有影响，但肝移植可能有效。因此，仍然需要用于治疗患有与α-1抗胰蛋白酶缺乏相关的肝病的患者的组合物和方法。
发明内容
本公开部分地基于如下寡核苷酸(例如，RNAi寡核苷酸)的发现，所述寡核苷酸具有降低肝脏中的Alpha-1抗胰蛋白酶(α-1抗胰蛋白酶或A1AT或SERPINA1)表达的功能。具体来说，鉴定了α-1抗胰蛋白酶mRNA内的靶序列，并且生成了能与这些靶序列结合并抑制α-1抗胰蛋白酶mRNA表达的寡核苷酸。如本文所证明的，所述寡核苷酸抑制肝脏中的鼠α-1抗胰蛋白酶表达和/或猴和人α-1抗胰蛋白酶表达。不受理论的束缚，本文所述的寡核苷酸可用于治疗与α-1抗胰蛋白酶表达相关的疾病、病症或状况(例如，肺部炎症、慢性阻塞性肺病(COPD)、肺气肿和/或慢性肝病，例如慢性肝病、肝脏炎症、肝硬化、肝纤维化和/或肝细胞癌)。在一些实施方案中，本文所述的寡核苷酸可用于治疗与α-1抗胰蛋白酶中的突变相关的疾病、病症或状况。第9,458,457号美国专利中描述了降低α-1抗胰蛋白酶表达的寡核苷酸，该专利通过引用并入本文。
在一些方面，本公开提供了用于降低α-1抗胰蛋白酶(A1AT)的表达的寡核苷酸，所述寡核苷酸包含15-30个核苷酸的反义链和15-50个核苷酸的有义链，其中所述反义链包含选自SEQ ID No：2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30和32的核苷酸序列，其中所述有义链包含与所述反义链互补的互补区域，任选地其中所述有义链包含选自SEQ ID No：1、3、5、7、9、11、13、15、17、19、21、23、25、27、29和31的核苷酸序列。
在任何前述或相关方面，所述有义链和反义链包含选自下组的核苷酸序列：
(a)分别为SEQ ID No：1和2；
(b)分别为SEQ ID No：3和4；
(c)分别为SEQ ID No：5和6；
(d)分别为SEQ ID No：7和8；
(e)分别为SEQ ID No：9和10；
(f)分别为SEQ ID No：11和12；
(g)分别为SEQ ID No：13和14；
(h)分别为SEQ ID No：15和16；
(i)分别为SEQ ID No：17和18；
(j)分别为SEQ ID No：19和20；
(k)分别为SEQ ID No：21和22；
(l)分别为SEQ ID No：23和24；
(m)分别为SEQ ID No：25和26；
(n)分别为SEQ ID No：27和28；
(o)分别为SEQ ID No：29和30；以及，
(p)分别为SEQ ID No：31和32。
在其他方面，本公开提供了用于降低α-1抗胰蛋白酶(A1AT)的表达的寡核苷酸，所述寡核苷酸包含15-30个核苷酸的反义链和15-50个核苷酸的有义链，其中所述反义链包含与SEQ ID NO：26中所示的核苷酸序列有3个或更少核苷酸不同的至少19个连续核苷酸，并且所述有义链包含SEQ ID NO：25中所示的核苷酸序列。在其他方面，本公开提供了用于降低α-1抗胰蛋白酶(A1AT)的表达的寡核苷酸，所述寡核苷酸包含15-30个核苷酸的反义链和15-50个核苷酸的有义链，其中所述反义链包含与SEQ ID NO：26中所示的核苷酸序列有3个或更少核苷酸不同的至少19个连续核苷酸，并且所述有义链包含SEQ ID NO：105中所示的核苷酸序列。
在任何前述或相关方面，所述有义链和反义链形成双链区域，其中所述反义链的长度为19至30个核苷酸。在其他方面，所述反义链包含与SEQ ID NO：26的核苷酸序列有2个或更少核苷酸不同的至少19个连续核苷酸。
在任何前述或相关方面，所述寡核苷酸包含至少一个经修饰的核苷酸。在一些方面，所述寡核苷酸的所有核苷酸均被修饰。在一些方面，所述经修饰的核苷酸包含2’-修饰。在一些方面，所述2’-修饰选自2’-氟代修饰、2’-O-甲基修饰或其两者。
在任何前述或相关方面，所述反义链包含22个核苷酸并且所述有义链包含36个核苷酸，其中所述反义链和有义链从5’至3’编号，并且其中以下位置中的一个或多个位置被2’-O-甲基修饰：有义链的位置1、2、4、6、7、12、14、16、18-26或31-36，和/或反义链的位置1、6、8、11-13、15、17或19-22。在其他方面，以下位置中的一个或多个位置被2’-氟代修饰：有义链的位置3、5、8-11、13、15或17，和/或反义链的位置2-5、7、9、10、14、16或18。在另外其他方面，以下位置中的一个或多个位置被2’-O-甲基修饰：有义链的位置1、2、4-7、11、14-16、18-26或31-36，和/或反义链的位置1、4、6、8-11、13、15、17、18或20-22；并且其中以下位置中的一个或多个位置被2’-氟代修饰：有义链的位置3、8-10、12、13和17，和/或反义链的位置2、3、5、7、12、14、16和19。在其他方面，以下位置中的一个或多个位置被2’-O-甲基修饰：有义链的位置1、2、4-7、11、14-16、18-26或31-36，和/或反义链的位置1、4、6、8、9、11-13、15、18或20-22；并且其中以下位置中的一个或多个位置被2’-氟代修饰：有义链的位置3、8-10、12、13或17，和/或反义链的位置2、3、5、7、10、14、16、17或19。
在任何前述或相关方面，所述寡核苷酸包含至少一个经修饰的核苷酸间键合。在一些方面，所述至少一个经修饰的核苷酸间键合是硫代磷酸酯键。在一些方面，所述寡核苷酸在以下各位置之间具有硫代磷酸酯键：有义链的位置1和2、反义链的位置1和2、反义链的位置2和3、反义链的位置3和4、反义链的位置20和21以及反义链的位置21和22。
在任何前述或相关方面，所述反义链的第一个位置处的尿苷包含磷酸酯类似物。在一些方面，所述寡核苷酸在反义链的位置1处包含以下结构：
在任何前述或相关方面，所述寡核苷酸附接至一个或多个N-乙酰半乳糖胺(GalNAc)部分。
在任何前述或相关方面，所述有义链包含表示为S1-L-S2的茎-环，其中S1与S2互补，并且其中L在S1与S2之间形成长度为3-5个核苷酸的环。在一些方面，L为四环。在一些方面，所述四环包含序列5’-GAAA’3’。在一些方面，所述有义链上的-GAAA-序列的一个或多个核苷酸缀合至单价GalNAc部分。在一些方面，所述-GAAA-序列包含以下结构：
其中：
L表示键、点击化学柄或长度为1至20个(包括端值)连续共价键合原子的连接体，该连接体选自取代和未取代的亚烷基、取代和未取代的亚烯基、取代和未取代的亚炔基、取代和未取代的亚杂烷基、取代和未取代的亚杂烯基、取代和未取代的亚杂炔基，以及它们的组合；且X为O、S或N。在一些方面，L为缩醛连接体。在一些方面，其中X为O。
在其他方面，所述-GAAA-序列包含以下结构：
在其他方面，本公开提供了用于降低α-1抗胰蛋白酶(A1AT)的表达的寡核苷酸，所述寡核苷酸包含15-30个核苷酸的反义链和15-50个核苷酸的有义链，其中所述反义链包含选自SEQ ID No：34、36、38、40、42、44、46、48、50、52、54、56、58、60、62、64、66、68、70、72、74、76、78、80、82、84、86、88、90、92、94、96、98、100、102和104的核苷酸序列，其中所述有义链包含与所述反义链互补的互补区域，任选地其中所述有义链包含选自SEQ ID No：33、35、37、39、41、43、45、47、49、51、53、55、57、59、61、63、65、67、69、71、73、75、77、79、81、83、85、87、89、91、93、95、97、99、101和103的核苷酸序列。
在任何前述或相关方面，所述有义链和反义链包含选自下组的核苷酸序列：
(a)分别为SEQ ID No：33和34；
(b)分别为SEQ ID No：35和36；
(c)分别为SEQ ID No：37和38；
(d)分别为SEQ ID No：39和40；
(e)分别为SEQ ID No：41和42；
(f)分别为SEQ ID No：43和44；
(g)分别为SEQ ID No：45和46；
(h)分别为SEQ ID No：47和48；
(i)分别为SEQ ID No：49和50；
(j)分别为SEQ ID No：51和52；
(k)分别为SEQ ID No：53和54；
(l)分别为SEQ ID No：55和56；
(m)分别为SEQ ID No：57和58；
(n)分别为SEQ ID No：59和60；
(o)分别为SEQ ID No：61和62；
(p)分别为SEQ ID No：63和64；
(q)分别为SEQ ID No：65和66；
(r)分别为SEQ ID No：67和68；
(s)分别为SEQ ID No：69和70；
(t)分别为SEQ ID No：71和72；
(u)分别为SEQ ID No：73和74；
(v)分别为SEQ ID No：75和76；
(w)分别为SEQ ID No：77和78；
(x)分别为SEQ ID No：79和80；
(y)分别为SEQ ID No：81和82；
(z)分别为SEQ ID No：83和84；
(aa)分别为SEQ ID No：85和86；
(bb)分别为SEQ ID No：87和88；
(cc)分别为SEQ ID No：89和90；
(dd)分别为SEQ ID No：91和92；
(ee)分别为SEQ ID No：93和94；
(ff)分别为SEQ ID No：95和96；
(gg)分别为SEQ ID No：97和98；
(hh)分别为SEQ ID No：99和100；
(ii)分别为SEQ ID No：101和102；以及，
(jj)分别为SEQ ID No：103和104。
在进一步的方面，本公开提供了用于降低A1AT的表达的寡核苷酸，所述寡核苷酸包含具有SEQ ID NO：26所示序列的反义链和具有SEQ ID NO：105所示序列的有义链，
其中所述有义链的位置1、2、4-7、11、14-16、18-26或31-36以及所述反义链的位置1、4、6、8-11、13、15、17、18或20-22均被2’-O-甲基修饰，并且所述有义链的位置3、8-10、12、13和17以及所述反义链的位置2、3、5、7、12、14、16和19均被2’-氟代修饰；
其中所述寡核苷酸在以下各位置之间具有硫代磷酸酯键：有义链的位置1和2、反义链的位置1和2、反义链的位置2和3、反义链的位置3和4、反义链的位置20和21以及反义链的位置21和22；
其中所述寡核苷酸在所述反义链的位置1处包含以下结构：
其中所述有义链上的-GAAA-序列的每个核苷酸缀合至单价GalNAc部分，其中所述-GAAA-序列包含以下结构：
在进一步的方面，本公开提供了用于降低A1AT的表达的寡核苷酸，所述寡核苷酸包含有义链和反义链，所述有义链包含SEQ ID NO：103的核苷酸序列，所述反义链包含SEQID NO：104的核苷酸序列，所述反义链包含与A1ATRNA转录物互补的互补区域，其中所述寡核苷酸是具有以下结构的缀合物的形式：
在其他方面，本公开提供了包含本文所述寡核苷酸的组合物。在一些方面，所述组合物包含Na+抗衡离子。在进一步的方面，本公开提供了包含本文所述寡核苷酸和药学上可接受的载剂或稀释剂的组合物。
在又进一步的方面，本公开提供了用于抑制α1抗胰蛋白酶(A1AT)的表达的双链核糖核酸(dsRNA)剂，其中所述dsRNA包含形成双链区域的有义链和反义链，其中所述反义链包含与SEQ ID NO：26的核苷酸序列有4个或更少核苷酸不同的至少15个连续核苷酸，其中所述反义链的长度为19至35个核苷酸。在一些方面，所述双链区域的所有核苷酸都是经修饰的核苷酸，并且其中所述经修饰的核苷酸选自2’-O-甲基修饰的核苷酸和2’-氟代修饰的核苷酸；并且其中所述dsRNA附接至一个或多个N-乙酰半乳糖胺(GalNAc)部分。在一些方面，所述反义链的长度为19至30个核苷酸，并且所述有义链的长度为32至80个核苷酸并且包含四环。在一些方面，所述有义链包含SEQ ID NO：25中所示的核苷酸序列。在一些方面，所述有义链包含SEQ ID NO：105中所示的核苷酸序列。在一些方面，所述反义链包含SEQ IDNO：104中所示的序列，并且所述有义链包含SEQ ID NO：103中所示的序列。
在进一步的方面，本公开提供了包含本文所述dsRNA剂的组合物。在一些方面，所述组合物包含Na+抗衡离子。在其他方面，所述组合物包含药学上可接受的载剂或稀释剂。
在一些方面，本公开提供了将寡核苷酸递送至受试者的方法，该方法包括施用本文所述的寡核苷酸、dsRNA剂或组合物。在一些方面，递送所述寡核苷酸、组合物或dsRNA剂以治疗或预防所述受试者的肝脏疾病或病症，其中所述肝脏疾病或病症选自慢性肝病、肝脏炎症、肝硬化、肝纤维化和肝细胞癌。在一些方面，所述受试者是人。在一些方面，将所述寡核苷酸、组合物或dsRNA剂静脉内或皮下施用于所述受试者。
在其他方面，本公开提供了用于降低哺乳动物中靶α-1抗胰蛋白酶mRNA的表达的方法，其包括以足以降低所述哺乳动物中靶α-1抗胰蛋白酶mRNA的表达的量施用本文所述的寡核苷酸、dsRNA剂或组合物。在一些方面，所述寡核苷酸在脂质纳米颗粒(LNP)中配制。
在任何前述或相关方面，所述寡核苷酸或dsRNA剂以选自每天每千克所述哺乳动物1微克至5毫克、每千克100微克至0.5毫克、每千克0.001至0.25毫克、每千克0.01至20微克、每千克0.01至10微克、每千克0.10至5微克以及每千克0.1至2.5微克的剂量施用。
在任何前述或相关方面，在向所述哺乳动物施用所述寡核苷酸、组合物或dsRNA剂后至少3天，所述哺乳动物的组织中的α-1抗胰蛋白酶mRNA水平降低至少70％的量(以％表示)。在一些方面，所述组织是肝组织。
在任何前述或相关方面，所述施用步骤包括选自静脉内注射、肌肉内注射、腹膜内注射、输注、皮下注射、透皮、气雾剂、直肠、阴道、局部、口服和吸入递送的给药途径。
在其他方面，本公开提供了用于治疗或预防动物的肝脏疾病或病症的方法，其包括向所述受试者施用足以治疗或预防所述受试者的所述肝脏疾病或病症的量的本文所述的寡核苷酸、dsRNA剂或组合物，其中所述肝脏疾病或病症选自慢性肝病、肝脏炎症、肝硬化、COPD、肺气肿、肝纤维化和肝细胞癌。在一些方面，所述动物是人。
在进一步的方面，本公开提供了试剂盒，其包含本文所述的寡核苷酸、dsRNA剂或组合物，以及关于降低有需要的受试者中的α-1抗胰蛋白酶表达的说明书。在一些方面，所述受试者患有肝脏疾病或病症。
在更进一步的方面，本公开提供了本文所述的寡核苷酸、dsRNA剂或组合物在制备用于降低有需要的受试者中的α-1抗胰蛋白酶表达的药物中的用途。在一些方面，所述受试者患有肝脏疾病或病症。
附图说明
图1提供的图形描绘了用1、0.1或0.01nM表2中提供的所示SERPINA1 RNAi寡核苷酸处理后24小时，Huh7细胞中剩余的人SERPINA1 mRNA的剩余百分比(％)。将样品相对于模拟转染的对照进行归一化。
图2A提供了描绘SERPINA1-1459的序列和化学修饰模式的示意图，SERPINA1-1459是一种N-乙酰半乳糖胺(GalNAc)缀合的双链RNAi(dsRNAi)寡核苷酸。2’-OMe＝2′-O-甲基；2’-F＝2′-氟代。图2A以出现的顺序分别披露了SEQ ID NO 103-104。
图2B-图2C提供的图形描绘了SERPINA1-1459寡核苷酸(如图2A中所示)的剂量响应(图2B)和确定的半数最大有效剂量(ED50)(图2C)。相对于PBS处理的小鼠中Z-AAT蛋白的百分比，在PiZ小鼠中皮下(SC)注射1、3或10mg/kg(n＝5)在PBS中配制的SERPINA1-1459后，在所示时间测量血清中剩余的人Z-AAT蛋白的百分比(％)。*＝通过未配对t检验P≤0.05；**＝通过未配对t检验P≤0.01；***＝通过未配对t检验P≤0.001；****＝通过未配对t检验P＜0.0001
图3提供的图形描绘了在22周期间每4周一次共给予六剂3mg/kg SERPINA1-1459(即，第0天的初始剂量，以及第4、8、12、16和20周的剂量)后，PiZ小鼠的肝脏中剩余的人SERPINA1 mRNA的百分比(％)。治疗在5、12或49周龄时开始，并在研究完成时(分别为27、34或71周龄)收集终末肝脏样品。使用盐水处理的小鼠作为对照。*＝与盐水处理的对照相比，P＜0.05；****＝与盐水处理的对照相比，P≤0.0001。
图4提供的图形描绘了如图3所述治疗的PiZ小鼠的血液中剩余的人Z-AAT蛋白的百分比(％)。在研究第4、8、12、16、20周以及研究结束时采集血液。使用盐水处理的小鼠作为对照。*＝与盐水处理的对照相比，P＜0.05；***＝与盐水处理的对照相比，P≤0.001；****＝与盐水处理的对照相比，P≤0.0001。
图5提供了在22周期间每4周一次共给予六剂3mg/kg SERPINA1-1459(即，第0天的初始剂量，以及第4、8、12、16和20周的剂量)后，测量PiZ小鼠肝脏中剩余的人Z-AAT蛋白的Westem印迹图像。治疗在5周龄时开始，并在研究完成时(27周龄)收集终末肝脏样品。使用盐水处理的小鼠作为对照。
图6提供了对基于图5中的Westem印迹测量的人Z-AAT蛋白水平进行定量的图形。*＝与盐水处理的对照相比，P＜0.05；****＝与盐水处理的对照相比，P≤0.0001。
图7提供了在22周期间每4周一次共给予六剂3mg/kg SERPINA1-1459(即，第0天的初始剂量，以及第4、8、12、16和20周的剂量)后，测量PiZ小鼠肝脏中剩余的总人Z-AAT蛋白(如使用总A1AT蛋白抗体测量的)的免疫组织化学图像。治疗在5周龄时开始，并在研究完成时(27周龄)收集肝脏样品。使用盐水处理的小鼠作为对照。基线样品是在5周龄时从小鼠采集的。
图8提供了在22周期间每4周一次共给予六剂3mg/kg SERPINA1-1459(即，第0天的初始剂量，以及第4、8、12、16和20周的剂量)后，测量PiZ小鼠肝脏中的人Z-AAT聚合物负荷的免疫组织化学图像。治疗在5周龄时开始，并在研究完成时(27周龄)收集终末肝脏样品。使用盐水处理的小鼠作为对照。基线样品是在5周龄时从小鼠采集的。
图9提供了在22周期间每4周一次共给予六剂3mg/kg SERPINA1-1459(即，第0天的初始剂量，以及第4、8、12、16和20周的剂量)后，测量PiZ小鼠肝脏中的人Z-AAT聚合物负荷的免疫组织化学图像。治疗在49周龄时开始，并在研究完成时(71周龄)收集终末肝脏样品。使用盐水处理的小鼠作为对照。基线样品是在49周龄时从小鼠采集的。
图10提供了在22周期间每4周一次共给予六剂3mg/kg SERPINA1-1459(即，第0天的初始剂量，以及第4、8、12、16和20周的剂量)后，测量PiZ小鼠肝脏中的肝脏细胞内小球形成的过碘酸-希夫-淀粉酶(PAS-D)图像。治疗在5周龄时开始，并在研究完成时(27周龄)收集终末肝脏样品。使用盐水处理的小鼠作为对照。基线样品是在5周龄时从小鼠采集的。
图11提供了在22周期间每4周一次共给予六剂3mg/kg SERPINA1-1459(即，第0天的初始剂量，以及第4、8、12、16和20周的剂量)后，测量PiZ小鼠肝脏中的细胞增殖(Ki67)的免疫组织化学图像。治疗在5周龄时开始，并在研究完成时(27周龄)收集终末肝脏样品。使用盐水处理的小鼠作为对照。基线样品是在5周龄时从小鼠采集的。
图12提供了在22周期间每4周一次共给予六剂3mg/kg SERPINA1-1459(即，第0天的初始剂量，以及第4、8、12、16和20周的剂量)后，PiZ小鼠肝脏中的肝纤维化(天狼星红(Sirius Red)染色)的免疫组织化学图像。治疗在5周龄时开始，并在研究完成时(27周龄)收集终末肝脏样品。使用盐水处理的小鼠作为对照。基线样品是在5周龄时从小鼠采集的。
图13提供的图形描绘了在22周期间每4周一次共给予六剂3mg/kg SERPINA1-1459(即，第0天的初始剂量，以及第4、8、12、16和20周的剂量)后，PiZ小鼠肝脏中丙氨酸氨基转移酶(ALT)、天冬氨酸氨基转移酶(AST)和碱性磷酸酶的水平。治疗在5、12或49周龄时开始，并在研究完成时(分别为27、34或71周龄)采集终末血液样品。使用盐水处理的小鼠作为对照。*＝与盐水处理的对照相比，P＜0.05；****＝与盐水处理的对照相比，P≤0.0001。
图14显示的图形描绘了用SERPINA1-1459治疗的PiZ小鼠中SERPINA1 mRNA、血清Z-AAT蛋白、肝Z-AAT蛋白和肝小球的剂量依赖性敲低。治疗在5周龄时开始，并在接受4剂0、0.3、1或3mg/kg SERPINA1-1459后，在18周龄时采集标本。使用盐水处理的小鼠作为对照。
图15提供了肝组织样品的图像，在每4周一次共给予4剂0、0.3、1或3mg/kgSERPINA1-1459后，通过对PiZ小鼠的肝脏进行过碘酸-希夫-淀粉酶(PAS-D)染色，测量了剂量依赖性肝脏细胞内小球形成。治疗在5周龄时开始，并在研究完成时(18周龄)收集终末肝脏样品。使用盐水处理的小鼠作为对照。
图16提供的图形描绘了用单次1、3或10mg/kg皮下(SC)剂量的SERPINA1-1459治疗的非人灵长类动物(NHP)的平均体重和个体体重。
图17A提供的图形描绘了在单次1、3或10mg/kg皮下(SC)剂量的SERPINA1-1459后，NHP的血液中剩余的A1AT蛋白(即，循环A1AT蛋白)的百分比(％)。
图17B提供的图形描绘了在单次1、3或10mg/kg皮下(SC)剂量的SERPINA1-1459后，NHP的血液中剩余的A1AT蛋白(即，循环A1AT蛋白)的百分比(％)。在第29、57、85和127天收集血清。使用对照血清(给药前采集)。
图18显示的图形描绘了在重复施用0、30、100或300mg/kg SERPINA1-1459(每4周一次；4剂)后，食蟹猴中的循环A1AT蛋白浓度。幼年和年轻成年猴子在第87天测量A1AT蛋白，并且幼年猴子在第141天测量A1AT蛋白。使用对照血清(无处理)。
图19提供的图形描绘了在重复施用0、20、60或180mg/kg SERPINA1-1459(每4周一次；10剂)后，食蟹猴肝脏中剩余SERPINA1 mRNA的百分比(％)。“主研究组”在施用最终剂量后两天进行尸检，“R”代表恢复(Recovery)性尸检，其中受试者在最后一剂SERPINA1-1459后8周进行尸检。
图20提供了带缺口的四环结构的示意图。
具体实施方式
具有25至35个核苷酸的链长的双链RNA(dsRNA)剂已被描述为哺乳动物细胞中靶基因表达的有效抑制剂(Rossi等人，美国专利申请2005/0244858和US2005/0277610)。这类长度的dsRNA剂被认为由RNA干扰(RNAi)途径的切酶(Dicer)加工，导致此类试剂被称为“切酶底物siRNA”(“DsiRNA”)剂。先前描述了DsiRNA剂的另外的修饰结构(Rossi等人，第2007/0265220号美国专利申请)。最近还描述了切酶底物的有效延伸形式(Brown，第8,349,809号美国专利、第10,370,655号美国专利和第10,370,655号美国专利)。本文提供了靶向α-1抗胰蛋白酶的改进的核酸试剂。已经具体举例说明了那些靶向α-1抗胰蛋白酶的试剂。
根据一些方面，本公开提供了降低肝脏中的α-1抗胰蛋白酶或SERPINA1表达的寡核苷酸(例如，RNAi寡核苷酸)。在一些实施方案中，本文提供的寡核苷酸被设计用于治疗与肝脏中的α-1抗胰蛋白酶表达相关的疾病。在一些方面，本公开提供了通过降低细胞(例如，肝脏的细胞)或器官(例如，肝脏)中的α-1抗胰蛋白酶表达来治疗与α-1抗胰蛋白酶表达相关的疾病的方法。
在一些方面，本公开提供了用于降低α-1抗胰蛋白酶(A1AT)的表达的寡核苷酸，所述寡核苷酸包含反义链和有义链，所述反义链和有义链分别具有如SEQ ID NO：2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30和32以及SEQ ID NO：1、3、5、7、9、11、13、15、17、19、21、23、25、27、29和31所示的5’至3’序列。在某些实施方案中，所述寡核苷酸包含至少一个经修饰的核苷酸。在一些实施方案中，所述寡核苷酸的所有核苷酸均被修饰。在一些实施方案中，所述经修饰的核苷酸包含2’-修饰。在一些实施方案中，该2’-修饰是2’-氟代或2’-O-甲基。
在一些方面，本公开提供了用于降低α-1抗胰蛋白酶(A1AT)的表达的寡核苷酸，所述寡核苷酸包含具有SEQ ID NO：26中所示的5’至3’序列的反义链和具有SEQ ID NO：25中所示的5’至3’序列的有义链。在其他方面，本公开提供了用于降低α-1抗胰蛋白酶(A1AT)的表达的寡核苷酸，所述寡核苷酸包含具有SEQ ID NO：26中所示的5’至3’序列的反义链和具有SEQ ID NO：105中所示的5’至3’序列的有义链。在某些实施方案中，所述寡核苷酸包含至少一个经修饰的核苷酸。在一些实施方案中，所述寡核苷酸的所有核苷酸均被修饰。在一些实施方案中，所述经修饰的核苷酸包含2’-修饰。在一些实施方案中，该2’-修饰是2’-氟代或2’-O-甲基。
在一些实施方案中，有义链包含从5’至3’编号的36个核苷酸，并且反义链包含从5’至3’编号的22个核苷酸。在一些实施方案中，以下位置处的一个或多个核苷酸被2’-O-甲基修饰：有义链的位置1、2、4、6、7、12、14、16、18-26或31-36，和/或反义链的位置1、6、8、11-13、15、17或19-22。在一些实施方案中，以下位置处的一个或多个核苷酸被2’-氟代修饰：有义链的位置3、5、8-11、13、15或17，和/或反义链的位置2-5、7、9、10、14、16或18。
在某些实施方案中，以下位置处的一个或多个核苷酸被2’-O-甲基修饰：有义链的位置1、2、4、6、7、12、14、16、18-26或31-36，和/或反义链的位置1-3、5、8、10-12、14、15、17、19或22。在一些实施方案中，以下位置处的一个或多个核苷酸被2’-氟代修饰：有义链的位置3、5、8-11、13、15或17，和/或反义链的位置2-4、6、7、9、13、16、18、20或21。
在某些实施方案中，以下位置处的一个或多个核苷酸被2’-O-甲基修饰：有义链的位置1、2、4-7、11、14-16、18-26或31-36，和/或反义链的位置1、4、6、8、9、11-13、15、18或20-22。在一些实施方案中，以下位置处的一个或多个核苷酸被2’-氟代修饰：有义链的位置3、8-10、12、13或17，和/或反义链的位置2、3、5、7、10、14、16、17或19。
在某些实施方案中，以下位置处的一个或多个核苷酸被2’-O-甲基修饰：有义链的位置1、2、4-7、11、14-16、18-26或31-36，和/或反义链的位置1、4、6、8-11、13、15、17、18或20-22。在一些实施方案中，以下位置处的一个或多个核苷酸被2’-氟代修饰：有义链的位置3、8-10、12、13或17，和/或反义链的位置2、3、5、7、12、14、16或19。
在某些另外的实施方案中，以下位置处的一个或多个核苷酸被2’-O-甲基修饰：有义链的位置1-7和12-36，和/或反义链的位置1、6、8-13和15-22。在一些实施方案中，以下位置处的一个或多个核苷酸被2’-氟代修饰：有义链的位置8-11，和/或反义链的位置2-5、7和14。
在一些实施方案中，以下位置处的一个或多个核苷酸被2’-O-甲基修饰：有义链的位置1、2、4-7、11、14-16、18-26或31-36，和/或反义链的位置1、4、6、9、11、13、15、17、18或20-22。在一些实施方案中，以下位置处的一个或多个核苷酸被2’-氟代修饰：有义链的位置3、8-10、12、13和17，和/或反义链的位置2、3、5、7、8、10、12、14、16和19。
在某些实施方案中，本公开提供了用于降低α-1抗胰蛋白酶(A1AT)的表达的寡核苷酸，所述寡核苷酸包含反义链和有义链，所述反义链和有义链分别包含选自SEQ ID NO：34、36、38、40、42、44、46、48、50、52、54、56、58、60、62、64、66、68、70、72、74、76、78、80、82、84、86、88、90、92、94、96、98、100、102和104以及SEQ ID NO：33、35、37、39、41、43、45、47、49、51、53、55、57、59、61、63、65、67、69、71、73、75、77、79、81、83、85、87、89、91、93、95、97、99、101和103的序列。
在一些实施方案中，本文所述的寡核苷酸包含至少一个经修饰的核苷酸间键合。所述至少一个经修饰的核苷酸间键合是硫代磷酸酯键。
在一些实施方案中，本文所述的寡核苷酸在以下各位置之间包含硫代磷酸酯键：有义链的位置1和2、反义链的位置1和2、反义链的位置2和3、反义链的位置3和4、反义链的位置20和21以及反义链的位置21和22。
在一些实施方案中，所述反义链的第一个位置处的尿苷包含磷酸酯类似物。在某些实施方案中，所述寡核苷酸在反义链的位置1处包含以下结构：
在一些实施方案中，本文所述的寡核苷酸包含有义链，该有义链包含表示为S1-L-S2的茎-环，其中S1与S2互补，并且其中L在S1与S2之间形成长度为3-5个核苷酸的环，并且任选地其中L为四环。在一些实施方案中，该四环包含序列5’-GAAA-3’。在一些实施方案中，有义链上的-GAAA-序列的一个或多个核苷酸缀合至单价GalNAc部分。
在任何以上公开的实施方案中，-GAAA-序列包含以下结构：
其中：
L表示键、点击化学柄或长度为1至20个(包括端值)连续共价键合原子的连接体，该连接体选自取代和未取代的亚烷基、取代和未取代的亚烯基、取代和未取代的亚炔基、取代和未取代的亚杂烷基、取代和未取代的亚杂烯基、取代和未取代的亚杂炔基，以及它们的组合；且X为O、S或N。
在某些实施方案中，L为缩醛连接体。在一些实施方案中，X为O。
在一些实施方案中，所述-GAAA-序列包含以下结构：
在一些方面，本公开提供了包含本文所述寡核苷酸和Na+抗衡离子的组合物。
在一些方面，本公开提供了具有如图2A所示的化学结构的组合物。
在一些方面，本公开提供了包含用于降低A1AT表达的寡核苷酸以及药学上可接受的载剂或稀释剂的组合物，所述寡核苷酸包含具有SEQ ID NO：26中所示序列的反义链和具有SEQ ID NO：105中所示序列的有义链，
其中有义链的位置1、2、4-7、11、14-16、18-26或31-36以及反义链的位置1、4、6、8-11、13、15、17、18或20-22均被2’-O-甲基修饰，并且有义链的位置3、8-10、12、13和17以及反义链的位置2、3、5、7、12、14、16和19均被2’-氟代修饰；
其中所述寡核苷酸在以下各位置之间具有硫代磷酸酯键：有义链的位置1和2、反义链的位置1和2、反义链的位置2和3、反义链的位置3和4、反义链的位置20和21以及反义链的位置21和22；
其中所述寡核苷酸在反义链的位置1处包含以下结构：
其中有义链上的-GAAA-序列的每个核苷酸缀合至单价GalNAc部分，包含以下结构：
在另一方面，本公开提供了将寡核苷酸递送至受试者的方法，该方法包括向受试者施用本文所述的组合物或寡核苷酸。
在一些实施方案中，递送所述寡核苷酸以治疗或预防所述受试者的肝脏疾病或病症，其中所述肝脏疾病或病症选自慢性肝病、肝脏炎症、肝硬化、肝纤维化和肝细胞癌。在某些实施方案中，该受试者是人。在某些情况下，将所述寡核苷酸或组合物静脉内或皮下施用于受试者。
在一些方面，本公开提供了用于降低A1AT的表达的寡核苷酸，该寡核苷酸包含反义链和有义链，该反义链包含SEQ ID NO：26中所示的序列，该有义链包含SEQ ID NO：105中所示的序列，
其中有义链的位置1、2、4-7、11、14-16、18-26或31-36以及反义链的位置1、4、6、8-11、13、15、17、18或20-22均被2’-O-甲基修饰，并且有义链的位置3、8-10、12、13和17以及反义链的位置2、3、5、7、12、14、16和19均被2’-氟代修饰；
其中所述寡核苷酸在以下各位置之间具有硫代磷酸酯键：有义链的位置1和2、反义链的位置1和2、反义链的位置2和3、反义链的位置3和4、反义链的位置20和21以及反义链的位置21和22；
其中所述寡核苷酸在反义链的位置1处包含以下结构：
其中有义链上的-GAAA-序列的每个核苷酸缀合至单价GalNAc部分，包含以下结构：
在另一方面，本公开提供了用于降低A1AT的表达的寡核苷酸，该寡核苷酸包含反义链和有义链，该反义链包含SEQ ID NO：26中所示的序列，该有义链包含SEQ ID NO：105中所示的序列，
其中有义链的位置1、2、4-7、11、14-16、18-26或31-36以及反义链的位置1、4、6、8、9、11-13、15、18或20-22均被2’-O-甲基修饰，并且有义链的位置3、8-10、12、13或17以及反义链的位置2、3、5、7、10、14、16、17或19均被2’-氟代修饰。
其中所述寡核苷酸在以下各位置之间具有硫代磷酸酯键：有义链的位置1和2、反义链的位置1和2、反义链的位置2和3、反义链的位置3和4、反义链的位置20和21以及反义链的位置21和22；
其中所述寡核苷酸在反义链的位置1处包含以下结构：
其中有义链上的-GAAA-序列的每个核苷酸缀合至单价GalNAc部分，包含以下结构：
在某些实施方案中，本公开提供了包含本文所述寡核苷酸的组合物。在一些实施方案中，该组合物进一步包含Na+抗衡离子。
在某些实施方案中，本公开提供了用于降低哺乳动物中靶α-1抗胰蛋白酶mRNA的表达的方法，其包括以足以降低哺乳动物中靶α-1抗胰蛋白酶mRNA的表达的量施用本文所述。在某些实施方案中，所述寡核苷酸在脂质纳米颗粒(LNP)中配制。在一些实施方案中，所述寡核苷酸以选自每天每千克所述哺乳动物1微克至5毫克、每千克100微克至0.5毫克、每千克0.001至0.25毫克、每千克0.01至20微克、每千克0.01至10微克、每千克0.10至5微克以及每千克0.1至2.5微克的剂量施用。
在一些实施方案中，在向所述哺乳动物施用本文所述的寡核苷酸后至少3天，所述哺乳动物的组织中的α-1抗胰蛋白酶mRNA水平降低至少70％的量(以％表示)。在一些实施方案中，所述组织是肝组织。
在某些实施方案中，所述施用步骤包括选自静脉内注射、肌肉内注射、腹膜内注射、输注、皮下注射、透皮、气雾剂、直肠、阴道、局部、口服和吸入递送的给药模式。
在某些方面，本公开提供了用于治疗或预防受试者的肝脏疾病或病症的方法，其包括以足以治疗或预防所述受试者的所述肝脏疾病或病症的量向所述受试者施用一定量的本文公开的寡核苷酸或组合物，其中所述肝脏疾病或病症选自慢性肝病、肝脏炎症、肝硬化、肝纤维化和肝细胞癌。在某些实施方案中，所述受试者是人。
α-1抗胰蛋白酶表达的寡核苷酸抑制剂
α-1抗胰蛋白酶靶序列
在一些实施方案中，本文的寡核苷酸(例如，RNAi寡核苷酸)靶向包含α-1抗胰蛋白酶mRNA的靶序列。在一些实施方案中，该寡核苷酸或其部分、片段或链(例如，双链(ds)RNAi寡核苷酸的反义链或指导链)与包含α-1抗胰蛋白酶mRNA的靶序列结合或退火，从而抑制α-1抗胰蛋白酶表达。
在一些实施方案中，为了在体内抑制α-1抗胰蛋白酶表达的目的，所述寡核苷酸靶向α-1抗胰蛋白酶靶序列。在一些实施方案中，靶向α-1抗胰蛋白酶靶序列的寡核苷酸抑制α-1抗胰蛋白酶表达的量或程度与该寡核苷酸的效力相关。在一些实施方案中，靶向α-1抗胰蛋白酶靶序列的寡核苷酸抑制α-1抗胰蛋白酶表达的量或程度与用该寡核苷酸治疗的、患有与α-1抗胰蛋白酶表达相关的疾病、病症或状况的受试者或患者中治疗益处的量或程度相关。
通过检查编码α-1抗胰蛋白酶的mRNA的核苷酸序列，包括多个不同物种(例如，人、食蟹猴、小鼠和大鼠；参见，例如，实施例2和3)的mRNA的核苷酸序列，并且作为体外和体内测试(参见，例如，实施例2-8)的结果，已发现α-1抗胰蛋白酶mRNA的某些核苷酸序列比其他序列更易发生基于寡核苷酸的抑制，因此可用作本文寡核苷酸的靶序列。在一些实施方案中，本文所述寡核苷酸(例如，RNAi寡核苷酸)的有义链包含α-1抗胰蛋白酶靶序列。在一些实施方案中，本文所述寡核苷酸(例如，RNAi寡核苷酸)的有义链的部分或区域包含α-1抗胰蛋白酶靶序列。在一些实施方案中，α-1抗胰蛋白酶靶序列包含SEQ ID NO：1、3、5、7、9、11、13、15、17、19、21、23、25、27、29和31中任一者的序列，或由上述序列组成。在一些实施方案中，α-1抗胰蛋白酶靶序列包含SEQ ID NO：25的序列，或由SEQ ID NO：25的序列组成。
α-1抗胰蛋白酶靶向序列
在一些实施方案中，本文的寡核苷酸(例如，RNAi寡核苷酸)具有与α-1抗胰蛋白酶mRNA(例如，在α-1抗胰蛋白酶mRNA的靶序列内)互补的互补区域，以用于靶向细胞中的α-1抗胰蛋白酶mRNA并抑制和/或降低α-1抗胰蛋白酶表达的目的。在一些实施方案中，本文的寡核苷酸包含α-1抗胰蛋白酶靶向序列(例如，dsRNA寡核苷酸的反义链或指导链)，该靶向序列具有通过互补(Watson-Crick)碱基配对与α-1抗胰蛋白酶靶序列结合或退火的互补区域。靶向序列或互补区域通常具有合适的长度和碱基含量，以使得寡核苷酸(或其链)能够与α-1抗胰蛋白酶mRNA结合或退火，从而达到抑制和/或降低α-1抗胰蛋白酶表达的目的。在一些实施方案中，靶向序列或互补区域的长度为至少约12、至少约13、至少约14、至少约15、至少约16、至少约17、至少约18、至少约19、至少约20、至少约21、至少约22、至少约23、至少约24、至少约25、至少约26、至少约27、至少约28、至少约29或至少约30个核苷酸。在一些实施方案中，靶向序列或互补区域的长度为约12至约30(例如，12至30、12至22、15至25、17至21、18至27、19至27或15至30)个核苷酸。在一些实施方案中，靶向序列或互补区域的长度为约12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29或30个核苷酸。在一些实施方案中，靶向序列或互补区域的长度为18个核苷酸。在一些实施方案中，靶向序列或互补区域的长度为19个核苷酸。在一些实施方案中，靶向序列或互补区域的长度为20个核苷酸。在一些实施方案中，靶向序列或互补区域的长度为21个核苷酸。在一些实施方案中，靶向序列或互补区域的长度为22个核苷酸。在一些实施方案中，靶向序列或互补区域的长度为23个核苷酸。在一些实施方案中，靶向序列或互补区域的长度为24个核苷酸。在一些实施方案中，寡核苷酸包含与SEQ ID NO：1、3、5、7、9、11、13、15、17、19、21、23、25、27、29和31中任一者的序列互补的靶序列或互补区域，并且该靶向序列或互补区域的长度为18个核苷酸。在一些实施方案中，寡核苷酸包含与SEQ ID NO：1、3、5、7、9、11、13、15、17、19、21、23、25、27、29和31中任一者的序列互补的靶序列或互补区域，并且该靶向序列或互补区域的长度为19个核苷酸。在一些实施方案中，寡核苷酸包含与SEQ ID NO：1、3、5、7、9、11、13、15、17、19、21、23、25、27、29和31中任一者的序列互补的靶序列或互补区域，并且该靶向序列或互补区域的长度为20个核苷酸。在一些实施方案中，寡核苷酸包含与SEQ ID NO：1、3、5、7、9、11、13、15、17、19、21、23、25、27、29和31中任一者的序列互补的靶序列或互补区域，并且该靶向序列或互补区域的长度为21个核苷酸。在一些实施方案中，寡核苷酸包含与SEQ ID NO：1、3、5、7、9、11、13、15、17、19、21、23、25、27、29和31中任一者的序列互补的靶序列或互补区域，并且该靶向序列或互补区域的长度为22个核苷酸。
在一些实施方案中，本文的寡核苷酸(例如，RNAi寡核苷酸)包含与α-1抗胰蛋白酶靶序列完全互补的靶向序列或互补区域(例如，双链寡核苷酸的反义链或指导链)。在一些实施方案中，靶向序列或互补区域与α-1抗胰蛋白酶靶序列为部分互补。在一些实施方案中，该寡核苷酸包含与α-1抗胰蛋白酶的序列完全互补的靶向序列或互补区域。在一些实施方案中，该寡核苷酸包含与α-1抗胰蛋白酶的序列为部分互补的靶向序列或互补区域。
在一些实施方案中，所述寡核苷酸包含与SEQ ID NO：1、3、5、7、9、11、13、15、17、19、21、23、25、27、29和31中任一者的序列完全互补的靶向序列或互补区域。在一些实施方案中，该寡核苷酸包含与SEQ ID NO：25中所示的序列完全互补的靶向序列或互补区域。在一些实施方案中，该寡核苷酸包含与SEQ ID NO：1、3、5、7、9、11、13、15、17、19、21、23、25、27、29和31中任一者的序列为部分互补的靶向序列或互补区域。在一些实施方案中，该寡核苷酸包含与SEQ ID NO：25中所示的序列为部分互补的靶向序列或互补区域。
在一些实施方案中，本文的寡核苷酸(例如，RNAi寡核苷酸)包含与包含于α-1抗胰蛋白酶mRNA的连续核苷酸序列互补的靶向序列或互补区域，其中所述连续核苷酸序列的长度为约12至约30个核苷酸(例如，长度为12至30、12至28、12至26、12至24、12至20、12至18、12至16、14至22、16至20、18至20或18至19个核苷酸)。在一些实施方案中，该寡核苷酸包含与包含于α-1抗胰蛋白酶mRNA的连续核苷酸序列互补的靶向序列或互补区域，其中所述连续核苷酸序列的长度为10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20个核苷酸。在一些实施方案中，该寡核苷酸包含与包含于α-1抗胰蛋白酶mRNA的连续核苷酸序列互补的靶向序列或互补区域，其中所述连续核苷酸序列的长度为19个核苷酸。在一些实施方案中，该寡核苷酸包含与包含于α-1抗胰蛋白酶mRNA的连续核苷酸序列互补的靶向序列或互补区域，其中所述连续核苷酸序列的长度为20个核苷酸。
在一些实施方案中，本文的寡核苷酸(例如，RNAi寡核苷酸)包含与连续核苷酸序列互补的靶向序列或互补区域，其中该靶向序列或互补区域选自SEQ ID NO：1、3、5、7、9、11、13、15、17、19、21、23、25、27、29和31，任选地其中所述连续核苷酸序列的长度为19个核苷酸。在一些实施方案中，该寡核苷酸包含与连续核苷酸序列互补的靶向序列或互补区域，其中该靶向序列或互补区域选自SEQ ID NO：1、3、5、7、9、11、13、15、17、19、21、23、25、27、29和31，其中所述连续核苷酸序列的长度为19个核苷酸。在一些实施方案中，该寡核苷酸包含与连续核苷酸序列互补的靶向序列或互补区域，其中该靶向序列或互补区域选自SEQ IDNO：1、3、5、7、9、11、13、15、17、19、21、23、25、27、29和31，其中所述连续核苷酸序列的长度为20个核苷酸。
在一些实施方案中，本文的寡核苷酸(例如，RNAi寡核苷酸)的靶向序列或互补区域与连续核苷酸序列互补，其中该靶向序列或互补区域选自SEQ ID NO：1、3、5、7、9、11、13、15、17、19、21、23、25、27、29和31，并且跨越反义链的整个长度。在一些实施方案中，该寡核苷酸的靶向序列或互补区域与连续核苷酸序列互补，其中该靶向序列或互补区域选自SEQID NO：1、3、5、7、9、11、13、15、17、19、21、23、25、27、29和31，并且跨越反义链的整个长度的一部分。在一些实施方案中，本文的寡核苷酸(例如，RNAi寡核苷酸)包含互补区域(例如，在dsRNA的反义链上)，该互补区域与跨越SEQ ID NO：1、3、5、7、9、11、13、15、17、19、21、23、25、27、29和31中任一者所示的序列的核苷酸1-20的连续核苷酸段至少部分(例如，完全)互补。
在一些实施方案中，本文的寡核苷酸(例如，RNAi寡核苷酸)包含与相应的α-1抗胰蛋白酶靶序列具有一个或多个碱基对(bp)错配的靶向序列或互补区域。在一些实施方案中，靶向序列或互补区域可以与相应的α-1抗胰蛋白酶靶序列具有最多约1个、最多约2个、最多约3个、最多约4个、最多约5个等错配，条件是该靶向序列或互补区域在适当杂交条件下与α-1抗胰蛋白酶mRNA结合或退火的能力和/或该寡核苷酸抑制α-1抗胰蛋白酶表达的能力得到维持。或者，靶向序列或互补区域可以与相应的α-1抗胰蛋白酶靶序列具有不超过1个、不超过2个、不超过3个、不超过4个或不超过5个错配，条件是该靶向序列或互补区域在适当杂交条件下与α-1抗胰蛋白酶mRNA结合或退火的能力和/或该寡核苷酸抑制α-1抗胰蛋白酶表达的能力得到维持。在一些实施方案中，该寡核苷酸包含与相应靶序列具有1个错配的靶向序列或互补区域。在一些实施方案中，该寡核苷酸包含与相应靶序列具有2个错配的靶向序列或互补区域。在一些实施方案中，该寡核苷酸包含与相应靶序列具有3个错配的靶向序列或互补区域。在一些实施方案中，该寡核苷酸包含与相应靶序列具有4个错配的靶向序列或互补区域。在一些实施方案中，该寡核苷酸包含与相应靶序列具有5个错配的靶向序列或互补区域。在一些实施方案中，该寡核苷酸包含与相应靶序列具有多于一个错配(例如，2、3、4、5个或更多个错配)的靶向序列或互补区域，其中至少2个(例如，全部)错配是连续定位的(例如，连续的2、3、4、5个或更多个错配)，或者其中所述错配散布在整个靶向序列或互补区域中。在一些实施方案中，该寡核苷酸包含与相应靶序列具有多于一个错配(例如，2、3、4、5个或更多个错配)的靶向序列或互补区域，其中至少2个(例如，全部)错配是连续定位的(例如，连续的2、3、4、5个或更多个错配)，或者其中至少一个或多个非错配的碱基对位于所述错配之间，或其组合。在一些实施方案中，该寡核苷酸包含与连续核苷酸序列互补的靶向序列或互补区域，其中该靶向序列或互补区域选自SEQ ID NO：1、3、5、7、9、11、13、15、17、19、21、23、25、27、29和31，其中该靶向序列或互补区域与相应α-1抗胰蛋白酶靶序列可具有最多约1个、最多约2个、最多约3个、最多约4个、最多约5个等错配。在一些实施方案中，该寡核苷酸包含与连续核苷酸序列互补的靶向序列或互补区域，其中该靶向序列或互补区域选自SEQ ID NO：1、3、5、7、9、11、13、15、17、19、21、23、25、27、29和31，其中该靶向序列或互补区域与相应α-1抗胰蛋白酶靶序列可具有不超过1个、不超过2个、不超过3个、不超过4个或不超过5个错配。在一些实施方案中，该寡核苷酸包含与连续核苷酸序列互补的靶向序列或互补区域，其中该靶向序列或互补区域选自SEQ ID NO：1、3、5、7、9、11、13、15、17、19、21、23、25、27、29和31，其中该靶向序列或互补区域与相应α-1抗胰蛋白酶靶序列可具有最多约1个、最多约2个、最多约3个、最多约4个、最多约5个等错配。在一些实施方案中，该寡核苷酸包含与连续核苷酸序列互补的靶向序列或互补区域，其中该靶向序列或互补区域选自SEQ ID NO：1、3、5、7、9、11、13、15、17、19、21、23、25、27、29和31，其中该靶向序列或互补区域与相应α-1抗胰蛋白酶靶序列可具有不超过1个、不超过2个、不超过3个、不超过4个或不超过5个错配。
寡核苷酸的类型
多种寡核苷酸类型和/或结构可用于在本文的方法中靶向α-1抗胰蛋白酶，包括但不限于RNAi寡核苷酸、反义寡核苷酸(ASO)、miRNA等。本文或别处描述的任何寡核苷酸类型均预期用作框架以并入本文的α-1抗胰蛋白酶靶向序列，以用于抑制α-1抗胰蛋白酶表达的目的。
在一些实施方案中，本文的寡核苷酸通过在切酶(Dicer)参与的上游或下游加入RNA干扰(RNAi)途径来抑制α-1抗胰蛋白酶表达。例如，已经开发出RNAi寡核苷酸，其每条链具有约19-25个核苷酸的大小，并具有至少一个1至5个核苷酸的3’突出端(参见，例如，第8,372,968号美国专利)。还开发了更长的寡核苷酸，其被切酶加工以生成活性RNAi产物(参见，例如，第8,883,996号美国专利)。进一步的工作产生了延伸的dsRNA，其中至少一条链的至少一端延伸超出双链体靶向区域，包括其中一条链包含热力学稳定四环结构的结构(参见，例如，第8,513,207和8,927,705号美国专利，以及公开号为WO 2010/033225的国际专利申请)。此类结构可包括单链(ss)延伸(在分子的一侧或两侧)以及双链(ds)延伸。
在一些实施方案中，本文的寡核苷酸在切酶参与(例如，切酶切割)的下游加入RNAi途径。在一些实施方案中，该寡核苷酸在有义链的3’端具有突出端(例如，长度为1、2或3个核苷酸)。在一些实施方案中，该寡核苷酸(例如，siRNA)包含与靶RNA呈反义的21个核苷酸的指导链和互补的过客链，其中这两条链退火以形成19-bp双链体和位于任一或两个3’端的2个核苷酸的突出端。还可用更长的寡核苷酸设计，包括具有23个核苷酸的指导链和21个核苷酸的过客链的寡核苷酸，其中在分子的右侧(过客链的3’端/指导链的5’端)具有平端，且在分子的左侧(过客链的5’端/指导链的3’端)具有两个核苷酸的3’-指导链突出端。在此类分子中，存在21bp双链体区域。参见，例如，第9,012,138、9,012,621和9,193,753号美国专利。
在一些实施方案中，本文的寡核苷酸包含长度均在约17至36(例如，17至36、20至25或21-23)个核苷酸范围内的有义链和反义链。在一些实施方案中，本文的寡核苷酸包含长度均在约19-22个核苷酸范围内的有义链和反义链。在一些实施方案中，有义链和反义链长度相等。在一些实施方案中，寡核苷酸包含有义链和反义链，使得在有义链或反义链上，或者在有义链和反义链两者上存在3’-突出端。在一些实施方案中，对于具有长度均在约21-23个核苷酸范围内的有义链和反义链的寡核苷酸，有义链、反义链或有义链和反义链两者上的3’-突出端的长度为1或2个核苷酸。在一些实施方案中，该寡核苷酸具有22个核苷酸的指导链和20个核苷酸的过客链，其中在分子的右侧(过客链的3’端/指导链的5’端)具有平端，且在分子的左侧(过客链的5’端/指导链的3’端)具有2个核苷酸的3’-指导链突出端。在此类分子中，存在20bp双链体区域。
与本文的组合物和方法一起使用的其他寡核苷酸设计包括：16-聚体siRNA(参见，例如，NUCLEIC ACIDS IN CHEMISTRY AND BIOLOGY，Blackburn(编)，Royal Society ofChemistry，2006)、shRNA(例如，具有19bp或更短的茎；参见，例如，Moore等人(2010)METHODS MOL.BIOL.629：141-158)、平端siRNA(例如，长度为19bp；参见，例如，Kraynack和Baker(2006)RNA 12：163-176)、不对称siRNA(aiRNA；参见，例如，Sun等人(2008)Nat.Biotechnol.26：1379-1382)、不对称较短双链体siRNA(参见，例如，Chang等人(2009)Mol.Ther.17：725-32)、叉siRNA(参见，例如，Hohjoh(2004)FEBS Lett.557：193-198)、单链siRNA(Elsner(2012)Nat.Biotechnol.30：1063)、哑铃形环状siRNA(参见，例如，Abe等人(2007)J.Am.Chem.Soc.129：15108-09)以及小的内部分段干扰RNA(siRNA；参见，例如，Bramsen等人(2007)Nucleic Acids Res.35：5886-97)。可以在一些实施方案中使用以降低或抑制α-1抗胰蛋白酶表达的寡核苷酸结构的其他非限制性实例是微小RNA(miRNA)、短发夹RNA(shRNA)和短siRNA(参见，例如，Hamilton等人(2002)EMBO J.21：4671-79；还参见公开号为2009/0099115的美国专利申请)。
另外，在一些实施方案中，本文中用于降低或抑制α-1抗胰蛋白酶表达的寡核苷酸是单链的(ss)。此类结构可包括但不限于单链RNAi分子。最近的努力已经证明了单链RNAi分子的活性(参见，例如，Matsui等人(2016)MOL.THER.24：946-55)。然而，在一些实施方案中，本文的寡核苷酸是反义寡核苷酸(ASO)。反义寡核苷酸是具有核碱基序列的单链寡核苷酸，当以5’至3’方向书写时，该核碱基序列包含特定核酸的被靶向区段的反向互补序列并且被适当地修饰(例如，作为gapmer)以诱导其靶RNA在细胞中的RNA酶H介导的切割，或者(例如，作为mixmer)抑制靶mRNA在细胞中的翻译。供此处使用的ASO可以以本领域已知的任何合适的方式进行修饰，包括，例如，如第9,567,587号美国专利中所示(包括，例如，长度，核碱基(嘧啶、嘌呤)的糖部分，以及核碱基的杂环部分的改变)。此外，数十年来，ASO已被用于降低特定靶基因的表达(参见，例如，Bennett等人(2017)ANNU.REv.PHARMACOL.57：81-105)。
在一些实施方案中，反义寡核苷酸与α-1抗胰蛋白酶mRNA共享互补区域。在一些实施方案中，反义寡核苷酸靶向SEQ ID NO：1、3、5、7、9、11、13、15、17、19、21、23、25、27、29或31。在一些实施方案中，反义寡核苷酸的长度为15-50个核苷酸。在一些实施方案中，反义寡核苷酸的长度为15-25个核苷酸。在一些实施方案中，反义寡核苷酸的长度为22个核苷酸。在一些实施方案中，反义寡核苷酸与SEQ ID NO：1、3、5、7、9、11、13、15、17、19、21、23、25、27、29或31中的任一者互补。在一些实施方案中，反义寡核苷酸的长度为至少15个连续核苷酸。在一些实施方案中，反义寡核苷酸的长度为至少19个连续核苷酸。在一些实施方案中，反义寡核苷酸的长度为至少20个连续核苷酸。在一些实施方案中，反义寡核苷酸与靶序列有1、2或3个核苷酸不同。
双链寡核苷酸
在一些方面，本公开提供了用于靶向α-1抗胰蛋白酶mRNA并抑制α-1抗胰蛋白酶表达(例如，通过RNAi途径)的双链(ds)RNAi寡核苷酸，其包含有义链(本文中也称为过客链)和反义链(本文中也称为指导链)。在一些实施方案中，有义链和反义链是单独的链，并且不是共价连接的。在一些实施方案中，有义链和反义链共价连接。在一些实施方案中，有义链和反义链形成双链体区域，其中有义链和反义链或其部分以互补方式(例如，通过Watson-Crick碱基配对)彼此结合。
在一些实施方案中，有义链具有第一区域(R1)和第二区域(R2)，其中R2包含第一亚区(S1)、四环(L)或三环(triL)和第二亚区(S2)，其中L或triL位于S1与S2之间，并且其中S1和S2形成第二双链体(D2)。D2可具有不同的长度。在一些实施方案中，D2的长度为约1-6bp。在一些实施方案中，D2的长度为2-6、3-6、4-6、5-6、1-5、2-5、3-5或4-5bp。在一些实施方案中，D2的长度为1、2、3、4、5或6bp。在一些实施方案中，D2的长度为6bp。
在一些实施方案中，有义链的R1和反义链形成第一双链体(D1)。在一些实施方案中，D1的长度为至少约15(例如，至少15、至少16、至少17、至少18、至少19、至少20或至少21)个核苷酸。在一些实施方案中，D1的长度在约12至30个核苷酸的范围内(例如，长度为12至30、12至27、15至22、18至22、18至25、18至27、18至30或21至30个核苷酸)。在一些实施方案中，D1的长度为至少12个核苷酸(例如，长度为至少12、至少15、至少20、至少25或至少30个核苷酸)。在一些实施方案中，D1的长度为12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29或30个核苷酸。在一些实施方案中，D1的长度为20个核苷酸。在一些实施方案中，包含有义链和反义链的D1不跨越有义链和/或反义链的整个长度。在一些实施方案中，包含有义链和反义链的D1跨越有义链或反义链或两者的整个长度。在一些实施方案中，包含有义链和反义链的D1跨越有义链和反义链两者的整个长度。
在一些实施方案中，本文提供的寡核苷酸(例如，RNAi寡核苷酸)包含具有SEQ IDNO：1、3、5、7、9、11、13、15、17、19、21、23、25、27、29或31中任一者的序列的有义链和包含选自SEQ ID NO：2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、24、26、28、30或32的互补序列的反义链，如表1中所排列的。
在一些实施方案中，本文提供的寡核苷酸(例如，RNAi寡核苷酸)包含有义链和反义链，该有义链和反义链包含选自以下的核苷酸序列：
(a)分别为SEQ ID NO：25和26；
(b)分别为SEQ ID NO：27和28；
(c)分别为SEQ ID NO：29和30；
(d)分别为SEQ ID NO：31和32；
(e)分别为SEQ ID NO：97和98；
(f)分别为SEQ ID NO：99和100；
(g)分别为SEQ ID NO：101和102；以及，
(h)分别为SEQ ID NO：103和104。
在一些实施方案中，有义链包含SEQ ID NO：31的序列并且反义链包含SEQ ID NO：32的序列。在一些实施方案中，有义链包含SEQ ID NO：25的序列并且反义链包含SEQ IDNO：26的序列。在一些实施方案中，有义链包含SEQ ID NO：25的序列并且反义链包含SEQ IDNO：105的序列。
应当理解，在一些实施方案中，在描述寡核苷酸(例如，dsRNAi寡核苷酸)或其他核酸的结构时可以参考序列表中呈现的序列。在这样的实施方案中，与指定序列相比，实际的寡核苷酸或其他核酸可具有一个或多个替代核苷酸(例如，DNA核苷酸的RNA对应物或RNA核苷酸的DNA对应物)和/或一个或多个经修饰的核苷酸和/或一个或多个经修饰的核苷酸间键合和/或一个或多个其他修饰，而仍然保留与指定序列基本相同或相似的互补性质。
在一些实施方案中，本文的寡核苷酸(例如，RNAi寡核苷酸)包含25个核苷酸的有义链和27个核苷酸的反义链，当受到切酶作用时，其产生并入成熟RISC中的反义链。在一些实施方案中，该寡核苷酸的有义链长于27个核苷酸(例如，28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49或50个核苷酸)。在一些实施方案中，该寡核苷酸的有义链长于25个核苷酸(例如，26、27、28、29或30个核苷酸)。在一些实施方案中，该寡核苷酸的有义链包含选自SEQ ID NO：1、3、5、7、9、11、13、15、17、19、21、23、25、27、29或31的核苷酸序列，其中该核苷酸序列长于27个核苷酸(例如，28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49或50个核苷酸)。在一些实施方案中，该寡核苷酸的有义链包含选自SEQ ID NO：1、3、5、7、9、11、13、15、17、19、21、23、25、27、29或31的核苷酸序列，其中该核苷酸序列长于25个核苷酸(例如，26、27、28、29或30个核苷酸)。
在一些实施方案中，本文的寡核苷酸(例如，RNAi寡核苷酸)具有与另一5’端相比热力学稳定性较差的一个5’端。在一些实施方案中，提供了不对称寡核苷酸，其在有义链的3’端包括平端并在反义链的3’端包括3’-突出端。在一些实施方案中，反义链上的3’-突出端的长度为约1-8个核苷酸(例如，长度为1、2、3、4、5、6、7或8个核苷酸)。在一些实施方案中，该寡核苷酸在反义(指导)链的3’端具有包含两(2)个核苷酸的突出端。然而，其他突出端也是可能的。在一些实施方案中，突出端是包含1至6个核苷酸，任选地1至5、1至4、1至3、1至2、2至6、2至5、2至4、2至3、3至6、3至5、3至4、4至6、4至5、5至6个核苷酸，或1、2、3、4、5或6个核苷酸的长度的3’-突出端。然而，在一些实施方案中，突出端是包含1至6个核苷酸，任选地1至5、1至4、1至3、1至2、2至6、2至5、2至4、2至3、3至6、3至5、3至4、4至6、4至5、5至6个核苷酸，或1、2、3、4、5或6个核苷酸的长度的5’-突出端。在一些实施方案中，该寡核苷酸包含有义链，该有义链包含选自SEQ ID NO：1、3、5、7、9、11、13、15、17、19、21、23、25、27、29或31的核苷酸序列，其中该寡核苷酸包含长度为1至6个核苷酸的5’-突出端。在一些实施方案中，该寡核苷酸包含反义链，该反义链包含选自SEQ ID NO：2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、24、26、28、30或32的核苷酸序列，其中该寡核苷酸包含长度为1至6个核苷酸的5’-突出端。在一些实施方案中，该寡核苷酸包含有义链和反义链，该有义链包含选自SEQ ID NO：1、3、5、7、9、11、13、15、17、19、21、23、25、27、29或31的核苷酸序列，该反义链包含选自SEQ ID NO：2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、24、26、28、30或32的核苷酸序列，其中该寡核苷酸包含长度为1至6个核苷酸的5’-突出端。
在一些实施方案中，反义链3’端上的两(2)个末端核苷酸被修饰。在一些实施方案中，反义链3’端上的两(2)个末端核苷酸与靶mRNA(例如，α-1抗胰蛋白酶mRNA)互补。在一些实施方案中，反义链3’端上的两(2)个末端核苷酸不与靶mRNA互补。在一些实施方案中，本文寡核苷酸的反义链3’端上的两(2)个末端核苷酸是不配对的。在一些实施方案中，本文寡核苷酸的反义链3’端上的两(2)个末端核苷酸包含未配对的GG。在一些实施方案中，本文寡核苷酸的反义链3’端上的两(2)个末端核苷酸不与靶mRNA互补。在一些实施方案中，寡核苷酸的每个3’端上的两(2)个末端核苷酸是GG。在一些实施方案中，本文寡核苷酸的每个3’端上的两(2)个末端GG核苷酸之一或两者不与靶mRNA互补。在一些实施方案中，该寡核苷酸包含与连续核苷酸序列互补的靶向序列或互补区域，其中该靶向序列或互补区域选自SEQ IDNO：1、3、5、7、9、11、13、15、17、19、21、23、25、27、29或31，其中本文寡核苷酸的反义链3’端上的两(2)个末端核苷酸包含未配对的GG。在一些实施方案中，该寡核苷酸包含反义链，该反义链包含选自SEQ ID NO：2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、24、26、28、30或32的核苷酸序列，其中该寡核苷酸的反义链3’端上的两(2)个末端核苷酸包含未配对的GG。在一些实施方案中，该寡核苷酸包含有义链和反义链，该有义链包含选自SEQ ID NO：1、3、5、7、9、11、13、15、17、19、21、23、25、27、29或31的核苷酸序列，该反义链包含选自SEQ ID NO：2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、24、26、28、30或32的核苷酸序列，其中该寡核苷酸的反义链3’端上的两(2)个末端核苷酸包含未配对的GG。
在一些实施方案中，在构成本文寡核苷酸(例如，RNAi寡核苷酸)的有义链与反义链之间存在一个或多个(例如，1、2、3、4或5个)错配。如果在有义链与反义链之间存在多于一个错配，则它们可以连续地定位(例如，连续的2个、3个或更多个)，或者散布在整个互补区域中。在一些实施方案中，有义链的3’端包含一个或多个错配。在一些实施方案中，在有义链的3’端处并入两(2)个错配。在一些实施方案中，本文寡核苷酸的有义链3’端处的碱基错配或区段去稳定化改善或增加了该寡核苷酸的效力。
在一些实施方案中，本文寡核苷酸的有义链和反义链包含选自下组的核苷酸序列：
(a)分别为SEQ ID NO：25和26；
(b)分别为SEQ ID NO：27和28；
(c)分别为SEQ ID NO：29和30；
(d)分别为SEQ ID NO：31和32；
(e)分别为SEQ ID NO：97和98；
(f)分别为SEQ ID NO：99和100；
(g)分别为SEQ ID NO：101和102；以及
(h)分别为SEQ ID NO：103和104；
其中在有义链与反义链之间存在一个或多个(例如，1、2、3、4或5个)错配。
反义链
在一些实施方案中，本文寡核苷酸(例如，RNAi寡核苷酸)的反义链被称为“指导链”。例如，反义链与RNA诱导的沉默复合物(RISC)接合并与Argonaute蛋白如Ago2结合，或者与一种或多种类似因子接合或结合，并指导靶基因的沉默，该反义链被称为指导链。在一些实施方案中，包含与指导链互补的互补区域的有义链在本文中被称为“过客链”。
在一些实施方案中，本文的寡核苷酸(例如，RNAi寡核苷酸)包含长度为最多约50个核苷酸(例如，长度为最多50个、最多40个、最多35个、最多30个、最多27个、最多25个、最多21个、最多19个、最多17个或最多12个核苷酸)的反义链。在一些实施方案中，寡核苷酸包含长度为至少约12个核苷酸(例如，长度为至少12个、至少15个、至少19个、至少21个、至少22个、至少25个、至少27个、至少30个、至少35个或至少38个核苷酸)的反义链。在一些实施方案中，寡核苷酸包含长度在约12至约40(例如，12至40、12至36、12至32、12至28、15至40、15至36、15至32、15至28、17至22、17至25、19至27、19至30、20至40、22至40、25至40或32至40)个核苷酸范围内的反义链。在一些实施方案中，寡核苷酸包含长度为15至30个核苷酸的反义链。在一些实施方案中，本文公开的任一种寡核苷酸的反义链为12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39或40个核苷酸的长度。在一些实施方案中，寡核苷酸包含长度为22个核苷酸的反义链。
在一些实施方案中，本文公开的用于靶向α-1抗胰蛋白酶的寡核苷酸(例如，RNAi寡核苷酸)包含反义链，该反义链包含如SEQ ID NO：2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、24、26、28、30或32中任一者所示的序列或由如SEQ ID NO：2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、24、26、28、30或32中任一者所示的序列组成。在一些实施方案中，本文的寡核苷酸包含反义链，该反义链包含如SEQ ID NO：2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、24、26、28、30或32中任一者所示的序列的至少约12个(例如，至少12个、至少13个、至少14个、至少15个、至少16个、至少17个、至少18个、至少19个、至少20个、至少21个、至少22个或至少23个)连续核苷酸。在一些实施方案中，本文公开的用于靶向α-1抗胰蛋白酶的寡核苷酸包含反义链，该反义链包含如SEQID NO：2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、24、26、28、30或32中任一者所示的序列或由如SEQ IDNO：2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、24、26、28、30或32中任一者所示的序列组成。在一些实施方案中，本文的寡核苷酸包含反义链，该反义链包含如SEQ ID NO：2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、24、26、28、30或32中任一者所示的序列的至少约12个(例如，至少12个、至少13个、至少14个、至少15个、至少16个、至少17个、至少18个、至少19个、至少20个、至少21个、至少22个或至少23个)连续核苷酸。在一些实施方案中，本文公开的用于靶向α-1抗胰蛋白酶的寡核苷酸包含反义链，该反义链包含如SEQ ID NO：2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、24、26、28、30或32中任一者所示的序列或由如SEQ ID NO：2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、24、26、28、30或32中任一者所示的序列组成。在一些实施方案中，本文的寡核苷酸包含反义链，该反义链包含如SEQ ID NO：2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、24、26、28、30或32中任一者所示的序列的至少约12个(例如，至少12个、至少13个、至少14个、至少15个、至少16个、至少17个、至少18个、至少19个、至少20个、至少21个、至少22个或至少23个)连续核苷酸。
有义链
在一些实施方案中，本文公开的用于靶向α-1抗胰蛋白酶mRNA并抑制α-1抗胰蛋白酶表达的寡核苷酸(例如，RNAi寡核苷酸)包含如SEQ ID NO：1、3、5、7、9、11、13、15、17、19、21、23、25、27、29或31中任一者所示的有义链序列。在一些实施方案中，本文的寡核苷酸具有有义链，该有义链由如SEQ ID NO：1、3、5、7、9、11、13、15、17、19、21、23、25、27、29或31中任一者所示的序列的至少约12个(例如，至少13个、至少14个、至少15个、至少16个、至少17个、至少18个、至少19个、至少20个、至少21个、至少22个或至少23个)连续核苷酸组成。在一些实施方案中，本文公开的用于靶向α-1抗胰蛋白酶mRNA并抑制α-1抗胰蛋白酶表达的寡核苷酸包含如SEQ ID NO：1、3、5、7、9、11、13、15、17、19、21、23、25、27、29或31中任一者所示的有义链序列。在一些实施方案中，本文的寡核苷酸具有有义链，该有义链由如SEQ ID NO：1、3、5、7、9、11、13、15、17、19、21、23、25、27、29或31中任一者所示的序列的至少约12个(例如，至少13个、至少14个、至少15个、至少16个、至少17个、至少18个、至少19个、至少20个、至少21个、至少22个或至少23个)连续核苷酸组成。在一些实施方案中，本文公开的用于靶向α-1抗胰蛋白酶mRNA并抑制α-1抗胰蛋白酶表达的寡核苷酸包含如SEQ ID NO：1、3、5、7、9、11、13、15、17、19、21、23、25、27、29或31中任一者所示的有义链序列。在一些实施方案中，本文的寡核苷酸具有有义链，该有义链包含如SEQ ID NO：1、3、5、7、9、11、13、15、17、19、21、23、25、27、29或31中任一者所示的序列的至少约12个(例如，至少13个、至少14个、至少15个、至少16个、至少17个、至少18个、至少19个、至少20个、至少21个、至少22个或至少23个)连续核苷酸。
在一些实施方案中，本文提供的寡核苷酸(例如，RNAi寡核苷酸)包含长度为最多约50个核苷酸(例如，长度为最多50个、最多40个、最多36个、最多30个、最多27个、最多25个、最多21个、最多19个、最多17个或最多12个核苷酸)的有义链(或过客链)。在一些实施方案中，本文的寡核苷酸包含长度为至少约12个核苷酸(例如，长度为至少12个、至少15个、至少19个、至少21个、至少25个、至少27个、至少30个、至少36个或至少38个核苷酸)的有义链。在一些实施方案中，本文的寡核苷酸包含长度在约12至约50(例如，12至50、12至40、12至36、12至32、12至28、15至40、15至36、15至32、15至28、17至21、17至25、19至27、19至30、20至40、22至40、25至40或32至40)个核苷酸范围内的有义链。在一些实施方案中，本文的寡核苷酸包含长度为15至50个核苷酸的有义链。在一些实施方案中，本文的寡核苷酸包含长度为18至36个核苷酸的有义链。在一些实施方案中，本文的寡核苷酸包含长度为12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49或50个核苷酸的有义链。在一些实施方案中，本文的寡核苷酸包含长度为36个核苷酸的有义链。
在一些实施方案中，本文提供的寡核苷酸(例如，RNAi寡核苷酸)包含有义链，在该有义链的3’端包含茎-环结构。在一些实施方案中，该茎-环通过链内碱基配对而形成。在一些实施方案中，有义链在其5’端包含茎-环结构。在一些实施方案中，该茎-环的茎包含长度为2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13或14个核苷酸的双链体。在一些实施方案中，该茎-环的茎包含长度为2个核苷酸的双链体。在一些实施方案中，该茎-环的茎包含长度为3个核苷酸的双链体。在一些实施方案中，该茎-环的茎包含长度为4个核苷酸的双链体。在一些实施方案中，该茎-环的茎包含长度为5个核苷酸的双链体。在一些实施方案中，该茎-环的茎包含长度为6个核苷酸的双链体。在一些实施方案中，该茎-环的茎包含长度为7个核苷酸的双链体。在一些实施方案中，该茎-环的茎包含长度为8个核苷酸的双链体。在一些实施方案中，该茎-环的茎包含长度为9个核苷酸的双链体。在一些实施方案中，该茎-环的茎包含长度为10个核苷酸的双链体。在一些实施方案中，该茎-环的茎包含长度为11个核苷酸的双链体。在一些实施方案中，该茎-环的茎包含长度为12个核苷酸的双链体。在一些实施方案中，该茎-环的茎包含长度为13个核苷酸的双链体。在一些实施方案中，该茎-环的茎包含长度为14个核苷酸的双链体。
在一些实施方案中，茎-环提供寡核苷酸免遭降解(例如，酶促降解)的保护，促进或改善向靶细胞、组织或器官(例如，肝脏)的靶向和/或递送，或以上两者。例如，在一些实施方案中，茎-环的环由包含一个或多个修饰的核苷酸组成，所述修饰促进、改善或增加对靶mRNA(例如，α-1抗胰蛋白酶mRNA)的靶向，对靶基因表达(例如，α-1抗胰蛋白酶表达)的抑制，和/或向靶细胞、组织或器官(例如，肝脏)中的递送、摄取和/或渗透，或其组合。在一些实施方案中，茎-环本身或对茎-环的修饰不影响或基本上不影响寡核苷酸固有的基因表达抑制活性，但促进、改善或增加寡核苷酸的稳定性(例如，提供针对降解的保护)和/或其向靶细胞、组织或器官(例如，肝脏)的递送、摄取和/或渗透。在一些实施方案中，本文的寡核苷酸包含有义链，该有义链包含(例如，在其3’端)如下所示的茎-环：S1-L-S2，其中S1与S2互补，并且其中L在S1与S2之间形成长度为最多约10个核苷酸(例如，长度为3、4、5、6、7、8、9或10个核苷酸)的连接的核苷酸的单链环。在一些实施方案中，环(L)的长度为3个核苷酸。在一些实施方案中，环(L)的长度为4个核苷酸。在一些实施方案中，环(L)的长度为5个核苷酸。在一些实施方案中，环(L)的长度为6个核苷酸。在一些实施方案中，环(L)的长度为7个核苷酸。在一些实施方案中，环(L)的长度为8个核苷酸。在一些实施方案中，环(L)的长度为9个核苷酸。在一些实施方案中，环(L)的长度为10个核苷酸。
在一些实施方案中，本文提供的寡核苷酸(例如，RNAi寡核苷酸)包含与连续核苷酸序列互补的靶向序列或互补区域，其中该靶向序列或互补区域选自SEQ ID NO：1、3、5、7、9、11、13、15、17、19、21、23、25、27、29和31，并且该寡核苷酸包含有义链，该有义链包含(例如，在其3’端)如下所示的茎-环：S1-L-S2，其中S1与S2互补，并且其中L在S1与S2之间形成长度为最多约10个核苷酸(例如，长度为3、4、5、6、7、8、9或10个核苷酸)的单链环。在一些实施方案中，该寡核苷酸包含与连续核苷酸序列互补的靶向序列或互补区域，其中该靶向序列或互补区域选自SEQ ID NO：1、3、5、7、9、11、13、15、17、19、21、23、25、27、29和31，并且该寡核苷酸包含有义链，该有义链包含(例如，在其3’端)如下所示的茎-环：S1-L-S2，其中S1与S2互补，并且其中L在S1与S2之间形成长度为4个核苷酸的单链环。
在一些实施方案中，具有如本文所述的结构S1-L-S2的茎-环的环(L)是三环。在一些实施方案中，所述寡核苷酸包含与连续核苷酸序列互补的靶向序列或互补区域，其中该靶向序列或互补区域选自SEQ ID NO：1、3、5、7、9、11、13、15、17、19、21、23、25、27、29和31以及三环。在一些实施方案中，该三环包含核糖核苷酸、脱氧核糖核苷酸、经修饰的核苷酸、配体(例如，递送配体)及其组合。
在一些实施方案中，具有如上所述的结构S1-L-S2的茎-环的环(L)是四环。在一些实施方案中，本文的寡核苷酸包含与连续核苷酸序列互补的靶向序列或互补区域，其中该靶向序列或互补区域选自SEQ ID NO：1、3、5、7、9、11、13、15、17、19、21、23、25、27、29和31以及四环。在一些实施方案中，该四环包含核糖核苷酸、脱氧核糖核苷酸、经修饰的核苷酸、配体(例如，递送配体)及其组合。
双链体长度
在一些实施方案中，在有义链与反义链之间形成的双链体的长度为至少12个(例如，至少15个、至少16个、至少17个、至少18个、至少19个、至少20个或至少21个)核苷酸。在一些实施方案中，在有义链与反义链之间形成的双链体的长度在12-30个核苷酸的范围内(例如，长度为12至30、12至27、12至22、15至25、18至30、18至22、18至25、18至27、18至30、19至30或21至30个核苷酸)。在一些实施方案中，在有义链与反义链之间形成的双链体的长度为12、13、14、15、16、17、18、19、29、21、22、23、24、25、26、27、28、29或30个核苷酸。在一些实施方案中，在有义链与反义链之间形成的双链体的长度为12个核苷酸。在一些实施方案中，在有义链与反义链之间形成的双链体的长度为13个核苷酸。在一些实施方案中，在有义链与反义链之间形成的双链体的长度为14个核苷酸。在一些实施方案中，在有义链与反义链之间形成的双链体的长度为15个核苷酸。在一些实施方案中，在有义链与反义链之间形成的双链体的长度为16个核苷酸。在一些实施方案中，在有义链与反义链之间形成的双链体的长度为17个核苷酸。在一些实施方案中，在有义链与反义链之间形成的双链体的长度为18个核苷酸。在一些实施方案中，在有义链与反义链之间形成的双链体的长度为19个核苷酸。在一些实施方案中，在有义链与反义链之间形成的双链体的长度为20个核苷酸。在一些实施方案中，在有义链与反义链之间形成的双链体的长度为21个核苷酸。在一些实施方案中，在有义链与反义链之间形成的双链体的长度为22个核苷酸。在一些实施方案中，在有义链与反义链之间形成的双链体的长度为23个核苷酸。在一些实施方案中，在有义链与反义链之间形成的双链体的长度为24个核苷酸。在一些实施方案中，在有义链与反义链之间形成的双链体的长度为25个核苷酸。在一些实施方案中，在有义链与反义链之间形成的双链体的长度为26个核苷酸。在一些实施方案中，在有义链与反义链之间形成的双链体的长度为27个核苷酸。在一些实施方案中，在有义链与反义链之间形成的双链体的长度为28个核苷酸。在一些实施方案中，在有义链与反义链之间形成的双链体的长度为29个核苷酸。在一些实施方案中，在有义链与反义链之间形成的双链体的长度为30个核苷酸。在一些实施方案中，在有义链与反义链之间形成的双链体不跨越有义链和/或反义链的整个长度。在一些实施方案中，有义链与反义链之间的双链体跨越有义链或反义链的整个长度。在一些实施方案中，有义链与反义链之间的双链体跨越有义链和反义链两者的整个长度。在一些实施方案中，寡核苷酸的有义链和反义链分别包含选自SEQ ID NO：33、35、37、39、41、43、45、47、49、51、53、55、57、59、61、63、65、67、69、71、73、75、77、79、81、83、85、87、89、91、93、95、97、99、101和103以及SEQ ID NO：34、36、38、40、42、44、46、48、50、52、54、56、58、60、62、64、66、68、70、72、74、76、78、80、82、84、86、88、90、92、94、96、98、100、102和104的核苷酸序列。在一些实施方案中，寡核苷酸的有义链和反义链包含选自下组的核苷酸序列：
(a)分别为SEQ ID NO：25和26；
(b)分别为SEQ ID NO：27和28；
(c)分别为SEQ ID NO：29和30；
(d)分别为SEQ ID NO：31和32；
(e)分别为SEQ ID NO：97和98；
(f)分别为SEQ ID NO：99和100；
(g)分别为SEQ ID NO：101和102；以及，
(h)分别为SEQ ID NO：103和104，
其中，在有义链与反义链之间形成的双链体的长度在12-30个核苷酸的范围内(例如，长度为12至30、12至27、12至22、15至25、18至30、18至22、18至25、18至27、18至30、19至30或21至30个核苷酸)。
寡核苷酸末端
在一些实施方案中，本文公开的寡核苷酸(例如，RNAi寡核苷酸)包含有义链和反义链，其中任一条链或两条链的末端包含平端。在一些实施方案中，本文的寡核苷酸包含有义链和反义链，其中任一条链或两条链的末端包含含有一个或多个核苷酸的突出端。在一些实施方案中，构成突出端的所述一个或多个核苷酸是未配对的核苷酸。在一些实施方案中，本文的寡核苷酸包含有义链和反义链，其中有义链的3’末端和反义链的5’末端包含平端。在一些实施方案中，本文的寡核苷酸包含有义链和反义链，其中有义链的5’末端和反义链的3’末端包含平端。
在一些实施方案中，本文的寡核苷酸包含有义链和反义链，其中任一条链或两条链的3’末端包含含有一个或多个核苷酸的3’-突出端。在一些实施方案中，本文的寡核苷酸包含有义链和反义链，其中有义链包含含有一个或多个核苷酸的3’-突出端。在一些实施方案中，本文的寡核苷酸包含有义链和反义链，其中反义链包含含有一个或多个核苷酸的3’-突出端。在一些实施方案中，本文的寡核苷酸包含有义链和反义链，其中有义链和反义链均包含含有一个或多个核苷酸的3’-突出端。
在一些实施方案中，3’-突出端的长度为约一(1)至二十(20)个核苷酸(例如，长度为约1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或约20个核苷酸)。在一些实施方案中，3’突出端的长度为约一(1)至十九(19)、一(1)至十八(18)、一(1)至十七(17)、一(1)至十六(16)、一(1)至十五(15)、一(1)至十四(14)、一(1)至十三(13)、一(1)至十二(12)、一(1)至十一(11)、一(1)至十(10)、一(1)至九(9)、一(1)至八(8)、一(1)至七(7)、一(1)至六(6)、一(1)至五(5)、一(1)至四(4)、一(1)至三(3)或约一(1)至两(2)个核苷酸。在一些实施方案中，3’-突出端的长度为(1)个核苷酸。在一些实施方案中，3’-突出端的长度为两(2)个核苷酸。在一些实施方案中，3’-突出端的长度为三(3)个核苷酸。在一些实施方案中，3’-突出端的长度为四(4)个核苷酸。在一些实施方案中，3’-突出端的长度为五(5)个核苷酸。在一些实施方案中，3’-突出端的长度为六(6)个核苷酸。在一些实施方案中，3’-突出端的长度为七(7)个核苷酸。在一些实施方案中，3’-突出端的长度为八(8)个核苷酸。在一些实施方案中，3’-突出端的长度为九(9)个核苷酸。在一些实施方案中，3’-突出端的长度为十(10)个核苷酸。在一些实施方案中，3’-突出端的长度为十一(11)个核苷酸。在一些实施方案中，3’-突出端的长度为十二(12)个核苷酸。在一些实施方案中，3’-突出端的长度为十三(13)个核苷酸。在一些实施方案中，3’-突出端的长度为十四(14)个核苷酸。在一些实施方案中，3’-突出端的长度为十五(15)个核苷酸。在一些实施方案中，3’-突出端的长度为十六(16)个核苷酸。在一些实施方案中，3’-突出端的长度为十七(17)个核苷酸。在一些实施方案中，3’-突出端的长度为十八(18)个核苷酸。在一些实施方案中，3’-突出端的长度为十九(19)个核苷酸。在一些实施方案中，3’-突出端的长度为二十(20)个核苷酸。
在一些实施方案中，本文公开的寡核苷酸(例如，RNAi寡核苷酸)包含有义链和反义链，其中该反义链包含3’-突出端，其中该寡核苷酸的有义链和反义链分别包含选自SEQID NO：33、35、37、39、41、43、45、47、49、51、53、55、57、59、61、63、65、67、69、71、73、75、77、79、81、83、85、87、89、91、93、95、97、99、101和103以及SEQ ID NO：34、36、38、40、42、44、46、48、50、52、54、56、58、60、62、64、66、68、70、72、74、76、78、80、82、84、86、88、90、92、94、96、98、100、102和104的核苷酸序列。
在一些实施方案中，本文公开的寡核苷酸(例如，RNAi寡核苷酸)包含有义链和反义链，其中该反义链包含3’-突出端，其中该寡核苷酸的有义链和反义链包含选自下组的核苷酸序列：
(a)分别为SEQ ID NO：25和26；
(b)分别为SEQ ID NO：27和28；
(c)分别为SEQ ID NO：29和30；以及，
(d)分别为SEQ ID NO：31和32，
并且其中反义链包含长度为约一(1)至二十(20)个核苷酸(例如，长度为约1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或约20个核苷酸)的3’-突出端，任选地其中该3’-突出端的长度为两(2)个核苷酸。
在一些实施方案中，本文的寡核苷酸包含有义链和反义链，其中任一条链或两条链的5’末端包含含有一个或多个核苷酸的5’-突出端。在一些实施方案中，本文的寡核苷酸包含有义链和反义链，其中有义链包含含有一个或多个核苷酸的5’-突出端。在一些实施方案中，本文的寡核苷酸包含有义链和反义链，其中反义链包含含有一个或多个核苷酸的5’-突出端。在一些实施方案中，本文的寡核苷酸包含有义链和反义链，其中有义链和反义链均包含含有一个或多个核苷酸的5’-突出端。
在一些实施方案中，5’-突出端的长度为约一(1)至二十(20)个核苷酸(例如，长度为约1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或约20个核苷酸)。在一些实施方案中，5’突出端的长度为约一(1)至十九(19)、一(1)至十八(18)、一(1)至十七(17)、一(1)至十六(16)、一(1)至十五(15)、一(1)至十四(14)、一(1)至十三(13)、一(1)至十二(12)、一(1)至十一(11)、一(1)至十(10)、一(1)至九(9)、一(1)至八(8)、一(1)至七(7)、一(1)至六(6)、一(1)至五(5)、一(1)至四(4)、一(1)至三(3)或约一(1)至两(2)个核苷酸。在一些实施方案中，5’-突出端的长度为(1)个核苷酸。在一些实施方案中，5’-突出端的长度为两(2)个核苷酸。在一些实施方案中，5’-突出端的长度为三(3)个核苷酸。在一些实施方案中，5’-突出端的长度为四(4)个核苷酸。在一些实施方案中，5’-突出端的长度为五(5)个核苷酸。在一些实施方案中，5’-突出端的长度为六(6)个核苷酸。在一些实施方案中，5’-突出端的长度为七(7)个核苷酸。在一些实施方案中，5’-突出端的长度为八(8)个核苷酸。在一些实施方案中，5’-突出端的长度为九(9)个核苷酸。在一些实施方案中，5’-突出端的长度为十(10)个核苷酸。在一些实施方案中，5’-突出端的长度为十一(11)个核苷酸。在一些实施方案中，5’-突出端的长度为十二(12)个核苷酸。在一些实施方案中，5’-突出端的长度为十三(13)个核苷酸。在一些实施方案中，5’-突出端的长度为十四(14)个核苷酸。在一些实施方案中，5’-突出端的长度为十五(15)个核苷酸。在一些实施方案中，5’-突出端的长度为十六(16)个核苷酸。在一些实施方案中，5’-突出端的长度为十七(17)个核苷酸。在一些实施方案中，5’-突出端的长度为十八(18)个核苷酸。在一些实施方案中，5’-突出端的长度为十九(19)个核苷酸。在一些实施方案中，5’--突出端的长度为二十(20)个核苷酸。
在一些实施方案中，本文公开的寡核苷酸(例如，RNAi寡核苷酸)包含有义链和反义链，其中该反义链包含5’-突出端，其中该寡核苷酸的有义链和反义链包含选自下组的核苷酸序列：
(a)分别为SEQ ID NO：25和26；
(b)分别为SEQ ID NO：27和28；
(c)分别为SEQ ID NO：29和30；以及，
(d)分别为SEQ ID NO：31和32，
并且其中反义链包含长度为约一(1)至二十(20)个核苷酸(例如，长度为约1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或约20个核苷酸)的5’-突出端，任选地其中该5’-突出端的长度为两(2)个核苷酸。
在一些实施方案中，构成有义链和/或反义链的3’末端或5’末端的一个或多个(例如，2、3、4、5个或更多个)核苷酸被修饰。例如，在一些实施方案中，反义链的3’末端的一个或两个末端核苷酸被修饰。在一些实施方案中，反义链的3’末端的最后一个核苷酸被修饰，例如，包含2’修饰，例如2’-O-甲氧基乙基。在一些实施方案中，反义链的3’末端的最后一个或两个末端核苷酸与靶标互补。在一些实施方案中，反义链的3’末端的最后一个或两个核苷酸不与靶标互补。
在一些实施方案中，本文公开的寡核苷酸(例如，RNAi寡核苷酸)包含有义链和反义链，其中有义链的3’末端包含本文所述的茎-环，并且反义链的3’末端包含本文所述的3’-突出端。在一些实施方案中，本文的寡核苷酸(例如，RNAi寡核苷酸)包含形成本文所述的带缺口的四环结构的有义链和反义链，其中有义链的3’末端包含茎-环，其中该环是本文所述的四环，并且其中反义链的3’末端包含本文所述的3’-突出端。在一些实施方案中，3’-突出端的长度为两(2)个核苷酸。在一些实施方案中，构成3’-突出端的两(2)个核苷酸均包含鸟嘌呤(G)核碱基。通常，构成反义链的3’-突出端的核苷酸之一或两者不与靶标互补。图20中提供了示例性的寡核苷酸结构。
寡核苷酸修饰
在一些实施方案中，本文所述的寡核苷酸(例如，RNAi寡核苷酸)包含修饰。寡核苷酸(例如，RNAi寡核苷酸)可以以多种方式进行修饰，以改善或控制特异性、稳定性、递送、生物利用度、核酸酶降解抗性、免疫原性、碱基配对性质、RNA分布和细胞摄取以及与治疗或研究用途相关的其他特征。
在一些实施方案中，所述修饰是经修饰的糖。在一些实施方案中，该修饰是5’-末端磷酸酯基团。在一些实施方案中，该修饰是经修饰的核苷酸间键合。在一些实施方案中，该修饰是经修饰的碱基。在一些实施方案中，本文所述的寡核苷酸可包含本文所述的任一种修饰或其任何组合。例如，在一些实施方案中，本文所述的寡核苷酸包含至少一种经修饰的糖、5’-末端磷酸酯基团、至少一种经修饰的核苷酸间键合和至少一种经修饰的碱基。在一些实施方案中，寡核苷酸的有义链和反义链包含选自下组的核苷酸序列：
(a)分别为SEQ ID NO：25和26；
(b)分别为SEQ ID NO：27和28；
(c)分别为SEQ ID NO：29和30；以及，
(d)分别为SEQ ID NO：31和32，
其中所述寡核苷酸包含至少一种经修饰的糖、5’-末端磷酸酯基团、至少一种经修饰的核苷酸间键合和至少一种经修饰的碱基。
寡核苷酸(例如，RNAi寡核苷酸)上的修饰数目和这些核苷酸修饰的位置可影响寡核苷酸的性质。例如，可以通过将寡核苷酸与脂质纳米颗粒(LNP)或类似载体缀合或将其包围在脂质纳米颗粒(LNP)或类似载体中来在体内递送所述寡核苷酸。然而，当寡核苷酸不受LNP或类似载体保护时，至少一些核苷酸被修饰可能是有利的。因此，在一些实施方案中，寡核苷酸的所有或基本上所有核苷酸均被修饰。在一些实施方案中，超过一半的核苷酸被修饰。在一些实施方案中，少于一半的核苷酸被修饰。在一些实施方案中，构成寡核苷酸的所有核苷酸的糖部分在2’位置被修饰。所述修饰可以是可逆的或不可逆的。在一些实施方案中，本文公开的寡核苷酸具有足以产生所需特性(例如，针对酶促降解的保护、在体内施用后靶向所需细胞的能力和/或热力学稳定性)的修饰核苷酸数目和类型。
糖修饰
在一些实施方案中，本文所述的寡核苷酸(例如，RNAi寡核苷酸)包含经修饰的糖。在一些实施方案中，经修饰的糖(本文中也称为糖类似物)包括经修饰的脱氧核糖或核糖部分，其中，例如，一个或多个修饰发生在糖的2’、3’、4’和/或5’碳位置处。在一些实施方案中，经修饰的糖还可以包括非天然替代碳结构，例如存在于锁定核酸(“LNA”；参见，例如，Koshkin等人(1998)TETRAHEDON 54：3607-30)、未锁定的核酸(“UNA”；参见，例如，Snead等人(2013)MOL.THER-NUCL.ACIDS2：e103)和桥连核酸(“BNA”；参见，例如，Imanishi&Obika(2002)CHEM COMMUN.(CAMB)21：1653-59)中的那些结构。
在一些实施方案中，糖中的核苷酸修饰包括2’-修饰。在一些实施方案中，2’-修饰可以是2’-O-炔丙基、2’-O-丙基氨基、2’-氨基、2’-乙基、2’-氟代(2’-F)、2’-氨基乙基(EA)、2’-O-甲基(2’-OMc)、2’-O-甲氧基乙基(2’-MOE)、2’-O-[2-(甲基氨基)-2-氧代乙基](2’-O-NMA)或2’-脱氧-2’-氟-β-d-阿拉伯糖核酸(2’-FANA)。在一些实施方案中，该修饰是2’-F、2’-OMe或2’-MOE。在一些实施方案中，糖中的修饰包括糖环的修饰，其可以包括糖环的一个或多个碳的修饰。例如，核苷酸的糖的修饰可以包括糖的2’-氧与糖的1’-碳或4’-碳连接，或者2’-氧与1’-碳或4’-碳经由亚乙基或亚甲基桥连接。在一些实施方案中，经修饰的核苷酸具有缺少2’-碳至3’-碳的键的无环糖。在一些实施方案中，经修饰的核苷酸具有硫醇基团，例如在糖的4’位置。
在一些实施方案中，本文所述的寡核苷酸(例如，RNAi寡核苷酸)包含至少约1个经修饰的核苷酸(例如，至少1个、至少5个、至少10个、至少15个、至少20个、至少25个、至少30个、至少35个、至少40个、至少45个、至少50个、至少55个、至少60个或更多个)。在一些实施方案中，该寡核苷酸的有义链包含至少约1个经修饰的核苷酸(例如，至少1个、至少5个、至少10个、至少15个、至少20个、至少25个、至少30个、至少35个或更多个)。在一些实施方案中，该寡核苷酸的反义链包含至少约1个经修饰的核苷酸(例如，至少1个、至少5个、至少10个、至少15个、至少20个或更多个)。
在一些实施方案中，所述寡核苷酸的有义链的所有核苷酸均被修饰。在一些实施方案中，该寡核苷酸的反义链的所有核苷酸均被修饰。在一些实施方案中，该寡核苷酸的所有核苷酸(即，有义链和反义链两者)均被修饰。在一些实施方案中，经修饰的核苷酸包含2’-修饰(例如，2’-F或2’-OMe、2’-MOE和2’-脱氧-2’-氟-β-d-阿拉伯糖核酸)。
在一些实施方案中，本公开提供了具有不同修饰模式的寡核苷酸。在一些实施方案中，本文的寡核苷酸包含具有如实施例和序列表中阐述的修饰模式的有义链以及具有如实施例和序列表中阐述的修饰模式的反义链。
在一些实施方案中，本文公开的寡核苷酸(例如，RNAi寡核苷酸)包含具有被2’-F修饰的核苷酸的反义链。在一些实施方案中，本文的寡核苷酸包含反义链，该反义链包含被2’-F和2’-OMe修饰的核苷酸。在一些实施方案中，本文公开的寡核苷酸包含具有被2’-F修饰的核苷酸的有义链。在一些实施方案中，本文公开的寡核苷酸包含有义链，该有义链包含被2’-F和2’-OMe修饰的核苷酸。
在一些实施方案中，有义链的位置8、9、10或11中的一个或多个被2’-F基团修饰。在一些实施方案中，有义链的位置3、8、9、10、12、13和17中的一个或多个被2’-F基团修饰。在一些实施方案中，反义链的位置2、3、4、5、7、10和14中的一个或多个被2’-F基团修饰。在一些实施方案中，位置2、3、4、5、7、8、10、14、16和19中的一个或多个被2’-F基团修饰。在一些实施方案中，有义链中位置1-7和12-20处的每个核苷酸处的糖部分被2’-OMe修饰。在一些实施方案中，有义链中位置1-7、12-27和31-36处的每个核苷酸处的糖部分被2’-OMe修饰。在一些实施方案中，有义链中位置6、9、11-13、15、17、18和20-22处的每个核苷酸处的糖部分被2’-OMe修饰。在一些实施方案中，以下位置中的一个或多个位置被2’-O-甲基修饰：有义链的位置1、2、4、6、7、12、14、16、18-26或31-36，和/或反义链的位置1、6、8、11-13、15、17或19-22。在一些实施方案中，以下位置中的一个或多个位置被2’-氟代修饰：有义链的位置3、5、8-11、13、15或17，和/或反义链的位置2-5、7、9、10、14、16或18。
在一些实施方案中，有义链的位置3、8-10、12、13和17处的核苷酸被2’-F基团修饰。在一些实施方案中，反义链的位置2、3、5、7、12、14、16和19处的核苷酸被2’-F基团修饰。在一些实施方案中，有义链的位置1、2、4-7、11、14-16、18-26和31-36处的核苷酸被2’-OMe修饰。在一些实施方案中，反义链的位置1、4、6、8-11、13、15、17、18和20-22处的核苷酸被2’-OMe修饰。在一些实施方案中，以下位置处的核苷酸被2’-O-Me修饰：有义链的位置1、2、4-7、11、14-16、18-26和31-36，和/或反义链的位置1、4、6、8-11、13、15、17、18和20-22。在一些实施方案中，以下位置处的核苷酸被2’-氟代修饰：有义链的位置3、8、9、10、12、13和17，和/或反义链的位置2、3、5、7、12、14、16和19。
在一些实施方案中，以下位置中的一个或多个位置被2’-O-甲基修饰：有义链的位置1-7和12-36，和/或反义链的位置1、6、8-13和15-22。在一些实施方案中，以下位置中的一个或多个位置被2’-氟代修饰：有义链的位置8-11，和/或反义链的位置2-5、7和14。
在一些实施方案中，以下位置中的一个或多个位置被2’-O-甲基修饰：有义链的位置1、2、4-7、11、14-16、18-26或31-36，和/或反义链的位置1、4、6、8-11、13、15、17、18或20-22。在一些实施方案中，以下位置中的一个或多个位置被2’-氟代修饰：有义链的位置3、8-10、12、13和17，和/或反义链的位置2、3、5、7、12、14、16和19。
在一些实施方案中，以下位置中的一个或多个位置被2’-O-甲基修饰：有义链的位置1、2、4-7、11、14-16、18-26或31-36，和/或反义链的位置1、4、6、8、9、11-13、15、18或20-22。在一些实施方案中，以下位置中的一个或多个位置被2’-氟代修饰：有义链的位置3、8-10、12、13或17，和/或反义链的位置2、3、5、7、10、14、16、17或19。
在一些实施方案中，寡核苷酸的有义链和反义链包含选自下组的核苷酸序列：
(a)分别为SEQ ID NO：25和26；
(b)分别为SEQ ID NO：27和28；
(c)分别为SEQ ID NO：29和30；以及，
(d)分别为SEQ ID NO：31和32，
其中有义链的位置3、8-10、12、13或17中的一个或多个位置被2’-F基团修饰。
在一些实施方案中，本文提供的寡核苷酸包含在一个或多个核苷酸处具有糖部分的反义链。该糖部分或者被2’-F修饰，或者被选自2’-O-炔丙基、2’-O-丙基氨基、2’-氨基、2’-乙基、2’-氨基乙基(EA)、2’-O-甲基(2’-OMe)、2’-O-甲氧基乙基(2’-MOE)、2’-O-[2-(甲基氨基)-2-氧代乙基](2’-O-NMA)和2’-脱氧-2’-氟-β-d-阿拉伯糖核酸(2’-FANA)的修饰所修饰。
5’-末端磷酸酯
在一些实施方案中，本文所述的寡核苷酸(例如，RNAi寡核苷酸)包含有义链和反义链，其中该反义链包含5’-末端磷酸酯。在一些实施方案中，RNAi寡核苷酸的5’-末端磷酸酯基团增强与Ago2的相互作用。然而，包含5’-磷酸酯基团的寡核苷酸可能容易经由磷酸酶或其他酶降解，这可能限制它们在体内的表现和/或生物利用度。在一些实施方案中，本文的寡核苷酸包括对这样的降解有抗性的5’磷酸酯类似物。在一些实施方案中，该磷酸酯类似物是氧基甲基膦酸酯、乙烯基膦酸酯或丙二酰基膦酸酯，或其组合。在一些实施方案中，寡核苷酸链的5’末端附接至模拟天然5’-磷酸酯基团的静电性质和空间性质的化学部分(“磷酸酯模拟物”)。在一些实施方案中，寡核苷酸的有义链和反义链包含分别选自SEQ IDNO：1、3、5、7、9、11、13、15、17、19、21、23、25、27、29和31以及SEQ ID NO：2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30和32的核苷酸序列。
在一些实施方案中，寡核苷酸的有义链和反义链包含选自下组的核苷酸序列：
(a)分别为SEQ ID NO：25和26；
(b)分别为SEQ ID NO：27和28；
(c)分别为SEQ ID NO：29和30；以及，
(d)分别为SEQ ID NO：31和32，
其中所述寡核苷酸包含5’-末端磷酸酯，任选地5’-末端磷酸酯类似物。
在一些实施方案中，本文的寡核苷酸(例如，RNAi寡核苷酸)在糖的4’-碳位置处具有磷酸酯类似物(称为“4’-磷酸酯类似物”)。参见，例如，公开号为WO 2018/045317的国际专利申请。在一些实施方案中，本文的寡核苷酸在5’-末端核苷酸处包含4’-磷酸酯类似物。在一些实施方案中，磷酸酯类似物是氧基甲基膦酸酯，其中氧基甲基的氧原子结合至糖部分(例如，在其4’-碳处)或其类似物。在其他实施方案中，4’-磷酸酯类似物是硫代甲基膦酸酯或氨基甲基膦酸酯，其中硫代甲基的硫原子或氨基甲基的氮原子结合至糖部分或其类似物的4’-碳。在一些实施方案中，4’-磷酸酯类似物是氧基甲基膦酸酯。在一些实施方案中，氧基甲基膦酸酯由式-O-CH2-PO(OH)2、-O-CH2-PO(OR)2或-O-CH2-POOH(R)表示，其中R独立地选自H、CH3、烷基、CH2CH2CN、CH2OCOC(CH3)3、CH2OCH2CH2Si(CH3)3或保护基。在一些实施方案中，该烷基是CH2CH3。更典型地，R独立地选自H、CH3或CH2CH3。在一些实施方案中，R为CH3。在一些实施方案中，该4’-磷酸酯类似物是4’-氧基甲基膦酸酯。
在一些实施方案中，所述4’-磷酸酯类似物是4’-(甲基甲氧基膦酸酯)。在一些实施方案中，本文提供的寡核苷酸包含反义链，该反义链在5’-末端核苷酸处包含4’-磷酸酯类似物，其中5’-末端核苷酸包含以下结构：
4’-O-单甲基膦酸酯-2’-O-甲基尿苷硫代磷酸酯[MePhosphonate-4O-mUs][MeMOP]
经修饰的核苷酸间键合
在一些实施方案中，本文提供的寡核苷酸(例如，RNAi寡核苷酸)包含经修饰的核苷酸间键合。在一些实施方案中，磷酸酯修饰或取代产生包含至少约1个(例如，至少1个、至少2个、至少3个或至少5个)经修饰的核苷酸间键合的寡核苷酸。在一些实施方案中，本文公开的任一种寡核苷酸包含约1至约10个(例如，1至10、2至8、4至6、3至10、5至10、1至5、1至3或1至2个)经修饰的核苷酸间键合。在一些实施方案中，本文公开的任一种寡核苷酸包含1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个经修饰的核苷酸间键合。
经修饰的核苷酸间键合可以是二硫代磷酸酯键、硫代磷酸酯键、磷酸三酯键、硫代烷基膦酸酯键、硫代烷基磷酸三酯键、亚磷酰胺键、膦酸酯键或硼代磷酸酯(boranophosphate)键。在一些实施方案中，本文公开的任一种寡核苷酸的至少一个经修饰的核苷酸间键合是硫代磷酸酯键。
在一些实施方案中，本文提供的寡核苷酸(例如，RNAi寡核苷酸)在有义链的位置1和2、反义链的位置1和2、反义链的位置2和3、反义链的位置3和4、反义链的位置20和21以及反义链的位置21和22中的一个或多个之间具有硫代磷酸酯键。在一些实施方案中，本文所述的寡核苷酸在有义链的位置1和2、反义链的位置1和2、反义链的位置2和3、反义链的位置20和21以及反义链的位置21和22中的每一个之间具有硫代磷酸酯键。在一些实施方案中，寡核苷酸的有义链和反义链包含选自下组的核苷酸序列：
(a)分别为SEQ ID NO：25和26；
(b)分别为SEQ ID NO：27和28；
(c)分别为SEQ ID NO：29和30；以及，
(d)分别为SEQ ID NO：31和32，
并且其中所述寡核苷酸包含经修饰的核苷酸间键合。
碱基修饰
在一些实施方案中，本文提供的寡核苷酸(例如，RNAi寡核苷酸)包含一个或多个经修饰的核碱基。在一些实施方案中，经修饰的核碱基(本文中也称为碱基类似物)在核苷酸糖部分的1’位置处连接。在一些实施方案中，经修饰的核碱基是含氮碱基。在一些实施方案中，经修饰的核碱基不含氮原子。参见，例如，公开号为2008/0274462的美国专利申请。在一些实施方案中，经修饰的核苷酸包含通用碱基。在一些实施方案中，经修饰的核苷酸不含核碱基(无碱基的)。在一些实施方案中，寡核苷酸的有义链和反义链包含选自下组的核苷酸序列：
(a)分别为SEQ ID NO：25和26；
(b)分别为SEQ ID NO：27和28；
(c)分别为SEQ ID NO：29和30；以及
(d)分别为SEQ ID NO：31和32，
其中所述寡核苷酸包含一个或多个经修饰的核碱基。
在一些实施方案中，通用碱基是杂环部分，该杂环部分位于经修饰的核苷酸中核苷酸糖部分的1’位置处，或者位于核苷酸糖部分取代中的等同位置处，以致于当存在于双链体中时，其可以放置于超过一种类型的碱基的对面，而基本上不改变双链体的结构。在一些实施方案中，相比于与靶核酸(例如，α-1抗胰蛋白酶mRNA)完全互补的参考单链核酸(例如，寡核苷酸)，含有通用碱基的单链核酸与靶核酸形成双链体，该双链体的Tm低于与互补核酸形成的双链体。在一些实施方案中，当与其中通用碱基已被碱基代替以生成单个错配的参考单链核酸相比时，含有通用碱基的单链核酸与靶核酸形成双链体，该双链体的Tm高于与包含该错配碱基的核酸形成的双链体。
通用结合核苷酸的非限制性实例包括但不限于肌苷、1-β-D-呋喃核糖基-5-硝基吲哚和/或1-β-D-呋喃核糖基-3-硝基吡咯(参见公开号为2007/0254362的美国专利申请；Van Aerschot等人(1995)NUCLEIC ACIDS RES.23：4363-4370；Loakes等人(1995)NucleicAcids Res.23：2361-66；以及Loakes&Brown(1994)Nucleic Acids Res.22：4039-43)。
靶向配体
在一些实施方案中，希望将本文提供的寡核苷酸(例如，RNAi寡核苷酸)靶向一种或多种细胞或细胞类型、组织、器官或解剖区域或区室。这样的策略可以有助于避免不良影响和/或避免寡核苷酸过度流失到不会从该寡核苷酸或其作用(例如，α-1抗胰蛋白酶表达的抑制或降低)受益的细胞、组织、器官或解剖区域或区室。因此，在一些实施方案中，本文公开的寡核苷酸(例如，RNAi寡核苷酸)被修饰，以促进向特定细胞或细胞类型、组织、器官或解剖区域或区室的靶向和/或递送(例如，促进寡核苷酸向肝脏的递送)。在一些实施方案中，寡核苷酸包含与一个或多个靶向配体缀合的至少一个核苷酸(例如，1、2、3、4、5、6个或更多个核苷酸)。在一些实施方案中，寡核苷酸的有义链和反义链包含选自下组的核苷酸序列：
(a)分别为SEQ ID NO：25和26；
(b)分别为SEQ ID NO：27和28；
(c)分别为SEQ ID NO：29和30；以及，
(d)分别为SEQ ID NO：31和32，
其中所述寡核苷酸包含与至少一个核苷酸缀合的靶向配体。
在一些实施方案中，靶向配体包含碳水化合物、氨基糖、胆固醇、肽、多肽、蛋白质或蛋白质的一部分(例如，抗体或抗体片段)或脂质。在一些实施方案中，靶向配体是包含GalNAc部分的碳水化合物。
在一些实施方案中，本文提供的寡核苷酸(例如，RNAi寡核苷酸)的1个或多个(例如，1、2、3、4、5或6个)核苷酸各自与单独的靶向配体(例如，GalNAc部分)缀合。在一些实施方案中，寡核苷酸的2至4个核苷酸各自与单独的靶向配体缀合。在一些实施方案中，靶向配体与有义链或反义链任一端的2至4个核苷酸缀合(例如，靶向配体与有义链或反义链5’或3’末端上的2至4个核苷酸的突出端或延伸部分缀合)，使得靶向配体类似于牙刷的刷毛，而寡核苷酸类似于牙刷。例如，寡核苷酸可在有义链的5’或3’末端包含茎-环，并且该茎的环的1、2、3或4个核苷酸可单独地与靶向配体缀合。在一些实施方案中，本公开提供的寡核苷酸(例如，RNAi寡核苷酸)在有义链的3’末端包含茎-环，其中该茎-环的环包含三环或四环，并且其中构成该三环或四环的3或4个核苷酸分别单独地与靶向配体缀合。
GalNAc是脱唾液酸糖蛋白受体(ASGPR)的高亲和力碳水化合物配体，ASGPR主要在肝细胞的表面上表达，并且在结合、内化及随后清除含有末端半乳糖或GaINAc残基的循环糖蛋白(脱唾液酸糖蛋白)方面起主要作用。GalNAc部分与本公开的寡核苷酸的缀合(间接的或直接的)可用来将这些寡核苷酸靶向细胞上表达的ASGPR。在一些实施方案中，本公开的寡核苷酸(例如，RNAi寡核苷酸)与至少一个或多个GalNAc部分缀合，其中所述GalNAc部分将该寡核苷酸靶向人肝脏细胞(例如，人肝细胞)上表达的ASGPR。在一些实施方案中，GalNAc部分将寡核苷酸靶向肝脏。
在一些实施方案中，本公开的寡核苷酸(例如，RNAi寡核苷酸)直接或间接地与单价GalNAc部分缀合。在一些实施方案中，该寡核苷酸直接或间接地与多于一个单价GalNAc缀合(即，与2、3或4个单价GalNAc部分缀合，并且通常与3或4个单价GalNAc部分缀合)。在一些实施方案中，寡核苷酸与一个或多个二价GalNAc、三价GalNAc或四价GalNAc部分缀合。
在一些实施方案中，本文所述的寡核苷酸(例如，RNAi寡核苷酸)的一(1)个或多个(例如，1、2、3、4、5或6个)核苷酸各自与GalNAc部分缀合。在一些实施方案中，四环的两(2)至四(4)个核苷酸各自与单独的GalNAc部分缀合。在一些实施方案中，三环的一(1)至三(3)个核苷酸各自与单独的GalNAc部分缀合。在一些实施方案中，靶向配体与有义链或反义链任一端的两(2)至四(4)个核苷酸缀合(例如，配体与有义链或反义链5’或3’末端上的两(2)至四(4)个核苷酸的突出端或延伸部分缀合)，使得GalNAc部分类似于牙刷的刷毛，而寡核苷酸类似于牙刷。在一些实施方案中，GalNAc部分与有义链的核苷酸缀合。例如，三(3)或四(4)个GalNAc部分可以与有义链的四环中的核苷酸缀合，其中每个GalNAc部分与一(1)个核苷酸缀合。
在一些实施方案中，本文所述的寡核苷酸(例如，RNAi寡核苷酸)包含四环，其中该四环(L)是腺嘌呤(A)和鸟嘌呤(G)核苷酸的任意组合。在一些实施方案中，所述四环(L)包含经由本文所述的任何连接体与该四环的任何一个或多个鸟嘌呤(G)核苷酸附接的单价GalNAc部分，如下所示(X＝杂原子)：
在一些实施方案中，所述四环(L)具有经由本文所述的任何连接体与该四环的任何一个或多个腺嘌呤核苷酸附接的单价GalNAc，如下所示(X＝杂原子)：
在一些实施方案中，本文的寡核苷酸(例如，RNAi寡核苷酸)包含与鸟嘌呤(G)核苷酸附接的单价GalNAc部分，称为[ademG-GalNAc]或2’-氨基二乙氧基甲醇-鸟嘌呤-GalNAc，如下所示：
在一些实施方案中，本文的寡核苷酸包含与腺嘌呤核苷酸附接的单价GalNAc部分，称为[ademA-GalNAc]或2’-氨基二乙氧基甲醇-腺嘌呤-GalNAc，如下所示：
下面针对从5’至3’包含核苷酸序列GAAA的环示出了这类缀合的实例(L＝连接体，X＝杂原子)。例如，这样的环可以存在于本文提供的有义链的位置27-30处，如图20所示。在化学式中，用来描述与寡核苷酸链连接的连接点。/>
可以使用适当的方法或化学(例如，点击化学)将靶向配体连接至核苷酸。在一些实施方案中，使用点击连接体将靶向配体与构成本文的寡核苷酸(例如，RNAi寡核苷酸)的核苷酸缀合。在一些实施方案中，使用基于缩醛的连接体将靶向配体与本文所述的任一种寡核苷酸的核苷酸缀合。基于缩醛的连接体例如在公开号为WO2016/100401的国际专利申请中公开。在一些实施方案中，该连接体是不稳定的连接体。然而，在其他实施方案中，该连接体是稳定的。下面示出了从5’至3’包含核苷酸GAAA的环的实例，其中使用缩醛连接体将GalNAc部分附接至该环的核苷酸。例如，这样的环可以存在于任一有义链的位置27-30处，如图20所示。在化学式中，是与寡核苷酸链连接的连接点。
在一些实施方案中，本文的寡核苷酸(例如，RNAi寡核苷酸)包含具有四环的有义链，其中四(4)个GalNAc部分缀合至构成该四环的核苷酸，并且其中每个GalNAc部分缀合至一(1)个核苷酸。在一些实施方案中，本文的寡核苷酸(例如，RNAi寡核苷酸)包含有义链，该有义链具有包含GalNAc缀合的核苷酸的四环，其中该四环包含以下结构：
在一些实施方案中，本文的寡核苷酸(例如，RNAi寡核苷酸)包含具有四环的有义链，其中三(3)个GalNAc部分缀合至构成该四环的核苷酸，并且其中每个GalNAc部分缀合至一(1)个核苷酸。在一些实施方案中，本文的寡核苷酸(例如，RNAi寡核苷酸)包含有义链，该有义链具有包含GalNAc缀合的核苷酸的四环，其中该四环包含以下结构：
如所提到的，可以使用各种适当的方法或化学合成技术(例如，点击化学)将靶向配体连接至核苷酸。在一些实施方案中，使用点击连接体将靶向配体与核苷酸缀合。在一些实施方案中，使用基于缩醛的连接体将靶向配体与本文所述的任一种寡核苷酸的核苷酸缀合。基于缩醛的连接体例如在公开号为WO 2016/100401的国际专利申请中公开。在一些实施方案中，连接体是不稳定的连接体。然而，在其他实施方案中，连接体是稳定的连接体。
在一些实施方案中，在靶向配体(例如，GalNAc部分)与寡核苷酸之间提供双链体延伸(例如，长度最多3、4、5或6bp)。在一些实施方案中，本文的寡核苷酸(例如，RNAi寡核苷酸)不具有与之缀合的GalNAc。
在一些实施方案中，寡核苷酸的有义链和反义链包含选自下组的核苷酸序列：
(a)分别为SEQ ID NO：25和26；
(b)分别为SEQ ID NO：27和28；
(c)分别为SEQ ID NO：29和30；以及，
(d)分别为SEQ ID NO：31和32，
其中所述寡核苷酸包含与核苷酸缀合的至少一个GalNAc部分。
用于降低α-1抗胰蛋白酶表达的示例性寡核苷酸
在一些实施方案中，本公开提供了用于降低α-1抗胰蛋白酶表达的寡核苷酸(例如，RNAi寡核苷酸)，其中该寡核苷酸包含根据以下的有义链和反义链：
有义链：5’
-[mAs][mA][fA][mC][mC][mC][mU][fU][fU][fG][mU][fC][fU][mU][mC][mU][fU][mA][mA][mA][mG][mC][mA][mG][mC][mC][ademG-GalNAc][ademA-GalNAc][ademA-GalNAc][ademA-GalNAc][mG][mG][mC][mU][mG][mC]-3’(SEQ ID NO：101)；
杂交至：
反义链：5’
[MePhosphonate-4O-mUs][fUs][fUs][mA][fA][mG][fA][mA][mG][mA][mC][fA][mA][fA][mG][fG][mG][mU][fU][mUs][mGs][mG]-3’(SEQ ID NO：104)；
其中mX＝2’-O-甲基修饰的核苷酸，fX＝2’-氟代修饰的核苷酸，-S-＝硫代磷酸酯键，-＝磷酸二酯键，[MePhosphonate-4O-mX]＝5’-甲氧基膦酸酯-4-氧基修饰的核苷酸，并且ademA-GalNAc＝附接至腺嘌呤核苷酸的GalNAc，并且ademG-GalNAc＝附接至鸟嘌呤核苷酸的GalNAc。
在一些实施方案中，寡核苷酸的有义链和反义链包含选自以下的核苷酸序列：
(a)分别为SEQ ID No：33和34；
(b)分别为SEQ ID No：35和36；
(c)分别为SEQ ID No：37和38；
(d)分别为SEQ ID No：39和40；
(e)分别为SEQ ID No：41和42；
(f)分别为SEQ ID No：43和44；
(g)分别为SEQ ID No：45和46；
(h)分别为SEQ ID No：47和48；
(i)分别为SEQ ID No：49和50；
(j)分别为SEQ ID No：51和52；
(k)分别为SEQ ID No：53和54；
(l)分别为SEQ ID No：55和56；
(m)分别为SEQ ID No：57和58；
(n)分别为SEQ ID No：59和60；
(o)分别为SEQ ID No：61和62；
(p)分别为SEQ ID No：63和64；
(q)分别为SEQ ID No：65和66；
(r)分别为SEQ ID No：67和68；
(s)分别为SEQ ID No：69和70；
(t)分别为SEQ ID No：71和72；
(u)分别为SEQ ID No：73和74；
(v)分别为SEQ ID No：75和76；
(w)分别为SEQ ID No：77和78；
(x)分别为SEQ ID No：79和80；
(y)分别为SEQ ID No：81和82；
(z)分别为SEQ ID No：83和84；
(aa)分别为SEQ ID No：85和86；
(bb)分别为SEQ ID No：87和88；
(cc)分别为SEQ ID No：89和90；
(dd)分别为SEQ ID No：91和92；
(ee)分别为SEQ ID No：93和94；
(ff)分别为SEQ ID No：95和96；
(gg)分别为SEQ ID No：97和98；
(hh)分别为SEQ ID No：99和100；
(ii)分别为SEQ ID No：101和102；以及，
(jj)分别为SEQ ID No：103和104。
在一些实施方案中，本公开提供了包含有义链和反义链的寡核苷酸，该有义链包含SEQ ID NO：103的核苷酸序列并且该反义链包含SEQ ID NO：104的核苷酸序列。
在一些实施方案中，本公开提供了包含有义链和反义链的寡核苷酸(例如，RNAi寡核苷酸)，该有义链包含SEQ ID NO：103的核苷酸序列，该反义链包含SEQ ID NO：104的核苷酸序列，其中所述寡核苷酸是具有以下结构的缀合物的形式：
/>
制剂
已经开发了多种用于寡核苷酸用途的制剂(例如，药物制剂)。例如，可以使用使降解最小化、促进递送和/或摄取、或为制剂中的寡核苷酸提供另一种有益性质的制剂将寡核苷酸(例如，RNAi寡核苷酸)递送至受试者或细胞环境。在一些实施方案中，本文提供了包含降低α-1抗胰蛋白酶表达的寡核苷酸(例如，RNAi寡核苷酸)的组合物。可以适当地配制这样的组合物，使得当施用于受试者时，无论是施用到靶细胞的直接环境中还是全身施用，都有足够部分的寡核苷酸进入细胞以降低α-1抗胰蛋白酶表达。如本文所公开的，可以使用任何种类的合适的寡核苷酸制剂来递送寡核苷酸以减少α-1抗胰蛋白酶。在一些实施方案中，将寡核苷酸配制在缓冲溶液如磷酸盐缓冲盐溶液、脂质体、胶束结构和壳体中。本文所述的任何寡核苷酸不仅可以作为核酸提供，而且还可以以药学上可接受的盐的形式提供。
具有阳离子脂质的寡核苷酸制剂可用来促进寡核苷酸向细胞中的转染。例如，可以使用阳离子脂质，如lipofectin、阳离子甘油衍生物和聚阳离子分子(例如，聚赖氨酸)。合适的脂质包括Oligofectamine、Lipofectamine(Life Technologies)、NC388(RibozymePharmaceuticals，Inc.，Boulder，Colo.)或FuGene 6(Roche)，所有这些都可以根据制造商的说明来使用。
因此，在一些实施方案中，制剂包含脂质纳米颗粒。在一些实施方案中，辅料包含脂质体、脂质、脂质复合物、微球、微粒、纳米球或纳米颗粒，或者可以以其他方式配制以供施用至有需要的受试者的细胞、组织、器官或身体(参见，例如，Remington：THE SCIENCEAND PRACTICE OF PHARMACY，第22版，Pharmaceutical Press，2013)。
在一些实施方案中，本文的制剂包含辅料。在一些实施方案中，辅料为组合物赋予活性成分的改善的稳定性、改善的吸收、改善的溶解度和/或治疗增强。在一些实施方案中，辅料是缓冲剂(例如，柠檬酸钠、磷酸钠、tris碱或氢氧化钠)或媒介物(例如，缓冲溶液、凡士林、二甲基亚砜或矿物油)。在一些实施方案中，将寡核苷酸冻干以延长其保质期，然后在使用(例如，施用至受试者)前制成溶液。因此，包含任一种本文所述寡核苷酸的组合物中的辅料可以是冻干保护剂(例如，甘露醇、乳糖、聚乙二醇或聚乙烯吡咯烷酮)或塌陷温度调节剂(例如，葡聚糖、FicollTM或明胶)。
在一些实施方案中，将药物组合物配制为与其预期的给药途径兼容。给药途径的实例包括肠胃外(例如，静脉内、肌肉内、腹膜内、皮内、皮下)、口服(例如，吸入)、经皮(例如，局部)、经粘膜和直肠给药。
适合注射使用的药物组合物包括无菌水溶液(当水溶性时)或分散体以及用于即时制备无菌注射溶液或分散体的无菌粉末。对于静脉内给药，合适的载剂包括生理盐水、抑菌水、Cremophor ELTM(BASF，Parsippany，N.J.)或磷酸盐缓冲盐水(PBS)。载剂可以是溶剂或分散介质，其含有例如水、乙醇、多元醇(例如，甘油、丙二醇和液体聚乙二醇等)及其合适的混合物。在许多情况下，优选地在组合物中包含等渗剂，例如糖、多元醇如甘露醇、山梨醇、氯化钠。无菌注射溶液可以如下制备：根据需要将所需量的寡核苷酸与上文列举的成分中的一种或其组合引入所选溶剂中，随后过滤除菌。
在一些实施方案中，组合物可含有至少约0.1％或更多的治疗剂(例如，用于降低α-1抗胰蛋白酶表达的RNAi寡核苷酸)，尽管活性成分的百分比可在总组合物的重量或体积的约1％至约80％之间或更多。制备此类药物制剂的本领域技术人员将考虑诸如溶解度、生物利用度、生物半衰期、给药途径、产品保质期以及其他药理学考虑因素等因素，并且因此，多种剂量和治疗方案可能是可取的。
使用方法
降低α-1抗胰蛋白酶表达
在一些实施方案中，本公开提供了用于使细胞或细胞群体接触或向其递送有效量的本文提供的寡核苷酸(例如，RNAi寡核苷酸)以降低α-1抗胰蛋白酶表达的方法。在一些实施方案中，通过测量细胞中α-1抗胰蛋白酶mRNA、α-1抗胰蛋白酶蛋白或α-1抗胰蛋白酶活性的量或水平的降低来确定α-1抗胰蛋白酶表达的降低。这些方法包括本文描述的和本领域普通技术人员已知的那些方法。
本文提供的方法可用于任何合适的细胞类型。在一些实施方案中，细胞是表达α-1抗胰蛋白酶mRNA的任何细胞(例如，肝细胞)。在一些实施方案中，细胞是从受试者获得的原代细胞。在一些实施方案中，该原代细胞已经历有限次数的传代，使得该细胞基本上保持其天然表型性质。在一些实施方案中，寡核苷酸所递送至的细胞是离体或体外的(即，可以被递送至培养中的细胞或细胞所在的生物体)。
在一些实施方案中，使用本领域已知的核酸递送方法向细胞或细胞群体递送本文的寡核苷酸(例如，RNAi寡核苷酸)，所述方法包括但不限于注射含有寡核苷酸的溶液，用被寡核苷酸覆盖的颗粒轰击，将细胞或细胞群体暴露于含有寡核苷酸的溶液，或在寡核苷酸的存在下对细胞膜进行电穿孔。可以使用本领域已知的用于将寡核苷酸递送至细胞的其他方法，例如脂质介导的载体转运、化学介导的转运和阳离子脂质体转染如磷酸钙等。
在一些实施方案中，α-1抗胰蛋白酶表达的降低通过评价与α-1抗胰蛋白酶表达相关的细胞或细胞群体的一种或多种分子、性质或特性的测定或技术来确定，或者通过评价直接指示细胞或细胞群体中的α-1抗胰蛋白酶表达的分子(例如，α-1抗胰蛋白酶mRNA或α-1抗胰蛋白酶蛋白)的测定或技术来确定。在一些实施方案中，通过将与寡核苷酸接触的细胞或细胞群体中的α-1抗胰蛋白酶表达与适当对照(例如，未与该寡核苷酸接触或与对照寡核苷酸接触的适当细胞或细胞群体)进行比较来评价本文提供的寡核苷酸降低α-1抗胰蛋白酶表达的程度。在一些实施方案中，预先确定对照细胞或细胞群体中α-1抗胰蛋白酶表达的对照量或水平，使得不需要在每次进行该测定或技术时都测量对照量或水平。预先确定的水平或值可以采取多种形式。在一些实施方案中，预先确定的水平或值可以是单个截断值，如中值或平均值。
在一些实施方案中，使本文所述的寡核苷酸(例如，RNAi寡核苷酸)接触或递送至细胞或细胞群体导致未与该寡核苷酸接触或与对照寡核苷酸接触的细胞或细胞群体中的α-1抗胰蛋白酶表达降低。在一些实施方案中，α-1抗胰蛋白酶表达的降低是相对于α-1抗胰蛋白酶表达的对照量或水平约1％或更低、约5％或更低、约10％或更低、约15％或更低、约20％或更低、约25％或更低、约30％或更低、约35％或更低、约40％或更低、约45％或更低、约50％或更低、约55％或更低、约60％或更低、约70％或更低、约80％或更低或者约90％或更低。在一些实施方案中，α-1抗胰蛋白酶表达的对照量或水平是尚未与本文的寡核苷酸接触的细胞或细胞群体中α-1抗胰蛋白酶mRNA和/或α-1抗胰蛋白酶蛋白的量或水平。在一些实施方案中，在任何有限的时间段或时间量(例如，分钟、小时、天、周、月)之后评估根据本文的方法将本文的寡核苷酸递送至细胞或细胞群体的效果。例如，在一些实施方案中，在使寡核苷酸接触或递送至细胞或细胞群体后至少约4小时、约8小时、约12小时、约18小时、约24小时；或至少约1天、约2天、约3天、约4天、约5天、约6天、约7天、约8天、约9天、约10天、约11天、约12天、约13天、约14天、约21天、约28天、约35天、约42天、约49天、约56天、约63天、约70天、约77天或约84天或更长时间，在细胞或细胞群体中测定α-1抗胰蛋白酶表达。在一些实施方案中，在使寡核苷酸接触或递送至细胞或细胞群体后至少约1个月、约2个月、约3个月、约4个月、约5个月或约6个月或更长时间，在细胞或细胞群体中测定α-1抗胰蛋白酶表达。
在一些实施方案中，本文提供的寡核苷酸(例如，RNAi寡核苷酸)以转基因的形式递送，该转基因被工程改造为在细胞中表达该寡核苷酸或构成该寡核苷酸的链(例如，其有义链和反义链)。在一些实施方案中，使用被工程改造为表达本文公开的任何寡核苷酸的转基因来递送本文的寡核苷酸。转基因可以使用病毒载体(例如，腺病毒、逆转录病毒、痘苗病毒、痘病毒、腺相关病毒或单纯疱疹病毒)或非病毒载体(例如，质粒或合成mRNA)来递送。在一些实施方案中，转基因可以直接注射至受试者。
治疗方法
本公开提供了用作药物、供治疗与α-1抗胰蛋白酶表达相关的疾病、病症和状况的方法中使用的寡核苷酸(例如，RNAi寡核苷酸)。本公开还提供了用于或适合用于治疗将会受益于降低α-1抗胰蛋白酶表达的受试者(例如，患有与α-1抗胰蛋白酶表达相关的疾病、病症或状况的人)的寡核苷酸。在一些方面，本公开提供了用于或适合用于治疗患有与α-1抗胰蛋白酶表达相关的疾病、病症或状况的受试者的寡核苷酸。本公开还提供了用于或适合用于制备治疗与α-1抗胰蛋白酶表达相关的疾病、病症或状况的药物或药物组合物的寡核苷酸。在一些实施方案中，供使用或适合使用的寡核苷酸靶向α-1抗胰蛋白酶mRNA并降低α-1抗胰蛋白酶表达(例如，经由RNAi途径)。在一些实施方案中，供使用或适合使用的寡核苷酸靶向α-1抗胰蛋白酶mRNA并降低α-1抗胰蛋白酶mRNA、α-1抗胰蛋白酶蛋白和/或α-1抗胰蛋白酶活性的量或水平。
另外，在本文方法的一些实施方案中，选择患有或易患与α-1抗胰蛋白酶表达相关的疾病、病症或状况的受试者来用本文提供的寡核苷酸(例如，RNAi寡核苷酸)进行治疗。在一些实施方案中，所述方法包括选择具有与α-1抗胰蛋白酶表达相关的疾病、病症或状况的标志物(例如，生物标志物)或容易具有该标志物(例如，但不限于，α-1抗胰蛋白酶mRNA、α-1抗胰蛋白酶蛋白或其组合)的个体。同样地，并且如下文所详述的，本公开提供的方法的一些实施方案包括诸如以下的步骤：测量或获得α-1抗胰蛋白酶表达的标志物(例如，α-1抗胰蛋白酶mRNA)的基线值，然后将这样获得的值与一个或多个其他基线值或在向受试者施用寡核苷酸后获得的值进行比较，以评估治疗的有效性。
本公开还提供了用本文提供的寡核苷酸治疗患有、疑似患有或有风险发展为与α-1抗胰蛋白酶表达相关的疾病、病症或状况的受试者的方法。在一些方面，本公开提供了使用本文的寡核苷酸治疗或减弱与α-1抗胰蛋白酶表达相关的疾病、病症或状况的发作或进展的方法。在其他方面，本公开提供了使用本文提供的寡核苷酸在患有与α-1抗胰蛋白酶表达相关的疾病、病症或状况的受试者中实现一种或多种治疗益处的方法。在本文方法的一些实施方案中，通过施用治疗有效量的任意一种或多种本文提供的寡核苷酸来治疗受试者。在一些实施方案中，治疗包括降低α-1抗胰蛋白酶表达。在一些实施方案中，对受试者进行治疗性治疗。在一些实施方案中，对受试者进行预防性治疗。
在一些实施方案中，患有与α-1抗胰蛋白酶表达相关的疾病、病症或状况的患者包含至少一个突变等位基因。突变等位基因是遗传的，因此患者可具有一个或两个拷贝的编码α-1抗胰蛋白酶的突变等位基因。M基因/等位基因是α-1抗胰蛋白酶基因最常见的等位基因，并且它产生正常水平的α-1抗胰蛋白酶蛋白。Z基因/等位基因是该基因最常见的变体，并且导致α-1抗胰蛋白酶缺乏。在一些实施方案中，Z等位基因是由于E342K突变的存在。S基因/等位基因是另一种不太常见的变体，其导致α-1抗胰蛋白酶缺乏。在一些实施方案中，S等位基因是由于E264V突变的存在。
在一些实施方案中，与α-1抗胰蛋白酶表达相关的疾病、病症或状况是由于一个拷贝的Z等位基因和一个拷贝的M等位基因的存在(即，Z等位基因杂合子，称为PiMZ患者)。在一些实施方案中，与α-1抗胰蛋白酶表达相关的疾病、病症或状况是由于两个拷贝的Z等位基因的存在(即，Z等位基因纯合的，称为PiZZ患者)。在一些实施方案中，与α-1抗胰蛋白酶表达相关的疾病、病症或状况是由于一个拷贝的S等位基因和一个拷贝的M等位基因的存在(即，S等位基因杂合子，称为PiSZ患者)。
在本文方法的一些实施方案中，将本文的一种或多种寡核苷酸(例如，RNAi寡核苷酸)或包含一种或多种寡核苷酸的药物组合物施用至患有与α-1抗胰蛋白酶表达相关的疾病、病症或状况的受试者，使得该受试者中的α-1抗胰蛋白酶表达降低，从而治疗该受试者。在一些实施方案中，受试者中α-1抗胰蛋白酶mRNA的量或水平降低。在一些实施方案中，受试者中α-1抗胰蛋白酶蛋白的量或水平降低。在一些实施方案中，受试者中α-1抗胰蛋白酶活性的量或水平降低。
在本文方法的一些实施方案中，将本文提供的寡核苷酸(例如，RNAi寡核苷酸)或包含该寡核苷酸的药物组合物施用至患有与α-1抗胰蛋白酶相关的疾病、病症或状况的受试者，使得与施用一种或多种寡核苷酸或药物组合物之前的α-1抗胰蛋白酶表达相比，该受试者中的α-1抗胰蛋白酶表达降低至少约30％、约35％、约40％、约45％、约50％、约55％、约60％、约65％、约70％、约75％、约80％、约85％、约90％、约95％、约99％或超过99％。在一些实施方案中，与未接受所述一种或多种寡核苷酸或药物组合物或接受一种或多种对照寡核苷酸、药物组合物或治疗的受试者(例如，参考或对照受试者)中的α-1抗胰蛋白酶表达相比，该受试者中的α-1抗胰蛋白酶表达降低至少约30％、约35％、约40％、约45％、约50％、约55％、约60％、约65％、约70％、约75％、约80％、约85％、约90％、约95％、约99％或超过99％。
在本文方法的一些实施方案中，将本文的一种或多种寡核苷酸(例如，RNAi寡核苷酸)或包含该一种或多种寡核苷酸的药物组合物施用至患有与α-1抗胰蛋白酶表达相关的疾病、病症或状况的受试者，使得与施用该寡核苷酸或药物组合物之前的α-1抗胰蛋白酶mRNA的量或水平相比，该受试者中α-1抗胰蛋白酶mRNA的量或水平降低至少约30％、约35％、约40％、约45％、约50％、约55％、约60％、约65％、约70％、约75％、约80％、约85％、约90％、约95％、约99％或超过99％。在一些实施方案中，与未接受所述一种或多种寡核苷酸或药物组合物或接受一种或多种对照寡核苷酸、药物组合物或治疗的受试者(例如，参考或对照受试者)中α-1抗胰蛋白酶mRNA的量或水平相比，该受试者中α-1抗胰蛋白酶mRNA的量或水平降低至少约30％、约35％、约40％、约45％、约50％、约55％、约60％、约65％、约70％、约75％、约80％、约85％、约90％、约95％、约99％或超过99％。
在本文方法的一些实施方案中，将本文的一种或多种寡核苷酸或包含该一种或多种寡核苷酸的药物组合物施用至患有与α-1抗胰蛋白酶表达相关的疾病、病症或状况的受试者，使得与施用该寡核苷酸或药物组合物之前的α-1抗胰蛋白酶蛋白的量或水平相比，该受试者中α-1抗胰蛋白酶蛋白的量或水平降低至少约30％、约35％、约40％、约45％、约50％、约55％、约60％、约65％、约70％、约75％、约80％、约85％、约90％、约95％、约99％或超过99％。在一些实施方案中，与未接受所述一种或多种寡核苷酸或药物组合物或接受一种或多种对照寡核苷酸或药物组合物或治疗的受试者(例如，参考或对照受试者)中α-1抗胰蛋白酶蛋白的量或水平相比，该受试者中α-1抗胰蛋白酶蛋白的量或水平降低至少约30％、约35％、约40％、约45％、约50％、约55％、约60％、约65％、约70％、约75％、约80％、约85％、约90％、约95％、约99％或超过99％。
在本文方法的一些实施方案中，将本文的一种或多种寡核苷酸(例如，RNAi寡核苷酸)或包含该一种或多种寡核苷酸的药物组合物施用至患有与α-1抗胰蛋白酶相关的疾病、病症或状况的受试者，使得与施用该寡核苷酸或药物组合物之前的α-1抗胰蛋白酶活性的量或水平相比，该受试者中α-1抗胰蛋白酶基因活性/表达的量或水平降低至少约30％、约35％、约40％、约45％、约50％、约55％、约60％、约65％、约70％、约75％、约80％、约85％、约90％、约95％、约99％或超过99％。在一些实施方案中，与未接受所述寡核苷酸或药物组合物或接受对照寡核苷酸、药物组合物或治疗的受试者(例如，参考或对照受试者)中α-1抗胰蛋白酶活性的量或水平相比，该受试者中α-1抗胰蛋白酶活性的量或水平降低至少约30％、约35％、约40％、约45％、约50％、约55％、约60％、约65％、约70％、约75％、约80％、约85％、约90％、约95％、约99％或超过99％。
在本文方法的一些实施方案中，将一种或多种本文的寡核苷酸(例如，RNAi寡核苷酸)或包含该一种或多种寡核苷酸的药物组合物施用至患有与α-1抗胰蛋白酶相关的疾病、病症或状况的受试者，使得与施用前的天冬氨酸氨基转移酶(AST)水平相比，AST水平降低。在本文方法的一些实施方案中，将一种或多种本文的寡核苷酸(例如，RNAi寡核苷酸)或包含该一种或多种寡核苷酸的药物组合物施用至患有与α-1抗胰蛋白酶相关的疾病、病症或状况的受试者，使得与施用前的丙氨酸氨基转移酶(ALT)水平相比，ALT水平降低。在本文方法的一些实施方案中，将一种或多种本文的寡核苷酸(例如，RNAi寡核苷酸)或包含该一种或多种寡核苷酸的药物组合物施用至患有与α-1抗胰蛋白酶相关的疾病、病症或状况的受试者，使得与施用前的碱性磷酸酶水平相比，碱性磷酸酶水平降低。
用于测定受试者中或来自受试者的样品中的α-1抗胰蛋白酶表达、α-1抗胰蛋白酶mRNA、α-1抗胰蛋白酶蛋白、α-1抗胰蛋白酶活性或与α-1抗胰蛋白酶表达调节相关或受α-1抗胰蛋白酶表达调节影响的生物标志物(例如，血浆生物标志物)的量或水平的合适方法是本领域已知的。此外，本文呈现的实施例说明了用于测定α-1抗胰蛋白酶表达的方法。
在一些实施方案中，在从受试者获得或分离的细胞(例如，肝细胞)、细胞群体或一组细胞(例如，类器官)、器官(例如，肝脏)、血液或其成分(例如，血浆)、组织(例如，肝组织)、样品(例如，肝脏活检样品)或任何其他适当的生物材料中，α-1抗胰蛋白酶表达、α-1抗胰蛋白酶mRNA、α-1抗胰蛋白酶蛋白、α-1抗胰蛋白酶活性或与α-1抗胰蛋白酶表达调节相关或受α-1抗胰蛋白酶表达调节影响的生物标志物的量或水平或其任何组合降低。在一些实施方案中，在多于一种类型的细胞(例如，肝细胞和一种或多种其他类型的细胞)、多于一组细胞、多于一种器官(例如，肝脏和一种或多种其他器官)、多于一种血液成分(例如，血浆和一种或多种其他血液成分)、多于一种类型的组织(例如，肝脏组织和一种或多种其他类型的组织)或多于一种类型的样品(例如，肝脏活检样品和一种或多种其他类型的活检样品)中，α-1抗胰蛋白酶表达、α-1抗胰蛋白酶mRNA、α-1抗胰蛋白酶蛋白、α-1抗胰蛋白酶活性或与α-1抗胰蛋白酶表达调节相关或受α-1抗胰蛋白酶表达调节影响的生物标志物的量或水平或其任何组合降低。
由于其高特异性，本文提供的寡核苷酸(例如，dsRNAi寡核苷酸)特异性地靶向细胞和组织或器官(例如，肝脏)的靶基因的mRNA(例如，α-1抗胰蛋白酶mRNA)。在预防疾病时，靶基因可以是疾病开始或维持所需的基因，或者已被鉴定为与患上该疾病的较高风险相关的基因。在治疗疾病时，可以使寡核苷酸与表现出或负责介导疾病的细胞、组织或器官(例如，肝脏)接触。例如，同与α-1抗胰蛋白酶表达相关病症或状况相关的野生型(即，天然)或突变基因的全部或部分基本相同的寡核苷酸(例如，RNAi寡核苷酸)可以接触或引入感兴趣的细胞或组织类型，如肝细胞或其他肝脏细胞。
在一些实施方案中，靶基因可以是来自任何哺乳动物的靶基因，如人靶标。任何靶基因可以按照本文所述的方法进行沉默。
本文所述的方法通常涉及向受试者施用有效量的本文寡核苷酸(例如，RNAi寡核苷酸)，即产生或生成期望的治疗结果的量。治疗上可接受的量可以是治疗性地治疗疾病或病症的量。针对任一受试者的适当剂量将取决于某些因素，包括受试者的体型、体表面积、年龄、待施用的组合物、组合物中的活性成分、施用时间和途径、一般健康状况以及同时施用的其他药物。
在一些实施方案中，经肠(例如，口服、通过胃饲管、通过十二指肠饲管、经由胃造口术或经直肠)、肠胃外(例如，皮下注射、静脉内注射或输注、动脉内注射或输注、骨内输注、肌肉内注射、脑内注射、脑室内注射、鞘内)、局部(例如，表皮、吸入、通过滴眼剂或通过粘膜)或通过直接注射到靶器官(例如，受试者的肝脏)中向受试者施用本文的任一种组合物(例如，包含本文所述的RNAi寡核苷酸的组合物)。通常，本文的寡核苷酸经静脉内或皮下施用。
在一些实施方案中，本文的寡核苷酸(例如，RNAi寡核苷酸)或包含该寡核苷酸的药物组合物单独或联合施用。在一些实施方案中，本文的寡核苷酸同时、依次(以任何顺序)或间歇地联合施用。例如，两种寡核苷酸可以同时共同施用。或者，可以施用一种寡核苷酸，并在任意时间长度(例如，一小时、一天、一周或一个月)后施用第二寡核苷酸。
在一些实施方案中，待治疗的受试者是人类或非人灵长类动物或其他哺乳动物受试者。其他示例性受试者包括家养动物，如狗和猫；家畜，如马、牛、猪、绵羊、山羊和鸡；以及诸如小鼠、大鼠、豚鼠和仓鼠等动物。
试剂盒
在一些实施方案中，本公开提供了包含本文的寡核苷酸(例如，RNAi寡核苷酸)和使用说明书的试剂盒。在一些实施方案中，该试剂盒包含本文的寡核苷酸，以及包含该试剂盒和/或其任何组分的使用说明的包装插页。在一些实施方案中，该试剂盒在合适的容器中包含本文的寡核苷酸、一种或多种对照，以及各种缓冲液、试剂、酶和本领域公知的其他标准成分。在一些实施方案中，该容器包含至少一个小瓶、孔、试管、烧瓶、瓶子、注射器或其他容器装置，所述寡核苷酸放置于其中，并且在一些情况下，适当地等分。在提供附加组分的一些实施方案中，该试剂盒包含放置该组分的附加容器。试剂盒还可包括用于容纳寡核苷酸的装置，以及为了商业销售而严密限制的任何其他试剂。这样的容器可以包括其中保留有所需小瓶的注塑或吹塑的塑料容器。这些容器和/或试剂盒可以包括带有使用说明和/或警告的标签。
在一些实施方案中，试剂盒包含本文的寡核苷酸(例如，RNAi寡核苷酸)，以及药学上可接受的载剂，或包含该寡核苷酸的药物组合物以及关于治疗有需要的受试者中与α-1抗胰蛋白酶表达相关的疾病、病症或状况或延迟其进展的说明书。
定义
如本文所用的，术语“反义寡核苷酸”涵盖基于核酸的分子，其具有与全部或部分靶mRNA互补的序列，特别是种子序列，从而能够与mRNA形成双链体。因此，如本文所用的，术语“反义寡核苷酸”可被称为“基于互补核酸的抑制剂”。
如本文所用的，“大约”或“约”当应用于一个或多个感兴趣的值时，是指与规定的参考值类似的值。在一些实施方案中，“约”是指落入规定参考值在任一方向上(大于或小于)的25％、20％、19％、18％、17％、16％、15％、14％、13％、12％、11％、10％、9％、8％、7％、6％、5％、4％、3％、2％、1％或更少之内的值范围，除非另有说明或从上下文中可以明显看出(该数字超过可能值的100％的情况除外)。
如本文所用的，“施用”、“给药”及类似用语是指以药理学上有用(例如，治疗受试者的疾病、病症或状况)的方式向受试者提供物质(例如，寡核苷酸)。
如本文所用的，“减弱”、“减轻”及类似用语是指降低或有效阻止。作为非限制性实例，本文的一种或多种治疗可以降低或有效阻止肝病和/或肺病的发作或进展。肝病包括但不限于慢性肝病、肝脏炎症、肝硬化、肝纤维化和/或肝细胞癌，而肺病包括但不限于受试者的哮喘、支气管扩张、呼吸衰竭、血管炎、肺部炎症、慢性阻塞性肺病(COPD)、肺气肿。这种减弱可以通过以下事实来例证：例如，慢性肝病、肝脏炎症、肝硬化、肝纤维化、肝细胞癌、肺部炎症、慢性阻塞性肺病(COPD)和/或肺气肿的一个或多个方面(例如，症状、组织特征，以及细胞活性、炎症活性或免疫活性，等等)降低，慢性肝病、肝脏炎症、肝硬化、肝纤维化、肝细胞癌、肺部炎症、慢性阻塞性肺病(COPD)和/或肺气肿的一个或多个方面没有可检测到的进展(恶化)，或者在受试者中没有可检测到的慢性肝病、肝脏炎症、肝硬化、肝纤维化、肝细胞癌、肺部炎症、慢性阻塞性肺病(COPD)和/或肺气肿的方面(而这些方面本来预期是可检测到的)。
如本文所用的，“互补”是指两个核苷酸之间(例如，在两个相对的核酸上或在单条核酸链的相对区域上)的结构关系，其允许这两个核苷酸彼此形成碱基对。例如，与相对核酸的嘧啶核苷酸互补的一个核酸的嘌呤核苷酸可以通过彼此形成氢键而碱基配对在一起。在一些实施方案中，互补的核苷酸可以以Watson-Crick方式或以允许形成稳定双链体的任何其他方式碱基配对。在一些实施方案中，两个核酸可具有彼此互补的多个核苷酸的区域以形成互补区域，如本文所述。
如本文所用的，“脱氧核糖核苷酸”是指与核糖核苷酸相比，在其戊糖的2’位置处具有氢而不是羟基的核苷酸。经修饰的脱氧核糖核苷酸是具有除2’位置以外的原子的一个或多个修饰或取代的脱氧核糖核苷酸，包括糖、磷酸基团或碱基的修饰或取代，或者它们之中的修饰或取代。
如本文所用的，“双链寡核苷酸”或“ds寡核苷酸”是指基本上呈双链体形式的寡核苷酸。在一些实施方案中，双链寡核苷酸的双链体区域的互补碱基配对在共价分离的核酸链的反向平行核苷酸序列之间形成。在一些实施方案中，双链寡核苷酸的双链体区域的互补碱基配对在共价连接的核酸链的反向平行核苷酸序列之间形成。在一些实施方案中，双链寡核苷酸的双链体区域的互补碱基配对由折叠(例如，通过发夹)的单核酸链形成，以提供碱基配对在一起的互补反向平行核苷酸序列。在一些实施方案中，双链寡核苷酸包含彼此完全形成双链体的两条共价分离的核酸链。然而，在一些实施方案中，双链寡核苷酸包含部分形成双链体的两条共价分离的核酸链(例如，在一端或两端具有突出端)。在一些实施方案中，双链寡核苷酸包含部分互补的反向平行核苷酸序列，因此可以具有一个或多个错配，其可以包括内部错配或末端错配。
如本文所用的，关于核酸(例如，寡核苷酸)的“双链体”是指通过两个反向平行核苷酸序列的互补碱基配对而形成的结构。
如本文所用的，“辅料”是指可包含在组合物中的非治疗剂，例如，用以提供或有助于所需的稠度或稳定效果。
如本文所用的，“肝细胞”是指肝脏实质组织的细胞。这些细胞约占肝脏质量的70％-85％，并产生血清白蛋白、FBN和凝血酶原组的凝血因子(因子3和4除外)。肝细胞谱系细胞的标志物包括但不限于运甲状腺素蛋白(Ttr)、谷氨酰胺合成酶(Glul)、肝细胞核因子1a(Hnf1a)和肝细胞核因子4a(Hnf4a)。成熟肝细胞的标志物可包括但不限于细胞色素P450(Cyp3a11)、延胡索酰乙酰乙酸水解酶(Fah)、葡萄糖6-磷酸(G6p)、白蛋白(Alb)和OC2-2F8。参见，例如，Huch等人(2013)NATURE 494：247-50。
如本文所用的，“肝毒性剂”是指本身对肝脏有毒或可被加工形成对肝脏有毒的代谢物的化学化合物、病毒或其他物质。肝毒性剂可包括但不限于四氯化碳(CCl4)、对乙酰氨基酚(扑热息痛)、氯乙烯、砷、氯仿、非甾体抗炎药(如阿司匹林和保泰松)。
如本文所用的，术语“SERPINA1”或“A1AT”或“α1-抗胰蛋白酶”是指属于丝氨酸蛋白酶抑制剂超家族的蛋白酶抑制剂。除非另有说明，否则术语“SERPINA1”旨在表示所有同工型。“SERPINA1”还可以指编码该蛋白质的基因。它通常被称为血清胰蛋白酶抑制剂。α1-抗胰蛋白酶也称为α-1蛋白酶抑制剂(A1PI)，因为它抑制种类多样的蛋白酶(Gettins PG.Chem Rev 102：4751-04)。它保护组织免受炎性细胞的酶(尤其是嗜中性粒细胞弹性蛋白酶)的影响，并且在血液中的参考范围为1.5-3.5克/升，但在急性炎症时其水平可升高数倍(Kushner，Mackiewicz，Acute-phase glycoproteins：molecular biology，biochemistry，and clinical applications，(CRC Press).pp.3-19)。如果不存在AAT，嗜中性粒细胞弹性蛋白酶可以自由分解弹性蛋白(弹性蛋白有助于肺的弹性)，从而导致呼吸系统并发症，如肺气肿，或成人的COPD(慢性阻塞性肺病)和成人或儿童的硬化。在AAT基因的一个或两个拷贝中发生突变的个体可能会罹患α-1抗胰蛋白酶缺乏症，由于肺和肝脏中的弹性蛋白酶活性高于正常水平，这会表现为发生肺气肿或慢性肝病的风险。
如上所述，在与α-1抗胰蛋白酶表达相关的某些疾病状态下，个体产生大量的α-1抗胰蛋白酶，但所产生的α-1抗胰蛋白酶蛋白质的很大一部分是错折叠的或包含损害该蛋白质的功能的突变。在某些这样的情况下，个体产生错折叠的蛋白质，这些蛋白质无法正确地从体内合成部位转运到作用部位。
α-1抗胰蛋白酶缺乏导致的肝病可能是由此类错折叠的蛋白质引起的。α-1抗胰蛋白酶的突变形式(例如，常见的PiZ变体，其在位置342(加工前形式中的位置366)处携带谷氨酸到赖氨酸的突变)在肝细胞中产生(肝脏中的肝细胞通常产生大量的循环AAT)，并且在错折叠的构型下，这类形式不容易被转运出细胞。这导致肝脏细胞中错折叠的蛋白质的积累，并且可引起一种或多种肝脏疾病或病症，包括但不限于慢性肝病、肝脏炎症、肝硬化、肝纤维化和/或肝细胞癌。
如本文所用的，“不稳定的连接体”是指可被切割(例如，通过酸性pH)的连接体。“相当稳定的连接体”是指不能被切割的连接体。
如本文所用的，“肝脏炎症”或“肝炎”是指这样的身体状况，其中肝脏变得肿胀、功能障碍和/或疼痛，尤其是由于损伤或感染，如可能由暴露于肝毒性剂而引起。症状可包括黄疸(皮肤或眼睛发黄)、疲劳、虚弱、恶心、呕吐、食欲减退和体重减轻。肝脏炎症如果不治疗，可进展为纤维化、肝硬化、肝功能衰竭或肝癌。
如本文所用的，“肝纤维化”“肝脏纤维化”或“肝脏的纤维化”是指细胞外基质蛋白在肝脏中的过度积累，细胞外基质蛋白可包括由炎症和肝脏细胞死亡产生的胶原蛋白(I、III和IV)、FBN、粗纤维调节素(undulin)、弹性蛋白、层粘连蛋白、透明质酸和蛋白聚糖。肝纤维化如果不治疗，可进展为肝硬化、肝功能衰竭或肝癌。
如本文所用的，“环”是指核酸(例如，寡核苷酸)的未配对区域，其侧翼为该核酸的两个反向平行区域，这两个区域彼此充分互补，使得在适当的杂交条件下(例如，在磷酸盐缓冲液中，在细胞中)，位于未配对区域侧翼的这两个反向平行区域杂交形成双链体(称为“茎”)。
如本文所用的，“代谢综合征”或“代谢性肝病”是指这样的病症，其特征在于一组相关的医学状况和相关的病理学，包括但不限于以下医学状况：腹部肥胖、血压升高、空腹血浆葡萄糖升高、高血清甘油三酯、肝纤维化和低水平的高密度脂蛋白(HDL)水平。如本文所用的，术语代谢综合征或代谢性肝病可涵盖与代谢综合征和代谢性肝病相关的众多直接和间接表现、疾病和病理学，在整个文件中使用状况的扩展列表。
如本文所用的，“经修饰的核苷酸间键合”是指与包含磷酸二酯键的参考核苷酸间键合相比，具有一个或多个化学修饰的核苷酸间键合。在一些实施方案中，经修饰的核苷酸是非天然存在的键合。通常，经修饰的核苷酸间键合赋予其中存在该经修饰的核苷酸间键合的核酸一种或多种期望的性质。例如，经修饰的核苷酸间键合可以改善热稳定性、降解抗性、核酸酶抗性、溶解度、生物利用度、生物活性、降低的免疫原性等。
如本文所用的，“经修饰的核苷酸”是指与选自腺嘌呤核糖核苷酸、鸟嘌呤核糖核苷酸、胞嘧啶核糖核苷酸、尿嘧啶核糖核苷酸、腺嘌呤脱氧核糖核苷酸、鸟嘌呤脱氧核糖核苷酸、胞嘧啶脱氧核糖核苷酸和胸腺嘧啶脱氧核糖核苷酸的相应参考核苷酸相比，具有一个或多个化学修饰的核苷酸。在一些实施方案中，经修饰的核苷酸是非天然存在的核苷酸。在一些实施方案中，经修饰的核苷酸在其糖、核碱基和/或磷酸基团中具有一个或多个化学修饰。在一些实施方案中，经修饰的核苷酸具有与相应的参考核苷酸缀合的一个或多个化学部分。通常，经修饰的核苷酸赋予其中存在该经修饰的核苷酸的核酸一种或多种期望的性质。例如，经修饰的核苷酸可以改善热稳定性、降解抗性、核酸酶抗性、溶解度、生物利用度、生物活性、降低的免疫原性等。
如本文所用的，“带缺口的(nicked)四环结构”是指RNAi寡核苷酸的结构，其特征在于单独的有义(过客)链和反义(指导)链，其中有义链具有与反义链互补的互补区域，并且其中至少一条链，通常是有义链，具有被配置为稳定在该至少一条链内形成的相邻茎区的四环。
如本文所用的，“寡核苷酸”是指短核酸(例如，长度短于约100个核苷酸)。寡核苷酸可以是单链的(ss)或ds。寡核苷酸可以具有或不具有双链体区域。作为一组非限制性实例，寡核苷酸可以是但不限于小干扰RNA(siRNA)、微小RNA(miRNA)、短发夹RNA(shRNA)、切酶底物干扰RNA(DsiRNA)、反义寡核苷酸、短siRNA或ss siRNA。在一些实施方案中，双链(dsRNA)是RNAi寡核苷酸。
如本文所用的，“突出端”是指末端非碱基配对核苷酸，其由一个链或区域延伸超出与该一个链或区域形成双链体的互补链的末端而产生。在一些实施方案中，突出端包含从寡核苷酸的5’末端或3’末端处的双链体区域延伸的一个或多个未配对的核苷酸。在一些实施方案中，突出端是寡核苷酸的反义链或有义链上的3’-或5’-突出端。
如本文所用的，“磷酸酯类似物”是指模拟磷酸酯基团的静电性质和/或空间性质的化学部分。在一些实施方案中，磷酸酯类似物位于寡核苷酸的5’末端核苷酸处，而不是通常容易被酶促去除的5’-磷酸酯。在一些实施方案中，5’磷酸酯类似物含有磷酸酶抗性连接。磷酸酯类似物的实例包括但不限于5’-膦酸酯，如5’-亚甲基膦酸酯(5’-MP)和5’-(E)-乙烯基膦酸酯(5’-VP)。在一些实施方案中，寡核苷酸在5’-末端核苷酸处的糖的4’-碳位置处具有磷酸酯类似物(称为“4’-磷酸酯类似物”)。4’-磷酸酯类似物的实例是氧基甲基膦酸酯，其中氧基甲基的氧原子结合至糖部分(例如，在其4’-碳处)或其类似物。参见，例如，第62/383,207号美国临时专利申请(2016年9月2日提交)和第62/393,401号美国临时专利申请(2016年9月12日提交)。已经针对寡核苷酸的5’端开发了其他修饰(参见，例如，第WO2011/133871号国际专利申请；第8,927,513号美国专利；和Prakash等人(2015)NucleicAcids Res.43：2993-3011)。
如本文所用的，基因(例如，α-1抗胰蛋白酶)的“表达降低”是指与适当的参考(例如，参考细胞、细胞群体、样品或受试者)相比，细胞、细胞群体、样品或受试者中RNA转录物(例如，α-1抗胰蛋白酶mRNA)或由该基因编码的蛋白质的量或水平降低，和/或该基因的活性的量或水平降低。例如，与未用本文的寡核苷酸处理的细胞相比，使细胞与该寡核苷酸(例如，包含反义链的寡核苷酸，该反义链具有与包含α-1抗胰蛋白酶mRNA的核苷酸序列互补的核苷酸序列)接触的行为可以导致α-1抗胰蛋白酶mRNA、蛋白质和/或活性的量或水平降低(例如，经由通过RNAi途径对α-1抗胰蛋白酶mRNA的降解)。类似地，并且如本文所用的，“降低表达”是指导致基因(例如，α-1抗胰蛋白酶)的表达降低的行为。
如本文所用的，“α-1抗胰蛋白酶表达的降低”是指与适当的参考(例如，参考细胞、细胞群体、样品或受试者)相比，细胞、细胞群体、样品或受试者中α-1抗胰蛋白酶mRNA、α-1抗胰蛋白酶蛋白和/或α-1抗胰蛋白酶活性的量或水平的降低。
如本文所用的，“互补区域”是指核酸(例如，寡核苷酸)的核苷酸序列，其与反向平行核苷酸序列充分互补，以允许这两个核苷酸序列在适当的杂交条件下(例如，在磷酸盐缓冲液中、在细胞中等)杂交。在一些实施方案中，本文的寡核苷酸包含具有与mRNA靶序列互补的互补区域的靶向序列。
如本文所用的，“核糖核苷酸”是指具有核糖作为其戊糖的核苷酸，其在其2’位置处含有羟基。经修饰的核糖核苷酸是具有除2’位置以外的原子的一个或多个修饰或取代的核糖核苷酸，包括核糖、磷酸基团或碱基的修饰或取代，或者它们之中的修饰或取代。
如本文所用的，“RNAi寡核苷酸”是指(a)具有有义(过客)链和反义(指导)链的双链寡核苷酸，其中反义链或反义链的一部分被Argonaute 2(Ago2)核酸内切酶在靶mRNA(例如，α-1抗胰蛋白酶mRNA)的切割中使用，或者(b)具有单反义链的单链寡核苷酸，其中该反义链(或该反义链的一部分)被Ago2核酸内切酶在靶mRNA(例如，α-1抗胰蛋白酶mRNA)的切割中使用。
如本文所用的，“链”是指通过核苷酸间键合(例如，磷酸二酯键或硫代磷酸酯键)连接在一起的单个、连续的核苷酸序列。在一些实施方案中，链具有两个游离端(例如，5’端和3’端)。
如本文所用的，“受试者”是指任何哺乳动物，包括小鼠、兔和人。在一些实施方案中，受试者是人或NHP。此外，“个体”或“患者”可以与“受试者”互换使用。
如本文所用的，“合成的”是指(例如，使用机器(例如，固态核酸合成仪))人工合成的或另外并非源自通常产生该分子的天然来源(例如，细胞或生物体)的核酸或其他分子。
如本文所用的，“靶向配体”是指这样的分子(例如，碳水化合物、氨基糖、胆固醇、多肽或脂质)：其选择性地结合感兴趣的组织或细胞的同源分子(例如，受体)，并且可与另一种物质缀合以便将该另一种物质靶向至感兴趣的组织或细胞。例如，在一些实施方案中，靶向配体可以与寡核苷酸缀合，以便将该寡核苷酸靶向至特定感兴趣的组织或细胞。在一些实施方案中，靶向配体选择性地结合细胞表面受体。因此，在一些实施方案中，当靶向配体与寡核苷酸缀合时，通过与细胞表面上表达的受体的选择性结合和细胞对包含该寡核苷酸、靶向配体和受体的复合物的内体内化，促进该寡核苷酸向特定细胞中的递送。在一些实施方案中，靶向配体经由连接体与寡核苷酸缀合，该连接体在细胞内化之后或期间被切割，使得该寡核苷酸在细胞中从靶向配体上释放。
如本文所用的，“四环”是指增加通过核苷酸侧翼序列杂交形成的相邻双链体的稳定性的环。稳定性的增加可检测为相邻茎双链体的解链温度(Tm)的增加，该Tm高于由随机选择的核苷酸序列组成的一组相当长度的环平均预期的相邻茎双链体的Tm。例如，四环可以赋予包含长度至少为2个碱基对(bp)的双链体的发夹在10mM Na2HPO4中至少约50℃、至少约55℃、至少约56℃、至少约58℃、至少约60℃、至少约65℃或至少约75℃的Tm。在一些实施方案中，四环可以赋予包含长度至少为2个碱基对(bp)的双链体的发夹在10mM NaH2PO4中至少约50℃、至少约55℃、至少约56℃、至少约58℃、至少约60℃、至少约65℃或至少约75℃的Tm。在一些实施方案中，四环可以通过堆积相互作用稳定相邻茎双链体中的bp。另外，四环中核苷酸之间的相互作用包括但不限于非Watson-Crick碱基配对、堆积相互作用、氢键键合和接触相互作用(Cheong等人(1990)Nature 346：680-82；Heus&Pardi(1991)SCIENCE253：191-94)。在一些实施方案中，四环包含3至6个核苷酸或由3至6个核苷酸组成，并且通常为4至5个核苷酸。在一些实施方案中，四环包含3、4、5或6个核苷酸或由3、4、5或6个核苷酸组成，其可以被修饰或可以未被修饰(例如，其可以与靶向部分缀合或可以不与靶向部分缀合)。在一些实施方案中，四环由4个核苷酸组成。任何核苷酸都可以在四环中使用，并且此类核苷酸的标准IUPAC-IUB符号可以如Cornish-Bowden(1985)NUCLEIC ACIDS RES.13：3021-30中所述使用。例如，字母“N”可以用来表示任何碱基可以在该位置，字母“R”可以用来表示A(腺嘌呤)或G(鸟嘌呤)可以在该位置，而“B”可以用来表示C(胞嘧啶)、G(鸟嘌呤)或T(胸腺嘧啶)可以在该位置。四环的实例包括UNCG家族的四环(例如，UUCG)、GNRA家族的四环(例如，GAAA)和CUUG四环(Woese等人(1990)PROC.NATL.ACAD.SCI.USA 87：8467-71；Antao等人(1991)NUCLEIC ACIDS RES.19：5901-05)。DNA四环的实例包括d(GNNA)家族的四环(例如，d(GTTA))、d(GNRA)家族的四环、d(GNAB)家族的四环、d(CNNG)家族的四环和d(TNCG)家族的四环(例如，d(TTCG))。参见，例如，Nakano等人(2002)BIOCHEM.41：14281-92；Shinji等人(2000)NIPPON KAGAKKAI KOEN YOKOSHU 78：731。在一些实施方案中，四环被包含在带缺口的四环结构内。
如本文所用的，“治疗”或“处理”是指向有需要的受试者提供医护的行为，例如，通过向受试者施用治疗剂(例如，本文的寡核苷酸)，以供改善受试者关于现有状况(例如，疾病、病症)的健康和/或福祉，或者预防或降低发生状况的可能性。在一些实施方案中，治疗涉及降低受试者所经历的状况(例如，疾病、病症)的至少一种体征、症状或促成因素的频率或严重程度。
实施例
实施例1：RNAi寡核苷酸的制备
寡核苷酸合成和纯化
在先前实施例中描述的寡核苷酸(RNAi寡核苷酸)使用本文所述的方法来化学合成。一般而言，除了使用已知的亚磷酰胺合成(参见，例如，Hughes和Ellington(2017)ColdSpring Harb Perspect Biol.9(1)：a023812；以及Beaucage S.L.和Caruthers M.H.，Studies on Nucleotide Chemistry V：Deoxynucleoside Phosphoramidites-A NewClass of Key Intermediates for Deoxypolynucleotide Synthesis，TETRAHEDRONLETT.1981；22：1859-62)之外，还使用针对19-23聚体siRNA描述的固相寡核苷酸合成方法(参见，例如，Scaringe等人(1990)NUCLEIC ACIDS REs..18：5433-41，和Usman等人(1987)J.Am.Chem.Soc.109：7845-45；另见，第5,804,683、5,831,071、5,998,203、6,008,400、6,111,086、6,117,657、6,353,098、6,362,323、6,437,117和6,469,158号美国专利)合成RNAi寡核苷酸。
按照标准方法(Integrated DNA Technologies；Coralville，IA)合成各条RNA链并进行HPLC纯化。例如，使用固相亚磷酰胺化学法合成RNA寡核苷酸，使用标准技术(Damha&Olgivie(1993)METHODS MOL.BIOL.20：81-114；Wincott等人(，1995)NUCLEIC ACIDSRES.23：2677-84)在NAP-5柱(Amersham Pharmacia Biotech；Piscataway，NJ)上脱保护并脱盐。使用离子交换高效液相色谱法(IE-HPLC)在Amersham Source 15Q柱(1.0cm×25cm；Amersham Pharmacia Biotech)上使用15min步进线性梯度纯化寡聚体。梯度从90∶10缓冲液A∶B到52∶48缓冲液A∶B变化，其中缓冲液A为100mM Tris pH 8.5，而缓冲液B为100mMTris pH 8.5，1M NaCl。在260nm处监测样品，并且将对应于全长寡核苷酸种类的峰收集、合并、在NAP-5柱上脱盐并冻干。
在Beckman PACE 5000(Beckman Coulter，Inc.；Fullerton，CA)上通过毛细管电泳(CE)测定每种寡聚体的纯度。CE毛细管的内径为100μm，并含有ssDNA 100R Gel(Beckman-Coulter))。通常，将约0.6nmol的寡核苷酸注入毛细管中，在444V/cm的电场中运行，并根据260nm处的UV吸光度进行检测。变性Tris-硼酸盐-7M-尿素电泳缓冲液购自Beckman-Coulter。获得了寡核糖核苷酸，经CE评估其纯度至少为90％，用于以下描述的实验中。在Voyager DETM Biospectometry Work Station(Applied Biosystems；FosterCity，CA)上，按照制造商推荐的方案，通过基质辅助激光解吸电离飞行时间(MALDI-TOF)质谱法验证化合物身份。获得了所有寡聚体的相对分子质量，通常在预期分子质量的0.2％以内。
双链体的制备
将单链RNA寡聚体重悬(例如，以100μM浓度)于由100mM乙酸钾、30mM HEPES组成的双链体缓冲液(pH 7.5)中。将互补的有义链和反义链以等摩尔量混合，以产生例如50μM双链体的最终溶液。将样品在RNA缓冲液(IDT)中加热至100℃持续5’，并在使用前冷却至室温。RNAi寡核苷酸储存于-20℃。单链RNA寡聚体冻干储存或于-80℃储存在无核酸酶水中。
表1：靶向SERPINA1的DsiRNA(未修饰的)
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使用表1中提供的寡核苷酸序列生成经修饰的寡核苷酸，所述寡核苷酸包含具有36-聚体过客链和22-聚体指导链的带缺口的四环结构。具体而言，表3中提供的SERPINA1RNAi寡核苷酸的过客链和指导链各自包含不同模式的经修饰的核苷酸和硫代磷酸酯键(SEQ ID No：33-102)。经修饰的核苷酸和硫代磷酸酯键的模式如下所示：
模式A(SM1047/ASM1508)
有义链：
[mXs][mX][fX][mX][mX][mX][mX][fX][fX][fX][mX][fX][fX][mX][mX][mX][fX][mX][mX][mA][mG][mC][mA][mG][mC][mC][prgG-peg-GalNAc][prgA-peg-GalNAc][prgA-peg-GalNAc][prgA-peg-GalNAc][mG][mG][mC][mU][mG][mC]
反义链；
[Phosphonate-4O-mUs][fXs][fXs][mX][fX][mX][fX][fX][mX][fX][mX][fX][mX][fX][mX][fX][mX][mX][fX][mXs][mGs][mG]
模式B(SM988/ASM1266)
有义链：
[mXs][mX][fX][mX][fX][mX][mX][fX][fX][fX][fX][mX][fX][mX][fX][mX][fX][mX][mX][mX][mG][mC][mA][mG][mC][mC][prgG-peg-GalNAC][prgA-peg-GalNAc][prgA-peg-GalNAc][prgA-peg-GalNAc][mG][mG][mC][mU][mG][mC]
反义链：
[Phosphonate-4O-mUs][fXs][fXs][mX][fX][mX][fX][mX][mX][fX][mX][mX]
[mX][fX][mX][fX][fX][mX][fX][mXs][mGs][mG]
模式C(SM1218/ASM1508)
有义链：
[mXs][mX][fX][mX][mX][mX][mX][fX][fX][fX][mX][fX][fX][mX][mX][mX][fX][mX[mX][mA][mG][mC][mC][prgG-peg-GalNAc][prgA-peg-GalNAc][prgA-peg-GalNAc][prgA-peg-GalNAc][mG][mG][mC]
反义链：
[Phosphonate-4O-mUs][fXs][fXs][mX][fX][mX][fX][fX][mX][fX][mX][fX][mX][fX][mX][fX][mX][mX][fX][mXs][mGs][mG]
模式D(SM1178/ASM1266)
有义链：
[mXs][mX][fX][mX][fX][mX][mX][fX][fX][fX][fX][mX][fX][mX][fX][mX][fX][mX][mX][mA][mG][mC][mC][prgG-peg-GalNAc][prgA-peg-GalNAc][prgA-peg-GalNAc][prgA-peg-GaINAc][mG][mG][mC]
反义链；
[Phosphonate-4O-mUs][fXs][fXs][mX][fX][mX][fX][mX][mX][fX][mX][mX][mX][fX][mX][fX][fX][mX][fX][mXs][mGs][mG]
模式E(SM1217/ASM1508)
有义链：
[mXs][mX][fX][mX][mX][mX][mX][fX][fX][fX][mX][fX][fX][mX][mX][mX][fX][mX][mX][mX][mG][mC][mA][mG][mC][mC][ademG-GalNAc][ademA-GalNAc][ademA-GalNAc][ademA-GalNAc][mG][mG][mC][mU][mG][mC]
反义链：
[MePhosphonate-4O-mXs][fXs][fXs][mX][fX][mX][fX][fX][mX][fX][mX][fX][mX][fX][mX][fX][mX][mX][fX][mXs][mGs][mG]
模式F(SM1217/ASM1704)
有义链：
[mXs][mX][fX][mX][mX][mX][mX][fX][fX][fX][mX][fX][fX][mX][mX][mX][fX][mX][mX][mX][mG][mC][mA][mG][mC][mC][ademG-GalNAc][ademA-GalNAc][ademA-GalNAc][ademA-GalNAc][mG][mG][mC][mU][mG][mC]
反义链：
[MePhosphonate-4O-mXs][fXs][fXs][mX][fX][mX][fX][mX][mX][mX][mX][fX][mX][fX][mX][fX][mX][mX][fX][mXs][mGs][mG]
表2.修饰关键词
表3：靶向SERPINA1的经修饰的寡核苷酸
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实施例2：RNAi寡核苷酸在体外对A1AT/SERPINA1表达的抑制
开发了与N-乙酰半乳糖胺(GalNAc)缀合的SERPINA1特异性小干扰RNA(siRNA)。SERPINA1 RNAi寡核苷酸使用RNA干扰(RNAi)策略(McManus M.T.和P.A.Sharp.2002.′Genesilencing in mammals by small interfering RNAs′，Nat Rev Genet，3(10)：737-47)来减少患有α-1抗胰蛋白酶缺乏症(A1ATD)的受试者肝脏中的SERPINA1 mRNA和突变α-1抗胰蛋白酶(Z-AAT)蛋白积累。这通过使用与GalNAc缀合的高效siRNA来实现，其在皮下(SC)给药后被肝细胞选择性吸收，以降低肝脏中Z-AAT蛋白的浓度。肝脏中聚集的Z-AAT蛋白的降解受损导致Z-AAT蛋白的毒性积累和A1ATD相关的肝病。通过靶向SERPINA1基因表达直接降低肝脏中Z-AAT蛋白的水平因此具有提供治疗益处的潜力。
本研究的目的是比较靶向人SERPINA1转录物的SERPINA1 RNAi寡核苷酸(具有修饰模式A-D)在体外在人肝癌细胞系HuH-7中的活性。
材料与方法
测试物的制备
表3中描述的SERPINA1 RNAi寡核苷酸通过固相合成来制备，并使用强阴离子交换色谱法(Chemgenes，Wilmington MA)进行纯化。使用电喷雾电离质谱法(ESI MS)确认序列同一性。RNA双链体通过260nm处的UV吸光度进行浓度归一化。
HuH-7细胞的细胞培养和转染
将人肝细胞癌细胞系HuH-7(日本研究生物资源保藏中心JCRB，日本)保持在含有10％FBS(Thermo Fisher Scientific，Waltham，MA)的DMEM(Thermo Fisher Scientific，Waltham，MA)中。将细胞保持在37℃和5％CO2的湿润培养箱中。Lipofectamine RNAi MAX(ThermoFisher Scientific，Waltham，MA)和指定的测试物在OptiMEM(ThermoFisherScientific)中稀释。将稀释的试剂与稀释的测试物(表3)一起混合并在室温下孵育15分钟以形成复合物。将该复合物添加到细胞中并孵育24小时。按照制造商的方案，使用Lipofectamine RNAiMAX(ThermoFisher Scientific)与OptiMEM介质(ThermoFisherScientific)中的3种浓度的指定测试物逆转染HuH-7细胞。测试物的最终浓度为1、0.1和0.01nM。最终细胞浓度为在96孔moat板(ThermoFisher Scientific)中2x104个细胞/孔。
RNA提取和cDNA合成
与转染复合物孵育24小时后，将细胞用1X PBS洗涤一次，然后使用iScript RT-qPCR裂解缓冲液(Bio-Rad，Hercules，CA)裂解。使用高容量cDNA逆转录试剂盒(ThermoFisher Scientific，Waltham，MA)，按照制造商的方案对裂解物中的RNA进行逆转录。
实时qPCR和数据分析
合成的cDNA用于使用iQ Power Mix(Bio-Rad，Hercules，CA)进行定量PCR。引物和探针购自Integrated DNA Technology(Coralville，IA)。qPCR反应在CFX-384系统(Bio-Rad，Hercules，CA)上运行，并使用DDCt法分析数据。基因表达数据相对于模拟转染的样品进行归一化。
结果与结论
多种缀合物在HuH-7细胞中显示出SERPINA1表达的良好敲低(图1)。
实施例3：SERPINA1-1459在小鼠中的药效学功效、剂量响应和持续时间的评价
基于实施例2的结果，选择具有SEQ ID NO：105的有义链和SEQ ID NO：25的反义链的SERPINA1-1459进行进一步的研究。生成具有修饰模式F的SERPINA1-1459(SEQ ID NO：103所示的有义链和SEQ ID NO：104所示的反义链，如图2A所示)。在本实施例和以下实施例中，“SERPINA1-1459”是指这些修饰的序列。具体而言，本研究旨在评价对α-1-抗胰蛋白酶缺乏症(A1ATD)的PiZ小鼠模型(该模型携带突变的人SERPINA1基因并表达人Z-AAT蛋白)进行单次皮下(SC)团注后，修饰的SERPINA1-1459活性的药效学功效、剂量响应和持续时间。
具体而言，表达肝脏人Z-AAT蛋白的雄性PiZ小鼠从使用来自圣路易斯大学J.Teckman博士实验室提供的品系的小鼠建立的繁育集群获得(Carlson等人，Accumulation of PiZ antitrypsin causes liver damage in transgenic mice，(1989年5月)，JOURNAL OF CLINICAL INVESTIGATION 83(4)：1183-90；Rudnick等人，HEPATOLOGY，Vol.39，No.4，2004)。将小鼠(4周龄)保持在无特定病原体的饲养条件下，可以随意获取实验室食物和水。在研究开始时，将雄性PiZ小鼠随机分为研究组(每组n＝5)。
对于1、3或10mg/kg剂量组，将每种测试物在PBS中分别稀释至0.1、0.3或1.0mg/mL的浓度。根据给药当天(第1天)皮下给药前称量的小鼠个体体重计算剂量体积。使用一次性1.0mL注射器将剂量制剂施用至小鼠背部。在研究第1天，小鼠接受0(磷酸盐缓冲盐水[PBS])、1、3或10mg/kg SERPINA1-1459的单次皮下(SC)注射。媒介物对照小鼠以与测试物相同的体积和方法(10mL/kg)施用PBS。
在给药前和整个研究期间(1和3mg/kg剂量组为8周，PBS和10mg/kg剂量组为10周)每周采集血液样品。对照参数来自给药前测量。血液样品从尾静脉采集。96孔v形底板的每个孔预先填充了来自人A1AT SimpleStep ELISA试剂盒(Abcam，Cambridge，MA)的98μL稀释剂NS。将小鼠在加热灯下预热，然后放置在限制器中。在尾静脉中进行小穿刺，并使用20μL单通道移液器取出2μL血液。使用200μL单通道移液器充分混合样品。将样品等分并储存在-80℃。通过酶联免疫吸附测定(ELISA)测量血清样品中的血清Z-AAT浓度——肝脏中的SERPINA1-1459活性的生物标志物。
在测定当天，将血液样品在冰上解冻并在稀释剂NS中进一步稀释(最终稀释度：1∶5,000)。使用用于检测人α1抗胰蛋白酶的市售ELISA试剂盒(Abcam，Cambridge，MA，目录号ab189579)，按照制造商的说明测量50μL稀释血液中的Z-AAT蛋白浓度。通过ELISA一式两份对样品进行分析。SERPINA1-1459治疗后循环Z-AAT蛋白浓度的降低被计算为循环Z-AAT蛋白浓度相对于给药前和时间匹配的PBS Z-AAT蛋白浓度的降低百分比。
SERPINA1-1459(图2A)的施用导致循环Z-AAT蛋白浓度的强劲且剂量相关的降低，对于1mg/kg剂量组，在单次皮下给药后1周有最大降低，如图2B所示。此时，循环Z-AAT蛋白浓度与基线相比的最大降低为2.1倍(降低51％，P≤0.01)。对于3mg/kg和10mg/kg剂量组，循环Z-AAT蛋白浓度的最大降低是在单次皮下给药后2周。此时，3mg/kg和10mg/kg剂量组的循环Z-AAT蛋白浓度与基线相比的最大降低分别为6.6倍(降低85％)和33.3倍(降低97％)(P＜0.0001，两组)。在1、3和10mg/kg剂量组中，Z-AAT蛋白的循环浓度分别在3、7或9周后缓慢恢复到基线浓度。SERPINA1-1459降低小鼠中循环Z-AAT蛋白浓度的半数最大有效剂量(ED50)在PiZ小鼠中估计为1mg/kg(图2C)。因此，在SERPINA1-1459施用后观察到的循环Z-AAT水平的降低在最大响应方面和该响应的持续时间方面均是剂量相关的。
A1ATD患者肝病的进展与肝细胞中Z-AAT的进行性积累有关。SERPINA1-1459具有产生有意义的治疗干预以减缓、阻止或可能逆转PiZZ(重度α1-抗胰蛋白酶缺乏症)患者的肝病进展的潜力。因此，SERPINA1-1459可能代表用于患有肝病的PiZZ患者的挽救生命的治疗干预。
实施例4：用SERPINA1-1459治疗后肝脏人Z-AAT敲低对A1ATD相关肝病表型的功效的评价
为了评价人Z-AAT敲低对A1ATD相关肝病表型的功效，在雄性和雌性PiZ小鼠中评价了SERPINA1-1459的功效(如实施例3中所述)。
具体而言，将小鼠(5-49周龄)保持在无特定病原体的饲养条件下，可以随意获取实验室食物和水。总共44只PiZ小鼠最初分配给该研究。小鼠基因型的最终确认显示，9只小鼠不表达人SERPINA1基因，因此从该研究中剔除。小鼠在22周期间每4周一次共给予六次皮下剂量的3mg/kg SERPINA1-1459(即，第0天的初始剂量，以及第4、8、12、16和20周的剂量)。在5、12和49周龄的雄性和雌性PiZ小鼠中开始给药，研究分别终止于27、34或71周龄。
材料与方法
通过RT-qPCR进行的SERPINA1 mRNA测量
采集终末肝组织用于测量SERPINA1 mRNA敲低以及对A1ATD相关肝病的特征的功效，先前表明这些特征在PiZ小鼠模型中是保守的，包括人Z-AAT蛋白的细胞内保留，这是一种相应的再生刺激，导致细胞增殖增加和进行性肝纤维化(Rudnick等人，HEPATOLOGY，Vol.39，No.4，2004；Marcus等人.Hepatol Res.2010年6月；40(6)：641-653；Tang等人.Am JPhysiol Gastrointest Liver Physiol 311：G156-G165，2016)。采集终末血清样品用于测量包括转氨酶在内的血清化学参数。具体而言，使用Tissuelyser II(Qiagen，Valencia，CA)将大约50mg样品在0.75mL基于苯酚/胍的QIAzol裂解试剂(Qiagen，Valencia，CA)中匀浆。用1-溴-3-氯丙烷(Sigma-Aldrich，St.Louis，MO)萃取匀浆。使用MagMax Technology(ThermoFisher Scientific，Waltham，MA)，按照制造商的说明从0.2mL水相中提取RNA。使用光谱法在260和280纳米处对RNA进行定量。使用来自Integrated DNA Technologies(Coralville，IA)的RT-qPCR引物和探针以及来自ThermoFisher Scientific(Waltham，MA)和BioRad Laboratories(Hercules，CA)的试剂来测量SERPINA1 mRNA水平，并相对于管家基因次黄嘌呤-鸟嘌呤磷酸核糖基转移酶(Hprt)进行归一化。SERPINA1-1459治疗组中SERPINA1 mRNA减少的程度被计算为相对于年龄匹配小鼠的盐水处理对照组的平均表达水平的表达百分比(相对于Hprt归一化)，其中盐水处理的对照组中的SERPIN1 mRNA表达被设定为100％。使用GraphPad Prism(GraphPad Software，La Jolla，CA)生成平均值±标准偏差图并分析数据。进行非配对t检验来比较SERPINA1-1459治疗组相对于年龄匹配小鼠的盐水处理对照组的SERPINA1 mRNA水平(相对于Hprt归一化)。PCR运行两次以供确认。
A1AT ELISA
使用人α1抗胰蛋白酶(SERPINA1)ELISA试剂盒(Abcam，Cambridge，MA)，按照制造商的说明一式两份测量50μL稀释血液样品(全血在来自ELISA试剂盒的测定缓冲液中1∶5,000稀释)中的人Z-AAT蛋白浓度。PiZ小鼠仅表达人Z-AAT蛋白，因此，人特异性抗A1ATELISA是循环人Z-AAT蛋白水平的测量。SERPINA1-1459治疗组中人Z-AAT蛋白浓度的降低对于雄性和雌性独立地被计算为相对于给药前人Z-AAT浓度和相对于年龄匹配对照(盐水处理)组在同一天的平均表达水平的表达百分比，其中对照组中的人Z-AAT蛋白浓度被设定为100％。使用GraphPad Prism(GraphPad Software，La Jolla，CA)生成平均值±标准偏差图并分析数据。进行非配对t检验来比较相同时间点SERPINA1-1459治疗组相对于年龄匹配小鼠的盐水处理对照组的人Z-AAT蛋白水平。
人Z-AAT蛋白的Western印迹
使用TissueLyser II(Qiagen，Valencia，CA)与T-PER组织蛋白提取试剂和蛋白酶抑制剂混合物(ThermoFisher Scientific，Waltham，MA)制备组织裂解物。通过BCA蛋白测定(ThermoFisher Scientific，Waltham，MA)测量总蛋白浓度，并通过NuPAGE 4-12％Bis-Tris SDS-PAGE(ThermoFisher Scientific，Waltham，MA)解析估计的等蛋白浓度。使用iBlot Dry Blotting System(ThermoFisher Scientific，Waltham，MA)将电泳的蛋白质转移到硝酸纤维素膜上，并用Odyssey封闭缓冲液(Li-Cor Biosciences，Lincoln，NE)封闭以防止非特异性结合。然后将膜与兔抗人A1AT抗体(Abcam，Cambridge，MA)和小鼠抗甘油醛3-磷酸脱氢酶抗体(Abcam，Cambridge，MA)一起孵育。使用抗兔IRDye 680和抗小鼠IRDye 800第二抗体(Li-Cor Biosciences，Lincoln，NE)进行检测，并使用Odyssey红外成像系统(Li-Cor Biosciences，Lincoln，NE)测量信号强度。PiZ小鼠仅表达人Z-AAT蛋白，因此，人特异性抗A1AT抗体是人Z-AAT蛋白水平的量度。SERPINA1-1459治疗组中人Z-AAT蛋白减少的程度被计算为相对于年龄匹配小鼠的盐水处理对照组的平均水平的表达百分比，其中盐水处理的对照组中的人Z-AAT水平被设定为100％。使用GraphPad Prism(GraphPad Software，La Jolla，CA)生成平均值±标准偏差图并分析数据。进行非配对t检验来比较SERPINA1-1459治疗组相对于年龄匹配小鼠的盐水处理对照组的人Z-AAT蛋白水平。
免疫组织化学
收集肝组织，在10％中性缓冲的福尔马林中固定过夜，然后转移到70％乙醇中。在Mass Histology Service(Worcester，MA)完成石蜡包埋和玻片准备。按照制造商的说明进行采用淀粉酶消化的过碘酸希夫染色(PAS-D)和天狼星红(Abcam，Cambridge，MA)染色。对于免疫组织化学(IHC)实验，将石蜡切片脱蜡并再水化。对A1AT、人Z-AAT聚合物和Ki67 IHC样品进行热介导的抗原修复(柠檬酸盐缓冲液，pH6.0)。用BLOXALL溶液(VectorLaboratories，Burlingame，CA)封闭内源性过氧化物酶和碱性磷酸酶。将兔单克隆抗A1AT抗体(1∶500稀释，Abcam，Cambridge，MA)、小鼠单克隆抗Z-AAT聚合物2C1抗体(1∶50，HycultBiotech，Wayne，PA)和兔单克隆抗Ki67抗体(1∶100稀释，Abcam，Cambridge，MA)在抗体稀释液(Cell Signaling Technology，Danvers，MA)中稀释，并在4℃下孵育过夜。PiZ小鼠仅表达人Z-AAT蛋白，因此，人特异性抗A1AT抗体是人Z-AAT蛋白水平的量度。使用山羊抗兔IgG HRP抗体(Antibodies-online，Atlanta，GA)或山羊抗小鼠IgGHRP抗体(Abcam，Cambridge，MA)用/>DAB Substrate试剂盒(Cell SignalingTechnology，Danvers，MA)检测第一抗体的结合。使用OlympusBX61VS玻片扫描仪和OlympusVS-ASW图像分析软件对结果进行可视化。
肝酶的分析
将采集的终末血液加工成血清，用于测量血液化学参数。丙氨酸氨基转移酶(ALT)、天冬氨酸氨基转移酶(AST)和碱性磷酸酶水平由IDEXX BioResearch Laboratories(Grafton，MA)测量。使用GraphPad Prism(GraphPad Software，La Jolla，CA)生成平均值±标准偏差图并分析数据。进行非配对t检验来比较SERPINA1-1459治疗组相对于年龄匹配小鼠的盐水处理对照组的ALT、AST或ALP水平。
结果
SERPINA1-1459的重复给药显著降低了PiZ小鼠中的SERPINA1 mRNA表达(如图3所示)。每4周一次共施用6剂SERPINA1-1459显著降低了5周龄(P＜0.0001)和12周龄(P≤0.05)PiZ小鼠中的SERPINA1 mRNA表达。由于每组小鼠数目较少，因此无法计算49周龄PiZ小鼠的统计显著性。
SERPINA1-1459的重复给药显著降低了PiZ小鼠中的循环人Z-AAT蛋白水平(如通过ELISA测量的，图4)。在5、12和49周龄的PiZ小鼠中，单剂量的SERPINA1-1459后，人Z-AAT水平降低，并且每4周一次的额外5剂SERPINA1-1459维持了这种降低。
肝组织样品的Western印迹和IHC证明，在5至27周龄治疗的PiZ小鼠中，SERPINA1-1459的重复给药显著降低了肝脏人Z-AAT蛋白水平。在SERPINA1-1459治疗的小鼠中，通过Western印迹(图5和图6)未检测到人Z-AAT蛋白，并且在肝组织的IHC(图7)中其有效减少。在12和49周龄开始治疗的小鼠中观察到类似的减少，分别在34和71周收集组织(数据未示出)。
用SERPINA1-1459治疗PiZ小鼠减少与A1AT相关的肝脏病理学
在PiZZ患者中，突变人Z-AAT蛋白容易发生错折叠并在肝细胞中以均聚物形式聚集。这种聚集蛋白的降解受损导致一些患有由此引起的A1ATD相关肝病的患者的肝脏中人Z-AAT的毒性积累。使用人Z-AAT聚合物特异性抗体进行的IHC(Tan等人.Int J BiochemCell Biol.2015年1月；58：81-91)证明，从五周龄开始用SERPINA1-1459治疗PiZ小鼠可以有效地减少肝脏中的人Z-AAT聚合物负荷(图8)。
另外，SERPINA1-1459治疗有效地减少了从49周龄开始治疗的PiZ小鼠的肝脏中的高人Z-AAT聚合物负荷(图9)。
正如在人类中所见，PiZ小鼠肝细胞的内质网(ER)中突变人Z-AAT的组织病理学特征是用淀粉酶抗性的高碘酸希夫(PAS-D)染色的细胞内小球(Rudnick等人，HEPATOLOGY，Vol.39，No.4，2004；Perlmutter等人，PEDIATRIC RESEARCH Vol.60，No.2，2006)。从五周龄开始用SERPINA1-1459治疗PiZ小鼠导致对肝小球形成的有效抑制(图10)。
PiZ小鼠肝脏中突变人Z-AAT蛋白的细胞内保留与导致细胞增殖增加的再生刺激相关(Rudnick等人，HEPATOLOGY，Vol.39，No.4，2004)。从五周龄开始用SERPINA1-1459治疗的PiZ小鼠显示出细胞增殖有效减少，如通过与对照处理的小鼠相比，Ki-67的免疫组织化学所评估的(图11)，Ki-67是增殖的细胞标志物。
已证明PiZ小鼠肝脏的慢性损伤与随年龄增长的进行性肝纤维化相关(Brunt等人，J PEDIATR GASTROENTEROL NUTR.2010年11月；51(5)：626-630)。27周龄PiZ小鼠肝脏的天狼星红染色显示出肝纤维化的发展，在用SERPINA1-1459治疗的小鼠的肝脏中显著减少(图12)。
PiZ小鼠中SERPINA1 mRNA的持续敲低具有良好的耐受性。从5、12或49周龄开始用SERPINA1-1459治疗的PiZ小鼠没有引起包括ALT、AST或碱性磷酸酶在内的重要血清生化参数水平升高(图13)。
总体而言，这些结果证明了PiZ小鼠中SERPINA1 mRNA的持续敲低具有良好的耐受性，包括转氨酶活性在内的血清生化值没有异常。
实施例5：用SERPINA1-1459治疗的PiZ小鼠中的SERPINA1 mRNA和人Z-AAT蛋白的剂量依赖性敲低与肝小球的减少相关
本研究的目的是评估将表达突变人Z-AAT蛋白的PiZ小鼠中的肝小球减少至少50％所需的SERPINA1-1459敲低SERPINA1 mRNA的水平。具体而言，小鼠(5周龄)给予4次皮下剂量的0、0.3、1或3mg/kg SERPINA1-1459，每4周一次。
在SERPINA1-1459的最后剂量后一周，SERPINA1 mRNA以及循环和肝脏人Z-AAT蛋白水平以剂量依赖性方式显著降低(图14)。在SERPINA1-1459的最后剂量后一周观察到肝小球的类似剂量依赖性减少(图14)。四剂1或3mg/kg SERPINA1-1459后观察到肝小球减少至少50％。
正如在人类中所见，PiZ小鼠肝细胞的ER中突变人Z-AAT的组织病理学特征是用淀粉酶抗性的高碘酸希夫(PAS-D)染色的细胞内小球(Rudnick等人，2004，Analyses ofhepatocellular proliferation in a mouse model of alpha-1-antitrypsindeficiency，HEPATOLOGY，39：1048-55；Perlmutter等人，2006，Pathogenesis of chronicliver injury and hepatocellular carcinoma in alpha-1-antitrypsin deficiency，PEDIATR RES 60(2)：233-8)。从五周龄开始用SERPINA1-1459治疗PiZ小鼠导致肝小球形成的剂量依赖性抑制(图15)。
实施例6：向食蟹猴单次皮下(SC)团注后对SERPINA1-1459的药效学功效、剂量响应和作用持续时间的评价。
本研究的主要目的是确定向食蟹猴单次皮下(SC)团注后SERPINA1-1459的药效学功效、剂量响应和作用持续时间。次要目的是通过在适当的时间点监测标准血液学和临床血液化学(CBC)参数、体重和潜在的注射部位反应来获得耐受性的初步评估。
雌性食蟹猴在Charles River Laboratories(Shrewsbury，MA)接收，在进行研究程序之前，它们在那里适应至少一周。除了指定程序期间以外，每天向动物提供两次PMINutrition International Certified Primate饮食。所有动物都可以自由饮水。动物被社交圈养并提供环境丰富化。在方案指定的最终研究(第169天)时，所有猴子都是健康的，并返回测试集群。
简言之，三组年龄从2岁到4岁的非幼稚雌性食蟹猴(每组n＝5)接受1mg/kg(第1组)、3mg/kg(第2组)或10mg/kg(第3组)SERPINA1-1459的单次皮下团注。给药后3天密切监测注射部位的炎症情况。每天记录临床观察结果。
在为期24周的整个研究中，每周采集血液样品并加工成血清和血浆。具体而言，所有动物都在采血程序之前禁食过夜。在Charles River使用给药前和48小时样品进行临床血液化学(CBC)和血液学参数测定。在Charles River从2mL血液样品加工血清和血浆，将其分装到多个储存小瓶中并在液氮中骤冻。除用于CBC和血液学的样品外，所有样品均在干冰上运送至Dicerna Pharmaceuticals。在Dicerna Pharmaceuticals通过ELISA对血清A1AT蛋白浓度进行定量。所有其他样品均在-80℃下保存。
对照参数来自第-5天、第-3天和第1天临注射前的给药前测量。通过ELISA测量血清样品中的血清α-1抗胰蛋白酶(A1AT)浓度，这是肝脏中SERPINA1-1459活性的生物标志物。
每日临床观察、临床血液化学和血液学参数均无异常，与给药前对照没有差异(数据未示出)。在整个研究中，体重以与该年龄雌性猴子的正常历史生长范围一致的方式增加，并且在任何时间点在各组之间都没有差异(图16；左侧图显示平均变化百分比±SEM，右侧图显示个体动物值)。在注射部位，任何剂量水平下任何动物均未观察到炎症反应或其他反应。总而言之，这些结果提示，高达10mg/kg SERPINA1-1459的单次皮下剂量在非人灵长类动物中具有良好的耐受性。
使用用于检测人α1抗胰蛋白酶的市售ELISA试剂盒(Abcam，Cambridge，MA)，按照制造商的说明测量25μL血清中的A1AT蛋白浓度。通过ELISA一式两份对样品进行分析。SERPINA1-1459治疗后血清A1AT蛋白浓度的降低被计算为相对于给药前A1AT血清蛋白浓度的降低百分比。
SERPINA1-1459的施用导致所有组中循环A1AT蛋白浓度的强劲且剂量相关的降低，单次皮下剂量后4周达到最大降低。此时，循环A1AT蛋白浓度与基线相比的最大降低为1mg/kg组的2.2倍(降低55％)、3mg/kg组的4.8倍(降低79％)和10mg/kg组的6.7倍(降低84％)(P＜0.0001，所有组)(图17A)。在第4周观察到的最大药效学作用在1mg/kg组中维持到第7周，在3mg/kg和10mg/kg剂量组中维持到第8周，之后A1AT的循环浓度缓慢恢复到基线浓度。在1mg/kg剂量组中，A1AT蛋白浓度在给药后大约18周恢复到基线。在3mg/kg和10mg/kg剂量组中，在研究最后一天(第24周)之前未达到基线浓度，在研究终止时分别达到基线血清A1AT浓度的86％和62％。据报道，70-80％的循环A1AT是由肝细胞产生的(Janciauskiene等人.Respiratory Medicine(2011)105，1129e1139)，因此，在10mg/kg组中达到的84％降低可能接近可达到的最大效果(图17A和图17B)。这得到了以下观察结果的进一步支持：3mg/kg和10mg/kg剂量组的药效学反应小于剂量比例。然而，1mg/kg剂量组的结果提示，SERPINA1-1459在非人灵长类动物中的半数最大有效剂量(ED50)约为1mg/kg。
讨论与结论
每日临床观察、CBC和血液学均无异常，与给药前对照没有差异。在整个研究中，每个剂量组的体重都有所增加，并且在任何时间点在各组之间都没有差异。直到注射后72小时，在任何剂量水平下，在任何动物中均未观察到注射部位反应。综上所述，这些观察结果提示，高达10mg/kg SERPINA1-1459的单次皮下剂量在非人灵长类动物中具有良好的耐受性。另外，SERPINA1-1459的施用在所有剂量组的猴子中都导致循环A1AT蛋白浓度的强劲且剂量相关的降低。
在一部分PiZZ患者中观察到的肝脏病理学的有效治疗代表了尚未得到满足的高度医疗需求(Lomas，DA.New therapeutic targets for alpha-1 antitrypsindeficiency.Chronic obstructive pulmonary diseases(Miami，Fla.).2018；5(4)：233-43)。SERPINA1-1459是一种siRNA治疗剂，旨在选择性降低SERPINA1 mRNA和A1AT蛋白水平，从而减少肝脏Z-AAT蛋白积累。由肝细胞产生的A1AT分泌到循环中，因此，A1AT血清浓度代表了在没有直接肝脏采样的情况下用于评估SERPINA1-1459功效的有用生物标志物。
A1ATD患者的肝病的进展与肝细胞中Z-AAT的进行性积累有关(Teckman，J.H.，2013COPD.2013年3月；10Suppl 1：35-43)。SERPINA1-1459具有产生有意义的治疗干预以减缓、阻止或可能逆转PiZZ患者的肝病进展的潜力。因此，SERPINA1-1459可能代表用于患有肝病和相关症状的PiZZ患者的挽救生命的治疗干预。
实施例7：用SERPINA1-1459治疗的食蟹猴中A1AT蛋白的剂量依赖性敲低
本阶段研究的目的是通过在该重复剂量毒性研究中四次皮下施用30、100或300mg/kg SERPINA1-1459的食蟹猴中第87天和第141天循环A1AT蛋白浓度的降低进行评估，来确定SERPINA1-1459的药效学作用。在研究的第1天，对年轻成年猴子(约42月龄)和幼年猴子(约15月龄)施用SERPINA1-1459，并且每28天再次注射。
使用人α1抗胰蛋白酶(SERPINA1)ELISA试剂盒(Abcam，Cambridge，MA)，按照制造商的说明一式两份测量25μL血清样品中的A1AT蛋白浓度。SERPINA1-1459治疗组中A1AT蛋白浓度的降低对于雄性和雌性独立地被计算为相对于年龄匹配对照(无菌盐水处理)组在同一天的平均表达水平的表达百分比，其中对照组中的A1AT蛋白浓度被设定为100％。
使用GraphPad Prism(GraphPad Software，La Jolla，CA)生成平均值±平均值标准误差图并分析数据。进行非配对t检验来比较SERPINA1-1459治疗组中的A1AT蛋白浓度与相同时间点的年龄匹配对照组中的A1AT蛋白浓度。仅在具有3只或更多只猴子的组中计算统计显著性。
SERPINA1-1459对A1AT蛋白浓度的抑制作用如图18所示。第87天采集的血液中循环A1AT蛋白浓度的药效学分析显示，年轻成年猴子和幼年猴子的循环A1AT蛋白浓度分别降低了57.3％至83.8％。在无治疗期结束时，幼年猴子中维持循环A1AT蛋白浓度降低57.8％至75.8％。在雄性和雌性幼年猴子之间循环A1AT蛋白浓度的降低没有观察到显著差异；然而，雌性年轻成年猴子比雄性年轻成年猴子的循环A1AT蛋白浓度降低的程度更大。SERPINA1-1459治疗导致与雄性年轻成年猴子相比，雄性幼年猴子中循环A1AT蛋白浓度有更大降低。剂量响应不明显。
在为期3个月的给药期结束时(第87天)采集的血液中循环A1AT蛋白浓度的药效学分析显示，年轻成年猴子和幼年猴子的循环A1AT蛋白浓度降低了约70％至80％。在无治疗期结束时(第141天)，幼年猴子中维持循环A1AT蛋白浓度降低约65％。药效学作用没有明显的有意义的剂量、性别或年龄相关差异。
实施例8：长期SERPINA1-1459治疗的剂量响应证明了SERPINA1 mRNA敲低和治疗耐受性
本研究的目的是确定食蟹猴皮下注射9个月重复剂量(每4周一次；10剂)的SERPINA1-1459的药效学作用。
雄性和雌性食蟹猴组皮下(SC)注射对照(盐水)或20、60或180mg/kg SERPINA1-1459。每组均包含主研究动物和恢复(recovery)动物(R)，主研究动物在第255天进行尸检，恢复动物(R)在第253天给药后停止治疗。在第309天(给药后8周)对这些动物进行尸检。在为期九个月的整个期间里，每28天皮下施用一次SERPINA1-1459，总共10剂。每个月的皮下剂量基于在每次给药事件前2天获取的体重。
通过采用未经验证的方法使用定量逆转录聚合酶链反应(RT-qPCR)测量SERPINA1mRNA表达，在所有剂量组中在主研究和恢复性尸检时对雄性和雌性肝脏样品进行了分析。
在所有治疗组的雄性和雌性食蟹猴的肝脏中分析了SERPINA1-1459的药效学(PD)(图19)。在所有SERPINA1-1459施用组中，在终末(主研究)和恢复时间点，SERPINA1 mRNA表达均降低至不到在对照中发现的水平的5％。尽管对照动物存在差异(18-188％范围)，但除了施用20mg/kg的恢复动物外，食蟹猴在所有SERPINA1-1459剂量水平下在终末和恢复时间点的SERPINA1 mRNA表达均显著降低，证明了SERPINA1-1459的有效活性。雄性和雌性猴子之间的表达或活性没有明显差异。主时间点和恢复时间点之间的SERPINA1 mRNA表达没有显著差异，提示mRNA表达没有恢复。在高达180mg/kg的水平下，在9个月内皮下重复剂量施用SERPINA1-1459(10剂)在食蟹猴中耐受良好。
附加引文
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Claims (56)

1.用于降低α-1抗胰蛋白酶(A1AT)的表达的寡核苷酸，所述寡核苷酸包含15-30个核苷酸的反义链和15-50个核苷酸的有义链，其中所述反义链包含选自SEQ ID No：2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30和32的核苷酸序列，其中所述有义链包含与所述反义链互补的互补区域，任选地其中所述有义链包含选自SEQ ID No：1、3、5、7、9、11、13、15、17、19、21、23、25、27、29和31的核苷酸序列。
2.根据权利要求1所述的寡核苷酸，其中所述有义链和反义链包含选自下组的核苷酸序列：
(a)分别为SEQ ID No：1和2；
(b)分别为SEQ ID No：3和4；
(c)分别为SEQ ID No：5和6；
(d)分别为SEQ ID No：7和8；
(e)分别为SEQ ID No：9和10；
(f)分别为SEQ ID No：11和12；
(g)分别为SEQ ID No：13和14；
(h)分别为SEQ ID No：15和16；
(i)分别为SEQ ID No：17和18；
(j)分别为SEQ ID No：19和20；
(k)分别为SEQ ID No：21和22；
(1)分别为SEQ ID No：23和24；
(m)分别为SEQ ID No：25和26；
(n)分别为SEQ ID No：27和28；
(o)分别为SEQ ID No：29和30；以及
(p)分别为SEQ ID No：31和32。
3.用于降低α-1抗胰蛋白酶(A1AT)的表达的寡核苷酸，所述寡核苷酸包含15-30个核苷酸的反义链和15-50个核苷酸的有义链，其中所述反义链包含与SEQ ID NO：26中所示的核苷酸序列有3个或更少核苷酸不同的至少19个连续核苷酸，并且所述有义链包含SEQ IDNO：25中所示的核苷酸序列。
4.根据权利要求3所述的寡核苷酸，其中所述有义链和反义链形成双链区域，其中所述反义链的长度为19至30个核苷酸。
5.根据权利要求3所述的寡核苷酸，其中所述反义链包含与SEQ ID NO：26的核苷酸序列有2个或更少核苷酸不同的至少19个连续核苷酸。
6.根据权利要求1-5中任一项所述的寡核苷酸，其中所述寡核苷酸包含至少一个经修饰的核苷酸。
7.根据权利要求6所述的寡核苷酸，其中所述寡核苷酸的所有核苷酸均被修饰。
8.根据权利要求6或7所述的寡核苷酸，其中所述经修饰的核苷酸包含2’-修饰。
9.根据权利要求8所述的寡核苷酸，其中所述2’-修饰选自2’-氟代修饰、2’-O-甲基修饰或其两者。
10.根据权利要求1-6中任一项所述的寡核苷酸，其中所述反义链包含22个核苷酸并且所述有义链包含36个核苷酸，其中所述反义链和有义链从5’至3’编号，并且其中以下位置中的一个或多个位置被2’-O-甲基修饰：所述有义链的位置1、2、4、6、7、12、14、16、18-26或31-36，和/或所述反义链的位置1、6、8、11-13、15、17或19-22。
11.根据权利要求1-6中任一项所述的寡核苷酸，其中所述反义链包含22个核苷酸并且所述有义链包含36个核苷酸，其中所述反义链和有义链从5’至3’编号，并且其中以下位置中的一个或多个位置被2’-氟代修饰：所述有义链的位置3、5、8-11、13、15或17，和/或所述反义链的位置2-5、7、9、10、14、16或18。
12.根据权利要求1-6中任一项所述的寡核苷酸，其中所述反义链包含22个核苷酸并且所述有义链包含36个核苷酸，其中所述反义链和有义链从5’至3’编号，并且其中以下位置中的一个或多个位置被2’-O-甲基修饰：所述有义链的位置1、2、4-7、11、14-16、18-26或31-36，和/或所述反义链的位置1、4、6、8-11、13、15、17、18或20-22；并且其中以下位置中的一个或多个位置被2’-氟代修饰：所述有义链的位置3、8-10、12、13和17，和/或所述反义链的位置2、3、5、7、12、14、16和19。
13.根据权利要求1-6中任一项所述的寡核苷酸，其中所述反义链包含22个核苷酸并且所述有义链包含36个核苷酸，其中所述反义链和有义链从5’至3’编号，并且其中以下位置中的一个或多个位置被2’-O-甲基修饰：所述有义链的位置1、2、4-7、11、14-16、18-26或31-36，和/或所述反义链的位置1、4、6、8、9、11-13、15、18或20-22；并且其中以下位置中的一个或多个位置被2’-氟代修饰：所述有义链的位置3、8-10、12、13或17，和/或所述反义链的位置2、3、5、7、10、14、16、17或19。
14.根据前述权利要求中任一项所述的寡核苷酸，其中所述寡核苷酸包含至少一个经修饰的核苷酸间键合。
15.根据权利要求14所述的寡核苷酸，其中所述至少一个经修饰的核苷酸间键合是硫代磷酸酯键。
16.根据权利要求1-15中任一项所述的寡核苷酸，其中所述寡核苷酸在以下各位置之间具有硫代磷酸酯键：有义链的位置1和2、反义链的位置1和2、反义链的位置2和3、反义链的位置3和4、反义链的位置20和21以及反义链的位置21和22。
17.根据前述权利要求中任一项所述的寡核苷酸，其中所述反义链的第一个位置处的尿苷包含磷酸酯类似物。
18.根据权利要求17所述的寡核苷酸，其在所述反义链的位置1处包含以下结构：
19.根据前述权利要求中任一项所述的寡核苷酸，其中所述有义链包含表示为S1-L-S2的茎-环，其中S1与S2互补，并且其中L在S1与S2之间形成长度为3-5个核苷酸的环，并且任选地其中L为四环。
20.根据权利要求19所述的寡核苷酸，其中所述四环包含序列5’-GAAA’3’。
21.根据权利要求1-20中任一项所述的寡核苷酸，其中所述寡核苷酸附接至一个或多个N-乙酰半乳糖胺(GalNAc)部分。
22.根据权利要求20所述的寡核苷酸，其中所述有义链上的-GAAA-序列的一个或多个核苷酸缀合至单价GalNAc部分。
23.根据权利要求22或22所述的寡核苷酸，其中所述-GAAA-序列包含以下结构：
其中：
L表示键、点击化学柄或长度为1至20个(包括端值)连续共价键合原子的连接体，该连接体选自取代和未取代的亚烷基、取代和未取代的亚烯基、取代和未取代的亚炔基、取代和未取代的亚杂烷基、取代和未取代的亚杂烯基、取代和未取代的亚杂炔基，以及它们的组合；且X为O、S或N。
24.根据权利要求23所述的寡核苷酸，其中L为缩醛连接体。
25.根据权利要求23或权利要求24所述的寡核苷酸，其中X为O。
26.根据权利要求20和22-25中任一项所述的寡核苷酸，其中所述-GAAA-序列包含以下结构：
27.用于降低α-1抗胰蛋白酶(A1AT)的表达的寡核苷酸，所述寡核苷酸包含15-30个核苷酸的反义链和15-50个核苷酸的有义链，其中所述反义链包含选自SEQ ID No：34、36、38、40、42、44、46、48、50、52、54、56、58、60、62、64、66、68、70、72、74、76、78、80、82、84、86、88、90、92、94、96、98、100、102和104的核苷酸序列，其中所述有义链包含与所述反义链互补的互补区域，任选地其中所述有义链包含选自SEQ ID No：33、35、37、39、41、43、45、47、49、51、53、55、57、59、61、63、65、67、69、71、73、75、77、79、81、83、85、87、89、91、93、95、97、99、101和103的核苷酸序列。
28.根据权利要求27所述的寡核苷酸，其中所述有义链和反义链包含选自下组的核苷酸序列：
(a)分别为SEQ ID No：33和34；
(b)分别为SEQ ID No：35和36；
(c)分别为SEQ ID No：37和38；
(d)分别为SEQ ID No：39和40；
(e)分别为SEQ ID No：41和42；
(f)分别为SEQ ID No：43和44；
(g)分别为SEQ ID No：45和46；
(h)分别为SEQ ID No：47和48；
(i)分别为SEQ ID No：49和50；
(j)分别为SEQ ID No：51和52；
(k)分别为SEQ ID No：53和54；
(1)分别为SEQ ID No：55和56；
(m)分别为SEQ ID No：57和58；
(n)分别为SEQ ID No：59和60；
(o)分别为SEQ ID No：61和62；
(p)分别为SEQ ID No：63和64；
(q)分别为SEQ ID No：65和66；
(r)分别为SEQ ID No：67和68；
(s)分别为SEQ ID No：69和70；
(t)分别为SEQ ID No：71和72；
(u)分别为SEQ ID No：73和74；
(v)分别为SEQ ID No：75和76；
(w)分别为SEQ ID No：77和78；
(x)分别为SEQ ID No：79和80；
(y)分别为SEQ ID No：81和82；
(z)分别为SEQ ID No：83和84；
(aa)分别为SEQ ID No：85和86；
(bb)分别为SEQ ID No：87和88；
(cc)分别为SEQ ID No：89和90；
(dd)分别为SEQ ID No：91和92；
(ee)分别为SEQ ID No：93和94；
(ff)分别为SEQ ID No：95和96；
(gg)分别为SEQ ID No：97和98；
(hh)分别为SEQ ID No：99和100；
(ii)分别为SEQ ID No：101和102；以及，
(jj)分别为SEQ ID No：103和104。
29.用于降低A1AT的表达的寡核苷酸，所述寡核苷酸包含具有SEQ ID NO：26所示序列的反义链和具有SEQ ID NO：105所示序列的有义链，
其中所述有义链的位置1、2、4-7、11、14-16、18-26或31-36以及所述反义链的位置1、4、6、8-11、13、15、17、18或20-22均被2’-O-甲基修饰，并且所述有义链的位置3、8-10、12、13和17以及所述反义链的位置2、3、5、7、12、14、16和19均被2’-氟代修饰；
其中所述寡核苷酸在有义链的位置1和2、反义链的位置1和2、反义链的位置2和3、反义链的位置3和4、反义链的位置20和21以及反义链的位置21和22中的每一个之间具有硫代磷酸酯键；
其中所述寡核苷酸在所述反义链的位置1处包含以下结构：
其中所述有义链上的-GAAA-序列的每个核苷酸缀合至单价GalNac部分，其中所述-GAAA-序列包含以下结构：
30.用于降低AlAT的表达的寡核苷酸，所述寡核苷酸包含有义链和反义链，所述有义链包含SEQ ID NO：103的核苷酸序列，所述反义链包含SEQ ID NO：104的核苷酸序列，所述反义链包含与AlATRNA转录物互补的互补区域，其中所述寡核苷酸是具有以下结构的缀合物的形式：
31.包含根据前述权利要求中任一项所述的寡核苷酸的组合物。
32.根据权利要求31所述的组合物，其进一步包含Na+抗衡离子。
33.包含根据权利要求1-30中任一项所述的寡核苷酸和药学上可接受的载剂或稀释剂的组合物。
34.用于抑制α1抗胰蛋白酶(AlAT)的表达的双链核糖核酸(dsRNA)剂，其中所述dsRNA包含形成双链区域的有义链和反义链，其中所述反义链包含与SEQ ID NO：26的核苷酸序列有4个或更少核苷酸不同的至少15个连续核苷酸，其中所述反义链的长度为19至35个核苷酸。
35.根据权利要求34所述的dsRNA剂，其中所述双链区域的所有核苷酸都是经修饰的核苷酸，并且其中所述经修饰的核苷酸选自2’-O-甲基修饰的核苷酸和2’-氟代修饰的核苷酸；并且其中所述dsRNA附接至一个或多个N-乙酰半乳糖胺(GalNAc)部分。
36.根据权利要求34或35所述的dsRNA剂，其中所述反义链的长度为19至30个核苷酸，并且其中所述有义链的长度为32至80个核苷酸并且包含四环。
37.根据权利要求34-36中任一项所述的dsRNA剂，其中所述有义链包含SEQ ID NO：25中所示的核苷酸序列。
38.根据权利要求34-37中任一项所述的dsRNA剂，其中所述反义链包含SEQ ID NO：104中所示的序列，并且所述有义链包含SEQ ID NO：103中所示的序列。
39.包含根据权利要求34-38中任一项所述的dsRNA剂的组合物。
40.根据权利要求39所述的组合物，其进一步包含Na+抗衡离子。
41.包含根据权利要求34-38中任一项所述的dsRNA剂和药学上可接受的载剂或稀释剂的组合物。
42.将寡核苷酸递送至受试者的方法，所述方法包括施用根据权利要求1-30中任一项所述的寡核苷酸、根据权利要求31-33中任一项所述的组合物、根据权利要求34-38中任一项所述的dsRNA剂或根据权利要求39-41中任一项所述的组合物。
43.根据权利要求42所述的方法，其中递送所述寡核苷酸、组合物或dsRNA剂以治疗或预防所述受试者的肝脏疾病或病症，其中所述肝脏疾病或病症选自慢性肝病、肝脏炎症、肝硬化、肝纤维化和肝细胞癌。
44.根据权利要求42或43所述的方法，其中所述受试者是人。
45.根据权利要求42-44中任一项所述的方法，其中将所述寡核苷酸、组合物或dsRNA剂静脉内或皮下施用于所述受试者。
46.用于降低哺乳动物中靶α-1抗胰蛋白酶mRNA的表达的方法，其包括以足以降低所述哺乳动物中靶α-1抗胰蛋白酶mRNA的表达的量施用根据权利要求1-30中任一项所述的寡核苷酸、根据权利要求31-33中任一项所述的组合物、根据权利要求34-38中任一项所述的dsRNA剂或根据权利要求39-41中任一项所述的组合物。
47.根据权利要求46所述的方法，其中所述寡核苷酸在脂质纳米颗粒(LNP)中配制。
48.根据权利要求42-47中任一项所述的方法，其中所述寡核苷酸或dsRNA剂以选自每天每千克所述哺乳动物1微克至5毫克、每千克100微克至0.5毫克、每千克0.001至0.25毫克、每千克0.01至20微克、每千克0.01至10微克、每千克0.10至5微克以及每千克0.1至2.5微克的剂量施用。
49.根据权利要求46-48中任一项所述的方法，其中在向所述哺乳动物施用所述寡核苷酸、组合物或dsRNA剂后至少3天，所述哺乳动物的组织中的α-1抗胰蛋白酶mRNA水平降低至少70％的量(以％表示)。
50.根据权利要求49所述的方法，其中所述组织是肝组织。
51.根据权利要求42-44和46-50中任一项所述的方法，其中所述施用步骤包括选自静脉内注射、肌肉内注射、腹膜内注射、输注、皮下注射、透皮、气雾剂、直肠、阴道、局部、口服和吸入递送的给药途径。
52.用于治疗或预防动物的肝脏疾病或病症的方法，其包括向所述受试者施用足以治疗或预防所述受试者的所述肝脏疾病或病症的量的根据权利要求1-30中任一项所述的寡核苷酸、根据权利要求31-33中任一项所述的组合物、根据权利要求34-38中任一项所述的dsRNA剂或根据权利要求39-41中任一项所述的组合物，其中所述肝脏疾病或病症选自慢性肝病、肝脏炎症、肝硬化、COPD、肺气肿、肝纤维化和肝细胞癌。
53.根据权利要求52所述的方法，其中所述动物是人。
54.试剂盒，其包含根据权利要求1-30中任一项所述的寡核苷酸、根据权利要求31-33中任一项所述的组合物、根据权利要求34-38中任一项所述的dsRNA剂或根据权利要求39-41中任一项所述的组合物，以及关于降低有需要的受试者中的α-1抗胰蛋白酶表达的说明书。
55.根据权利要求1-30中任一项所述的寡核苷酸、根据权利要求31-33中任一项所述的组合物、根据权利要求34-38中任一项所述的dsRNA剂或根据权利要求39-41中任一项所述的组合物在制备用于降低有需要的受试者中的α-1抗胰蛋白酶表达的药物中的用途。
56.根据权利要求54所述的试剂盒或根据权利要求55所述的用途，其中所述受试者患有肝脏疾病或病症。
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